WO2006003222A1 - Uso del formoterol en el tratamiento profiláctico y/o terapéutico del desgaste muscular y/o síndrome caquéctico, asociados a estados catabólicos de ciertas enfermedades como cáncer, sida, infecciones, diabetes y otras - Google Patents

Uso del formoterol en el tratamiento profiláctico y/o terapéutico del desgaste muscular y/o síndrome caquéctico, asociados a estados catabólicos de ciertas enfermedades como cáncer, sida, infecciones, diabetes y otras Download PDF

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Definitions

  • This invention is related to the field of human medicine, and specifically with a new use of a compound for the treatment of certain diseases or human states.
  • cachexia occurs in the majority of cancerous patients, and is responsible for the death of 22% of cancer patients.
  • cachexia is associated with other diseases or conditions such as acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), trauma or sepsis.
  • AIDS acquired immunodeficiency syndrome
  • trauma trauma or sepsis.
  • abnormalities associated with cachexia include anorexia, weight loss, loss and muscle atrophy, anemia and alterations in the metabolism of carbohydrates, lipids and proteins (cf. Argües JM et al., "The metabolic basis of cancer cachexia", Med Res. Rev. 1997, vol. 17, pp. 477-98).
  • the degree of cachexia is inversely correlated with survival time
  • Asthenia that is, lack of muscular strength
  • Asthenia is also characterized by general weakness as well as physical and mental fatigue.
  • 25 of the lean body mass is one of the main trends of cachexia and involves not only skeletal muscle but also affects cardiac proteins, leading to important alterations in the functions of the heart.
  • 35 medroxyprogesterone which are capable of improving appetite and weight gain, although the increase observed in body mass is mainly due to an increase in fat mass and water retention, without significant effects on the Karnofsky index (a measure of the level of activity for cancer patients).
  • Cannabinoid dronabinol is able to improve cachexia in both cancer and AIDS patients, although many of them experience side effects such as euphoria, dizziness, drowsiness and confusion.
  • Insulin has been used as an appetite stimulator (in order to improve anorexia), but it has been shown to be associated with an increase in tumor weight.
  • Corticosteroids eg dexamethasone or prednisolone
  • Corticosteroids when used in prolonged treatments, appear to cause weakness, delirium, osteoporosis and immunosuppression, and do not appear to have any significant effect on the reduction of mortality.
  • Clenbuterol is another compound that has shown some anti-cachectic effects, although its toxicity in humans and animals (especially its negative effects on the heart) has not allowed clinical trials to be performed (cf. Carbó N. et al., "Comparative effects of beta2-adrenergic agonists on muscle waste associated with tumor growth ", Cancer Lett. 1997, vol. 115, pp. 113-8; Hoffman, RJ.
  • Hydrazine sulfate has been used as an anti-cachectic drug, but it has some problems derived from its toxicity (cf. Argües JM et al., "Cachexia cancer: a therapeutic approach", Med. Res. Rev. 2001, vol. 21, pp 83-101).
  • formoterol used so far for the treatment of bronchospasm associated with asthma, exhibits a potent anti-cachectic efficiency with relatively low adverse side effects and low toxicity.
  • Formoterol is a racemic compound that has the chemical formula attached (the relative stereochemistry of one of the two enantiomers is shown) and is a potent selective ⁇ 2 -adrenergic agonist that combines the clinical advantages of a rapid onset of the action and a long duration of the action. This compound is used in humans for the treatment of bronchospasm associated with asthma. In vitro, formoterol is a potent relaxant of smooth muscle by air with high efficacy and very high affinity and selectivity for the ⁇ 2 -adrenergic receptor.
  • formoterol In addition to the relaxation of smooth muscle by air, formoterol inhibits a variety of acute inflammatory processes in animal models, including activation of eosinophils and infiltration of the airways, microvascular spills, and antigen-induced release of mediators from The lung in humans. Likewise, formoterol relaxes bronchial smooth muscle and also provides important clinical benefits in symptomatic patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Formoterol, like other long-acting ⁇ 2 -adrenoceptor agonists, attenuates the allergen-induced asthmatic reaction and, under certain conditions, has more effect than other ⁇ 2 -adrenergic receptors such as salbutamol and salmeterol (cf. Linden A.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • the present invention relates to the use of formoterol or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable solvate of any of them, for the preparation of a medicament for the prophylactic and / or therapeutic treatment of muscle wasting and / or a syndrome.
  • cachectic both associated with a catabolic state in a mammal, in particular a human.
  • the term "catabolic state” as used herein refers to a pathophysiological situation in which the catabolic pathways are activated. Examples of catabolic pathways are hepatic glycogenolysis, adipose tissue lipolysis, skeletal muscle proteolysis and thermogenesis.
  • the invention relates to a method of treating a patient suffering from muscle wasting and / or a cachectic syndrome, both associated with a catabolic state in a mammal, in particular a human, which comprises the administration of a therapeutically dose.
  • formoterol fumarate, as such or as dihydrate, is used for these indications.
  • Formoterol exerts a selective, potent and protective action on the heart and skeletal muscle by antagonism of the increased protein degradation that characterizes cancer cachexia.
  • formoterol is a convenient therapeutic agent in pathological states wherein the catabolic muscle protein is critical, such as of cachexia in cancer or other diseases associated with muscle wasting.
  • formoterol or its pharmaceutically acceptable salts and / or solvates can be used for the treatment of muscle wasting or the cachectic syndrome associated with cancer, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), sepsis, diabetes, states of immobilization, severe burns, chronic obstructive pulmonary disease, old age, cardiovascular pathologies, liver pathologies, rheumatoid arthritis, nutritional disorders, acidosis, neuromuscular diseases, Alzheimer's disease, hyperadrenocortisolism, hyperthyroidism, Cushing's syndrome, atrophies and muscular dystrophies, ulcerative colitis, chronic fatigue syndrome, renal failure, liver cirrhosis, Crohn's disease and a state of muscle wasting due to weightlessness.
  • AIDS acquired immunodeficiency syndrome
  • sepsis AIDS
  • diabetes states of immobilization
  • severe burns chronic obstructive pulmonary disease
  • old age cardiovascular pathologies
  • liver pathologies liver pathologies
  • Formoterol treatment has a clear protective effect on skeletal muscle and heart, in terms of wet tissue weight. Then, formoterol provides significant trophic action also in muscles of non-cancer-bearing individuals, particularly in the gastrocnemius, tibialis, extensor digitorium longus (EDL) and cardiac muscle, while the soleus muscle is not significantly affected. Regarding adipose tissues, treatment with formoterol induces an increase in the weight of brown adipose tissue. In addition, treatment with formoterol does not alter the weight of the solid tumor or the food intake.
  • formoterol or its pharmaceutically acceptable salts and / or solvates such as oral, nasal, parenteral, subcutaneous, topical, etc.
  • suitable release system for the selected route of administration.
  • FIG. 1 shows the Northern blot of gastrocnemius muscles of control rats (C), rats treated with formoterol (C + F), tumor-bearing rats (ascitic hepatoma Yoshida AH-130) (TB) and tumor-bearing rats treated with formoterol (TB) + F).
  • C control rats
  • C + F tumor-bearing rats
  • TB tumor-bearing rats
  • TB tumor-bearing rats treated with formoterol
  • TB tumor-bearing rats treated with formoterol
  • FIG. 2 shows the apoptosis in tibialis muscles of control rats (C), rats treated with formoterol (C + F), tumor-bearing rats (ascitic hepatoma Yoshida AH-130) (TB) and tumor-bearing rats treated with formoterol (TB + F).
  • C control rats
  • C + F rats treated with formoterol
  • TB tumor-bearing rats
  • TB + F tumor-bearing rats treated with formoterol
  • FIG. 2C Caspase-3 activity was determined by a colorimetric assay, and the results are expressed in nmoles / hour. Statistical significance of the results (by the Student's t test); FIG. 2A: untreated versus F: ttP ⁇ 0.01; FIG. 2C: C versus TB: * p ⁇ 0.05, untreated versus F: tttp ⁇ 0.001.
  • FIG. 3 shows the Northern blot of gastrocnemius muscles of control mice (C), mice treated with formoterol (C + F), tumor-bearing mice (Lewis lung carcinoma) (TB) and tumor-bearing mice treated with formoterol (TB + F ).
  • C control mice
  • C + F mice treated with formoterol
  • TB Tumor-bearing mice
  • TB + F tumor-bearing mice treated with formoterol
  • mice Male Wistar rats (Interfauna, Barcelona, Spain) weighing about 110 g, and C57BI / 6 mice (Criffa, Barcelona, Spain), about 12 weeks old, were used. The animals were kept at 22 ⁇ 2 0 C with a regular light-dark cycle (light on between 08:00 am and 08:00 pm) and had free access to food and water.
  • the diet (BK Universal GJ / SL, Sant Viceng deis Horts, Barcelona, Spain) consisted of 45.5-48.5% carbohydrates (3.5% absorbable glucose, 42-45% starch), 18 , 5% protein and 3.1% fat (the residue was non-digestible material). The food intake was measured daily.
  • Yoshida AH-130 ascites hepatoma This is a rat tumor that grows exponentially for 4-5 days and enters stationary phase on day 7 after transplantation.
  • the rats were divided into two groups, controls and tumor hosts. The latter received an intraperitoneal inoculum of 10 8 Yoshida AH-130 ascites hepatoma cells obtained from exponential tumors.
  • Both groups were subsequently divided into treated and untreated, the former being administered with a daily intraperitoneal (ip) dose of formoterol (2 mg / kg body weight (bw), dissolved in physiological solution) and the latter with the corresponding volume of solvent
  • ip intraperitoneal
  • the animals were weighed and anesthetized with an ip injection of a ketamine / xylazine mixture (3: 1) (Imalgene® and Rompun® respectively).
  • the tumor was extracted from the peritoneal cavity and its volume and cellularity were evaluated.
  • the blood was collected from the abdominal aorta in heparinized and centrifuged tubes (3500 g, 10 min, 4 0 C) to obtain plasma.
  • the tissues were quickly extracted, weighed and frozen in liquid nitrogen.
  • the experimental groups were the following: control rats and tumor host rats, two, four and seven days after inoculation. Both groups were subsequently divided into treated and untreated, the former being administered with a daily subcutaneous (sc) dose of formoterol (3 mg / kg body weight (bw) and pentoxifylline (10 mg / kg body weight (bw), dissolved in physiological solution) and the latter with the corresponding volume of the solvent. The animals were sacrificed two, four and seven days after tumor inoculation.
  • sc subcutaneous
  • the experimental groups were the following: untreated tumor-bearing rats and tumor-bearing rats treated subcutaneously with formoterol at different doses: 0.3, 1, 3, and 10 mg / kg body weight. The animals were sacrificed seven days after tumor inoculation.
  • the experimental groups were the following: control rats and tumor host rats, two, four and seven days after inoculation. Both groups were subsequently divided into treated and untreated, the former being administered with a daily subcutaneous (sc) dose of formoterol (0.3 mg / kg body weight (bw), dissolved in physiological solution) and the latter with the corresponding solvent volume The animals were sacrificed two, four and seven days after tumor inoculation.
