WO2006009276A1 - プラジエノライドの生合成に関与するポリペプチドをコードするｄｎａ - Google Patents

プラジエノライドの生合成に関与するポリペプチドをコードするｄｎａ Download PDF

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Kazuhiro Machida
Akira Arisawa
Susumu Takeda
Masashi Yoshida
Toshio Tsuchida
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Eisai R & D Management Co., Ltd.
Mercian Corporation
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    • C12P17/162—Heterorings having oxygen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. Lasalocid

Definitions

  • the present invention relates to polypeptides involved in the biosynthesis of macrolide compound pragenolide, DNAs encoding these polypeptides, and variants thereof. Furthermore, the present invention relates to a transformant that retains part or all of the DNA and their variants, and a method for producing a macrolide compound pragenolide using these transformants.
  • Conventional technology relates to polypeptides involved in the biosynthesis of macrolide compound pragenolide, DNAs encoding these polypeptides, and variants thereof. Furthermore, the present invention relates to a transformant that retains part or all of the DNA and their variants, and a method for producing a macrolide compound pragenolide using these transformants.
  • polyketide compounds compounds having a polyketide as a mother nucleus
  • compounds having various biological activities such as tacrolimus, rapamycin known as daunomycin, and daunomycin, adriamycin, aclacinomycin known as antitumor substances are known.
  • Pragenolide is a general term for a group of compounds discovered from the culture of Streptomyces sp. Mer-11107 strain, which is represented by the following formula (I): 11107B (Pragenolide B) More than 50 analogs are known (W002 / 060890).
  • DNA sequence encoding polyketide synthase generally encodes all activities necessary for polyketide backbone synthesis and is composed of repeating units, ie modules, including a condensation step and a modification step after condensation.
  • Each catalytic activity involves a different site that defines the specific post-condensation modification function that is involved in the specificity for a particular carboxylic acid building block included in each condensation step.
  • Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 12111-12116 includes Streptomyces venezuelae
  • W093 / 13663 also includes Saccharopolis The structure of the gene encoding the erythromycin polyketide synthase of erythraea (Saccharopolyspora erythraea) is described. This gene is composed of six modules, and each module performs one condensation step. That is, the exact sequence of the end chain extension and the modification of the extending chain are determined by the genetic information present in each module.
  • polyketide compounds are synthesized by the polyketide synthase and then catalyzed by modification reactions such as hydroxylation, epoxidation, and methylation (hereinafter sometimes referred to as modification enzymes). Often undergoes modification and is converted to the final metabolite.
  • modification enzymes such as hydroxylation, epoxidation, and methylation
  • Genes that encode the genes involved in these productions that is, the enzymes necessary for biosynthesis of the final metabolites, and the regulatory factors necessary for production control (hereinafter these biosynthesiss). It is clear that the gene groups involved in the gene are sometimes referred to simply as “biosynthetic genes”), and are generally arranged in a cluster in the DNA region on the genome or plasmid of the producing bacteria. Has been.
  • the domain is modified based on that information, so that the size of the carbon chain and the functional group at the 3-position carbon of the condensation process are changed. It becomes possible to change. For example
  • Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 7119-7123 contains a novel derivative of erythromycin by selectively inactivating specific domains within the polyketide synthase gene of erythromycin. It is stated that it can be done. In addition, by recombining each module domain with another, it becomes possible to produce predictable new compounds. For example
  • a modifying enzyme gene a gene encoding a modifying enzyme
  • the modifying enzyme gene is selectively selected based on that information.
  • Science 252 (1991) 114-116 describes that a new derivative 6-deoxyserionolide B can be obtained by deleting the hydroxylase gene eryF present in the vicinity of the polyketide synthase gene of erythromycin. ing.
  • gene expression activation include transcriptional activation by replacing a promoter, increase in the number of gene copies using a multi-copy vector, and improvement in gene product function by introduction of mutations.
  • the desired polyketide compound may be produced by the heterologous strains.
  • the heterogeneous strain used at this time it is advantageous to use a microorganism, particularly Escherichia coli which can be cultured for a short period of time.
  • Science 291 (2001) 1790-1792 describes that the desired 6-deoxyseri-onolide B, which is a precursor of erythromycin, can be efficiently produced by incorporating a polyketide synthase gene into E. coli. Yes. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a polypeptide involved in the biosynthesis of the macrolide compound pragenolide and a DNA encoding the polypeptide and a variant thereof. Furthermore, the present invention provides a transformant retaining a part or all of the DNA and their variants, and a method for producing a macromolecular compound pragenolide using the transformant.
  • a gene fragment of hydroxylase (cytochrome P450 enzyme), which is one of the modifying enzymes, from a known actinomycete is subjected to PCR.
  • cytochrome P450 enzyme which is one of the modifying enzymes
  • the present invention relates to the following [1] to [20].
  • the polypeptide involved in the biosynthesis of pragenolide is at least one selected from polyketide synthase, 6-position hydroxylase, 7-position acylase, 18, 19-position epoxidase and transcription regulator. 0 according to [1] or [2], characterized in that
  • polypeptide according to [10] which has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or a partial sequence thereof.
  • polypeptide according to [12] which has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 or a partial sequence thereof.
  • [20] A method for producing pragenolide, comprising culturing the transformant according to [19] in a medium and collecting the culture solution or pragenolide.
  • R 3A , R 6 ⁇ R 16A and R 21A represent a hydrogen atom or a protecting group for a hydroxyl group (provided that R 3A , R 6A , RieA and R 21A do not represent a hydrogen atom at the same time) I)]
  • the “lower alkyl group” means an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and specifically includes, for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, and the like. In particular, a methyl group, an ethyl group, an isopropyl group, and the like are preferable.
  • Cyclic lower alkyl group means an alkyl group having 3 to 6 carbon atoms, and specific examples include cyclopropyl group, cyclobutyl group, cyclohexyl and the like, and in particular, cyclopropyl group, A cyclobutyl group and the like are preferable.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions means, for example, a colony that uses a DNA having the base sequence defined in any of the above paragraphs (a) to (i) as a probe. It means DNA obtained by using the hybridization method, plaque hybridization method, Southern hybridization method, etc., specifically, a filter on which colony or plaque-derived DNA is immobilized. After hybridization at 65 ° C in the presence of 0 ⁇ 7 ⁇ 1 ⁇ 0 ⁇ sodium chloride, 0.1 to 2 times concentrated SSC solution (composition of 1x concentrated SSC solution is 150 mM DNA can be identified by washing the filter at 65 ° C using sodium chloride and 15 mM sodium citrate.
  • the “DNA variant” means a derivative modified by deleting, converting, adding, or inserting a constituent base, or a derivative thereof.
  • X I 0 0 can be calculated using a commercially available algorithm. Such algorithms are also incorporated into the NBLAST and XBLAST programs described in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410.
  • an “analogue” is the same main skeleton that characterizes its chemical structure. Means compounds having different shapes.
  • DNA encoding a part or all of the polypeptide involved in the biosynthesis of pragenolide is isolated from cultured cells of microorganisms capable of producing the macrolide compound pragenolide, The sequence can be determined. As such microorganisms, any microorganisms capable of producing pragenolide can be used regardless of species and strains. However, Streptomyces sp.
  • Morphology ... + Spirales of aerial hyphae extend from the basic hyphae.
  • a spore chain consisting of about 10 to 20 cylindrical spores is formed at the end of the mature aerial hyphae.
  • the size of the spore is 0.7 X 1.0 ⁇ , the surface of the spore is smooth, and there are no special organs such as spore, fungus nucleus, or flagella.
  • the culture properties after culturing at 28 ° C for 2 weeks on various media are shown below.
  • the description of the color tone is displayed with the name of the color mark of Tresner's best color wheel and the sign shown in parentheses.
  • the growth is moderate, with a slight aerial hyphae on the surface and gray spores (Gray; g).
  • the reverse side of the culture is Nude tan (4gc) or Putty (1 1/2 ec). No soluble pigment is produced.
  • the following shows the growth conditions after 2 weeks of culture at 28 ° C with various carbon sources added to Pleidham.
  • Salt tolerance yeast malt agar medium, cultured for 2 weeks: Grows with a salt content of 4% or less
  • LL-dimaminopimelic acid and glycine were detected in the cell wall of the fungus.
  • the present inventors tried to obtain the DNA of the present invention from the above microorganisms according to the colony hybridization method described in Moquila cloning second edition.
  • a recombinant DNA obtained by merging the genomic DNA of Mer-11107 strain with a partial restriction enzyme such as Sau3AI, and linking a cosmid vector replicable in E. coli with a restriction enzyme such as BamHI. DNA was integrated into E. coli to obtain a transduced strain.
  • the DNA obtained from the Mer-11107 strain is of a cocoon type, generally sequence information that is said to be conserved in the keto synthase domain of the polyketide synthase, and the keto synthase of the picromycin producing bacterium. Designed with reference to region sequence information (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 12111-12116) PCR was performed using primers to obtain amplified DNA. Screening the previously prepared transduced strains using the obtained DNA as a probe, but a number of positive clones (cosmids) were obtained, and it was not possible to immediately identify the transduced strains with the desired DNA. .
  • hydroxylase cytochrome P450 enzyme
  • a gene-disrupted strain was created using a cosmid considered to contain the polyketide synthesis region. It was decided to confirm the function of the DNA obtained by confirming that it would lose the ability to produce the DNA.
  • some problems became clear. One of them is that since the Mer-11107 strain cannot be converted into protoplasts by the widely used lysozyme treatment, the commonly used plastoplast PEG method cannot be applied as a method for transforming actinomycetes into plasmids.
  • the present inventors tried a conjugation method for transferring DNA by mixing E. coli in the early logarithm phase and an appropriate amount of actinomycete spores instead of the protoplast PEG method as a method of transformation.
  • Mer-11107 Since the strain had the property that it was difficult to form spores, further examination was carried out, and it was finally possible to transform by using mycelia cultured until the first logarithmic phase instead of actinomycetes.
  • Another problem is that since the Mer-11107 strain originally has a certain level of resistance to thiostrepton, the thiostrepton resistance gene, which is widely used for transformation of actinomycetes, cannot be used as a marker. Therefore, the transformation method of Mer-11107 was transformed by reexamining the transformation method and using an aminoglycoside phosphatase gene (aminoglycoside resistance gene) as a marker and a lipostamycin-containing medium as a selective medium. It was found that can be selected efficiently. Using this method, we created a gene-disrupted strain that disrupted DNA, which is considered to be a polyketide synthesis region, and confirmed that the disrupted strain lost its ability to produce pragenolide.
  • aminoglycoside phosphatase gene aminoglycoside resistance gene
  • each cosmid was isolated using the cesium chloride method, then sheared to about lkb and subcloned. Next, the base sequence of each fragment was determined for the obtained subclone, and the base sequence of about 75 kb containing DNA related to the synthesis of pragenolide was determined (see SEQ ID NO: 1).
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 1 includes pldA I (bases 8340 to 27935), pldA II (Base 28021-49098), pldA III (base 49134-60269), pldA IV (base 60269-65692), pldB (base 65707-66903), pldC (base 68160-66970), pldD (base 69568-68270) and pldR Eight open 'reading' frames (0RF) of (base 72725-7020) were included.
  • the amino acid sequences of the polypeptides encoded by these sequences are as shown in SEQ ID NOs: 2 to 9, respectively.
  • pldA I, pldA II, pldA III, and pldA IV have the same modules as other polyketide biosynthesis genes that have already been clarified. There were several open reading frames, each containing one or more repeating units called. Each module is also involved in the condensation reaction of polyketide synthesis, as described below.
  • the acyl-cylinder protein (ACP),] 3-ketosyl ACP synthase (KS), the acyltransferase (AT), and the i-position carboxy group modification Encodes all or some of the domains selected from ketoacil reductase (KR), dehydrase (DH) and enol reductase (ER) involved in the reaction.
  • the last module contains a polyketide synthase A thioesterase (TE) domain was present that cleaved from Figure 1 shows the biosynthesis pathway of pragenolide in Mer-11107 strain. Unlike the other modules, the loading module is replaced by glutamine at the active center, indicating that PldA I is involved in the initial reaction.
  • Module 10 also has a thioesterase (TE) domain, indicating that PldA IV is involved in the final reaction of polyketides.
  • TE thioesterase
  • PldA IV is involved in the final reaction of polyketides.
  • PldR is highly homologous to the gene aveR, which encodes a transcriptional regulatory factor in avermectin biosynthesis, and seems to encode a transcriptional regulatory factor for DNA involved in bradyenolide biosynthesis.
  • ORF pldA I (bases 8340 to 27935 of SEQ ID NO: 1) encodes the starter module, module 1, module 2 and module 3 and the corresponding polypeptide is shown by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. .
  • ACPs bases 11148-11327
  • KS1 Base 11385-12650
  • ACP2 Bases 21189-21371
  • ACP3 Base 27498-27680
  • amino acid sequence of the corresponding polypeptide is as follows.
  • KSs amino acids 7-427
  • ATs amino acids 455-814
  • ACPs amino acids 937-996
  • KR1 amino acids 2201 to 2488
  • ACP2 amino acids 4284-4344
  • ACP3 amino acids 6387-6447
  • ORF pldA II (bases 28021 to 49098 of SEQ ID NO: 1) encodes module 4, module 6 and module 7, and the corresponding poly is shown by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • KR4 bases 32413 to 33276
  • ACP4 Base 33298 ⁇ 33480
  • ACP5 Bases 38647-38829
  • ACP6 Base 43429-43611
  • ACP7 Base 48766 ⁇ 48948
  • KS4 amino acids 38-459
  • ACP4 amino acids 1760-1820
  • KR5 amino acids 3246-3535
  • ACP5 Amino acids 3543-3603
  • ACP6 amino acids 5137-5197
  • KR7 amino acids 6621 to 6908
  • ACP7 amino acids 6916-6976
  • ORF pldA III (bases 49134-60269 of SEQ ID NO: 1) encodes module 8 and module 9, and the corresponding polypeptide is shown by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • ACP8 Bases 53642-53825
  • DH9 Bases 56514 to 57230
  • ACP9 Base 59826-6008
  • amino acid sequence of the corresponding polypeptide is as follows.
  • ACP8 amino acids 1504-1564
  • KS9 amino acids 1585-2006 AT9: amino acids 2038 to 2403
  • ACP9 Amino acids 3565-3625
  • ORF pldA IV (bases 60269 to 65692 of SEQ ID NO: 1) codes for module 10, and the corresponding nucleotide is shown in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
  • ACP10 Base 64631-64813
  • amino acid sequence of the corresponding polypeptide is as follows.
  • ACP10 amino acids 1455-1515
  • ORF pldB (bases 65707 to 66903 of SEQ ID NO: 1) encodes pragenolide 6-position hydroxylase, and the corresponding polypeptide is represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6.
  • ORF pldC (bases 68160 to 66970 of SEQ ID NO: 1) encodes a widelyenolide 7-position asylating enzyme, and the corresponding polypeptide is represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7.
  • ORF pldD (bases 69568 to 68270 in SEQ ID NO: 1) encodes pragenolide 18, 19-position epoxidase, and the corresponding polypeptide is represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8.
  • ORF pldR (bases 65707 to 66903 of SEQ ID NO: 1) encodes pragenolide 6-position hydroxylase, and the corresponding polypeptide is represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6.
  • ORF pldC (bases
  • Bases 72725 to 70020 of SEQ ID NO: 1 are transposable in pragenolide biosynthesis.
  • the DNA of the present invention includes not only the DNA but also a variant thereof, which hybridizes to the DNA under stringent conditions and participates in the biosynthesis of pragenolide.
  • a variant include a continuous base sequence from base 8340 to base 27935 of SEQ ID NO: 1, a continuous base sequence of base 28021 to base 49098 of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1
  • the DNA involved in the biosynthesis of the pragenolide of the present invention can be obtained by a known method based on the information.
  • DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is erased with an appropriate restriction enzyme, and DNA digested by the method described in Molecular 'Cloning 2nd Edition' is separated and recovered, and an oligonucleotide used as a probe or primer is obtained.
  • the obtained DNA fragment is preferably labeled with digoxigenin or the like.
  • digoxigenin it is preferable to use the DIG Labeling & Detection Kit (Roche Dynastic).
  • a library is prepared from the cells of microorganisms capable of producing pragenolide using the genomic cloning method or the cDNA cloning method described in Molecular Cloning, Second Edition, etc. From the obtained library, select the clone (colony) to be hybridized with the probe prepared earlier. The plasmid is extracted from the selected clone according to the method described in Molecular Cloning, 2nd edition, and DNA involved in the biosynthesis of the target pragenolide can be obtained from the obtained plasmid.
  • the extracted plasmid contains only a partial fragment of DNA involved in the biosynthesis of pragenolide, it can be obtained by digesting the extracted plasmid with an appropriate restriction enzyme such as BamHI.
  • a plasmid restriction enzyme map is prepared and prepared in accordance with conventional methods. Next, the restriction enzyme fragment that is common to several clones is found from the restriction enzyme map, and the cloned DNA fragments are joined together at the overlapping part, so that the entire DNA involved in the biosynthesis of bradienolide can be obtained. DNA containing can be obtained.
  • DNA involved in the biosynthesis of pragenolide can be obtained by directly performing a PCR reaction using the library and primers described above and directly amplifying the target DNA.
  • the base sequence of DNA encoding a polypeptide involved in the biosynthesis of pragenolide can be determined by a commonly used base sequence analysis method such as the dideoxy method [Proc. Natl Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] or 373A It can be determined by analysis using a base sequence analyzer such as DNA Sequencer (manufactured by Paikkin Elma). Specifically, double-stranded plasmid DNA can be used directly as a variant of a cycle sequence reaction using various sequence-specific oligonucleotide primers, or the DNA fragment can be fragmented and transferred to bacteriophage M13.
  • a base sequence analyzer such as DNA Sequencer (manufactured by Paikkin Elma).
  • double-stranded plasmid DNA can be used directly as a variant of a cycle sequence reaction using various sequence-specific oligonucleotide primers, or the DNA fragment can be fragmented and transferred to bacteriophage M
  • a duplicate library is created by introducing deletions sequentially from the end of the DNA fragment, and then each individual recombinant DNA fragment is converted into a vector sequence.
  • DNA sequences can be determined using a specific oligonucleotide primer.
  • the target DNA can be prepared by chemical synthesis using a DNA synthesizer such as an 8905 DNA synthesizer (manufactured by Perspective Biosystems). . Organize, edit and analyze the obtained base sequence data using existing software such as software development It can be performed using GenetyxTM manufactured by the company.
  • a DNA synthesizer such as an 8905 DNA synthesizer (manufactured by Perspective Biosystems).
  • the polypeptide of the present invention can be produced by expressing the DNA of the present invention in a host cell using the method described in Molecular 'Cloning 2nd Edition, Current' Protocols 'in' Molecular Biology, etc. be able to.
  • the site for incorporating the DNA of the present invention or a variant thereof may be either on the plasmid or chromosome of the host microorganism.
  • Such a plasmid may contain an autonomously replicating sequence, a promoter sequence, a terminator sequence, a drug resistance gene, and the like in addition to the DNA or a modified form thereof.
  • the plasmid may be an integrative plasmid having a sequence homologous to a certain region of the genome of the host to be used.
  • the host / plasmid-vector system for expressing the polypeptide encoded by the DNA of the present invention may be any system as long as these DNAs are stably retained and expressed.
  • the autonomously replicating vector pi J6021 (Gene 166, 133-137 (1995)) or the chromosomal integration vector KC515 [The bacteria, vol. 9. Antibiotic-producing Streptorayces (ed: Queener, SE and Day, LE). P. 119-158. Academic Press, Orlando, Fgla.].
  • a normal enzyme isolation and purification method can be used as a method for isolating and purifying the polypeptide produced by the transformant of the present invention.
  • a normal enzyme isolation and purification method can be used.
  • the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, an ultrasonic crusher, a French press, a manton. Crush the cells with a Gaurin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract. From the supernatant obtained by centrifuging the obtained cell-free extract, a purified sample can be obtained by a conventional enzyme isolation and purification method.
