WO2006013281A1 - Utilisation de sequences nucleotidiques pour l'obtention de semences dont la capacite de germination en situation d'hypoxie est accrue - Google Patents

Utilisation de sequences nucleotidiques pour l'obtention de semences dont la capacite de germination en situation d'hypoxie est accrue Download PDF

Info

Publication number
WO2006013281A1
WO2006013281A1 PCT/FR2005/001722 FR2005001722W WO2006013281A1 WO 2006013281 A1 WO2006013281 A1 WO 2006013281A1 FR 2005001722 W FR2005001722 W FR 2005001722W WO 2006013281 A1 WO2006013281 A1 WO 2006013281A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
aquaporin
asp
arg
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2005/001722
Other languages
English (en)
Inventor
Christophe Maurel
Wilinger Clare Vander
Doan-Trung Luu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of WO2006013281A1 publication Critical patent/WO2006013281A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/8267—Seed dormancy, germination or sprouting

Definitions

  • the present invention relates to the use of nucleotide sequences for obtaining seeds whose germination capacity in a situation of hypoxia is increased.
  • seeds may experience hypoxia. Under these conditions, the supply of oxygen is not sufficient to satisfy the metabolic consumption of seeds, and germination is slowed down (Veselova et al, 2003, and references cited).
  • an irregular watering can, locally in a culture, induce a flood of the substrate, creating consequently a hypoxia, and a delay of germination, which results in a non-coordinated germination of seeds (Vartapetian and Jackson, 1997, Veselova et al, 2003, and references cited).
  • the seed coat of the seed remains relatively hermetic which can create hypoxia in germinating seeds with high metabolic activity and cause a defect in germination or even seed damage (Veselova et al, 2003 ).
  • Aquaporins are membrane proteins that promote the diffusion of water through the membrane, found in both plants and animals.
  • the activity of some of these aquaporins, i.e., their water permeability, can be modulated according to the intracellular pH.
  • Part of the protein, usually extramembrane, is responsible for the perception of pH and the resulting opening or closing of the aquaporin.
  • PIPs Intrinsic Plasmic Membrane Proteins
  • an intracellular loop called the D loop, appears to be responsible for the perception of intracellular pH, and causes aquaporin closure when the pH is below 7 (Tournaire-Roux et al, 2003).
  • An object of the invention is therefore to provide genetically modified seeds whose germination capacity in a situation of hypoxia are increased, as well as their method of production.
  • the present invention relates to the use of nucleotide sequences coding for a pH-dependent permeability aquaporin in plants, whose proton perception site has been inactivated by mutation, for the transformation of plants for the purpose of preparation. seeds whose germination capacity in hypoxia is increased.
  • the pH of the collection site is defined as a part of the sequence of aquaporins, to which certain "mutations cause the stop of the dependent permeability function of the pH of said aquaporin, while maintaining a substantially constant permeability to water.
  • the permeability of the aquaporins can be measured as described in Tournaire-Roux et al. (2003).
  • mutation denotes the deletion, substitution or insertion of at least one amino acid.
  • the expression "seeds whose germination capacity in a situation of hypoxia is increased” means that said seeds germinate more rapidly in a situation of hypoxia than the corresponding seeds that have not been transformed according to the invention, under the same conditions.
  • the genetically modified seeds according to the invention germinate at least about 1 hour, in particular at least about 5 hours, and more particularly at least about 12 hours, before the corresponding unmodified seeds, in the germination test in situation hypoxia described as an example.
  • the germination test in hypoxia situation can be implemented as follows.
  • the seeds are placed in a nutrient solution essentially free of O 2 , then their germination is evaluated at regular time intervals, especially with the naked eye or using a binocular loupe, as the apparent emergence of a radicle from the seed coat.
  • the nutrient solution may be for example an ABIS solution [5 mM KNO 3 , 2 mM MgSO 4 , 1 mM Ca (NO 3 ) 2 , 50 ⁇ M Fe-EDTA, microelements as described by Murashige & Skoog (1962), 10 g L “1 sucrose, 7 g L " 1 agar, 1 mM MES, and 2.5 mM K 2 HPO 4 H-KH 2 PO 4 , pH 6.1] in which the concentration of agar is reduced to 0 , 1%.
  • ABIS solution 5 mM KNO 3 , 2 mM MgSO 4 , 1 mM Ca (NO 3 ) 2 , 50 ⁇ M Fe-EDTA, microelements as described by Murashige & Skoog (1962), 10 g L “1 sucrose, 7 g L " 1 agar, 1 mM MES, and 2.5 mM K 2 HPO 4 H-KH 2 PO 4 , pH
  • the dissolved oxygen is removed from the nutrient solution, for example using a stream of nitrogen gas for about 1 hour under sterile conditions, optionally after autoclaving and cooling with stirring of the nutrient solution, to obtain a solution essentially without oxygen, is it that is to say, in particular, a solution whose concentration of O 2 is about 0.5%.
  • the O 2 concentration can be measured using a WTW Oxi 330 Bioblock Scientific oxygen electrode (Weilheim, Germany, CeIl Ox 325).
  • the solution is then immediately transferred to tubes, such as 1.5 mL microcentrifuge tubes, in which several dry seeds, especially about 10, are placed, and then the tubes are hermetically sealed.
  • cytosolic pH in a plant or a seed, a situation of hypoxia leads to a decrease in the cytosolic pH. Normally, this decrease in cytosolic pH results in a decrease in the water permeability of pH-dependent permeability aquaporins. In the case of a seed, the decrease in the permeability to water has the effect of delaying germination.
  • Plant transformation methods are well known to those skilled in the art, for example the method of soaking inflorescence described by Clough and Bent (1998).
  • the invention relates to the use as defined above nucleotide sequences encoding an aquaporin of the intrinsic protein type of the plasma membrane (PIP) 5, the D-loop between transmembrane domains 4 and 5, corresponding to the site of perception of protons, has been modified by the substitution, the deletion or the addition of at least one amino acid, said loop D being between amino acids 180 to 220 of the aquaporin sequences PIP and being delimited on the N-terminal side by the Ser-Ala-Thr triplet and on the C-terminal side by the VaI-Pro-Ile / Val triplet.
  • PIP plasma membrane
  • the permeability of PIPs varies with cytosolic pH. When the cytosolic pH decreases, especially when it is less than 7, the permeability of the PIPs decreases, until it becomes essentially zero at cytosolic pH values below 6.
  • the PIP loop D is notably described by Tournaire-Roux et al. (2003). A representation of the D loop is also given in Figure 2.
  • the modification of this D loop results in a decrease in the perception of the pH variations of the PIPs that carry this modified D-loop, that is to say that the decrease in the permeability of PIPs carrying a modified D-loop is lower than it is for PD? normal.
  • this loop is located between amino acids 180 to 220 in the peptide sequence of PIP aquaporins.
  • This loop is extremely well conserved in plants as shown by the sequence alignment shown in Figure 3. It is therefore easy for one skilled in the art to identify it in an aquaporin sequence. Over consistently, it is framed by a Ser-Ala-Thx triplet on the N-terminal side and Val-Pro-Ile / Val on the C-terminal side. Ile / Val means that the third amino acid of this triplet can be either an isoleucine or a valine.
  • the invention relates to the use as defined above, of nucleotide sequences coding for an aquaporin PIP whose loop D is homologous to the sequence extending from amino acids 185 to 200 of the peptide sequence of aquaporin PIP2; 2 of Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 5).
  • the invention relates to the use as defined above, of nucleotide sequences coding for an aquaporin PIP, whose His amino acid of the D loop is substituted by another amino acid, in particularly by an amino acid selected from Asp, Glu, Ala, Lys, Arg, and more particularly by Asp.
  • the D loop of aquaporins PIP includes only one His, so it is easy to identify it.
  • the modification of this unique amino acid leads to the production of PIP aquaporins essentially insensitive to cytosolic pH and to obtaining seeds whose germination is less affected than normal by hypoxia conditions.
  • the invention relates to the use as defined above, of nucleotide sequences coding for an aquaporin PIP, including the amino acid His of the loop D, corresponding to the His ⁇ of the Peptide sequence of the aquaporin PIP2; 2 of Arabidopsis thaliana, is substituted by another amino acid, in particular by an amino acid selected from Asp, Glu, Ala, Lys, Arg and more particularly by Asp.
  • a sequence alignment as described above makes it possible to easily identify the Hisi corresponding to the Hisi 97 of the peptide sequence of the aquaporin PIP2; 2 of Arabidopsis thaliana.
  • the invention relates to the use as defined above, of nucleotide sequences coding for an aquaporin PIP, at least one of the amino acids of the dipeptide Arg-Asp of the D loop, is substituted by another amino acid, in particular an amino acid selected from Ala, Asp, Glu for the amino acid Arg, and among Ala, Arg, Lys for the amino acid Asp, and more particularly by the amino acid Ala, each of the two positions.
  • the PIP loop D only has one Arg-Asp doublet, so it's easy to identify.