  • sc subcutaneous
  • formoterol 0.3 mg / kg body weight (bw)
  • bw body weight
  • the experimental groups were the following: control rats, rats that were caused muscle damage with an acute injection of bupivacaine (0.5%), rats that caused muscle damage with an acute injection of bupivacaine (0.5%) and treated during the last seven days of the experiment, rats that were caused muscle damage with an acute injection of bupivacaine (0.5%) and treated fourteen days of experiment.
  • the treatment with formoterol was 0.3 mg / kg body weight, dissolved in physiological solution injected subcutaneously.
  • the tumor was extracted from the peritoneal cavity and its volume and cellularity were evaluated.
  • the blood was collected from the abdominal aorta in heparinized and centrifuged tubes (3500 g, 10 min, 4 0 C) to obtain plasma.
  • the tissues were quickly extracted, weighed and frozen in liquid nitrogen.
  • Lewis lung carcinoma This is a suitable model to study the mechanisms involved in the establishment of cachexia. This tumor has been described as an anaplastic epidermoid with a marked hemorrhagic tendency, which regulates, spontaneously and consistently produces multiple lung metastases. Its growth causes rapid and progressive weight loss and tissue wear in the host, particularly in skeletal muscle. The mice were divided into two groups, controls and tumor hosts. Tumor hosts received an inoculum of 5 x 10 5 Lewis lung carcinoma cells obtained from exponential tumors, given intramuscularly (left thigh). The development of a nodule at the injection site, growing in size up to 20% of the animal's weight, was considered as an index of the efficacy of the inoculation.
  • Both groups were subsequently divided into treated and untreated, the former being administered, during the last 9 days before slaughter, with a daily ip dose of formoterol (2 mg / kg pe, dissolved in physiological solution) and the latter with the corresponding solvent volume
  • a daily ip dose of formoterol (2 mg / kg pe, dissolved in physiological solution)
  • the latter with the corresponding solvent volume
  • the animals were weighed and anesthetized with a mixture of ketamine / xylazine (ip) (Imalgene® and Rompun® respectively).
  • ip ketamine / xylazine
  • the tumor was removed from the hind leg and its mass was determined. Tissue samples were quickly extracted, weighed and frozen in liquid nitrogen.
  • Total extensor digitorum longus (EDL) muscle RNA was extracted using the guanidino / phenol / chloroform isothiocyanate method.
  • RNA samples (20 ⁇ g) were denatured, subjected to electrophoresis in 1.2% agarose gels containing 6.3% formaldehyde and transferred to Hybond N membranes (Amersham). The RNA was fixed to the membrane by Genelinker. The RNA in the gels and filters was visualized with ethidium bromide and photographed by UV transillumination to guarantee the integrity of the RNA, check the load of equivalent amounts of RNA and confirm that the transfer had been correct.
  • the ubiquitin probe used was a cDNA clone containing 12 pairs of the second coding sequence of the ubiquitin plus a third and fourth complete coding sequences and 120 base pairs of the 3'-untranslated region of the chicken polyubiquitin gene UBI
  • the membranes were also hybridized with the cDNA probes encoding C8, C9, the conjugating enzyme E2, the rat m-calpain and Ia rat cathepsin B. Filters were exposed to Hyperfilm-MP (Amersham) at -80 0 C for 1-4 days and the films quantified by scanning densitometry. The statistical analysis of the data was performed by means of the Student's t test.
  • the activity similar to the chymotrypsin of the muscular proteasome was determined by evaluating the breakage of the specific succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amido-4-methylcumarin (Fluorogenic) substrate (LLVY).
  • the gastrocnemius muscle was homogenized in 20 mM TRIS-HCI pH 7.2 containing 0.1 mM EDTA, 1 mM 2-mercaptoethanol, 5 mM ATP, 20% glycerol, and 0.04% (v / v) Triton X-100 . Muscle homogenates were centrifuged (13000 g, 15 min, 4 0 C).
  • the supernatant was collected and the protein concentration was determined using the BCA assay (Pierce Chemical Co.). Aliquots of 40 ⁇ g of protein were incubated for 60 min at 37 ° C in the presence of 40 ⁇ M LLVY. The incubation buffer for the evaluation of proteasome activity was 50 mM HEPES pH 8.0 containing 5 mM EGTA. The fluorescence was read with a spectrofluorimeter (380 nm excitation and 460 nm emission; RF-5001 PC spectrofluorophotometer,
  • Muscle tibialis muscle protein extracts were isolated as previously described (cf. Blough E. et al., "Extraction of nuclear proteins from striated muscle tissue” Biotechni ⁇ ues 1999, vol. 26, pp. 202-4), and the protein concentration was determined by the BCA protein test kit (Pierce, USA).
  • the oligonucleotides corresponding to the consensus sequences to NF- ⁇ B (nuclear factor kappa B), AP-1 (activating protein 1) and C / EBP (CCAAT / binding enhancer protein) were labeled at the end end using [ ⁇ 32 P] dCTP and Klenow enzyme.
  • the double labeled oligonucleotide chains (30,000 cpm) were incubated for 10 min on ice with 150 ⁇ g of nuclear protein extract.
  • the reactions were carried out in a final volume of 20 ⁇ l containing 12% glycerol, 12 mM Hepes (pH 7.9), 4 mM Tris-HCI (pH 7.9), 1 mM EDTA (pH 8), 1 mM dithiothreitol (DTT), 25 mM KCI, 5 mM MgCl 2 , 40 ⁇ g / ml poly dl-dC (deoxyinosinic-deoxycytidyl acid) and protease inhibitors (PMSF, aprotinin and leupeptin).
  • PMSF protease inhibitors
  • the samples were electrophoresed at 4 0 C at 325 V for 60-80 min on a non-denaturing gel of 7% polyacrylamide in 0.5x Tris-borate-EDTA. Ia after electrophoresis, the gel was dried for 120 min in a BioRad GHG Dryer and exposed overnight to a sensitive film to X - rays (Hyperfilm-MP, Amersham Biosciences) at -80 0 C with intensifying screens. The specificity of the NF- ⁇ B, AP-1 and C / EBP bands was confirmed by reactions with mutant oligonucleotides labeled at the end end.
  • the number of tumor cells of the hosts carrying the Yoshida AH-130 model was not significantly affected by formoterol, nor was food intake (observed in tumor carriers). The hypophagia present during tumor growth remained unchanged in the treated animals (cf. TABLE 1).
  • formoterol therefore had a clear protective effect, in terms of fresh tissue weight, for skeletal muscles and for the heart.
  • formoterol also had a significant trophic action on the muscles in non-tumor carriers, particularly on the gastrocnemius, tibialis, EDL and cardiac muscles, while the soleus was not significantly affected.
  • tumor growth caused large reductions in the mass of white adipose tissue (46%).
  • brown adipose tissue (53%).
  • TABLE 1 shows the food intake, tissue weights and tumor growth in rats carrying the Yoshida AH-130 ascites hepatoma.
  • the food intake is expressed in g and refers to the ingestion during the period of the experiment prior to sacrifice (7 days after tumor inoculation).
  • Tissue weights are expressed as mg / 100 g of initial body weight.
  • the carcass (body without organs or tumor) is expressed as g / 100 d of the initial body weight.
  • the content in tumor cells is expressed in millions of cells. The results are mean ⁇ SEM for the number of animals indicated in parentheses.
  • the accelerated degradation of muscle proteins in both the AH-130 and Lewis lung carcinoma hosts is basically due to the activation of the proteolytic system dependent on ATP and ubiquitin.
  • formoterol the effects of formoterol on the gene expression of the different proteolytic systems present in skeletal muscle were investigated.
  • the tumor-bearing animals showed an increased expression of the two polyubiquitin genes in relation to the corresponding control animals: above 2 times (2.4 kb) and 6 times (1, 2 kb) (cf. FIG. 1).
  • the tumor-bearing animals received formoterol, that activation was suppressed (cf. TABLE 2).
  • similar results were found for the C8 and C9 subunit of the proteasome, and for the conjugating enzyme E2 whose expressions were significantly increased as a result of tumor growth, and treatment with formoterol suppressed this activation in gene expression (cf. TABLE 2 and FIG. 1).
  • TABLE 2 shows the gene expression (mRNA) of different proteolytic systems in gastrocnemius muscles of rats carrying the ascitic hepatoma Yoshida AH-130. This was detected after hybridization with cDNA probes. The load correction was made with blots with the probe of the rat 18S ribosomal subunit. Autoradiographs were subjected to scanning densitometry. The symbols are as in TABLE 1.
  • TABLE 3 shows the proteasome activity in skeletal muscle homogenates of tumor-bearing rats.
  • the activities expressed as nkatal / mg of protein referred to the total protein stock, were calculated using free amidocoumarin as the working standard.
  • the final result is the difference between nkatales obtained with and without the presence of 25 ⁇ M lactacistine, a specific proteasome inhibitor.
  • the symbols are as in TABLE 1.
  • FIG. 2 Another aspect that was evaluated was muscle apoptosis during cancer.
  • the results presented in FIG. 2 show that tumor growth is associated with an increased rate of apoptosis both if it is determined as DNA fragmentation (68%) (cf. FIG. 2A and 2B) and as activation of caspase-3 (59%) (cf. FIG. 2C).
  • the treatment with formoterol completely abolished the increased rate of muscular apoptosis (cf. FIG. 2A, 2B and 2C).
  • TABLE 4 shows the DNA binding activity of NF- ⁇ B, AP-1 and C / EBP in tibialis muscles of rats carrying the ascitic hepatoma Yoshida AH-130.
  • the DNA binding of NF- ⁇ B, AP-1 and C / EBP was determined in tibialis muscle nuclear extracts. Autoradiographs were subjected to scanning densitometry. The symbols are as in TABLE 1.
  • TABLE 5 shows the gene expression (mRNA) of the decoupling proteins (UCP2 and UCP3) in gastrocnemius muscles of rats carrying the ascitic hepatoma Yoshida AH-130. This was detected after hybridization with cDNA probes. The load correction was made with blots with the probe of the rat 18S ribosomal subunit. Autoradiographs were subjected to scanning densitometry. The symbols are as in TABLE 1.
  • the dissection and isolation of the EDL muscles was carried out under anesthesia with a mixture of ketamine / xylazine.
  • the isolated muscles were fixed to a stainless steel clip in order to keep the muscle under slight tension (making it comparable to the resting length) during incubation.
  • Such muscles are capable of maintaining normal concentrations of ATP and phosphocreatine during an incubation period of 3 hours.
  • the muscles were incubated in a water bath thermostatted shaking at 35 0 C for 3 hours in 2 ml of Krebs-Henseleit physiological saline pH 7.4, containing 5 mM glucose and 20 mM HEPES. After the addition of the muscles to the vials, the incubation began with an agitation rate of 45 cycles / min.
  • the vials were gassed with O 2 / CO 2 19: 1 during the entire incubation period.
  • the muscles were pre-incubated for 60 minutes: 30 minutes in Krebs Henseleit buffer and 30 minutes in a supplemented medium containing 10 "4 M formoterol, 10 " 4 M clenbuterol or nothing, and then incubated for 120 minutes in half. Supplemented fresh.
  • the total protein degradation by the isolated muscles was calculated as the tyrosine rate released in the last two hours of incubation in the medium in the presence of 0.5 mM cycloheximide in order to block the re-polarization of tyrosine in tissue proteins.
