WO2006004214A1 - リン酸化タンパク質のプロテオーム解析方法 - Google Patents

リン酸化タンパク質のプロテオーム解析方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2006004214A1
WO2006004214A1 PCT/JP2005/012714 JP2005012714W WO2006004214A1 WO 2006004214 A1 WO2006004214 A1 WO 2006004214A1 JP 2005012714 W JP2005012714 W JP 2005012714W WO 2006004214 A1 WO2006004214 A1 WO 2006004214A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
sample
phosphorylated
proteins
database
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/012714
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshiya Oda
Tsuyoshi Tabata
Original Assignee
Eisai R & D Management Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eisai R & D Management Co., Ltd. filed Critical Eisai R & D Management Co., Ltd.
Priority to US11/630,927 priority Critical patent/US8131479B2/en
Priority to JP2006529017A priority patent/JPWO2006004214A1/ja
Priority to EP05758169A priority patent/EP1780537B1/en
Priority to AT05758169T priority patent/ATE525462T1/de
Publication of WO2006004214A1 publication Critical patent/WO2006004214A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/54—Sorbents specially adapted for analytical or investigative chromatography

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a plurality of types of phosphorylated proteins in a sample, characterized by using a database comprising data on a plurality of types of proteins in a sample. Further, the present invention provides a method for purifying a phosphorylated protein product using a metal-immobilized carrier or a titania carrier (in the present specification, “purification” includes separation and / or enrichment). How to do
  • the present invention relates to a method for purifying one or more phosphorylated proteins in a sample. .
  • peptide chain that is 80 Da larger than the theoretical value obtained from the primary sequence of amino acids, it is highly likely that one of the peptide chains is phosphorylated.
  • the peptide chain is specifically treated with alkaline phosphatase treatment. When the phosphate group was removed and the measurement was performed again with a mass spectrometer, if the peptide chain was reduced by 80 Da and agreed with the theoretical value, the peptide chain was phosphorylated at one point. 2) .
  • proteome analysis refers to an analysis that reveals the relationship between genetic information and various proteins that interact in a complex manner in cells 3) .
  • proteome analysis is a method that comprehensively analyzes all the proteins that make up cells.
  • proteome analysis it is extremely difficult to check each mass spectrometry spectrum, and the results of automatic search engines (for example, MASCOT, etc.) are often used as a trap.
  • automatic search engines for example, MASCOT, etc.
  • protein databases eg NCBInr, IPI, Sport, etc.
  • protein databases eg NCBInr, IPI, Sport, etc.
  • an automatic search engine eg MASCOT, etc.
  • false positives and false negatives are very common.
  • proteins are a mixture of non-phosphorylated and non-phosphorylated molecules, and few protein molecules are phosphorylated.
  • IMAC metal-immobilized affinity chromatography
  • the IMAC column consists of a chelate-forming group mediated by multiple carboxylic acids with trivalent iron ions or gallium immobilized as a metal. Since the phosphate group specifically binds strongly to trivalent iron ions, phosphorylated proteins can be bound to the IMAC column. Performed under acidic conditions when to bond phosphate groups to the IMAC column, 4 competitive elution means to liberate the phosphate groups by or phosphate buffer to a weak Al force re the pH of the solvent is used one 1 2) .
  • DAB Dihydroxy Benzoic Acid
  • McLachlin DT Chait BT. Analysis of phosphorylated proteins and peptides by mass spectrometry. Curr Op in Chem Biol. 2001: 5, 591-602.) Gerard D, Tewis B. Global approaches to protein-protein interactions. Current Opinion in Cell Biology. 2003: 15 (2), 199-205.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and the problem to be solved is a plurality of kinds in a sample (for example, a tissue, a biological fluid, a cell, a cell organ, or a protein complex). It is to detect the phosphorylated protein in a short time with high accuracy.
  • a sample for example, a tissue, a biological fluid, a cell, a cell organ, or a protein complex.
  • sample eg tissue, biological fluid, cell, organelle or protein It is to efficiently purify one or more kinds of phosphorylated proteins in a complex etc.).
  • the present inventors are composed of data on a plurality of types of proteins in a sample (eg, tissue, biological fluid, cell, cell organ, protein complex, etc.). Create a database, measure the phosphorylated protein separated from the sample with a mass spectrometer, and analyze the data obtained as a result of the measurement using the created database. It has been found that the phosphorylated protein can be detected accurately and in a short time.
  • a sample eg, tissue, biological fluid, cell, cell organ, protein complex, etc.
  • phosphorylated protein in the purification of phosphorylated protein using a metal-immobilized carrier, it contains 40% (V / V) to 60% (V / V) of acetonitrile and more than 0.1% of trifanoloacetic acid ( V / V) or more and 1.0% (V / V) or less or by using a solution containing hydrochloric acid of 0.03% (V / V) or more and 0.3% (V / V) or less.
  • Non-specific adsorption is dramatically reduced and one or more phosphorylated proteins in a sample (eg tissue, biological fluid, cell, organelle or protein complex) can be efficiently purified.
  • a sample eg tissue, biological fluid, cell, organelle or protein complex
  • a method for detecting a plurality of types of phosphorylated proteins in a sample comprising using a database comprising data on a plurality of types of proteins in a sample.
  • step (c) searching the data obtained in step (b) from the database to detect phosphorylated proteins
  • a method for detecting a plurality of types of phosphorylated proteins in a sample characterized by using a database comprising data on a plurality of types of proteins in a sample,
  • step (f) searching the data obtained in step (e) from the database obtained in step (c) to detect phosphorylated proteins
  • sample is a tissue, biological fluid, cell, cell organ, or protein complex.
  • the process of separating multiple phosphorylated proteins in a sample consists of a metal immobilization support or titania support and 40% (V / V) or more of acetonitrile.
  • a solution containing 40% (V / V) to 60% (V / V) of acetonitrile is used as an equilibration solvent for a metal-immobilized support or titania support, a solvent for dissolving a sample and / or a metal-immobilized support or The method as described above, which is used as a developing solvent in a titania carrier.
  • Metal ions immobilized on the metal immobilization carrier are iron ions (III) or gallium
  • a phosphorylated protein purification kit containing a solution containing 40% (V / V) or more of acetonitrile.
  • a sample for example, a tissue, a biological fluid, a cell, a cell organ, a protein complex, etc.
  • the method using a conventional automatic search engine (for example, MASCOT) and a protein database (for example, NCBInr, IPI, Sport) has a large number of false positives and false negatives, and the search time is enormous.
  • a conventional automatic search engine for example, MASCOT
  • a protein database for example, NCBInr, IPI, Sport
  • acetonitrile is added in an amount of 40% (V / V) to 60% (V / V) or less, more preferably trifluoroacetic acid (for example, 0.1% (V / V) or more and 1.0% (V / V) or less) or hydrochloric acid (for example, 0.03% (V / V) )
  • trifluoroacetic acid for example, 0.1% (V / V) or more and 1.0% (V / V) or less
  • hydrochloric acid for example, 0.03% (V / V)
  • carboxylic acids also have an affinity for IMAC columns, so proteins with acidic amino acids also bind more or less to IMAC columns. Therefore, it was not easy to purify only phosphorylated protein using an IMAC column.
  • hydrophobic peptides often have a non-specific effect on IMAC and cannot be removed.
  • adsorption to the IMAC column due to carboxylic acid or hydrophobicity can be suppressed, and 1 or in a sample (eg, tissue, biological fluid, cell, cell organ or protein complex) It has become possible to efficiently purify multiple types of phosphorylated proteins.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the protein detection method of the present invention.
  • FIG. 2 shows the gi number and amino acid sequence expressed in the FASTA format in the NCBInr database (gi 1 2853677: SEQ ID NO: 4, gi 12564245: SEQ ID NO: 5).
  • the line starting with the first character S ">" indicates the name of the protein, the next line indicates the amino acid sequence, and the two lines are composed of a plurality of blocks.
  • Figure 3 shows the results of measuring the purified phosphorylated protein with a mass spectrometer using 0.1 M aqueous acetic acid in a method for purifying phosphorylated protein using a metal-immobilized support.
  • Two phosphorylated proteins of ovoalbumin (EWGSAEAGVDAASVSEEFR 2089 (SEQ ID NO: 1) and LPGFGDSIEAQCGTSVNVH 2082 (SEQ ID NO: 2), but nonspecific cleavage of trypsin occurs in the latter, originally LPGFGDSIEAQCGTSVNVHSSLR (sequence Many proteins other than (3)) were detected, and the phosphorylated protein could not be selectively purified.
  • Figure 4 shows the results of measuring the purified phosphorylated protein with a mass spectrometer using a 50% acetonitrile solution containing 0.3% trifluoroacetic acid in a method for purifying phosphorylated protein using a metal-immobilized support.
  • Two phosphorylated proteins of ovalbumin (EWGSAEAGVDAASVSEEFR 2089 (SEQ ID NO: 1) and LPGFGDSIEAQCGTSVNVH 2082 (SEQ ID NO: 2), but non-specific cleavage of trypsin occurs in the latter, originally LPGFGDSIEAQCGTSVNVHSSLR (SEQ ID NO: 3)
  • the “protein” includes a peptide in which two or more amino acids are bound by a peptide bond.
  • phosphorylated protein refers to a protein in which one or more amino acids in the protein (for example, tyrosine, serine or threonine) are phosphorylated.
  • sample refers to a detection target, a preparation target, a fractionation target, or a purification target that includes a protein, preferably a tissue, biological fluid, cell, cell organ, or protein complex. Refers to the body.
  • tissues include the brain, brain parts (eg, olfactory bulb, squamous nucleus, basal basal sphere, hippocampus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary gland, stomach, knee Kidney, liver, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, duodenum, small intestine, large intestine, blood vessel, heart, thymus, spleen, submandibular gland, parotid gland, sublingual gland, peripheral blood, Examples include prostate, testicles, ovaries, placenta, pupae, bones, joints, and skeletal muscles.
  • brain parts eg, olfactory bulb, squamous nucleus, basal basal sphere, hippocampus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum
  • spinal cord e.g., spinal cord, pituitary gland, stomach,
  • biological fluid examples include blood (including plasma and serum), urine, feces, saliva, tear fluid, and infiltrating fluid (including ascites and tissue fluid).
  • cells include hepatocytes, spleen cells, neurons, glial cells, spleen 3 cells, bone marrow cells, mesangium cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts Cells, fibrocytes, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, eosinophils, basophils, monocytes), megakaryocytes, Examples include synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, stromal cells or their precursor cells, stem cells, cancer cells and the like.
  • organelles include nuclei, organelles (nuclear bodies, nuclear membranes, cell membranes, mitochondria, lysosomes, ribosomes, peroxisomes, endoplasmic reticulum (rough endoplasmic reticulum, smooth endoplasmic reticulum, sarcoplasmic reticulum, etc.) , Golgi, microtubule, centrosome, actin filament, etc.), cytosol, synapse, basement membrane, cell-cell adhesion device, etc.
  • a protein complex is one in which two or more proteins are physically bound. Here are the sun The pull is a specific example, and is not limited thereto.
  • the sample of interest eg, tissue, biological fluid, cell, cell organ or protein complex
  • the target cells can be collected from a living body and then treated with an enzyme, or only the target cells can be selected with a cell sorter or the like.
  • Cells used as samples include primary cultured cells, cell lines, or cultures thereof, and may be cells under various culture conditions such as stimulation and induction.
  • the “database” is a set of amino acid sequence information used for proteome analysis, and is a systematic configuration of the sequence information so that it can be searched using an electronic computer.
  • proteome analysis it is a technique commonly used by those skilled in the art to search amino acid sequence information using a database and an electronic computer to identify a protein.
  • the “database consisting of data on multiple types of proteins in a sample” is a set of amino acid sequence information of multiple types of proteins in a target sample, and is searched using an electronic computer.
  • sequence information is systematically constructed so that it can be used (hereinafter sometimes referred to as “database of the present invention”). Therefore, in addition to amino acid sequence information, the database of the present invention may include characters and symbols for systematically constructing the database, and key information and protein names used for searching. Etc. may be included.
  • the present invention is a method for detecting a plurality of types of phosphorylated proteins in a sample, characterized in that a database comprising data on a plurality of types of proteins in a sample is created and used. I will provide a.
  • the method includes the steps of creating a database consisting of data on multiple types of proteins in a sample, isolating multiple types of phosphorylated proteins in the sample, analyzing the mass of the phosphorylated proteins, Obtained
  • a method for detecting phosphorylated protein comprising a step of searching the data from the database of the present invention to detect phosphorylated protein (FIG. 1 (a)). Details are described below. 1. Creation of the database of the present invention
  • the database of the present invention prepares a protein in a sample to be detected for phosphorylated protein (hereinafter also referred to as “phosphorylated protein detection sample”), and measures its mass with a mass spectrometer. It can be created by systematically constructing it so that it can be measured and identified using the obtained data, the amino acid sequence information of the protein can be obtained, and searched using an electronic computer ( Figure 1 ( b)). In addition, if the amino acid sequence information of a protein contained in a sample can be obtained from known information without measurement, the amino acid sequence information can be obtained and searched using an electronic computer. It can be created by systematically configuring it as possible.
  • the following is a method for measuring a protein in a sample to be detected for phosphorylated protein with a mass spectrometer, identifying the protein using the obtained data, and creating a database from the amino acid sequence information of the multiple types of proteins. Is described.
  • a tissue, a biological fluid, a cell, a cell organ, or a protein complex that is the same type as the detection target sample of phosphorylated protein can be used.
  • the measurement sample for preparing the database of the present invention is preferably the same tissue, biological fluid, cell, cell organ or protein complex as the sample to be detected for phosphorylated protein.
  • Fig. 1 (c) An example of the preparation method of the measurement sample is shown in Fig. 1 (c), but the method is not limited to this.
  • Fig. L (c) (ii) Disrupt the sample to be detected for phosphoprotein and extract the crude protein (Fig. After 1 (c) (0), it can be centrifuged (Fig. L (c) (ii)). This is called “centrifugated protein”. Crushing. Extraction method is: Downs type Teflon ⁇ homogenizer, Polytron, Waring 'Plender, Potter type glass' homogenizer, ultrasonic breaker, cell lysate (eg Pierce M-PER: cat no. 78501, T-PER: cat no. 78510, etc.) or a freeze-thaw method, and a method using a Dounce type Teflon ⁇ homogenizer, Potter type glass homogenizer is preferable. Examples of the centrifugal fractionating method include fractional centrifugation and sucrose density gradient centrifugation, and sucrose density gradient centrifugation is preferred.
  • the centrifuged protein can be roughly purified (FIG. 1 (c) (iii)). This is called “crudely purified protein”.
  • Crude purification methods include group-specific affinity column purification, cation exchange chromatography, cation exchange chromatography, reverse phase chromatography, immunoprecipitation, ammonium sulfate precipitation, and organic solvent precipitation. , Ultrafiltration, gel filtration, dialysis, or a combination of these, and group-specific affinity column purification is preferred.
  • the protein adsorbed on the carrier is a phosphorylated protein
  • the protein not adsorbed on the carrier is a protein that is not phosphorylated.
  • fractionation or digestion ( Figure l (c) (iv), (v)). These are referred to as “fractionated protein” and “digested protein”, respectively.
  • fractionation method two-dimensional electrophoresis, SDS-PAGE, various types of chromatography (for example, affinity chromatography, reverse phase chromatography, anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, etc.) can be employed.
  • the present invention is not limited to these, and an appropriate one may be selected.
  • the digestion method include enzyme digestion, chemical decomposition, and the like. Enzymatic digestion is preferable, but the digestion method is not limited to this, and an appropriate one may be selected.
  • Examples of the enzyme used for enzymatic digestion include trypsin, chymotrypsin, Lys-C, Asp-N, and Glu-C, with trypsin being preferred.
  • a surfactant preferably 5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltoside (US Pat. No. 5674987 and US Pat. No. 5763586, Anatrace Inc.) is used for enzyme digestion. ., Maumee, OH, USA)).
  • HPLC fractionated protein The resulting centrifugally fractionated protein, crudely purified protein, fractionated protein or digested protein can be further fractionated by HPLC ( Figure l (c) (vi)). This is referred to as “HPLC fractionated protein”.
  • a column used for HPLC may be selected according to technical common knowledge in the art, and is preferably an anion exchange column or a cation exchange column.
  • Various HPLC conditions flow rate, detector, mobile phase, etc.
  • flow rate, detector, mobile phase, etc. can be selected as appropriate based on common technical knowledge of those skilled in the art.
  • the crudely purified protein is, for example, a phosphorylated protein roughly purified with a metal-immobilized carrier or a titaure carrier
  • the phosphorylated protein is digested and then the metal-immobilized carrier or Proteins phosphorylated and non-phosphorylated by a titer carrier can be further fractionated. That is, in order to selectively fractionate non-phosphorylated proteins, a metal-immobilized carrier or titania carrier is used again to fix proteins that are not adsorbed to the metal-immobilized carrier or titer carrier. Non-phosphorylated by fractionating from protein adsorbed on titanized carrier or titania carrier Protein can be obtained. This is called “fractionated non-phosphorylated protein”.
  • a small amount (for example, 0.1% to 20%) of a phosphoprotein may be mixed therein. This is because even if a small amount of phosphorylated protein is mixed, it hardly affects the measurement result of non-phosphorylated protein.
  • Proteins that are not phosphorylated have two uses:
  • phosphorylated protein and non-phosphorylated protein are separated by a method that separates phosphorylated protein from the protein present in the sample to be detected, and is not phosphorylated.
  • a database is created using proteins, and phosphorylated proteins are detected using phosphorylated proteins.
  • the phosphorylated protein is separated from the protein present in the phosphorylated protein detection sample by the method of separating the phosphorylated protein, the phosphorylated protein is digested, and phosphorylated. Prepared protein (peptide) and non-phosphorylated protein (peptide). Then, a non-phosphorylated protein (peptide) is measured to create a database, and the phosphorylated protein (peptide) is used to detect the phosphorylated protein. At this time, the above-mentioned “fractionated non-phosphorylated protein” can be used as a protein (peptide) that is not phosphorylated.
  • This database is particularly useful in the detection method of the present invention because it becomes a database limited to phosphorylated proteins among the proteins contained in the sample.
  • Mass spectrometer Such as gas chromatograph mass spectrometry (GC / MS), which is a mass spectrometer combined with a gas chromatograph, and liquid chromatography mass spectrometry (LCMS), which is a mass spectrometer combined with a liquid chromatograph.
  • GC / MS gas chromatograph mass spectrometry
  • LCMS liquid chromatography mass spectrometry
  • a general-purpose apparatus can be used. The ionization method in the mass spectrometer can be appropriately selected depending on each apparatus.
  • MALDI Mass Assisted Laser Desorption Ionization
  • ESI Electro Spray Ionization
  • EI Electro Ionization
  • CI Cellular Ionization
  • APCI Admospheric Pressure Chemical Ionization
  • FAB Fluorescence atom bombardment method
  • LD FD
  • SIMS SIMS
  • TSP Transmission Protocol
  • MALDI or ESI is preferred.
  • the analyzer can be appropriately selected according to each device. For example, it can be performed using general-purpose devices such as TOF (time-of-flight type), ion trap, double-focusing type, quadrupole type, and Fourier transform type.
  • TOF time-of-flight type
  • ion trap ion trap
  • double-focusing type double-focusing type
  • quadrupole type and Fourier transform type.
  • the apparatus and method of the mass spectrometer are not limited to those exemplified here, and those skilled in the art can appropriately select those normally used for mass spectrometry.
  • Proteins can be identified using data obtained as a result of measurement by a mass spectrometer. That is, the obtained data is stored in software (eg SonarMSMS (Genomic solution)) and databases (eg NCBInr (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), IPI, Sport, etc.). ) Can be used to analyze and identify proteins in the sample. It is easy for those skilled in the art to identify proteins using mass spectrometer data (Nat Genet. 1998: 20, 46-50; J Cell Biol. 1998: 141, 967-977; J Cell Biol. 2000: 148, 635.651; Nature. 2002: 415, 141-147; Nature. 2002: 415, 180-183; Curr Opin Cell Biol. 2003: 15, 199-205; Curr Opin Cell Biol. 2003: 7 , 21-27) 0 It is easy for those skilled in the art to obtain amino acid sequence information from identified protein information.
  • software eg SonarMSMS (Genomic solution)
  • the amino acid sequence information used to create the database may be a combination of multiple amino acid sequence information obtained from samples with different preparation methods.
  • systematically means that a plurality of amino acid sequence information obtained is ordered and configured in a unified manner so that it can be used using an electronic computer.
  • the format is particularly It is not limited.
  • the database creation method of the present invention is created by systematically configuring the amino acid sequence information of the identified protein in the phosphorylated protein detection target sample so that it can be searched using an electronic computer. be able to.
  • An example of the database creation method of the present invention will be described below.
  • Each identified protein always has unique key information so that the database used can be accessed. For example, in the case of NCBInr database, it is the gi number.
  • the database format usually used in protein identification software is called FASTA format
  • the line starting with the first character s ">" indicates the name of the protein
  • the next line indicates the amino acid sequence
  • the two lines It is described by the rule that a lump is composed of multiple pieces ( Figure 2).
  • This database can be searched by registering it with protein identification software.
  • the database of the present invention relates to a protein identified by mass spectrometry of a plurality of types of proteins in a sample, and the protein in a sample to be detected for phosphorylated protein is measured with a mass spectrometer. Then, the protein can be prepared by identifying the protein using the obtained data, obtaining the amino acid sequence information of the protein, and systematically configuring it so that it can be searched using an electronic computer.
  • the database of the present invention includes the same type of tissue, biological fluid, cell, cell organ.
  • protein complexes need not be created for each experiment and can be used repeatedly between experiments. 2. Separation of phosphorylated proteins
  • the phosphorylated protein detection sample is disrupted, and the digested protein is extracted by extraction, centrifugation, crude purification, fractionation, or digestion, or a combination thereof.
  • the phosphorylated protein is preferably prepared by disrupting the sample and extracting the protein, centrifugation, crude purification, fractionation and digestion.
  • FIG. L (d) (i) shows one embodiment of a method for preparing a phosphorylated protein, and the method is not limited to this. Method for separating phosphorylated proteins (Fig. 1 (d) (ii)) Further separate the phosphorylated protein from the digested protein. This is called “separated phosphorylated protein”.
  • Separation of phosphorylated protein is not particularly limited as long as it is possible to selectively separate phosphorylated proteins.
  • separation using a metal-immobilized carrier or titania carrier immunoprecipitation using an anti-phosphorylated antibody, etc.
  • a separation (purification) method using a metal-immobilized carrier or a titaure carrier described later in “B. Purification method of phosphorylated protein” is preferable.
  • a metal-immobilized carrier or a titania carrier is equilibrated with a solution containing cetonitrile.
  • the protein prepared by the above operation (1) is dissolved in a solution containing acetonitrile. Subsequently, the protein dissolved in the solution is brought into contact with the metal-immobilized support or the titaure support equilibrated with the solution. Thereafter, it is desirable to wash the metal-immobilized support or titania support with a solution containing acetonitrile. Then elute the phosphorylated protein with a suitable elution solution.
  • the elution solution is not particularly limited. For example, 150 mM aqueous ammonia containing 5% (V / V) acetonitrile, 0.1% phosphoric acid containing 5% (V / V) acetonitrile can be used. . In case of elution with ammonia water, it is desirable to dry the eluate as it is, and in case of elution with phosphoric acid, desalting operation is desirable.