  • the modifications described above of these two amino acids make it possible to obtain PIP proteins whose sensitivity to pH is reduced, and therefore seeds whose germination capacity under hypoxic conditions is increased.
  • the invention relates to the use as defined above, of nucleotide sequences coding for an aquaporin PIP, including at least one of the amino acids of an Arg-Asp dipeptide of the D loop, corresponding to the dipeptide ATg 194 -ASp 1P s of aquaporin PIP2; 2 of Arabidopsis thaliana, is substituted by another amino acid, in particular by an amino acid selected from Ala, Asp, Glu for the amino acid Arg, and among Ala, Arg, Lys for the amino acid Asp, and more particularly by the amino acid Ala, at each of the two positions.
  • the invention relates to the use as defined above, of nucleotide sequences coding for an aquaporin PIP, of which:
  • an amino acid His of the loop D corresponding in particular to HiS 197 of the peptide sequence of aquaporin PIP2; 2 of Arabidopsis thaliana, is substituted by an amino acid Ala, and the amino acid Arg of an Arg dipeptide -Asp of the D loop, corresponding in particular to the Arg 194 dipeptide -Asp 195 of the aquaporin PIP2; 2 of Arabidopsis thaliana, is substituted by an amino acid AIa, or
  • an amino acid His-D-loop in particular corresponding to His-197 of the peptide sequence of aquaporin PEP2; 2 from Arabidopsis thaliana, is substituted by an amino acid Ala, and the amino acid Asp dipeptide Arg-Asp of the D loop, corresponding in particular the the amino acid
  • the dipeptide Arg 2 -Asp 2 of aquaporin PD 2, 2 of Arabidopsis thaliana is substituted with an amino acid Ala.
  • the double mutations described above reinforce the insensitivity to pH of the double mutated PIP aquaporins compared to aquaporins having a simple mutation of one of the two amino acids of the Arg-Asp pair.
  • the invention relates to the use as defined above, of nucleotide sequences encoding an aquaporin PIP, comprising at least one of the following modifications:
  • the present invention also relates to the use as defined above of nucleotide sequences coding for an aquaporin PIP, comprising the following sequence:
  • X 1 represents any amino acid
  • X 2 represents any amino acid
  • X 3 represents P or A
  • X 4 represents any amino acid
  • X 5 represents any amino acid
  • X 6 represents I, S or N
  • X 7 represents any amino acid
  • Xs represents any amino acid
  • Xg represents P or S
  • X 10 represents any amino acid
  • - X 1 represents an amino acid other than S, in particular the amino acid P;
  • X 2 represents an amino acid other than D, in particular an amino acid chosen from A, R or K;
  • - X 4 represents an amino acid other than K, in particular an amino acid selected from A, E, or D;
  • X 5 represents an amino acid other than R, in particular an amino acid chosen from A, E or D
  • - X 7 represents an amino acid other than R, in particular an amino acid selected from A, E, or D, and more particularly A;
  • Xs represents an amino acid other than D, in particular an amino acid chosen from A, R or K, and more particularly A;
  • - X 10 represents an amino acid other than H, in particular an amino acid selected from K, R, A, E, or D, and more particularly D.
  • the position of the sequence (1) in the overall sequence of any PIP aquaporins can be unambiguously identified by virtue of the unique LVYTVF sequence.
  • the whole of the sequence (1) covers the D loop of the aquaporins PIP which is delimited by the triplets X 1 AT and VPX 11 .
  • nucleotide sequences coding for an aquaporin PIP comprising the sequence (1), wherein Xj o represents D.
  • the invention relates to the use as defined above, of nucleotide sequences coding for an aquaporin PIP, comprising the sequence (1), in which:
  • X 1 O represents A
  • X 7 represents A, and / or
  • nucleotide sequences coding for an aquaporin PIP comprising one of the following sequences:
  • SEQ ID NO: 7 corresponds to the nucleotide sequence coding for the PIP2 protein; 2 d : 'Arabidopsis thaliana in which the amino acid H 197 has been replaced by a D amino acid.
  • SEQ ID NO: 7 can be used to transform plants of Arabidopsis thaliana or any other plant species.
  • the transformed plants are chosen from the following species: Actinidia arguta, Actinidia delidosa, Allium sativum, Apium graveolens, Arabidopsis thaliana, Avena sativa, Beta vulgaris, Brassica campestos, Brassica napus, Brassica vompa , Cicer arietinum, Cichorium endivia, Citrus limon, Citrus medica, Citrus paradisi, Coffea arabica, Cucumis sativus, Daucus carota, Glycine max, Gossypium hirsutum, Helianthus annuus, Hordeum vulgare, Lactuca spp, Linum usitatissimum, Lycopersicon esculentum, Malus sp.
  • Medicago sativa Nicotiana tabacum, Oriza sativa, Phaseolus vulgaris, Pisum sativum, Prunus armeniaca, Prunus persica, Raphanus sativus, Solanum melongena, Solanum tuberosum, Triticosecale species, Triticum aestivum, Vigna radiata, Zea mays.
  • the invention relates to the use as defined above, of nucleotide sequences coding for an aquaporin, for the transformation of plants for the preparation of seeds, including: the germination capacity in a situation hypoxia is increased, in order to obtain essentially synchronous germination of said seeds of a given plant when they are cultured simultaneously, especially in the context of germination under irrigation and / or in compact soil, and / or the germination rate is higher than that of the corresponding non-transformed seeds.
  • the present invention also relates to genetically modified plants or seeds, characterized in that they comprise at least one sequence nucleotide encoding a pH-dependent permeability aquaporin in plants, whose proton perception site has been inactivated by mutation.
  • Said nucleotide sequence coding for a pH-dependent permeability aquaporin in plants whose site of proton perception has been inactivated by mutation can be found in said plants or seeds, either episomally or integrated into one of the chromosomes of the genome of the plant, in one or more copies.
  • the wild-type, that is, non-mutated, copy of said nucleotide sequence coding for a pH-dependent permeability aquaporin in plants may be present in or absent from the genome of said plants or seeds.
  • the insertion site of said mutated sequence into the genome of said plants or seeds has no effect on the ability of said seeds to germinate under hypoxia conditions.
  • the invention relates to genetically modified plants or seeds as defined above, characterized in that they comprise at least one nucleotide sequence coding for an aquaporin of the intrinsic protein type of the plasma membrane ( PIP), whose loop D between the transmembrane domains 4 and 5, corresponding to the site of proton perception, has been modified by the substitution, the deletion or the addition of at least one amino acid, said loop D being understood between amino acids 180 to 220 of the aquaporin PlP sequences and being delimited on the N-terminal side by the Ser-Ala-Thr triplet and on the C-terminal side by the VaI-Pro-Ile / Val triplet.
  • PIP plasma membrane
  • the invention relates to genetically modified plants or seeds as defined above, characterized in that they comprise at least one nucleotide sequence coding for an aquaporin PIP whose D loop is homologous to the sequence extending from amino acids 185 to 200 of the peptide sequence of aquaporin PIP2; 2 drabidopsis thaliana.
  • the invention relates to genetically modified plants or seeds as defined above, characterized in that they comprise at least one nucleotide sequence coding for an aquaporin PIP, including the amino acid His of the D loop is substituted by another amino acid, particularly an amino acid selected from Asp, Glu, Ala 5 Lys, Arg, and more particularly Asp.
  • the invention relates to genetically modified plants or seeds as defined above, characterized in that they comprise at least one nucleotide sequence encoding a PIP aquaporin, of which the the the
  • the amino acid His of loop D corresponding to HiS 1S i 7 of the peptide sequence of Faquaporin PIP2; 2 of Arabidopsis thaliana, is substituted by another amino acid, in particular by an amino acid chosen from Asp, Glu, AIa, Lys, Arg, and more particularly by Asp.
  • the invention relates to genetically modified plants or seeds as defined above, characterized in that they comprise at least one nucleotide sequence coding for an aquaporin PIP 5 of which at least one of the amino acids of the Arg-Asp dipeptide of the D loop, is substituted by another amino acid, in particular by an amino acid selected from Ala, Asp, Glu for the amino acid Arg, and among Ala, Arg, Lys for the amino acid Asp, and more particularly by the amino acid Ala, at each of the two positions.
  • the invention relates to genetically modified plants or seeds as defined above, characterized in that they comprise at least one nucleotide sequence coding for an aquaporin PIP, of which at least one of the acids Amines of an Arg-Asp dipeptide of the D loop, corresponding to the dipeptide ATg 1P4 -ASp 195 of the aquaporin PIP2; 2 of Arabidopsis thaliana, is substituted by another amino acid, in particular by an amino acid selected from AIa , Asp, Glu for the amino acid Arg, and among Ala, Arg, Lys for the amino acid Asp, and more particularly by the amino acid Ala at each of the two positions.
  • the invention relates to genetically modified plants or seeds as defined above, characterized in that they comprise at least one nucleotide sequence coding for an aquaporin PIP, of which:
  • an amino acid His of the loop D corresponding in particular to HiS 197 of the peptide sequence of aquaporin PB 2, 2 of Arabidopsis thaliana, is substituted by an amino acid Ala, and the amino acid Arg of a dipeptide Arg-Asp of the D loop, corresponding in particular to the dipeptide ATg 194 -ASp 195 of the aquaporin PIP2; 2 of Arabidopsis thaliana, is substituted by an amino acid AIa, or