  • Tyrosine was measured fluorimetrically. The statistical analysis of the data was carried out by means of the Student's t test. As can be seen in TABLE 6, formoterol decreased the protein degradation rate by 20% (measured as the release of tyrosine in the incubation medium), confirming that the action of the molecule is based on a decrease in the proteolytic rate.
  • TABLE 7 shows the proteolytic rates in EDL muscles isolated from rats to which a formoterol treatment (2 mg / kg pe) was administered for six consecutive days prior to slaughter. The rates were measured in the presence of cycloheximide (0.5 mM) and are expressed as nmoles / g and 2 hours. Statistical significance of the results (by Student's t test): treated rats versus controls * p ⁇ 0.05.
  • both formoterol and clenbuterol influenced the rate of protein synthesis, which was increased by 20% by both formoterol and clenbuterol (cf. TABLE 8) .
  • the total protein synthesis rate in isolated muscles was evaluated as previously described (cfr.
  • TABLE 9 shows food intake, tissue weights and tumor growth in rats carrying Yoshida AH-130 ascites hepatoma.
  • the food intake is expressed in g and refers to the ingestion during the period of the experiment prior to sacrifice (2, 4 or 7 days after the inoculation of the tumor, TABLE 9A, 9B and 9C respectively).
  • Tissue weights are expressed as mg / 100 g of initial body weight.
  • the carcass (body without organs or tumor) is expressed as g / 100 d of the initial body weight.
  • the content in tumor cells is expressed in millions of cells. The results are mean ⁇ SEM for the number of animals indicated in parentheses.
  • TABLE 10 shows food intake, tissue weights and tumor growth in rats carrying the ascitic hepatoma Yoshida AH-130.
  • the food intake is expressed in g and refers to the average daily intake.
  • the other parameters are expressed as in TABLE 9.
  • F treated with formoterol
  • TB tumor carriers.
  • TABLE 11 shows food intake, tissue weights and tumor growth in rats carrying Yoshida AH-130 ascites hepatoma. All parameters are expressed in the same way as in TABLE 9. TABLE 11 A (two days after inoculation)
  • Muscle regeneration is a process that involves the activation of satellite cells, muscle precursors which are adjacent to muscle fibers. Muscle damage was caused by intramuscularly injecting bupivacaine (single injection, 0.5%), a compound that once done the damage stimulates muscle regeneration, and the effect of two treatments with formoterol (0.3 mg / kg body weight) was also verified. : 7 or 14 days of treatment. Table 12 shows the anabolic effect of formoterol treatments on the tibialis muscle that was previously damaged with bupivacaine.
  • TABLE 13 shows the gene expression of two markers of the activation of the satellite cells: Pax-7 and myogenin.
  • the results are mean + SEM for the number of animals indicated in parentheses.
  • C control;
  • F treated with formoterol;
  • Statistical significance of the results (by the Student's t test);
  • the treatment with formoterol did not alter the weight of the solid tumor of the hosts carrying the Lewis lung carcinoma model, nor did the food (controls and tumor carriers).
  • the hypophagia present during tumor growth persisted invariably in the treated animals (TABLE 14).
  • the presence of the tumor induced a large decrease in muscle weight (13% for gastrocnemius, 21% for tibialis and 18% for soleus) (TABLE 14).
  • Treatment with formoterol significantly increased the weights of the gastrocnemius (19%), tibialis (13%) and soleus (28%) muscles in non-tumor-bearing animals.
  • TABLE 14 shows the food intake, tissue weights and tumor growth in mice bearing Lewis lung carcinoma.
  • the food intake is expressed in g and refers to the ingestion during the period of the experiment prior to the sacrifice, which took place 15 days after the inoculation of the tumor.
  • Tissue weights are expressed as mg / 100 g of initial body weight.
  • the shell is expressed as g / 100 g of initial body weight.
  • the weight of the tumor is expressed in g.
  • the symbols are as in TABLE 1.
  • the tumor-bearing mice showed an increased expression for the polyubiquitin genes in relation to the corresponding control animals: more than 2 times (2.4 kb) and 3 times (1.2 kb) ( FIG. 3).
  • this activation was suppressed (TABLE 15).
  • similar results were found for the C8 and C9 subunit of the proteasome, whose expression was significantly increased as a result of tumor growth, and treatment with formoterol suppressed this activation of gene expression (TABLE 15 and FIG. 3).
  • TABLE 15 shows the gene expression (mRNA) of the different proteolytic systems in gastrocnemius muscles of mice carrying carcinoma Lewis lung. This was detected after hybridization with cDNA probes. The load correction was made with blots with the probe of the rat 18S ribosomal subunit. Autoradiographs were subjected to scanning densitometry. The symbols are as in TABLE 1.
  • TABLE 16 shows the gene expression (mRNA) of the decoupling proteins (UCP2 and UCP3) in gastrocnemius muscles of mice bearing Lewis lung carcinoma. This was detected after hybridization with cDNA probes. The load correction was made with blots with the probe of the rat 18S ribosomal subunit. Autoradiographs were subjected to scanning densitometry. The symbols are as in TABLE 1.

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Abstract

El formoterol, utilizado hasta ahora para el tratamiento del broncoespasmo asociado a asma, exhibe una potente eficiencia anti-caquéctica con relativamente bajos efectos secundarios adversos y toxicidad. Así, la invención se refiere al use del formoterol o sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, particularmente fumarato o fumarato dihidrato, para la preparación de un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico del desgaste muscular y/o un síndrome caquéctico, ambos asociados a un estado catabólico en un mamífero, en particular un humano. Algunos estados catabólicos que se pueden tratar con formoterol son cáncer, el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA), infecciones, diabetes, estados de inmovilización o distrofias musculares.

Description

Uso del formoterol en el tratamiento profiláctico y/o terapéutico del desgaste muscular y/o síndrome caquéctico, asociados a estados catábólicos de ciertas enfermedades como cáncer, SIDA, infecciones, diabetes y otras.
Esta invención está relacionada con el campo de Ia medicina humana, y específicamente con un nuevo uso de un compuesto para el tratamiento de 5 determinadas enfermedades o estados humanos.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La manifestación quizás más común de Ia enfermedad maligna avanzada es
10 el desarrollo de caquexia cancerosa. Efectivamente, Ia caquexia se presenta en Ia mayoría de pacientes cancerosos, y es responsable de Ia muerte del 22% de los pacientes con cáncer. Además del cáncer, Ia caquexia está asociada a otras enfermedades o estados tales como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), traumatismos o sepsis. Las
15 anormalidades asociadas con Ia caquexia incluyen anorexia, pérdida de peso, pérdida y atrofia de músculo, anemia y alteraciones en el metabolismo de glúcidos, lípidos y proteínas (cfr. Argües J. M. et al., "The metabolic basis of cáncer cachexia", Med. Res. Rev. 1997, vol. 17, pp. 477-98). El grado de caquexia está inversamente correlacionado con el tiempo de supervivencia
20 del paciente y siempre implica una mala prognosis. Una de las características más relevantes de Ia caquexia es Ia astenia (es decir, falta de fuerza muscular), que refleja el importante desgaste muscular que tiene lugar en el paciente canceroso caquéctico. La astenia también se caracteriza por una debilidad general así como por fatiga física y mental. Además, Ia disminución
25 de Ia masa corporal magra es una de las principales tendencias de Ia caquexia e implica no sólo al músculo esquelético sino que también afecta a las proteínas cardiacas, dando lugar a importantes alteraciones en las funciones del corazón.
30 Se han propuesto varias estrategias para tratar Ia caquexia, aunque sólo unas pocas han llegado a nivel clínico con resultados positivos. Sin embargo, Ia mayoría de éstas muestran problemas derivados de su utilización. Entre las drogas anticaquécticas más ampliamente utilizadas están varios derivados sintéticos de Ia progesterona (p.ej. acetato de megestrol y
35 medroxiprogesterona), que son capaces de mejorar el apetito y Ia ganancia de peso, aunque el incremento observado en Ia masa corporal es debido principalmente a un incremento en Ia masa grasa y a retención de agua, sin efectos significativos en el índice de Karnofsky (una medida del nivel de actividad para pacientes de cáncer). El cannabinoide dronabinol es capaz de mejorar Ia caquexia tanto en pacientes de cáncer como de SIDA, aunque muchos de ellos experimentan efectos secundarios como euforia, mareos, somnolencia y confusión. La insulina ha sido usada como un estimulador del apetito (con el fin de mejorar Ia anorexia), pero se ha demostrado que está asociada a un incremento en el peso del tumor. Los corticosteroides (p.ej. dexametasona o prednisolona), cuando se usan en tratamientos prolongados, parecen ocasionar debilidad, delirio, osteoporosis e inmunosupresión, y no parecen tener ningún efecto significativo sobre Ia reducción de Ia mortalidad. El clenbuterol es otro compuesto que ha mostrado algunos efectos anticaquécticos, aunque su toxicidad en humanos y animales (especialmente sus efectos negativos sobre el corazón) no han permitido Ia realización de pruebas clínicas (cfr. Carbó N. et al.,"Comparative effects of beta2-adrenergic agonists on muscle waste associated with tumor growth", Cáncer Lett. 1997, vol. 115, pp. 113-8; Hoffman, RJ. et al., "Clenbuterol ingestión causing prolonged tachycardia, hypokalemia, and hypophosphatemia with confirmation by quantitative levéis", J. Toxicol. Clin. Toxicol. 2001 , vol. 39, pp. 339-44). El uso de anticuerpos y receptores solubles de citoquinas es una aproximación prometedora para tratar Ia caquexia, pero estos tratamientos son demasiado caros porque requieren un número muy grande de moléculas con el fin de bloquear completamente Ia acción de las citoquinas. Lo mismo sucede con el uso de citoquinas anti-inflamatorias. El uso de esteroides anabolizantes (p.ej. nandrolona y oximetolona) tiene importantes efectos secundarios adversos tales como Ia masculinización, Ia retención de fluidos y Ia toxicidad hepática. Se ha utilizado el sulfato de hidracina como droga anticaquéctica, pero tiene algunos problemas derivados de su toxicidad (cfr. Argües J. M. et al., "Cáncer cachexia: a therapeutic approach", Med. Res. Rev. 2001 , vol. 21 , pp. 83-101 ).
Así, es muy deseable proporcionar nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de Ia caquexia y el desgaste muscular. En particular, es deseable tener nuevos agentes terapéuticos con una gran eficiencia anti-caquéctica y consecuencias no tóxicas. EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han encontrado sorprendentemente que el formoterol, utilizado hasta ahora para el tratamiento del broncoespasmo asociado a asma, exhibe una potente eficiencia anti-caquéctica con relativamente bajos efectos secundarios adversos y baja toxicidad.