  • the polypeptide of the present invention can be obtained by chemical synthesis methods such as the fluorenylmethyloxycarbonyl method (Fmoc method) and the t-butoxycarbonyl method (t_Boc method).
  • Fmoc method fluorenylmethyloxycarbonyl method
  • t_Boc method t-butoxycarbonyl method
  • Pragenolide can be produced by culturing in the ground, producing and accumulating pragenolide in the culture, and collecting pueenolide from the culture.
  • the culture conditions are not particularly limited, but conform to the normal culture conditions of the host.
  • the carbon chain size of the polyketide basic skeleton and the functional group at the 3-position carbon in the condensation process are changed. be able to.
  • pldB of Mer-11107 which is a strain that mainly produces bradienolide B
  • ME-265 which is a 6-position deoxy form of pragenolide B.
  • mutating pldB there can be mentioned a method of substitution or conversion by homologous recombination according to a conventional method described in Molecular Cloning 2nd edition and the like.
  • a specific pragenolide can be produced according to the production method of pragenolide B using a strain that has been capable of preferentially producing the obtained pragenolide.
  • DNA encoding a polypeptide involved in the biosynthesis of macrolide compound pragenolide can be isolated and its base sequence determined. Furthermore, a plasmid carrying the DNA and a transformant transformed with the plasmid can be prepared, and pragenolide can be efficiently produced using the transformant. Furthermore, by modifying or altering the DNA sequence obtained, the type of carboxylic acid incorporated, the modification reaction after condensation, the modification reaction after skeleton formation, or any combination thereof can be modified to make a new or specific Production of brazienolides becomes possible.
  • FIG. 1 shows the biosynthesis pathway of pragenolide in Mer-11107 strain.
  • Fig. 2 shows the correspondence between each 0RF of DNA involved in the biosynthesis of pragenolide and cosmids in the Mer-11107 strain.
  • FIG. 3 is a diagram showing the structure of pKU253.
  • Example 1 Culture of Mer-11107 strain and acquisition of genomic DNA
  • Streptomyces sp. (Streptomyces sp.) Mer-11107 mycelium was inoculated into 25 ml of Tryptic Soy Broth and cultured with shaking at 28 ° C for 3 days. From the resulting culture solution, genomic DNA was prepared according to the method described in the Isolation genomic DNA (P162-170) of Actinomycetes Genetic Experiment Practical Streptomyces Genetics (The John Innes Foundation, Norwich, England, 2000) of DA Hopwood et al. did.
  • KS-3F 5'-GACCGCGGCTGGGACGTGGAGGG-3 '(SEQ ID NO: 10)
  • KS-4R 5'-GTGCCCGATGTTGGACTTCAACGA-3 '(SEQ ID NO: 1 1)
  • dNTP mixed solution (2.5 mM each for dATP, dGTP, dTTP, dCTP) 16 ⁇ 1
  • the 930b DNA fragment amplified as a result of this reaction was electrophoresed on a 0.8 ° / 0 agarose gel, the separated 930b DNA fragment was excised, and the DNA was recovered and purified using SUPREC_01 (Takara Shuzo). Furthermore, the 930b DNA fragment containing the keto synthase coding region was re-amplified under the same reaction conditions as described above except that 10 ng of the obtained DNA fragment was used as a saddle and the number of reaction cycles was 20 cycles. A 50 1 TE solution obtained by concentrating and purifying this DNA fragment using SUPREC-02 (Takara Shuzo) was used as a probe solution.
  • cytochrome P450 gene probes Two known cytochrome P450 genes were amplified from actinomycetes. That is, in order to amplify the 0RF-A gene (Biosci. Biotechnol. Biochem. 59: 582-588, 1995) derived from Streptomyces thermotolerans ATCC11416, the bases shown in the following SEQ ID NOs: 12 and 13 respectively. Two primers consisting of sequences, namely CB-1F and CB-2R, were synthesized.
  • CB-1F 5 '-ATGACAGCTTTGAATCTGATGGATCCC-3' (SEQ ID NO: 1 2)
  • CB-2R 5 '-TCAGAGACGGACCGGCAGACTCTTCAGACG-3' (SEQ ID NO: 1 3)
  • PKC-1F 5'-GTGCGCCGTACCCAGCAGGGAACGACC-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • PKC-2R 5'-TCACGCGCTCTCCGCCCGCCCCCTGCC-3 '(SEQ ID NO: 15)
  • dNTP mixed solution (2.5 mM each for dATP, dGTP, dTTP, dCTP) 16 ⁇ 1
  • Example 4 Screening using a probe containing keto synthase coding region Using the packaging solution of the genomic DNA library of Mer-11107 prepared in Example 2, Escherichia coli XL-lBlue MR (Stratagene) was used as the host. And transduction was performed according to the Stratagene manual. Dissolve the bacterial solution after transduction into 10 LB-50 // g / ml ampicillin-1.5% agar dishes (inner diameter 90, height 15 mm), and incubate at 37 ° C for 18 hours did. The colonies grown in each petri dish were treated with alkali and neutralized under the conditions described in the manual attached to HybondoN + Fino Letter (amersham biosciences) The colony-derived DNA was immobilized on the filter by drying for a while.
  • Example 3 Flow through the 930b DNA fragment lOOng containing the keto synthase region prepared in Example 3 (1) and use AlkPhos Direct System araersham biosciences) to screen the genomic DNA library using the colony hybridization method. Ninged. Hybridization was performed at a salt concentration of 0.5M NaCl for 2 hours at 65 ° C. The conditions for probe DNA labeling, hybridization and detection were as described in the manual attached to the AlkPhos Direct System. Of the approximately 7,600 colonies tested, 59 colonies strongly hybridized with the alkaline phosphatase-labeled probe were isolated. Cosmids were extracted and purified from E. coli clones derived from these colonies.
  • Example 5 Confirmation of selection of cosmid clone having pragenolide biosynthesis gene region using probe containing cytochrome P450 gene region
  • pKS58 DNA was partially digested with the restriction enzyme Sau3AI, ligated to phage vector I Zap Express, BamHI-CIAP-treated (Stratagene), and packaged into lambda phage using Gigapack III XL Kit (Stratagene). This phage solution was infected with E. coli XL1-Blue MRF 'to form plaques. Plaque hybridization was performed using the cytochrome P450 gene probe prepared in Example 3 (2), so that a DNA fragment containing about 2 kb cytochrome P450 gene was subcloned.
  • the cytochrome P450 gene DNA fragment was sequenced, and from the N-terminal and C-terminal, which are cytochrome P450 coding regions, the following SEQ ID NO: 16 and And two primers consisting of the nucleotide sequences shown in FIGS. 1 and 7, namely, PDL58-1F and -PDL58-2R were synthesized.
  • PDL58-1F 5'-GCCCCGCATATGGATCTGGAAACCCAACTTCTC-3 '(SEQ ID NO: 16)
  • PDL58-2R 5'-GCACTAGTCAGCCGCGCTCGACGAGGAGGTG-3 '(SEQ ID NO: 17)
  • dNTP mixed solution (2.5 mM each for dATP, dGTP, dTTP, dCTP) 16 ⁇ 1
  • the 1.2 kb DNA fragment amplified as a result of this reaction was purified with QIAGEN PCR Purification Kit (QIAGEN) and then digested with restriction enzymes Ndel and Spel. After the reaction, the DNA was electrophoresed on a 0.8% agarose gel, the separated 1.2 kb DNA fragment was excised, and the DNA was recovered and purified using QIAGEN Gel Extraction Kit (QIAGEN).
  • This DNA fragment was constructed PPDL9 6 by inserting into the Ndel Oyopi Spel site of the cytochrome P450 gene expression plasmid pT7NS- camAB (Japanese Patent Application No. 2002- 110311).
  • E. coli BL21 (DE3) was transformed with this plasmid, and M9CG medium (1.28%
  • the bacterial cells were collected and suspended in 5 ml of CV buffer [50 mM sodium phosphate buffer ( PH 7.3), ImM EDTA, 10% glycerol, ImM gnolecose]. Take 1 ml of this solution in a test tube, add 5 ⁇ l of DMS0 solution (50 mg / l) of pragenolide B 6-positioned deoxy compound, MS-265, and incubate at 28 ° C for 15 hours.
  • CV buffer 50 mM sodium phosphate buffer ( PH 7.3), ImM EDTA, 10% glycerol, ImM gnolecose.
  • Retention time ME-265; 20 minutes, Pradienolide B; 13 minutes,
  • Example 6 Selection of cosmid containing biosynthetic gene cluster adjacent to cytochrome P450 gene
  • Example 4 cosmids containing a biosynthetic gene cluster adjacent to the cytochrome P450 gene obtained in Example 5 were selected.
  • KS domain DNA (aveA2 KS6 domain), AT domain DNA ( Southern hybridization using the cytochrome P450 gene obtained in Example 5 as a probe was performed.
  • cosmids Based on the electrophoresis pattern of DNA digested with restriction enzymes EcoRI and BamHI and the hybridized band pattern of each probe, we first grouped cosmids with DNA fragments hybridized at the same length. Among them, the cosmids that showed almost the same pattern were deleted except for one, and the remaining cosmids that were partially matched in the pattern were aligned. Then, centering on the cosmid pKS58 containing the cytochrome P450 gene obtained in Example 5, pKS56 and pKS54 were selected as cosmids adjacent to the side containing the polyketide synthase gene from the cytochrome P450 gene side, and pKS54 PKS35 was selected as a cosmid adjacent to.
  • cosmid pKS58 and cytochrome P450 gene side did not contain polyketide synthase gene! /
  • pKS23 was selected as a cosmid adjacent to the side.
  • pKS23, pKS58, pKS56, pKS54, and .pKS35 were selected as cosmid clones encompassing the pragenolide biosynthesis gene cluster as shown in FIG.
  • Example 7 Preparation of a pragenolide biosynthetic gene cluster-breaking strain Of the cosmids selected in Example 6, preparation of a biosynthetic gene-disrupted strain using pKS56 DNA, which is thought to contain the polyketide synthesis region Went.
  • shuttle vector PKU253 was used.
  • p56aadA was digested with the restriction enzyme EcoRI, and 14 kb each containing no cosmid vector portion was separated by agarose gel electrophoresis, and purified using the Gene Clean II kit (Bio 101).
  • the resulting 14 kb EcoRI fragment was ligated with the shuttle vector pKU253 digested with EcoRI using the NEB quick ligation kit to obtain pKU253-56aadA.
  • PKU253 is a plasmid SCP2 derived from Streptomyces coel icolor A3 (2) as shown in Fig. 3.
  • the obtained pKU253-56aadA was transformed into conjugated Escherichia coli S17-1 (ATCC47055) using the electrovolution method to obtain the S17-l / pKU253-56aadA strain.
  • the obtained S17-l / pKU253-56aadA strain was mixed with 25 / xg / ml kanamycin and 200 ⁇ g / ml spectinomycin LB medium (1% butatotryptone, 0.5% yeast extract, 0.
  • the cells were inoculated into 10 ml of 5% NaCl), shake-cultured at 30 ° C. for 2 hours, collected, washed twice with 10 ml of LB medium, and suspended in 5 ml of LB medium. This was used as a donor cell suspension.
  • the Mer-11107 strain is inoculated into 10 ml of TSB medium (Trypto-Soya broth: Nissui Pharmaceutical), shaken at 30 ° C for 5 hours, and then collected. The plate was washed twice with 10 ml of sterile water and then suspended in 1 ml of sterile water. This was used as a recipient bacterial suspension.
  • the obtained pKU253-56aadA transformant was inoculated into 10 ml of TSB medium not containing ribostamycin and cultured with shaking at 30 ° C for 24 hours.
  • Brass vector PKU253 has poor replication efficiency in strain Mer, France 11107, when cultured in medium containing no drug resistance marker one (Ribosutama leucine), Mer - 11107 strain such can hold PKU 25 3 les.
  • the PKU253-56aadA transformant culture solution was collected, washed twice with 10 ml of sterilized water, and suspended in 10 ml of sterilized water. Appropriately diluted suspension was added to a YMS agar medium (0.4% yeast extract, 1% malt extract, 0.4% soluble starch, 2% agar, 10 mM chloride) containing 200 g / ml spectinomycin. And incubated at 30 ° C for 4 days.
  • a single rice cake grown on a YMS agar medium containing spectinomycin is transferred to a YMS agar medium containing 200 ⁇ g / ml ribostamycin and 200 ⁇ g / ml YMS agar medium containing spectinomycin.
  • the cells were cultured at 30 ° C for 2 days.
  • the obtained strain was designated as Mer-1110-56 :: aadA strain.
  • Example 8 Bragenolide productivity test of pragenolide biosynthetic gene cluster single disruption strain
  • Example 7 - 11107-56 aadA strain and a controller port Lumpur parent strain Mer, France 11107 strain and the total of three strains of Mer_11107 / pKU 2 53 strains of transformants, the plug Jienoraido B Productivity was tested.
  • the Mer-11107-56 aadA strain obtained in Example 7 and the frozen seed mother 200 W 1 of each of the Mer-11107 strain and the Mer-11107 / pKU253 strain were added to a seed medium (soluble starch 2%, S Sunmeet 2%, yeast extract 0.5%, K 2 HP0 4 0. 1%, MgS0 4 ⁇ 7H 2 0 0. 25%, CaC0 3 0. 3% pH unadjusted) Inoculated into 20ml, 25 ° C For 2 days.
  • a seed medium soluble starch 2%, S Sunmeet 2%, yeast extract 0.5%, K 2 HP0 4 0. 1%, MgS0 4 ⁇ 7H 2 0 0. 25%, CaC0 3 0. 3% pH unadjusted
  • the culture medium stabilizer rose 5%, Darko one scan 1% Fuarumamedi Ryo 3 0/0, ⁇ -. Cyclodextrin 2%, CaC0 3 0. 1% pH7 5 ) Inoculated into 30 ml and cultured at 25 ° C for 4 and 5 days.
  • Example 9 Determination of the base sequence of the pragenolide biosynthesis gene cluster The base sequence of a group of DNAs encoding the pragenolide biosynthesis gene was determined. From Example 8, the A-site-deficient strain in FIG. 2 cannot produce pradienolide B, and therefore the gene in the A site is related to the biosynthesis of pragenolide. Therefore, for the four cosmids pKS35, pKS54, pKS58 and pKS23 selected in Example 6, the nucleotide sequences of the inserted DNA fragments in these cosmids were determined.
  • the resulting subclone is subjected to a cycle sequence reaction (amersham biosciences) using fluorescently labeled primers, and the base sequence of each fragment is determined (MegaBACE 1000: amersham biosciences) to synthesize pragenolide.
  • a base sequence of about 75 kb containing DNA related to was determined (see SEQ ID NO: 1).
  • pldA II base 28021-49098
  • pldA IV Base 60269-65692
  • pldB Base 65707-66903
  • pldD Base 69568-68270
  • pldR Base 72725-7020
  • Figure 2 shows the correspondence between each 0RF and cosmid.
  • Pradienolide is biosynthesized in the biosynthetic pathway shown in Figure 1 from the approximately 75 kb base sequence (see SEQ ID NO: 1) containing DNA related to the biosynthesis of pragenolide determined in Example 9. It became clear. Therefore, by destroying only pldB of the cytochrome P450 gene, it is considered possible to obtain a strain that produces only ME-265, the 6th-positioned dexogen of pladienolide B. Strains were created.
  • P ldB-L-Bgl2F 5 '-GGGAGATCTAGAGGCCGGTTACCTCTACGAGTA- 3'
  • pldB- L- Hind3R 5,--GGGAAGCTTGCGATGAGCTGTGCCAGATAG- 3
  • pldB- R- Hind3F 5 '-GGGACGTT 3
  • pldB- R- 3 ⁇ 412R 5, -GGGAGATCTGCAGCGGATCGTCTTCGAGACCCTT-3 '(SEQ ID NO: 2 1)
  • dNTP mixed solution (2.5 mM each for dATP, dGTP, dTTP, dCTP) 16 ⁇ 1
  • pldB-L-Hind3R or pldB_R- Bgl2R 50 pmol/1) ⁇ ⁇ ⁇
  • DNA fragment L1 containing base 66756 to base 66302 of SEQ ID NO: 1 was amplified and P From a reaction using ldB-R-Hind3F and pldB-R-Bgl2R, a DNA fragment (DNA fragment R1) of 1 ⁇ 54 kb containing base 68368 to base 68368 was amplified from SEQ ID NO: 1.
  • DNA fragments L1 and R1 were purified with QIAGEN PCR purification Kit (QIAGEN) and then digested with restriction enzymes Bglll and Hindlll.
  • a hygromycin B resistance gene was inserted between DNA fragments L1 and R1, and an approximately 5.4 kb DNA fragment inserted into PKU253 was constructed into an approximately 21.4 kb plasmid pKU253-Ll-hyg-R1. It was done.
  • the obtained pKU253-LI-hyg-R1 was transformed into conjugated Escherichia coli S17-1 using the electroporation method to obtain a .S17-l / pKU253-Ll-hyg-Rl strain.
  • the obtained S17-l / pKU253-Ll-hyg-Rl strain was added to LB medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast containing 25 ⁇ g / ml kanamycin and 100 / zg / ml hygromycin B.
  • E. C., 0.5% NaCl was inoculated into 10 ml, collected by shaking at 30 ° C. for 2 hours, collected, washed twice with 10 ml of LB medium, and suspended in 5 ml of LB medium. This was used as a donor cell suspension.
  • the obtained pKU253-L ⁇ hyg-Rl transformed strain was inoculated into 10 ml of TSB medium not containing ribostamycin and cultured with shaking at 30 ° C for 24 hours.
  • the pKU253-Ll_hyg-R1 transformation strain culture solution was collected, washed twice with 10 ml of sterile water, and suspended in 10 ml of sterile water. Appropriately diluted suspension was added to YMS agar containing 200 g / ml hygromycin B
  • the obtained strain is a pldB disruption strain in which 546 bp (base 66303 to base 66848 of SEQ ID NO: 1) have been deleted and a hygromycin B resistance gene has been inserted between them. 11107 pldB :: hyg strain.
  • Example 11 1 Prajenolide 6-position hydroxylase gene (pldB) pragenolide productivity test of a disrupted strain
  • Example 11 Mer-11107 pldB hyg strain frozen seed mother 200 ⁇ 1 obtained in 0 was added to seed medium (soluble starch 2%, essan meat 2%, yeast extract 0.5%, K 2 HP0 4 0. 1%, MgS0 4 - 7H 2 0 0. 25%, was inoculated into CaC0 3 0. 3% pH unadjusted) 20 ml, and cultured for 2 days at 25 ° C.
  • seed medium soluble starch 2%, essan meat 2%, yeast extract 0.5%, K 2 HP0 4 0. 1%, MgS0 4 - 7H 2 0 0. 25%
  • 300 ml of the seed culture solution obtained was added to 30 ml of the main culture medium (Stabilose 5%, Darcos 1%, Pharmamedy 3%, ⁇ -cyclodextrin 2%, CaC0 3 0.1% pH 7.5) Inoculated and cultured at 25 ° C for 4 and 5 days.
  • the main culture medium Stilose 5%, Darcos 1%, Pharmamedy 3%, ⁇ -cyclodextrin 2%, CaC0 3 0.1% pH 7.5
  • Example 1 2 Isolation and purification of ME-265 and confirmation of structure
  • TLC thin layer chromatograph
  • Example 13 Production of a pragenolide 7-position acylating enzyme gene (pldC) disruption strain
  • pldB- L- Bgl2F 5 '-GGGAGATCTAGAGGCCGGTTACCTCTACGAGTA-3' (SEQ ID NO: 1 8) pldC-L-Hind3R: 5 '-GGGAAGCTTCCAGTCTCGTGCTCACCAA-3' (SEQ ID NO: 2 2) pldC-R-Hind3F: 5 '-TGGAAGGATAGGCC '(SEQ ID NO: 2 3) pldC-R-Bgl2R: 5' -GGGAGATCTGCAGCCTCATCCTCACCGAGCTGAA-3 '(SEQ ID NO: 2 4)
  • dNTP mixed solution (2.5 mM each for dATP, dGTP, dTTP, dCTP) 16 ⁇ 1
  • pldB-L- Bgl2F or pldC_R- Hind3F 50 pmol/ l
  • DNA fragment L2 a DNA fragment of about 2.5 kb containing nucleotides 64756 to 67220 of SEQ ID NO: 1
  • DNA fragment R2 an approximately 3.