  • an amino acid His of the loop D corresponding in particular to HiSj 97 of the peptide sequence of aquaporin PIP2; 2 of Arabidopsis thaliana, is substituted by an amino acid Ala, and the amino acid Asp of an Arg dipeptide -Asp of the D loop, corresponding in particular to the dipeptide Arg 194- Aspi 95 of the aquaporin PEP2; 2 of Arabidopsis thaliana, is substituted by an amino acid AIa.
  • the invention relates to genetically modified plants or seeds as defined above, characterized in that they comprise at least one nucleotide sequence coding for an aquaporin PIP comprising at least one of the modifications following: substitution of Ser corresponding to Ser 185 of the peptide sequence of aquaporin PIP2; 2 to Arabidopsis thaliana by another amino acid, such as Pro; substitution of the Asp corresponding to Asp 188 of the peptide sequence of aquaporin PD2,2 to Arabidopsis thaliana by another amino acid, such as Ala, Lys or Arg; substitution of the Lys corresponding to the LyS 1C o of the peptide sequence of aquaporin PIP2; 2 to Arabidopsis thaliana by another amino acid, such as Ala, Asp or Glu; substitution of the Arg corresponding to the Arg 2 of the peptide sequence of aquaporin PIP 2; 2 to Arabidopsis thaliana by another amino acid, such as Ala, Ala, Asp or
  • the present invention also relates to genetically modified plants or seeds as defined above, characterized in that they comprise at least one nucleotide sequence coding for an aquaporin PIP, which aquaporin comprises the following sequence:
  • X 1 represents any amino acid
  • X 2 represents any amino acid
  • X 3 represents P or A
  • X 4 represents any amino acid
  • X 5 represents any amino acid
  • X 6 represents I, S or N
  • X 7 represents any amino acid
  • X 8 represents any amino acid
  • X 9 represents P or S
  • - Xn represents V or I, provided that at least one of the following conditions is met: - X 1 represents an amino acid other than S, in particular the amino acid P;
  • X 2 represents an amino acid other than D, in particular an amino acid chosen from A, R or K;
  • - X 4 represents an amino acid other than K, in particular an amino acid selected from A, E, or D;
  • - X 5 is an amino acid other than R, in particular an amino acid selected from A, D or E 5
  • - X 7 represents an amino acid other than R, in particular an amino acid selected from A, E, or D, and more particularly A;
  • X 8 represents an amino acid other than D, in particular an amino acid chosen from A, R or K, and more particularly A;
  • X 10 represents an amino acid other than H, in particular an amino acid chosen from K 7 R, A, E, or D, and more particularly D.
  • the invention relates to genetically modified plants or seeds as defined above, characterized in that they comprise at least one nucleotide sequence coding for an aquaporin PIP, which aquaporin comprises the sequence (1 ), wherein X 10 is D.
  • the invention relates to genetically modified plants or seeds as defined above, characterized in that they comprise at least one nucleotide sequence coding for an aquaporin PEP, which aquaporin comprises the sequence ( 1), in which:
  • X 7 represents A, and / or
  • X 8 represents A.
  • the invention relates to genetically modified plants or seeds as defined above, characterized in that they comprise at least one nucleotide sequence coding for an aquaporin PIP, which aquaporin comprises one of the following sequences:
  • LVYTVFSATDX 3 KRX 6 ARDX 9 DVPX 1 ILAPL (SEQ ID NO: 2) LVYTVFSATDX 3 KRX 6 AADX 9 AVPXnLAPL (SEQ H) NO: 3) LVYTVFSATDX 3 KRX 6 ARAX 9 AVPX 11 LAPL (SEQ ID NO: 4) in which X 3 , X 6 , X9 and Xu are as defined above, and in particular the nucleotide sequence SEQ ID NO: 7.
  • the genetically modified plants or seeds are chosen from the following species: Actinidia arguta, Actinidia deliciosa, Allium sativum, Apium graveolens, Arabidopsis thaliana, Avena sativa, Beta vulgaris, Brassica campestris, Brassica Napus, Brassica raspa, Cicer arietinum, Cichorium endivia, Citrus limon, Citrus medica, Citrus paradisi, Coffea arabica, Cucumis sativus, Daucus carota, Glycine max, Gossypium hirsutum, Helianthus annuus, Hordeum vulgare, Lactuca spp, Linum usitatissimum, Lycopersicon esculentum, Malus sp., Medicago sativa, Nicotiana tabacum, Oriza sativa, Phaseolus vulgaris, Pisum sativum, Prunus armeniaca, Prunus
  • the invention relates to a method for obtaining essentially synchronous germination of seeds of plants of a given species cultured simultaneously, especially in the context of germination under irrigation and / or in compact soil. , characterized in that seed is cultured as defined above.
  • the present invention also relates to pH-dependent permeability aquaporins in plants, whose proton perception site has been inactivated by mutation, as defined above.
  • the present invention also relates to the nucleic acids encoding pH-dependent pH permeability aquaporins in plants, whose proton perception site has been inactivated by mutation, as defined above.
  • the invention also relates to vectors comprising the nucleic acids defined above as well as possibly the elements necessary for their expression in prokaryotic and / or eukaryotic cells, and in particular plant cells.
  • the present invention relates to prokaryotic or eukaryotic cells, in particular plant cells, comprising the vectors described above.
  • FIG. 1 shows the effects of anoxic treatment on the germination of transgenic Arabidopsis thaliana seeds overexpressing an aquaporin insensitive to cytosolic protons.
  • Wild plants (WT) or whose original gene pip2; 2 was inactivated (KO) were transformed by a transgene over-expressing wild-type aquaporin PEP2; 2 or a mutant form insensitive to pH (PIP2; 2pi).
  • seed germination was characterized under normal and hypoxic conditions, and the time required to observe 50% germination of viable seeds (t 50RE ) was measured under each of these conditions.
  • the graph represents the delay of germination (axis of ordinates, in days), relative to the control condition, induced by anoxic treatment of the seeds. Bars represent standard deviations and letters (A, B) indicate statistically different values.
  • FIG. 2 is a schematic of the membrane topology of Intrinsic Protein Intrinsic Plasma Membrane (PIP) aquaporins in plants.
  • the scheme represents the His residues conserved in the PIP aquaporins.
  • the numbers refer to the position of the residues in the aquaporin sequence PIP2; 2 to Arabidopsis thaliana.
  • the PIP1 aquaporins have two additional His (corresponding to positions 160 and 240 of PIP2; 2 and shown in italics in the figure).
  • the transmembrane domains (1-6) and the extra- and intra-cytoplasmic loops (A-E) are drawn by, respectively, gray rectangles and solid lines.
  • PIP aquaporin sequences of wheat Triticum aestivum, AAM00369, AAM00368), rice (Oryza sauva, CAAl 1896, AAC16545), maize (Zea mays, CAC33802), and Samanea saman (AAC 17529, AAC17528) were aligned with, for reference, the sequence of aquaporin PEP2; 2 to Arabidopsis thaliana (P43287).
  • the figure shows the very high conservation of the loop D (framed), with in particular a His (H) residue in bold, as well as its location, between the amino acids Ser ⁇ s and VaI 220 (for Arabidopsis thaliana).
  • the stars represent positions for which the residues are identical for each sequence, and the points the positions for which the amino acids have similar properties.
  • the PIP2; 2 and PD? 2; 2pi cDNAs were cloned into a plasmid pGreenII 179 (Hellens et al., 2000) under the control of the cauliflower mosaic virus 35S duplicated promoter, upstream of the region.
  • PIP2 2pi designated WT (PIP2; 2pi) or KO (PIP2; 2pi), respectively, in the following
  • Seeds were surface sterilized in 86% ethanol, 3.4 g L- 1 Bayroclor (Bayrol, France), 0.0002% Clean N (Colgate-Palmolive) for 6 min, rinsed thoroughly with water sterile and then deposited in transparent polystyrene boxes (12 ⁇ 12 cm) on a standard nutrient medium [ABIS: 5 mM KNO 3 , 2 mM MgSO 4 , 1 mM Ca (NOs) 2 , 50 ⁇ M Fe-EDTA, microelements as described by Murashige & Skoog (1962), 10 g L -1 sucrose, 7 g 1 agar, 1 mM MES, and 2.5 mM K 2 HPO 4 + KH 2 PO 4 , pH 6.1].
  • ABIS 5 mM KNO 3 , 2 mM MgSO 4 , 1 mM Ca (NOs) 2 , 50 ⁇ M Fe-EDTA, microelements as described by Murashige & Skoog
  • Seed germination was evaluated at regular time intervals, either with the naked eye or with a binocular loupe, as the apparent emergence of a radicle from the seed coat, until no more seeds from the same box germinate over a period of 24 hours.
  • Germination curves representing the cumulative percentage of radicles that emerged over time for more than 80 seeds, were adjusted by a Weibull sigmoid function (Brown and Mayer, 1989) using Sigma Plot software (SPSS Science). ). The adjusted curves were used to estimate t 50RE , the time required for the emergence of the radicles for half of the viable seeds, ie for the seeds that finally germinated. Seed lots with a final germination percentage of less than 90% were evacuated.
  • Germination under hypoxic conditions was performed in an ABIS solution in which the agar concentration was reduced to 0.1%. Briefly, the autoclaved solution was cooled with stirring and then streamed with nitrogen gas for about 1 hour under sterile conditions. The O 2 concentration, measured using a WTW Oxi 330 Bioblock Scientific oxygen electrode (Weilheim, Germany, CeIl Ox 325), was evaluated at 0.5%. The solution was immediately transferred to 1.5 mL microcentrifuge tubes, in which about 10 dry seeds were placed, and then the tubes were sealed. For each seed lot and each hypoxia experiment, three micro-centrifugation tubes were considered. 3. Results