  • the acetonitrile concentration in the solution containing the acetonitrile is 30% (V / V) to 70% (V / V), preferably 35% (V / V ) To 65% (V / V), more preferably 40% (V / V) to 60% (V / V), particularly preferably 45% (V / V) to 55% (V / V) For example, 50% (V / V).
  • An acid solution can be added to the solution.
  • the acid solution to be used is preferably a strong acid such as trifluoroacetic acid, hydrochloric acid and the like, and particularly preferably trifluoroacetic acid, but is not particularly limited.
  • the concentration of the acid solution in the solution is preferably 0.1% (V / V) or more and 1.0% (V / V) or less, particularly preferably 0.2% (V / V) in trifluoroacetic acid. More than 0.6% (V / V), for example, 0. In hydrochloric acid, it is preferably 0.03% (V / V) or more and 0.3% (V / V) or less, particularly preferably 0.06% (V / V). V) to 0.2% (VZV), for example, 0.1% (V / V).
  • phosphorylated proteins can be separated.
  • the mass spectrometer is a gas chromatograph mass spectrometer (GC / MS), which is a mass spectrometer coupled with a gas chromatograph, and a liquid chromatograph mass spectrometer, which is a mass spectrometer coupled with a liquid chromatograph. (LC / MS) etc. can be used, and it is preferable to carry out using liquid chromatography mass spectrometry.
  • GC / MS gas chromatograph mass spectrometer
  • LC / MS liquid chromatograph mass spectrometer
  • the ionization method in the mass spectrometer can be appropriately selected according to each apparatus.
  • MALDI Microdesorption Ionization
  • ESI Electro Spray Ionization
  • EI Electro Ionization
  • CI Cellular Ionization
  • APCI Admospheric Pressure Chemical Ionization
  • FAB Fast atom bombardment method
  • LD FD
  • SIMS SIMS
  • TSP Transmission Protocol
  • MALDI or ESI preferably MALDI or ESI.
  • the analyzer can be appropriately selected according to each device. For example, it can be performed using general-purpose devices such as TOF (time-of-flight type), ion trap, double-focusing type, quadrupole type, and Fourier transform type.
  • TOF time-of-flight type
  • ion trap ion trap
  • double-focusing type double-focusing type
  • quadrupole type and Fourier transform type.
  • the apparatus and method of the mass spectrometer are not limited to those described here, and those skilled in the art can appropriately select one that is usually used for mass spectrometry.
  • the database of the present invention is used as the database.
  • Data obtained as a result of measurement by a mass spectrometer is analyzed by using a software (for example, MASCOT (Matrix Science)) and the database of the present invention, and a phosphorylated protein in a sample is identified. It is possible. Regarding the obtained results, it is preferable to manually check the mass spectrometry spectrum one by one, but it is not limited to this.
  • the present invention relates to a method for purifying a phosphorylated protein using a metal-immobilized support or a titania support, and uses a solution containing 40% (V / V) or more and 60% (V / V) or less of acetonitrile.
  • a method for purifying a phosphorylated protein is provided.
  • the “metal immobilization support” means a chelate-forming group (for example, an iminodiacetic acid group (hereinafter sometimes referred to as IDA), a nitrite triacetic acid group (hereinafter sometimes referred to as NTA) Etc.) is a carrier in which a metal ion is chelate-bonded.
  • the metal immobilization carrier include an iron ion (III) carrier chelated with iron ion (III), a gallium ( ⁇ ) ion carrier chelated with gallium (III) ion, and the like.
  • the carrier examples include agarose gel, acrylamide, magnetic beads, cellulose and the like, preferably agarose gel.
  • the metal-immobilized carrier is a carrier having a chelate-forming group (for example, IDA, NTA, etc.) Further, it can be prepared by chelating a suitable metal ion, preferably iron ion (111) or gallium (III) ion.
  • a suitable metal ion preferably iron ion (111) or gallium (III) ion.
  • a carrier having a chelate-forming group can be purchased from, for example, Amersham Biosciences (Chelating Sepharose Fast Flow, Amersham Biosciences, Cat No. 17 ⁇ 0575 ⁇ 01).
  • the iron ion ( ⁇ ) carrier is, for example, a 50 mM iron chloride solution in which a carrier having a chelate-forming group (for example, IDA, NTA, etc.) is washed with 0.1% acetic acid solution and subsequently dissolved in 0.1% acetic acid. It can be prepared by mixing with III (FeCl 3 ) and then washing with 0.1% aqueous acetic acid.
  • a carrier having a chelate-forming group for example, IDA, NTA, etc.
  • a carrier having a chelate-forming group can also be obtained by purchasing from Sigma-Aldrich (PHOS-Selec Iron Affinity Gel, Sigma-Aldrich, Cat No. P9740).
  • the gallium ion ( ⁇ ) carrier is, for example, a 50 mM gallium chloride solution in which a carrier having a chelate-forming group (for example, IDA, NTA, etc.) is washed with 0.1% aqueous acetic acid and subsequently dissolved in 0.1% acetic acid. It can be prepared by mixing with III (GaCls) and then washing with 0.1% acetic acid.
  • a carrier having a chelate-forming group for example, IDA, NTA, etc.
  • the carrier Ru can be obtained even cowpea to be purchased from Pierce, Inc. (Phosphopeptide Isolation Kit, Pierce Inc., Cat No. 89853) 0
  • the metal-immobilized support is packed in a suitable column (for example, Polyprepempty column (Piorado, Cat No. 731-1550) etc.), so that the metal-immobilized affinity chromatography column (IMAC column). ) Can be used as In addition, the metal immobilization support can be used by adding it to an appropriate tube (for example, Eppendorf tube (manufactured by Eppendorf)).
  • a suitable column for example, Polyprepempty column (Piorado, Cat No. 731-1550) etc.
  • IMAC column metal-immobilized affinity chromatography column
  • the metal immobilization support can be used by adding it to an appropriate tube (for example, Eppendorf tube (manufactured by Eppendorf)).
  • titanium refers to titanium oxide (IV) (TiO 2 , Titanium dioxide (IV)).
  • the “titer carrier” means that titania is in the form of round beads having a diameter of about several tens of micrometers. Titania carriers can be obtained by purchasing from GL Sciences. it can.
  • the titer carrier can be used as a titer column by packing it in a suitable column (for example, a micro bio spin empty column (Pioladone, Cat No. 732-6204)).
  • a suitable column for example, a micro bio spin empty column (Pioladone, Cat No. 732-6204)
  • the titania carrier can be used by adding it to a suitable tube (for example, Eppendorf tube (manufactured by Eppendorf)).
  • the method for purifying phosphorylated protein using the above metal-immobilized carrier or titania carrier is a solution containing 40% (V / V) or more and 60% (V / V) or less of acetonitrile (hereinafter referred to as “the present invention”). It may be referred to as a “purified solution”).
  • Acetonitrile may be a commercially available product, and can be obtained, for example, by purchasing from Wako Pure Chemical.
  • the purified solution of the present invention is used as a metal-immobilized support or titania support. More specifically, it is used, for example, as an equilibration solvent for a metal-immobilized carrier or titania carrier, a solvent for dissolving the sample and Z, or a developing solvent for a metal-immobilized carrier or titania carrier. .
  • the acetonitrile concentration in the purified solution of the present invention is at least 30% (V / V) or more and 70% (V / V) or less, preferably 35% (V / V) or more and 65% (V / V) or less, more preferably 40% (V / V) to 60% (V / V), particularly preferably 45% (V / V) to 55% (V
  • the purified solution of the present invention may contain other substances.
  • the acid solution to be used is preferably a strong acid such as trifluoroacetic acid, hydrochloric acid and the like, and particularly preferably trifluoroacetic acid, but is not particularly limited.
  • the concentration of the acid solution used is preferably 0.1% ( ⁇ ) or more for trifluoroacetic acid.
  • hydrochloric acid it is preferably 0.03% (V / V) or more and 0.3% (V / V) or less, particularly preferably 0. More than 0 6% (V / V) and less than 0.2% (V / V), for example, 0.1% (V / V).
  • Those skilled in the art can easily prepare these purification solutions of the present invention.
  • Trifluoroacetic acid may be commercially available, and can be obtained by purchasing from, for example, Pierce.
  • Hydrochloric acid may be commercially available, and can be obtained, for example, by purchasing from Wako Pure Chemical.
  • the type of protein to be purified is not limited as long as it contains a phosphorylated protein.
  • the sample tissue, biological fluid, cell, cell organ, protein complex, etc.
  • the method for purifying phosphorylated protein in a sample is described below.
  • the sample can be disrupted, the crude protein extracted, and then centrifuged. This is referred to as “centrifugated protein”.
  • the crushing and extraction methods are: Downs type Teflon TM homogenizer, polytron, Waring. Blender, potter type glass homogenizer, ultrasonic breaker, cell lysate (eg Pierce M-PER: cat no. 78501, T-PER: cat no. 78510 or the like) or freeze-thaw method, and a method using a Dounce type Teflon TM homogenizer or a potter type glass homogenizer.
  • the centrifugal fractionation method include fractional centrifugation and sucrose density gradient centrifugation, preferably sucrose density gradient centrifugation.
  • the centrifuged protein can be crudely purified.
  • Crude purification methods include group-specific affinity column purification, cation exchange chromatography, and anion exchange chromatography. Tomography, reverse phase chromatography, immunoprecipitation, ammonium sulfate precipitation, organic solvent precipitation, ultrafiltration, gel filtration, dialysis, or a combination of these.
  • Specific affinity column purification The operations of crushing 'extraction, centrifugal fractionation, and crude purification are not limited to those described above. Appropriate ones may be selected and combined according to the common general technical knowledge of those skilled in the art.
  • the crudely purified protein can be fractionated and digested as necessary. These are called “fractionated protein” and “digested protein”, respectively.
  • fractionation method two-dimensional electrophoresis, SDS-PAGE, various chromatographies (for example, affinity chromatography, reverse phase chromatography, anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, etc.) can be employed. However, it is not limited to these, and an appropriate one may be selected.
  • the digestion method include enzyme digestion, chemical decomposition, and the like. Enzymatic digestion is preferable. However, the digestion method is not limited to this, and an appropriate one may be selected.
  • Examples of the enzyme used for enzymatic digestion include trypsin, chymotrypsin, Lys-C, Asp-N, and Glu-C, with trypsin being preferred.
  • a surfactant preferably 5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltoside (US Pat. No. 5674987, US Pat. No. 5763586, Anatres ( Anatrace Inc., Maumee, OH, USA)).
  • centrifugally-fractionated protein, crudely purified protein, fractionated protein or digested protein thus obtained can be further fractionated by HPLC.
  • HPLC protein fractionated by HPLC
  • a column used for HPLC may be selected according to technical common knowledge in the art, and is preferably an anion exchange column or a cation exchange column.
  • Various HPLC conditions flow rate, detector, mobile phase, etc. can be selected as appropriate according to common technical knowledge in the art.
  • the metal-immobilized carrier or titania carrier is equilibrated with the purified solution of the present invention.
  • the metal-immobilized carrier or titania carrier is packed in a suitable column, the metal-immobilized carrier or titania carrier is applied by applying the purified solution of the present invention to the column. If it is added to an appropriate tube, it can be performed by adding the purified solution of the present invention to the tube.
  • the protein obtained by the above operation is dissolved in the purification solution of the present invention.
  • a concentrated purified solution of the present invention can be diluted and used.
  • the concentration of the acid in the purified solution of the present invention can be adjusted according to the solute contained in the protein solvent.
  • the final concentration of the acid solution is preferably 0.1% (V / V) or more and 1.0% (V / V) or less, particularly preferably 0.2% (V / V) or more in trifluoroacetic acid.
  • hydrochloric acid preferably 0.3% (V / V) or more and 0.3% (V / V) or less, It is particularly preferably 0.06% (V / V) or more and 0 ⁇ 2% (V / V) or less, for example, 0.1% (V / V).
  • the protein dissolved in the purified solution of the present invention is brought into contact with the metal-immobilized carrier or titer carrier equilibrated with the purified solution of the present invention.
  • the step of bringing the protein dissolved in the purified solution of the present invention into contact with the metal-immobilized carrier or titania carrier equilibrated with the purified solution of the present invention comprises the step of contacting the metal-immobilized carrier or titania carrier with an appropriate column. If the metal-immobilized carrier or titania carrier is added to an appropriate tube, the protein dissolved in the purification solution of the present invention can be applied to the column. In Each can be performed by adding the protein dissolved in the purification solution of the present invention to the tube.
  • the metal-immobilized carrier or the titania carrier With the purification solution of the present invention.
  • the washing operation when the metal-immobilized carrier or titania carrier is packed in an appropriate column, the purified solution of the present invention is added to the column, so that the metal-immobilized carrier or titania carrier becomes an appropriate tube. Can be carried out by adding the purified solution of the present invention to a tube and centrifuging it.
  • the metal-immobilized support or titania support is packed in an appropriate column
  • the metal-immobilized support is applied by applying an appropriate elution solution to the column.
  • a titer carrier is added to an appropriate tube, it can be performed by adding an appropriate elution solution to the tube and centrifuging.
  • the elution solution is not particularly limited. For example, 150 mM aqueous ammonia containing 5% (V / V) acetate-tolyl, 0.1% phosphoric acid containing 5% (V / V) acetonitrile, etc. may be used. it can. If it is eluted with aqueous ammonia, it is desirable to dry the eluate as it is, and if it is eluted with phosphoric acid, desalting operation is desirable.
  • the phosphorylated protein can be efficiently purified.
  • the phosphorylated protein thus obtained can be used for various experiments, and can be preferably used for analysis of phosphorylated protein by MS.
  • the present invention is a method for purifying a phosphorylated protein using a metal-immobilized support or a titania support, and uses a solution containing 40% (V / V) to 60% (V / V) of acetonitrile.
  • a phosphorylated protein purification kit (hereinafter sometimes referred to as “the purification kit of the present invention”) containing a solution used in the method is provided.
  • the purification kit of the present invention is used in a method for purifying phosphorylated protein (shown in the above-mentioned “B. 3. (2) Method for purifying phosphorylated protein”).
  • Examples of carriers, solutions and the like included in the purification kit of the present invention include the following.
  • acids preferably strong acids such as trifluoroacetic acid or hydrochloric acid, particularly preferably trifluoroacetic acid
  • An acid preferably a strong acid, for example, trifluoroacetic acid or hydrochloric acid, particularly preferably trifluoroacetic acid, may be added in advance to a solution containing 40% (V / V) or more of acetonitrile.
  • the purification kit of the present invention may further contain tubes, columns, containers, instruction manuals, etc. necessary for purification.
  • the present invention relates to a method for purifying a phosphorylated protein using a metal-immobilized support or a titania support, and uses a solution containing 40% (V / V) or more and 60% (V / V) or less of acetonitrile.
  • a phosphorylated protein purification solution containing a solution used in the above-described method (hereinafter sometimes referred to as “the phosphorylated protein purification solution of the present invention”) is provided.
  • the phosphorylated protein purification solution of the present invention is used for a method for purifying a phosphorylated protein (shown in the above-mentioned “B. 3. (2) Method for purifying phosphorylated protein”).
  • the phosphorylated protein purification solution of the present invention is a solution containing 40% (V / V) or more of acetonitrile, and an acid, preferably a strong acid, for example, trifluoroacetic acid or hydrochloric acid, particularly preferably trifluoroacetic acid is added in advance. It may be done.
  • an acid preferably a strong acid, for example, trifluoroacetic acid or hydrochloric acid, particularly preferably trifluoroacetic acid is added in advance. It may be done.
  • the present invention will be described below with specific examples, but the present invention is not limited to this. [Reference Example 1]
  • PSD Post Synaptic Density
  • the whole brain of 7-week-old BALB / c (female) was taken out, and the whole brain was finely crushed with a glass homogenizer coated with Teflon TM with ice-cold PBS (with protease-cocktail, Roche: 1873580).
  • the solids were removed, the precipitate was first removed by centrifugation at 1400 G for 10 minutes, and the supernatant was centrifuged at 13800 G (16 minutes) to collect the precipitate. This was suspended in 0.32 M sucrose, and this sample was placed on a sucrose layered in the order of 1.2M, 1M: 0.85M from the bottom, and the centrifugation at 82500 G was performed for 120 minutes.
  • the fraction (Synaptosome) collected in the second layer from the bottom was collected and suspended in 0.32 M sucrose, then 6 mM Tris buffer was added and stirred for 45 minutes under ice cooling. Thereafter, a 32800 G centrifugation was performed for 20 minutes to collect the precipitate. This was suspended in 0.32 M sucrose, and this sample was placed on sucrose layered in order of 0.8 M, 0.6 M, and 0.4 M from the bottom and centrifuged at 64700 G for 120 minutes. The second layer from the bottom was removed and centrifuged at 48200 G for 30 minutes. To this precipitate, a Tris buffer / 0.32 M sucrose mixed solution containing 1% TritonX-100 was added and stirred for 15 minutes. The precipitate collected by centrifugation at 48200 G for 30 minutes was used as the PSD fraction.
  • This PSD fraction was dissolved in 7 M urea ⁇ 2 M thiourea ⁇ 2% 1 CHAPS, and the dissolved protein was subjected to the following combinations of digestion and fractionation analysis.
  • the precipitate was also dissolved in SDS, the protein was fractionated by SDS-PAGE, digested with trypsin in the gel, and analyzed by LC / MSMS using a C18 column.
  • each fraction was digested with trypsin, fractionated with a CN column, and each fraction was LC / MS / MS (using a C18 column) (Hereinafter referred to as MonoQ color) (Protein fraction) -digestion-CN column-referred to as LC / MS / MS).
  • the protein data of the NCBInr device was transferred to a PC server (Windows 2000 Server) with Compaq's ProLiant ML530 (hard disk capacity 425GB, memory capacity 3.767828GB, CPU Intel TM ⁇ 2.40 GHz, number of logical CPUs 4). saved. All the LC / MS / MS data obtained in the previous analysis was also stored on this PC server. Then, using the automatic search engine MASCOT installed on the PC server, we searched for phosphoproteins contained in 1150 measurement samples. As the search conditions, Variable Modification f Oxidation (M), hospho ST), Pnospho (Y) was specified, missed cleavages was set to 2, and NCBInr was specified in the database. The reason why Missed cleavages is set to 2 is that it is known from previous experience that phosphorylated peptides have poor digestion efficiency with trypsin.
  • M Variable Modification f Oxidation
  • hospho ST hospho ST
  • Pnospho Y
  • Search conditions include Variable Modification with Oxidation (M), Phospho (ST), Phospho (Y ), Missed cleavages was set to 2, and the database of this experiment was specified as a database. These were not searched for various post-translational modifications at the same time, but only for phosphorylated proteins. It was 36 peptides that scored more than 95%, and as a result of confirming MS / MS mass spectrometry spectrum of these, it was thought that MS / MS of phosphorylated peptide In other words, most of them were false positives even though the search conditions were narrowed down (using the database of this experiment).
  • PHOS-SELECT As a kind of IMAC column, 0.1 mL of PHOS-SELECT (Sigma) gel was placed in an Eppendorf tube and mixed with 0.1% acetic acid for 30 seconds. This was centrifuged and the supernatant was discarded. This washing operation was repeated three times. Subsequently, the PSD fraction obtained in Reference Example 1 was fractionated using a Mono'Q column (manufactured by Amersham), and samples digested with trypsin for each fraction were adjusted to pH 3 with acetic acid. Next, the obtained sample was added to PHOS-SELECT and mixed gently at room temperature for 3 hours.
  • the mixture was centrifuged and the supernatant was discarded, followed by washing with 0.5 mL of 0.1% acetic acid three times. Then, 0.5 mL of 0.15M aqueous ammonia containing 15% acetonitrile was added and centrifuged. The supernatant was then collected and the solvent was evaporated. In this way, phosphorylated peptides in the PSD fraction were separated. Then, the obtained residue was dissolved in 20 Z L of a solvent containing 5% (V / V) acetonitrile and 0.1% TFA, and measured by LC / MS / MS.
  • the obtained measurement data was searched for phosphorylated modified proteins.
  • NCBInr protein data of the instrument NCBInr is saved on a Compaq ProLiant ML530 PC server (Windows 2000 Server) with a hard disk capacity of 425 GB, memory capacity of 3.767828 GB, CPU Inte M XEON TM 2.40 GHz, and number of logical CPUs 4 did. All LC / MS / MS data obtained in the previous measurement was also stored on this PC server. The search was then performed using MASCOT, an automatic search engine installed on the PC server. As search conditions, Phosplio (ST) and Phosplio (Y) were specified in Variable Modification, missed cleavages was 2, and NCBInr was specified in Database.
  • ST Phosplio
  • Y Phosplio
  • the database of this experiment (Reference Example 2) was stored on a Compaq ProLiant ML530 (hard disk capacity 425GB, memory capacity 3.767828GB, CPU Intel TM ⁇ 2.40 GHz, number of logical CPUs 4) PC server (Windows 2000 Server) ). All the LC / MS / MS data obtained in the previous analysis (Reference Example 3) was also stored on this PC server.
  • a search was performed using MASCOT, an automatic search engine installed on the PC server.
  • search conditions Phospho (ST) and Phospho (Y) were specified in Variable Modification, missed cleavages was set to 2, and the database of this experiment was specified as the database.
  • the search time for one LC / MS data was only 3-5 minutes.
  • Ovalbumin (Sigma, Cat No. A2512) 1 mg 0.5 M containing 8 M urea Tris buffer (pH 8.6 at room tenip.) was dissolved in 1 mL. After adding 1 mg Dithios Reitol (Nacalai Tesque / Kyoto, cat no. 14112-52) and reducing at 37 ° C for 1 hour, 2.5 mg Acrylamide (Piorad, cat no. 161- 010) was added, and an alkylation treatment was performed by incubating at room temperature for 1 hour.
  • Acetonitrile concentrations to be studied were prepared in units of 5% from 0% to 90% (V / V).
  • As the acid to be added to the purified solution 0.1% (V / V) trifluoroacetic acid was used for the same examination as above. .
  • sample solution 20 L was taken and diluted 20-fold with each concentration of acetonitrile solution.
  • 50 ⁇ L of PHOS-Selec Iron Affinity Gel, a metal immobilization support is taken into a 1.6 mL Eppendorf tube (Sigma-Aldrich, Cat No. P9740), and the same concentration as the solvent in which the sample is diluted beforehand. Washed with acetonitrile solvent (0.1% (V / V, the same applies below) containing trifluoroacetic acid). The above diluted sample solution was added and stirred vigorously for 30 seconds. After centrifugation at 20000 g for 1 minute, the supernatant was discarded.
  • the concentration of acid added to the purified solution used when purifying phosphorylated protein using a metal-immobilized support was fixed at 50% acetonitrile.
  • the acid to be added four types of acetic acid, formic acid, trifluoroacetic acid, and hydrochloric acid were examined as described above.
  • the acid concentrations to be studied were 0%, 0.01%, 0.03%, 0.1%, 0.3%, 1%, 3%, and 10%. Using these solvents, the same study as described above was performed.
  • trifluoroacetic acid 0.1% or more and 1.0% or less or hydrochloric acid
  • aqueous sodium chloride solution was added to the sample solution in advance, and the final concentrations were set to 0, 0.05 M, 0.1 M, 0.2 M, 0.5 M, 0.75 M, and 1 M, respectively.
  • sodium chloride can be used to purify phosphoproteins and nonspecific adsorption. It had no effect.
  • Triton X100 Triton X100, Nonidet p40, 5-cyciohexyl-pentyl-pentyl-beta-D-maltoside, beta-octyl glucoside were used to examine the effects of surfactants in the purification solution used to purify phosphorylated proteins.
  • CHAPS was added to the sample solution to a concentration of 0.1%, and the effect was investigated.
  • the sample solution was first diluted 20-fold with 0.1 M acetic acid water.
  • 50 iL of PHOS-Selec Iron Affinity Gel, a metal immobilization support was taken into a 1.6 mL Eppendorf tube and washed with 0.1 M acetic acid in advance.
  • the sample solution diluted with 0.1 M aqueous acetic acid was added thereto and stirred vigorously for 30 seconds.
  • 200 L of 0.1 M acetic acid water was added, and the mixture was vigorously stirred for 30 seconds.
  • a sample for example, a tissue, a biological fluid, a cell, a cell organ, a protein complex, etc.
  • acetonitrile is contained in an amount of 40% (V / V) to 60% (V / V), more preferably trifluoro.
  • Acetic acid for example, 0.1% or more (V / V) or more and 1.0% or less (VZV)
  • hydrochloric acid for example, 0.03% (V / V) or more, 0.3% or less (V / V)
  • the non-specific adsorption is dramatically reduced and one or more phosphorylation in the sample (eg tissue, biological fluid, cell, cell organ or protein complex) It became possible to purify the protein efficiently.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Library & Information Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースを使用することを特徴とする、当該サンプル中の複数のリン酸化タンパク質を検出する方法、および、金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する方法であって、アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液を使用することを特徴とする、前記方法。