  • DNA fragment R2 comprising base 68112 to base 71112 of SEQ ID NO: 1 was amplified.
  • DNA fragments L2 and R2 were purified with QIAGEN PCR purification Kit (QIAGEN) and then digested with restriction enzymes Bglll and Hindlll.
  • the shuttle vector pKU253 (see Fig. 3) digested with the restriction enzyme BamHI was ligated with DNA ligation kit ver. 2.1 (Takara Shuzo).
  • the obtained S17-l / pKU253-L2-hyg-R2 strain was added to LB medium (1% bactotryptone, 0.5%) containing 25 ⁇ g / ml kanamycin opi 100 ⁇ g / ml hygromycin B.
  • LB medium 1% bactotryptone, 0.5%) containing 25 ⁇ g / ml kanamycin opi 100 ⁇ g / ml hygromycin B.
  • Yeast extract, 0.5% NaCl was inoculated into 10 ml, shake-cultured at 30 ° C. for 2 hours, collected, washed twice with 10 ml of LB medium, and suspended in 5 ml of LB medium. This was used as a donor cell suspension.
  • the Mer-11107 strain was inoculated into 10 ml of TSB medium (Trypto-Soya broth: Nissui Pharmaceutical), shaken at 30 ° C for 5 hours, and collected. The plate was washed twice with 10 ml of sterile water and then suspended in 1 ml of sterile water. This was used as a recipient bacterial suspension.
  • the obtained S17-1 / pKU253-L2-hyg-R2 strain suspension 500 ⁇ 1 was mixed with Mer_11107 strain suspension 101 and put into Actino Medium No, 4 agar medium (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.). Painted. After culturing at 30 ° C.
  • the obtained pKU253-L2-hyg-R2 transformed strain was inoculated into 10 ml of TSB medium not containing ribostamycin and cultured with shaking at 30 ° C for 24 hours.
  • the pKU253-L2-hyg-R2 transformation strain culture solution was collected, washed twice with 10 ml of sterilized water, and suspended in 10 ml of sterilized water.
  • suitable Dilute the suspension into YMS agar containing 200 ⁇ g / ml hygromycin B ''
  • the obtained strain is a pldC spoilage strain in which 886 bp (base 67221 to base 68105 in SEQ ID NO: 1) have been deleted and a hygromycin B resistance gene has been inserted between them. 1110 7 pldC:: hyg strain.
  • Example 14 4 Pragenolide productivity test of pragenolide 7-position asylating enzyme gene (pldC) sorghum strain
  • the frozen seed mother 200 ⁇ 1 of Mer-11107 pldC :: hyg strain obtained in Example 1 3 was added to the seed mother medium (soluble starch 2%, essan meat 2%, yeast extract 0.5%, K 2 HP0 4 0. 1%, MgS0 4. 7H 2 0 0. 25%, was inoculated into CaC0 3 0. 3% pH unadjusted) 20 ml, and cultured for 2 days at 25 ° C.
  • the obtained seed culture solution was added to the main culture medium (Stabilose 5%, Darcos 1%, Pharmamedia 3 %, ⁇ -cyclodextrin 2%, CaC0 3 0.1% pH 7.5. ) Inoculated to 30 ml and cultured at 25 ° C for 4 days and 5 days.
  • the main culture medium Stilose 5%, Darcos 1%, Pharmamedia 3 %, ⁇ -cyclodextrin 2%, CaC0 3 0.1% pH 7.5.
  • Example 16 Preparation of a 18- and 19-position epoxidase gene (pldD) -destroying strain of pragenolide
  • Pradienolide is biosynthesized in the biosynthetic pathway shown in Figure 1 from the approximately 75 kb base sequence (see SEQ ID NO: 1) containing DNA related to the biosynthesis of pragenolide determined in Example 9. It became clear. Therefore, by destroying the 18- and 19-position epoxidase gene (pldD) and suppressing the expression of the 7-position asylation enzyme gene (pldC) downstream of it, pragenolide 7-position deacylation, 18- and 19-position olefins PldD sorghum strain was prepared by the following method.
  • pldD- L- Bgl2F 5 '-GGGAGATCTAGACCTGTCCATGGATCTGGAAAC -3'
  • pldD-L-Hind3R 5 '-GGGAAGCTTCGGATCGTCTTCGAGACCCTT -3'
  • pldD- R- Hind3F 5, -GGGAAGTTTGTGGGGC
  • pldD-R-Bgl2R 5, -GGGAGATCTGCAGGAGGAGCTGCTCGGGCTGAA -3
  • PCR was performed using these primers under the following conditions.
  • dNTP mixed solution (2.5 mM each for dATP, dGTP, dTTP, dCTP) 16 ⁇ 1
  • pldD-L- Bgl2F or pldD- R-Hind3F 50 pmol/ ⁇ 1) ⁇ ⁇ ⁇
  • pldD-L-Hind3R or pldD- R- Bgl2R 50 pmol/ / _t 1) ⁇ ⁇ ⁇
  • DNA fragment L3 of approximately 2 ⁇ 7 kb containing base 68700 to base 68368 of SEQ ID NO: 1 was amplified, and pldD- From the reaction using R-Hind3F and pldD-R-Bgl2R, an approximately 2.4 kb DNA fragment (DNA fragment R3) containing base 69951 to base 71951 of SEQ ID NO: 1 was amplified.
  • DNA fragments L3 and R3 were purified with QIAGEN PCR purification Kit (QIAGE) and then digested with restriction enzymes Bglll and Hindlll.
  • Hindlll derived from pHHP45omegahyg: Gene 190, 315-317, 1997.
  • hyg And the shuttle vector pKU253 digested with the restriction enzyme BamHI, were ligated with DNA ligation kit ver. 2.1 (Takara Shuzo).
  • globulin B containing LB medium ⁇ % pacttryptone, 0.5% yeast extract, 0.5
  • the cells were inoculated in 10 ml of (NaCl), shake-cultured at 30 ° C for 2 hours, collected, washed twice with 10 ml of LB medium, and suspended in LB medium 5ral. This was used as a donor cell suspension.
  • the Mer-11107 strain was inoculated into 10 ml of TSB medium (Trypto-Soya broth: Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), shaken at 30 ° C for 5 hours, and collected. The plate was washed twice with 10 ml of sterile water and then suspended in 1 ml of sterile water. This was used as a recipient bacterial suspension.
  • the obtained S17-1 / pKU253-L3-hyg-R3 strain donor suspension 500 ⁇ 1 was mixed with Mer-11107 recipient suspension 10 ⁇ 1, and Actino Medium No. 4 agar medium (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) Applied).
  • the obtained pKU253-L3-hyg-R3 transformant was inoculated into 10 ml of TSB medium not containing ribostamycin and cultured with shaking at 30 ° C for 24 hours.
  • the pKU253-L3-hyg_R3 transformation strain culture solution was collected, washed twice with 10 ml of sterilized water, and suspended in 10 ml of sterilized water. Appropriately diluted suspension was added to YMS agar medium containing 200 ⁇ g / ml hygromycin B.
  • the obtained strain is a pldD destructive strain in which 1146 bp (base 68369 to base 69513 of SEQ ID NO: 1) has been deleted and a hygromycin B resistance gene has been inserted between them.
  • -11107 pldDC : Hyg strain.
  • Example 1 Pragenolide productivity test of pragenolide 18th and 19th epoxidase gene (pldD) disrupted strain
  • Medium soluble starch 2%, essan meat 2%, yeast extract 0.5%, K 2 HP0 4
  • the seed culture solution obtained was added to the main culture medium (Stabilose 5%, Darcos 1%, Pharmamedia 3 %, Cyclodextrin 2%, CaC0 3 0.1% pH 7.5) 30ml And cultured at 25 ° C for 4 and 5 days.
  • the main culture medium Stilose 5%, Darcos 1%, Pharmamedia 3 %, Cyclodextrin 2%, CaC0 3 0.1% pH 7.5
  • the acetonitrile extract obtained in Example 17 was filtered and further washed with water 1 (1 ⁇ 21 and 10 ml of ethyl acetate.
  • the filtrate was extracted by adding 40 ml of saturated saline and 90 ml of ethyl acetate, and 50 ml of saturated saline.
  • pragenolide Z could be produced and obtained by the above method.

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Abstract

本発明は、マクロライド系化合物プラジエノライドの生合成に関与するポリペプチドおよびそれらのポリペプチドをコードするDNAおよびそれらの改変体、並びにそれらDNAおよびそれらの改変体の一部または全体を保持する形質転換体、およびそれらの形質転換体を用いたマクロライド系化合物プラジエノライドの製造方法を提供する。詳しくは、プラジエノライドの生合成に関与するポリペプチドをコードする少なくとも１個の領域を含んでなる単離された純粋なDNA、このDNAによりコードされるポリペプチド、このDNAを担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド、このDNAを保持する形質転換体、並びにこの形質転換体を培地で培養し、その培養液からプラジエノライドを採取することを特徴とする、プラジエノライドの製造方法である。

Description

プラジェノライドの生合成に関与するポリペプチドをコードする DNA
技術分野
本発明は、 マクロライド系化合物プラジェノライ ドの生合成に関与するポリ ぺプチドおよびそれらのポリぺプチドをコードする DNAおよびそれらの改変体 に関する。 さらには、 それら DNAおよびそれらの改変体の一部または全体を保 持する形質転換体、 およびそれらの形質転換体を用いたマクロライド系化合物 プラジェノライドの製造方法に関する。 従来技術
放線菌の生産する様々な代翻す産物のなかには生理活性物質として重要な物質 が見出されている。 とりわけ構造上ポリケチドを母核にもつ化合物 （以下、 ポ リケチド化合物という） が多く見出されている。 例えば、 抗菌性物質として知 られるエリスロマイシン、 ジョサマイシン、 タイ口シン、 ミデカマイシン、 マ イシナマイシン、 抗真菌性物質.として知られるナイスタチン、 アンフォテリシ ン、 殺虫性物質として知られるミルべマイシン、 ェパーメタチン、 免疫抑制物 質として知られるタクロリムス、 ラパマイシンおよび抗腫瘍性物質として知ら れるダウノマイシン、 アドリアマイシン、 アクラシノマイシンなどのように 種々の生物活性を有する化合物が知られている。
そのような化合物の 1つとしてプラジェノライドと命名された優れた抗腫瘍 活性を示す一群のマクロライド系化合物がある。 プラジェノライドは、 放線菌 ストレプトマイセス ·エスピー（Streptomyces sp. ) Mer- 11107株の培養物から 見出された化合物群の総称であり、 下記式 (I)で示される 11107B (プラジェノ ライド B) をはじめとして 50種以上の類縁体が知られている（W002/060890)。
Figure imgf000003_0001
11107B (プラジェノライド B) 一方、 ポリケチド化合物の生合成機構についても多くのことが知られている。 上記の多種多様なポリケチド化合物は共通な生合成機構を共有していると言わ れており、 その機構は脂肪酸の生合成と極めて類似している。 即ち、 ポリケチ ド化合物の合成は酢酸やプロピオン酸などの低級脂肪酸が連続的に縮合し、 次 いで伸張したァシル基の ]3位のカルボ二ル基を脂肪酸合成と同様な方法で様々 にケトン還元、 脱水あるいはエノィル還元する工程により生合成される。 これ ら多くのポリケチド化合物の種々の反復的な合成工程はそれぞれの反応触媒活 性に必要な別々の活性部位 （ドメイン） を有する高分子の多機能酵素複合体に よって調節されると言われている。 ポリケチド生合成の一般的な反応様式は、 例えば、 Ann. Rev. Gen. , 24 (1990) 37- 66および Ann. Rev. Microbiol. , 47 (1993) 874 - 912に概説されている。
ポリケチド合成酵素をコードしている DNA配列は一般にポリケチド骨格合成 に必要なすべての活性をコードしており、 縮合工程と縮合後の修飾工程を含む 反復単位、 即ちモジュールに構成されていることが明らかにされている。 各々 の触媒活性は、 各縮合工程に含まれる特定のカルボン酸構成単位に対する特異 性に関与するかあるいは達成される特定の縮合後の修飾機能を規定する異なる 部位が関与している。 例えば Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 12111-12116 にはス卜レプ卜マイセス ·ベネズ工ラエ (Streptomyces venezuelae)
ATCC15439のピク口マイシン生合成に関わるポリケチド合成酵素をコードする 遺伝子について記載されている。 また W093/13663にはサッカロポリスポラ · エリスレア (Saccharopolyspora erythraea) のェリスロマィシンポリケチド 合成酵素をコードする遺伝子の構成が記载されている。 この遺伝子は 6つのモ ジュールから構成されており、 各モジュールが 1つの縮合工程を行う。 即ち、 了シル側鎖伸長の正確な配列と伸長している鎖の修飾は各モジュールに存在す る遺伝子情報によって決定される。
また、 多種多様なポリケチド化合物は、 ポリケチド合成酵素によりポリケチ ド骨格の合成が行われた後、 水酸化、 エポキシ化、 メチル化などの修飾反応を 触媒する酵素 （以下、 修飾酵素ということがある） により、 しばしば修飾を受 けて最終的な代謝産物に変換される。 これらの生産に関与する遺伝子群、 すな わち最終的な代謝産物を生合成するために必要な酵素のほ力、 生産調節に必要 な調節因子などをコードする遺伝子 （以下、 これらの生合成に関与する遺伝子 群を総称して単に 「生合成遺伝子」 と称することがある） は、 一般に生産菌の ゲノムまたはプラスミ ド上の DNA領域にクラスタ一を形成して配置されている ことが明らかにされている。
ポリケチド合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列情報が決定されれば、 そ の情報を基にして、 ドメインを改変することにより、 炭素鎖の大きさ、 縮合過 程の ]3位炭素の官能基を変化させることが可能となってくる。 例えば
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 7119 - 7123には、 エリスロマイシンのポリ ケチド合成酵素遺伝子内の特定ドメィンを選択的に不活化することにより、 ェ リスロマイシンの新規誘導体を生じさせることができると記載されている。 さ らに、 各モジュールのドメインを他のものと組み換えることにより、 予測可能 な新規の化合物を生産させることが可能となってくる。 例えば
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 1846 - 1851には、 エリスロマイシンのポリ ケチド合成酵素遺伝子内のドメィンをいくつか組み換えることで多種の新規化 合物ができることが記載されている。