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine à perméabilité dépendante du pH chez les plantes, dont le site de perception des protons a été inactivé par mutation, pour la transformation de plantes en vue de la préparation de semences dont la capacité de germination en situation d'hypoxie est accrue.

Description

UTILISATION DE SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES POUR L'OBTENTION DE SEMENCES DONT LA CAPACITE DE GERMINATION EN SITUATION D'HYPOXIE EST ACCRUE
La présente invention concerne l'utilisation de séquences nucléotidiques pour l'obtention de semences dont la capacité de germination en situation d'hypoxie est accrue. Lors des premières étapes de la germination, les semences peuvent subir des situations d'hypoxie. Dans ces conditions, l'apport en oxygène n'est pas suffisant pour satisfaire la consommation métabolique de semences, et la germination s'en trouve ralentie (Veselova et al, 2003, et références citées).
Ainsi, dans le cadre de cultures irriguées (horticoles ou maraîchères) un arrosage irrégulier peut, localement dans une culture, induire une inondation du substrat, créant en conséquence une hypoxie, et un retard de germination, ce qui aboutit à une germination non coordonnée des semences (Vartapetian et Jackson, 1997 ; Veselova et al, 2003, et références citées).
De plus, dans d'autres cas, si un tassage du sol a lieu, ponctuellement après semis, ce phénomène peut également être un facteur d'hypoxie créant une hétérogénéité de culture (Vartapetian et Jackson, 1997).
Enfin, chez certaines espèces de plantes, le tégument de la graine reste relativement hermétique ce qui peut créer une hypoxie chez les semences en germination à forte activité métabolique et provoquer un défaut de germination, voir même un endommagement des semences (Veselova et al, 2003).
Les aquaporines sont des protéines de la membrane plasmique favorisant la diffusion de l'eau à travers la membrane, que l'on retrouve tant chez les plantes que chez les animaux. L'activité de certaines de ces aquaporines, c'est-à-dire leur perméabilité à l'eau, peut être modulée en fonction du pH intracellulaire. Une partie de la protéine, en général extramembranaire, est responsable de la perception du pH et de l'ouverture ou de la fermeture de l'aquaporine qui en découle. Ainsi dans le cas des Protéines Intrinsèques de la membrane Plasmique (PIP), qui sont des aquaporines de plantes (Maurel et al, 2002), une boucle intracellulaire, nommée boucle D, semble être responsable de la perception du pH intracellulaire, et provoque la fermeture de l'aquaporine lorsque le pH est inférieur à 7 (Tournaire-Roux et al, 2003). Un objet de l'invention est donc de fournir des semences génétiquement modifiées dont les capacités de germination en situation d'hypoxie sont accrues, ainsi que leur mode d'obtention.
A ce titre, la présente invention concerne l'utilisation de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine à perméabilité dépendante du pH chez les plantes, dont le site de perception des protons a été inactivé par mutation, pour la transformation de plantes en vue de la préparation de semences dont la capacité de germination en situation d'hypoxie est accrue.
Le site de perception du pH est défini comme étant une partie de la séquence des aquaporines, pour laquelle certaines " mutations provoquent l'arrêt de la fonction de perméabilité dépendante du pH desdites aquaporines, tout en maintenant une perméabilité à l'eau essentiellement constante.
La perméabilité des aquaporines peut être mesurée comme décrit dans Tournaire-Roux ét al. (2003).
On désigne par « mutation », la suppression, la substitution ou l'insertion d'au moins un acide aminé.
Selon l'invention, l'expression « semences dont la capacité de germination en situation d'hypoxie est accrue » signifie que lesdites semences germent plus rapidement en situation d'hypoxie que les semences correspondantes n'ayant pas été transformées selon l'invention, dans les mêmes conditions. En particulier, les semences génétiquement modifiées selon l'invention germent au moins environ 1 heure, en particulier au moins environ 5 heures, et plus particulièrement au moins environ 12 heures, avant les semences correspondantes non- modifiées, dans le test de germination en situation d'hypoxie décrit en exemple.
En particulier, le test de germination en situation d'hypoxie peut être mis en oeuvre comme suit. Les semences sont placées dans une solution nutritive essentiellement dépourvue d'O2, puis leur germination est évaluée à intervalles de temps réguliers, notamment à l'oeil nu ou à l'aide d'une loupe binoculaire, comme étant l'émergence apparente d'une radicule à partir de l'enveloppe de la semence.
La solution nutritive peut être par exemple une solution ABIS [5 mM KNO3, 2 mM MgSO4, 1 mM Ca(NO3)2, 50 μM Fe-EDTA, micro-éléments tels que décrits par Murashige & Skoog (1962), 10 g L"1 saccharose, 7 g L"1 agar, 1 mM MES, et 2,5 mM K2HPO4H-KH2PO4, pH 6,1] dans laquelle la concentration d'agar est réduite à 0,1%. L'oxygène dissous est évacué de la solution nutritive, par exemple à l'aide d'un flux d'azote gazeux pendant environ 1 h en conditions stériles, éventuellement après autoclavage et refroidissement sous agitation de la solution nutritive, pour obtenir une solution essentiellement dépourvue d'oxygène, c'est- à-dire, en particulier, une solution dont la concentration d'O2 est d'environ 0,5%. La concentration d'O2 peut être mesurée à l'aide d'une électrode à oxygène WTW Oxi 330 Bioblock Scientific (Weilheim, Germany, CeIl Ox 325). La solution est ensuite immédiatement transférée en tubes, tels que des tubes de micro-centrifugation de 1,5 mL, dans lesquels plusieurs semences sèches, notamment environ 10, sont placées, puis les tubes sont scellés de manière hermétique.
Selon l'invention, dans une plante ou une semence, une situation d'hypoxie entraîne une diminution du pH cytosolique. En temps normal, cette diminution du pH cytosolique entraîne une diminution de la perméabilité à l'eau des aquaporines à perméabilité dépendante du pH. Dans le cas d'une semence, la diminution de la perméabilité à l'eau a pour conséquence de retarder la germination.
Les méthodes de transformation de végétaux sont bien connues de l'homme de l'art, on peut citer à titre d'exemple la méthode dite de trempage d'inflorescence décrite par Clough et Bent (1998).
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine du type protéine intrinsèque de la membrane plasmique (PIP)5 dont la boucle D comprise entre les domaines transmembranaires 4 et 5, correspondant au site de perception des protons, a été modifiée par la substitution, la délétion ou l'ajout d'au moins un acide aminé, ladite boucle D étant comprise entre les acides aminés 180 à 220 des séquences d'aquaporines PIP et étant délimitée du côté N-terminal par le triplet Ser-Ala-Thr et du côté C-terminal par le triplet VaI- Pro-Ile/Val.
La perméabilité des PIP varie avec le pH cytosolique. Lorsque le pH cytosolique diminue, en particulier lorsque il est inférieur à 7, la perméabilité des PIP diminue, jusqu'à devenir essentiellement nulle pour des pH cytosoliques inférieurs à 6.
La boucle D des PIP est notamment décrite par Tournaire-Roux et al. (2003). Une représentation de la boucle D est également donnée dans la Figure 2. La modification de cette boucle D entraîne une diminution de la perception des variations du pH des PIP qui portent cette boucle D modifiée, c'est-à-dire que la diminution de la perméabilité des PIP portant une boucle D modifiée est inférieure à ce qu'elle est pour les PD? normales.
En règle générale, cette boucle se situe entre les acides aminés 180 à 220 dans la séquence peptidique des aquaporines PIP. Cette boucle est extrêmement bien conservée chez les plantes comme le montre l'alignement de séquence présenté dans la Figure 3. Il est donc aisé pour l'homme de l'art de l'identifier dans une séquence d'aquaporine. De plus, de manière constante, elle est encadrée par un triplet Ser-Ala-Thx du côté N-teminal et Val-Pro- Ile/Val du côté C-terminal. Ile/Val signifie que le troisième acide aminé de ce triplet peut être soit une isoleucine, soit une valine.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP dont la boucle D est homologue à la séquence s'étendant des acide aminés 185 à 200 de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana (SEQ DD NO : 5).
Il est aisé pour l'homme de l'art d'identifier une séquence d'aquaporine PIP homologue à la séquence s'étendant des acides aminés 185 à 200 de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 ÔL Arabidopsis thaliana. En effet, ladite séquence d'aquaporine PIP est dite homologue à la séquence s'étendant des acides aminés 185 à 200 de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 dΑrabidopsis thaliana, si elle s'aligne avec celle-ci lorsqu'on réalise un alignement de séquence selon les méthodes de l'art. En particulier, un tel alignement peut être réalisé à l'aide d'un logiciel du type Clustal W (Thompson et al, 199 A), bien connu de l'homme de l'art.
Un exemple d'une telle identification de séquences homologues à la séquence s'étendant des acide aminés 185 à 200 de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2. d'Arabidopsis thaliana est donné dans la Figure 3 (les séquences homologues y sont encadrées).
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP, dont l'acide aminé His de la boucle D est substitué par un autre acide aminé, en particulier par un acide aminé choisi parmi Asp, Glu, AIa, Lys, Arg, et plus particulièrement par Asp.
La boucle D des aquaporines PIP ne comprend qu'une seule His, il est donc aisé de l'identifier. La modification de cet unique acide aminé conduit à l'obtention d'aquaporines PIP essentiellement insensibles au pH cytosolique et à l'obtention de semences dont la germination est moins affectée que la normale par des conditions d'hypoxie.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP, dont l'acide aminé His de la boucle D, correspondant à l'His^ de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana, est substitué par un autre acide aminé, en particulier par un acide aminé choisi parmi Asp, Glu, AIa, Lys, Arg et plus particulièrement par Asp. l'
Un alignement de séquence tel que décrit ci-dessus permet d'identifier facilement l'His correspondant à l'Hisi97 de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana.
Selon un mode de réalisation préféré, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP , dont au moins un des acides aminés du dipeptide Arg-Asp de la boucle D, est substitué par un autre acide aminé, en particulier par un acide aminé choisi parmi AIa, Asp, Glu pour l'acide aminé Arg, et parmi AIa, Arg, Lys pour l'acide aminé Asp, et plus particulièrement par l'acide aminé AIa, à chacune des deux positions.
La boucle D des PIP ne porte qu'un seul doublet Arg-Asp, il est donc facile de l'identifier. Les modifications décrites ci-dessus de ces deux acides aminés permettent d'obtenir des protéines PIP dont la sensibilité au pH est diminuée, et donc des semences dont la capacité de germination en conditions d'hypoxie est accrue.
Selon un autre mode de réalisation préféré, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP, dont au moins un des acides aminés d'un dipeptide Arg-Asp de la boucle D, correspondant au dipeptide ATg194-ASp1Ps de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana, est substitué par un autre acide aminé, en particulier par un acide aminé choisi parmi AIa, Asp, Glu pour l'acide aminé Arg, et parmi AIa, Arg, Lys pour l'acide aminé Asp, et plus particulièrement par l'acide aminé AIa, à chacune des deux positions.
L'identification du doublet Arg-Asp correspondant au doublet ATg194-ASp195 de l'aquaporine PIP2;2 ά'Arabidopsis thaliana peut être identifié aisément par un alignement de séquence.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP, dont :
- un acide aminé His de la boucle D, correspondant notamment à HiS197 de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana, est substitué par un acide aminé AIa, et l'acide aminé Arg d'un dipeptide Arg-Asp de la boucle D, correspondant notamment au dipeptide Arg194-Asp195 de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana, est substitué par un acide aminé AIa, ou
- un acide aminé His de la boucle D, correspondant notamment à l'His197 de la séquence peptidique de l'aquaporine PEP2;2 d'Arabidopsis thaliana, est substitué par un acide aminé AIa, et l'acide aminé Asp d'un dipeptide Arg-Asp de la boucle D, correspondant notamment l'l'
au dipeptide Arg^-Asp^s de l'aquaporine PD?2;2 d'Arabidopsis thaliana, est substitué par un acide aminé AIa.
Avantageusement, les doubles mutations décrites ci-dessus renforcent l'insensibilité au pH des aquaporines PIP double mutées par rapport aux aquaporines possédant une simple mutation d'un des deux acides aminés du couple Arg-Asp.