Description

リン酸化タンパク質のプロテオーム解析方法
技術分野
本発明は、 サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータ ベースを使用することを特徴とする、 当該サンプル中の複数種のリン酸化タン パク質を検出する方法に関する。 また、 本発明は、 金属固定化担体またはチタ ニァ担体を用いてリン酸化タンパク明質を精製 (本明細書において、「精製」とは、 分離および/または濃縮 （enrichment) することを含むものとする） する方法 書
であって、 ァセトニトリルを 4 0 % (V/V) (容量対容量百分率を表す。 本明 細書および特許請求の範囲について同じ。）以上 6 0 % (V/V) 以下含有する 溶液を使用することを特徴とする、 サンプル中の 1または複数種のリン酸化タ ンパク質を精製する方法に関する。 .
背景技術 - 多くのタンパク質は、 翻訳後に種々の修飾を受けることが知られている。 そ の中でもタンパク質のリン酸化は、 さまざまなタンパク質の生理活性や酵素活 性を変化させ、 細胞内情報伝達や細胞内代謝活性を調節するものとして主要な ものである。 よって、 細胞内におけるタンパク質のリン酸化を解析することは 非常に重要である。 これまでに、 タンパク質のリン酸化について調べる様々な 手法が開発されてきており、その一つに、質量分析計を用いた分析法がある 1〉。 具体的には、 電気泳動などによって分離、 精製したタンパク質を酵素消化し て MALD TOF/MSなどで測定する。 これによつて得られたぺプチド .マス - フィンガープリントとデータベースとを照合してタンパク質の同定を行う。 そ の際にアミノ酸の一次配列から得られる理論値よりも 80 Da大きいぺプチド鎖 があるなら、 そのペプチド鎖のどこか一ヶ所がリン酸化されている可能性が高 い。 そして、 そのペプチド鎖をアルカリフォスファターゼ処理により特異的に リン酸基をはずして、 もう一度質量分析計で測定した際に、 今度はそのべプチ ド鎖が 80 Da小さくなって理論値と一致すれば、そのべプチド鎖は一ヶ所リン 酸化されていたことになる 2)。
このように、 ある 1つのタンパク質のリン酸化については、 そのタンパク質 を消化してペプチド断片を質量分析計で解析していけば、 リン酸化ペプチド、 そしてリン酸化部位を同定することが可能である。
しかしながら、 プロテオーム解析においては一度に測定するタンパク質の数 が数百から数千になる。 ここで、 用語 「プロテオーム解析」 とは、 遺伝子情報 と細胞内で複雑に相互作用している多様なタンパク質との関係を明らかにする 解析のことをいう 3)。 つまり、 プロテオーム解析は、 細胞を構成するすべての タンパク質を網羅的に解析する手法をいう。
そのため、 プロテオーム解析においては、 質量分析スぺクトルを一つ一つ確 認することは極めて困難であり、 自動検索エンジン （例えば、 MASCOT等） の結果を鵜呑みにする場合がほとんどである。
このとき、 通常、 プロテオーム解析ではタンパク質データベース （例えば、 NCBInr、 IPI、 Sport等） を使用するが、 自動検索エンジン（例えば、 MASCOT 等） を用いた場合、 偽陽性および偽陰性が非常に多くなること、 また、 検索時 間に膨大な時間を要することから、 プロテオーム解析を効率よく高精度に行う ことが困難である。
通常、 タンパク質の多くは、 リン酸化されている分子とされていない分子が 混在しており、 ほとんどのタンパク質分子がリン酸化されているタンパク質は ほとんどない。 また、 タンパク質分子が複数箇所リン酸化されていたり、 他種 のタンパク質が混在していたりするため、 リン酸化タンパク質を質量分析計で 直接検出することは困難である。
ざらに、 一般的に、 タンパク質がリン酸化を受けるとそのタンパク質の質量 分析計での検出感度が下がることが知られている。 そのため、 目的のタンパク 質を純度よく精製できなかったり、 少量しか精製できなかったりすると、 リン 酸化タンパク質を検出することは困難である。 それゆえ、 サンプル中の目的の タンパク質が極めて少ない場合には、 リン酸化タンパク質を検出することは極 めて困難である。 したがって、 リン酸化タンパク質を網羅的に解析するために は、 リン酸化タンパク質を特異的に精製してから質量分析計で測定することが 望ましい。
リン酸化タンパク質を特異的に精製する方法として、 金属固定化ァフィニテ ィ一クロマトグラフィー （以下、 IMACと称することがある） が汎用されてい る。 IMACカラムは、 複数のカルボン酸を介したキレート形成基に金属として 3価の鉄イオンもしくはガリゥムを固定化したものからなる。 三価の鉄イオン にリン酸基が特異的に強く結合する性質があるため、 IMACカラムにリン酸化 タンパク質を結合させることができる。 IMACカラムにリン酸基を結合させる ときは酸性条件下で行い、 リン酸基を遊離させるには溶媒の pHを弱アル力リ にするもしくはリン酸緩衝液による競合的溶出手段が用いられる4一 1 2)。
し力 し、 カルボン酸も IMACカラムに対して親和性を持っため、 酸性アミノ 酸を有するペプチドもまた多かれ少なかれ IMACカラムに結合する。そのため、 IMACカラムを用いてリン酸化タンパク質のみを精製するのは容易ではない。 この問題を解決するため、 タンパク質をトリプシンで消化後に、 無水メタノ 一ル'塩酸液中でカルボン酸のメチルエステル化を行うことで IMACカラムに 対する酸性アミノ酸の吸着を抑える精製方法が報告されている 1 3 )。 しかし、ェ ステル化反応が定量的に進行しなかったり、 副反応が起きたり、 選択性が期待 通りよくならなかったり、 エステル化した後にペプチドが不溶化したりするた め、 特異的に精製できないことも多い 1 4 )。
さらには、 従来からリン酸化タンパク質の精製に用いられている Dihydroxy Benzoic Acid (以下、 「DHB」 と称する場合がある） は、 MALDI-MSには使えるが、 LC-MSには使えない。
このような状況下では、 リン酸化タンパク質を検出することが困難である。 参照文献
1 ) Shou W， Verma R， Annan RS, Huddleston MJ, Chen SL, Carr SA， Deshaies RJ. Mapping phosphorylation sites in proteins by mass spectrometry. Methods Enzymol. 2002, 351:279.296.
) McLachlin DT, Chait BT. Analysis of phosphorylated proteins and peptides by mass spectrometry. Curr Op in Chem Biol. 2001: 5, 591-602. ) Gerard D, Tewis B. Global approaches to protein-protein interactions. Current Opinion in Cell Biology. 2003： 15(2), 199-205.
) Watts JD, Affolter M， Krebs DL, Wange RL, Samelson LE, Aebersold R: Identification by electrospray ionization mass spectrometry of the sites of tyrosine phosphorylation induced in activated Jurkat T cells on the protein tyrosine kinase ZAP-70. J Biol Chem 1994, 269:29520-29529.) Michel H, Griffin PR, Shabanowitz J， Hunt DF， Bennett J.: Tandem mass spectrometry identifies sites of three post-translational modifications of spinach light-harvesting chlorophyll protein II. Proteolytic cleavage, acetylation, and phosphorylation. J Biol Chem. 1991， 266:17584-17591.
) Neville DC, Rozanas CR, Price EM, Gruis DB, Verkman AS, Townsend RR: Evidence for phosphorylation of serine 753 in CFTR using a novel metal- ion affinity resin and matrix-assisted laser desorption mass spectrometry. Protein Sci 1997, 6:2436-2445.
) Posewitz MC, Tempst P: Immobilized gallium(IIl) affinity chromatography of phosphopeptides. Anal Chem 1999， 71:2883-2892. ) Wu X, Ranganathan V, Weisman DS， Heine WF， Ciccone DN, O'Neill TB，
Crick KE, Pierce KA, Lane WS, Rathbun G, et al.: ATM phosphorylation of Nijmegen breakage syndrome protein is required in a DNA damage response. Nature 2000, 405:477.482.
) Stensballe A, Andersen S, Jensen ON: Characterization of p ho sp hop roteins from electrophoretic gels by nanoscale Fe(lII) affinity chromatography with off-line mass spectrometry analysis. Proteomics 2001, 1:207-222.
1 0 ) Zhou W, Merrick BA， Khaledi MG, Tomer KB: Detection and sequencing of phosphopeptid.es affinity bound to immobilized metal ion beads by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom 2000, 11:273-282.
1 1 ) Nuwaysir LM, Stults JT: Electrospray ionization mass spectrometry of phosphopeptides isolated by on-line immobilized metal-ion affinity chromatography. J Am Soc Mass Spectrom 1993, 4:662-669.
1 2 ) Haydon CE, Eyers PA, Aveline-Wolf LD, Resing KA, Mailer JL, Ahn NG.: Identification of Novel Phosphorylation Sites on Xenopus laevis
Aurora A and Analysis of Phosphopeptide Enrichment by Immobilized Metal- affinity Chromatography. Mol Cell Proteoniics 2003， 2:1055-1067.
1 3 ) Ficarro SB, McCleland ML, Stukenberg PT, Burke DJ, Ross MM, Shabanowitz J, Hunt DF, White FM: P osp oproteome analysis by mass spectrometry and its application to Saccharomyces cerevisiae. Nat Biotec nol. 2002, 20： 301-305.
1 4 ) Nuhse TS， Stensballe A, Jensen ON, Peck SC. Large-scale Analysis of in Vivo Phosphorylated Membrane Proteins by Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography and Mass Spectrometry. Mol Cell Proteomics
2003, 2：1234-1243. 発明の開示
本発明は、 このような状況を鑑みてなされたものであり、 その解決しようと する課題は、 サンプル （例えば、 組織、 生体液、 細胞、 細胞器官またはタンパ ク質複合体等） 中の複数種のリン酸化タンパク質を精度よく、 かつ、 短時間に 検出することにある。
また、 サンプル （例えば、 組織、 生体液、 細胞、 細胞器官またはタンパク質 複合体等） 中の 1または複数種のリン酸化タンパク質を効率的に精製すること にある。
本発明者らは、 上記課題を解決するため、 鋭意検討を重ねた結果、 サンプル (例えば、 組織、 生体液、 細胞、 細胞器官またはタンパク質複合体等） 中の複 数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースを作成し、 サンプルか ら分離したリン酸化タンパク質を質量分析計により測定し、 測定の結果得られ たデータを、 当該作成されたデータベースを使用して解析することにより、 サ ンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を精度よく 、 かつ、 短時間に検出でき ることを見出した。
また、 金属固定化担体によるリン酸化タンパク質の精製において、 ァセトニ トリノレを 4 0 % (V/V) 以上 6 0 % (V/V) 以下含有し、 さらにトリフノレ ォロ酢酸を 0 . 1 %以上 （V/V) 以上 1 . 0 % (V/V) 以下または塩酸を 0 . 0 3 % (V/V) 以上 0 · 3 % ( V/V) 以下含有する溶液を使用することによ り、 非特異的吸着が劇的に減少し、 サンプル （例えば、 組織、 生体液、 細胞、 細胞器官またはタンパク質複合体等） 中の 1または複数のリン酸化タンパク質 を効率的に精製することが出来ることを見出し、 本発明を完成するに至った。 すなわち本発明は、 以下に関する。
( 1 ) サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベース を使用することを特徴とする、 当該サンプル中の複数種のリン酸化タンパ ク質を検出する方法。
( 2 ) サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベース を使用することを特徴とする、 当該サンプル中の複数種のリン酸化タンパ ク質を検出する方法であって、
(a) サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を分離する工程と、
(b) 当該分離されたリン酸化タンパク質の質量を分析する工程と、
(c) 工程 (b)で得られたデータを、上記データベースから検索してリン酸化タ ンパク質を検出する工程と、
を含む、 前記方法。 (3) サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベース が、
(a) サンプル中の複数種のタンパク質の質量を分析する工程と、
(b) 得られた分析結果よりタンパク質を同定する工程と、
(c) 当該同定されたタンパク質に関するデータからなるデータベースを作 成する工程と、
を含む工程から作成されるものである、 （1) または （2) に記載の方法。
( 4 ) サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベース 力 サンプル中の複数種のタンパク質の質量分析により同定されたタンパ ク質に関するものである、 （1) または （2) に記載の方法。
(5) サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベース を使用することを特徴とする、 当該サンプル中の複数種のリン酸化タンパ ク質を検出する方法であって、
(a) サンプル中の複数種のタンパク質の質量を分析する工程と、
(b) 得られた分析結果よりタンパク質を同定する工程と、
(c) 当該同定されたタンパク質に関するデータからなるデータベースを作 成する工程と、
(d) サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を分離する工程と、
(e) 当該分離されたリン酸化タンパク質の質量を分析する工程と、
(f) 工程 (e)で得られたデータを、工程 (c)で得られたデータベースから検索し てリン酸化タンパク質を検出する工程と、
を含む、 前記方法。
(6) サンプルが、 組織、 生体液、 細胞、 細胞器官またはタンパク質複合体で ある、 （1) 〜 （5) のいずれか 1項に記載の方法。
(7) サンプル中の複数のリン酸化タンパク質を分離する工程が、 金属固定化 担体またはチタニア担体と、ァセトニトリルを 40% (V/V)以上 60%
(V/V) 以下含有する溶液とを使用することを特徴とするものである、
(2) 〜 （6) のいずれか 1項に記載の方法。 (8) 金属固定化担体またはチタ-ァ担体を用いてリン酸化タンパク質を精製 する方法であって、 ァセトニトリルを 40% (V/V) 以上 60% (V/ V) 以下含有する溶液を使用することを特徴とする、 前記方法。
(9) 金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質を精製 する方法であって、
ァセトニトリルを 40% (V/V) 以上 60% (V/V) 以下含有する溶 液を、 金属固定化担体若しくはチタニア担体の平衡化溶媒、 サンプルを溶 解する溶媒および/または金属固定化担体若しくはチタニア担体における 展開溶媒として使用することを特徴とする、 前記方法。
(10) 金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質を精 製する方法であって、
ァセトニトリノレを 40% (V/V) 以上 60 % (V/V) 以下含有する溶 液で金属固定化担体またはチタニア担体を平衡化する工程と、
サンプルを、 ァセトニトリルを 40% (V/V) 以上 60 % (V/V) 以 下含有する溶液に溶解する工程と、
当該溶解したサンプルと、 前記平衡化された担体とを接触させる工程と、 リン酸化タンパク質を溶出させる工程と、
を含む、 前記方法。
(1 1) ァセトニトリルを 40% (V/V) 以上 60% (V/V) 以下含有す る溶液が、 さらに酸を含有する溶液である、 （8) 〜 （10) のいずれか
1項に記載の方法。
(12) 酸が強酸である、 （1 1) に記載の方法。
(1 3) 強酸が、 トリフルォロ酢酸または塩酸である、 （1 2) に記載の方法。
(14) トリフルォロ酢酸の濃度が、 0. 1% (V/V) 以上 1. 0% (V/ V) 以下である、 （1 3) に記載の方法。
(1 5) 塩酸の濃度が、 0. 03% (V/V) 以上 3% (V/V) 以下で ある、 （13) に記載の方法。
(1 6) 金属固定化担体に固定される金属イオンが、 鉄イオン （III) またはガ リウムイオン （III) である、 （8) 〜 （15) のいずれか 1項に記載の方 法。
(17) Dihydroxy Benzoic Acid を含まないことを特徴とする、 （8) 〜 （1
6) のいずれか 1項に記載の方法。
(18) ァセトニトリルを 40% (V/V) 以上含有する溶液を含む、 リン酸 化タンパク質精製キット。
(19) (8) 〜 （17) のいずれか 1項に記載の方法に使用するための、 （1
8) に記載のキット。
(20) ァセトニトリルを 40% (V/V) 以上含有する溶液を含む、 リン酸 化タンパク質精製溶液。
(21) (8) 〜 （17) のいずれか 1項に記載の方法に使用するための、 （2
0) に記載の溶液。 本発明により、 サンプル （例えば、 組織、 生体液、 細胞、 細胞器官またはタ ンパク質複合体等） 中の複数種のリン酸化タンパク質を精度よく検出すること ができ、 かつ、 検索時間も短縮することが可能になった。
すなわち、 従来の自動検索エンジン （例えば、 MASCOT等） およびタンパ ク質データベース （例えば、 NCBInr、 IPI、 Sport等） を使用する方法では、 偽陽性および偽陰性が非常に多く、 また、 検索時間に膨大な時間を要していた 、 リン酸化タンパク質を検出する対象となる被検サンプル中の複数種のタン パク質に関するデータからなるデータベースを作成し、 サンプルから分離した リン酸化タンパク質を質量分析計により測定し、測定の結果得られたデータを、 当該作成されたデータベースを使用して解析することにより、 サンプル中の複 数種のリン酸化タンパク質を精度よく、 かつ、 短時間に検出できるようになつ た。 また、 従来の方法では検出できなかったリン酸化タンパク質をも検出する ことができるようになった。