また、 修飾酵素をコードする遺伝子 （以下、 修飾酵素遺伝子ということがあ る） を含んだ生合成遺伝子クラスターの塩基配列が決定されれば、 その情報を 基にして、 修飾酵素遺伝子を選択的に改変することにより、 予測可能な新規の 化合物を生産させることが可能となってくる。 例えば、 Science 252 (1991) 114-116には、 エリスロマイシンのポリケチド合成酵素遺伝子の近傍に存在す る水酸化酵素遺伝子 eryFを欠損させ ¾ことで新たな誘導体 6 -デォキシェリス ォノリ ド Bができることが記載されている。
さらに修飾酵素遺伝子の発現を活性化することで不要な副産物を減少させ、 単一の目的成分を生産させることも可能となる場合がある。 遺伝子発現の活性 化には一般的にはプロモーターを置換することによる転写活性化、 マルチコピ 一ベクターを用いた遺伝子コピー数の増加、 変異導入による遺伝子産物機能の 向上などによる方法が知られている。 また調節遺伝子を同様な方法で活性化さ せたり、 逆に不活性化させたりすることで生産性を高めることが可能となる場 合がある。
さらに、 これら生合成遺伝子クラスターをコードする遺伝子を取得し、 適当 な方法を用いて異種菌株に導入することで、 異種菌株による目的ポリケチド化 合物の生産ができる場合がある。 この時用いる異種菌株は、 微生物、 特に短期 間の培養が可能な大腸菌などを使うと有利である。 例えば Science 291 (2001) 1790-1792には、 大腸菌にポリケチド合成酵素遺伝子を組み込むことにより、 エリス口マイシン前駆体である目的の 6-デォキシェリスオノリ ド Bを効率よく 生産できることが記載されている。 発明の開示
本発明の課題は、 マクロライド系化合物プラジェノライドの生合成に関与す るポリぺプチドぉょぴそれらのポリペプチドをコードする DNAおよぴそれらの 改変体を提供することである。 さらには、 それら DNAおよびそれらの改変体の 一部または全体を保持する形質転換体、 およびそれらの形質転換体を用いたマ クロライド系化合物プラジェノライドの製造方法を提供することである。
本発明者らは、 上記課題を解決するため、 コロニーハイブリダィゼーシヨン 法に従って、 一般にポリケチド合成酵素のケト合成酵素領域 (keto synthase domain)において保存されていると言われてレ、る配列に基づいて調製したプロ ーブを用い、 マクロライド系化合物プラジェノライ ド生産菌であるストレプト マイセス ·エスピー（Streptomyces sp. ) Mer- 11107株（以下、 Mer- 11107株と いうことがある）から目的の DNAの取得を試みたが、 多数のコスミ ドが選択さ れ目的の DNAを直ちに同定することはできなかった。
そこで、 ポリケチド合成酵素遺伝子の近傍に修飾酵素遺伝子が存在する可能 性が高いことに着目し、 公知の放線菌から修飾酵素の 1つである水酸化酵素 (シトクロム P450酵素） の遺伝子断片を PCR法にて取得し、 これをプローブ とすることによりポリケチド合成酵素領域の配列に基づいて取得された多数の コスミ ドから目的の DNAを含むいくつかのコスミ ドを選択した。
一方、 Mer- 11107株は、 多種類のプラジェノライド類縁体を生産する能力を 有することから多数の修飾酵素の存在が推定される。 本努明者らは、 選択され たコスミ ド中に存在する水酸ィヒ酵素が、 これら多くの修飾酵素のうちの 6位水 酸化酵素であることを見出し、 さらに Mer- 11107株固有の性質であるプロ トプ ラストになりにくい、 あるいは常用される薬剤マーカーに耐性を有する等の遺 伝子工学を適用するためには不利になる性質を克服することにより、 初めて目 的の DNAを取得、 同定することに成功した。
すなわち、 本発明は、 以下の [ 1 ] 〜 [ 2 0 ] に関する。
[ 1 ] プラジェノライ ドの生合成に関与するポリペプチドをコードする少なく とも 1個の領域を含んでなる単離された純粋な DNA。
[ 2 ] プラジェノライドの生合成に関与するポリペプチドをコードする全ての 領域を含んでなることを特徵とする、 [ 1 ]記载の1) 。
[ 3 ] プラジェノライ ドの生合成に関与するポリペプチドが、 ポリケチド合成 酵素、 6位水酸化酵素、 7位ァシル化酵素、 18， 19位エポキシ化酵素および転 写調節因子から選ばれる少なくとも 1種であることを特徴とする、 [ 1 ]または [ 2 ]記載の0 。
[ 4 ] ストレプトマイセス（Streptomyces)属に属する微生物に由来することを 特徴とする、 [ 1 ]から [ 3 ]までのいずれかに記載の DNA。
[ 5 ] 以下の（1)項から（5)項までのいずれかの項で定義された塩基配列から選 択された少なくとも 1個の塩基配列を含んでなる、 [ 1 ]記載の1) 。
(1) 以下の（a)項から（i)項までのいずれかの項で定義された塩基配列、
(a) 配列番号 1の塩基 8340から塩基 27935までの連続した塩基配列
(b) 配列番号 1の塩基 28021から塩基 49098までの連続した塩基配列
(c) 配列番号 1の塩基 49134から塩基 60269までの連続した塩基配列
(d) 配列番号 1の塩基 60269から塩基 65692までの連続した塩基配列
(e) 配列番号 1の塩基 65707から塩基 66903までの連続した塩基配列
(f) 配列番号 1の塩基 68160から塩基 66970までの連続した塩基配列
(g) 配列番号 1の塩基 69568から塩基 68270までの連続した塩基配列
(h) 配列番号 1の塩基 72725から塩基 70020までの連続した塩基配列
(i) 配列番号 1の塩基 1から塩基 74342までの連続した塩基配列
(2) (1)項において定義されたいずれかの塩基配列を含む DNAとストリンジェ ントな条件下でハイプリダイズする DNAが有する塩基配列
(3) (1)項において定義されたいずれかの塩基配列との相同性が 70%以上であ る塩基配列
(4) (1)項から（3)項までのいずれかの項で定義されたいずれかの塩基配列と 相補的な塩基配列
(5) 遺伝暗号の縮重のため、 （1)項において定義された塩基配列を含む DNAと ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズしないが、 （1)項から（3)項までの いずれかの項で定義された塩基配列と同じアミノ酸配列をコードする塩基配列 [ 6 ] 以下の（a)項から（i)項までのいずれかの項で定義された塩基配列から選 択された少なくとも 1個の塩基配列を含んでなる、 [ 1 ]記載の DNA。
(a) 配列番号 1の塩基 8340から塩基 27935までの連続した塩基配列
(b) 配列番号 1の塩基 28021から塩基 49098までの連続した塩基配列
(c) 配列番号 1の塩基 49134から塩基 60269までの連続した塩基配列
(d) 配列番号 1の塩基 60269から塩基 65692までの連続した塩基配列
(e) 配列番号 1の塩基 65707から塩基 66903までの連続した塩基配列
(f) 配列番号 1の塩基 68160から塩基 66970までの連続した塩基配列 (g) 配列番号 1の塩基 69568から塩基 68270までの連続した塩基配列
(h) 配列番号 1の塩基 72725から塩基 70020までの連続した塩基配列
(i) 配列番号 1の塩基 1から塩基 74342までの連続した塩基配列
[7] [1]から [6]までのいずれかの項に記載された DNAによりコードされる ポリぺプチド。
[8] ポリケチド合成酵素活性を有することを特徴とする、 [7]記載のポリべ プチド。
[9] 配列番号 2、 3、 4または 5記載のアミノ酸配列またはその部分配列を 有することを特徴とする、 [8]記載のポリペプチド。
[10] 6位水酸化酵素活性を有することを特徴とする、' [7]記載のポリぺプ チド。
[1 1] 配列番号 6記載のァミノ酸配列またはその部分配列を有することを特 徴とする、 [10]記載のポリペプチド。
[12] 18， 19位エポキシ化酵素活性を有することを特徴とする、 [7]記載の ポリぺプチド。
[13] 配列番号 8記載のアミノ酸配列またはその部分配列を有することを特 徴とする、 [12]記載のポリペプチド。
[14] 転写調節因子活性を有することを特徴とする、 [7]記載のポリべプチ ド、。
[15] 配列番号 9記載のァミノ酸配列またはその部分配列を有することを特 徴とする、 [14]記載のポリペプチド。
[16] 7位ァシル化酵素活性を有することを特徴とする、 [ 7 ]記载のポリぺ プチド。
[1 7] 配列番号 7記載のアミノ酸配列またはその部分配列を有することを特 徴とする、 [16]記載のポリペプチド。
[18] [1]から [6]までのいずれかの項に記載された DNAを担持する自立複 製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド。
[19] [ 1 ]から [ 6 ]までのいずれかの項に記載された DNAを保持する形質転 換体。
[20] [19]記載の形質転換体を培地で培養し、 その培養液かプラジェノラ ィ ドを採取することを特徴とする、 プラジェノライドの製造方法。
[21] プラジェノライ ドがプラジェノライド Bである、 [20]記載の製造方 法。
[22] 式 （V I)
Figure imgf000009_0001
[式中、 RNは、 低級アルキル基または環状の低級アルキル基を示し、 nは、 1 または 2を示す]で表されるプラジェノライド D誘導体を製造方法であって、 (1) [20]または [22]に記載の製造方法によって得られる式 （I)
Figure imgf000009_0002
の化合物 （プラジェノライ ド D) に変換する工程、 (2) 式 （I I) の化合物の 3、 6、 16及び/または 21位の水酸基に適宜 保護基を導入して、 式 （I I I)
Figure imgf000010_0001
の化合物 [式中、 R3A、 R6\ R16Aおよび R21Aは、 水素原子または水酸基の保護 基を示す （ただし、 R3A、 R6A、 RieAおよび R21Aは、 同時に水素原子を示さな い） ]に変換する工程、
(3) 式 （I I I) の化合物の 7位のァセチル基を脱離させることにより、 式 （ I V)
Figure imgf000010_0002
の化合物 [式中、 R3A、 R6\ R16Aおよぴ "は、 前記の意味を有する]に変換す る工程、
(4) 式 （IV) の化合物の 7位に置換基を導入して、 式 （V)
Figure imgf000010_0003
の化合物 [式中、 RN、 R3A、 R6A、 R16Aおよび R21Aは、 前記の意味を有する]に 変換する工程
および （5) 式 （V) の化合物の保護基を脱離させる工程を含む製造方法。 発明の詳細な説明
以下、 本発明の実施の形態について詳細に説明する。
なお、 本発明書において、 「低級アルキル基」 とは、 炭素数 1ないし 6個の アルキル基を意味し、 具体的には、 例えばメチル基、 ェチル基、 プロピル基、 イソプロピル基、 プチル基等が挙げられ、 特に、 メチル基、 ェチル基、 イソプ 口ピル基等が好ましい。
「環状の低級アルキル基」 とは、 炭素数 3ないし 6個のアルキル基を意味し、 具体的には、 例えばシクロプロピル基、 シクロブチル基、 シクロへキシル等が 挙げられ、 特に、 シクロプロピル基、 シクロブチル基等が好ましい。
「ストリンジェントな条件下でハイプリダイズする DNA」 とは、 例えば、 上 記 (a)項から（i)項までのいずれかの項で定義された塩基配列を有する DNAをプ ローブとして、 コロニー 'ハイブリダィゼーシヨン法、 プラーク ·ハイブリダ ィゼーション法あるいはサザンハイブリダィゼーション法等を用いることによ り得られる DNAを意味し、 具体的には、 コロニーあるいはプラーク由来の DNA を固定化したフィルターを用いて、 0· 7〜1· 0Μの塩化ナトリウム存在下、 65°C でハイブリダイゼーションを行った後、 0. 1〜2倍濃度の SSC溶液 （1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM塩化ナトリウム、 15mMクェン酸ナトリウムよりな る） を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄することにより同定できる DNAを あげることができる。
「DNAの改変体」 とは、 構成塩基の削除、 変換、 付加、 挿入などにより修飾 されたもの、 あるいはその誘導体を意味する。
「相同性」 とは、 2つの配列を最適の態様で整列させた場合に、 2つの配列 間で共有する一致したヌクレオチドの百分率を意味する。 すなわち、相同性 =
(—致した位置の数/位置の全数） X I 0 0で算出でき、 市販されているアル ゴリズムを用いて計算することができる。 また、 このようなアルゴリズムは、 Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215 (1990) 403 - 410に記載される N B L A S Tおよび X B L A S Tプログラム中に組込まれている。
「類縁体」 とは、 化学構造を特徴づける主骨格が同じで、 修飾の様式や側鎖 の形状などが異なる化合物を意味する。
本発明においては、 マクロライド系化合物プラジェノライ ドを生産する能力 を有する微生物の培養菌体から、 プラジェノライ ドの生合成に関与するポリべ プチドを一部にまたは全体としてコードする DNAを単離し、 塩基配列を決定す ることができる。 このような微生物としては、 プラジェノライ ドを生産する能 力を有するものであれば種および株の種類を問うことなく使用できるが、 好ま しい微生物として土壌から分離されたストレプトマイセス ·エスピー
(Streptomyces sp. ) Mer - 11107株を挙げることができる。 本菌株は、 FERM P - 18144として平成 12年 12月 19 日付で日本国 305 - 8566茨城県つくば市東 1丁 目 1番 3号在の工業技術院生命工学工業技術研究所 （その後、 日本国 305- 8566 茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人産業技術総合研究 所特許生物寄託センター（IP0D)に組織変更した） に寄託され、 さらに平成 13 年 11月 27日付で日本国 305-8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IP0D)において、 これを国際寄託 FERM BP - 7812に移管された。なお、 本菌株の菌学的性状は次の とおりである。
(1)形態 .·· + 基生菌糸より螺旋状 （Spirales) の気中菌糸を伸長する。 成熟した気中菌糸 の先に 10〜20個程度の円筒形の胞子からなる胞子鎖を形成する。 胞子の大き さは 0. 7 X 1. 0 μ ηι位で、 胞子の表面は平滑 （smooth) を示し、 胞子のう、 菌核、 鞭毛などの特殊な器官は認められない。
(2)各種培地における生育状態
各種培地上で 28°C、 2週間培養後の培養性状を以下に示す。 色調の記載はト レズナ一のカラー .ホイールズ （Tresnerの Color wheels) の色標名と括弧 内に示す符号で表示する。
1) イースト ·麦芽寒天培地
生育は良好で、 その表面に気中菌糸を着生し、 灰色の胞子 (Light gray ； d) が見られる。 培養裏面は Light melon yellow (3ea)である。 溶解性色素は産生 しない。
2) ォートミール寒天培地
生育は中程度で、 その表面に気中菌糸を僅かに着生し、 灰色の胞子 (Gray ； g)が見られる。 培養裏面は Nude tan (4gc)または Putty (1 1/2 ec)である。 溶解性色素は産生しない。
3) スターチ '無機塩寒天培地
生育は良好で、 その表面に気中菌糸を着生し、 灰色の胞子 (Gray ； e)が見ら れる。 培養裏面は Fawn (4ig)または Gray (g)である。 溶解性色素は産生しな い。
4) グリセリン . ァスパラギン寒天培地
生育は良好で、 その表面に気中菌糸を着生し、 白色の胞子 (White ； a)が見 られる。 培養裏面は Pearl pink (3ca)である。 溶解性色素は産生しない。
5) ぺプトン 'イース ト ·鉄寒天培地
生育は悪く、 その表面に気中菌糸を着生しない。 培養裏面は Light melon yellow (3ea)である。 溶解性色素は産生しない。
6) チロシン寒天培地
生育は良好で、 その表面に気中菌糸を着生し、 白色の胞子 (White ； a)が見 ら;^る。 培養裏面は Pearl pink (3ca)である。 溶解性色素は産生しない。 (3)各種炭素源の同化性
プリードハム . ゴトリーブ寒天培地に各種の炭素源を加え、 28°C、 培養 2週 間後の生育状況を以下に示す。
1) L -ァラビノース 土
2) D -キシロース 士
3) D -グノレコース +
4) D -フルク トース +
5) シユークロース +
6) イノシト一ノレ +
7) L -ラムノース 一 8) D-マンニトール +
9) ラフイノース +
(+は同化する、 士は多少同化する、.一は殆ど同化しない。 ）
(4)生理学的諸性質
本菌の生理学的諸性質は以下の通りである。
1)生育温度範囲 （イースト '麦芽寒天培地、 2週間培養） ： 12°C〜37°C
2)最適温度範囲 （イースト '麦芽寒天培地、 2週間培養） ： 21°C〜33°C
3)ゼラチンの液ィ匕 （グルコース ·ぺプトン ·ゼラチン培地） ：陰性
4)ミルクの凝固 （スキムミルク培地） ：陰性
5)ミルクのぺプトン化 （スキムミノレク培地) ：陰性
6)スターチの加水分解 （スターチ '無機塩寒天培地） ：陽性
7)メラ二ン様色素の産生 （ぺプトン 'イースト '鉄寒天培地） ：陰性
(チロシン培地） ：陰性
8)硫化水素の産生 （ぺプトン 'イースト '鉄寒天培地） ：陰性
9)硝酸塩の還元 （0. 1%硝酸力リ含有ブロス） ：陰性
10)食塩の耐性 （イースト ·麦芽寒天培地、 2週間培養） ：食塩含有量 4%以下 で生育
(5)菌体成分
本菌の細胞壁から LL -ジァミノピメリン酸およぴグリシンが検出された。 本発明者らはモ キユラ ·クローニング第 2版に記載されたコロニーハイプ リダイゼーション法に従って、 上記微生物から本発明の DNAの取得を試みた。 まず Mer- 11107株のゲノム DNAを適当な制限酵素、 例えば Sau3AIで部分分解 したものを、 大腸菌内で複製可能なコスミ ドベクターを制限酵素、 例えば BamHIで分解したものと連結して得た組換え DNAを大腸菌に組込み形質導入株 を得た。 一方、 Mer - 11107株から取得した DNAを錶型とし、 一般にポリケチド 合成酵素のケト合成酵素領域（keto synthase domain)において保存されている と言われている配列情報と、 ピクロマイシン生産菌のケト合成酵素領域の配列 情報（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 12111 - 12116)とを参考に設計された プライマーを用いて PCRを行い増幅された DNAを取得した。 得られた DNAをプ ロープとして先に調製した形質導入株をスクリーニングしたが、 多数の陽性ク ローン（コスミ ド）が取得され、 目的の DNAをもつ形質導入株を直ちに同定する ことはできなかった。
そこでポリケチド合成酵素遺伝子の近傍に修飾酵素遺伝子が存在する可能性 が高いことに着目し、 公知の放線菌 2株から 2種類の水酸化酵素（シトクロム P450酵素）遺伝子の断片を PCR法にて取得し、 これをプローブとして、 先に得 られた多数の形質導入株をスクリーニングし、 プローブと結合する 1種類の形 質導入株を選択した。 そして選択されたコスミ ド中に存在する水酸化酵素遺伝 子と結合する DNAを取得し、 配列を決定した。 さらにこれを大腸菌に導入し、 形質転換された大腸菌がプラジェノライド Bの 6位デォキシ体である、 下記式 で表される ME - 265 をプラジェノライ ド B に変換する能力をもつことを見出し、 この DNAが、 6位水酸化酵素をコードする DNAであることを確認した。
Figure imgf000015_0001
ME-265 こうしてプラジェノライドの生合成に関与する DNAの一部が判明したので、 この 6位水酸化酵素をコードするシトクロム P450遺伝子をプローブに用いて サザンハイブリダィゼーションを行い、 先に取得した多数の陽性クローン（コ スミ ド）からシトクロム P450遺伝子に隣接するプラジェノライ ド生合成遺伝子 クラスターを含むコスミ ドを選択し整列化した。
次いで得られたいくつかのコスミ ドのうち、 ポリケチド合成領域を含むと考 えられるコスミ ドを用いて遺伝子破壊株を作成し、 その破壊株がプラジェノラ ィド生産能を失うことを確認することにより、 取得した DNAの機能を確認する ことにした。 まず、 ポリケチド合成領域と考えられる領域の一部を欠失させた コスミ ドを作成し、 汎用される手法を用いて Mer- 11107株の相同組換えを行い 遺伝子破壊株を取得することを試みたが、 いくつかの問題点が明らかになった。 その 1つは、 Mer- 11107株が汎用されるリゾチーム処理ではプロトプラストに ならないので、 放線菌にプラスミ ドを形質転換させる方法として汎用されるプ 口 トプラスト PEG法が適用できないということである。
そこで本発明者らは、 形質転換させる方法としてプロトプラスト PEG法の代 りに対数増殖期前期の大腸菌と適量の放線菌胞子とを混合して DNAを受渡す接 合法を試みたが、 Mer- 11107株は胞子を形成しにくい性質をもっていたため、 さらに検討を加え、 胞子菌体の放線菌の代りに対数増^期前期まで培養した菌 糸を用いることによりようやく形質転換することができた。
もう 1つの問題点は Mer- 11107株が元々チォストレプトンにある程度の耐性 をもっているため、 放線菌の形質転換で汎用されるチォストレプトン耐性遺伝 子をマーカーとして利用できないということである。 そのため形質転換の手法 を再度検討し、 マーカーとしてァミノグリコシドリン酸化酵素遺伝子 （ァミノ グリコシド耐性遺伝子） 、 選択培地としてリポスタマイシン含有培地をそれぞ れ用いることにより、 Mer - 11107株の形質転換株を効率的に選択できることを 見出した。 そしてこの方法を用いてポリケチド合成領域と考えられる DNAを破 壊した遺伝子破壊株を作成し、 その破壊株がプラジェノライ ド生産能を失うこ とを確認した。