Selon un autre mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP, comprenant au moins une des modifications suivantes :
- substitution de la Ser correspondant à la Seriss de la séquence peptidique de raquaporine PD?2;2 d'Arabidopsis thaliana par un autre acide aminé, tel qu'une Pro ;
- substitution de l'Asp correspondant à ASp188 de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana par un autre acide aminé, tel que AIa, Lys ou Arg ; substitution de la Lys correspondant à la Lys 190 de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana par un autre acide aminé, tel que AIa, Asp ou Glu ; substitution de l'Arg correspondant à ATg191 de la séquence peptidique de l'aquaporine PD?2;2 d'Arabidopsis thaliana par un autre acide aminé, tel que AIa, Asp ou Glu. •
Les modifications des acides aminés décrits ci-dessus permettent d'obtenir des protéines PIP dont la sensibilité au pH est diminuée, et donc des semences dont la capacité de germination en conditions d'hypoxie est accrue. L'identification des acides aminés correspondant aux acides aminés de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana peut être réalisée aisément par un alignement de séquence, comme cela est décrit précédemment.
La présente invention concerne également, l'utilisation telle que définie ci-dessus, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP, comprenant la séquence suivante :
LVYTVFXIATX2X3X4X5X6AX7X8X9XIOVPX, ÎLAPL (1) (SEQ ID NO : 1)
dans laquelle : - X1 représente un acide aminé quelconque,
- X2 représente un acide aminé quelconque,
- X3 représente P ou A,
- X4 représente un acide aminé quelconque,
- X5 représente un acide aminé quelconque, - X6 représente I, S ou N,
- X7 représente un acide aminé quelconque,
- Xs représente un acide aminé quelconque,
- Xg représente P ou S,
- X1O représente un acide aminé quelconque,
- X11 représente V ou I, sous réserve qu'au moins une des conditions suivantes soit remplie :
- X1 représente un acide aminé différent de S, en particulier l'acide aminé P ;
- X2 représente un acide aminé différent de D, en particulier un acide aminé choisi parmi A, R ou K ;
- X4 représente un acide aminé différent de K, en particulier un acide aminé choisi parmi A, E, ou D ;
- X5 représente un acide aminé différent de R, en particulier un acide aminé choisi parmi A, E, ou D
- X7 représente un acide aminé différent de R, en particulier un acide aminé choisi parmi A, E, ou D, et plus particulièrement A ;
- Xs représente un acide aminé différent de D, en particulier un acide aminé choisi parmi A, R ou K, et plus particulièrement A ;
- X1O représente un acide aminé différent de H, en particulier un acide aminé choisi parmi K, R, A, E, ou D, et plus particulièrement D.
La position de la séquence (1) dans la séquence globale d'aquaporines PIP quelconques peut être identifiée de manière non équivoque grâce à la séquence LVYTVF qui est unique. L'ensemble de la séquence (1) recouvre la boucle D des aquaporines PIP qui est délimitée par les triplets X1AT et VPX11.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP, comprenant la séquence (1), dans laquelle Xj o représente D.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP, comprenant la séquence (1), dans laquelle :
- X1O représente A, et
- X7 représente A, et/ou
- Xg représente A. En particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP, comprenant l'une des séquences suivantes :
LVYTVFSATDX3KRX6ARDX9DVPXnLAPL (SEQ ID NO : 2) LVyTVFSATDX3KRX6AADX9AVPX1 !LAPL (SEQ ID NO : 3) LVYTVFSATDX3KRX6ARAX9AVPX11LAPL (SEQ ID NO : 4) dans lesquelles X3, X6, X9 et X11 sont tels que définis ci-dessus, et notamment de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7.
SEQ ID NO : 7 correspond à la séquence nucléotidique codant la protéine PIP2;2 d: 'Àrabidopsis thaliana dans laquelle l'acide aminé H197 a été remplacé par un acide aminé D.
Avantageusement, SEQ ID NO : 7 peut être utilisée pour transformer des plants d'Arabidopsis thaliana ou de toute autre espèce végétale.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les plantes transformées sont choisies parmi les espèces suivantes : Actinidia arguta, Actinidia delidosa, Allium sativum, Apium graveolens, Arabidopsis thaliana, Avena sativa, Beta vulgaris, Brassica campestήs, Brassica napus, Brassica râpa, Cicer arietinum, Cichorium endivia, Citrus limon, Citrus medica, Citrus paradisi, Coffea arabica, Cucumis sativus, Daucus carota, Glycine max, Gossypium hirsutum, Helianthus annuus, Hordeum vulgare, Lactuca spp, Linum usitatissimum, Lycopersicon esculentum, Malus sp., Medicago sativa, Nicotiana tabacum, Oriza sativa, Phaseolus vulgaris, Pisum sativum, Prunus armeniaca, Prunus persica,, Raphanus sativus, Solanum melongena, Solanum tuberosum, Triticosecale species, • Triticum aestivum, Vigna radiata, Zea mays.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine, pour la transformation de plantes en vue de la préparation de semences dont : la capacité de germination en situation d'hypoxie est accrue, afin d'obtenir une germination essentiellement synchrone desdites semences d'une plante donnée lorsqu'elles sont mises en culture simultanément, notamment dans le cadre d'une germination sous irrigation et/ou en sol compact, et/ou la vitesse de germination est plus élevée que celle des semences correspondantes non transformées.
La présente invention concerne également, des plantes ou des semences génétiquement modifiées, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine à perméabilité dépendante du pH chez les plantes, dont le site de perception des protons a été inactivé par mutation.
Ladite séquence nucléotidique codant pour une aquaporine à perméabilité dépendante du pH chez les plantes, dont le site de perception des protons a été inactivé par mutation peut se trouver chez lesdites plantes ou semences, soit de manière épisomale, soit intégrée dans un des chromosomes du génome de la plante, en une ou plusieurs copies. La copie sauvage, c'est- à-dire non mutée, de ladite séquence nucléotidique codant pour une aquaporine à perméabilité dépendante du pH chez les plantes peut être présente dans le génome desdites plantes ou semences, ou bien absente.
Avantageusement, le site d'insertion de ladite séquence mutée dans le génome desdites plantes ou semences n'a pas d'effet sur la capacité desdites semences à germer dans des conditions d'hypoxie.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne des plantes ou des semences génétiquement modifiées telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine du type protéine intrinsèque de la membrane plasmique (PIP), dont la boucle D comprise entre les domaines transmembranaires 4 et 5, correspondant au site de perception des protons, a été modifiée par la substitution, la délétion ou l'ajout d'au moins un acide aminé, ladite boucle D étant comprise entre les acides aminés 180 à 220 des séquences d'aquaporines PlP et étant délimité du côté N-terminal par le triplet Ser-Ala-Thr et du côté C-terminal par le triplet VaI- Pro-Ile/Val.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne des plantes ou des semences génétiquement modifiées telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP dont la boucle D est homologue à la séquence s 'étendant des acide aminés 185 à 200 de la séquence peptidique de l' aquaporine PIP2;2 dΑrabidopsis thaliana.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne des plantes ou des semences génétiquement modifiées telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP, dont l'acide aminé His de la boucle D est substitué par un autre acide aminé, en particulier par un acide aminé choisi parmi Asp, Glu, AIa5 Lys, Arg, et plus particulièrement par Asp.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne des plantes ou des semences génétiquement modifiées telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP, dont l'l'l'
l'acide aminé His de la boucle D, correspondant à HiS1Si7 de la séquence peptidique de Faquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana, est substitué par un autre acide aminé, en particulier par un acide aminé choisi parmi Asp, Glu, AIa, Lys, Arg, et plus particulièrement par Asp.
Selon un mode de réalisation préféré, l'invention concerne des plantes ou des semences génétiquement modifiées telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP5 dont au moins un des acides aminés du dipeptide Arg-Asp de la boucle D, est substitué par un autre acide aminé, en particulier par un acide aminé choisi parmi AIa, Asp, Glu pour l'acide aminé Arg, et parmi AIa, Arg, Lys pour l'acide aminé Asp, et plus particulièrement par l'acide aminé AIa, à chacune des deux positions.
Selon un autre mode de réalisation préféré, l'invention concerne des plantes ou des semences génétiquement modifiées telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP, dont au moins un des acides aminés d'un dipeptide Arg-Asp de la boucle D, correspondant au dipeptide ATg1P4-ASp195 de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana, est substitué par un autre acide aminé, en particulier par un acide aminé choisi parmi AIa, Asp, Glu pour l'acide aminé Arg, et parmi AIa, Arg, Lys pour l'acide aminé Asp, et plus particulièrement par l'acide aminé AIa à chacune des deux positions.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention concerne des plantes ou des semences génétiquement modifiées telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP, dont :
- un acide aminé His de la boucle D, correspondant notamment à HiS197 de la séquence peptidique de l'aquaporine PB?2;2 d'Arabidopsis thaliana, est substitué par un acide aminé AIa, et l'acide aminé Arg d'un dipeptide Arg-Asp de la boucle D, correspondant notamment au dipeptide ATg194-ASp195 de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana, est substitué par un acide aminé AIa, ou
- un acide aminé His de la boucle D, correspondant notamment à HiSj97 de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana, est substitué par un acide aminé AIa, et l'acide aminé Asp d'un dipeptide Arg-Asp de la boucle D, correspondant notamment au dipeptide Arg194-Aspi95 de l'aquaporine PEP2;2 d'Arabidopsis thaliana, est substitué par un acide aminé AIa. Selon un autre mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention concerne des plantes ou des semences génétiquement modifiées telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP comprenant au moins une des modifications suivantes : substitution de la Ser correspondant à la Ser185 de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 à'Arabidopsis thaliana par un autre acide aminé, tel qu'une Pro ; substitution de l'Asp correspondant à l'Asp188 de la séquence peptidique de l'aquaporine PD?2;2 à'Arabidopsis thaliana par un autre acide aminé, tel que AIa, Lys ou Arg ; - substitution de la Lys correspondant à la LyS1Co de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 à'Arabidopsis thaliana par un autre acide aminé, tel que AIa, Asp ou Glu ; substitution de l'Arg correspondant à l'Arg^ de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 à'Arabidopsis thaliana par un autre acide aminé, tel que AIa, Asp ou Glu.
La présente invention concerne également des plantes ou des semences génétiquement modifiées telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP, laquelle aquaporine comprend la séquence suivante :
LVYTVFX1ATX2X3X4X5X6AX7X8X9X1OVPX11LAPL (1) (SEQ DD NO : 1)
dans laquelle : - X1 représente un acide aminé quelconque,
- X2 représente un acide aminé quelconque,
- X3 représente P ou A,
- X4 représente un acide aminé quelconque,
- X5 représente un acide aminé quelconque,
- X6 représente I, S ou N,
- X7 représente un acide aminé quelconque,
- X8 représente un acide aminé quelconque,
- X9 représente P ou S,
- X10 représente un acide aminé quelconque,
- Xn représente V ou I, sous réserve qu'au moins une des conditions suivantes soit remplie : - X1 représente un acide aminé différent de S, en particulier l'acide aminé P ;
- X2 représente un acide aminé différent de D, en particulier un acide aminé choisi parmi A, R ou K ;
- X4 représente un acide aminé différent de K, en particulier un acide aminé choisi parmi A, E, ou D ;
- X5 représente un acide aminé différent de R, en particulier un acide aminé choisi parmi A, E5 ou D
- X7 représente un acide aminé différent de R, en particulier un acide aminé choisi parmi A, E, ou D, et plus particulièrement A ;
- X8 représente un acide aminé différent de D, en particulier un acide aminé choisi parmi A, R ou K, et plus particulièrement A ;