El formoterol es un compuesto racémico que tiene Ia fórmula química que se adjunta (se muestra Ia estereoquímica relativa de uno de los dos enantiómeros) y es un potente agonista β2-adrenérgico selectivo que combina las ventajas clínicas de un rápido inicio de Ia acción y una larga duración de Ia acción. Este compuesto se utiliza en humanos para el tratamiento del broncoespasmo asociado a asma. In vitro el formoterol es un potente relajante del músculo liso por vía aérea con alta eficacia y muy alta afinidad y selectividad por el receptor β2-adrenérgico. Además de Ia relajación del músculo liso por vía aérea, el formoterol inhibe una variedad de procesos inflamatorios agudos en modelos animales, incluyendo Ia activación de eosinófilos y Ia infiltración de las vías aéreas, los derrames microvasculares, y Ia liberación inducida por antígeno de mediadores desde el pulmón en humanos. Asimismo, el formoterol relaja el músculo liso bronquial y también proporciona importantes beneficios clínicos en pacientes sintomáticos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD). El formoterol, como otros agonistas β2-adrenoceptor de larga actuación, atenúa Ia reacción asmática inducida por alérgeno y, bajo ciertas condiciones, tiene más efecto que otros receptores β2-adrenérgicos tales como el salbutamol y el salmeterol (cfr. Linden A. et al., "Salmeterol, formoterol and salbutamol ¡n the isolated guinea pig trachea: differences in máximum relaxant effect and potency but not in functional antagonism" Thorax 1993, vol. 48, pp. 547-53).
O
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La presente invención se refiere al uso del formoterol o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un solvato farmacéuticamente aceptable de cualquiera de ellos, para Ia preparación de un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico del desgaste muscular y/o de un síndrome caquéctico, ambos asociados a un estado catabólico en un mamífero, en particular un humano. El término "estado catabólico" como se usa aquí, se refiere a una situación patofisiológica en Ia que las rutas catabólicas están activadas. Ejemplos de rutas catabólicas son Ia glicogenólisis hepática, Ia lipólisis del tejido adiposo, Ia proteólisis del músculo esquelético y Ia termogénesis. Así, Ia invención se refiere a un método de tratamiento de un paciente que sufre de desgaste muscular y/o de un síndrome caquéctico, ambos asociados a un estado catabólico en un mamífero, en particular un humano, que comprende Ia administración de una dosis terapéuticamente aceptable de formoterol o de sus sales y/o solvatos farmacéuticamente aceptables, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, se usa el fumarato de formoterol, como tal o como dihidrato, para estas indicaciones.
El formoterol ejerce una acción selectiva, potente y protectora sobre el corazón y el músculo esquelético mediante antagonismo de Ia degradación aumentada de proteínas que caracteriza Ia caquexia en cáncer. Así, al contrario de Io que se encuentra con otros agonistas β2 que tienen numerosos efectos secundarios adversos y una toxicidad considerable, el formoterol es un agente terapéutico conveniente en estados patológicos donde el hipercatabolismo de proteína muscular es un aspecto crítico, como es el caso de la caquexia en cáncer u otras enfermedades asociadas al desgaste muscular.
En realizaciones particulares de Ia invención, el formoterol o sus sales y/o solvatos farmacéuticamente aceptables pueden usarse para el tratamiento del desgaste muscular o el síndrome caquéctico asociado a cáncer, el síndrome de Ia inmunodeficiencia adquirida (SIDA), sepsis, diabetes, estados de inmobilización, quemadas severas, Ia enfermedad pulmonar obstructiva crónica, Ia vejez, patologías cardiovasculares, patologías hepáticas, artritis reumatoide, desórdenes nutricionales, acidosis, enfermedades neuromusculares, Ia enfermedad de Alzheimer, hiperadrenocortisolismo, hipertiroidismo, el síndrome de Cushing, atrofias y distrofias musculares, colitis ulcerosa, el síndrome de Ia fatiga crónica, el fallo renal, Ia cirrosis hepática, Ia enfermedad de Crohn y un estado de desgaste muscular debido a Ia ingravidez.
El tratamiento con formoterol tiene un claro efecto protector para el músculo esquelético y el corazón, en términos de peso de tejido húmedo. Luego, el formoterol proporciona una significante acción trófica también en músculos de individuos no portadores de cáncer, particularmente en el músculo gastrocnemius, tibialis, extensor digitorium longus (EDL) y cardíaco, mientras que el músculo soleus no queda significativamente afectado. Respecto a los tejidos adiposos, el tratamiento con formoterol induce un incremento en el peso del tejido adiposo marrón. Además, el tratamiento con formoterol no altera ni el peso del tumor sólido ni Ia ingesta de comida.
Dependiendo de las circunstancias, un experto en Ia materia seleccionará una apropiada vía de administración del formoterol o de sus sales y/o solvatos farmacéuticamente aceptables, tales como oral, nasal, parenteral, subcutánea, tópica, etc. El experto en Ia materia también escogerá un sistema de liberación adecuado para Ia vía de administración seleccionada.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El resumen de esta solicitud se incorpora aquí como referencia. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes modos de realización y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 muestra el Northern blot de músculos gastrocnemius de ratas control (C), ratas tratadas con formoterol (C+F), ratas portadoras de tumor (hepatoma ascítico Yoshida AH-130) (TB) y ratas portadoras de tumor tratadas con formoterol (TB+F). La expresión de los mARN de Ia ubiquitina (Ub), Ia subunidad C8 del proteasoma (C8), Ia m-calpaína (m-cal) y Ia catepsina B (catB) en gastrocnemius fue detectada después de Ia hibridación con sondas de ADNc. Se utilizó una sonda del rARN 18S (18S) para Ia cuantificación total y Ia corrección de Ia carga. Las autorradiografías fueron sometidas a densitometría de barrido.
La FIG. 2 muestra Ia apoptosis en músculos tibialis de ratas control (C), ratas tratadas con formoterol (C+F), ratas portadoras de tumor (hepatoma ascítico Yoshida AH-130) (TB) y ratas portadoras de tumor tratadas con formoterol (TB+F). Los resultados son medias ± EEM de cinco animales por grupo. FIG. 2A y 2B: Ia fragmentación del DNA fue determinada por monitorización del "laddering" en un gel de agarosa. El porcentaje de fragmentación del DNA fue cuantificado por densitometría de barrido. El hígado de ratones tratados con anticuerpo anti-Fas fue utilizado como control positivo. FIG. 2C: Ia actividad caspasa-3 fue determinada por un ensayo colorimétrico, y los resultados están expresados en nmoles/hora. Significatividad estadística de los resultados (por el test de Ia t de Student); FIG. 2A: no tratados versus F: ttP<0.01 ; FIG. 2C: C versus TB: *p<0.05, no tratados versus F: tttp<0.001.
La FIG. 3 muestra el Northern blot de músculos gastrocnemius de ratones control (C), ratones tratados con formoterol (C+F), ratones portadores de tumor (carcinoma pulmonar de Lewis) (TB) y ratones portadores de tumor tratados con formoterol (TB+F). El procedimiento seguido y las abreviaturas son análogos a los de Ia FIG. 1.
EXPOSICIÓN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN
Animales v reactivos bioquímicos
Se utilizaron en los diferentes experimentos, ratas macho Wistar (Interfauna, Barcelona, España) que pesaban unos 110 g, y ratones C57BI/6 (Criffa, Barcelona, España), de unas 12 semanas de edad. Los animales se mantuvieron a 22 ± 2 0C con un ciclo luz-oscuridad regular (luz encendida entre 08:00 a.m. y 08:00 p.m.) y tuvieron libre acceso a comida y agua. La dieta (B. K. Universal G.J./S.L., Sant Viceng deis Horts, Barcelona, España) consistió en un 45,5-48,5% de carbohidratos (3,5% de glucosa absorbible, 42-45% de almidón), un 18,5% de proteína y 3,1% de grasa (el residuo fue material no digerible). Se midió Ia ingesta de comida diariamente. Todas las manipulaciones de los animales fueron hechas de acuerdo con las directrices de la Comunidad Europea para el uso de animales de laboratorio. Los reactivos bioquímicos fueron todos de calidad reactiva y obtenidos de Roche S.A. (Barcelona, España) o de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, Estados Unidos). Los productos radioquímicos fueron proporcionados por Amersham Int. (Amersham, Bucks., Reino Unido) y el fumarato de formoterol micronizado por Industríale Chimica s.r.l. (Saronno, Italia).
Inoculación del tumor v tratamiento
Hepatoma ascítico Yoshida AH-130: Este es un tumor de rata que crece exponencialmente durante 4-5 días y entra en fase estacionaria el día 7 después del transplante. Las ratas fueron divididas en dos grupos, controles y huéspedes del tumor. Estas últimas recibieron un inoculo intraperitoneal de 108 células del hepatoma ascítico Yoshida AH-130 obtenidas de tumores exponenciales. Ambos grupos fueron divididos posteriormente en tratados y no tratados, siendo administrados los primeros con una dosis intraperitoneal (i.p.) diaria de formoterol (2 mg/kg de peso corporal (bw), disuelto en solución fisiológica) y los últimos con el correspondiente volumen del disolvente. En el día 7 después del transplante del tumor, los animales fueron pesados y anestesiados con una inyección i.p. de una mezcla de ketamina/xilazina (3:1) (Imalgene® y Rompun® respectivamente). El tumor fue extraído de Ia cavidad peritoneal y se evaluó su volumen y celularidad. La sangre fue recogida de Ia aorta abdominal en tubos heparinizados y centrifugados (3500 g, 10 min, 4 0C) para obtener plasma. Los tejidos fueron extraídos rápidamente, pesados y congelados en nitrógeno líquido.
En el tratamiento de combinación de formoterol y pentoxifilina los grupos experimentales fueron los siguientes: ratas controles y ratas huéspedes del tumor, dos, cuatro y siete días después de su inoculación. Ambos grupos fueron divididos posteriormente en tratados y no tratados, siendo administrados los primeros con una dosis subcutánea (s.c.) diaria de formoterol (3 mg/kg de peso corporal (bw) y pentoxifilina (10 mg/kg de peso corporal (bw), disueltos en solución fisiológica) y los últimos con el correspondiente volumen del disolvente. Los animales se sacrificaron dos, cuatro y siete días después de Ia inoculación del tumor.
En el tratamiento de diferentes dosis de formoterol los grupos experimentales fueron los siguientes: ratas portadoras del tumor sin tratamiento y ratas portadoras de tumor tratadas subcutáneamente con formoterol a distintas dosis: 0,3, 1 , 3, y 10 mg/kg peso corporal. Los animales se sacrificaron siete días después de Ia inoculación del tumor.
En el tratamiento de formoterol a dosis bajas los grupos experimentales fueron los siguientes: ratas controles y ratas huéspedes del tumor, dos, cuatro y siete días después de su inoculación. Ambos grupos fueron divididos posteriormente en tratados y no tratados, siendo administrados los primeros con una dosis subcutánea (s.c.) diaria de formoterol (0,3 mg/kg de peso corporal (bw), disuelto en solución fisiológica) y los últimos con el correspondiente volumen del disolvente. Los animales se sacrificaron dos, cuatro y siete días después de Ia inoculación del tumor.
En el experimento de indución de daño muscular, los grupos experimentales fueron los siguientes: ratas controles, ratas a las que se provocó el daño muscular con una inyección aguda de bupivacaina (0,5%), ratas a las que se provocó el daño muscular con una inyección aguda de bupivacaina (0,5%) y se las trató durante los últimos siete días de experimento, ratas a las que se provocó el daño muscular con una inyección aguda de bupivacaina (0,5%) y se las trató los catorce días de experimento. El tratamiento con formoterol fue de 0,3 mg/kg de peso corporal, disuelto en solución fisiológica inyectado subcutáneamente.
En todos los experimentos, el tumor fue extraído de Ia cavidad peritoneal y se evaluó su volumen y celularidad. La sangre fue recogida de Ia aorta abdominal en tubos heparinizados y centrifugados (3500 g, 10 min, 40C) para obtener plasma. Los tejidos fueron extraídos rápidamente, pesados y congelados en nitrógeno líquido.
Carcinoma pulmonar de Lewis: Este es un modelo adecuado para estudiar los mecanismos implicados en el establecimiento de Ia caquexia. Este tumor ha sido descrito como un epidermoide anaplástico con una marcada tendencia hemorrágica, que regular, espontánea y consistentemente produce múltiples metástasis pulmonares. Su crecimiento causa en el huésped una rápida y progresiva pérdida de peso y desgaste tisular, particularmente en el músculo esquelético. Los ratones fueron divididos en dos grupos, controles y huéspedes del tumor. Los huéspedes del tumor recibieron un inoculo de 5 x 105 células del carcinoma pulmonar de Lewis obtenidas de tumores exponenciales, dadas intramuscularmente (muslo izquierdo). El desarrollo de un nodulo en el lugar de Ia inyección, creciendo en tamaño hasta un 20% del peso del animal, fue considerado como un índice de Ia eficacia de Ia inoculación. Ambos grupos fueron divididos posteriormente en tratados y no tratados, siendo administrados los primeros, durante los últimos 9 días antes del sacrificio, con una dosis i.p. diaria de formoterol (2 mg/kg pe, disuelto en solución fisiológica) y los últimos con el correspondiente volumen del disolvente. En el día 15 tras el transplante del tumor, los animales fueron pesados y anestesiados con una mezcla de ketamina/xilazina (i.p.) (Imalgene® y Rompun® respectivamente). El tumor fue extirpado de Ia pata trasera y se determinó su masa. Las muestras de tejidos fueron rápidamente extraídas, pesadas y congeladas en nitrógeno líquido.
Aislamiento de ARN v análisis por Northern blot
El ARN total de músculo extensor digitorum longus (EDL) fue extraído usando el método del isotiocianato de guanidino/fenol/cloroformo. Las muestras de ARN (20 μg) fueron desnaturalizadas, sometidas a electroforesis en geles de agarosa al 1 ,2% conteniendo 6,3% de formaldehído y transferidas a membranas de Hybond N (Amersham). El ARN fue fijado a Ia membrana por Genelinker. El ARN en los geles y en los filtros fue visualizado con bromuro de etidio y fotografiado por transiluminación UV para garantizar Ia integridad del ARN, comprobar Ia carga de cantidades equivalentes de ARN y confirmar que Ia transferencia había sido correcta. El ARN fue transferido en citrato salino estándar 2Ox (SSC; 0,15 M NaCI y 15 mM citrato sódico, pH 7,0). La hibridación fue a 65 0C durante toda Ia noche en el tampón de hibridación (0,25 M Na2HPO4 / 7% SDS / 1 mM EDTA / 1% BSA / 10% sulfato de dextrano), y se añadieron las sondas marcadas desnaturalizadas (106-107 cpm/ml). Las sondas radiomarcadas se prepararon por el método del cebador aleatorio (Amersham). La sonda de ubiquitina utilizada era un clon de ADNc que contenía 12 pares de Ia segunda secuencia codificadora de Ia ubiquitina más unas tercera y cuarta secuencias codificadoras completas y 120 pares de bases de Ia región 3'-no traducida del gen de Ia poliubiquitina de pollo UBI. Las membranas fueron también hibridadas con las sondas de ADNc que codifican para C8, C9, el enzima conjugador E2, Ia m-calpaína de rata y Ia catepsina B de rata. Los filtros fueron expuestos a Hyperfilm-MP (Amersham) a -80 0C durante 1-4 días y las películas cuantificadas por densitometría de barrido. El análisis estadístico de los datos fue realizado por medio del test de Ia t de Student.
Determinación de Ia actividad del proteasoma
La actividad similar a Ia quimotripsina del proteasoma muscular fue determinada evaluando Ia rotura del substrato fluorogénico específico succinil-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amido-4-metilcumarina (LLVY). El músculo gastrocnemius fue homogenizado en 20 mM TRIS-HCI pH 7,2 conteniendo 0,1 mM EDTA, 1 mM 2-mercaptoetanol, 5 mM ATP, 20% glicerol, y 0,04% (v/v) Tritón X-100. Los homogenados de músculos fueron centrifugados (13000 g, 15 min, 4 0C). Se recogió el sobrenadante y se determinó Ia concentración de proteínas usando el ensayo del BCA (Pierce Chemical Co.). Se incubaron alícuotas de 40 μg de proteína durante 60 min a 37 °C en presencia de 40 μM LLVY. El tampón de incubación para Ia evaluación de Ia actividad del proteasoma fue 50 mM HEPES pH 8,0 conteniendo 5 mM EGTA. La fluorescencia fue leída con un espectrofluorímetro (380 nm excitación y 460 nm emisión; RF-5001 PC spectrofluorophotometer,
Shimadzu). La actividad, expresada en nkatal/mg proteína referida al acervo de proteína total, fue calculada usando amidocumarina libre como estándar de trabajo. El resultado final es Ia diferencia entre los nkatales obtenidos con y sin Ia presencia de 25 μM lactacistina, un inhibidor específico del proteasoma.
Ensayos de apoptosis
El ensayo de Ia fragmentación del DNA en músculo tibialis se llevó a cabo tal como se ha descrito previamente (cfr. Van Royen M. et al., "DNA fragmentation occurs in skeletal muscle during tumor growth: a link with cáncer cachexia?" Biochem. Biophvs. Res. Commun. 2000, vol. 270, pp. 533-7). La actividad caspasa-3 en músculo tibialis fue determinada usando el kit de ensayo colorimétrico de caspasa-3 BD Apoalert™ (BD Biosciences Clontech, USA). Análisis del cambio en Ia movilidad electroforética ("electrophoretic mobilitv shift analvsis". EMSA)
Los extractos de proteína muscular de músculo tibialis fueron aislados tal como se ha descrito previamente (cfr. Blough E. et al., "Extraction of nuclear proteins from striated muscle tissue" Biotechniαues 1999, vol. 26, pp. 202-4), y Ia concentración de proteína fue determinada por el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce, USA). Los oligonucleótidos correspondientes a las secuencias consenso a NF-κB (factor nuclear kappa B), AP-1 (proteína activadora 1 ) y C/EBP (CCAAT/proteína aumentadora de unión) fueron marcadas en el extremo final usando [α32P]dCTP y enzima Klenow. Las dobles cadenas de oligonucleótidos marcadas (30.000 cpm) fueron incubadas durante 10 min en hielo con 150 μg de extracto de proteína nuclear. Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 20 μl conteniendo 12% glicerol, 12 mM Hepes (pH 7,9), 4 mM Tris-HCI (pH 7,9), 1 mM EDTA (pH 8), 1 mM ditiotreitol (DTT), 25 mM KCI, 5 mM MgCI2, 40 μg/ml poli dl-dC (ácido desoxiinosínico-desoxicitidílico) e inhibidores de proteasas (PMSF, aprotinina y leupeptina). Al final de Ia incubación, se sometieron las muestras a electroforesis a 4 0C a 325 V durante 60-80 min sobre un gel no desnaturalizante de poliacrilamida al 7% en 0,5x Tris-borato-EDTA. Después de Ia electroforesis, el gel se secó durante 120 min en un BioRad GeI Dryer y se expuso durante una noche a una película sensible a los rayos X (Hyperfilm-MP, Amersham Biosciences) a -80 0C con pantallas intensificadoras. La especificidad de las bandas de NF-κB, AP-1 y C/EBP se confirmó por reacciones con oligonucleótidos mutantes marcados en el extremo final.
Análisis de Ia expresión αénica mediante Ia técnica de PCR a tiempo real
El análisis de Ia expresión génica de Pax-7 y miogenina mediante Ia técnica de PCR a tiempo real en músculo tibialis fue llevada a cabo tal como se ha descrito previamente (cfr. Edstrom, E. et al., "Sarcopenia is not due to lack of regenerative drive in senescent skeletal muscle" Aαinα CeII 2005, vol. 4, pp. 65-77). Efecto del tratamiento con formoterol en ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130
El número de células tumorales de los huéspedes portadores del modelo Yoshida AH-130 no fue afectado significativamente por el formoterol, así como tampoco Ia ingesta de comida (observada en portadores del tumor). La hipofagia presente durante el crecimiento del tumor permaneció invariable en los animales tratados (cfr. TABLA 1).
El patrón con respecto a los músculos esqueléticos y cardiaco fue totalmente diferente. Así, como se muestra en Ia TABLA 1 , Ia implantación del hepatoma ascítico Yoshida AH-130 resultó en un descenso en el peso de los músculos (13% para gastrocnemius, 16% para tibialis, 11% para soleus, 19% para EDL y 11% para corazón). El tratamiento con formoterol resultó en un incremento en Ia mayoría de tipos musculares incluyendo gastrocnemius (28%), tibialis (25%), EDL (32%) y músculo cardiaco (21%) en el grupo control. En los animales portadores de tumor, el formoterol indujo un incremento en el peso de gastrocnemius (9%), tibialis (11 %), EDL (16%) y corazón (11 %), previniendo por tanto el desgaste muscular. El tratamiento con formoterol tuvo por Io tanto un claro efecto protector, en términos de peso fresco de tejido, para los músculos esqueléticos y para el corazón. Además, el formoterol tuvo también una significativa acción trófica sobre los músculos en los no portadores de tumor, particularmente sobre los músculos gastrocnemius, tibialis, EDL y cardiaco, mientras que el soleus no fue afectado significativamente. Con respecto a los tejidos adiposos, el crecimiento del tumor causó grandes reducciones en Ia masa de tejido adiposo blanco (46%). Una situación similar fue observada en el tejido adiposo marrón (53%). En el modelo tumoral de rata, el tratamiento con formoterol estuvo asociado con una tendencia hacia un descenso en Ia masa de tejido adiposo blanco tanto en los animales controles como en los portadores de tumor, aunque los resultados no alcanzaron significatividad estadística, mientras que indujo un incremento en el peso del tejido adiposo marrón (cfr. TABLA 1 ).
La TABLA 1 muestra Ia ingesta de comida, los pesos de los tejidos y el crecimiento del tumor en las ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. La ingesta de comida es expresada en g y se refiere a Ia ingestión durante el periodo del experimento previo al sacrificio (7 días después de Ia inoculación del tumor). Los pesos de los tejidos están expresados como mg/100 g del peso corporal inicial. La carcasa (cuerpo sin órganos ni tumor) está expresada como g/100 d del peso corporal inicial. El contenido en células tumorales está expresado en millones de células. Los resultados son media ± EEM para el número de animales indicado entre paréntesis. C = control; F = tratados con formoterol; TB = portadores de tumor. Significatividad estadística de los resultados (por el test de Ia t de Student); C versus TB: *p<0.05, **p<0.01 , ***p<0.001 No tratados versus F: fp<0.05; ttP<0.01,tttP<0.001.
TABLA 1
C (4) C+F (5) TB (12) TB+F(12) ingesta de comida 121 ±1 135 ±2 105 ±4 109 ±5 tt ** ** peso del músculo:
- gastrocnemius 673 ±12 859 ± 38 585 ±10 639 ±16 tt *** tt***
- tibialis 219±7 275 ±12 184 ±4 204 ±4 tt ** tt***
- soleus 46 ±1 55 ±4 41 ±1 40 ±1
* ***
-EDL 53 ±2 70 ±3 43 ±1 50 ±1 tt *** ttt***
- corazón 430 ±17 520 ±15 382 ±7 426 ±17 tt ** peso del tejido adiposo:
- blanco (dorsal) 963 ±103 759 ±126 516 ±90 461 ± 49
* *
- marrón (interescapular) 260 ±13 278 ± 21 123 ±11 177 + 11
*** α. *** peso de Ia carcasa 92 ±1 113 + 11 80 ±1 81 ±1
*** *** contenido de células tumorales — — 3886 ± 444 (5) 3403 ± 88 (5)
La acelerada degradación de proteínas musculares tanto en los huéspedes del AH-130 como del carcinoma pulmonar de Lewis es básicamente debida a Ia activación del sistema proteolítico dependiente de ATP y ubiquitina. Así, se investigaron los efectos del formoterol sobre Ia expresión génica de los diferentes sistemas proteolíticos presentes en el músculo esquelético. Se estudió Ia expresión génica en el músculo gastrocnemius de las dos especies del mRNA de Ia poliubiquitina (2,4 kb y 1 ,2 kb) y de Ia subunidad C8 del proteasoma (ambas implicadas en Ia vía proteolítica dependiente de ATP y ubiquitina), Ia m-calpaína (sistema dependiente de calcio) y Ia catepsina B (sistema lisosomal). Como se muestra en TABLA 2, los animales portadores de tumor mostraron una expresión incrementada de los dos genes de Ia poliubiquitina en relación con los correspondientes animales control: por encima de 2 veces (2,4 kb) y de 6 veces (1 ,2 kb) (cfr. FIG. 1 ). Cuando los animales portadores de tumor recibieron formoterol, esa activación fue suprimida (cfr. TABLA 2). Interesantemente, se encontraron resultados similares para Ia subunidad C8 y C9 del proteasoma, y para el enzima conjugador E2 cuyas expresiones fueron incrementadas significativamente como resultado del crecimiento del tumor, y el tratamiento con formoterol suprimió esta activación en Ia expresión génica (cfr. TABLA 2 y FIG. 1 ). Con respecto a otros sistemas proteolíticos, Ia presencia del tumor también resultó en un incremento en Ia expresión del sistema m-calpaína dependiente de calcio (3 veces) pero el tratamiento con formoterol no suprimió esta activación en este modelo tumoral (cfr. TABLA 2 y FIG.1). Finalmente, el tratamiento con formoterol disminuyó Ia expresión de Ia catepsina B lisosomal en las ratas portadoras de tumor (cfr. TABLA 2).
La TABLA 2 muestra Ia expresión génica (ARNm) de diferentes sistemas proteolíticos en músculos gastrocnemius de ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. Ésta fue detectada después de Ia hibridación con sondas de ADNc. La corrección de carga se hizo con blots con Ia sonda de Ia subunidad ribosomal 18S de rata. Las autorradiografías fueron sometidas a densitometría de barrido. Los símbolos son como en Ia TABLA 1.
TABLA 2 sistema proteolítico C C+F TB TB+F dependiente de ubiquitina:
- ubiquitina 2.4 kb 100 ±12 92 ±12 233 ± 23 128 ±19
(4) (5) (3)** (5)t
-ubiquitina 1.2 kb 52 ±10 57 ±12 311 ±71 73 ±15
(3) (5) (3)* (4)t
- sub. C8 proteasoma 100 ± 9 62 ±7 155 ±7 78 ±9
(4) (5)t (5)** (5)ttt
- sub. C9 proteasoma 100 ± 5 104 ±7 126 ±6 80 ±4
(4) (5) (5)* (5) ttt
- enzima conjugador E2 100 ± 4 91 ±3 163 ±4 136 ±5
1,8Kb (4) (5) (5) *** (5)tt
- enzima conjugador E2 100 ± 7 88 ±6 157 ±8 128 ±5
1,2Kb (4) (5) (5)*** (5)t dependiente de calcio:
- m-calpaína 100 ±13 187 + 14 282 ± 33 212 ±9
(4) (5)tt (5)** (4) lisosomal:
- catepsina B 100 ±8 106 ±6 113 ± 3 65 ±6
(4) (5) (5) (5) ttt***
Teniendo en cuenta el incremento en Ia actividad del proteasoma previamente descrito en músculo esquelético de ratones portadores de tumor (cfr. Whitehouse A.S. et al., "Mechanism of attenuation of skeletal muscle protein catabolism in cáncer cachexia by eicosapentaenoic acid" Cáncer Res. 2001 , vol.61 , pp.3604-9), se decidió comprobar si el formoterol también era capaz de revertir esta actividad en músculo esquelético de ratas portadoras de tumor. Se midió Ia actividad catalítica predominante (actividad similar a Ia quimotripsina) en músculo gastrocnemius de ratas portadoras del tumor Yoshida AH-130. Los resultados obtenidos muestran una disminución de Ia actividad del proteasoma tanto en ratas no portadoras (64%) como en portadoras de tumor (47%) tratadas con formoterol (cfr. TABLA 3).
La TABLA 3 muestra Ia actividad del proteasoma en homogenados de músculo esquelético de ratas portadoras de tumor. Las actividades, expresadas como nkatal/mg de proteína referida al acervo de proteína total, fueron calculadas usando amidocumarina libre como estándar de trabajo. El resultado final es Ia diferencia entre los nkatales obtenidos con y sin Ia presencia de 25 μM lactacistina, un inhibidor específico del proteasoma. Los símbolos son como en Ia TABLA 1. TABLA 3
Grupo experimental Tratamiento Actividad del proteasoma
Control Ninguno 13.3 + 2.5 (3) Formoterol 4.8 ± 1.4 (3) *
Tumor Ninguno 20.3 ± 4.7 (3)
Formoterol 10.7 ± 2.4 (5)
Otro aspecto que se evaluó fue Ia apoptosis muscular durante el cáncer. Los resultados presentados en Ia FIG. 2 muestran que el crecimiento tumoral está asociado a una tasa incrementada de apoptosis tanto si es determinada como fragmentación del DNA (68%) (cfr. FIG. 2A y 2B) y como activación de Ia caspasa-3 (59%) (cfr. FIG. 2C). El tratamiento con formoterol abolió completamente Ia incrementada tasa de apoptosis muscular (cfr. FIG. 2A, 2B y 2C).
Los resultados mostrados en Ia TABLA 4 muestran que ninguno de los factores de transcripción estudiados (NF-κB, AP-1 y C/EBP) estuvieron involucrados en el desarrollo del desgaste muscular durante el crecimiento tumoral.
La TABLA 4 muestra Ia actividad de unión al DNA de NF-κB, AP-1 y C/EBP en músculos tibialis de ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. La unión al DNA de NF-κB, AP-1 y C/EBP fue determinada en extractos nucleares de músculo tibialis. Las autoradiografías fueron sometidas a densitometría de barrido. Los símbolos son como en Ia TABLA 1.
TABLA 4
C C+F TB TB+F Factor de transcripción
NF-κB 100 ± 7 (4) 118 + 7 (5) 100 ± 16 (4) 93 + 13 (5)
AP-1 100 ± 14 (4) 85 + 8 (5) 112 ± 10 (5) 105 ± 12 (4)
C/EBP 100 ± 20 (4) 128 + 13 (4) 122 ± 20 (4) 107 ± 13 (5)
La expresión génica tanto de Ia UCP2 como de Ia UCP3 estaba incrementada en el músculo esquelético como consecuencia del crecimiento del tumor. Así, el contenido de ARNm de Ia UCP2 en el músculo gastrocnemius se elevó 3 veces, mientras que el de Ia UCP3 se incrementó 5 veces. Cuando las ratas portadoras del tumor recibieron formoterol, esta activación disminuyó significativamente en Ia expresión de Ia UCP2 y se observó una gran tendencia en Ia expresión de Ia UCP3 (cfr. TABLA 5).
La TABLA 5 muestra Ia expresión génica (ARNm) de las proteínas desacopladoras (UCP2 y UCP3) en músculos gastrocnemius de ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. Ésta fue detectada después de Ia hibridación con sondas de ADNc. La corrección de carga se hizo con blots con Ia sonda de Ia subunidad ribosomal 18S de rata. Las autorradiografías fueron sometidas a densitometría de barrido. Los símbolos son como en Ia TABLA 1.
TABLA5 C C+F TB TB+F
UCP2 100 ± 14 106:t7 317± 56 212±31
(3) (5) (4)* (5)(p=0,1)
UCP3 100 ± 11 84± 18 573± 66 352±41
(4) (4) (4)*** (4)t
Efecto directo del formoterol en incubaciones de músculo
La disección y aislamiento de los músculos EDL fue llevada a cabo bajo anestesia con una mezcla de ketamina/xilacina. Los músculos aislados fueron fijados a un clip de acero inoxidable con el fin de mantener al músculo bajo una ligera tensión (haciéndola comparable a Ia longitud en reposo) durante Ia incubación. Tales músculos son capaces de mantener concentraciones normales de ATP y fosfocreatina durante un periodo de incubación de 3 horas. Los músculos fueron incubados en un baño de agua termostatizado con agitación a 35 0C durante 3 horas en 2 mi de salino fisiológico Krebs-Henseleit pH 7,4, conteniendo 5 mM glucosa y 20 mM HEPES. Después de Ia adición de los músculos a los viales, Ia incubación comenzó con una tasa de agitación de 45 ciclos/min. Los viales fueron gaseados con O2/CO2 19:1 durante el periodo completo de incubación. Los músculos fueron preincubados durante 60 minutos: 30 minutos en tampón Krebs Henseleit y 30 minutos en un medio suplementado que contenía 10"4 M formoterol, 10"4 M clenbuterol o nada, y entonces incubados durante 120 minutos en medio suplementado fresco.
La degradación proteica total por los músculos aislados fue calculada como Ia tasa de tirosina liberada en las dos últimas horas de incubación en el medio en presencia de 0,5 mM cicloheximida con el fin de bloquear Ia reincoporación de tirosina en las proteínas del tejido. La tirosina fue medida fluorimétricamente. El análisis estadístico de los datos fue llevado a cabo por medio del test de Ia t de Student. Como puede verse en TABLA 6, el formoterol disminuyó un 20% Ia tasa de degradación proteica (medida como Ia liberación de tirosina en el medio de incubación), confirmando que Ia acción de Ia molécula está basada en un descenso de Ia tasa proteolítica.
La TABLA 6 muestra las tasas proteolíticas en músculos EDL aislados de ratas control. Fueron medidas en presencia de cicloheximida (0,5 mM) y se expresan como nmoles/g y 2 horas y son media ± EEM para el número de animales indicados entre paréntesis. Significatividad estadística de los resultados (por el test de Ia t de Student); β2-agonista añadido versus nada ***p<0.001.
TABLA 6
Adiciones al medio de incubación tasa proteolítica ninguna 225 ± 8.9 (7) formoterol 180 + 5.6 (8) *** clenbuterol 176 + 4.4 (8) ***
Además, Ia tasa proteolítica fue también disminuida significativamente (12%) en ratas que habían sido previamente pretratadas durante seis días consecutivos con el β2-agonista (cfr. TABLA 7).
La TABLA 7 muestra las tasas proteolíticas en músculos EDL aislados de ratas a las que se administró un tratamiento de formoterol (2 mg/kg pe) durante seis días consecutivos previos al sacrificio. Las tasas fueron medidas en presencia de cicloheximida (0,5 mM) y están expresadas como nmoles/g y 2 horas. Significatividad estadística de los resultados (por el test de Ia t de Student): ratas tratadas versus controles *p<0.05. TABLA 7
Tratamiento Tasa proteolítica
Ninguno 182 + 7 (12) Ratas tratadas 159 + 5 (8) *
Además de los efectos sobre Ia tasa de degradación proteica en músculos de rata incubados, tanto el formoterol como el clenbuterol influyeron Ia tasa de síntesis proteica, Ia cual fue incrementada un 20% tanto por el formoterol como por el clenbuterol (cfr. TABLA 8). La tasa de síntesis de proteína total en músculos aislados se evaluó como se ha descrito previamente (cfr.
García-Martínez C. et al., "lnterleukin-6 does not actívate protein breakdown in rat skeletal muscle" Cáncer Lett. 1994, vol. 76, pp. 1-4). Estos resultados están de acuerdo con observaciones similares realizadas en estudios previos que implicaron β2-agonistas en músculos de rata incubados (cfr. Rehfeldt C. et al., "The effect of the beta-adrenergic agonist clenbuterol on the growth of skeletal muscles of rats" Arch. Tieremahr 1994, vol. 45, pp. 333-44).
La TABLA 8 muestra Ia tasa de síntesis proteica en músculos EDL aislados de ratas control. Las tasa sintéticas están expresadas como nmoles de
14 [ C]fenilalanina incorporada por g y 30 min. Significatividad estadística de los resultados (por el test de Ia t de Student): β2-agonista añadido versus ninguna *p<0.05.
TABLA 8 Adiciones al medio de incubación Tasa de síntesis proteica Ninguna 7.82 ± 0.5 (6) Formoterol 9.36 ± 0.3 (7) * Clenbuterol 9.36 + 0.5 (9) *
Se demostró que un tratamiento combinado de formoterol (3 mg/kg peso corporal) y pentoxifilina, un inhibidor de Ia síntesis de Ia citoquina factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-α) (cfr. Combaret L. et al., "Manipulation of the ubiquitin-proteasome pathway in cachexia: pentoxifylline suppresses the activation of 2OS and 26S proteasomes in muscles from tumor-bearing rats" Mol Biol Rep 1999, vol. 26, pp.95-101) (10 mg/kg peso corporal) producía un efecto positivo en Ia recuperación de Ia masa muscular debida a Ia caquexia (TABLA 9). Este efecto se observó los diferentes días de crecimiento tumoral analizados (día 2, día 4 y día 7 después de Ia inoculación del tumor).
La TABLA 9 (A, B y C) muestra Ia ingesta de comida, los pesos de los tejidos y el crecimiento del tumor en las ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. La ingesta de comida es expresada en g y se refiere a Ia ingestión durante el periodo del experimento previo al sacrificio (2, 4 o 7 días después de Ia inoculación del tumor, TABLA 9A, 9B y 9C respectivamente). Los pesos de los tejidos están expresados como mg/100 g del peso corporal inicial. La carcasa (cuerpo sin órganos ni tumor) está expresada como g/100 d del peso corporal inicial. El contenido en células tumorales está expresado en millones de células. Los resultados son media ± EEM para el número de animales indicado entre paréntesis. C = control; F = tratados con formoterol; P = tratados con pentoxifilina; TB = portadores de tumor. Significatividad estadística de los resultados (por el test de Ia t de Student); C versus TB: *p<0.05, **p<0.01 , ***p<0.001 No tratados versus F: fP<0.05; ttP<0.01 , tttpθ.001.
TABLA 9A (dos días después de su inoculación)
C (4) C+F+P (5) TB (5) TB+F+P (5) ingesta de comida 35 ± 1 29 ± 1 32 ± 1 26 ± 1 ttt t peso del músculo:
- gastrocnemius 484 ±13 533 ± 11 503 ± 9 553 ± 17 t t
- tibialis 167 ± 6 185 ± 3 171 ± 4 183 ± 3 t t
- soleus 39 ± 2 44 ± 2 40 ± 1 43 ± 1
- EDL 39 ± 1 43 ± 1 40 ± 1 43 ± 1 t t
- corazón 410 ± 17 430 ± 20 351 ± 8 424 ± 10
** ttt peso de Ia carcasa 93 ± 1 93 ± 1 93 ± 1 92 ± 1 TABLA 9B (cuatro días después de su inoculación)
C (3) C+F+P (5) TB (7) TB+F+P (5) ingesta de comida 52 ±1 60 ±3 61 ±3 65 ±3
+
T peso del músculo:
- gastrocnemius 590 ±16 597 ±14 517±9 594 ± 11
*** ttt
- tibialis 195 ±3 198 ±6 173 ±4 203 ±3
** ttt
- soleus 43 ±1 45 ±2 41 ±1 42 ±1
-EDL 46 ±1 46 ±1 40 ±1 46 ±1
- corazón 402 ±9 517 ±22 387 ±17 430 ±9 tt (p=0,08) ** peso de Ia carcasa 101 ±2 97 ±2 96 ±2 97 ±1 contenido de células tumorales — 1886 + 197 1059 + 435
TABLA 9C (siete días después de su inoculación)
C (4) C+F+P (5) TB (5) TB+F+P (6) ingesta de comida 123 ±1 148 ±1 98 ±3 84 ±1 ttt *** ttt*** peso del músculo:
- gastrocnemius 651 ±10 745 ±15 482 ± 22 596 ± 20 tt *** ***
- tibialis 235 ±6 247 ±3 161 ±5 188 ±8
***
- soleus 51 ±2 52 ±2 38 + 1 41 ±2
** **
-EDL 53 ±2 60 ±2 38 ±1 44 ±1 t ***
- corazón 430 ± 29 484 ± 23 330 ± 27 415 ±8
* * peso de Ia carcasa 107 ±8 99 ±4 89 + 6 95 ±1 contenido de células tumorales — — 3596 ± 531 3868 ±810
Se comprovó que el tratamiento con formoterol a distintas dosis (0.3, 1 , 3 y 10 mg/kg peso corporal) era similar, por Io que ya a dosis muy bajas, su efecto anticaquéctico era patente (TABLA 10).
La TABLA 10 muestra Ia ingesta de comida, los pesos de los tejidos y el crecimiento del tumor en las ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. La ingesta de comida es expresada en g y se refiere a Ia ingestión media diaria. Los demás parámetros se expresan igual que en Ia TABLA 9. F = tratados con formoterol; TB = portadores de tumor. Significatividad estadística de los resultados (por el tes t de Ia t de Student); No tratados versus F: tP<0.05; ftpθ.01, tttP<0.001.
TABLA 10
TB TB + F 0.3 TB + F 1 TB + F 3 TB + F 10
(6) (5) (4) (5) (5) ingesta de comida 14± 1 11 ±1 8±1 9±1 10 ± 1 ttt ttt ttt peso del músculo:
- gastrocnemius 486 ±7 563 ± 23 518 ±34 557 ±15 537 ±5 tt ttt ttt
- tibialis 154 ±3 172 ±7 166 ±6 161 ±5 159 ±5
T
- soleus 35 ± 1 37 ±1 33 ±2 37 ±2 37 ±2
-EDL 36 ± 1 41 ±1 39 ±2 38 ±1 40 ±1 tt t
- corazón 278 ±6 322 ±9 320 ±13 341 ± 12 351 ±11 tt tt ttt ttt peso de Ia carcasa 78 ± 1 81 ±2 77 ±2 80 ±1 77 ±1 células tumorales 3842 : ± 251 3294 ± 2723 644 ± 356 3787 ± 424 3675 ±146
Con los resultados del apartado anterior se decidió estudiar el efecto del formoterol a dosis bajas (0.3 mg/kg peso corporal) sobre Ia caquexia cancerosa en los distintos días de crecimiento tumoral (día 2, día 4 y día 7 después de Ia inoculación del tumor) confirmando de este modo que el efecto de este agonista β2-adrenérgico es efectivo también a dosis bajas (TABLA 11 A, B y C).
La TABLA 11 (A, B y C) muestra Ia ingesta de comida, los pesos de los tejidos y el crecimiento del tumor en las ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. Todos los parámetros se expresan igual que en Ia TABLA 9. TABLA 11 A (dos días después de su inoculación)
C (5) C+F (5) TB (7) TB+F (7) ingesta de comida 38 ±1 34 ±1 36 ±1 35 ±1 ttt * peso del músculo:
- gastrocnemius 540 ±12 563 ±18 523 + 9 539 ±8
4 t-
- tibialis 177 ±3 186 ±5 179 ±5 182 ±4
- soleus 41 ±2 45 + 2 39 ±2 40 ±1
*
-EDL 45 ±3 50 ±2 44 ±1 49 ±1 t
- corazón 366 ± 11 426 ±6 377 + 11 403 ±10 tt (P=O.1) peso de Ia carcasa 90 ±1 92 ±1 89 ±1 88 ±1
TABLA 11B (cuatro días después de su inoculación)
C (5) C+F (5) TB (7) TB+F (7) ingesta de comida 75 ±1 71 ±1 69 ±2 65 ±1 tt ** peso del músculo:
- gastrocnemius 583 ±9 629 ±9 553 ±6 598 ±16 tt * tt
- tibialis 191 ±3 210±5 181 ±4 199 ±4 t t
- soleus 44 ±1 43 ±2 41 ±1 43 ±1
-EDL 48 ±1 52 ±1 46 ±1 51 ±2 t t
- corazón 396 ±7 431 ±5 369 ±6 417 ±18 tt * t peso de la carcasa 102 ±1 106 ±1 94 ±1 97 ±1 tt *** *** contenido de células 1 :umorales — — 1346 ±224 1065 ±95
TABLA 11C (siete días después de su inoculación)
C (5) C+F (5) TB (6) TB+F (7) ingesta de comida 133 ± 1 131 ± 2 106 ± 1 108 ± 1
*** *** peso del músculo:
- gastrocnemius 718 ±10 759 ± 16 505 ± 17 611 ± 18 t ***
- tibialis 236 ± 6 266 ± 5 171 ± 5 200 ± 9 ttt ***
- soleus 52 ± 2 52 ± 2 41 ± 3 44 ± 1
** **
- EDL 59 ± 2 60 ± 2 42 ± 2 51 ± 2
*** t *
- corazón 449 ± 6 504 ± 10 372 ± 19 403 ± 9 tt ** *** peso de Ia carcasa 118 ± 1 124 ± 2 88 ± 3 94 ± 3 t *** (p=0.1) *** contenido de células tumorales — — 3386 ± 163 2871 ± 271
La regeneración muscular es un proceso que implica Ia activación de las células satélite, precursoras del músculo las cuales se encuentran adyacentes a las fibras musculares. Se provocó daño muscular inyectando intramuscularmente bupivacaina (inyección única, 0,5%), compuesto que una vez realizado el daño estimula Ia regeneración muscular, y se comprovó además el efecto de dos tratamientos con formoterol (0,3 mg/kg peso corporal): 7 o 14 días de tratamiento. En Ia TABLA 12 se observa el efecto anabólico de los tratamientos con formoterol sobre el músculo tibialis que fue dañado previamente con bupivacaina.
La TABLA 12 muestra los pesos de los músculos tibialis que fueron inyectados con bupivacaina y que posteriormente se trataron con formoterol durante 7 y 14 días. Los pesos de los músculos están expresados como mg/100 g del peso corporal inicial. Los resultados son media ± EEM para el número de animales indicado entre paréntesis. C = control; F = tratados con formoterol; B = tratados con bupivacaina, d7 = 7 días de tratamiento, d14 = 14 días de tratamiento. Significatividad estadística de los resultados (por el test de Ia t de Student); C versus tratados: *p<0.05, **p<0.01. Bupivacaina versus formoterol: t<0.05. TABLA 12
C (4) C+ B (4) C + B+ F d7 (3) C + B+ F d14 (4)
- tibialis 249 ± 4 265 ± 4 297 ± 13 304 ± 10 ! *J_ t
Ya que el efecto del tratamiento con formoterol Indicó que existía una recuperación del peso del músculo superior a Ia provocada por el propio inductor del daño y posterior estimulación de Ia regeneración muscular (bupivacaina), se estudió el comportamiento de algunos genes marcadores de Ia regeneración muscular: genes que se expresan durante Ia activación de Ia células satélites, como es el gen Pax-7 (marcador de una activación temprana) y Ia miogenina (marcador de Ia diferenciación tardía). Los resultados se detallan en Ia TABLA 13.
La TABLA 13 muestra Ia expresión génica de dos marcadores de Ia activación de las células satélites: Pax-7 y miogenina. Los resultados son media + EEM para el número de animales indicado entre paréntesis. C = control; F = tratados con formoterol; B = tratados con bupivacaina, d7 = 7 días de tratamiento, d14 = 14 días de tratamiento. Significatividad estadística de los resultados (por el test de Ia t de Student); C versus tratados: *p<0.05, **p<0.01. Bupivacaina versus formoterol: t<0.05.
TABLA 13
C (3) C+ B (3) C + B+ F d7 (3) C + B+ F d14 (3)
- Pax-7 100 ± 11 105 ± 11 147 ± 10 203 ± 4 t tt
- Miogenina 100 ± 36 142 ± 77 131 ± 49 190 ± 58
Efecto del tratamiento con formoterol en ratones portadores del carcinoma pulmonar de Lewis
El tratamiento con formoterol no alteró el peso del tumor sólido de los huéspedes portadores del modelo del carcinoma pulmonar de Lewis, ni tampoco Ia comida (controles y portadores de tumor). La hipofagia presente durante el crecimiento del tumor persistió invariable en los animales tratados (TABLA 14). En el modelo del carcinoma pulmonar de Lewis Ia presencia del tumor indujo un gran descenso en el peso de los músculos (13% para gastrocnemius, 21 % para tibialis y 18% para soleus) (TABLA 14). El tratamiento con formoterol incrementó significativamente los pesos de los músculos gastrocnemius (19%), tibialis (13%) y soleus (28%) en los animales no portadores de tumor. Interesantemente, el tratamiento con formoterol tuvo un significativo efecto protector sobre los pesos de los músculos esqueléticos -gastrocnemius (11 %), tibialis (11 %) y soleus (56%)- y en el músculo cardiaco (24%) en los animales portadores de tumor. Con respecto a los tejidos adiposos, el crecimiento del tumor causó grandes reducciones en Ia masa de tejido adiposo blanco en el modelo del carcinoma pulmonar de Lewis (76%). Una situación similar fue observada para el tejido adiposo marrón (39%). En el modelo del carcinoma pulmonar de Lewis, el formoterol no alteró Ia masa de tejido adiposo blanco ni en los animales control ni en los portadores del tumor, pero indujo un incremento en Ia masa del tejido adiposo marrón tanto en los controles como en los portadores de tumor (TABLA 14).
La TABLA 14 muestra Ia ingesta de comida, los pesos de los tejidos y el crecimiento tumoral en ratones portadores del carcinoma pulmonar de Lewis. La ingesta de comida está expresada en g y se refiere a Ia ingestión durante el periodo del experimento previo al sacrificio, que tuvo lugar 15 días después de Ia inoculación del tumor. Los pesos de los tejidos están expresados como mg/100 g de peso corporal inicial. La carcasa está expresada como g/100 g de peso corporal inicial. El peso del tumor está expresado en g. Los símbolos son como en Ia TABLA 1.
TABLA 14
C (7) C+F (6) TB (S) TB+F (7) ingesta de comida 46 ± 1 53 + 4 51 ± 3 53 ± 2 peso del músculo:
- gastrocnemius 563 ± 4 669 ± 13 492 ± 9 548 ± 13 ttt *** tt ***
- tibialis 192 ± 2 217 ± 4 152 ± 3 169 ± 3 ttt ***
- soleus 28 ± 1 36 + 1 23 ± 2 36 ± 2 ttt * ttt
- EDL 40 ± 1 42 + 2 35 ± 2 40 ± 2
- corazón 432 ± 15 462 ± 31 401 ± 17 496 ± 40 t peso del tejido adiposo:
- blanco (dorsal) 238 ±18 217 ± 25 58 ± 12 68 ± 9
*** ***
- marrón (interescapular) 208 ±12 249 ± 6 127 ± 5 153 ± 13 t *** peso de Ia carcasa 80 ± 1 87 ± 1 69 ± 1 73 ± 2 ttt *** *** peso del tumor — — 4.26 ± 0.3 4.58 ± 0.3
Como se muestra en TABLA 15, los ratones portadores del tumor mostraron una expresión incrementada para los genes de Ia poliubiquitina en relación con los correspondientes animales control: más de 2 veces (2,4 kb) y 3 veces (1 ,2 kb) (FIG. 3). Cuando los ratones portadores del tumor recibieron formoterol, esta activación fue suprimida (TABLA 15). Interesantemente, resultados similares fueron hallados para Ia subunidad C8 y C9 del proteasoma, cuya expresión estuvo incrementada significativamente como resultado del crecimiento del tumor, y el tratamiento con formoterol suprimió esta activación de Ia expresión génica (TABLA 15 y FIG. 3). Con respecto a los otros sistemas proteolíticos, el crecimiento del tumor también resultó en un incremento en Ia expresión del sistema m-calpaína dependiente de calcio (2 veces), pero el tratamiento con formoterol no suprimió esta activación en el modelo del carcinoma pulmonar de Lewis (TABLA 15 y FIG. 3). Finalmente, el ligero incremento en el contenido de ARNm observado en los ratones portadores del carcinoma pulmonar de Lewis en Ia catepsina B lisosomal no fue revertido por el tratamiento con formoterol (TABLA 15 y FIG. 3).
La TABLA 15 muestra Ia expresión génica (ARNm) de los diferentes sistemas proteolíticos en músculos gastrocnemius de ratones portadores del carcinoma pulmonar de Lewis. Ésta fue detectada después de Ia hibridación con sondas de ADNc. La corrección de carga se hizo con blots con Ia sonda de Ia subunidad ribosomal 18S de rata. Las autorradiografías fueron sometidas a densitometría de barrido. Los símbolos son como en Ia TABLA 1.
TABLA 15 sistema proteolítico C C+F TB TB+F dependiente de ubiquitina:
- ubiquitina 2.4 kb 100 ± 9 50 ± 9 227 ± 59 90 ± 21
(5) (5) tt (4) * (β) tt
- ubiquitina 1.2 kb 36 ± 3 25 ± 5 113 ± 14 27 ± 5
(5) (5) (4) *** (6) ttt
- sub. C8 proteasoma 100 ± 8 116 ± 9 177 ± 11 129 ± 12
(5) (5) (5) *** (6)t
- sub. C9 proteasoma 100 ± 10 114 ± 7 145 ± 3 101 ± 12
(5) (4) (5) ** (5) tt dependiente de calcio:
- m-calpaína 100 ± 21 136 ± 20 222 ± 27 254 ± 33
(5) (5) (5) *** (7) * lisosomal:
- catepsina B 100 ± 14 137 ± 6 157 ± 11 161 ± 18
( 5 ) ( 3 ) ( 5 ) * ( 7 )
La expresión génica de tanto Ia UCP2 como Ia UCP3 estaba incrementada en el músculo gastrocnemius como consecuencia del crecimiento del tumor pulmonar de Lewis. En el músculo gastrocnemius el contenido de ARNm de Ia UCP2 estuvo elevado 3 veces, mientras que el de Ia UCP3 estuvo incrementado 2 veces (sin alcanzar significatividad). Cuando los ratones portadores de tumor recibieron formoterol, esta activación fue suprimida en Ia expresión de ambos genes (TABLA 16).
La TABLA 16 muestra Ia expresión génica (ARNm) de las proteínas desacopladoras (UCP2 y UCP3) en músculos gastrocnemius de ratones portadores del carcinoma pulmonar de Lewis. Ésta fue detectada después de Ia hibridación con sondas de ADNc. La corrección de carga se hizo con blots con Ia sonda de Ia subunidad ribosomal 18S de rata. Las autorradiografías fueron sometidas a densitometría de barrido. Los símbolos son como en Ia TABLA 1. TABLA 16
C C+F TB TB+F
UCP2 100 ±25 102 ±17 310 ±37 175 ±21
(4) (6) (5)** (7)t UCP3 100 ±11 94 ± 10 174 ±28 102 ±13
(3) (5) (4) (P=O1OS) (6)t

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso del formoterol o una sal farmacéuticamente aceptable, o un solvato farmacéuticamente aceptable de cualquiera de ellos, para Ia preparación de un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico del desgaste muscular y/o de un síndrome caquéctico, ambos asociados a un estado catabólico en mamíferos, incluyendo humanos.
2. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es Ia enfermedad de Crohn.
3. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es cáncer.
4. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es el síndrome de Ia inmunodeficiencia adquirida.
5. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es una infección.
6. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es Ia diabetes.
7. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es un estado de inmobilización.
8. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es una quemadura severa.
9. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es debido a Ia ingravidez.
10. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es Ia vejez.
11. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es Ia enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
12. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es una patología cardiovascular.
13. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es una patología hepática.
14. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es Ia artritis reumatoide.
15. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es un desorden nutricio na I.
16. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es Ia acidosis.
17. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es una enfermedad neuromuscular.
18. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es Ia enfermedad de Alzheimer.
19. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es el hiperadrenocortisolismo.
20. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es el hipertiroidismo.
21. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es el síndrome de Cushing.
22. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es una atrofia y/o una distrofia muscular.
23. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es Ia colitis ulcerosa.
24. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es el síndrome de Ia fatiga crónica.
25. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es el fallo renal.
26. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado catabólico es Ia cirrosis hepática.
27. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-26, donde el compuesto utilizado es el fumarato de formoterol o el fumarato de formoterol dihidrato.
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