こうして先に得られたコスミ ドに含まれる遺伝子がプラジェノライドの生合 成に関連していることが確認されたので、 次に各コスミ ド中の挿入 DNA断片の 塩基配列を決定した。 まず、 各コスミ ドを塩化セシウム法を用いて単離後、 約 lkbに剪断しサブクローン化した。 次いで得られたサブクローンに対し、 それ ぞれの断片の塩基配列を決定し、 プラジェノライ ドの合成に関連する DNAを含 む約 75kbの塩基配列を決定した（配列番号 1参照）。
この配列番号 1で示される DNAには、 pldA I (塩基 8340〜27935) 、 pldA II (塩基 28021〜49098) 、 pldA III (塩基 49134〜60269) 、 pldA IV (塩基 60269〜65692) 、 pldB (塩基 65707〜66903) 、 pldC (塩基 68160〜66970) 、 pldD (塩基 69568〜68270) および pldR (塩基 72725〜70020) の 8つのオーブ ン ' リーディング 'フレーム（0RF)が含まれていた。 またこれらの配列によつ てコードされるポリぺプチドのァミノ酸配列はそれぞれ配列番号 2〜 9に示す とおりである。
こうして得られた Mer - 11107株のプラジェノライ ド生合成に関与する DNAの うち、 pldA I、 pldA II、 pldA IIIおよび pldA IVには、 既に明らかにされて いる他のポリケチド生合成遺伝子と同様にモジュールと呼ばれる 1またはそれ 以上の反復単位をそれぞれ含むいくつかの転写解読枠があった。 そして各モジ ユールは後述するとおりポリケチド合成の縮合反応に関与するァシルキャリ了 一タンパク質 （ACP) 、 ]3 -ケトァシル ACP合成酵素 （KS) 、 ァシル転移酵素 (AT) と、 i3位カルボ-ル基修飾反応に関与するケトァシル還元酵素 （KR) 、 脱水酵素 （DH) およびエノィル還元酵素 （ER) から選択されるドメインの全て あるいはいくつかをコードしており最後のモジュールにはポリケチド鎖をポリ ケチド合成酵素から切り離すチォエステラーゼ （TE) ドメインが存在していた。 図 1に、 Mer- 11107株におけるプラジェノライ ドの生合成経路を示した。 開 始モジュール (loading module) は他のモジュールと違って活性中心のシステ ィンがグルタミンに置換されていることより、 PldA Iは初発反応に関与してい ることがわかる。 またモジュール 10にはチォエステラーゼ (TE) ドメインが あることより、 PldA IVはポリケチドの最後の反応に関与していることがわか る。 こうしてポリケチドの基本骨格が形成された後、 さらに、 pldB、 pldCおよ び pldDがコードしている酵素群 （PldB、 PldCおよび PldD) により修飾を受け、 プラジェノライドが生合成されると思われる。 なお、 pldRはエバーメクチン生 合成における転写調節因子をコードする遺伝子 aveRとの相同性が高く、 ブラ ジエノライ ド生合成に関与する DNAの転写調節因子をコードしていると思われ る。
こうして明らかになったプラジェノライド生合成に関与する DNAのモジユー 13541
ルおよび対応するドメインは以下のとおりである。
ORF pldA I (配列番号 1の塩基 8340〜27935) は、 開始モジュール、 モジュ 一ノレ 1、 モジユーノレ 2およびモジュール 3をコードし、 対応するポリペプチド は、 配列番号 2に記載したァミノ酸配列で示される。
開始モジュール （塩基 8340〜11384)
KSs：塩基 8358〜9620
ATs：塩基 9702〜 10781
ACPs：塩基 11148〜11327
モジュール 1 (塩基 11385〜16070)
KS1：塩基 11385〜12650
ATI：塩基 12747〜 13829
KR1：塩基 14940〜15803
ACPI：塩基 15825〜16007
モジュール 2 (塩基 16071〜21431)
KS2：塩基 16071〜17336
AT2：塩基 17445〜18536
DH2：塩基 18717〜19418
KR2：塩基 20298〜21167
ACP2：塩基 21189〜21371
モジュール 3 (塩基 21432〜27935)
KS3：塩基 21432〜22695
AT3：塩基 22800〜23880
DH3：塩基 24066〜24779
ER3：塩基 25659〜26588
KR3：塩基 26610〜27476
ACP3：塩基 27498〜27680
また対応するポリペプチドのァミノ酸配列は以下のとおりである。
KSs：アミノ酸 7〜427 ATs：アミノ酸 455〜814
ACPs：アミノ酸 937〜996
KS1：アミノ酸 1016〜1437
ATI：アミノ酸 1470〜1830
KR1：アミノ酸 2201〜2488
ACPI：アミノ酸 2496〜2556
KS2：アミノ酸 2578〜2999
AT2：アミノ酸 3036〜3399
DH2：アミノ酸 3460〜3693
KR2：アミノ酸 3987〜4276
ACP2：アミノ酸 4284〜4344
KS3：アミノ酸 4365〜4786
AT3：アミノ酸 4821〜5181
DH3：アミノ酸 5243〜5480
ER3：アミノ酸 5774〜6083
KR3：アミノ酸 6091〜6379
ACP3：アミノ酸 6387〜6447
ORF pldA II (配列番号 1の塩基 28021〜49098) は、 モジュール 4 ール 5、 モジュール 6およびモジュール 7をコードし、 対応するポリ は、 配列番号 3に記載したァミノ酸配列で示される。
モジュール 4 (塩基 28021〜33540)
KS4：塩基 28132〜29397
AT4：塩基 29530〜30627
DH4：塩基 30865〜31566
KR4：塩基 32413〜33276
ACP4：塩基 33298〜33480
モジュール 5 (塩基 33541〜39003)
KS5：塩基 33541〜34806 AT5：塩基 34912〜35994
DH5：塩基 36175〜36876
KR5：塩基 37755〜38625
ACP5：塩基 38647〜38829
モジュ一ノレ 6 (塩基 39004〜43686)
KS6：塩基 39004〜40269
AT6：塩基 40372〜41454
KR6：塩基 42550〜43407
ACP6：塩基 43429〜43611
モジユーノレ 7 (塩基 43687〜49098)
KS7：塩基 43687〜44952
AT7：塩基 45031〜46128
DH7：塩基 46303〜47022
KR7：塩基 47881〜48744
ACP7：塩基 48766〜48948
また対応するポリぺプチドのァミノ酸配列は以下のとおりである KS4：アミノ酸 38〜459
AT4：アミノ酸 504〜869
DH4：アミノ酸 949〜1182
KR4：アミノ酸 1465〜1752
ACP4：アミノ酸 1760〜1820
KS5：アミノ酸 1841〜2262
AT5：アミノ酸 2298〜2658
DH5：アミノ酸 2719〜2952
KR5：アミノ酸 3246〜3535
ACP5： アミノ酸 3543〜3603
KS6：アミノ酸 3662〜4083
AT6：アミノ酸 4118〜4478 KR6：アミノ酸 4844〜5129
ACP6：アミノ酸 5137〜5197
KS7：アミノ酸 5223〜5644
AT7：アミノ酸 5671〜6036
DH7：アミノ酸 6095〜6334
KR7：アミノ酸 6621〜 6908
ACP7：アミノ酸 6916〜6976
ORF pldA III (配列番号 1の塩基 49134〜60269) は、 モジュール 8およびモ ジュール 9をコードし、 対応するポリペプチドは、 配列番号 4に記載したアミ ノ酸配列で示される。
モジュール 8 (塩基 49134〜53885)
KS8：塩基 49235〜50501
AT8：塩基 50580〜51656
KR8：塩基 52752〜53621
ACP8：塩基 53642〜53825
モジユーノレ 9 (塩基 53886〜60269)
KS9：塩基 53886〜55151
AT9：塩基 55245〜56342
DH9：塩基 56514〜57230
ER9：塩基 58029〜58925
KR9：塩基 58947〜59804
ACP9：塩基 59826〜60008
また対応するポリぺプチドのァミノ酸配列は以下のとおりである。
KS8：アミノ酸 35〜456
AT8：アミノ酸 483〜841
KR8：アミノ酸 1207〜1496
ACP8：アミノ酸 1504〜 1564
KS9：アミノ酸 1585〜2006 AT9：アミノ酸 2038〜2403
DH9 -:アミノ酸 2461〜2699
ER9 :アミノ酸 2966〜3264
KR9：アミノ酸 3272〜3557
ACP9： アミノ酸 3565〜3625
ORF pldA IV (配列番号 1の塩基 60269〜65692) は、 モジュール 1 0をコー ドし、 対応するヌクレオチドは、 配列番号 5に記載したアミノ酸配列で示され る。
モジュール 10 (塩基 60269〜65692)
KS10：塩基 60431〜61696
AT10：塩基 61781〜62869
KR10：塩基 63752〜64609
ACP10：塩基 64631〜64813
TE10：塩基 64832〜65692
また対応するポリぺプチドのァミノ酸配列は以下のとおりである。
KS10： アミノ酸 55〜476
AT10： アミノ酸 505〜867
KR10： アミノ酸 1162〜1447
ACP10：アミノ酸 1455〜1515
TE10： アミノ酸 1522〜1808
ORF pldB (配列番号 1の塩基 65707〜66903) は、 プラジェノライ ドの 6位水 酸化酵素をコードし、 対応するポリペプチドは、 配列番号 6に記載したァミノ 酸配列で示される。 ORF pldC (配列番号 1の塩基 68160〜66970) は、 プラジェ ノライ ドの 7位ァシル化酵素をコードし、 対応するポリぺプチドは、 配列番号 7に記載したァミノ酸配列で示される。 ORF pldD (配列番号 1の塩基 69568〜 68270) は、 プラジェノライドの 18， 19位エポキシ化酵素をコードし、 対応す るポリぺプチドは、 配列番号 8に記載したアミノ酸配列で示される。 ORF pldR
(配列番号 1の塩基 72725〜70020) は、 プラジェノライ ドの生合成における転 写調節因子をコードし、 対応するポリペプチドは、 配列番号 9に記載したアミ ノ酸配列で示される。
さらに本発明の DNAには、 前記 DNAだけでなく、 それらの改変体であって、 前 記 DNAに対して、 ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつプラジ エノライ ドの生合成に関与する DNAも包含される。 このような改変体のより具 体的なものとして、 配列番号 1の塩基 8340から塩基 27935までの連続した塩基 配列、 配列番号 1の塩基 28021から塩基 49098までの連続した塩基配列、 配列番 号 1の塩基 49134から塩基 60269までの連続した塩基配列、 配列番号 1の塩基 60269から塩基 65692までの連続した塩基配列、 配列番号 1の塩基 65707から塩 基 66903までの連続した塩基配列、 配列番号 1の塩基 68160から塩基 66970まで の連続した塩基配列、 ·配列番号 1の塩基 69568から塩基 68270までの連続した塩 基配列または配列番号 1の塩基 72725から塩基 70020までの連続した塩基配列の いずれかの配列と少なくとも 70%、 好ましくは 80%、 さらに好ましくは 90%の 相同性を示すものである。
こうして、 一旦塩基配列を確定することができればその情報をもとに公知の 方法によって本発明のプラジェノライ ドの生合成に関与する DNAを取得するこ ともできる。
例えば、 配列番号 1に示された塩基配列を有する DNAを適当な制限酵素で消 化し、 モレキュラー 'クローニング第 2版記載の方法により消化された DNAを 分離回収し、 プローブまたはプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドを調 製する。 プローブとして用いる場合には、 得られた DNA断片をジゴキシゲニン 等で標識することが好ましい。 ジゴキシゲニンによる標識には DIGラベリング &デテクシヨンキット (ロシュダイァノスティック社) 等を用いることがこの ましい。
次いでプラジェノライ ドを生産する能力を有する微生物の菌体から、 モレキ ユラ一 · クローニング第 2版等に記載のゲノムクローニング法または cDNAク ローニング法を用いてライブラリーを作製する。 得られたライブラリーから先 に調製したプローブとハイプリダイゼーシヨンするクローン （コロニー） を選 抜し、 モレキュラー . クローニング第 2版に記載の方法に従い選抜されたクロ ンからプラスミ ドを抽出し、 得られたプラスミ ドから目的のプラジェノライ ドの生合成に関与する DNAを取得することができる。
この場合において、 抽出されたプラスミ ドにプラジェノライ ドの生合成に関 与する DNAの部分断片しか存在しない場合には、 抽出されたプラスミ ドを適当 な制限酵素、 例えば BamHIで消化することにより、 これらプラスミ ドの制限酵 素地図を常法に従レ、作成する。 次いでその制限酵素地図からいくつかのクロー ンに共通して存在する制限酵素断片を見出し、 オーバーラップしている部分で クローン化断片をつなぎ合わせることでブラジエノライドの生合成に関与する DNA全体を含む DNAを取得することができる。
あるいは、 上記したライブラリーおよびプライマーを用いて、 直接 PCR反応 を行い、 目的の DNAを直接増幅することにより、 プラジェノライ ドの生合成に 関与する DNAを取得することもできる。
プラジェノライ ドの生合成に関与するポリペプチドをコードする DNAの塩基 配列は、 通常用いられる塩基配列解析方法、 例えばジデォキシ法 〔Proc. Natl Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977) 〕 あるいは 373A · DNAシークェンサ一 （パ 一キン ·エルマ一社製） 等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより決 定することができる。 具体的には、 2本鎖プラスミ ド DNAを種々の配列特異的 なオリゴヌクレオチドプライマ一を用いたサイクルシークェンス反応の铸型と して直接用いるか、 あるいは、 DNA断片を細分化し、 バクテリオファージ M13 にランダムにそして各断片が一部重複したライブラリーまたはプラスミ ドべク ターを用い DNA断片の末端部分から順次欠失を導入した重複ライブラリーを作 製し、 ついで個々の組み換え DNA断片をベクター配列に特異的なオリゴヌクレ ォチドプライマ一を用いて DNA配列を決定することができる。
また、 決定された DNAの塩基配列に基づいて、 例えば 8905型 DNA合成装置 (パーセティブ ·バイオシステムズ社製） 等の DNA合成装置を用いて化学合成 することにより目的とする DNAを調製することもできる。 得られた塩基配列デ ータの整理、 編集および解析は既存のソフトウェア、 例えばソフトウェア開発 社製 GenetyxTMを用いて行うことができる。
また本発明のポリペプチドは、 例えばモレキュラー ' クローニング第 2版、 カレント 'プロ トコールズ 'イン 'モレキュラー ·バイオロジー等に記載され た方法を用い、 本発明の DNA を宿主細胞中で発現させて製造することができる。 本発明の DNAまたはそれらの改変体を組み込む部位は、 宿主微生物のプラスミ ド上または染色体上のいずれでもよい。 このようなプラスミ ドは、 前記 DNAま たはそれらの改変体以外に、 自律複製配列、 プロモーター配列、 ターミネータ 一配列、 薬剤耐性遺伝子等を含んでいてもよい。 さらに、 プラスミ ドは、 使用 が予定される宿主のゲノムの一定領域と相同の配列をもつ組込み型ブラスミ ド であってもよい。
このように本発明の DNAでコードされるポリべプチドを発現させるための宿 主、 プラスミ ド-ベクター系は、 これらの DNAが安定に保持、 発現される系で あればどのような系でもよいが、 例えば元々プラジェノライ ドを生産する能力 を有する放線菌あるいはその類縁株を宿主とするならば、 自律複製型べクタ一 pi J6021 (Gene 166, 133 - 137 (1995) )や染色体組み込み型ベクター KC515 [The bacteria, vol. 9. Antibiotic-producing Streptorayces (ed : Queener, S. E. and Day, L. E. ) . p. 119-158. Academic Press, Orlando, Fgla.〕 などが利用できる。 本発明の形質転換体により製造されたポリぺプチドを単離 ·精製する方法と しては、 通常の酵素の単離 '精製法を用いることができる。 例えば、 本発明の ポリペプチドが、 細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培養終了後、 細胞を 遠心分離により回収し、 水系緩衝液に懸濁後、 超音波破砕機、 フレンチプレス、 マントンガウリンホモゲナイザ一、 ダイノミル等により細胞を破砕し、 無細胞 抽出液を得る。 得られた無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清 から、 通常の酵素の単離精製法により精製標品を得ることができる。
また、 先に得られたポリペプチドのアミノ酸配列の情報を基に、 フルォレニ ルメチルォキシカルボニル法 （Fmoc法） 、 t-ブトキシカルボニル法 （t _Boc 法） 等の化学合成法により本発明のポリべプチドを製造することもできる。
また先に取得したプラジェノライド生合成遺伝子を含有する形質転換体を培 地に培養し、 培養物中にプラジェノライドを生成蓄積させ、 該培養物からプ ジエノライ ドを採取することによりプラジェノライ ドを製造することができる。 培養条件は、 特に制限はないが宿主の通常の培養条件に準ずる。
また、 プラジェノライ ドの生合成に関与する DNAの塩基配列情報を基に、 モ ジュールを修飾することにより、 ポリケチド基本骨格の炭素鎖の大きさおよび 縮合過程の /3位炭素の官能基を変化させることができる。 さらにポリケチド形 成後の修飾酵素を選択的に不活化することにより、 予測可能なブラジエノライ ドの特定成分を優先的に生産させることが可能である。 例えば、 主としてブラ ジエノライ ド Bを生産する菌株である Mer - 11107株の pldBを欠損変異するこ とにより、 プラジェノライド Bの 6位デォキシ体である、 ME- 265を主に生産す る菌株にすることが可能である。 pldBを欠損変異する方法としては、 モレキュ ラー . クローユング第 2版等に記載の常法により、 相同組換えによる置換、 あ るいは変換を行う方法をあげることができる。
こうして取得された特定のプラジェノライドを優先的に生産することが可能 となった菌株を用い、 プラジェノライド Bの製造法に準じて、 特定のプラジェ ノライ ドを製造することができる。
本発明により、 マクロライド系化合物プラジェノライ ドの生合成に関与する ポリぺプチドをコ一ドする DNAを単離して、 その塩基配列を決定することがで きる。 さらにその DNAを担持するプラスミ ド、 そのプラスミ ドで形質転換した 形質転換体を作成し、 その形質転換体を用いて、 プラジェノライドを効率よく 生産することができる。 さらに得られた DNAの配列を修飾、 変更することによ り取り込まれるカルボン酸の種類、 縮合後の修飾反応、 骨格形成後の修飾反応、 またそれらのあらゆる組み合わせを改変することにより新規または特定のブラ ジエノライ ドの生産が可能になる。 図面の簡単な説明
図 1は、 Mer - 11107株におけるプラジェノライドの生合成経路を示した図で ある。 図 2は、 Mer - 11107株におけるプラジェノライ ドの生合成に関与する DNAの 各 0RFとコスミ ドの対応関係を示した図である。
図 3は、 pKU253の構造を示す図である。 実施例
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが本発明はこれらの実施例 により何ら限定されるものではない。 また下記の説明中、 特に記載がない限り 表示濃度は重量％である。
実施例 1 ： Mer - 11107株の培養およびゲノム DNAの取得
ストレプトマイセス 'エスピー（Streptomyces sp. ) Mer- 11107株の菌糸を 25mlの Tryptic Soy Brothに接種し、 28°C、 3日間振とう培養した。 この結果 得られた培養液から、 D. A. Hopwoodらの放線菌遺伝子実験書 Practical Streptomyces Genetics (The John Innes Foundation, Norwich, England, 2000) の Isolation genomic DNA (P162〜170)記載の方法に従ってゲノム DNAを調製し た。
実施例 2 ： Mer- 11107株のゲノムライブラリーの調製
滅菌精製水 160 μ 1と、 Mer-丄丄^^株のゲノム！^ 溶液ひ /!^) と、 10倍濃度の M緩衝液 [lOOmM Tris - HC1 (pH7. 5)， lOOmM MgCl2， 10mMジチォスレイ トール， 500mM NaCl]40 ^ 1と制限酵素 SauSAI dunit/ ^u 1) 1 1とを混合し、 37°Cで 3分インキュベートした。 その後、 50 μ 1を取り出し、 のフエノ 一ル-クロロホルム混液 （フエノーノレ： クロロホルム ：ィソァミルアルコール =25： 24： 1,容量比） で抽出し、 水相を回収し、 さらに 50 μ 1のクロ口ホルム で抽出し、 再ぴ水相を回収した。 この液に 5 の 3Μ酢酸ナトリウム（pH6. 0) と 150 1のエタノールを加えて、 一 80°Cに 30分置き、 遠心することで沈殿し てくる DNAを回収した。 この DNAを 70%エタノールで洗浄した後、 90 1の滅 菌精製水に溶解し、 10 μ 1の 10倍濃度 ΒΑΡ緩衝液 [500mM Tris-