- X10 représente un acide aminé différent de H, en particulier un acide aminé choisi parmi K7 R, A, E, ou D, et plus particulièrement D.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne des plantes ou des semences génétiquement modifiées telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP, laquelle aquaporine comprend la séquence (1), dans laquelle X10 représente D.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne des plantes ou des semences génétiquement modifiées telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PEP, laquelle aquaporine comprend la séquence (1), dans laquelle :
- X10 représente A, et
- X7 représente A, et/ou
- X8 représente A.
En particulier, l'invention concerne des plantes ou des semences génétiquement modifiées telles que définies ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP, laquelle aquaporine comprend l'une des séquences suivantes :
LVYTVFSATDX3KRX6ARDX9DVPX1 ILAPL (SEQ ID NO : 2) LVYTVFSATDX3KRX6AADX9AVPXnLAPL (SEQ H) NO : 3) LVYTVFSATDX3KRX6ARAX9AVPX11LAPL (SEQ ID NO : 4) dans lesquelles X3, X6, X9 et Xu sont tels que définis ci-dessus, et notamment la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les plantes ou les semences génétiquement modifiées sont choisies parmi les espèces suivantes : Actinidia arguta, Actinidia deliciosa, Allium sativum, Apium graveolens, Arabidopsis thaliana, Avena sativa, Beta vulgaris, Brassica campestris, Brassica napus, Brassica râpa, Cicer arietinum, Cichorium endivia, Citrus limon, Citrus medica, Citrus paradisi, Coffea arabica, Cucumis sativus, Daucus carota, Glycine max, Gossypium hirsutum, Helianthus annuus, Hordeum vulgare, Lactuca spp, Linum usitatissimum, Lycopersicon esculentum, Malus sp., Medicago sativa, Nicotiana tabacum, Oriza sativa, Phaseolus vulgaris, Pisum sativum, Prunus armeniaca, Prunus persica,, Raphanus sativus, Solarium melongena, Solanum tuberosum, Triticosecale species, Triticum aestivum, Vigna radiata, Zea mays.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention concerne une méthode pour obtenir une germination essentiellement synchrone de semences de plantes d'une espèce donnée mises en culture simultanément, notamment dans le cadre d'une germination sous irrigation et/ou en sol compact, caractérisée en ce que sont mises en culture des semences telles que définies ci-dessus.
La présente invention concerne également les aquaporines à perméabilité dépendante du pH chez les plantes, dont le site de perception des protons a été inactivé par mutation, telles que définies ci-dessus.
La présente invention concerne aussi les acides nucléiques codant pour les aquaporines à perméabilité dépendante du pH chez les plantes, dont le site de perception des protons a été inactivé par mutation, telles que définies ci-dessus.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne également des vecteurs comprenant les acides nucléiques définis ci-dessus ainsi qu'éventuellement les éléments nécessaires à leur expression dans des cellules procaryotes et/ou eucaryotes, et notamment végétales.
Dans encore un autre mode de réalisation, la présente invention concerne les cellules procaryotes ou eucaryotes, notamment végétales, comprenant les vecteurs décrits ci-dessus.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1
La Figure 1 représente les effets d'un traitement anoxique sur la germination de semences transgéniques d'Arabidopsis thaliana sur-exprimant une aquaporine insensible aux protons cytosoliques. Des plantes sauvages (WT) ou dont le gène originel pip2;2 a été inactivé (KO) ont été transformées par un transgène sur-exprimant l'aquaporine sauvage PEP2;2 ou une forme mutante insensible au pH (PIP2;2pi). Pour chaque génotype, la germination des semences a été caractérisée en conditions normales et en conditions d'hypoxie, et le temps nécessaire pour observer 50% de germination des graines viables (t50RE) a été mesuré dans chacune de ces conditions. Le graphe représente le retard de germination (axe des ordonnées, en jours), relatif à la condition contrôle, induit par un traitement anoxique des graines. Les barres représentent les déviations standard et les lettres (A, B) indiquent des valeurs statistiquement différentes.
Figure 2
La Figure 2 représente un schéma de la topologie membranaire des aquaporines de type Protéine Intrinsèque de la membrane Plasmique (PIP) chez les plantes. Le schéma représente les résidus His conservés chez les aquaporines PIP. Les numéros se rapportent à la position des résidus dans la séquence de l'aquaporine PIP2;2 à'Arabidopsis thaliana. En comparaison des aquaporines du sous-groupe PIP2, les aquaporines PIPl possèdent deux His supplémentaires (correspondant aux positions 160 et 240 de PIP2;2 et figurées en italique sur la figure). Les domaines transmembranaires (1-6) et les boucles extra- et intra-cytoplasmiques (A-E) sont dessinées par, respectivement, des rectangles gris et des lignes pleines.
Figure 3
Les séquences d' aquaporines PIP de blé (Triticum aestivum ; AAM00369, AAM00368), de riz (Oryza sauva ; CAAl 1896, AAC16545), de maïs (Zea mays ; CAC33802), et de Samanea saman (AAC 17529, AAC17528) ont été alignées avec, pour référence, la séquence de l'aquaporine PEP2;2 à'Arabidopsis thaliana (P43287). La figure montre la très grande conservation de la boucle D (encadrée), avec en particulier un résidu His (H ; en gras), ainsi que sa localisation, entre les acides aminés Ser^s et VaI220 (pour Arabidopsis thaliana). Les étoiles représentent des positions pour lesquelles les résidus sont identiques pour chaque séquence, et les points les positions pour lesquelles les acides aminés possèdent des propriétés semblables. EXEMPLE
Obtention de semences génétiquement modifiées exprimant une aquaporine PIP2;2 dont le site de perception des protons est non fonctionnel
1. Transformation des plantes
Le gène codant pour l' aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO : 5) sous sa forme sauvage ou mutante (PIP2;2pi) (SEQ ID NO :7), portant la mutation His en Asp en position 197 (Hl 97D) (Tournaire-Roux et al, 2003), a été exprimé de manière ectopique dans Ar-abidopsis thaliana, écotype Wassilewskija. Les ADNc de PIP2;2 et de PD?2;2pi ont été clones dans un plasmide pGreenlI 179 (Hellens et ah, 2000) sous le contrôle du promoteur 35S dupliqués du virus de la mosaïque du chou-fleur, en amont de la région non traduite de F ADNc . rbcS-E9 du pois. Des souches d'Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90) transformées avec la construction pGreenlI 179 ont été utilisées pour la transformation de plants d'Arabidopsis par trempage d'inflorescence en présence de Silwet L-77 0,05% (Lehle Seeds, USA), essentiellement comme décrit par Clough et Bent (1998). Des plants d'A. thaliana soit de type sauvage (WT) soit portant une insertion d'ADN-T d'Agrobacterium tumefaciens dans le gène pip2; 2 (lignée pip2;2-l désignée dans la suite KO; Javot et al. 2003) ont été utilisés pour ces transformations. Les transformants primaires (Tl) ont été sélectionnés en présence d'hygromycine 50 mg L"1 puis ont été croisés entre-eux pour identifier les plants donnant une descendance ayant une résistance aux herbicides de type mendélien à locus unique (3 : 1). Les transformants vraisemblablement homozygotes, c'est à dire les plants de T2 dont la descendance était complètement résistante à l'hygromycine, ont été sélectionnés pour une amplification de semences. L'expression ectopique de PIP2;2 ou de PIP2;2pi a été confirmée par analyse en marquage de Western sur des extraits bruts de feuilles. Les lignées WT ou KO d'origine, ou les mêmes lignées mais exprimant PIP2;2 (désignées WT(PIP2;2).ou KO(PIP2;2), respectivement, dans la suite) ou PIP2;2pi (désignées WT(PIP2;2pi) ou KO(PIP2;2pi), respectivement, dans la suite) ont été utilisées dans cette étude. Dans toutes les expériences, et pour chaque génotype étudié, les semences provenant d'au moins trois lignées transformées indépendantes ont été utilisées. Les semences utilisées pour la plupart des expériences, en particulier celles pour lesquelles la vitesse de germination a été comparée entre les lignées, ont été obtenues à partir de plantes cultivées en parallèle sous des conditions environnementales identiques. 2. Tests de germinations
Les semences ont été stérilisées en surface dans une solution 86% éthanol, 3,4 g L"1 Bayroclore (Bayrol, France), 0,0002% Clean N (Colgate-Palmolive) pendant 6 min, rincées abondamment avec de l'eau stérile puis déposées dans des boites de polystyrène transparentes (12 x 12 cm) sur un milieu nutritif standard [ABIS: 5 mM KNO3, 2 mM MgSO4, 1 mM Ca(NOs)2, 50 μM Fe-EDTA, micro-éléments tels que décrits par Murashige & Skoog (1962), 10 g L"1 saccharose, 7 g L'1 agar, 1 mM MES, et 2,5 mM K2HPO4+KH2PO4, pH 6,1]. Les boites, contenant 4 lignes de semences en rangs avec >80 semences par lignes, ont été scellées à l'aide d'un film imperméable à l'air, laissées à 40C à l'obscurité pendant 48 h, puis transférées en pièce de culture à 25 ± 20C sous un cycle 16-h-lumière-(100-120 μmol m"2 s'VS-h-obscurité
La germination des semences a été évaluée à intervalles de temps réguliers, soit à l'oeil nu soit à l'aide d'une loupe binoculaire, comme étant l'émergence apparente d'une radicule à partir de l'enveloppe de la semence, jusqu'à ce que plus aucune semence d'une même boite ne germe sur une période de 24 h. Les courbes de germination, représentant le pourcentage cumulé de radicules ayant émergé au cours du temps pour plus de 80 semences, ont été ajustée par une fonction sigmoïde de Weibull (Brown et Mayer, 1989) à l'aide du logiciel Sigma Plot (SPSS Science). Les courbes ajustées ont été utilisées pour estimer t50RE, le temps nécessaire à l'émergence des radicules pour la moitié des semences viables, c'est à dire pour les semences qui ont finalement germé. Les lots de semences ayant un pourcentage final de germination inférieur à 90% ont été évacués.
Les germinations en conditions hypoxiques ont été réalisées dans une solution ABIS dans laquelle la concentration d'agar a été réduite à 0,1%. Brièvement, la solution autoclavée a été refroidie sous agitation puis mise sous flux d'azote gazeux pendant environ 1 h en conditions stériles. La concentration d'O2, mesurée à l'aide d'une électrode à oxygène WTW Oxi 330 Bioblock Scientific (Weilheim, Germany, CeIl Ox 325), a été évaluée à 0.5%. La solution a été immédiatement transférée en tubes de micro-centrifugation de 1,5 mL, dans lesquels environ 10 semences sèches ont été placées, puis les tubes ont été scellés de manière hermétique. Pour chaque lot de semences et chaque expérience d'hypoxie, trois tubes de micro-centrifugation ont été pris en considération. 3. Résultats
Les résultats obtenus sont portés dans la Figure 1. Dans les conditions testées, l'hypoxie retarde d'environ 36 heures la germination de graines d'Arabidopsis thaliana. L'expression de l'aquaporine PIP2;2pi avance d'au moins 12 heures la réponse de germination. Cet effet est observé pour des plantes transgéniques exprimant PIP2;2pi dans un fond génétique sauvage (WT) ou dans des plantes dont le gène pip2;2 a été inactivé par insertion d'un transgène (KO). Par contre, des plantes transgéniques, exprimant dans les mêmes fonds génétiques, l'aquaporine PIP2;2 non mutée, ne voient pas leur capacité de germination modifiée. Ce résultat établit la spécificité du procédé de l'invention et démontre donc l'intérêt d'utiliser une aquaporine mutée sur son site de perception du pH intracellulaire.
REFERENCES
Brown RF, Mayer DG (1988) Representing cumulative germination. 2. The use of Weibull fonction and other empirically derived curves. Annals Bot. 61 : 127-138 Clough SJ, Bent AF (1998) Floral dip: a simplified method for /ïgroδαctermm-niediated transformation oî Ârabidopsis thaliana. Plant J. 16: 735-43 Hellens RP, Edwards EA, Leyland NR, Bean S, Mullineaux PM (2000) pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant
MolBiol. 42: 819-832. Javot H, V Lauvergeat, V Santoni, F Martin-Laurent, J Gϋçlϋ, J Vinh, J Heyes, KI Franck,
AR Schâffher, D Bouchez, C Maurel (2003) Rôle of a single aquaporin isoform in root water uptake. Plant CeIl 15: 509-522. Maurel C, H Javot, V Lauvergeat, P Gerbeau, C Tournaire, V Santoni, J Heyes (2002)
Molecular physiology of aquaporins in plants. Int. Rev. Cytol, 215: 105-148. Murashige T, Skoog F (1962) A revised médium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple séquence alignment through séquence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. NucleicAcids Res. 22: 4673-4680. Tournaire-Roux C, M Sutka, H Javot, E Goût, P Gerbeau, D-T Luu, R Bligny, C Maurel
(2003) Cytosolic pH régulâtes root water transport during anoxie stress through gating of aquaporins. Nature 425: 393-397. Vartapetian, B. B. & Jackson, M. B. Plant adaptations to anaerobic stress. Ann. Bot. 79
(Suppl. A): 3-20 (1997) Veselova TV, Veselovskii VA, Usmanov PD, Usmanova OV, Kozar VI (2003) Hypoxia and inhibition injuries in aging seeds. Russ. J. Plant Physiol. 50: 835-842