また、 本発明により、 金属固定化担体またはチタ-ァ担体によるリン酸化タ ンパク質の精製において、 ァセトニトリルを 40% (V/V) 以上 60% (V /V) 以下含有し、 さらに好ましくはトリフルォロ酢酸 （例えば、 0 . 1 % (V /V) 以上 1 . 0 % (V/V) 以下） または塩酸 （例えば、 0 . 0 3 % (V/V) 以上 0 . 3 % (V/V)以下）などの強酸を含有する溶液を使用することにより、 非特異的吸着が劇的に減少し、 サンプル （例えば、 組織、 生体液、 細胞、 細胞 器官またはタンパク質複合体等） 中の 1または複数種のリン酸化タンパク質を 効率的に精製することが可能となった。
従来の方法では、 カルボン酸も IMACカラムに対して親和性を持っため、 酸 性アミノ酸を有するタンパク質もまた多かれ少なかれ IMAC カラムに結合す る。 したがって、 IMACカラムを用いてリン酸化タンパク質のみを精製するの は容易ではなかった。 また、疎水性ペプチドも IMACに対して非特異的な作用 を有するため除去できないことが多かった。これに対し、本発明の方法により、 カルボン酸や疎水性による IMACカラムに対する吸着を抑制することができ、 サンプル （例えば、 組織、 生体液、 細胞、 細胞器官またはタンパク質複合体等） 中の 1または複数種のリン酸化タンパク質を効率的に精製することが可能とな つた。
さらには、 タンパク質のカルボン酸のメチルエステル化を行うことで IMAC カラムに対する酸性アミノ酸の吸着を抑える精製方法における課題点、 すなわ ち、 エステル化反応が定量的に進行しなかったり、 副反応が起きたり、 選択性 が期待通り改良しなかったり、 エステル化した後にぺプチドが不溶化したりす るため、 特異的に精製できないことも多いという課題点についても解決し、 本 発明の方法はメチルエステル化を行うことなくサンプル （例えば、 組織、 生体 液、 細胞、 細胞器官またはタンパク質複合体等） 中の 1または複数種のリン酸 化タンパク質を効率的に精製することが可能となった。
また、 本発明は、 リン酸化タンパク質の精製において DHBを用いる必要がな いため、 DHBを除く操作をすることなく、精製したサンプルを MALDI-MSのみな らず LC-MSにおいても測定することが可能となった。 図面の簡単な説明 図 1は、 本発明のタンパク質検出方法の模式図である。
図 2は、 NCBInrデータベースにおける FASTA形式で表された gi番号お ょぴアミノ酸配列を示す (gi 1 2853677：配列番号 4、 gi 12564245：配列番号 5 )。 先頭文字力 S"> "で始まる行がタンパクの名称を示し、 次の行がアミノ酸配 列を示し、 この 2行の塊が複数個で構成される。
図 3は、 金属固定化担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する方法にお いて、 0.1 Mの酢酸水を使用し、 精製したリン酸化タンパク質を質量分析計で 測定した結果を表す。 オボアルブミ ンの 2 ケ所のリン酸化タンパク質 ( EWGSAEAGVDAASVSEEFR 2089 ( 配 列 番 号 1 ) お よ び LPGFGDSIEAQCGTSVNVH 2082 (配列番号 2 )、 ただし後者についてはトリ プシンの非特異的切断が起き、本来は LPGFGDSIEAQCGTSVNVHSSLR (配 列番号 3 ) である） 以外の多くのタンパク質が検出され、 リン酸化タンパク質 を選択的に精製することはできなかった。
図 4は、 金属固定化担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する方法にお いて、 トリフルォロ酢酸 0.3%を含む 50%ァセトニトリル溶液を使用し、 精製 したリン酸化タンパク質を質量分析計で測定した結果を表す。 オボアルブミン の 2ケ所のリン酸化タンパク質 （EWGSAEAGVDAASVSEEFR 2089 (配列 番号 1 ) および LPGFGDSIEAQCGTSVNVH 2082 (配列番号 2 )、 ただし後 者につい て は ト リ プシ ン の非特異的切断が起 き 、 本来は LPGFGDSIEAQCGTSVNVHSSLRである （配列番号 3 ) ) を選択的に精製す ることが可能になった。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施の形態について説明する。 以下の実施の形態は、 本発明 を説明するための例示であり、 本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨で はない。 本発明は、 その要旨を逸脱しない限り、 さまざまな形態で実施をする ことができる。
なお、 本明細書において引用した文献、 および公開公報、 特許公報その他の 特許文献は、 参照として本明細書に組み込むものとする。 本発明において 「タンパク質」 とは、 2以上のアミノ酸がペプチド結合によ つて結合したぺプチドを含む。
本発明において 「リン酸化タンパク質」 とは、 タンパク質中の 1残墓以上の アミノ酸 （例えば、 チロシン、 セリンまたはスレオニン等） がリン酸化された タンパク質をいう。
本明細書において 「サンプル」 とは、 タンパク質を含む検出対象物、 調製対 象物、 分画対象物、 または精製対象物を示し、 好ましくは、 組織、 生体液、 細 胞、 細胞器官またはタンパク質複合体を指す。 組織としては、 例えば、 脳、 脳 の各部位 （例えば、 嗅球、 扁祧核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳 皮質、 延髄、 小脳）、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆嚢、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 十二指腸、 小腸、 大腸、 血管、 心臓、 胸 腺、 脾臓、 顎下腺、 耳下腺、 舌下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子 宫、 骨、 関節、 骨格筋などがあげられる。 生体液としては、 例えば、 血液 （血 漿、 血清を含む）、 尿、 糞、 唾液、 涙液、 浸潤液 （腹水、 組織液を含む） などが あげられる。細胞としては、例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、 グリア細胞、 脖臓 3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 線維芽細胞、 線維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例えば、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラル キラー細胞、肥満細胞、好中球、好酸球、好塩基球、単球）、巨核球、滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 間質細胞もしくはこれら の前駆細胞、 幹細胞、 癌細胞などがあげられる。 細胞器官としては、 例えば、 核、 細胞小器官 （核小体、 核膜、 細胞膜、 ミ トコンドリア、 リソソーム、 リボ ソーム、ペルォキシソーム、小胞体（粗面小胞体、滑面小胞体、筋小胞体など）、 ゴルジ体、 微小管、 中心体、 ァクチンフィラメントなど）、 サイトゾル、 シナプ ス、 基底膜、 細胞間接着装置などがあげられる。 タンパク質複合体とは、 ニ以 上のタンパク質が物理的に結合している状態のものをいう。 ここにあげたサン プルは具体例であって、 これらに限定されるものではない。
上記目的のサンプル (例えば、 組織、 生体液、 細胞、 細胞器官またはタンパ ク質複合体） は、 生体からメスまたは注射器などを用いて採取することができ る。 細胞の場合、 生体から目的細胞を採取した後に酵素で処理し、 あるいはセ ルソーターなどで目的細胞のみ選別したものを用いることができる。 サンプル として用いる細胞には、 初代培養細胞、 細胞株、 またはそれらの培養物も含ま れ、 刺激、 誘導等のさまざまな培養条件下の細胞であってもよい。
本発明において、 「データベース」 とは、 プロテオーム解析に用いられるァ ミノ酸配列情報の集合であって、 電子計算機を用いて検索することができるよ うに当該配列情報を体系的に構成したものをいう。 プロテオーム解析に際し、 データベースおよび電子計算機を用いてアミノ酸配列情報を検索し、 タンパク 質を同定することは、 当業者において通常用いられる技術である。
本発明において、 「サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからな るデータベース」 とは、 目的とするサンプル中の複数種のタンパク質のァミノ 酸配列情報の集合であって、 電子計算機を用いて検索することができるように 当該配列情報を体系的に構成したものをいう （以下、 「本発明のデータベース」 と称する場合がある） 。 したがって、 本発明のデータベースには、 アミノ酸配 列情報の他に、 データベースを体系的に構築するための文字および記号などが 含まれていてもよく、 また、 検索に使用するキー情報およびタンパク質の名称 などが含まれていてもよい。
A. リン酸化タンパク質検出方法 ， 本発明は、 サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータ ベースを作成し、 使用する工程を特徴とする、 サンプル中の複数種のリン酸化 タンパク質を検出する方法を提供する。
この方法は、 サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデー タベースを作成する工程と、 サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を分離 する工程と、 当該リン酸化タンパク質の質量を分析する工程と、 当該得られた データを、 上記本発明のデータベースから検索してリン酸化タンパク質を検出 する工程とを含む、 リン酸化タンパク質を検出する方法である （図 l (a))。 以下に、 詳細について記載する。 1 . 本発明のデータベースの作成
本発明のデータベースは、 リン酸化タンパク質を検出する対象となる被検サ ンプル （以下、 「リン酸化タンパク質の検出対象サンプル」 ともいう） 中のタ ンパク質を調製し、 質量分析計でその質量を測定し、 得られたデータを用いて タンパク質を同定し、 当該タンパク質のアミノ酸配列情報を得て、 電子計算機 を用いて検索することができるように体系的に構成することにより作成できる (図 1 (b)) 。 また、 測定しなくても既知情報からサンプル中に含まれるタンパ ク質のァミノ酸配列情報を知ることができる場合には、 当該ァミノ酸配列情報 を得て、 電子計算機を用いて検索することができるように体系的に構成するこ とにより作成できる。
以下に、 リン酸化タンパク質の検出対象サンプル中のタンパク質を質量分析 計で測定し、 得られたデータを用いてタンパク質を同定し、 当該複数種のタン パク質のアミノ酸配列情報からデータベースを作成する方法を記載する。
( 1 ) 本発明のデータベースを作成するための測定サンプルの調製方法 （図 1 (c))
本発明のデータベースを作成するための測定サンプルは、 リン酸化タンパク 質の検出対象サンプルと同種の組織、 生体液、 細胞、 細胞器官またはタンパク 質複合体を用いることができる。 本発明のデータベースを作成するための測定 サンプルは、好ましくはリン酸化タンパク質の検出対象サンプルと同一の組織、 生体液、 細胞、 細胞器官またはタンパク質複合体があげられる。
測定サンプルの調製方法の例を図 1 (c)に示すが、 当該方法はこれに限定され るわけではない。
リン酸化タンパク質の検出対象サンプルを破砕し、タンパク質粗液を抽出（図 1 (c)(0) 後、 遠心分画することができる （図 l (c)(ii))。 これを 「遠心分画した タンパク質」 とする。 破砕.抽出する方法は、 ダウンス型テフロン ΤΜ ·ホモジ ナイザー、 ポリ トロン、 ワーリング 'プレンダー、 ポッター型ガラス 'ホモジ ナイザー、 超音波破碎装置、 細胞溶解液 （例えばピアス社製の M-PER: cat no. 78501, T-PER: cat no. 78510など） を用いる方法または凍結融解法があげられ、 好ましくはダウンス型テフロン ΤΜ ·ホモジナイザー、 ポッター型ガラス .ホモ ジナイザーを用いる方法である。 遠心分画する方法は、 分画遠心法ゃショ糠密 度勾配遠心法などがあげられ、 好ましくはショ糖密度勾配遠心法である。
次に、必要に応じて、遠心分画したタンパク質を粗精製することができる（図 l (c)(iii))。 これを 「粗精製したタンパク質」 とする。 粗精製する方法は、 群特 異的ァフイエティーカラム精製、 カチオン交換クロマトグラフィー、 ァ-オン 交換クロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィーを利用する方法、 免疫沈降 法、 硫安沈殿法、 有機溶媒による沈殿法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 透析法ま たはこれらの組合せなどがあげられ、 好ましくは群特異的ァフィ二ティーカラ ム精製である。 また、 リン酸化タンパク質またはリン酸化されていないタンパ ク質を粗精製するために、 後述する金属固定化担体 （J Biol Chem 1994, 269:29520-29529、 J Exp Med 2000, 192:1755-1762、 Protein Sci 1997, 6:2436-2445、 Anal Chem 1999， 71:2883-2892、 Nature 2000, 405:477-482、 Proteomics 2001, 1:207.222、 J Am Soc Mass Spectrom 2000, 11:273-282、 J Am Soc Mass Spectrom 1993, 4:662.669、 J Biol Chem 2001, 276:6959-6966、 Nat Biotechnol. 2002： 20, 301.305、 Proc Natl Acad Sci U S A. 2003： 100, 443-448) またはチタ-ァ担体を利用してもよい。 これらの担体を使用した場 合、 担体に吸着するタンパク質がリン酸化タンパク質であり、 担体に吸着しな いタンパク質がリン酸化されていないタンパク質である。
破砕 ·抽出、 遠心分画、 粗精製の各操作は、 これらに限定されるものではな く、 当業者における技術常識により、 適当なものを選択し、 また、 組み合わせ ればよい。
その後、 必要に応じて、 粗精製したタンパク質の分画おょぴ Zまたは消化を 行うことができる （図 l (c)(iv)、 （v))。 これをそれぞれ 「分画したタンパク質」 およぴ「消化したタンパク質」とする。分画方法は、二次元電気泳動、 SDS-PAGE, 各種クロマトグラフィー (例えば、 ァフィ二ティークロマトグラフィー、 逆相 クロマトグラフィー、 ァニオン交換クロマトグラフィー、 カチオン交換クロマ トグラフィーなど） 等を採用することができるが、 これらに限定されるもので はなく、 適当なものを選択すればよい。 消化方法には、 酵素消化、 化学分解等 があげられ、 好ましくは酵素消化であるが、 これに限定されるものではなく、 適当なものを選択すればよい。 酵素消化に用いる酵素としては、 トリプシン、 キモトリプシン、 Lys-C, Asp-N, Glu-Cなどがあげられ、 好ましくはトリプシ ンである。 また、 酵素消化の際には、 界面活性剤、 好ま しく は 5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltoside (米国特許第 5674987号明細書および 米国特許第 5763586号明細書、アナトレース社（Anatrace Inc., Maumee, OH, USA) ) を加えることが望ましい。
こうして得られた遠心分画したタンパク質、 粗精製したタンパク質、 分画し たタンパク質または消化したタンパク質は、 HPLCによりさらに分画すること ができる（図 l (c)(vi))。これを「HPLCにより分画されたタンパク質」とする。 HPLCに用いるカラムは、 当業者における技術常識により、 適当なものを選択 すればよく、好ましくはァニオン交換カラムまたはカチオン交換カラムである。 HPLCの諸条件 （流速、 検出器、 移動相など） は、 当業者における技術常識に より、 適宜選択できる。
また、 粗精製したタンパク質が、 例えば、 金属固定化担体またはチタユア担 体で粗精製したリン酸化されたタンパク質の場合には、 当該リン酸化されたタ ンパク質を消化した後、 金属固定化担体またはチタ-ァ担体によりリン酸化さ れたタンパク質およぴリン酸化されていないタンパク質をさらに分画すること もできる。 すなわち、 リン酸化されていないタンパク質を選択的に分画するた めに、 再び金属固定化担体またはチタニア担体を利用して、 金属固定化担体ま たはチタ-ァ担体に吸着されないタンパク質を金属固定化担体またはチタニア 担体に吸着されたタンパク質から分画することにより、 リン酸化されていない タンパク質を得ることができる。 これを 「分画したリン酸化されていないタン パク質」 とする。 このとき、 少量 （例えば、 0 . 0 1 %から 2 0 %) のリン酸 化タンパク質が混入していてもよい。 少量のリン酸化タンパク質が混入してい ても、 リン酸化されていないタンパク質の測定結果にはほとんど影響を与えな いからである。
リン酸化されていないタンパク質は、 以下の二つの使用法がある。
第一に、 リン酸化タンパク質の検出対象サンプル中に存在するタンパク質か ら、 リン酸化タンパク質を分離する方法によって、 リン酸化されたタンパク質 とリン酸化されていないタンパク質とを分離し、 リン酸化されていないタンパ ク質を用いてデータベースを作成し、 リン酸化されたタンパク質を用いてリン 酸化タンパク質を検出するというものである。
第二に、 リン酸化タンパク質の検出対象サンプル中に存在するタンパク質か ら、 リン酸化タンパク質を分離する方法によって、 リン酸化されたタンパク質 を分離し、 当該リン酸化されたタンパク質を消化して、 リン酸化されたタンパ ク質 （ペプチド） とリン酸化されていないタンパク質 （ペプチド） とを用意す る。 そして、 リン酸化されていないタンパク質 （ペプチド） を測定してデータ ベースを作成し、 リン酸化されたタンパク質 （ペプチド） を用いてリン酸化さ れたタンパク質を検出するというものである。 このとき、 リン酸化されていな いタンパク質 （ペプチド） は、 上記の 「分画したリン酸化されていないタンパ ク質」 を使用することができる。 当該データベースは、 サンプル中に含まれる タンパク質の中でもリン酸化タンパク質に限定されたデータベースとなるため 本発明の検出方法において特に有用である。
( 2 ) 本発明のデータベースを作成するための測定サンプルの質量測定方法 次に、 上記の操作により得られた測定サンプル （遠心分画したタンパク質、 粗精製したタンパク質、 分離したタンパク質、 消化したタンパク質、 HPLCに より分離されたタンパク質または分離したリン酸化されていないタンパク質を 意味する） に含まれるタンパク質の質量を質量分析計で測定する。 質量分析計 は、 ガスクロマトグラフと結合された質量分析装置であるガスクロマトグラフ ィーマススぺクトロメ トリー （GC/MS)や液体クロマトグラフと結合された質 量分析装置である液体クロマトグラフィーマススぺクトロメ トリー （LCMS) 等の汎用の装置を用いて行うことができる。 質量分析計におけるイオン化方法 は、 各装置に応じて適宜選択できる。 例えば、 MALDI (マトリックス支援レー ザ一脱離イオン化法）、 ESI (エレクトロスプレーイオン化法）、 EI (電子ィォ ン化法）、 CI (化学イオン化法）、 APCI (大気圧化学イオン化法）、 FAB (高速 原子衝撃法）、 LD、 FD、 SIMS, TSP等があげられ、 好ましくは MALDIまた は ESIである。アナライザ一は、各装置に応じて適宜選択できる。例えば、 TOF (飛行時間型）、イオントラップ、 二重収束型、 四重極型、 フーリェ変換型等の 汎用の装置を用いて行うことができる。 質量分析計の装置および方法は、 ここ に例示したものに限定されるものではなく、 当業者において質量分析に通常使 用されるものを適宜選択すればよレ、。 ( 3 ) タンパク質の同定方法
質量分析計による測定の結果得られたデータを用いて、 タンパク質を同定す ることができる。 すなわち、 得られたデータを、 ソフトフェア (例えば、 SonarMSMS (Genomic solution社製））およびデータベース（例えば、 NCBInr (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) , IPI、 Sport等のデータベース） を使用する ことにより解析し、 サンプル中のタンパク質を同定することが可能である。 質 量分析計による測定データを用いて、 タンパク質を同定することは当業者にと つて容易である （Nat Genet. 1998: 20， 46-50； J Cell Biol. 1998: 141, 967-977； J Cell Biol. 2000: 148, 635.651; Nature. 2002: 415, 141-147； Nature. 2002: 415, 180-183； Curr Opin Cell Biol. 2003: 15, 199-205； Curr Opin Cell Biol. 2003： 7, 21-27) 0 同定されたタンパク質の情報から、 アミノ酸配列情報を得る ことは、 当業者にとって容易である。
( 4 ) データベースの作成方法 得られた複数のァミノ酸配列情報を、 電子計算機を用いて検索することがで きるように体系的に構成する。 データベースの作成に用いるァミノ酸配列情報 は、 調製方法の異なるサンプルから得られた複数のアミノ酸配列情報を組み合 わせてもよい。
本明細書において 「体系的に」 構成するとは、 得られた複数のアミノ酸配列 情報を、 電子計算機を用いて使用できるように秩序づけて統一の様式で構成す ることを意味する。
本発明のデータベースは、 リン酸化タンパク質の検出対象サンプル中の同定 されたタンパク質のァミノ酸配列情報を、 電子計算機を用いて検索することが できるように体系的に構成されていれば、 形式は特に限定されない。
本発明のデータベースの作成方法は、 リン酸化タンパク質の検出対象サンプ ル中の同定されたタンパク質のアミノ酸配列情報を、 電子計算機を用いて検索 することができるように体系的に構成することにより作成することができる。 以下に、 本発明のデータベースの作成方法の一例を記載する。
同定されたタンパク質には、使用したデータベースにアクセス可能なように、 必ずユニークなキー情報が存在する。 例えば、 NCBInrデータベースの場合に は、 gi番号である。
また、 通常、 タンパク質同定ソフトウェアで使用するデータベース形式は、 FASTA形式と呼ばれ、 先頭文字力 s"> "で始まる行がタンパク質の名称を示し、 次の行がアミノ酸配列を示し、 この 2行の塊が複数個で構成される、 という規 則で記載されている （図 2 )。
タンパク質同定ソフトウェアで同定されたタンパク質情報から gi 番号
(gi l XXXXXX) (gi 1 2853677、 配列番号 4 ) (gi 1 2564245、 配列番号 5 ) で構 成されたキー情報を取り出し、 FASTA形式で定義されたデータベースをサー チし、 タンパク質の名称が定義された行とキー情報とが部分一致した行と次の アミノ酸配列が定義された行をとりだす。 それを同定されたタンパク質全てに 関して実行し、 同定されたタンパク質のみの FATSA形式のデータベースを新 規に作成する。
このデータベースをタンパク質同定ソフトウェアに登録することで、 検索可 能となる。
以上のように、 本発明のデータベースは、 サンプル中の複数種のタンパク質 の質量分析により同定されたタンパク質に関するものであって、 リン酸化タン パク質の検出対象サンプル中のタンパク質を質量分析計で測定し、 得られたデ ータを用いてタンパク質を同定し、当該タンパク質のァミノ酸配列情報を得て、 電子計算機を用いて検索することができるように体系的に構成することにより 作成できる。
なお、 同種の組織、 生体液、 細胞、 細胞器官またはタンパク質複合体は、 同 一のタンパク質を発現していると考えられるため、 本発明のデータベースは、 同種の組織、 生体液、 細胞、 細胞器官またはタンパク質複合体については、 実 験ごとに作成する必要がなく、 実験間において繰り返し使用できる。 2 . リン酸化タンパク質の分離
以下に、 リン酸化タンパク質の検出対象サンプル中からリン酸化タンパク質 を分離する方法を記載する。
( 1 ) リン酸化タンパク質の調製方法 （図 l (d)(i))
前述の測定サンプルの調製方法と同様にして、 リン酸化タンパク質の検出対 象サンプルを破砕し、 タンパク質を抽出、 遠心分画、 粗精製、 分画、 もしくは 消化またはこれらの組合せにより、 消化したタンパク質を得ることができる。 本発明において、 好ましくは、 リン酸化タンパク質は、 サンプルを破碎し、 タ ンパク質を抽出、遠心分画、粗精製、分画及び消化することにより調製される。 図 l (d)(i)は、 リン酸化タンパク質の調製方法の一態様を示したものであり、 当 該方法はこれに限定されるわけではない。 リン酸化タンパク質の分離方法 （図 1 (d)(ii)) 消化したタンパク質からリン酸化タンパク質をさらに分離する。 これを 「分 離したリン酸化タンパク質」 とする。 リン酸化タンパク質の分離は、 選択的に リン酸化タンパク質を分離できる方法であれば何でもよく、 例えば、 金属固定 化担体またはチタニア担体を用いた分離方法、 抗リン酸化抗体を用いた免疫沈 降法などが挙げられ、 好ましくは 「B. リン酸化タンパク質の精製方法」 で後 述する金属固定化担体またはチタユア担体を用いた分離 （精製） 方法である。 金属固定化担体またはチタニア担体を用いた、 リン酸化タンパク質の分離方 法は、 初めに、 ァセトニトリルを含有する溶液で金属固定化担体またはチタ二 ァ担体を平衡化する。 次に、 上記 （1) の操作により調製したタンパク質を、 ァセトニトリルを含有する溶液に溶解する。 続いて、 上記溶液に溶解したタン パク質と、 上記溶液で平衡化した金属固定化担体またはチタユア担体とを接触 させる。 その後、 金属固定化担体またはチタニア担体をァセトニトリルを含有 する溶液で洗浄することが望ましい。 そして、 適当な溶出溶液でリン酸化タン パク質を溶出する。 溶出溶液は、 特に限定されないが、 例えば、 5% (V/V) ァセトニトリルを含む 150 mMのアンモニア水、 5% (V/V) ァセトニトリ ルを含む 0. 1%リン酸等を用いることができる。 アンモニア水で溶出させた 場合には、 溶出液をそのまま乾燥させ、 リン酸で溶出させた場合には、 脱塩操 作を行うことが望ましい。
上記の平衡化、 溶解、 洗浄の各操作において、 ァセトニトリルを含有する溶 液中のァセトニトリル濃度は、 30% (V/V) 以上 70% (V/V) 以下、 好ましくは 35% (V/V)以上 65% (V/V)以下、 より好ましくは 40% (V/V) 以上 60% (V/V) 以下、 特に好ましくは 45% (V/V) 以上 55% (V/V) 以下、 例えば、 50% (V/V) である。 また、 当該溶液に は、 酸溶液を加えることができる。 使用する酸溶液は、 好ましくは、 強酸、 例 えば、 トリフルォロ酢酸、 塩酸等があげられ、 特に好ましくはトリフルォロ酢 酸であるが、 特に限定されない。 当該溶液中の酸溶液の濃度は、 トリフルォロ 酢酸においては、好ましくは 0. 1% (V/V) 以上 1. 0% (V/V) 以下、 特に好ましくは 0. 2% (V/V) 以上 0. 6% (V/V) 以下、 例えば 0. 3 % (V/V) であり、 塩酸においては、 好ましくは 0 . 0 3 % (V/V) 以 上 0 . 3 % (V/V) 以下、 特に好ましくは 0 . 0 6 % (V/V) 以上 0 . 2 % (VZV) 以下、 例えば、 0 . 1 % (V/V) である。
以上のように、 リン酸化タンパク質を分離することができる。
3 . 質量分析計によるリン酸化タンパク質の測定
次に、 分離したリン酸化タンパク質を質量分析計にて測定する。 質量分析計 は、 ガスクロマトグラフと結合された質量分析装置であるガスクロマトグラフ ィーマススぺクトロメ トリー （GC/MS) および液体クロマトグラフと結合され た質量分析装置である液体ク口マトグラフィーマススぺク トロメ トリー (LC/MS) 等の汎用の装置を用いて行うことができ、 液体クロマトグラフィー マススぺクトロメ トリーを用いて行うことが好ましい。 質量分析計におけるィ オン化方法は、 各装置に応じて適宜選択できる。 例えば、 MALDI (マトリック ス支援レ一ザ一脱離イオン化法）、 ESI (エレクトロスプレーイオン化法）、 EI (電子イオン化法）、 CI (化学イオン化法）、 APCI (大気圧化学イオン化法）、 FAB (高速原子衝擊法）、 LD、 FD、 SIMS, TSP等があげられ、 好ましくは MALDIまたは ESIである。アナライザ一は、各装置に応じて適宜選択できる。 例えば、 TOF (飛行時間型）、 イオントラップ、 二重収束型、 四重極型、 フー リエ変換型等の汎用の装置を用いて行うことができる。 質量分析計の装置およ び方法は、 ここにあげたものに限定されるものではなく、 当業者において質量 分析に通常使用されるものを適宜選択すればよレ、。
4 . リン酸化タンパク質のデータ解析、 検出
データ解析には、 データベースとして、 本発明のデータベースを用いる。 質量分析計による測定の結果得られたデータをソフ トフェア （例えば、 MASCOT (Matrix Science社製）） およぴ本発明のデータベースを使用するこ とにより解析し、 サンプル中のリン酸化タンパク質を同定することが可能であ る。 得られた結果については手作業で一つ一つ質量分析スぺクトルを確認するこ とが好ましいが、 これに限定されるものではない。 その際、 リン酸化されるァ ミノ酸がセリンまたはスレオニンの場合には、 親イオンのピーク （リン酸化さ れていないタンパク質のピーク） から 98 Da外れたピークが明確に （イオント ラップ型の ESI-MSでは非常に強く） 観測され、 リン酸化されるアミノ酸がチ 口シンの場合には、 80 Da外れたピークが明確に観測されていることが好まし レ、。 この判定基準は、 当業者であれば容易に想定されるものである。
これらの方法により、 リン酸化タンパク質を効率よく検出でき、 かつ検索時 間も大幅に短縮できる。 ·
B . リン酸化タンパク質の精製方法
本発明は、 金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質 を精製する方法であって、 ァセトニトリルを 4 0 % (V/V) 以上 6 0 % (V /V) 以下含有する溶液を使用することを特徴とする、 リン酸化タンパク質を 精製する方法を提供する。
以下に、 詳細について記載する。
1 . 金属固定化担体またはチタニア担体
本発明において、 「金属固定化担体」 とは、 キレート形成基 （例えば、 イミ ノジ酢酸基（以下、 IDAと称する場合がある）、 二トリ口三酢酸基（以下、 NTA と称する場合がある） 等） に金属イオンをキレート結合させた担体をいう。 金 属固定化担体としては、 例えば、 鉄イオン （III) をキレート結合させた鉄ィォ ン （III) 担体、 ガリウム （III) イオンをキレート結合させたガリウム （ΙΠ) ィォン担体等があげられる。
担体としては、 ァガロースゲル、 アクリルアミド、 磁気ビーズ、 セルロース などがあげられ、 好ましくはァガロースゲルである。
金属固定化担体は、 キレート形成基 （例えば、 IDA、 NTA等） を有する担体 に、 適当な金属イオン、 好ましくは鉄イオン （111)、 またはガリウム （III) ィ オンをキレート結合させることにより、 作製することができる。
キレート形成基 （例えば、 IDA、 NTA等） を有する担体は、 例えば、 アマシ ャム バイオサイエンス社等から購入することができる （Chelating Sepharose Fast Flow, アマシャム バイオサイエンス社製、 Cat No. 17·0575·01)。
鉄イオン （ΠΙ) 担体は、 例えば、 キレート形成基 （例えば、 IDA、 NTA等） を有する担体を 0 . 1 %酢酸水で洗浄し、続いて、 0 . 1 %酢酸に溶かした 50 mM 塩化鉄 III (FeCl3) と混ぜ、 その後、 0 . 1 %酢酸水で洗浄することによって、 作製することができる。
また、 キレート形成基を有する担体は、 Sigma-Aldrich社から購入すること によっても入手するこ とができる （ PHOS-Selec Iron Affinity Gel、 Sigma-Aldrich社製、 Cat No. P9740)。
ガリウムイオン （ΙΠ)担体は、例えば、 キレート形成基 （例えば、 IDA, NTA 等） を有する担体を 0 . 1 %酢酸水で洗浄し、 続いて、 0 . 1 %酢酸に溶かした 50 mM塩化ガリウム III (GaCls) と混ぜ、 その後、 0 . 1 %酢酸水で洗浄する ことによって、 作製することができる。
また、当該担体は Pierce社から購入することによつても入手することができ る （Phosphopeptide Isolation Kit, Pierce社製、 Cat No. 89853) 0
金属固定化担体は、 適当なカラム （例えば、 ポリプレップェンプティカラム (パイオラド社製、 Cat No. 731-1550) 等） に充填することによって、 金属 固定化ァフィユティークロマトグラフィーカラム （IMACカラム） として使用 できる。 また、 金属固定化担体は、 適当なチューブ （例えば、 エツペンドルフ チューブ （エツペンドルフ社製） 等） に加えることによって、 使用することも できる。
本発明において「チタ-ァ」 とは、酸化チタン（IV) (TiO2、 Titanium dioxide (IV)) をいう。 また、 本発明において 「チタ-ァ担体」 とは、 チタニアが、 直 径数から数十マイクロメ一トル程度の丸いビーズ状となっているものをいう。 チタニア担体は、 GL サイエンス社から購入することによって入手することが できる。
チタ-ァ担体は、 適当なカラム （例えば、 マイクロバイオスピンェンプティ カラム （パイオラドネ土製、 Cat No.732-6204) 等） に充填することによって、 チタ-ァカラムとして使用できる。また、チタニア担体は、適当なチューブ（例 えば、 エツペンドルフチューブ (エツペンドルフ社製) 等） に加えることによ つて、 使用することもできる。
2. 本発明の精製溶液
本発明において、 上記金属固定化担体またはチタニア担体によってリン酸化 タンパク質を精製する方法は、 ァセトニトリルを 40% (V/V) 以上 60% (V/V)以下含有する溶液（以下、「本発明の精製溶液」 と称する場合がある） を用いることを特徴とする。
ァセトニトリルは、 市販のものを用いればよく、 例えば、 和光純薬などから 購入することによって入手することができる。
本発明の精製溶液は、 金属固定化担体またはチタニア担体に用いる。 より具 体的には、 例えば、 金属固定化担体若しくはチタニア担体の平衡化溶媒、 サン プルを溶解する溶媒およぴ Zまたは金属固定化担体若しくはチタニア担体にお ける展開溶媒としての使用等に用いる。 本発明の精製溶液中のァセトニトリノレ 濃度は、 少なくとも 30% (V/V) 以上 70% (V/V) 以下、 好ましくは 35% (V/V) 以上 65 % (V/V) 以下、 より好ましくは 40% (V/V) 以上 60% (V/V) 以下、 特に好ましくは 45% (V/V) 以上 55% (V
/V) 以下、 例えば、 50% (V/V) である。 また、 当該本発明の精製溶液 には、 他の物質が含まれていてもよい。
本発明の精製溶液には、 酸溶液を加えることができる。 使用する酸溶液は、 好ましくは、 強酸、 例えば、 トリフルォロ酢酸、 塩酸等があげられ、 特に好ま しくはトリフルォロ酢酸であるが、 特に限定されない。 また、 使用する酸溶液 濃度は、 トリフルォロ酢酸においては、好ましくは 0. 1% (¥ ）以上1.
0% (V/V) 以下、 特に好ましくは 0. 2% (V/V) 以上 0. 6% (V/ V) 以下、例えば 0 . 3 % (V/V) であり、塩酸においては、好ましくは 0 . 0 3 % (V/V) 以上 0 . 3 % (V/V) 以下、特に好ましくは 0 . 0 6 % (V /V) 以上 0 . 2 % (V/V) 以下、 例えば、 0 . 1 % (V/V) である。 こ れら本発明の精製溶液は、 当業者であれば容易に調製できる。
トリフルォロ酢酸は、 市販のものを用いればよく、 例えば、 Pierce社などか ら購入することによって入手することができる。
塩酸は、 市販のものを用いればよく、 例えば、 和光純薬などから購入するこ とによって入手することができる。
3 . リン酸化タンパク質
本発明において、 精製されるタンパク質は、 リン酸化タンパク質を含むもの であれば、 その種類は限定されない。 好ましくは、 サンプル （組織、 生体液、 細胞、 細胞器官またはタンパク質複合体等） 力 ^抽出したタンパク質である。 以下に、 サンプル中のリン酸化タンパク質を精製する方法を記載する。
( 1 ) サンプル中のタンパク質の調製方法
サンプルを破碎し、 タンパク質粗液を抽出後、 遠心分画することができる。 これを 「遠心分画したタンパク質」 とする。 破砕 ·抽出する方法は、 ダウンス 型テフロン TM .ホモジナイザー、 ポリ トロン、 ワーリング.プレンダー、 ポッ ター型ガラス ·ホモジナイザー、 超音波破碎装置、 細胞溶解液 （例えばピアス 社の M-PER: cat no. 78501, T-PER: cat no. 78510など） を用いる方法または 凍結融解法があげられ、 好ましくはダウンス型テフロン ™ · ホモジナイザー、 ポッター型ガラス ·ホモジナイザ一を用いる方法である。遠心分画する方法は、 分画遠心法ゃショ糖密度勾配遠心法などがあげられ、 好ましくはショ糖密度勾 配遠心法である。
次に、 必要に応じて、 遠心分画したタンパク質を粗精製することができる。 これを 「粗精製したタンパク質」 とする。 粗精製する方法は、 群特異的ァフィ ユティーカラム精製、 カチオン交換クロマトグラフィー、 ァニオン交換クロマ トグラフィー、 逆相クロマトグラフィーを利用する方法、 免疫沈降法、 硫安沈 殿法、 有機溶媒による沈殿法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 透析法またはこれら の組合せなどがあげられ、 好ましくは群特異的ァフィユティーカラム精製であ る。 破砕 '抽出、 遠心分画、 粗精製の各操作は、 これらに限定されるものでは なく、 当業者における技術常識により、 適当なものを選択し、 また、 組み合わ せればよい。
その後、 必要に応じて、 粗精製したタンパク質の分画および消化を行うこと ができる。 これをそれぞれ 「分画したタンパク質」 および 「消化したタンパク 質」 とする。 分画方法は、 二次元電気泳動、 SDS-PAGE、 各種クロマトグラフ ィー (例えば、ァフィ二ティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、 ァニオン交換クロマトグラフィー、 カチオン交換クロマトグラフィーなど) 等 を採用することができるが、 これらに限定されるものではなく、 適当なものを 選択すればよい。 消化方法には、 酵素消化、 化学分解等があげられ、 好ましく は酵素消化であるが、 これに限定されるものではなく、 適当なものを選択すれ ばよい。酵素消化に用いる酵素としては、 トリプシン、 キモトリプシン、 Lys-C, Asp-N, Glu-Cなどがあげられ、好ましくはトリプシンである。 また、酵素消化 の際には、界面活性剤、好ましくは 5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltoside (米 国特許第 5674987号明細書おょぴ米国特許第 5763586号明細書、 アナトレー ス社 （Anatrace Inc., Maumee, OH, USA) ) を加えることが望ましい。
こうして得られた遠心分画したタンパク質、 粗精製したタンパク質、 分画し たタンパク質または消化したタンパク質は、 HPLCによりさらに分画すること ができる。 これを 「HPLCにより分画されたタンパク質」 とする。 HPLCに用 いるカラムは、当業者における技術常識により、適当なものを選択すればよく、 好ましくはァニオン交換カラムまたはカチオン交換カラムである。 HPLCの諸 条件 （流速、 検出器、 移動相など） は、 当業者における技術常識により、 適宜 選択できる。
( 2 ) リン酸化タンパク質の精製方法 次に、 上記の操作により得られたタンパク質 （遠心分画したタンパク質、 粗 精製したタンパク質、 分画したタンパク質、 消化したタンパク質、 HPLCによ り分画されたタンパク質または分離したリン酸化されていないタンパク質を意 味する） を金属固定化担体またはチタニァ担体で精製する。
以下、 精製方法を詳細に説明する。
初めに、 本発明の精製溶液で金属固定化担体またはチタニア担体を平衡化す る。 平衡化する工程は、 金属固定化担体またはチタニア担体が、 適当なカラム に充填されている場合には、 本発明の精製溶液をカラムにアプライすることに よって、 金属固定化担体またはチタユア担体が、 適当なチューブに加えられて いる場合には、 本発明の精製溶液をチューブに添加することによって、 それぞ れ行うことができる。
次に、 上記の操作により得られたタンパク質を、 本発明の精製溶液に溶解す る。 当該タンパク質が溶媒に溶解している場合には、 濃厚な本発明の精製溶液 を希釈して用いることもできる。 このとき、 本発明の精製溶液は、 タンパク質 の溶媒に含まれる溶質に応じて酸の濃度を調整することもできる。
酸溶液の最終濃度は、 トリフルォロ酢酸においては、好ましくは 0 . 1 % (V /V) 以上 1 . 0 % (V/V) 以下、 特に好ましくは 0 . 2 % (V/V) 以上 0 . 6 % (V/V) 以下、 例えば 0 . 3 % (V/V) であり、塩酸においては、 好ましくは 0 . 0 3 % (V/V) 以上 0 . 3 % (V/V) 以下、 特に好ましく は 0 . 0 6 % (V/V) 以上 0 · , 2 % (V/V) 以下、 例えば、 0 . 1 % (V /V) である。
続いて、 本発明の精製溶液に溶解したタンパク質と、 本発明の精製溶液で平 衡化した金属固定化担体またはチタ-ァ担体とを接触させる。 本発明の精製溶 液に溶解したタンパク質と、 本発明の精製溶液で平衡化した金属固定化担体ま たはチタユア担体とを接触させる工程は、 当該金属固定化担体またはチタニア 担体が、 適当なカラムに充填されている場合には、 本発明の精製溶液に溶解し たタンパク質をカラムにアプライすることによって行うことができ、 当該金属 固定化担体またはチタニァ担体が、適当なチユーブに加えられている場合には、 本発明の精製溶液に溶解したタンパク質をチューブに添加することによって、 それぞれ行うことができる。
その後、 金属固定化担体またはチタ二ァ担体を本発明の精製溶液で洗浄する ことが望ましい。 洗浄操作は、 金属固定化担体またはチタニア担体が、 適当な カラムに充填されている場合には、 本発明の精製溶液をカラムに添加すること によって、 金属固定化担体またはチタニア担体が、 適当なチューブに加えられ ている場合には、 本発明の精製溶液をチューブに添加し、 遠心操作をすること によって、 それぞれ行うことができる。
そして、 適当な溶出溶液でリン酸化タンパク質を溶出する。 リン酸化タンパ ク質を溶出させる工程は、 金属固定化担体またはチタニア担体が、 適当なカラ ムに充填されている場合には、 適当な溶出溶液をカラムにアプライすることに よって、 金属固定化担体またはチタ-ァ担体が、 適当なチューブに加えられて いる場合には、 適当な溶出溶液をチューブに添加し、 遠心操作をすることによ つて、それぞれ行うことができる。溶出溶液は、特に限定されないが、例えば、 5 % (V/V) ァセト-トリルを含む 150 mMのアンモニア水、 5 % (V/V) ァセトニトリルを含む 0 . 1 %リン酸等を用いることができる。 アンモニア水 で溶出させた場合には、 溶出液をそのまま乾燥させ、 リン酸で溶出させた場合 には、 脱塩操作を行うことが望ましい。
これらの方法により、リン酸化タンパク質を効率的に精製することができる。 このようにして得られたリン酸化タンパク質は、各種実験に用いることができ、 好ましくは、 MSによるリン酸化タンパク質の解析に用いることができる。
4 . リン酸化タンパク質精製キット
本発明は、 金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質 を精製する方法であって、 ァセトニトリルを 4 0 % ( V/V) 以上 6 0 % (V /V) 以下含有する溶液を使用することを特徴とする、 前記方法に使用する溶 液を含むリン酸化タンパク質精製キット （以下、 「本発明の精製キット」 と称す る場合がある） を提供する。 本発明の精製キットは、 リン酸化タンパク質の精製方法（前記「B . 3 . ( 2 ) リン酸化タンパク質の精製方法」 を示す） に用いられるものである。
本発明の精製キットに含まれる担体、 溶液等の例としては、 次のものが挙げ られる。
(i) 金属固定化担体またはチタ-ァ担体
(ii) ァセトニトリルを 4 0 % (V/V) 以上含有する溶液
(iii) 酸、 好ましくは強酸、 例えば、 トリフルォロ酢酸または塩酸、 特に好まし くはトリフルォロ酢酸
(iv) その他必要な溶液 （例えば、 PBS、 トリス緩衝液など）
ァセトニトリルを 4 0 % (V/V) 以上含有する溶液には、 酸、 好ましくは 強酸、 例えば、 トリフルォロ酢酸または塩酸、 特に好ましくはトリフルォロ酢 酸があらかじめ加えられていてもよい。
また、 本発明の精製キットには、 精製に必要なチューブ、 カラム、 容器、 取 扱説明書などがさらに含まれていてもよい。
5 . リン酸ィ匕タンパク質精製溶液
本発明は、 金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質 を精製する方法であって、 ァセトニトリルを 4 0 % (V/V) 以上 6 0 % (V /V) 以下含有する溶液を使用することを特徴とする、 前記方法に使用する溶 液を含むリン酸化タンパク質精製溶液（以下、 「本発明のリン酸化タンパク質精 製溶液」 と称する場合がある） を提供する。
本発明のリン酸化タンパク質精製溶液は、リン酸化タンパク質の精製方法 (前 記 「B . 3 . ( 2 ) リン酸化タンパク質の精製方法」 を示す） に用いられるもの である。
本発明のリン酸化タンパク質精製溶液は、ァセトニトリルを 4 0 % (V/V) 以上含有する溶液であり、 酸、 好ましくは強酸、 例えば、 トリフルォロ酢酸ま たは塩酸、 特に好ましくはトリフルォロ酢酸があらかじめ加えられていてもよ い。 以下に、 具体的な例をもって本発明を示すが、 本発明はこれに限られるもの ではない。 [参考例 1 ]
. マウスの脳から以下の操作により Post Synaptic Density (以下、 PSDとす る） フラクションを調製した。
7週齢の BALB/c (メス）の全脳を取り出し、 氷冷した PBS (プロテアーゼ - カクテル入り、 ロッシュ社： 1873580) を加えてテフロン TMコートしたガラス 製ホモジナイザーで全脳を細かく摺り潰した。固形物を取り除き、まず 1400 G の遠心 10分で沈殿物を取り除き、その上清を 13800 Gの遠心（16分）にかけ、 沈殿物を集めた。これを 0.32 Mシユークロースに懸濁し、下から順に 1.2M, 1M: 0.85Mの層にしたシユークロースの上に、このサンプルをのせて 82500 Gの遠 心を 120分間行った。 下から 2番目の層に溜まった画分 （Synaptosome) を集 めて 0.32 Mのシユークロースに懸濁し、 続いて 6 mMのトリス緩衝液を加え て氷冷下 45分間攪拌した。 その後に、 32800 Gの遠心を 20分間行つて沈殿物 を集めた。これを 0.32 Mのシユークロースに懸濁し、下から順に 0.8 M， 0.6 M, 0.4 Mの層にしたシユークロースの上にこのサンプルをのせて 64700 Gで 120 分間遠心した。 下から 2番目の層を取り出し、 48200 Gの遠心を 30分間行つ た。 この沈殿物に対して 1% TritonX-100を含むトリス緩衝液 · 0.32 Mシュ ークロース混液を加えて 15分間攪拌した。 48200 Gで 30分間遠心して集めた 沈殿物を PSDフラクションとした。
この PSDフラクションを 7 M尿素 · 2 Mチォ尿素 · 2% 1 CHAPSに溶かし、 溶けたタンパク質について、 以下の組合せの消化、 分画おょぴ解析を行った。 また、 沈殿物についても、 SDSに溶かし、 SDS-PAGEでタンパク質を分画 後にゲル内でトリプシン消化を行い、 C18カラムを使った LC/MSMSで解析 を行った。
1) トリプシン消化後、 陽イオン交換カラム （アマシャム社製。 以下、 SCX カラムと称する）で分画し、それぞれの画分を、 C18カラムを使つた LC/MS/MS (フィ二ガン社、 LCQ) で解析した （以下、 消化- SCXカラム- LC/MS/MSと称 する）。
2) トリプシン消化後、 シァノプロピルカラム （YMC社製。 以下、 CNカラ ムと称する） で分画し、 それぞれの画分を、 C18 カラムを使った LC/MS/MS
(フィ二ガン社、 LCQ) で解析した （以下、 消化- CNカラム- LC/MS/MSと称 する）。
3) トリプシン消化後、 陰イオン交換カラム (アマシャム社製。 以下、 SAX 力ラムと称する）で分画し、それぞれの画分を、 C18力ラムを使つた LC/MS/MS (フィ二ガン社、 LCQ) で解析した （以下、 消化- SAX力ラム- LC/MS/MSと称 する）。
4) トリプシン消化後、 SAX力ラムで分画した後、 さらに CN力ラムで分画 し、それぞれの画分を、 C18カラムを使った LC/MS/MS (フィ二ガン社、 LCQ) で解析した （以下、 消ィ匕- SAXカラム- CNカラム- LC/MS/MSと称する）。
5) SDS-PAGEでタンパク質を分画後、 ゲル内でトリプシン消化を行い、 C18 カラムを使った LC/MS/MS (フィニガン社、 LCQ)で解析した（以下、 SDS-PAGE (タンパク質分画） -消化- LC/MS/MSと称する）。
6) MonoQカラム （アマシャム社製） でタンパク質を分画後、 各画分につい てトリプシンで消化し、 SCXカラムで分画し、 それぞれの画分を、 C18カラム を使った LC/MS/MS (フィ二ガン社、 LCQ) で解析した （以下、 MonoQカラ ム （タンパク質分画） -消化- SCXカラム- LC/MS/MSと称する）。
7) MonoQカラム （アマシャム社製） でタンパク質を分画後、 各画分につい てトリプシンで消化し、 SAXカラムで分画し、 それぞれの画分を、 C18カラム を使った LC/MS/MS (フイエガン社、 LCQ) で解析した （以下、 MonoQカラ ム （タンパク質分画） -消ィ匕- SAXカラム- LC/MS/MSと称する）。
8) MonoQカラム （アマシャム社製） でタンパク質を分画後、 各画分につい てトリプシンで消化し、 CNカラムで分画し、 それぞれの画分を、 C18カラム を使った LC/MS/MS (フイエガン社、 LCQ) で解析した （以下、 MonoQカラ ム （タンパク質分画） -消化- CNカラム- LC/MS/MSと称する）。
9) MonoQカラム （アマシャム社製） でタンパク質を分画し、 SDS-PAGEで タンパク質を分画後、 ゲル内でトリプシン消化を行い、 C18 カラムを使った LC/MS/MS (フィ二ガン社、 LCQ) で解析した （以下、 MonoQ カラム （タン パク質分画） - SDS-PAGE (タンパク質分画） -消化- LC/MS/MSと称する）。
10) MonoQカラム （アマシャム社製） でタンパク質を分画し、 トリプシン消 化し、 SA カラムで分画した後、 さらに CNカラムで分画し、 それぞれの画分 を、 C18 カラムを使った LC/MS/MS (フイエガン社、 LCQ) で解析した （以 下、 MonoQカラム（タンパク質分画） -消ィ匕- SAXカラム- CN力ラム- LC/MS/MS と称する）。
11) 沈殿物について、 SDS に溶かし、 SDS-PAGE でタンパク質を分画後、 ゲル内でトリプシン消化を行い、 C18カラムを使った LC/MS/MS (フイエガン 社、 LCQ) で解析した （以下、 沈殿物- SDS-PAGE (タンパク質分画） -消化 -LC/MS/MSと称する）。
これらの結果、 それぞれ、 1 ) 消化- SCX力ラム- LC/MS/MSによりタンパク 質 108個、 2 ) 消化- CNカラム- LC/MS/MSによりタンパク質 94個、 3 ) 消 ィ匕- SAXカラム- LC/MS/MSによりタンパク質 212個、 4 )消化- SAXカラム- CN カラム- LC/MS/MSによりタンパク質 376個、 5 ) SDS-PAGE (タンパク質分 画） -消化- LC/MS/MSによりタンパク質 92個、 6 ) MonoQカラム （タンパク 質分画） -消化- SCX力ラム- LC/MS/MSによりタンパク質 140個、 7 ) MonoQ カラム（タンパク質分画） -消ィ匕- SAXカラム- LC/MS/MSによりタンパク質 301 個、 8 ) MonoQカラム （タンパク質分画） -消化- CNカラム- LC/MS/MSによ りタンパク質 199個、 9 ) MonoQカラム （タンパク質分画） - SDS'PAGE (タ ンパク質分画） -消化- LC/MS/MSによりタンパク質 233個、 1 0 ) MonoQ力 ラム （タンパク質分画） -消化- SAXカラム- CNカラム- LC/MS/MSによりタン パク質 450個、 1 1 ) 沈殿物- SDS-PAGE (タンパク質分画） -消化- LC/MS/MS によりタンパク質 152個を同定した。 このうち、 重複を除くと 888個のタンパ ク質を同定することが出来た （LC/MS/MSとしては合計 1150回、 同定された ペプチド （未修飾） は 10592個であった)
次に、 今回の実験では膨大な数のぺプチドが分析にかけられており、 解析に よって同定には至らなかったものの中にはリン酸化ぺプチドもあるであろうと 考えて、 自動検索ェンジン MASCOT (Matrix Science社製） およぴ NCBInr データベースを使用して、 リン酸化修飾を受けたタンパク質を検索した。
具体的には、 機器 NCBInr のタンパク質データを Compaq社の ProLiant ML530 (ハードディスク容量 425GB、 メモリ容量 3.767828GB、 CPU Intel™ ΧΕΟΝΤΜ 2.40 GHz,論理 CPUの数 4)の PCサ一バー (Windows 2000 Server) に保存した。 また、先の解析で得られた LC/MS/MSの全データもこの； PCサー バーに保管した。 そして、 当該 PCサーバーにインス トールされている自動検 索エンジン MASCOTを使って、 1150回の測定サンプルに含まれているリン酸 化タンパク質の検索をおこなった。 検索条件としては、 Variable Modification fこ Oxidation (M), hospho ST), Pnospho(Y)を旨疋'し、 missed cleavagesを 2 として、データベースには NCBInrを指定した。 Missed cleavagesを 2とした のは、 これまでの経験からリン酸化ペプチドは、 トリプシンによる消化効率が 悪くなることがわかっているためである。
その結果、 検索開始後、 何日たつても検索が終わらないため実用的でないと 考えて途中で打ち切った。
—般に、 翻訳後修飾べプチドについて自動検索エンジン MASCOTを使って 検索する際には、 まず翻訳後修飾を受けていないペプチドでタンパク質を同定 してから、 次に翻訳後修飾の有無について吟味するように推奨している (Journal of Biological Chemistry. 276： 8475-8483, 2001.)。
[参考例 2 ]
そこで、 次に検索する際のデータベースとして、 非常に情報件数が多いデー タベース （例えば、 NCBInrなど） を使用するのではなく、 先に同定した 888 個のタンパク質に関するデータからなるデータベースを使用した。 この先に同定した 888個のタンパク質に関するデータからなるデータベース の作成は、 NCBInrデータベースにアクセスするためのキー情報である gi番号 を取り出し、 検索に使用した NCBInrの FASTA形式のファイルを使い、 タン パク質の名称とアミノ酸配列の定義部分を取り出した。 これを先に同定した 888個のタンパク質全てについて実行し、 FASTA形式のデータベースを新規に 作成した。 このように作成したデータベース （以下、 「本実験のデータベース J と称する）を MASCOTに登録し、検索可能とした。検索条件としては、 Variable Modificationに Oxidation (M), Phospho(ST), Phospho(Y)を指定し、 missed cleavagesを 2として、 データベースには本実験のデータベースを指定した。 様々な翻訳後修飾を一度に検索するのではなくリン酸化タンパク質のみにつ いて検索した。 その結果、 信頼値 95%以上のスコアを出したのは 36個のぺプ チドとなった。これらについて MS/MSの質量分析スぺクトルを確認した結果、 リン酸化ペプチドの MS/MSであろうと考えられたものは 1個であった。 つま り、 検索条件を絞った （本実験のデータベースを使用した） にも関わらず、 そ の大半が偽陽性であった。
このように、 検索エンジン （例えば、 MASCOT など） を使って網羅的にリ ン酸化タンパク質を同定しようとすると間違ったものを同定してしまう危険性 が高い。今回の実験では 11種類の異なった組み合わせの分離方法で計 1150回 も測定を行っているので、 高い確率でリン酸化ペプチドが分離され検出できて いるであろうと予想した。 しかし、 実際には混合サンプルの中からリン酸化ぺ プチドを検出するのは極めて難しかった。 その理由として、 同じペプチド配列 であってもリン酸化されることによって検出感度が低下すること、 そして、 生 体内では同一のぺプチドであってもリン酸化されている分子は、 ぺプチドのー 部の分子でしかないこと、 これらの理由によつて他の種類のぺプチドが数多く 存在する混合サンプルではリン酸化ぺプチドは簡単には検出できないと考えら れる。
[参考例 3 ] 次に、 リン酸化べプチドの精製を試みた。
IMACカラムの 1種として PHOS-SELECT (シグマ社製)ゲル 0.1 mLをェッ ペンドルフのチューブに入れ、 0. 1 %酢酸と 30秒間混合した。 これを遠心し上 清を捨てた。 この洗浄操作を 3回繰り返した。続いて参考例 1で得られた PSD フラクションを Mono'Qカラム (アマシャム社製) で分画後、 各画分について トリプシンで消化したサンプルを、 酢酸を加えて pH 3とした。 次に、 得られ たサンプルを PHOS-SELECTに加えて室温で 3時間ゆつくり混合した。 その 後、 遠心し上清を捨て、 0.5 mLの 0. 1 %酢酸で 3回洗浄操作を行った。 そし て、 15%のァセトニトリルを含む 0.15Mアンモニア水 0.5 mLを加えて遠心し た。 次に、 上清を集めて溶媒を蒸発させた。 このように、 PSDフラクション中 のリン酸化ペプチドを分離した。 そして、 得られた残渣を 5% (V/V) ァセ トニトリノレと 0.1%TFAを含む溶媒 20 Z Lに溶かして、 LC/MS/MSによる測 定を行った。
次に、 得られた測定データを自動検索ェンジン MASCOTおよぴデータベー ス NCBInrを使用して、 リン酸化修飾を受けたタンパク質を検索した。
具体的には、 機器 NCBInr のタンパク質データを Compaq社の ProLiant ML530 (ハードディスク容量 425GB、 メモリ容量 3.767828GB、 CPU Inte M XEON™ 2.40 GHz,論理 CPUの数 4)の PCサーバー (Windows 2000 Server) に保存した。また、先の測定で得られた LC/MS/MSの全データもこの PCサー バーに保管した。 そして、 当該 PCサーバーにインストールされている自動検 索エンジン MASCOTを使って検索をおこなった。検索条件としては、 Variable Modificationに Phosplio(ST), Phosplio(Y)を旨定し、 missed cleavagesを 2と して、 Databaseには NCBInrを指定した。
その結果、 翻訳後修飾としてリン酸化のみを指定したにも関わらず、 1つの LC/MS/MSデータの検索に 2時間を要した。 そして、 43個のリン酸化ぺプチ ドが 95%以上の信頼値で同定され、その一つ一つの質量分析スぺクトルを確認 した結果、 23個のリン酸化ペプチドについては信頼性が高いと考えられた。 実施例 1
次に、 IMACカラムを使って PSDフラクション中のリン酸化べプチドを分 離し、 LCMS/MSによる測定を行った結果得られた測定データ （参考例 3 ) に ついて、 自動検索エンジン MASCOT (Matrix Science社製） および本実験の データベースを使用して、 リン酸化修飾を受けたタンパク質を検索した。
具体的には、 本実験のデータベース （参考例 2 ) を Compaq社の ProLiant ML530 (ハードディスク容量 425GB、 メモリ容量 3.767828GB、 CPU Intel™ ΧΕΟΝΤΜ 2.40 GHz,論理 CPUの数 4) の PCサーバー (Windows 2000 Server) に保存した。 また、 先の解析で得られた LC/MS/MS の全データ （参考例 3 ) もこの PCサーバーに保管した。 そして、 当該 PCサーバーにィンス トールさ れている自動検索エンジン MASCOTを使って検索をおこなった。 検索条件と しては、 Variable Modificationに Phospho(ST), Phospho(Y)を指定し、 missed cleavagesを 2として、 データベースには本実験のデータベースを指定した。 その結果、 一つの LC/MSデータの検索時間は、 僅か 3-5分程度であった。 そして、 155個のリン酸化ペプチドが 95%以上の信頼値で同定され、その一つ 一つの質量分析スぺク トルを確認した結果、 107個のリン酸化べプチドについ ては信頼性が高いと考えられた。
以上のように、 リン酸化タンパク質の検出対象サンプル中の複数のタンパク 質に関するデータからなるデータベースを作成し、 サンプルから分離したリン 酸化タンパク質を質量分析計により測定し、 測定の結果得られたデータを、 当 該データベースを使用して解析することにより、 サンプル中の複数のリン酸化 タンパク質を精度よく、 かつ、 短時間に検出できるようになった。 また、 従来 の方法では、 検出できなかったリン酸化タンパク質をも検出することができる ようになった。 実施例 2
( 1 ) サンプル液の調製
オボアルブミン （シグマ社、 Cat No. A2512) 1 mgを 8 M尿素を含む 0.5 M トリス緩衝液 （pH 8.6 at room tenip.) 1 mLに溶かした。 1 mgのディチォス レイ トール （ナカライテスク社 ·京都、 cat no. 14112-52) を加えて 37°Cで 1 時間還元処理を行った後、 2.5 mgのァクリルアミ ド （パイオラド社、 cat no. 161-010) を加え、 室温にて 1時間インキュベートすることによりアルキル化 処理を施した。 この後、 2.5 mgのデイチオスレィトールを加えて未反応のァク リルァミ ドを失活させ、 ピアス社の Slide-A-Lyzer MiniDialysis Unit(Cat No. 69572)を使い 5 Lの 50 mM炭酸水素アンモニア水に対して 1晚透析を行った, これを Savant社の SpeedVacにてサンプル液を乾燥させ、 8 M尿素を含む 50 mMの炭酸水素アンモニア水 1 mLに溶解させた。 これに 50 mMの炭酸水素 アンモニア水を加えて全量を 8 mLとした。 次に、 トリプシン 50 ; g (プロメ ガ社、 cat no. V5280) を加えて 37 °Cにてー晚消化を行い、 4°Cの冷蔵庫で保 存し、 これを本実施例においてサンプル液とした。
( 2 ) 酸の検討 （金属固定化担体）
最初に、 金属固定化担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する際に用いる 精製溶液について、 添加する酸の効果を検討した。 検討する酸として酢酸、 ギ 酸、 トリフルォロ酢酸、 塩酸の 4種類を選択し、 それぞれ 0.1% (V/V) の 各酸溶液を用意した。 次に、 サンプル液 20 /z Lを取り、 0.1% (V/V) の各 酸溶液で 20倍に希釈した。
一方、 1.6 mL容量のエツペンドルフチューブに、 金属固定化担体である PHOS-Selec Iron Affinity Gelを 50 z L取り （ Sigma- Aldrich社， Cat No.
P9740)、 あらかじめサンプルを希釈した酸と同じ 0.1% (V/V) の各酸溶液 で洗浄した。 そこに、 上記の希釈したサンプル液を加えて 30秒間激しく攪拌 した。 20000 g ( gは重力加速度を表す）で 1分間遠心した後、上清を捨てた。 続いて、 同じ 0.1% (V/V) の各酸溶液を 200 / L加えて 30秒間激しく攪拌 し、 20000 gで 1分間遠心した後、 上清を捨てた。 次に、 150 mMのアンモニ ァ水を加えて 30秒間激しく攪拌し、 20000 gで 1分間遠心した後、 上清を集 めて Savant社の SpeedVacにて乾燥させた。
次に、 乾燥させたサンプルに の 33% (V/V) ァセトニトリル 0.1% (v/v) トリフルォロ酢酸を加えてサンプルを再溶解し、 当該再溶解したサ レー卜に乗せ、 33% (V/V) ァセトニトリル 0.1% (V/V) トリフルォロ 酢酸で飽和したマトリクス液 (alpha-cyano-4-hydroxycinnaniic acid, ァノレド リツチ社 cat no. 47687-0) 0.5 Lを、 MALDIプレート上で先に乗せたサンプ ル液に液滴が広がらないように重ね合わせて自然乾燥させた。 これをアプライ ドバイオシステムズ社の質量分析装置 （MS) ABI4700の正イオン検出のリニ ァモードにて MALD TOF/MS測定を行つた。
その結果、 酸としてトリフルォロ酢酸または塩酸を使った場合、 酢酸または ギ酸を使った場合に比べ、 カラムへの非特異的な吸着が少ないことが明らかに なった。
( 3 ) ァセトニトリル濃度の検討 （金属固定化担体）
次に、 金属固定化担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する際に用いる精 製溶液について、 ァセトニトリルの濃度を検討した。 検討するァセトニトリル 濃度として、 0%から 90% (V/V) まで 5%単位で変えたものを用意した。 精製溶液に添加する酸としては 0.1% (V/V) のトリフルォロ酢酸を用いて 上記と同等の検討を行った。 .
具体的には、 サンプル液 20 Lを取り、 各濃度のァセトニトリル溶液で 20 倍に希釈した。一方、 1.6 mL容量のエツペンドルフチューブに金属固定化担体 である PHOS-Selec Iron Affinity Gelを 50 μ L取り（Sigma-Aldrich社， Cat No. P9740)、あらかじめサンプルを希釈した溶媒と同じ濃度のァセトニトリル溶媒 (0.1% (V/V , 以下同様） トリフルォロ酢酸を含む） で洗浄した。 そこに、 上記の希釈したサンプル液を加えて 30秒間激しく攪拌した。 20000 gで 1分 間遠心した後、 上清を捨てた。 続いて、 同じ濃度のァセトニトリル溶媒 （0.1% トリフルォロ酢酸を含む） を 200 加えて 30秒間激しく攪拌し、 20000 g で 1分間遠心した後、 上清を捨てた。 次に、 150 mMのアンモニア水を加えて 30秒間激しく攪拌し、 20000 gで 1分間遠心した後、 上清を集めて Savant 社の SpeedVacにて乾燥させた。 次に、 乾燥させたサンプルに 5 Lの 33%ァセトニトリル 0.1%トリフルォ 口酢酸を加えてサンプルを再溶解し、 当該再溶解したサンプル液 0.5 /z L を ァセ ト ニ ト リ ル 0.1 % ト リ フルォロ酢酸で飽和したマ ト リ タ ス液 ( ai ha- cy ano■ - h droxy cinnamic acid, ァ /レドリツチ社 cat no. 47687-0) 0.5 L- を、 MALDI プレート上で先に乗せたサンプル液に液滴が広がらないよう に重ね合わせて自然乾燥させた。 これをアプライドバイオシステムズ社の質量 分析装置（MS) ABI4700の正イオン検出のリニアモードにて MALDI-TOF/MS 測定を行った。
その結果、 ァセトニトリル濃度が 40%から 60%の場合において、 非特異的 な吸着が少ないことが明らかになった。
なお、 有機溶媒としてァセトニトリル以外にメタノール、 エタノール、 ァセ トンを用いて 20-80%濃度の範囲で 10%おきに検討したが、 これらの有機溶媒 種では、 いかなる濃度においても非特異的な吸着を減らす顕著な効果はなかつ た。
( 4 ) 酸濃度の検討 （金属固定化担体）
そこで、 金属固定化担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する際に用いる 精製溶液について、 ァセトニトリル濃度を 50%に固定して、添加する酸の濃度 を検討した。添加する酸としては上記と同様に酢酸、ギ酸、 トリフルォロ酢酸、 塩酸の 4種類について検討した。検討する酸の濃度は、 0%、0.01%, 0.03%, 0.1%, 0.3%, 1%, 3%, 10%とした。 これらの溶媒を用いて、 上記と同様の検討を行つ た。
具体的には、 サンプル液 20 Lを取り、各濃度の酸を含むァセトニトリル溶 液で 20倍に希釈した。 一方、 1.6 mL容量のエツペンドルフチューブに金属固 定化担体である PHOS-Selec Iron Affinity Gelを 50 μ L取り （Sigma'Aldrich 社， Cat No. P9740)、 あらかじめサンプルを希釈した溶媒と同じ各濃度の酸を 含むァセトニトリル溶液で洗浄した。 そこに、 上記の希釈したサンプル液を加 えて 30秒間激しく攪拌した。 20000 gで 1分間遠心した後、 上清を捨てた。 続いて、同じ各濃度の酸を含むァセトニトリル溶液を 200 L加えて 30秒間激 しく攪拌し、 20000 gで 1分間遠心した後、 上清を捨てた。 次に、 150 mMの アンモニア水を加えて 30秒間激しく攪拌し、 20000 gで 1分間遠心した後、 上清を集めて Savant社の SpeedVacにて乾燥させた。
次に、 乾燥させたサンプルに の 33%ァセトニトリノレ 0.1%トリフルォ 口酢酸を加えてサンプルを再溶解し、 当該再溶解したサンプル液 0.5 L を ァセ トニ ト リル 0.1 % ト リ フルォロ酢酸で飽和したマ ト リ タス液 ( alp a - cy ano - 4- hy dr oxy cmnamic acid, ァノレドリツチ土 cat no. 47687-0) 0.5 /z Lを、 MALDIプレート上で先に乗せたサンプル液に液滴が広がらないよう に重ね合わせて自然乾燥させた。 これをアプライドバイオシステムズ社の質量 分析装置（MS) ABI4700の正イオン検出のリニアモードにて MALDI-TOF/MS 測定を行った。
その結果、 トリフルォロ酢酸の濃度が 0.1%以上 1%以下の場合において、 お ょぴ塩酸の濃度が 0.03%以上 0.3%以下の場合において、非特異的な吸着の減少 が認められた。 一方、 酢酸およぴギ酸を用いた場合には、 非特異的な吸着の減 少は認められなかった。
以上の結果から、 金属固定化担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する方 法において、 ァセトニトリルを 4 0 % (V/V) 以上 6 0 % (V/V) 以下含 有する溶液を使用することにより、 リン酸化タンパク質を効率的に精製するこ とが明らかになった。
さらに、 酸として、 トリフルォロ酢酸 0 . 1 %以上1 . 0 %以下または塩酸 0 . 0 3 %以上0 . 3 %以下を添カ卩することが好ましいことが明らかになった。 ( 5 ) チタニア担体での検討
また、 チタニア担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する際に用いる精製 溶液について、 金属固定化担体の場合と同様の検討を行った。
その結果、 チタニア担体においても、 ァセトニトリルを 4 0 % (V/V) 以 上 6 0 % (V/V) 以下含有する溶液を使用することにより、 リン酸化タンパ ク質を効率的に精製することが明らかになった。
さらに、 酸として、 トリフルォロ酢酸 0 . 1 %以上 1 . 0 %以下または塩酸
0 . 0 3 %以上0 . 3 %以下を添加することが好ましいことが明らかになった。
( 6 ) 塩化ナトリウム、 界面活性剤の影響
そこで、負荷量が大きいチタ-ァを使い、 トリフルォロ酢酸 0.3%を含む 50% ァセトニトリル溶液を用いて上記と同様の検討を行った。
具体的には、 サンプル液 20 μ Lを取り、 トリフルォロ酢酸 0.3%を含む 50% ァセトニトリル溶液で 20倍に希釈した。 一方、 1.6 mL容量のエツペンドルフ チューブにチタニア担体 （GLサイエンス社製） を 50 ii L取り、 あらかじめサ ンプルを希釈した溶媒と同じトリフルォロ酢酸 0.3%を含む 50°/。ァセトニトリ ル溶液で洗浄した。 そこに、 上記の希釈したサンプル液を加えて 30秒間激し く攪拌した。 20000 g、 1分間遠心した後、 上清を捨てた。 続いて、 同じトリ フルォロ酢酸 0.3%を含む 50%ァセトニトリル溶液を 200 L加えて 30秒間激 しく攪拌し、 20000 gで 1分間遠心した後、 上清を捨てた。 次に、 150 mMの アンモニア水を加えて 30秒間激しく攪拌し、 20000 gで 1分間遠心した後、 上清を集めて Savant社の SpeedVacにて乾燥させた。
次に、 乾燥させたサンプルに 5 / Lの 33%ァセトニトリル 0.1%トリフルォ 口酢酸を加えてサンプルを再溶解し、 当該再溶解したサンプル液 0.5 Ai L を
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI)プレートに乗せ、 33% ァセ トニ ト リ ル 0.1 % ト リ フルォロ酢酸で飽和したマ ト リ クス液
( alpha■ cy ano■ 4■ hy dr oxy cinnamic aci , ァノレトリ ツチ子土 cat no. 47687-0) 0.5
M Lを、 MALDIプレート上で先に乗せたサンプル液に液滴が広がらないよう に重ね合わせて自然乾燥させた。 これをアプライドバイオシステムズ社の質量 分析装置（MS) ABI4700の正イオン検出のリニアモードにて MALDI-TOF/MS 測定を行った。
ただし、 サンプル液にはあらかじめ 5M塩化ナトリゥム水溶液を添加して、 最終濃度をそれぞれ 0， 0.05 M, 0.1 M, 0.2 M, 0.5 M, 0.75 M, 1 Mとしておいた。 しかし、 塩化ナトリウムは、 リン酸化タンパク質の精製、 非特異的な吸着に 何ら影響を及ぼさなかった。
さらに、 リン酸化タンパク質を精製する際に用いる精製溶液において、 界面 活性剤 の 影 響 を 検討す る た め 、 Triton X100, Nonidet p40, 5-cyciohexyl-pentyl-beta-D-maltoside, beta-octyl glucoside, CHAPS サンプ ル液に 0.1%になるように添加し、 影響を調べた。
その結果、 riton X100, Nonidet p 40、 CHAPSの 3種類については、 マス スペク トルに対して悪影響を認めた （途中の過程で除去できなかった） 力 5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltoside beta-octyl glucoside こつレヽて fまこのよ うな問題を生じなかった。
こ れ ら の 結 果 力 ら 、 サ ン プ ル 液 中 に 0.1% 程 度 の
5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltoside beta-octyl glucoside 1Mよでの塩 化ナトリゥムが混在していても本発明における方法において特に影響がないこ とが明らかになった。
( 7 ) 溶出条件の検討
また、 金属固定化担体またはチタニア担体に吸着させたリン酸化タンパク質 を溶出させる条件として、 150 mMのアンモニア水、 リン酸、 リン酸ーナトリ ゥム、 リン酸ニナトリウムを使って比較したが、 いずれの場合においても結果 に大差はなく、 溶出させる条件は特に限定されないことが明らかになった。
( 8 ) 従来法との比較
次に、 比較実験としてシグマ社推奨のプロトコールに基づき、 まず、 サンプ ル液を 0.1 Mの酢酸水で 20倍に希釈した。 次に、 1.6 mL容量のエツペンドル フチューブに金属固定化担体である PHOS-Selec Iron Affinity Gelを 50 i L取 り、 あらかじめ 0.1 Mの酢酸水で洗浄した。 そこに、 上記の 0.1 Mの酢酸水で 希釈したサンプル液を加えて 30秒間激しく攪拌した。 次に、 20000 gで 1分 間遠心した後、 上清を捨てた。 続いて、 0.1 Mの酢酸水を 200 L加えて 30秒 間激しく攪拌し、 20000 gで 1分間遠心後、 上清を捨てた。 次に、 150 mMの アンモニア水を加えて 30秒間激しく攪拌し、 20000 gで 1分間遠心後、 上清 を集めて Savant社の SpeedVacにて乾燥させた。 次に、 乾燥させたサンプルに の 33%ァセトニトリノレ 0.1%トリフルォ 口酢酸を加えてサンプルを再溶解し、 当該再溶解したサンプル液 0.5 L を ァセ トニ ト リル 0.1 % ト リ フルォロ酢酸で飽和したマ ト リ タ ス液 i,alpha-cyano-4"hydroxycinnamic aci , ァノレドリ ッテ社 cat no. 47687-0) 0.5 Lを、 MALDIプレート上で先に乗せたサンプル液に液滴が広がらないよう に重ね合わせて自然乾燥させた。 これをアプライドバイオシステムズ社の質量 分析装置（MS) ABI4700の正イオン検出のリニアモードにて MALDI-TOF/MS 測定を行った。
その結果、 従来の 0.1 Mの酢酸水を用いた方法では、 オボアルブミンの 2ケ 所のリン酸化タンパク質 （EWGSAEAGVDAASVSEEFR 2089 (配列番号 1 ) および LPGFGDSIEAQCGTSVNVH 2082 (配列番号 2 )、 ただし後者につい て は ト リ プ シ ン の 非 特 異 的 切 断 が 起 き 、 本 来 は LPGFGDSIEAQCGTSVNVHSSLR (配列番号 3 ) である） 以外の多くのタン パク質が検出され、 リン酸化タンパク質を選択的に精製することはできなかつ た （図 3 )。 一方、 本発明のトリフルォロ酢酸 0.3%を含む 50%ァセトニトリル 溶液を用いた方法では、 オボアルブミンの 2 ケ所のリン酸化タンパク質 ( EWGSAEAGVDAASVSEEFR 2089 ( 配 列 番 号 1 ) お よ び LPGFGDSIEAQCGTSVNVH 2082 (配列番号 2 )、 ただし後者についてはトリ プシンの非特異的切断が起き、本来は LPGFGDSIEAQCGTSVNVHSSLR (配 列番号 3 ) である） を選択的に精製することが可能になった （図 4 )。 産業上の利用の可能性
本発明により、 サンプル （例えば、 組織、 生体液、 細胞、 細胞器官またはタ ンパク質複合体等） 中の複数種のリン酸化タンパク質を精度よく検出すること ができ、 かつ、 検索時間も短縮することが可能になった。
すなわち、 従来の自動検索エンジン （例えば、 MASCOT等） およびタンパ ク質データベース （例えば、 NCBInr、 IPI、 Sport等） を使用する方法では、 偽陽性および偽陰性が非常に多く、 また、 検索時間に膨大な時間を要していた 力 リン酸化タンパク質の検出対象サンプル中の複数種のタンパク質に関する データからなるデータベースを作成し、 サンプルから分離したリン酸化タンパ ク質を質量分析計により測定し、 測定の結果得られたデータを、 当該データべ ースを使用して解析することにより、 サンプル中の複数種のリン酸化タンパク 質を精度よく、 かつ、 短時間に検出できるようになった。 また、 従来の方法で は、 検出できなかったリン酸化タンパク質をも検出することができるようにな つた。
また、 本発明により、 金属固定化担体またはチタニア担体によるリン酸化タ ンパク質の精製において、 ァセトニトリルを 4 0 % (V/V) 以上 6 0 % (V /V) 以下含有し、 さらに好ましくはトリフルォロ酢酸 （例えば、 0 . 1 %以上 (V/V) 以上 1 . 0 %以下 （VZV) ) または塩酸 （例えば、 0 . 0 3 % (V/ V) 以上 0 . 3 %以下 (V/V) ) を含有する溶液を使用することにより、 非特 異的吸着が劇的に減少し、 サンプル （例えば、 組織、 生体液、 細胞、 細胞器官 またはタンパク質複合体等） 中の 1または複数種のリン酸化タンパク質を効率 的に精製することが可能となった。
すなわち、 従来の方法では、 カルボン酸も IMACカラムに対して親和性を持 つため、酸性アミノ酸を有するタンパク質もまた多かれ少なかれ IMACカラム に結合し、 IMACカラムを用いてリン酸化タンパク質のみを精製するのは容易 ではなかった。 また、疎水性ペプチドも IMACに対して非特異的な作用を有す るため除去できないことが多かったが、 本発明の方法により、 カルボン酸や疎 水性による IMACカラムに対する吸着を抑制することができ、 サンプル （例え ば、 組織、 生体液、 細胞、 細胞器官またはタンパク質複合体等） 中の 1または 複数種のリン酸化タンパク質を効率的に精製することが可能となった。
さらには、 タンパク質のカルボン酸のメチルエステル化を行うことで IMAC カラムに対する酸性アミノ酸の吸着を抑える精製方法における課題点、 すなわ ち、 エステル化反応が定量的に進行しなかったり、 副反応が起きたり、 選択性 が期待通りょくならなかったり、 エステル化した後にぺプチドが不溶化したり するため、 特異的に精製できないことも多いという課題点についても解決し、 サンプル (例えば、 組織、 生体液、 細胞、 細胞器官またはタンパク質複合体等) 中の 1または複数種のリン酸化タンパク質を効率的に精製することが可能とな つた。 配列表フリーテキスト
配列番号 1 ： リン酸化タンパク質
配列番号 2 ： リン酸化タンパク質
配列番号 3 ： リン酸化タンパク質

Claims

請求 の 範 囲
1 . サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースを 使用することを特徴とする、 当該サンプル中の複数種のリン酸化タンパク 質を検出する方法。
2 . サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースを 使用することを特徴とする、 当該サンプル中の複数種のリン酸化タンパク 質を検出する方法であって、
(a) サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を分離する工程と、
(b) 当該分離されたリン酸化タンパク質の質量を分析する工程と、
(c) 工程 (b)で得られたデータを、上記データベースから検索してリン酸化タ ンパク質を検出する工程と、
を含む、 前記方法。
3 .サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースが、 (a) サンプル中の複数種のタンパク質の質量を分析する工程と、
(b) 得られた分析結果よりタンパク質を同定する工程と、
(c) 当該同定されたタンパク質に関するデータからなるデータベースを作 成する工程と、
を含む工程から作成されるものである、 請求項 1または 2に記載の方法。
4 . サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースが. サンプル中の複数種のタンパク質の質量分析により同定されたタンパク質 に関するものである、 請求項 1または 2に記載の方法。
5 . サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースを 使用することを特徴とする、 当該サンプル中の複数種のリン酸化タンパク 質を検出する方法であって、
(a) サンプル中の複数種のタンパク質の質量を分析する工程と、
(b) 得られた分析結果よりタンパク質を同定する工程と、
(c) 当該同定されたタンパク質に関するデータからなるデータベースを作 成する工程と、
(d) サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を分離する工程と、
(e) 当該分離されたリン酸化タンパク質の質量を分析する工程と、
(f) 工程 (e)で得られたデータを、工程 (c)で得られたデータベースから検索し てリン酸化タンパク質を検出する工程と、
を含む、 前記方法。
6. サンプルが、 組織、 生体液、 細胞、 細胞器官またはタンパク質複合体であ る、 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の方法。
7. サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を分離する工程が、 金属固定化 担体またはチタ-ァ担体と、ァセトニトリルを 40% (V/V)以上 6 0%
(V/V) 以下含有する溶液とを使用することを特徴とするものである、 請求項 2〜 6のいずれか 1項に記載の方法。
8. 金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質を精製す る方法であって、 ァセトニトリルを 40% (V/V) 以上 6 0 % (V/V) 以下含有する溶液を使用することを特徴とする、 前記方法。
9. 金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質を精製す る方法であって、
ァセトニトリルを 40% (V/V) 以上 6 0 % (V/V) 以下含有する溶 液を、 金属固定化担体若しくはチタニア担体の平衡化溶媒、 サンプルを溶 解する溶媒およぴ /または金属固定化担体若しくはチタニア担体における 展開溶媒として使用することを特徴とする、 前記方法。
1 0. 金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質を精製 する方法であって、
ァセトニトリルを 40% (V/V) 以上 6 0% (V/V) 以下含有する溶 液で金属固定化担体またはチタニア担体を平衡化する工程と、
サンプルを、 ァセトニトリルを 40% (V/V) 以上 6 0% (V/V) 以 下含有する溶液に溶解する工程と、
当該溶解したサンプルと、 前記平衡化された担体とを接触させる工程と、 リン酸化タンパク質を溶出させる工程と、
を含む、 前記方法。
11. ァセトニトリルを 40% (V/V) 以上 60% (V/V) 以下含有する 溶液が、 さらに酸を含有する溶液である、 請求項 8〜10のいずれか 1項 に記載の方法。
12. 酸が強酸である、 請求項 11に記載の方法。
13.強酸が、 トリフルォロ酢酸または塩酸である、請求項 12に記載の方法。
14. トリフルォロ酢酸の濃度が、 0. 1% (V/V) 以上 1. 0% (V/V) 以下である、 請求項 13に記載の方法。
15. 塩酸の濃度が、 0. 03°/。 (V/V) 以上 0. 3% (V/V) 以下であ る、 請求項 13に記載の方法。
16. 金属固定化担体に固定される金属イオンが、 鉄イオン （III) またはガリ ゥムイオン （III) である、 請求項 8〜15のいずれか 1項に記載の方法。
17. Dihydroxy Benzoic Acidを含まないことを特 ί敷とする、 請求項 8〜： 16 のいずれか 1項に記載の方法。
18. ァセトニトリルを 40% (V/V) 以上含有する溶液を含む、 リン酸化 タンパク質精製キット。
19. 請求項 8〜1 7のいずれか 1項に記載の方法に使用するための、 請求項 17に記載のキット。
20. ァセトニトリルを 40% (V/V) 以上含有する溶液を含む、 リン酸化 タンパク質精製溶液。
21. 請求項 8〜 1 7のいずれか 1項に記載の方法に使用するための、 請求項 20に記載の溶液。
PCT/JP2005/012714 2004-07-02 2005-07-04 リン酸化タンパク質のプロテオーム解析方法 WO2006004214A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/630,927 US8131479B2 (en) 2004-07-02 2005-07-04 Method of proteome analysis for phosphorylated protein
JP2006529017A JPWO2006004214A1 (ja) 2004-07-02 2005-07-04 リン酸化タンパク質のプロテオーム解析方法
EP05758169A EP1780537B1 (en) 2004-07-02 2005-07-04 Method of proteome analysis for phosphorylated protein
AT05758169T ATE525462T1 (de) 2004-07-02 2005-07-04 Proteomanalyseverfahren für phosphoryliertes protein

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-197344 2004-07-02
JP2004197344 2004-07-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006004214A1 true WO2006004214A1 (ja) 2006-01-12

Family

ID=35783007

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/012714 WO2006004214A1 (ja) 2004-07-02 2005-07-04 リン酸化タンパク質のプロテオーム解析方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8131479B2 (ja)
EP (2) EP2113562B1 (ja)
JP (3) JPWO2006004214A1 (ja)
AT (2) ATE525462T1 (ja)
WO (1) WO2006004214A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010038664A (ja) * 2008-08-04 2010-02-18 Shimadzu Corp 質量分析データ解析装置
JP2013047624A (ja) * 2011-08-29 2013-03-07 Shimadzu Corp 質量分析を用いた修飾タンパク質同定方法及び同定装置
JP2013545446A (ja) * 2010-10-20 2013-12-26 クイーン マリー アンド ウエストフィールド カレッジ、ユニバーシティ オブ ロンドン トランスフェラーゼの活性同定方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100855620B1 (ko) 2005-12-13 2008-09-03 주식회사 프로바이온 메조다공성 이산화티탄을 이용한 분리 또는 농축방법
WO2008148645A1 (en) * 2007-06-07 2008-12-11 Syddansk Universitet Separation of mono- from multi-phoshorylated peptides
EP2240271A4 (en) * 2008-02-15 2016-08-10 Ge Healthcare Bio Sciences Ab SEPARATION OF BIOMOLECULES
GB0906698D0 (en) * 2009-04-17 2009-06-03 Queen Mary & Westfield College Method for quantifying modified peptides
EP2588428A4 (en) * 2010-06-30 2014-03-05 Univ Saskatchewan KINOME ANALYSIS METHODS
US9659146B2 (en) 2011-05-02 2017-05-23 Tyler Stuart Bray Method for quantitative analysis of complex proteomic data
GB201204278D0 (en) 2012-03-09 2012-04-25 Queen Mary & Westfield College Method
CN108287200B (zh) * 2017-04-24 2020-12-18 麦特绘谱生物科技（上海）有限公司 质谱参照数据库的建立方法及基于其的物质分析方法
JP6928816B2 (ja) * 2017-12-14 2021-09-01 株式会社Ｌｓｉメディエンス 質量分析計を用いたタンパク質分析のためのタンパク質含有試料の前処理方法
CN108872442B (zh) * 2018-08-17 2021-04-27 无限极（中国）有限公司 一种基于谱效关系的骨胶原肽质量检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003065031A1 (fr) * 2002-01-31 2003-08-07 Gl Sciences Incorporated Procede et dispositif pour analyser de l'acide amine, un peptide, une proteine, une saccharide ou un lipide

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5674987A (en) 1994-07-22 1997-10-07 Anatrace, Inc. Extraction of proteins from naturally occurring membranes
ATE359521T1 (de) 2000-02-07 2007-05-15 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur identifizierung und/oder charakterisierung eines (poly)peptides
US20030031350A1 (en) 2001-03-09 2003-02-13 Pe Corporation (Ny) Methods for large scale protein matching
US7063966B2 (en) 2001-07-11 2006-06-20 Sri International Chimeric G protein coupled receptors
US7026167B2 (en) * 2001-12-28 2006-04-11 University Of Virginia Patent Foundation Systems and methods for the analysis of protein phosphorylation

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003065031A1 (fr) * 2002-01-31 2003-08-07 Gl Sciences Incorporated Procede et dispositif pour analyser de l'acide amine, un peptide, une proteine, une saccharide ou un lipide

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIRANO H. ET AL: "Tanpakushitsu no Hon'yakugo Shushoku no Kaiseki", EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 20, no. 14, 25 September 2002 (2002-09-25), pages 45 - 50, XP002996674 *
ODA Y.: "Phospation Proteome Kaiseki no Saishin Gijutsu", EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 20, no. 1, 1 January 2002 (2002-01-01), pages 23 - 27, XP002996672 *
ODA Y.: "Tanpakushitsu no Hon'yakugo Shushoku no Kaiseki", GENDAI KAGAKU, ZOKAN 42 PROTEOMICS-HOHO TO SONO BYOTAI KAISEKI ENO OYO-, 10 October 2002 (2002-10-10), pages 24 - 30, XP002996673 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010038664A (ja) * 2008-08-04 2010-02-18 Shimadzu Corp 質量分析データ解析装置
JP2013545446A (ja) * 2010-10-20 2013-12-26 クイーン マリー アンド ウエストフィールド カレッジ、ユニバーシティ オブ ロンドン トランスフェラーゼの活性同定方法
JP2013047624A (ja) * 2011-08-29 2013-03-07 Shimadzu Corp 質量分析を用いた修飾タンパク質同定方法及び同定装置

Also Published As

Publication number Publication date
ATE545460T1 (de) 2012-03-15
JPWO2006004214A1 (ja) 2008-04-24
US8131479B2 (en) 2012-03-06
EP2113562A1 (en) 2009-11-04
JP2010133971A (ja) 2010-06-17
JP2011090012A (ja) 2011-05-06
EP1780537B1 (en) 2011-09-21
US20080221802A1 (en) 2008-09-11
EP2113562B1 (en) 2012-02-15
ATE525462T1 (de) 2011-10-15
EP1780537A1 (en) 2007-05-02
EP1780537A4 (en) 2009-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2006004214A1 (ja) リン酸化タンパク質のプロテオーム解析方法
Tholey et al. Top-down proteomics for the analysis of proteolytic events-Methods, applications and perspectives
Jensen Interpreting the protein language using proteomics
Tan et al. Trifunctional cross-linker for mapping protein-protein interaction networks and comparing protein conformational states
McLachlin et al. Analysis of phosphorylated proteins and peptides by mass spectrometry
JP4714584B2 (ja) 同位体標識化内部標準物質を用いる定量方法、該定量方法を実行する解析システムおよび該解析のためのプログラム
Garcia What does the future hold for top down mass spectrometry?
Grimsrud et al. Phosphoproteomics for the masses
Gafken et al. Methodologies for characterizing phosphoproteins by mass spectrometry
Tichy et al. Phosphoproteomics: Searching for a needle in a haystack
Pasing et al. N-glycoproteomics: mass spectrometry-based glycosylation site annotation
Magni et al. Biomarkers discovery by peptide and protein profiling in biological fluids based on functionalized magnetic beads purification and mass spectrometry
JP2004500567A (ja) タンパク質分離および提示
Wardman et al. Quantitative peptidomics of mice lacking peptide-processing enzymes
Righetti et al. Combinatorial peptide ligand libraries as a “Trojan Horse” in deep discovery proteomics
Liu et al. Positive enrichment of C-terminal peptides using oxazolone chemistry and biotinylation
Rosenqvist et al. Analytical strategies in mass spectrometry-based phosphoproteomics
Mayne et al. Fine tuning of proteomic technologies to improve biological findings: advancements in 2011–2013
Kjellström et al. In situ liquid− liquid extraction as a sample preparation method for matrix-assisted laser desorption/ionization ms analysis of polypeptide mixtures
Zhou et al. Proteomics approaches to biomarker detection
Zhu et al. Single chain variable fragment displaying M13 phage library functionalized magnetic microsphere-based protein equalizer for human serum protein analysis
Leitner et al. Chemical tagging strategies for mass spectrometry-based phospho-proteomics
Cunningham et al. Investigation and reduction of sub‐microgram peptide loss using molecular weight cut‐off fractionation prior to mass spectrometric analysis
Liang et al. Quantitation of protein post-translational modifications using isobaric tandem mass tags
Tang et al. Formaldehyde derivatization: An unexpected side reaction during filter-aided sample preparation

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006529017

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11630927

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005758169

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005758169

Country of ref document: EP