HC1 (pH9. 0) , lOmM MgCl2]および 5 /i 1 bacterial alkaline
phosphatase (0. 5unit/ ^ l, 宝酒造社）を加えて 37°Cで 3時間ィンキュベートし た。 この反応液を ΙΟΟ μ 1のフエノ一ル-ク口口ホルム混液 （フエノール： クひ ロホノレム ：イソアミルアルコール =25： 24： 1,容量比） で抽出し、 水相を回収 し、 さらに lOO w lのクロ口ホルムで抽出し、 再び水相を回収した。 この液に 10 μ 1の 3Μ酢酸ナトリゥム（ρΗ6· 0)と 300 ^ 1のエタノールを加えて、 _ 80°Cに 30分置き、 遠心することで沈殿してくる DNAを回収した。 この DNAを 70%ェ タノールで洗浄した後、 20 μ 1の TE緩衝液 [10mM Tri s - HC1 (pH8. 0) , lmM EDTA] に溶角早した。
一方で SuperCosコスミ ドべクタ一（Stratagene社） 10 gを Stratagene社の マニュアルに従い制限酵素 Xbalで消化後、 calf intestional alkal ine phosphatase (宝酒造社）により DNA末端の脱リン酸化を行い、 さらに制限酵素 BamHIで消化、 精製後、 10 1の TE緩衝液に溶解した。
このコスミド DNA溶液 1 1に、 前述の Mer- 11107株 DNAの Sau3Al部分分解 物の溶液 2. 5 1を加え、 さらに滅菌精製水 1. 5 1、 DNA Ligation Kit (宝酒造 社）の Solution IIを 5 1、 Solut ion Iを 10 1順次加えた後、 23°Cで 10分 ィンキュベートした。 この反応 ¾ 4 1を Gigapack III XL Kit (Stratagene 社）を用いてラムダファージにパッケージングした。 得られたパッケージング 液 (全量 500 μ 1)について形質導入試験を実施して、 コロニー形成能を検定した 結果、 380cfu、colony forming unit) / μ 1であった。
実施例 3 ：各種プローブの調製
( 1 ) ケト合成酵素コード領域を含むプローブの調製
一般にポリケチド合成酵素のケト合成酵素領域 (keto synthase domain)にお いて保存されている配列に基づいて、 それぞれ、 以下の配列番号 1 0および 1 1に示す塩基配列からなる 2種のプライマー、 即ち、 KS- 3Fおよび KS- 4Rを合 成した。
KS-3F： 5' -GACCGCGGCTGGGACGTGGAGGG-3' (配列番号 1 0 )
KS-4R : 5' -GTGCCCGATGTTGGACTTCAACGA-3' (配列番号 1 1 )
これらのプライマーを用いて PCRを下記の条件にて行った。
(PCR反応液組成） 滅菌精製水 31 1
2倍濃縮 GC buffer 50 μ 1
dNTP混合溶液（dATP， dGTP, dTTP, dCTP各 2. 5mM) 16 μ 1
KS-SF dOOpmol/ ^ l) 0. 5 1
KS-4R (l00pmol/ ^ 1) 0. 5 μ 1
Mer-11107株 total DNA (100ng/ ^ 1)
LA Taq polymerase (5u/ 1，宝酒造社)
(反応温度条件）
95°C 3分
(98°C 20秒， 63°C 30秒， 68°C 2分) 30サイクル
72°C 5分
この反応の結果増幅された 930b DNA断片を 0. 8°/0ァガロースゲル上で電気泳 動し、 分離した 930b DNA断片を切り出し、 SUPREC_01 (宝酒造社）を用いて DNA を回収精製した。 さらに得られた DNA断片 10ngを铸型として反応サイクノレ数 を 20サイクルとする以外は前述の PCRと同じ反応条件でケト合成酵素コード 領域を含む 930b DNA断片を再増幅した。 この DNA断片を SUPREC- 02 (宝酒造社） を用いて濃縮精製して得られた 50 1の TE溶液をプローブ溶液とした。
( 2 ) シトクロム P450遺伝子領域を含むプローブの調製
シトクロム P450遺伝子プローブを調製するために公知の 2種のシトクロム P450遺伝子を放線菌から増幅した。 すなわちス トレプトマイセス サーモトレ ランス（Streptomyces thermotolerans) ATCC11416由来 0RF- A遺伝子（Biosci . Biotechnol. Biochem. 59 : 582- 588, 1995)を増幅するために、 それぞれ、 以下 の配列番号 1 2および 1 3に示す塩基配列からなる 2種のプライマー、 即ち、 CB-1Fおよぴ CB- 2Rを合成した。
CB-1F： 5' - ATGACAGCTTTGAATCTGATGGATCCC - 3' (配列番号 1 2 )
CB-2R： 5' - TCAGAGACGGACCGGCAGACTCTTCAGACG- 3' (配列番号 1 3 )
—方でス卜レプ卜マイセス ·ベネズェラエ（Streptomyces venezuelae) ATCC15439由来 OikC遺伝子（Chem. Biol. 5 : 661- 667, 1998)を増幅するために、 それぞれ、 以下の配列番号 1 4および 1 5に示す塩基配列からなる 2種のブラ イマ一、 即ち、 PKC- 1Fおよび PKC-2Rを合成した。
PKC-1F： 5' -GTGCGCCGTACCCAGCAGGGAACGACC-3' (配列番号 1 4 )
PKC-2R： 5' -TCACGCGCTCTCCGCCCGCCCCCTGCC- 3' (配列番号 1 5 )
これらのプライマーを用いて PCRを下記の条件にて行った。
(PCR反応液組成）
滅菌精製水 31 /z l
2倍濃縮 GC buffer 50 μ ΐ
dNTP混合溶液（dATP， dGTP， dTTP, dCTP各 2. 5mM) 16 μ 1
primer-F (lOOpmol/ μ 1) 0. 5 1
primer-R (lOOpmol/ μ 1) 0. 5 1
ATCC11416株または ATCC15439株のゲノム DNA dOOng/ μ 1) Ι μ Ι
LA Taq polymerase (5u/ μ 1，宝酒造社） 1 μ 1
(反応温度条件）
95°C 3分
(98°C 20秒， 63°C 30秒， 68°C 2分） 30サイクル
72°C 5分
この反応の結果增幅された 2種の 1. 2kb DNA断片を QIAGEN PCR
Purification Kit (QIAGEN社）で精製した後、 各 DNA断片 lOng/ μ 1ずつを含む 等量混合溶液を調製してプローブ溶液とした。
実施例 4 ：ケト合成酵素コード領域を含むプローブを用いたスクリーニング 実施例 2で調製した Mer- 11107株のゲノム DNAライブラリ一のパッケージン グ液を使つて大腸菌 XL-lBlue MR (Stratagene社）を宿主とし、 Stratagene社の マニュアルに従って形質導入した。 形質導入操作後の菌液を 10枚の LB- 50 // g/mlアンピシリン- 1. 5%寒天培地シャーレ （内径 90 、 高さ 15mm) に分注し て広げ、 37°Cで 18時間培養した。 各シャーレに生育したコロニーを HybondoN+ フイノレター (amersham biosciences社)（こ早 し、 HybondoN+フイノレターこ添付 のマニュアルに記載された条件でアルカリ処理、 中和処理を行い、 80°Cで 2時 間乾燥することでフィルター上にコロニー由来の DNAを固定化した。
実施例 3 ( 1 ) にて調製したケト合成酵素領域を含む 930b DNA断片 lOOng をフローフ ίこして AlkPhos Direct System araersham biosciences社)を用レヽて ゲノム DNAライブラリ一をコロニーハイブリダィゼーション法でスクリ一ニン グした。 ハイブリダイゼーションは塩濃度 0. 5M NaClで 65°Cで 2時間行つた。 プローブ DNAの標識、 ハイブリダィゼーションおよび検出の条件については AlkPhos Direct Systemに添付されたマニュアルに記載された条件に従った。 試験した約 7, 600コロニーのうち、 アルカリホスファターゼで標識したプロ一 ブと強くハイブリダィズした 59コロニーを分離した。 このコロニーから派生 した大腸菌クローンからコスミ ドを抽出精製した。
実施例 5 ：シトクロム P450遺伝子領域を含むプローブを用いたプラジェノ ライ ド生合成遺伝子領域を有するコスミドクローンの選択確認
実施例 4で得られた各コスミ ドの DNA溶液 2 ^ 1を HybondoN+フィルター上に スポットし、 添付のマニュアルに記載された条件でアルカリ処理、 中和処理を 行い、 さらに 80°Cで 2時間乾燥することでフィルター上に DNAを固定ィヒした。 このフィルターを用いて、 実施例 3にて記述したシトクロム P450遺伝子断片 をプローブとして実施例 4と同じ条件でハイブリダイゼーションを行つた。 こ の結果プローブと強くハイブリダィズしたコスミ ド 1つを選択し、 PKS58と命 名した。
pKS58 DNAを制限酵素 Sau3AIで部分分解した後、 ファージベクタ一 Zap Express, BamHI- CIAP処理済（Stratagene社）にライゲーシヨンし、 Gigapack III XL Kit (Stratagene社）を用いてラムダファージにパッケージングした。 こ のファージ液を大腸菌 XL1 - Blue MRF' に感染させて、 プラークを形成させた。 実施例 3 ( 2 ) で調製したシトクロム P450遺伝子プローブを用いてプラーク ハイブリダイゼーションを行うことで、 約 2 kbのシトクロム P450遺伝子を含 む DNA断片をサブクローニングした。
このシトクロム P450遺伝子 DNA断片の配列を決定し、 シトクロム P450コ一 ド領域とされる N -末端および C -末端から、 それぞれ、 以下の配列番号 1 6お よび 1 7に示す塩基配列からなる 2種のプライマー、 即ち、 PDL58-1Fおよび - PDL58-2Rを合成した。
PDL58-1F： 5' -GCCCCGCATATGGATCTGGAAACCCAACTTCTC-3' (配列番号 1 6 )
PDL58-2R： 5' - GCACTAGTCAGCCGCGCTCGACGAGGAGGTG-3' (配列番号 1 7 )
これらのプライマーを用いて PCRを下記の条件にて行った。
(PCR反応液組成）
滅菌精製水 31
2倍濃縮 GC buffer 50 μ 1
dNTP混合溶液 (dATP, dGTP, dTTP, dCTP各 2. 5mM) 16 μ 1
PDL58-1F (lOOpmol/ μ 1) 0. 5 μ 1
PDL58-2R (lOOpmol/ μ 1) 0. 5 μ ϊ
pKS58DNA (10ng/ / l) Ι μ ΐ
LA Taq polymerase (5u/ μ 1，主酒造社) 1 At 1
(反応温度条件）
95°C 3分
(98°C 20秒， 63。C 30秒， 68°C 2分） 20サイクル
72°C 5分
この反応の結果増幅された 1. 2kb DNA断片を QIAGEN PCR Purification Kit (QIAGEN社）で精製した後、 制限酵素 Ndelと Spelで分解した。 反応後 DNA を 0. 8%ァガロースゲル上で電気泳動し、 分離した 1. 2kb DNA断片を切り出し、 QIAGEN GelExtraction Kit (QIAGEN社）を用いて DNAを回収精製した。 この DNA 断片をシトクロム P450遺伝子発現用プラスミ ド pT7NS- camAB (特願 2002- 110311号） の Ndelおよぴ Spel部位へ挿入することで pPDL96を構築した。
このプラスミドで大腸菌 BL21 (DE3)を形質転換し、 M9CG培地 （1· 28%
Na2HP04 · 7 0、 0. 3% KH2P04、 0. 05% NaCl、 0. 1 % NH4C1、 1 %カザミノ酸、 0. 4%グルコース、 ImM MgCl2、 100 z M CaCl2、 50 g/mlアンピシリン） にて菌 密度として 0D6。。（optical density at 600 nm)が 0· 8に達するまで培養した。 5 -ァミノレブリン酸および IPTGをそれぞれ 80 μ g/ml , 0. ImMになるよう添カロ した後、 22°Cで 25時間培養を継続し、 シトクロム P450タンパク質を誘導させ た。 誘導後、 菌体を集めて CV緩衝液 [50mM リン酸ナトリゥム緩衝液 (PH7. 3)、 ImM EDTA、 10%グリセロール、 ImMグノレコース] 5mlに懸濁した。 この液 lmlを 試験管に取り、 プラジェノライド Bの 6位デォキシ体である ME- 265の DMS0溶 液（50mg/ l)を 5 μ 1添加して 28°Cで 15時間ィンキ
ュペートした。 この反応液に lmlのァセトニトリルを加えて混合した後、 遠心 分離して上清を下記の条件にて HPLCで分析することでブラジエノライ ド Bへ の変換を認めた。 このことから pKS58にプラジエノライ ド生合成遺伝子領域が 含まれていることを確認、した。
(HPLCの分析条件)
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ
カラム： Develosi l ODS UG-3 (4. 6mra X 50rara 3 μ m)
移動相 （容量0 /o) ： 45%〜55% メタノール（0〜5分）
55% メタノール（5〜13分)
55%〜70ο/ο メタノール（13〜21分）
45% メタノール（21〜25分）
流速： 1. 2ml/分 ·
検出： UV240nm
ィンジェクション容量： 5 1
カラム温度： 40°C
分析時間： 25分
保持時間： ME - 265； 20分、 プラジエノライ ド B； 13分、
実施例 6 ： シトクロム P450遺伝子に隣接する生合成遺伝子クラスターを含 むコスミ ドの選定
実施例 4で得られた、 59個のコスミ ド DNAの中で、 実施例 5で得られたシト クロム P450遺伝子に隣接する生合成遺伝子クラスターを含むコスミ ドを選定 した。
59個のコスミ ド DNAを制限酵素 EcoRI, BaraHIで消化し、 得られた各々の DNA をァガロースゲル電気泳動し、 エバーメクチンァグリコン合成酵素遺伝子
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 9509 - 9514、 特開平 2000-245457号公報 または W0 00/50605パンフレット参照） の KS ドメインの DNA (aveA2の KS6 domain)、 AT ドメインの DNA (aveAlの AT2 domain)、 および実施例 5で得られ たシトクロム P450遺伝子をプローブに用いたサザンハイブリダイゼーション を fiつた。
制限酵素 EcoRI， BamHIで消化した DNAの電気泳動パターンと、 各プローブで のハイブリダィズしたバンドパターンの結果から、 まず、 同じ長さでハイブリ ダイズした DNA断片を持つコスミドをグループ化した。 そのうち、 ほぼ同等の パターンを示したコスミドについては 1つを残して削除し、 残ったものでパン ドパターンが部分一致するものについて整列化した。 そして、 実施例 5で得ら れたシトクロム P450遺伝子を含むコスミ ド pKS58を中心とし、 シトクロム P450遺伝子側からポリケチド合成酵素遺伝子を含む側に隣接するコスミ ドとし て pKS56，pKS54を選出し、 さらに pKS54に隣接するコスミドとして pKS35を選 出した。 また、 コスミ ド pKS58とシトクロム P450遺伝子側からポリケチド合 成酵素遺伝子を含まな!/、側に隣接するコスミ ドとして pKS23を選出した。 その 結果、 図 2に示すようにプラジェノライド生合成遺伝子クラスターを包括する コスミ ドクローンとして pKS23, pKS58，pKS56, pKS54, .pKS35が選定された。
実施例 7 ：プラジェノライド生合成遺伝子クラスタ一破壌株の作製 実施例 6で選定されたコスミドのうち、 ポリケチド合成領域を含むと考えら れる pKS56の DNAを用いた生合成遺伝子破壊株の作製を行った。
pKS56のコスミ ド DNAを制限酵素 BamHIで消化し、 2kbのスぺクチノマイシ ン耐' I'生： ¾1：5子、 aminoglycoside 3" -adenyltransf erase； r aadAと田各 する ときがある） BamHI消化断片と NEB quick ligation kit (New England Biolabs 社） を用いて連結した。 こうして、 BamHIにより pKS56のコスミド DNA内の 30kb (図 2の A部位：配列番号 1のヌクレオチド番号 31194- 61374)が欠失し、 2 kbのスぺクチノマイシン耐性遺伝子と組み換わったコスミ ド p56aadAを得た。 なお、 aadAは、 プラスミ pHP45omega (Gene 190， 315-317 (1997) )を制限酵素 BamHIで消化して作成したものである。
得られたコスミ ド p56aadAを Mer- 11107株に組み込むために、 シャトルべク ター PKU253を用いた。 p56aadAを制限酵素 EcoRIで消化し、 ァガロースゲル電 気泳動により、 各々コスミ ドベクター部分を含まない 14kbを分離して、 ジー ンクリーン IIキット （バイオ 101社） を用いて精製した。 得られた 14kbの EcoRI断片を、 シャトルベクター pKU253を EcoRIで消化したものと NEB quick l igation kitを用いて連結し、 pKU253- 56aadAを得た。 なお、 pKU253は、 図 3 に示すとおり、 放線菌 Streptomyces coel icolor A3 (2)由来のプラスミド SCP2
(J. Gen. Microbiol. , 126, 427-442, 1981) をベースに大腸菌のプラスミ ド pUC19 (Gene, 33 (1) , 103 - 119, 1985)を繋ぎ、 アミノグリコシド耐性遺伝子 aphll
(Gene, 19 (3)， 327-336， 1982) と接合遺伝子の oriT (J. Bacteriol. , 169, 5320 5323， 1987)を入れて作成したものである。
得られた pKU253- 56aadAを、 接合大腸菌 S17- 1 (ATCC47055) へエレクトロボ レーシヨン法を用いて形質転換し、 S17- l/pKU253- 56aadA株を得た。 得られた S17- l/pKU253 - 56aadA株を、 25 /x g/mlのカナマイシンおよび 200 χ g/mlのスぺ クチノマイシンを含む LB培地（1 %バタトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl) 10mlに植菌し、 30°Cで 2時間振盪培養後、 集菌し、 LB培地 10mlで 2回洗浄後、 LB培地 5mlに懸濁した。 これを供与菌懸濁液とした。
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、 Mer- 11107株を TSB培地（Trypto- Soya broth :日水製薬社） 10mlに植菌し、 30°Cで 5時間振盪培養後、 集菌し、 滅 菌水 10ml で 2回洗浄後、 滅菌水 1ml に懸濁した。 これを受容菌懸濁液とした。 得られた S17 - l/pKU253 -56 aadA株供与菌懸濁液500 ^ 1を、 Mer-11107株受容 菌懸濁液 10 μ 1と混ぜ、 Actino Medium No. 4寒天培地 （日本製薬社） に塗布し た。 30°Cで 18時間培養後、 2mg/mlのリボスタマィシンを含む 2. 5mlの
SNA (0. 8%栄養培地： Difco社、 0. 4%寒天）を重層した。 30°Cで 7日間培養し、 リボスタマィシンに耐性な pKU253- 56aadA形質転換株を得た。
得られた pKU253- 56aadA形質転換株を、 リボスタマイシンを含まない TSB培 地 10mlに植菌し、 30°Cで 24時間振盪培養した。 なお、 ブラスミ ドベクター PKU253は Mer- 11107株中での複製効率が悪く、 薬剤耐性マーカ一（リボスタマ イシン）を含まない培地で培養すると、 Mer - 11107株は pKU253 を保持できなレ、。
PKU253- 56aadA形質転換株培養液を集菌し、 滅菌水 10mlで 2回洗浄後、 滅菌 水 10mlに懸濁した。 適当に希釈した懸濁液を、 200 g/mlのスぺクチノマイシ ンを含む YMS寒天培地 （0. 4%酵母エキス、 1%麦芽エキス、 0. 4%溶性デンプ ン、 2%寒天、 10mM塩化カルシウム） に塗布し、 30°Cで 4日間培養した。 スぺ クチノマイシンを含む YMS寒天培地で生育したシングルコ口ニーを 200 μ g/ml のスぺクチノマイシンを含む YMS寒天培地おょぴ 200 μ g/mlのリボスタマイシ ンを含む YMS寒天培地に植えかえ、 30°Cで 2日間培養した。
培養後、 スぺクチノマイシン耐性で、 リボスタマイシン感受性の株を選択し、 ゲノム DNA上の目的とする生合成遺伝子とみられる領域にスぺクチノマイシン 耐性遺伝子が挿入されたことをサザンハイブリダイゼーション法で確認した。 得られた菌株を Mer- 1110ァ- 56 :： aadA株とした。
実施例 8 ：プラジェノライド生合成遺伝子クラスタ一破壊株のブラジェノラ ィド生産性試験
実施例 7で得られた Mer - 11107-56 :： aadA株とコント口ールとして親株の Mer- 11107株とその形質転換株の Mer_11107/pKU253株の計 3株について、 プラ ジエノライド Bの生産性を試験した。
実施例 7で得られた Mer- 11107- 56 :： aadA株と、 Mer- 11107株および Mer- 11107/pKU253株の各々の凍結種母 200 W 1を、 種母培地 （溶性でんぷん 2%、 エスサンミート 2%、 酵母エキス 0. 5%、 K2HP04 0. 1%、 MgS04 · 7H20 0. 25%、 CaC03 0. 3% pH無調整） 20mlに植菌し、 25°Cで 2日間培養した。
得られた種母培養液の 300 1を、 本培養培地 （スタビローズ 5%、 ダルコ一 ス 1%、 フアルマメディ了 30/0、 β -シクロデキストリン 2%、 CaC03 0. 1% pH7. 5) 30mlに植菌し、 25°Cで 4日間および 5日間培養した。
培養終了後、 得られた培養液に対して 9倍量のァセトニトリルを加えて抽出 した。 得られた抽出液について HPLCにてプラジェノライド B量を測定した。 測定結果を表 1に示す。 また、 HPLCの測定条件を以下に示す。
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ
カラム ： Develosil ODS UG-3 (4. 6讓 X 50蘭 3 /i m)
移動相 （容量％) ： 45%〜55% メタノール（0〜5分）
55% メタノール（5〜13分）
55%〜70% メタノール（13〜21分)
45% メタノール（21〜25分)
流速： 1. 2ml/分
検出 ： UV240nra
ィンジェクション容量： 5 μ 1
カラム温度： 40°C
分析時間： 25分
保持時間：ブラジエノライド B 13分
表 1
Figure imgf000037_0001
この結果、 図 2における A部位を欠損した Mer-11107- 56 : : aadA株はプラジ エノライ ド Bを全く作らない株であることが確認された。 このことより.、 A部 位中の遺伝子がプラジェノライドの生合成に関連していることが示された。 実施例 9 ：プラジェノライド生合成遺伝子クラスターの塩基配列の決定 プラジェノライ ド生合成遺伝子をコードする一群の DNAの塩基配列を決定し た。 実施例 8より図 2の A部位の欠損株はプラジエノライ ド Bを生産できない ことから、 A部位中の遺伝子がプラジェノライ ドの生合成に関連している。 よ つて実施例 6で選出した pKS35、 pKS54, pKS58および pKS23の 4つのコスミ ド について、 これらコスミ ド中の挿入 DNA断片の塩基配列を決定した。
各コスミ ドを、 塩化セシウム法を用いて単離後、 HydroShear (Genomic solutions社）を用いて約 lkbに剪断し、 BKL Kit (宝酒造社） を用いて、 サブ クローン化した。
得られたサブクローンに対し、 蛍光標識プライマーを用いたサイクルシーク エンス反応 （amersham biosciences社） を行い、 それぞれの断片の塩基配列を 決定 （MegaBACE 1000 : amersham biosciences社） することにより、 プラジェノ ライドの合成に関連する DNAを含む約 75kbの塩基配列を決定した（配列番号 1 参照)。
この DNA中のオープン · リーディング ' フレーム（0RF)を検索したところ、 以下の 8つの 0RFが含まれていた。
pldA I：塩基 8340〜27935
pldA II：塩基 28021〜49098
pldA III :塩基 49134〜60269
pldA IV：塩基 60269〜65692
pldB:塩基 65707〜66903
pldC:塩基 68160〜66970
pldD:塩基 69568〜68270
pldR:塩基 72725〜70020
各 0RFとコスミ ドの対応関係を図 2に示す。
実施例 1 0 ：プラジェノライドの 6位水酸化酵素遺伝子 （pldB) 破壊株の作 製
実施例 9で決定されたプラジェノライドの生合成に関連する DNAを含む約 75kbの塩基配列 （配列番号 1参照） より、 図 1に示された生合成経路でプラジ エノライ ドが生合成されることが明らかとなった。 そこで、 そのうちのシトク 口ム P450遺伝子 pldBのみを破壌することで、 プラジエノライ ド Bの 6位デォ キシ体である ME- 265のみを生産する株を取得可能と考え、 以下の方法で pldB 破壊株を作製した。
配列番号 1記載の塩基配列に基づいて、 それぞれ、 以下の配列番号 1 8、 1 9、 2 0および 2 1に示す塩基配列からなる 4種のプライマー、 即ち、 pldB - L-Bgl2F、 pldB- L-Hind3R、 pldB- R- Hind3Fおよび pl dB- R- Bgl2Rを合成した。 PldB-L-Bgl2F : 5 ' - GGGAGATCTAGAGGCCGGTTACCTCTACGAGTA- 3 ' (配列番号 1 8 ) pldB- L- Hind3R : 5， - GGGAAGCTTGCGATGAGCTGTGCCAGATAG- 3， （配列番号 1 9 ) pldB- R- Hind3F: 5 ' -GGGAAGCTTGAACTGGCGCGACAGTGTCTT-3， (配列番号 2 0 ) pldB- R- ¾12R : 5， -GGGAGATCTGCAGCGGATCGTCTTCGAGACCCTT-3 ' (配列番号 2 1 )
これらのプライマーを用いて PCRを下記の条件にて行った。
(PCR反応液組成）
滅菌精製水 30 μ ΐ
2倍濃縮 GC buffer · 50 μ 1
dNTP混合溶液（dATP, dGTP, dTTP, dCTP各 2. 5mM) 16 μ 1
pldB— L- Bgl2F または pldB- R-Hind3F (50pmol/ μ 1) 1 1
pldB-L-Hind3R または pldB_R- Bgl2R (50pmol/ 1) Ι μ ΐ
Mer - 11107株 total DNA (100ng/ 1) Ι μ ΐ
LA Taq polymerase (5u/ μ 1,宝酒造社） Ι β ΐ
(反応温度条件）
95°C 3分
(98。C 20秒, 63°C 30秒， 68°C 2分） 30サイクル
72°C 5分
この反応の結果、 pldB - L-Bgl2Fと pldB - L - Hind3Rを用いた反応から、 配列番 号 1の塩基 64756から塩基 66302を含む 1. 57kbの DNA断片 （DNA断片 L1) が 増幅され、 PldB-R-Hind3Fと pldB-R-Bgl2Rを用いた反応から、 配列番号 1の塩 基 66849から塩基 68368を含む 1· 54kbの DNA断片 （DNA断片 R1) が増幅され た。 DNA断片 L1及び R1を QIAGEN PCR purification Kit (QIAGEN社）で精製し た後、 制限酵素 Bglllと Hindlllで消化した。
制限酵素 Bgl llと Hindlllで消化した DNA断片 L1及び R1と、 制限酵素 Hindlllで消化した 2. 3kbのハイグロマイシン B耐性遺伝子 (pHP45omegahyg ： Gene 190, 315 - 317, 1997 由来。 以下 hygと略記することがある） 、 及ぴ制限 酵素 BamHIで消化したシャトルべクタ一 pKU253 (図 3参照）、 の計 4者を DNA ligation kit ver. 2. 1 (宝酒造社） で違結した。 こうして DNA断片 L1と R1の 間にハイグロマイシン B耐性遺伝子が.挿入された形の約 5. 4kbの DNA断片が、 PKU253に挿入された約 21. 4kbのプラスミド pKU253-Ll- hyg- R1が構築された。 得られた pKU253- LI- hyg- R1を、 接合大腸菌 S17- 1へエレクトロポレーショ ン法を用いて形質転換し、 . S17-l/pKU253-Ll-hyg-Rl株を得た。 得られた S17 - l/pKU253-Ll-hyg-Rl株を、 25 μ g/mlのカナマイシンおよび 100 /z g/mlのハイ グロマイシン Bを含む LB培地（1 %バクトトリプトン、 0. 5%酵母ェキス、 0. 5%NaCl) 10mlに植菌し、 30°Cで 2時間振盪培養後、 集菌し、 LB培地 10mlで 2回洗浄後、 LB培地 5mlに懸濁した。 これを供与菌懸濁液とした。
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、 Mer- 11107株を TSB培地 (Trypto- Soya broth :日水製薬社） 10mlに植菌し、 30DCで 5時間振盪培養後、 集菌し、 滅 菌水 10ml で 2回洗浄後、 滅菌水 1ml に懸濁した。 これを受容菌懸濁液とした。 得られた S17- 1/ pKU253-Ll-hyg-Rl株供与菌懸濁液 500 1を、 Mer- 11107株 受容菌懸濁液 10 1と混ぜ、 Actino Medium No. 4寒天培地 （日本製薬社） に塗 布した。 30。Cで 18時間培養後、 2mg/mlのリボスタマイシンを含む 2. 5mlの SNA (0. 8%栄養培地： D:ifco社、 0. 4°/0寒天）を重層した。 30°Cで 7日間培養し、 リポスタマイシンに耐性な PKU253- LI- hyg-Rl形質転換株を得た。
得られた pKU253- L卜 hyg-Rl形質転換株を、 リボスタマイシンを含まない TSB 培地 10mlに植菌し、 30°Cで 24時間振盪培養した。 pKU253- Ll_hyg- R1形質転換 株培養液を集菌し、 滅菌水 10mlで 2回洗浄後、 滅菌水 10mlに懸濁した。 適当 に希釈した懸濁液を、 200 g/mlのハイグロマイシン Bを含む YMS寒天培地
(0. 4%酵母エキス、 1%麦芽エキス、 0. 4%溶性デンプン、 2%寒天、 lOmM塩化 カルシウム） に塗布し、 30°Cで 4日間培養した。 ハイグロマイシン Bを含む YMS寒天培地で生育したシングルコ口ニーを 200 μ g/mlのハイグロマイシン B を含む YMS寒天培地おょぴ 200 μ g/mlのリボスタマィ、/ンを含む YMS寒天培地 に植えかえ、 30°Cで 2日間培養した。
培養後、 ハイグロマイシン B耐性で、 リボスタマイシン感受性の株を選択し た。 得られた菌株は、 ゲノム中の pldB遺伝子内の 546bp (配列番号 1の塩基 66303から塩基 66848) を欠失し、 その間にハイグロマイシン B耐性遺伝子が 挿入された pldB破壌株であり、 Mer-11107pldB :： hyg株とした。
実施例 1 1 ：プラジェノライ ドの 6位水酸化酵素遺伝子 （pldB) 破壊株のプ ラジェノライ ド生産性試験
実施例 1 0で得られた Mer- 11107 pldB :： hyg株の凍結種母 200 μ 1を、 種母 培地 （溶性でんぷん 2%、 エスサンミート 2%、 酵母エキス 0. 5%、 K2HP04 0. 1 %、 MgS04 - 7H20 0. 25% , CaC03 0. 3% pH無調整) 20mlに植菌し、 25°Cで 2 日間培養した。
得られた種母培養液の 300 を、 本培養培地 （スタビローズ 5%、 ダルコ一 ス 1 %、 フアルマメディ了 3%、 β -シクロデキストリン 2%、 CaC03 0. 1 % pH7. 5) 30mlに植菌し、 25°Cで 4日間および 5日間培養した。
培養終了後、 得られた培養液 20mlに同量のァセトニトリルを加えて抽出し た。 その抽出液の一部を分取しァセトニトリルで 5倍量に希釈し、 下記の条件 にて HPLCでプラジエノライ K B及び ME- 265の量を測定した。 測定結果を表 2 に示す。
(HPLC分析条件）
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ
カラム： Develosi l ODS UG-3 (4. 6腿 X 50mm 3 i m)
移動相 （容量％) ： 45%〜55% メタノール (0〜5分)
55% メタノール（5〜13分）
55%〜70% メタノール（13〜17分）
70% メタノール（17〜35分）
45% メタノール（35〜40分）
流速： 1. 2ml/分
検出： UV240nm
ィンジェクション容量： 10 μ 1
カラム温度： 40°C 分析時間： 35分
保持時間： ME - 265； 22分、 プラジエノライ ド B； 16分
表 2
Figure imgf000042_0001
実施例 1 2 ： ME - 265の単離精製と構造確認
実施例 1 1で得られたァセトニトリノレ抽出液をろ過し、 菌体を水 10ml、 40ml で洗浄した。 ろ液と洗浄液を一緒にして酢酸ェチル 100mlで抽出した。 さらに 水層に飽和食塩水 50mlを加え、 酢酸ェチル 50mlで再度抽出した。 酢酸ェチル 層を合わせ飽和食塩水 50mlで洗浄した後、 無水硫酸ナトリウムにより乾燥し た。 溶媒を留去した後、 TLC (薄層クロマトグラフ、 Merck社製 Art. 5744 展 開溶媒 トルエン：アセトン = 2 : 1) により精製し ME- 265を 20. 3mg得た。
-蘭 Rスぺクトノレ' (CD30D， 500MHz)： δ ppra (積分，多重度，結合定数 J (Hz) )： 0. 87 (3H, d, J=7. OHz)， 0. 90 (3H, d， J=7. OHz) , 0. 94 (3H, d, J=7. 3Hz)， 0. 97 (3H, d， J=7. OHz)， 1. 08 (3H, d, J=7. OHz) , 1. 17-1. 21 (IH, m) , 1. 24-1. 36 (2H, ra)， 1. 42-1. 52 (3H, m) , 1. 61-1. 66 (3H, m) , 1. 74 (3H, d， J=l. 1Hz)， 1. 89-1. 96 (IH, m)， 2. 00 (3H， s) , 2. 41-2. 47 (1H， m) , 2. 43 (IH, dd, J=5. 5, 13. 9Hz) , 2. 51 - 2. 58 (IH, m)， 2. 56 (IH, dd, J=3. 7， 13. 9Hz) , 2. 65 (IH, dd, J=2. 2, 8. 1Hz) , 2. 72 (IH, dt， J=2. 2, 5. 9Hz) , 3. 51 (IH, dt, J=4. 4， 8. 4Hz) , 3. 75-3. 80 (IH, m)， 4. 91 (IH, dd, J=8. 8， 10. 6Hz) , 5. 00 (1H， d， J=10. 6Hz) , 5. 42 (1H， dd, J=9. 2Hz, 15. OHz) , 5. 49 (IH, dd, J=9. 2, 15. OHz) , 5. 65 (IH, dd, J=8. 4, 15. 0Hz) , 6. 08 (IH, d, J=10. 6Hz)， 6. 32 (1H， dd, J=10. 6, 15. OHz)
この結果、 pldB破壌株である Mer_11107 pldB : : hyg株はプラジェノライ B を生産せずに、 ME - 265を生産していることが確認された。 すなわち、 上記方法 により、 ME - 265を製造、 取得することができた。
実施例 1 3 ：プラジェノライ ドの 7位ァシル化酵素遺伝子 （pldC) 破壊株の 作製
実施例 9で決定されたプラジェノライ ドの生合成に関連する DNAを含む約 75kbの塩基配列 （配列番号 1参照） より、 図 1に示された生合成経路でプラジ エノライ ドが生合成されることが明らかとなった。 そこで、 そのうちの 7位ァ シル化酵素遺伝子 pldCのみを破壊することで、 プラジェノライドの 7位脱ァ シル体 (プラジェノライ ド B12)を生産する株を取得可能と考え、 以下の方法で pldC破壊株を作製した。
配列番号 1記載の塩基配列に基づいて、 それぞれ、 以下の配列番号 18、 22、 23および 24に示す塩基配列からなる 4種のプライマー、 即ち、 pldB-L- Bgl2F、 pldC_L_Hind3R、 pldC- R- Hind3Fおよび pldC_R- Bgl2Rを合成した。
pldB- L- Bgl2F： 5 ' - GGGAGATCTAGAGGCCGGTTACCTCTACGAGTA-3 ' (配列番号 1 8 ) pldC-L-Hind3R： 5 ' -GGGAAGCTTCCAGTCTCGTGCTCACCAA-3 ' (配列番号 2 2 ) pldC-R-Hind3F： 5 ' -GGGAAGCTTAGGCCCGTTGGAGAAGCTGTT-3 ' (配列番号 2 3 ) pldC-R-Bgl2R： 5 ' -GGGAGATCTGCAGCCTCATCCTCACCGAGCTGAA-3 ' (配列番号 2 4 )
これらのプライマーを用いて PCRを下記の条件にて行った。
(PCR反応液組成）
滅菌精製水 30
2倍濃縮 GC buffer . 50 1
dNTP混合溶液（dATP, dGTP, dTTP, dCTP各 2. 5mM) 16 μ 1
pldB - L- Bgl2F または pldC_R- Hind3F (50pmol/ l) Ι μ ΐ
PldC-L-Hind3R または pl dC- R- BglSR
Figure imgf000043_0001
1) Ι μ ΐ
Mer - 11107株 total DNA dOOng/ μ 1) 1 1
LA Taq polymerase (5u/ μ 1,宝酒造社） 1 μ 1
(反応温度条件）
95°C 3分
(98°C 20秒， 63°C 4分） 30サイクル
68°C 5分
この反応の結果、 pldB-L-Bgl2Fと pldC - L-Hind3Rを用いた反応から、 配列番 号 1の塩基 64756から塩基 67220を含む約 2. 5kbの DNA断片 （DNA断片 L2) 力 S 増幅され、 pldC - R-Hind3Fと pldC-R-Bgl2Rを用いた反応から、 配列番号 1の塩 基 68106から塩基 71112を含む約 3. Okbの DNA断片 （DNA断片 R2) が増幅され た。 DNA断片 L2及び R2を QIAGEN PCR purification Kit (QIAGEN社）で精製し た後、 制限酵素 Bglllと Hindlllで消化した。
制限酵素 Bglllと Hindlllで消化した DNA断片 L2及ぴ R2と、 制限酵素 Hindlllで消化した 2. 3kbのハイグロマイシン B H生遺伝子 （pHP45omegahyg ： Gene 190, 315 - 317， 1997 由来。 以下 hygと略記することがある） 、 及ぴ制限 酵素 BamHIで消化したシャトルべクタ一 pKU253 (図 3参照）、 の計 4者を DNA ligation kit ver. 2. 1 (宝酒造社） で連結した。 こうして DNA断片 L2と R2の 間にハイグロマイシン B而村生遺伝子が挿入された形の約 7· 8kbの DNA断片が、 PKU253に挿入された約 23. 8kbのプラスミド pKU253 - L2- hyg - R2が構築された。 得られた pKU253 - L2 - hyg-R2を、 接合大腸菌 S -lへエレクトロポレーショ ン法を用いて形質転換し、 S17-l/pKU253- L2- hyg- R2株を得た。 得られた S17 - l/pKU253-L2-hyg-R2株を、 25 μ g/mlのカナマイシンおょぴ 100 μ g/mlのハイ グロマイシン Bを含む LB培地（1%バクトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl) 10mlに植菌し、 30°Cで 2時間振盪培養後、 集菌し、 LB培地 10mlで 2回洗浄後、 LB培地 5mlに懸濁した。 これを供与菌懸濁液とした。
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、 Mer- 11107株を TSB培地（Trypto- Soya broth:日水製薬社） 10mlに植菌し、 30°Cで 5時間振盪培養後、 集菌し、 滅 菌水 10ml で 2回洗浄後、 滅菌水 1ml に懸濁した。 これを受容菌懸濁液とした。 得られた S17 - 1/ pKU253-L2-hyg-R2株供与菌懸濁液 500 μ 1を、 Mer_11107株 受容菌懸濁液 10 1と混ぜ、 Actino Medium No, 4寒天培地 （日本製薬社） に塗 布した。 30°Cで 18時間培養後、 2rag/mlのリポスタマイシンを含む 2· 5mlの SNA (0. 8%栄養培地： Dif co社、 0. 4%寒天）を重層した。 30°Cで 7日間培養し、 リポスタマイシンに耐性な PKU253-L2- hyg- R2形質転換株を得た。
得られた pKU253- L2- hyg- R2形質転換株を、 リボスタマイシンを含まない TSB 培地 10mlに植菌し、 30°Cで 24時間振盪培養した。 pKU253- L2- hyg- R2形質転換 株培養液を集菌し、 滅菌水 10mlで 2回洗浄後、 滅菌水 10mlに懸濁した。 適当 に希釈した懸濁液を、 200 μ g/mlのハイグロマイシン Bを含む YMS寒天培地 '
(0,4%酵母エキス、 1 %麦芽エキス、 0. 4°/。溶性デンプン、 2%寒天、 10mM塩化 カルシウム） に塗布し、 30°Cで 4日間培養した。 ハイグロマイシン Bを含む YMS寒天培地で生育したシングルコロニーを 200 g/mlのハイグロマイシン B を含む YMS寒天培地おょぴ 200 μ g/mlのリボスタマィシンを含む YMS寒天培地 に植えかえ、 30°Cで 2日間培養した。
培養後、 ハイグロマイシン B耐性で、 リボスタマイシン感受性の株を選択し た。 得られた菌株は、 ゲノム中の pldC遺伝子内の 886bp (配列番号 1の塩基 67221から塩基 68105) を欠失し、 その間にハイグロマイシン B耐性遺伝子が 挿入された pldC破壌株であり、 Mer-11107pldC : : hyg株とした。
実施例 1 4 ：プラジェノライドの 7位ァシル化酵素遺伝子 （pldC) 破壌株の プラジェノライド生産性試験
実施例 1 3で得られた Mer- 11107 pldC : : hyg株の凍結種母200 μ 1を、 種母 培地 （溶性でんぷん 2%、 エスサンミート 2%、 酵母エキス 0. 5%、 K2HP04 0. 1%、 MgS04 . 7H20 0. 25%、 CaC03 0. 3% pH無調整) 20mlに植菌し、 25°Cで 2 日間培養した。
得られた種母培養液の 300 μ 1を、 本培養培地 （スタビローズ 5%、 ダルコ一 ス 1 %、 フアルマメディア 3%、 β -シクロデキス トリン 2%、 CaC03 0. 1 % pH7. 5) 30mlに植菌し、 25°Cで 4日間おょぴ 5日間培養した。
培養終了後、 得られた培養液 25mlに同量のァセトニトリルを加えて抽出し た。 その抽出液の一部を分取しァセトニトリノレで 5倍量に希釈し、 下記の条件 にて HPLCでプラジェノライド B及ぴプラジェノライド B12の量を測定した。 測 定結果を表 3に示す。
(HPLC分析条件）
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ
カラム： Develos i l ODS UG - 3 (4. 6ram X 50膽 3 μ ηι)
移動相 （容量。/。） ： 45%〜55% メタノール（0〜5分）
55% メタノール（5〜13分） 55%〜70% メタノール（13〜； 17分）
70% メタノール（17〜35分）
45% メタノール（35〜40分）
流速： 1. 2ml/分
検出： UV240nm
ィンジェクション容量： 10 μ 1
カラム温度： 40°C
分析時間： 35分
保持時間：プラジエノライ ド B12； 16分、 プラジエノライド B； 12分
表 3
Figure imgf000046_0001
実施例 1 5 ：プラジェノライド B12の単離精製と構造確認
実施例 1 4で得られたァセトニトリル抽出液をろ過し、 更に水 10ml及ぴァ セトニトリル 10mlにて洗浄した。 ろ液を酢酸ェチル 40mlにて抽出し、 有機層 を硫酸ナトリウムにて乾燥後、 ろ過し、 減圧下濃縮した。 得られた残渣 91. 4mg を TLC (薄層クロマトグラフィー、 Merck社製 Art. 5744 展開溶媒；へキサ ン：酢酸ェチル = 10 : 50) にて精製し、 プラジェノライ ド B12 (Rf=0. 46， 3. lmg) を得た。
1.分子量： 478， ESI- MS m/z 501 (M+Na) +， 477 (M - H
2. ¾-NMRスぺク トル (CD30D, 500MHz)： β ppm (積分，多重度，結合定数 J (Hz) )： 0. 89 (3H, d， J=6. 7Hz) , 0. 90 (3H, d, J=7. 1Hz)， 0. 94 (3H， t， J=7. 5Hz)， 1. 07 (3H， d， J=6. 8 Hz) , 1. 08 (3H， d, J=6. 8Hz)， 1. 16-1. 26 (2H, m) , 1. 27-1. 36 (IH, m)， 1. 41-1. 67 (7H, ra) , 1. 74 (3H, d, J=l. 1Hz) , 2. 42 (IH, dd, J=5. 4, 14. 2Hz)， 2. 44-2. 58 (2H, m) ,
2. 56 (IH, dd, J=3. 5, 14. 1Hz) , 2. 65 (IH, dd, J=2. 3， 8. 2Hz) , 2. 72 (IH, dt, J=2. 3, 6. OHz) , 3. 51 (IH, dt, J=4. 4, 8. 6 Hz) , 3. 57 (IH, dd, J=9. 6, 9. 6Hz) , 3. 72-3. 79 (IH, m)， 5. 00 (IH, d, J=10. 7 Hz) , 5. 30 (IH, dd, J=9. 7， 15. 1Hz)， 5. 46 (IH, dd, J-9. 5， 15. 0Hz) ' 5. 65 (1H， dd， J=8. 4， 15. 1Hz) , 6. 07 (1H， d, J=10. 9Hz)， 6. 32 (1H， dd， J=10. 9， 15. 1Hz)
Figure imgf000047_0001
プラジェノライド B12
この結果、 pldC破壊株である Mer- 11107 pldC : : hyg株は、 プラジェノライ ド Bを生産せずにプラジェノライド B12を生産していることが確認された。 すなわ ち、 上記方法によりプラジェノライ ド B12を製造、 取得することができた。
実施例 1 6 ：プラジェノライドの 18, 19位エポキシ化酵素遺伝子 （pldD) 破 壊株の作製
実施例 9で決定されたプラジェノライドの生合成に関連する DNAを含む約 75kbの塩基配列 （配列番号 1参照） より、 図 1に示された生合成経路でプラジ エノライ ドが生合成されることが明らかとなった。 そこで、 18， 19位エポキシ 化酵素遺伝子 （pldD) を破壌し、 その下流の 7位ァシル化酵素遺伝子 （pldC) の発現を抑えることで、 プラジェノライ ドの 7位脱ァシル、 18, 19位ォレフィ ン体 （プラジェノライド Z) を生産する株を取得可能と考え、 以下の方法で pldD破壌株を作製した。
配列番号 1記載の塩基配列に基づいて、 それぞれ、 以下の配列番号 25、 26、 27および 28 に示す塩基配列からなる 4種のプライマー、 即ち、 pldD- L- Bgl2F, pldD-L- Hind3R、 pldD- R_Hind3Fおよび pldD- R- Bgl2Rを合成した。
pldD- L- Bgl2F: 5' -GGGAGATCTAGACCTGTCCATGGATCTGGAAAC -3' (配列番号 25) pldD-L-Hind3R： 5 ' - GGGAAGCTTCGGATCGTCTTCGAGACCCTT -3 ' (配列番号 26) pldD- R- Hind3F: 5， -GGGAAGCTTGTGGGGTGCCCTTTCTGACTT -3 ' (配列番号^) pldD- R- Bgl2R: 5， -GGGAGATCTGCAGGAGGAGCTGCTCGGGCTGAA -3， （配列番号 28) これらのプライマーを用いて PCRを下記の条件にて行った。
(PCR反応液組成）
滅菌精製水 30 μ ΐ
2倍濃縮 GC buffer 50 1
dNTP混合溶液（dATP, dGTP, dTTP, dCTP各 2. 5mM) 16 ^ 1
pldD-L- Bgl2F または pldD- R - Hind3F (50pmol/ μ 1) Ι μ ΐ
pldD-L-Hind3R または pldD- R- Bgl2R (50pmol/ /_t 1) Ι μ ΐ
Mer - 11107株 total DNA (100ng/ n 1) Ι μ ΐ
LA Taq polymerase (5u/ 1，宝酒造社) Ι μ ΐ
(反応温度条件）
95°C 3分
(98°C 20秒， 63°C 4分） 30サイクル
68°C 5分
この反応の結果、 pldD - L- Bgl2Fと pldD_L- Hind3Rを用いた反応から、 配列番 号 1の塩基 65700から塩基 68368を含む約 2· 7kbの DNA断片 （DNA断片 L3) が 増幅され、 pldD- R- Hind3Fと pldD- R - Bgl2Rを用いた反応から、 配列番号 1の塩 基 69514から塩基 71951を含む約 2. 4kbの DNA断片 （DNA断片 R3) が増幅され た。 DNA断片 L3及ぴ R3を QIAGEN PCR purification Kit (QIAGE 社）で精製し た後、 制限酵素 Bglllと Hindlllで消化した。
制限酵素 Bglllと Hindlllで消化した DNA断片 L3及ぴ R3と、 制限酵素 Hindlllで消化した 2. 3kbのハイグロマイシン B耐性遺伝子 （pHP45omegahyg ： Gene 190, 315-317, 1997 由来。 以下 hygと略記することがある） 、 及び制限 酵素 BamHIで消化したシャトルべクタ一 pKU253 (図 3参照）、 の計 4者を DNA ligation kit ver. 2. 1 (宝酒造社） で連結した。 こうして DNA断片 L3と R3の 間にハイグロマイシン B耐性遺伝子が挿入された形の約 7. 4kbの DNA断片が、 PKU253に挿入された約 23. 4kbのプラスミ ド pKU253 - L3- hyg- R3が構築された。 得られた pKU253 - L3_hyg - R3を、 接合大腸菌 S17- 1へエレクト口ポレーショ ン法を用いて形質転換し、 S17- l/pKU253- L3- hyg- R3株を得た。 得られた S17- l/pKU253- L3- hyg- R3株を、 g/ralのカナマイシンおょぴ ΙΟΟ μ g/mlのハイ . グロマイシン Bを含む LB培地 α%パクトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl) 10mlに植菌し、 30°Cで 2時間振盪培養後、 集菌し、 LB培地 10mlで 2回洗浄後、 LB培地 5ralに懸濁した。 これを供与菌懸濁液とした。
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、 Mer- 11107株を TSB培地 (Trypto - Soya broth :日水製薬社） 10mlに植菌し、 30°Cで 5時間振盪培養後、 集菌し、 滅 菌水 10ml で 2回洗浄後、 滅菌水 1ml に懸濁した。 これを受容菌懸濁液とした。 得られた S17- 1/ pKU253-L3-hyg-R3株供与菌懸濁液 500 ^ 1を、 Mer - 11107株 受容菌懸濁液 10 ^ 1と混ぜ、 Actino Medium No. 4寒天培地 （日本製薬社） に塗 布した。 30°Cで 18時間培養後、 2mg/mlのリポスタマイシンを含む 2. 5mlの SNA (0. 8%栄養培地： D co社、 0. 4%寒天）を重層した。 30°Cで 7日間培養し、 リボスタマィシンに耐性な PKU253- L3- hyg-R3形質転換株を得た。
得られた pKU253- L3- hyg- R3形質転換株を、 リボスタマイシンを含まない TSB 培地 10mlに植菌し、 30°Cで 24時間振盪培養した。 pKU253- L3- hyg_R3形質転換 株培養液を集菌し、 滅菌水 10mlで 2回洗浄後、 滅菌水 10mlに懸濁した。 適当 に希釈した懸濁液を、 200 μ g/mlのハイグロマイシン Bを含む YMS寒天培地
(0. 4%酵母エキス、 1%麦芽エキス、 0. 4%溶性デンプン、 2%寒天、 lOmM塩化 カルシウム） に塗布し、 30°Cで 4日間培養した。 ハイグロマイシン Bを含む YMS寒天培地で生育したシングルコロニーを 200 ^ g/mlのハイグロマイシン B を含む YMS寒天培地おょぴ 200 μ g/mlのリボスタマィシンを含む YMS寒天培地 に植えかえ、 30°Cで 2日間培養した。
培養後、 ハイグロマイシン B耐性で、 リボスタマイシン感受性の株を選択し た。 得られた菌株は、 ゲノム中の pldD遺伝子内の 1146bp (配列番号 1の塩基 68369から塩基 69513) を欠失し、 その間にハイグロマイシン B耐性遺伝子が 揷入された pldD破壌株であり、 Mer- 11107 pldDC : : hyg株とした。
実施例 1 Ί ：プラジェノライドの 18, 19位エポキシ化酵素遺伝子 （pldD) 破 壌株のプラジェノライド生産性試験
実施例 1 6で得られた Mer - 11107 pldDC :： hyg株の凍結種母 200 μ 1を、 種母 培地 （溶性でんぷん 2%、 エスサンミート 2%、 酵母エキス 0. 5%、 K2HP04
0. 1%、 MgS04 · 7H20 0. 25%、 CaC03 0. 3% pH無調整) 20mlに植菌し、 25°Cで 2 日間培養した。
得られた種母培養液の 300 1を、 本培養培地 （スタビローズ 5%、 ダルコ一 ス 1%、 フアルマメディア 3%、 -シクロデキストリン 2%、 CaC03 0. 1% pH7. 5) 30mlに植菌し、 25°Cで 4日間および 5日間培養した。
培養終了後、 得られた培養液 20mlに同量のァセトニトリルを加えて抽出し た。 その抽出液の一部を分取しァセトニトリノレで 5倍量に希釈し、 下記の条件 にて HPLCでプラジエノライド B及ぴプラジエノライ ド Zの量を測定した。 測 定結果を表 4に示す。
(HPLC分析条件)
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ
カラム： Develosil ODS UG - 3 (4. 6醒 X 50mm 3 z m)
移動相 （容量。/。） ： 45%〜55% メタノール (0〜5分）
55% メタノール（5〜13分）
55%〜70% メタノール（13〜17分）
70% メタノール（17〜35分）
45% メタノール（35〜40分）
流速： 1. 2ml/分
検出： UV240nm
インジェクション容量： 10 1
カラム温度： 40°C
分析時間： 35分
保持時間：プラジエノライド Z； 20分、 プラジエノライド B； 12分
表 4
プラジュノライド プラジェノライド
Mer-11107 pldC: :hyg株 Z (mg/L) - B (mg/L)
4日培養 (96hr) 676. 9 0. 0
5日培養 (I20hr) 695. 8 0. 0 実施例 1 8 ：プラジェノライド Zの単離精製と構造確認
実施例 1 7で得られたァセトニトリル抽出液をろ過し、 更に水 1(½1及び酢 酸ェチル 10mlにて洗浄した。 ろ液に飽和食塩水 40ml及び酢酸ェチル 90mlを 加え抽出し、 飽和食塩水 50mlにて洗浄した。 有機層を硫酸ナトリウムにて乾 燥後、 ろ過し、 減圧下濃縮した。 得ら た残渣を TLC (薄層クロマトグラフィ 一、 Merck社製 Art. 5744 展開溶媒；へキサン：酢酸ェチル = 10 : 50) にて精 製し、 プラジェノライ ド Z (Rf=0. 59, 22. 8mg) を得た。
1.分子量： 462，ESI - MS m/z 485 (M+Na) +, 461 (M-H) "
2. _NMRスぺク トル（CD30D， 500MHz)： δ ppra (積分，多重度，結合定数 J (Hz) )： 0. 89 (3H， d, 6. 8Hz) , 0. 92 (3Η, t, J=7. 5Hz)， 0. 98 (3H, d， J=6. 8Hz)， 1. 01 (3H, d， J=6. 8 Hz) , 1. 07 (3H， d, J=6. 8Hz) , 1. 17-1. 37 (3H, m)， 1. 49-1. 67 (4H, m)， 1. 73 (3H， d: J=l. 0Hz) , 2. 04 (2H, dd, J=6. 8, 6. 8Hz) , 2. 07-2. 15 (1H， m) , 2. 23-2. 31 (IH, m) ,
2. 42 (1H， dd, J=5. 3， 14. 1Hz) , 2. 50-2. 59 (IH, ra)， 2. 55 (1H， dd, J=3. 4, 14. 1Hz)， 3. 16-3. 22 (IH, m) , 3, 57 (1H， dd, J=9. 6， 9. 6Hz) , 3. 72-3. 79 (IH, m)， 5. 00 (IH, d, J=10. 7Hz) , 5. 17-5. 43 (3H， m) , 5. 46 (IH, dd, J=9. 5, 15. OHz) , 5. 64 (IH, dd, J=7. 8, 15. 1Hz) , 6. 05 (IH, d， J=10. 8Hz)， 6. 21 (IH, dd, J=10. 8， 15. 1Hz)
Figure imgf000051_0001
プラジェノライ ド z
この結果、 pldD破壊株である Mer-11107 pldDC : : hyg株は、 プラジェノライ ド Bを生産せずにプラジェノライド Zを生産していることが確認された。 すな わち、 上記方法によりプラジェノライド Zを製造、 取得することができた。

Claims

請求の範囲
1 . プラジェノライドの生合成に関与するポリぺプチドをコ一ドする少な くとも 1個の領域を含んでなる単離された純粋な DNA。
2 . プラジェノライドの生合成に関与するポリペプチドをコードする全て の領域を含んでなることを特徴とする、 請求項 1記載の DNA。
3 . プラジェノライドの生合成に関与するポリペプチドが、 ポリケチド合 成酵素、 6位水酸化酵素、 7位ァシル化酵素、 18, 19位エポキシ化酵素および転 写調節因子から選ばれる少なくとも 1種であることを特徴とする、 請求項 1ま たは 2記載の DNA。
4 . ストレプトマイセス（Streptomyces)属に属する微生物に由来すること を特徴とする、 請求項 1から 3までのいずれかに記載の DNA。
5 . 以下の（1)項から（5)項までのいずれかの項で定義された塩基配列から 選択された少なくとも 1個の塩基配列を含んでなる、 請求項 1記載の DNA。
(1) 以下の（a)項から（i)項までのいずれかの項で定義された塩基配列、
(a) 配列番号 1の塩基 8340から塩基 27935までの連続した塩基配列
(b) 配列番号 1の塩基 28021から塩基 49098までの連続した塩基配列
(c) 配列番号 1の塩基 49134から塩基 60269までの連続した塩基配列
(d) 配列番号 1の塩基 60269から塩基 65692までの連続した塩基配列
(e) 配列番号 1の塩基 65707から塩基 66903までの連続した塩基配列
(f) 配列番号 1の塩基 68160から塩基 66970までの連続した塩基配列
(g) 配列番号 1の塩基 69568から塩基 68270までの連続した塩基配列
(h) 配列番号 1の塩基 72725から塩基 70020までの連続した塩基配列
(i) 配列番号 1の塩基 1から塩基 74342までの連続した塩基配列
(2) (1)項において定義されたいずれかの塩基配列を含む DNAとストリンジェ ントな条件下でハイプリダイズする DNAが有する塩基配列
(3) (1)項において定義されたいずれかの塩基配列との相同性が 70%以上であ る塩基配列 (4) (1)項から（3)項までのいずれかの項で定義され いずれかの塩基配列と 相補的な塩基配列
(5) 遺伝暗号の縮重のため、 （1)項において定義された塩基配列を含む DNAと ストリンジェントな条件下でハイプリダイズしないが、 （1)項から（3)項までの いずれかの項で定義された塩基配列と同じァミノ酸配列をコードする塩基配列
6 . 以下の（a)項から（i)項までのいずれかの項で定義された塩基配列から 選択された少なくとも 1個の塩基配列を含んでなる、 請求項 1記載の DNA。
(a) 配列番号 1の塩基 8340から塩基 27935までの連続した塩基配列
(b) 配列番号 1の塩基 28021から塩基 49098までの連続した塩基配列
(c) 配列番号 1の塩基 49134から塩基 60269までの連続した塩基配列
(d) 配列番号 1の塩基 60269から塩基 65692までの連続した塩基配列
(e) 配列番号 1の塩基 65707から塩基 66903までの連続した塩基配列
(f) 配列番号 1の塩基 68160から塩基 66970までの連続した塩基配列
(g) 配列番号 1の塩基 69568から塩基 68270までの連続した塩基配列
(h) 配列番号 1の塩基 72725から塩基 70020までの連続した塩基配列
(i) 配列番号 1の塩基 1から塩基 74342までの連続した塩基配列
7 . 請求項 1から 6までのいずれかの請求項に記載された DNAによりコー ドされるポリペプチド。
8 . ポリケチド合成酵素活性を有することを特徴とする、 請求項 7記載の ポリペプチド。
9 . 配列番号 2、 3、 4または 5記載のアミノ酸配列またはその部分配列 を有することを特徴とする、 請求項 8記載のポリペプチド。
1 0 . 6位水酸化酵素活性を有することを特徴とする、 請求項 7記載のポ リぺプチド。
1 1 . 配列番号 6記載のアミノ酸配列またはその部分配列を有することを 特徴とする、 請求項 1 0記載のポリペプチド。
1 2 . 18， 19位エポキシ化酵素活性を有することを特徴とする、 請求項 7 記載のポリペプチド。
1 3 . 配列番号 8記載のァミノ酸配列またはその部分配列を有することを 特徴とする、 請求項 1 2記载のポリぺプチド。
1 4 . 転写調節因子活性を有することを特徴とする、 請求項 7記載のポリ ぺプチド。
1 5 . 配列番号 9記載のァミノ酸配列またはその部分配列を有することを 特徴とする、 請求項 1 4記載のポリぺプチド。
1 6 . 7位ァシル化酵素活性を有することを特徴とする、 請求項 7記載の ポリペプチド。
1 7 . 配列番号 7記載のァミノ酸配列またはその部分配列を有することを 特徴とする、 請求項 1 6記載のポリぺプチド。
1 8 . 請求項 1から 6までのいずれかの請求項に記载された DNAを担持す る自立複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミ ド。
1 9 . 請求項 1カゝら 6までのいずれかの請求項に記載された DNAを保持す る形質転換体。
2 0 . 請求項 1 9記載の形質転換体を培地で培養し、 その培養液かブラジ エノライ ドを採取することを特徴とする、 プラジェノライドの製造方法。
2 1 . プラジェノライ ドがプラジェノライド Bである、 請求項 2 0記載の 製造方法。
2 2 . 式 （V I )
Figure imgf000054_0001
[式中、 RNは、 低級アルキル基または環状の低級アルキル基を示し、 nは、 1 または 2を示す]で表されるプラジェノライド D誘導体を製造方法であつて、
( 1 ) 請求項 2 0または請求項 2 1に記載の製造方法によって得られる式
( I )
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000055_0002
の化合物 (プラジェノライド D) に変換する工程、
(2) 式 （I I) の化合物の 3、 6、 16及び/または 21位の水酸基に適宜 保護基を導入して、 式 （I I I)
Figure imgf000055_0003
の化合物 [式中、 R3A、 R6\ R16Aおよび R21Aは、 水素原子または水酸基の保護 基を示す （ただし、 R3A、 R6A、 R16Aおよび R21Aは、 同時に水素原子を示さな い） ]に変換する工程、
(3) 式 （I I I) の化合物の 7位のァセチル基を脱離させることにより、 式 （ I V)
Figure imgf000056_0001
の化合物 [式中、 R3A、 R6\ R16Aおよび R21Aは、 前記の意味を有する]に変換す _ 、
(4) 式 （I V) の化合物の 7位に置換基を導入して、 式 （V)
Figure imgf000056_0002
の化合物 [式中、 RN、 R3A、 R6A、 R16Aおよび R21Aは、 前記の意味を有する]に 変換する工程
および （5) 式 （V) の化合物の保護基を脱離させる工程を含む製造方法。
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