Claims

l'REVENDICATIONS
1. Utilisation de séquences nucléotidiques Godant pour une aquaporine à perméabilité dépendante du pH chez les plantes, dont le site de perception des protons a été inactivé par mutation, pour la transformation de plantes en vue de la préparation de semences dont la capacité de germination en situation d'hypoxie est accrue.
2. Utilisation selon la revendication 1, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine du type protéine intrinsèque de la membrane plasmique (PIP), dont la boucle D comprise entre les domaines transmembranaires 4 et 5, correspondant au site de perception
,des protons, a été modifiée par la substitution, la délétion ou l'ajout d'au moins un acide aminé, ladite boucle D étant comprise entre les acides aminés 180 à 220 des séquences d'aquaporines PIP et étant délimitée du côté N-terminal par le triplet Ser-Ala-Thr et du côté C-terminal par le triplet Val-Pro-Ile/Val.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP dont la boucle D est homologue à la séquence s 'étendant des acide aminés 185 à 200 de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 à'Αrabidopsis thaliana (SEQ ID NO : 5)
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP, dont l'acide aminé His de la boucle D est substitué par un autre acide aminé, en particulier par un acide aminé choisi parmi Asp, Glu, AIa, Lys, Arg, et plus particulièrement par Asp.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP, dont l'acide aminé His de la boucle D, correspondant à HiS197 de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2,2 à'Arabidopsis thaliana, est substitué par un autre acide aminé, en particulier par un acide aminé choisi parmi Asp, GIu5 AIa, Lys, Arg et plus particulièrement par Asp.
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP5 dont au moins un des acides aminés du dipeptide Arg- Asp de la boucle D, est substitué par un autre acide aminé, en particulier par un acide aminé choisi parmi AIa, l'l'
Asp, Glu pour l'acide aminé Arg, et parmi AIa, Arg, Lys pour l'acide aminé Asp, et plus particulièrement par l'acide aminé AIa, à chacune des deux positions.
7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP, dont au moins un des acides aminés d'un dipeptide Arg- Asp de la boucle D, correspondant au dipeptide Argi94-Aspi95 de l'aquaporine PEP2;2 d'Arabidopsis thaliana, est substitué par un autre acide aminé, en particulier par un acide aminé choisi parmi AIa, Asp, Glu pour l'acide aminé Arg, et parmi AIa, Arg, Lys pour l'acide aminé Asp, et plus particulièrement par l'acide aminé AIa, à chacune des deux positions.
8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP, dont :
- un acide aminé His de la boucle D, correspondant notamment à HiS197 de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana, est substitué par un acide aminé AIa, et l'acide aminé Arg d'un dipeptide Arg- Asp de la boucle D, correspondant notamment au dipeptide ATg194-ASp195 de l'aquaporine PB?2;2 d'Arabidopsis thaliana, est substitué par un acide aminé AIa, ou
- un acide aminé His de la boucle D, correspondant notamment à HiSi97 de la séquence peptidique de l'aquaporine PEP2;2 d'Arabidopsis thaliana, est substitué par un acide aminé AIa, et l'acide aminé Asp d'un dipeptide Arg- Asp de la boucle D, correspondant notamment au dipeptide ATg194-ASp195 de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana, est substitué par un acide aminé AIa.
9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP, comprenant au moins une des modifications suivantes :
- substitution de la Ser correspondant à la SeT]85 de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana par un autre acide aminé, tel qu'une Pro ;
- substitution de l'Asp correspondant à l'Asp^s de la séquence peptidique de l'aquaporine PEP2;2 d'Arabidopsis thaliana par un autre acide aminé, tel que AIa, Lys ou Arg ;
- substitution de la Lys correspondant à la Lys190 de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana par un autre acide aminé, tel que AIa, Asp ou Glu ; l'
substitution de l'Arg correspondant à ATg191 de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 à'Àrabidopsis thaliana par un autre acide aminé, tel que AIa, Asp ou Glu.
10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP5 comprenant la séquence suivante :
LVYTVFX1ATX2X3X4X5X6AX7X8X9X10VPX11LAPL (1) (SEQ ID NO : 1)
dans laquelle : - X1 représente un acide aminé quelconque,
- X2 représente un acide aminé quelconque,
- X3 représente P ou A,
- X4 représente un acide aminé quelconque,
- X5 représente un acide aminé quelconque,
- X6 représente I, S ou N,
- X7 représente un acide aminé quelconque,
- X8 représente un acide aminé quelconque,
- X9 représente P ou S,
- X10 représente un acide aminé quelconque,
- X11 représente V ou I, sous réserve qu'au moins une des conditions suivantes soit remplie :
- X1 représente un acide aminé différent de S, en particulier l'acide aminé P ;
- X2 représente un acide aminé différent de D, en particulier un acide aminé choisi parmi A, R ou K ;
- X4 représente un acide aminé différent de K, en particulier un acide aminé choisi parmi A, E, ou D ;
- X5 représente un acide aminé différent de R, en particulier un acide aminé choisi parmi A, E, ou D
- X7 représente un acide aminé différent de R, en particulier un acide aminé choisi parmi A, E, ou D, et plus particulièrement A ;
- X8 représente un acide aminé différent de D, en particulier un acide aminé choisi parmi A, R ou K, et plus particulièrement A ;
- X10 représente un acide aminé différent de H, en particulier un acide aminé choisi parmi K, R, A, E, ou D, et plus particulièrement D.
11. Utilisation selon la revendication 10, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP, comprenant la séquence (1), dans laquelle Xj0 représente D.
12. Utilisation selon la revendication 10, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP, comprenant la séquence (1), dans laquelle :
- X1O représente A, et
- X7 représente A, et/ou
- X8 représente A.
13. Utilisation selon l'une des revendications 10 à 12, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine PIP, comprenant l'une des séquences suivantes :
LVYTVFSATDX3KRX6ARDX9DVPX11LAPL (SEQ ID NO : 2) LVYTVFSATDX3KRX6AADX9AVPX11LAPL (SEQ ID NO : 3) LVYTVFSATDX3KRX6ARAX9AVPXI 1LAPL (SEQ ID NO : 4) dans lesquelles X3, X6, X9 et X11 sont tels que définis dans la revendication 10, et notamment de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7.
14. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 13, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine, pour la transformation de plantes choisies parmi les espèces suivantes : Actinidia arguta, Actinidia delidosa, Allium sativum, Apium graveolens, Arabidopsis thaliana, Avena sativa, Beta vulgaris, Brassica campestris, Brassica napus, Brassica râpa, Cicer arietinum, Cichorium endivia, Citrus limon, Citrus medica, Citrus paradisi, Coffea arabica, Cucumis sativus, Daucus carota, Glycine max, Gossypium hirsutum, Helianthus annuus, Hordeum vulgare, Lactuca spp, Linum usitatissimum, Lycopersicon esculentum, Malus sp., Medicago sativa, Nicotiana tabacum, Oriza sativa, Phaseolus vulgaris, Pisum sativum, Prunus armeniaca, Prunus persica,, Raphanus sativus, Solanum melongena, Solanum tuberosum, Triticosecale species, Triticum aestivum, Vigna radiata, Zea mays.
15. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 14, de séquences nucléotidiques codant pour une aquaporine, pour la transformation de plantes en vue de la préparation de semences dont :
- la capacité de germination en situation d'hypoxie est accrue, afin d'obtenir une germination essentiellement synchrone desdites semences d'une plante donnée lorsqu'elles sont mises en culture simultanément, notamment dans le cadre d'une germination sous irrigation et/ou en sol compact, et/ou la vitesse de germination est plus élevée que celle des semences correspondantes non transformées.
16. Plantes ou semences génétiquement modifiées, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine à perméabilité dépendante du pH chez les plantes, dont le site de perception des protons a été inactivé par mutation.
17. Plantes ou semences génétiquement modifiées selon la revendication 16, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine du type protéine intrinsèque de la membrane plasmique (PIP), dont la boucle D comprise entre les domaines transmembranaires 4 et 5, correspondant au site de perception des protons, a été modifiée par la substitution, la délétion ou l'ajout d'au moins un acide aminé, ladite boucle D étant comprise entre les acides aminés 180 à 220 des séquences d'aquaporines PBP et étant délimité du côté N-terminal par le triplet Ser-Ala-Thr et du côté C-terminal par le triplet VaI- Pro-Ile/Val.
18. Plantes ou semences génétiquement modifiées selon la revendication 16 ou 17, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP dont la boucle D est homologue à la séquence s' étendant des acide aminés 185 à 200 de la séquence peptidique de l' aquaporine PIP2;2 & Arabidopsis thaliana.
19. Plantes ou semences génétiquement modifiées selon l'une des revendications 16 à 18, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP, dont l'acide aminé His de la boucle D est substitué par un autre acide aminé, en particulier par un acide aminé choisi parmi Asp, Glu, AIa, Lys, Arg, et plus particulièrement par Asp.
20. Plantes ou semences génétiquement modifiées selon l'une des revendications 16 à 19, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP, dont l'acide aminé His de la boucle D, correspondant à l'His^ de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana, est substitué par un autre acide aminé, en particulier par un acide aminé choisi parmi Asp, Glu, AIa, Lys, Arg, et plus particulièrement par Asp. l'l'
21. Plantes ou semences génétiquement modifiées selon l'une des revendications 16 à 20, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP, dont au moins un des acides aminés du dipeptide Arg-Asp de la boucle D, est substitué par un autre acide aminé, en particulier par un acide aminé choisi parmi AIa, Asp, Glu pour l'acide aminé Arg, et parmi AIa, Arg, Lys pour l'acide aminé Asp, et plus particulièrement par l'acide aminé AIa à chacune des deux positions.
22. Plantes ou semences génétiquement modifiées selon l'une des revendications 16 à 21, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP, dont au moins un des acides aminés d'un dipeptide Arg-Asp de la boucle D, correspondant au dipeptide ATg1Q4-ASpIg5 de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaîiana, est substitué par un autre acide aminé, en particulier par un acide aminé choisi parmi AIa, Asp, Glu pour l'acide aminé Arg, et parmi AIa, Arg, Lys pour l'acide aminé Asp, et plus particulièrement par l'acide aminé AIa à chacune des deux positions.
23. Plantes ou semences génétiquement modifiées selon l'une des revendications 16 à 22, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP, dont :
- un acide aminé His de la boucle D, correspondant notamment à HiS1 s>7 de la séquence peptidique de l'aquaporine PDP2;2 d'Arabidopsis thaîiana, est substitué par un acide aminé AIa, et l'acide aminé Arg d'un dipeptide Arg-Asp de la boucle D, correspondant notamment au dipeptide ATg194-ASp195 de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaîiana, est substitué par un acide aminé AIa, ou
- un acide aminé His de la boucle D, correspondant notamment à HiS197 de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaîiana, est substitué par un acide aminé AIa, et l'acide aminé Asp d'un dipeptide Arg-Asp de la boucle D, correspondant notamment au dipeptide Arg194-Aspi95 de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaîiana, est substitué par un acide aminé AIa.
24. Plantes ou semences génétiquement modifiées selon l'une des revendications 16 à 23, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PlP comprenant au moins une des modifications suivantes :
- substitution de la Ser correspondant à la Serjss de la séquence peptidique de l'aquaporine PE?2;2 d'Arabidopsis thaîiana par un autre acide aminé, tel qu'une Pro ; l'
- substitution de l'Asp correspondant à l'Aspiss de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 d'Αrabidopsis thaliana par un autre acide aminé, tel que AIa, Lys ou Arg ; substitution de la Lys correspondant à la LyS190 de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 d'Ambidopsis thaliana par un autre acide aminé, tel que AIa, Asp ou Glu ;
- substitution de l'Arg correspondant à ATg191 de la séquence peptidique de l'aquaporine PIP2;2 d'Arabidopsis thaliana par un autre acide aminé, tel que AIa, Asp ou Glu.
25. Plantes ou semences génétiquement modifiées selon l'une des revendications 16 à 18, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP, laquelle aquaporine comprend la séquence suivante :
LVYTVFX1ATX2X3X4X5X6AX7X8X9X1OVPX11LAPL (1) (SEQ ID NO : 1)
dans laquelle : - X1 représente un acide aminé quelconque,
- X2 représente un acide aminé quelconque,
- X3 représente P ou A,
- X4 représente un acide aminé quelconque,
- X5 représente un acide aminé quelconque,
- X6 représente I, S ou N,
- X7 représente un acide aminé quelconque,
- X8 représente un acide aminé quelconque,
- X9 représente P ou S,
- X10 représente un acide aminé quelconque,
- X11 représente V ou I, sous réserve qu'au moins une des conditions suivantes soit remplie :
- X1 représente un acide aminé différent de S5 en particulier l'acide aminé P ;
- X2 représente un acide aminé différent de D, en particulier un acide aminé choisi parmi A, R ou K ;
- X4 représente un acide aminé différent de K, en particulier un acide aminé choisi parmi A3 E, ou D ; - Xs représente un acide aminé différent de R, en particulier un acide aminé choisi parmi A, E, ou D
- X7 représente un acide aminé différent de R, en particulier un acide aminé choisi parmi A5 E, ou D, et plus particulièrement A ;
- X8 représente un acide aminé différent de D, en particulier un acide aminé choisi parmi A, R ou K, et plus particulièrement A ;
- X10 représente un acide aminé différent de H, en particulier un acide aminé choisi parmi K, R, A, E, ou D, et plus particulièrement D.
26. Plantes ou semences génétiquement modifiées selon la revendication 25, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP, laquelle aquaporine comprend la séquence (1), dans laquelle X1O représente D.
27. Plantes ou semences génétiquement modifiées selon la revendication 25, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP, laquelle aquaporine comprend la séquence (1), dans laquelle :
- X10 représente A, et
- X7 représente A, et/ou
- Xg représente A.
28. Plantes ou semences génétiquement modifiées selon l'une des revendications 25 à 27, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une séquence nucléotidique codant pour une aquaporine PIP, laquelle aquaporine comprend l'une des séquences suivantes :
LVYTVFSATDX3KRX6ARDX9DVPX11LAPL (SEQ ID NO : 2) LVYTVFSATDX3KRX6AADX9AVPXnLAPL (SEQ ID NO : 3) LVYTVFSATDX3KRX6ARAX9AVPXI iLAPL (SEQ ID NO : 4) dans lesquelles X3, X6, Xg et X11 sont tels que définis dans la revendication 10, et notamment de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7.
29. Plantes ou semences génétiquement modifiées selon l'une des revendications 16 à 28, caractérisées en ce qu'elles sont choisies parmi les espèces suivantes : Actinidia arguta, Actinidia delidosa, Allium sativum, Apium graveolens, Arabidopsis thaliana, Avena sativa, Beta vulgaris, Brassica campestris, Brassica napus, Brassica râpa, Cicer arietinum, Cichorium endivia, Citrus limon, Citrus medica, Citrus paradisi, Coffea arabica, Cucumis sativus, Daucus carota, Glycine max, Gossypium hirsutum, Helianthus annuus, Hordeum vulgare, Lactuca spp, Linum usitatissimum, Lycopersicon esculentum, Malus sp., Medicago sativa, Nicotiana tabacum, Oriza sativa, Phaseolus vulgaris, Pisum sativum, Prunus armeniaca, Prunus persica,, Raphanus sativus, Solanum melongena, Solanum tuberosum, Triticosecale species, Triticum aestivum, Vigna radiata, Zea mays.
30. Méthode pour obtenir une germination essentiellement synchrone de semences de plantes d'une espèce donnée mises en culture simultanément, notamment dans le cadre d'une germination sous irrigation et/ou en sol compact, caractérisée en ce que sont mises en culture des semences selon l'une des revendications 16 à 29.
PCT/FR2005/001722 2004-07-05 2005-07-05 Utilisation de sequences nucleotidiques pour l'obtention de semences dont la capacite de germination en situation d'hypoxie est accrue Ceased WO2006013281A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0407447A FR2872517A1 (fr) 2004-07-05 2004-07-05 Utilisation de sequences nucleotidiques pour l'obtention de semences dont la capacite de germination en situation d'hypoxie est accrue
FR0407447 2004-07-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006013281A1 true WO2006013281A1 (fr) 2006-02-09

Family

ID=34948195

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2005/001722 Ceased WO2006013281A1 (fr) 2004-07-05 2005-07-05 Utilisation de sequences nucleotidiques pour l'obtention de semences dont la capacite de germination en situation d'hypoxie est accrue

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2872517A1 (fr)
WO (1) WO2006013281A1 (fr)

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GAO YONG-PING ET AL: "Characterization and expression of plasma and tonoplast membrane aquaporins in primed seed of Brassica napus during germination under stress conditions", PLANT MOLECULAR BIOLOGY, vol. 40, no. 4, July 1999 (1999-07-01), pages 635 - 644, XP002317612, ISSN: 0167-4412 *
TOURNAIRE-ROUX COLETTE ET AL: "Cytosolic pH regulates root water transport during anoxic stress through gating of aquaporins.", NATURE (LONDON), vol. 425, no. 6956, 25 September 2003 (2003-09-25), pages 393 - 397, XP002317611, ISSN: 0028-0836 *

Also Published As

Publication number Publication date
FR2872517A1 (fr) 2006-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wuriyanghan et al. The ethylene receptor ETR2 delays floral transition and affects starch accumulation in rice
Antoni et al. Selective inhibition of clade A phosphatases type 2C by PYR/PYL/RCAR abscisic acid receptors
Oh et al. The diageotropica gene of tomato encodes a cyclophilin: a novel player in auxin signaling
KR102078764B1 (ko) 합성 브라시카-유래 엽록체 전이 펩티드
Borsics et al. The cyclic nucleotide-gated calmodulin-binding channel AtCNGC10 localizes to the plasma membrane and influences numerous growth responses and starch accumulation in Arabidopsis thaliana
Stein et al. Elevation of free proline and proline-rich protein levels by simultaneous manipulations of proline biosynthesis and degradation in plants
Dong et al. Identification and functional analysis of three MAX2 orthologs in chrysanthemum
Zheng et al. PcDWF1, a pear brassinosteroid biosynthetic gene homologous to AtDWARF1, affected the vegetative and reproductive growth of plants
CN101896608A (zh) 镉积累减少的转基因植物
WO1999025842A1 (fr) Gene chimere ayant un promoteur lumiere dependant conferant la tolerance aux inhibiteurs de l'hppd
US11408011B2 (en) Plant tolerance to stress through the control of chloroplast stability
Luhua et al. Unlocking the synergy: ABA seed priming enhances drought tolerance in seedlings of sweet sorghum through ABA‐IAA crosstalk
CN101686641B (zh) 推定的细胞激动素受体和其应用方法
WO2006013281A1 (fr) Utilisation de sequences nucleotidiques pour l'obtention de semences dont la capacite de germination en situation d'hypoxie est accrue
Yang et al. Over-expressing Salicornia europaea (SeNHX1) gene in tobacco improves tolerance to salt
KR102101690B1 (ko) 고추 녹광품종 유래 bZIP 전사인자 CaAIBZ1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법
EP4605417A1 (fr) Nouveaux peptides et leur utilisation pour moduler l'accumulation d'une proteine
KR101926961B1 (ko) 고추 RING Finger 단백질 유전자 CaDIR1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법
EP1481071A1 (fr) Utilisation de proteines elip pour accroitre la resistance des vegetaux au stress photo-oxydant
JP5648822B2 (ja) 相同組換えを利用したイネアントラニル酸合成酵素の改変
EP0828836A1 (fr) Fragment d'acide nucleique codant pour un enzyme implique dans la voie de biosynthese de l'acide abscissique (aba) chez les plantes
Cho et al. A red algal cyclophilin has an effect on development and growth in Nicotiana tabacum
Chandler Auxin biosynthesis.
WO2026058885A1 (fr) Plante à régulation du temps de floraison et son procédé de production
Antoni et al. Selective inhibition of clade A PP2Cs by PYR/PYLs

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase