ES2245612A1

ES2245612A1 - Nuevo uso terapeutico del formoterol.

Info

Publication number: ES2245612A1
Application number: ES200401941A
Authority: ES
Inventors: Jose Maria Argiles Huguet; Fco. Javier Lopez Soriano; Silvia Busquets Rius
Original assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Universitat de Barcelona UB
Current assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Universitat de Barcelona UB
Priority date: 2004-06-29
Filing date: 2004-06-29
Publication date: 2006-01-01
Anticipated expiration: 2024-06-29
Also published as: CY1109771T1; WO2006003222A1; PL1818052T3; EP1818052B1; ES2336229T3; ES2245612B1; WO2006003222A9; PT1818052E; EP1818052A1; DK1818052T3; DE602005017659D1; ATE447944T1

Abstract

Nuevo uso terapéutico del formoterol. El formoterol, utilizado hasta ahora para el tratamiento del broncoespasmo asociado a asma, exhibe una potente eficiencia anti-caquéctica con relativamente bajos efectos secundarios adversos y toxicidad. Así, la invención se refiere al uso del formoterol o sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, particularmente fumarato o fumarato dihidrato, para la preparación de un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico del desgaste muscular y/o un síndrome caquéctico, ambos asociados a un estado catabólico en un mamífero, en particular un humano. Algunos estados catabólicos que se pueden tratar con formoterol son cáncer, el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA), infecciones, diabetes, estados de inmobilización o distrofias musculares.

Description

Nuevo uso terapéutico del formoterol.

Esta invención está relacionada con el campo de la medicina humana, y específicamente con un nuevo uso de un compuesto para el tratamiento de determinadas enfermedades o estados humanos.

Estado de la técnica anterior

La manifestación quizás más común de la enfermedad maligna avanzada es el desarrollo de caquexia cancerosa. Efectivamente, la caquexia se presenta en la mayoría de pacientes cancerosos, y es responsable de la muerte del 22% de los pacientes con cáncer. Además del cáncer, la caquexia está asociada a otras enfermedades o estados tales como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), traumatismos o sepsis. Las anormalidades asociadas con la caquexia incluyen anorexia, pérdida de peso, pérdida y atrofia de músculo, anemia y alteraciones en el metabolismo de glúcidos, lípidos y proteínas (cfr. Argilés J.M. et al., "The metabolic basis of cáncer cachexia", Med. Res. Rev. 1997, vol. 17, pp. 477-98). El grado de caquexia está inversamente correlacionado con el tiempo de supervivencia del paciente y siempre implica una mala prognosis. Una de las características más relevantes de la caquexia es la astenia (es decir, falta de fuerza muscular), que refleja el importante desgaste muscular que tiene lugar en el paciente canceroso caquéctico. La astenia también se caracteriza por una debilidad general así como por fatiga física y mental. Además, la disminución de la masa corporal magra es una de las principales tendencias de la caquexia e implica no sólo al músculo esquelético sino que también afecta a las proteínas cardiacas, dando lugar a importantes alteraciones en las funciones del corazón.

Se han propuesto varias estrategias para tratar la caquexia, aunque sólo unas pocas han llegado a nivel clínico con resultados positivos. Sin embargo, la mayoría de éstas muestran problemas derivados de su utilización. Entre las drogas anticaquécticas más ampliamente utilizadas están varios derivados sintéticos de la progesterona (p.ej. acetato de megestrol y medroxiprogesterona), que son capaces de mejorar el apetito y la ganancia de peso, aunque el incremento observado en la masa corporal es debido principalmente a un incremento en la masa grasa y a retención de agua, sin efectos significativos en el índice de Karnofsky (una medida del nivel de actividad para pacientes de cáncer). El cannabinoide dronabinol es capaz de mejorar la caquexia tanto en pacientes de cáncer como de SIDA, aunque muchos de ellos experimentan efectos secundarios como euforia, mareos, somnolencia y confusión. La insulina ha sido usada como un estimulador del apetito (con el fin de mejorar la anorexia), pero se ha demostrado que está asociada a un incremento en el peso del tumor. Los corticosteroides (p.ej. dexametasona o prednisolona), cuando se usan en tratamientos prolongados, parecen ocasionar debilidad, delirio, osteoporosis e inmunosupresión, y no parecen tener ningún efecto significativo sobre la reducción de la mortalidad. El clenbuterol es otro compuesto que ha mostrado algunos efectos anticaquécticos, aunque su toxicidad en humanos y animales (especialmente sus efectos negativos sobre el corazón) no han permitido la realización de pruebas clínicas (cfr. Carbó N. et al.,"Comparative effects of beta2-adrenergic agonists on muscle waste associated with tumor growth", Cancer Lett. 1997, vol. 115, pp. 113-8; Hoffman, R.J. et al., "Clenbuterol ingestion causing prolonged tachycardia, hypokalemia, and hypophosphatemia with confirmation by quantitative levels", J. Toxicol. Clin. Toxicol. 2001, vol. 39, pp. 339-44). El uso de anticuerpos y receptores solubles de citoquinas es una aproximación prometedora para tratar la caquexia, pero estos tratamientos son demasiado caros porque requieren un número muy grande de moléculas con el fin de bloquear completamente la acción de las citoquinas. Lo mismo sucede con el uso de citoquinas anti-inflamatorias. El uso de esteroides anabolizantes (p.ej. nandrolona y oximetolona) tiene importantes efectos secundarios adversos tales como la masculinización, la retención de fluidos y la toxicidad hepática. Se ha utilizado el sulfato de hidracina como droga anticaquéctica, pero tiene algunos problemas derivados de su toxicidad (cfr. Argilés J.M. et al.,"Cancer cachexia: a therapeutic approach", Med. Res. Rev. 2001, vol. 21, pp. 83-101).

Así, es muy deseable proporcionar nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de la caquexia y el desgaste muscular. En particular, es deseable tener nuevos agentes terapéuticos con una gran eficiencia anti-caquéctica y consecuencias no tóxicas.

Explicación de la invención

Los inventores han encontrado sorprendentemente que el formoterol, utilizado hasta ahora para el tratamiento del broncoespasmo asociado a asma, exhibe una potente eficiencia anti-caquéctica con relativamente bajos efectos secundarios adversos y baja toxicidad.

El formoterol es un compuesto racémico que tiene la fórmula química que se adjunta (se muestra la estereoquímica relativa de uno de los dos enantiómeros) y es un potente agonista \beta_{2}-adrenérgico selectivo que combina las ventajas clínicas de un rápido inicio de la acción y una larga duración de la acción. Este compuesto se utiliza en humanos para el tratamiento del broncoespasmo asociado a asma. In vitro el formoterol es un potente relajante del músculo liso por vía aérea con alta eficacia y muy alta afinidad y selectividad por el receptor \beta_{2}-adrenérgico. Además de la relajación del músculo liso por vía aérea, el formoterol inhibe una variedad de procesos inflamatorios agudos en modelos animales, incluyendo la activación de eosinófilos y la infiltración de las vías aéreas, los derrames microvasculares, y la liberación inducida por antígeno de mediadores desde el pulmón en humanos. Asimismo, el formoterol relaja el músculo liso bronquial y también proporciona importantes beneficios clínicos en pacientes sintomáticos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD). El formoterol, como otros agonistas \beta_{2}-adrenoceptor de larga actuación, atenua la reacción asmática inducida por alérgeno y, bajo ciertas condiciones, tiene más efecto que otros receptores \beta_{2}-adrenérgicos tales como el salbutamol y el salmeterol (cfr. Linden A. et al., "Salmeterol, formoterol and salbutamol in the isolated guinea pig trachea: differences in maximum relaxant effect and potency but not in functional antagonism" Thorax 1993, vol. 48, pp. 547-53).

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La presente invención se refiere al uso del formoterol o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un solvato farmacéuticamente aceptable de cualquiera de ellos, para la preparación de un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico del desgaste muscular y/o de un síndrome caquéctico, ambos asociados a un estado catabólico en un mamífero, en particular un humano. El término "estado catabólico" como se usa aquí, se refiere a una situación patofisiológica en la que las rutas catabólicas están activadas. Ejemplos de rutas catabólicas son la glicogenólisis hepática, la lipólisis del tejido adiposo, la proteólisis del músculo esquelético y la termogénesis. Así, la invención se refiere a un método de tratamiento de un paciente que sufre de desgaste muscular y/o de un síndrome caquéctico, ambos asociados a un estado catabólico en un mamífero, en particular un humano, que comprende la administración de una dosis terapéuticamente aceptable de formoterol o de sus sales y/o solvatos farmacéuticamente aceptables, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, se usa el fumarato de formoterol, como tal o como dihidrato, para estas indicaciones.

El formoterol ejerce una acción selectiva, potente y protectora sobre el corazón y el músculo esquelético mediante antagonismo de la degradación aumentada de proteínas que caracteriza la caquexia en cáncer. Así, al contrario de lo que se encuentra con otros agonistas \beta_{2} que tienen numerosos efectos secundarios adversos y una toxicidad considerable, el formoterol es un agente terapéutico conveniente en estados patológicos donde el hipercatabolismo de proteína muscular es un aspecto crítico, como es el caso de la caquexia en cáncer u otras enfermedades asociadas al desgaste muscular.

En realizaciones particulares de la invención, el formoterol o sus sales y/o solvatos farmacéuticamente aceptables pueden usarse para el tratamiento del desgaste muscular o el síndrome caquéctico asociado a cáncer, el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA), sepsis, diabetes, estados de inmobilización, quemadas severas, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la vejez, patologías cardiovasculares, patologías hepáticas, artritis reumatoide, desórdenes nutricionales, acidosis, enfermedades neuromusculares, la enfermedad de Alzheimer, hiperadrenocortisolismo, hipertiroidismo, el síndrome de Cushing, atrofias y distrofias musculares, colitis ulcerosa, el síndrome de la fatiga crónica, el fallo renal, la cirrosis hepática, la enfermedad de Crohn y un estado de desgaste muscular debido a la ingravidez.

El tratamiento con formoterol tiene un claro efecto protector para el músculo esquelético y el corazón, en términos de peso de tejido húmedo. Luego, el formoterol proporciona una significante acción trófica también en músculos de individuos no portadores de cáncer, particularmente en el músculo gastrocnemius, tibialis, extensor digitorium longus (EDL) y cardíaco, mientras que el músculo soleus no queda significativamente afectado. Respecto a los tejidos adiposos, el tratamiento con formoterol induce un incremento en el peso del tejido adiposo marrón. Además, el tratamiento con formoterol no altera ni el peso del tumor sólido ni la ingesta de comida.

Dependiendo de las circunstancias, un experto en la materia seleccionará una apropiada vía de administración del formoterol o de sus sales y/o solvatos farmacéuticamente aceptables, tales como oral, nasal, parenteral, subcutánea, tópica, etc. El experto en la materia también escogerá un sistema de liberación adecuado para la vía de administración seleccionada.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El resumen de esta solicitud se incorpora aquí como referencia. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes modos de realización y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra el Northern blot de músculos gastrocnemius de ratas control (C), ratas tratadas con formoterol (C+F), ratas portadoras de tumor (hepatoma ascítico Yoshida AH-130) (TB) y ratas portadoras de tumor tratadas con formoterol (TB+F). La expresión de los mARN de la ubiquitina (Ub), la subunidad C8 del proteasoma (C8), la m-calpaína (m-cal) y la catepsina B (catB) en gastrocnemius fue detectada después de la hibridación con sondas de ADNc. Se utilizó una sonda del rARN 18S (18S) para la cuantificación total y la corrección de la carga. Las autorradiografías fueron sometidas a densitometría de barrido.

La Fig. 2 muestra la apoptosis en músculos tibialis de ratas control (C), ratas tratadas con formoterol (C+F), ratas portadoras de tumor (hepatoma ascítico Yoshida AH-130) (TB) y ratas portadoras de tumor tratadas con formoterol (TB+F). Los resultados son medias \pm EEM de cinco animales por grupo. Fig. 2A y 2B: la fragmentación del DNA fue determinada por monitorización del "Iaddering" en un gel de agarosa. El porcentaje de fragmentación del DNA fue cuantificado por densitometría de barrido. El hígado de ratones tratados con anticuerpo anti-Fas fue utilizado como control positivo. Fig. 2C: la actividad caspasa-3 fue determinada por un ensayo colorimétrico, y los resultados están expresados en nmoles/hora. Significatividad estadística de los resultados (por el test de la t de Student); Fig. 2A: no tratados versus F: \dagger\daggerp<0.01; Fig. 2C: C versus TB: *p<0.05, no tratados versus F: \dagger\dagger\daggerp<0.001.

La Fig. 3 muestra el Northern blot de músculos gastrocnemius de ratones control (C), ratones tratados con formoterol (C+F), ratones portadores de tumor (carcinoma pulmonar de Lewis) (TB) y ratones portadores de tumor tratados con formoterol (TB+F). El procedimiento seguido y las abreviaturas son análogos a los de la Fig. 1.

Exposición detallada de modos de realización Animales y reactivos bioquímicos

Se utilizaron en los diferentes experimentos, ratas macho Wistar (Interfauna, Barcelona, España) que pesaban unos 110 g, y ratones C57B1/6 (Criffa, Barcelona, España), de unas 12 semanas de edad. Los animales se mantuvieron a 22 \pm 2ºC con un ciclo luz-oscuridad regular (luz encendida entre 08:00 a.m. y 08:00 p.m.) y tuvieron libre acceso a comida y agua. La dieta (B.K. Universal G.J./S.L., Sant Vicenç deis Horts, Barcelona, España) consistió en un 45,5-48,5% de carbohidratos (3,5% de glucosa absorbible, 42-45% de almidón), un 18,5% de proteína y 3,1% de grasa (el residuo fue material no digerible). Se midió la ingesta de comida diariamente. Todas las manipulaciones de los animales fueron hechas de acuerdo con las directrices de la Comunidad Europea para el uso de animales de laboratorio. Los reactivos bioquímicos fueron todos de calidad reactiva y obtenidos de Roche S.A. (Barcelona, España) o de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, Estados Unidos). Los productos radioquímicos fueron proporcionados por Amersham Int. (Amersham, Bucks., Reino Unido) y el fumarato de formoterol micronizado por Industriale Chimica s.r.l. (Saronno, Italia).

Inoculación del tumor y tratamiento

Hepatoma ascítico Yoshida AH-130: Este es un tumor de rata que crece exponencialmente durante 4-5 días y entra en fase estacionaria el día 7 después del transplante. Las ratas fueron divididas en dos grupos, controles y huéspedes del tumor. Estas últimas recibieron un inóculo intraperitoneal de 108 células del hepatoma ascítico Yoshida AH-130 obtenidas de tumores exponenciales. Ambos grupos fueron divididos posteriormente en tratados y no tratados, siendo administrados los primeros con una dosis intraperitoneal (i.p.) diaria de formoterol (2 mg/kg de peso corporal (bw), disuelto en solución fisiológica) y los últimos con el correspondiente volumen del disolvente. En el día 7 después del transplante del tumor, los animales fueron pesados y anestesiados con una inyección i.p. de una mezcla de ketamina/xilazina (3:1) (Imalgene® y Rompun® respectivamente). El tumor fue extraído de la cavidad peritoneal y se evaluó su volumen y celularidad. La sangre fue recogida de la aorta abdominal en tubos heparinizados y centrifugados (3500 g, 10 min, 4ºC) para obtener plasma. Los tejidos fueron extraídos rápidamente, pesados y congelados en nitrógeno líquido.

Carcinoma pulmonar de Lewis: Este es un modelo adecuado para estudiar los mecanismos implicados en el establecimiento de la caquexia. Este tumor ha sido descrito como un epidermoide anaplástico con una marcada tendencia hemorrágica, que regular, espontánea y consistentemente produce múltiples metástasis pulmonares. Su crecimiento causa en el huésped una rápida y progresiva pérdida de peso y desgaste tisular, particularmente en el músculo esquelético. Los ratones fueron divididos en dos grupos, controles y huéspedes del tumor. Los huéspedes del tumor recibieron un inóculo de 5 x 10^{5} células del carcinoma pulmonar de Lewis obtenidas de tumores exponenciales, dadas intramuscularmente (muslo izquierdo). El desarrollo de un nódulo en el lugar de la inyección, creciendo en tamaño hasta un 20% del peso del animal, fue considerado como un índice de la eficacia de la inoculación. Ambos grupos fueron divididos posteriormente en tratados y no tratados, siendo administrados los primeros, durante los últimos 9 días antes del sacrificio, con una dosis i.p. diaria de formoterol (2 mg/kg pc, disuelto en solución fisiológica) y los últimos con el correspondiente volumen del disolvente. En el día 15 tras el transplante del tumor, los animales fueron pesados y anestesiados con una mezcla de ketamina/xilazina (i.p.) (Imalgene® y Rompun® respectivamente). El tumor fue extirpado de la pata trasera y se determinó su masa. Las muestras de tejidos fueron rápidamente extraídas, pesadas y congeladas en nitrógeno líquido.

Aislamiento de ARN y análisis por Northern blot

El ARN total de músculo extensor digitorum longus (EDL) fue extraído usando el método del isotiocianato de guanidino/fenol/cloroformo. Las muestras de ARN (20 \mug) fueron desnaturalizadas, sometidas a electroforesis en geles de agarosa al 1,2% conteniendo 6,3% de formaldehído y transferidas a membranas de Hybond N (Amersham). El ARN fue fijado a la membrana por Genelinker. El ARN en los geles y en los filtros fue visualizado con bromuro de etidio y fotografiado por transiluminación UV para garantizar la integridad del ARN, comprobar la carga de cantidades equivalentes de ARN y confirmar que la transferencia había sido correcta. El ARN fue transferido en citrato salino estándar 20x (SSC; 0,15 M NaCl y 15 mM citrato sódico, pH 7,0). La hibridación fue a 65ºC durante toda la noche en el tampón de hibridación (0,25 M Na2HPO4/7% SDS/1 mM EDTA/1% BSA/10% sulfato de dextrano), y se añadieron las sondas marcadas desnaturalizadas (10^{6}-10^{7} cpm/ml). Las sondas radiomarcadas se prepararon por el método del cebador aleatorio (Amersham). La sonda de ubiquitina utilizada era un clon de ADNc que contenía 12 pares de la segunda secuencia codificadora de la ubiquitina más unas tercera y cuarta secuencias codificadoras completas y 120 pares de bases de la región 3'-no traducida del gen de la poliubiquitina de pollo UBI. Las membranas fueron también hibridadas con las sondas de ADNc que codifican para C8, la m-calpaína de rata y la catepsina B de rata. Los filtros fueron expuestos a Hyperfilm-MP (Amersham) a -80ºC durante 1-4 días y las películas cuantificadas por densitometría de barrido. El análisis estadístico de los datos fue realizado por medio del test de la t de Student.

Determinación de la actividad del proteasoma

La actividad similar a la quimotripsina del proteasoma muscular fue determinada evaluando la rotura del substrato fluorogénico específico succinil-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amido-4-metilcumarina (LLVY). El músculo gastrocnemius fue homogenizado en 20 mM TRIS-HCI pH 7,2 conteniendo 0,1 mM EDTA, 1 mM 2-mercaptoetanol, 5 mM ATP, 20% glicerol, y 0,04% (v/v) Tritón X-100. Los homogenados de músculos fueron centrifugados (13000 g, 15 min, 4ºC). Se recogió el sobrenadante y se determinó la concentración de proteínas usando el ensayo del BCA (Pierce Chemical Co.). Se incubaron alícuotas de 40 \mug de proteína durante 60 min a 37ºC en presencia de 40 \muM LLVY. El tampón de incubación para la evaluación de la actividad del proteasoma fue 50 mM HEPES pH 8,0 conteniendo 5 mM EGTA. La fluorescencia fue leída con un espectrofluorímetro (380 nm excitación y 460 nm emisión; RF-5001 PC spectrofluorophotometer, Shimadzu). La actividad, expresada en nkatal/mg proteína referida al acervo de proteína total, fue calculada usando amidocumarina libre como estándar de trabajo. El resultado final es la diferencia entre los nkatales obtenidos con y sin la presencia de 25 \muM lactacistina, un inhibidor específico del proteasoma.

Ensayos de apoptosis

El ensayo de la fragmentación del DNA en músculo tibialis se llevó a cabo tal como se ha descrito previamente (cfr. Van Royen M. et al., "DNA fragmentation occurs in skeletal muscle during tumor growth: a link with cancer cachexia?" Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000, vol. 270, pp. 533-7). La actividad caspasa-3 en músculo tibialis fue determinada usando el kit de ensayo colorimétrico de caspasa-3 BD Apoalert^{TM} (BD Biosciences Clontech, USA).

Análisis del cambio en la movilidad electroforética ("electrophoretic mobility shift analysis", EMSA)

Los extractos de proteína muscular de músculo tibialis fueron aislados tal como se ha descrito previamente (cfr. Blough E. et al., "Extraction of nuclear proteins from striated muscle tissue" Biotechniques 1999, vol. 26, pp. 202-4), y la concentración de proteína fue determinada por el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce, USA). Los oligonucleótidos correspondientes a las secuencias consenso a NF-\kappaB (factor nuclear kappa B), AP-1 (proteína activadora 1) y C/EBP (CCAAT/proteína aumentadora de unión) fueron marcadas en el extremo final usando [\alpha^{32}P]dCTP y enzima Klenow. Las dobles cadenas de oligonucleótidos marcadas (30.000 cpm) fueron incubadas durante 10 min en hielo con 150 \mug de extracto de proteína nuclear. Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 20 \mul conteniendo 12% glicerol, 12 mM Hepes (pH 7,9), 4 mM Tris-HCI (pH 7,9), 1 mM EDTA (pH 8), 1 mM ditiotreitol (DTT), 25 mM KCl, 5 mM MgCl_{2}, 40 \mug/ml poli dl-dC (ácido desoxiinosínico-desoxicitidílico) e inhibidores de proteasas (PMSF, aprotinina y leupeptina). Al final de la incubación, se sometieron las muestras a electroforesis a 4ºC a 325 V durante 60-80 min sobre un gel no desnaturalizante de poliacrilamida al 7% en 0,5x Tris-borato-EDTA. Después de la electroforesis, el gel se secó durante 120 min en un BioRad Gel Dryer y se expuso durante una noche a una película sensible a los rayos X (Hyperfilm-MP, Amersham Biosciences) a -80ºC con pantallas intensificadoras. La especificidad de las bandas de NF-\kappaB, AP-1 y C/EBP se confirmó por reacciones con oligonucleótidos mutantes marcados en el extremo final.

Efecto del tratamiento con formoterol en ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130

El número de células tumorales de los huéspedes portadores del modelo Yoshida AH-130 no fue afectado significativamente por el formoterol, así como tampoco la ingesta de comida (observada en portadores del tumor). La hipofagia presente durante el crecimiento del tumor permaneció invariable en los animales tratados (cfr. Tabla 1).

El patrón con respecto a los músculos esqueléticos y cardiaco fue totalmente diferente. Así, como se muestra en la Tabla 1, la implantación del hepatoma ascítico Yoshida AH-130 resultó en un descenso en el peso de los músculos (13% para gastrocnemius, 16% para tibialis, 11% para soleus, 19% para EDL y 11% para corazón). El tratamiento con formoterol resultó en un incremento en la mayoría de tipos musculares incluyendo gastrocnemius (28%), tibialis (25%), EDL (32%) y músculo cardiaco (21%) en el grupo control. En los animales portadores de tumor, el formoterol indujo un incremento en el peso de gastrocnemius (9%), tibialis (11%), EDL (16%) y corazón (11%), previniendo por tanto el desgaste muscular. El tratamiento con formoterol tuvo por lo tanto un claro efecto protector, en términos de peso fresco de tejido, para los músculos esqueléticos y para el corazón. Además, el formoterol tuvo también una significativa acción trófica sobre los músculos en los no portadores de tumor, particularmente sobre los músculos gastrocnemius, tibialis, EDL y cardiaco, mientras que el soleus no fue afectado significativamente. Con respecto a los tejidos adiposos, el crecimiento del tumor causó grandes reducciones en la masa de tejido adiposo blanco (46%). Una situación similar fue observada en el tejido adiposo marrón (53%). En el modelo tumoral de rata, el tratamiento con formoterol estuvo asociado con una tendencia hacia un descenso en la masa de tejido adiposo blanco tanto en los animales controles como en los portadores de tumor, aunque los resultados no alcanzaron significatividad estadística, mientras que indujo un incremento en el peso del tejido adiposo marrón (cfr. Tabla 1).

La Tabla 1 muestra la ingesta de comida, los pesos de los tejidos y el crecimiento del tumor en las ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. La ingesta de comida es expresada en g y se refiere a la ingestión durante el periodo del experimento previo al sacrificio (7 días después de la inoculación del tumor). Los pesos de los tejidos están expresados como mg/100 g del peso corporal inicial. La carcasa (cuerpo sin órganos ni tumor) está expresada como g/100 d del peso corporal inicial. El contenido en células tumorales está expresado en millones de células. Los resultados son media \pm EEM para el número de animales indicado entre paréntesis. C = control; F = tratados con formoterol; TB = portadores de tumor. Significatividad estadística de los resultados (por el test de la t de Student); C versus TB: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 No tratados versus F: \daggerp<0.05; \dagger\daggerp<0.01, \dagger\dagger\daggerp<0.001.

TABLA 1

2

La acelerada degradación de proteínas musculares tanto en los huéspedes del AH-130 como del carcinoma pulmonar de Lewis es básicamente debida a la activación del sistema proteolítico dependiente de ATP y ubiquitina. Así, se investigaron los efectos del formoterol sobre la expresión génica de los diferentes sistemas proteolíticos presentes en el músculo esquelético. Se estudió la expresión génica en el músculo gastrocnemius de las dos especies del mRNA de la poliubiquitina (2,4 kb y 1,2 kb) y de la subunidad C8 del proteasoma (ambas implicadas en la vía proteolítica dependiente de ATP y ubiquitina), la m-calpaína (sistema dependiente de calcio) y la catepsina B (sistema lisosomal). Como se muestra en Tabla 2, los animales portadores de tumor mostraron una expresión incrementada de los dos genes de la poliubiquitina en relación con los correspondientes animales control: por encima de 2 veces (2,4 kb) y de 6 veces (1,2 kb) (cfr. Fig. 1). Cuando los animales portadores de tumor recibieron formoterol, esa activación fue suprimida (cfr. Tabla 2). Interesantemente, se encontraron resultados similares para la subunidad C8 del proteasoma, cuya expresión fue incrementada significativamente como resultado del crecimiento del tumor, y el tratamiento con formoterol suprimió esta activación en la expresión génica (cfr. Tabla 2 y Fig. 1). Con respecto a otros sistemas proteolíticos, la presencia del tumor también resultó en un incremento en la expresión del sistema m-calpaína dependiente de calcio (3 veces) pero el tratamiento con formoterol no suprimió esta activación en este modelo tumoral (cfr. Tabla 2 y Fig.1). Finalmente, el tratamiento con formoterol disminuyó la expresión de la catepsina B lisosomal en las ratas portadoras de tumor (cfr. Tabla 2).

La Tabla 2 muestra la expresión génica (ARNm) de diferentes sistemas proteolíticos en músculos gastrocnemius de ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. Esta fue detectada después de la hibridación con sondas de ADNc. La corrección de carga se hizo con blots con la sonda de la subunidad ribosomal 18S de rata. Las autorradiografías fueron sometidas a densitometría de barrido. Los símbolos son como en la Tabla 1.

TABLA 2

3

Teniendo en cuenta el incremento en la actividad del proteasoma previamente descrito en músculo esquelético de ratones portadores de tumor (cfr. Whitehouse A.S. et al., "Mechanism of attenuation of skeletal muscle protein catabolism in cancer cachexia by eicosapentaenoic acid" Cancer Res. 2001, vol. 61, pp. 3604-9), se decidió comprobar si el formoterol también era capaz de revertir esta actividad en músculo esquelético de ratas portadoras de tumor. Se midió la actividad catalítica predominante (actividad similar a la quimotripsina) en músculo gastrocnemius de ratas portadoras del tumor Yoshida AH-130. Los resultados obtenidos muestran una disminución de la actividad del proteasoma tanto en ratas no portadoras (64%) como en portadoras de tumor (47%) tratadas con formoterol (cfr. Tabla 3).

La Tabla 3 muestra la actividad del proteasoma en homogenados de músculo esquelético de ratas portadoras de tumor. Las actividades, expresadas como nkatal/mg de proteína referida al acervo de proteína total, fueron calculadas usando amidocumarina libre como estándar de trabajo. El resultado final es la diferencia entre los nkatales obtenidos con y sin la presencia de 25 \muM lactacistina, un inhibidor específico del proteasoma. Los símbolos son como en la Tabla 1.

TABLA 3

4

Otro aspecto que se evaluó fue la apoptosis muscular durante el cáncer. Los resultados presentados en la Fig. 2 muestran que el crecimiento tumoral está asociado a una tasa incrementada de apoptosis tanto si es determinada como fragmentación del DNA (68%) (cfr. Fig. 2A y 2B) y como activación de la caspasa-3 (59%) (cfr. Fig. 2C). El tratamiento con formoterol abolió completamente la incrementada tasa de apoptosis muscular (cfr. Fig. 2A, 2B y
2C).

Los resultados mostrados en la Tabla 4 muestran que ninguno de los factores de transcripción estudiados (NF-\kappaB, AP-1 y C/EBP) estuvieron involucrados en el desarrollo del desgaste muscular durante el crecimiento tumoral.

La Tabla 4 muestra la actividad de unión al DNA de NF-\kappaB, AP-1 y C/EBP en músculos tibialis de ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. La unión al DNA de NF-\kappaB, AP-1 y C/EBP fue determinada en extractos nucleares de músculo tibialis. Las autoradiografías fueron sometidas a densitometría de barrido. Los símbolos son como en la Tabla 1.

TABLA 4

5

La expresión génica tanto de la UCP2 como de la UCP3 estaba incrementada en el músculo esquelético como consecuencia del crecimiento del tumor. Así, el contenido de ARNm de la UCP2 en el músculo gastrocnemius se elevó 3 veces, mientras que el de la UCP3 se incrementó 5 veces. Cuando las ratas portadoras del tumor recibieron formoterol, esta activación disminuyó significativamente en la expresión de la UCP2 y se observó una gran tendencia en la expresión de la UCP3 (cfr. Tabla 5).

La Tabla 5 muestra la expresión génica (ARNm) de las proteínas desacopladoras (UCP2 y UCP3) en músculos gastrocnemius de ratas portadoras del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. Esta fue detectada después de la hibridación con sondas de ADNc. La corrección de carga se hizo con blots con la sonda de la subunidad ribosomal 18S de rata. Las autorradiografías fueron sometidas a densitometría de barrido. Los símbolos son como en la Tabla 1.

TABLA 5

6

Efecto directo del formoterol en incubaciones de músculo

La disección y aislamiento de los músculos EDL fue llevada a cabo bajo anestesia con una mezcla de ketamina/xilacina. Los músculos aislados fueron fijados a un clip de acero inoxidable con el fin de mantener al músculo bajo una ligera ténsión (haciéndola comparable a la longitud en reposo) durante la incubación. Tales músculos son capaces de mantener concentraciones normales de ATP y fosfocreatina durante un periodo de incubación de 3 horas. Los músculos fueron incubados en un baño de agua termostatizado con agitación a 35ºC durante 3 horas en 2 ml de salino fisiológico Krebs-Henseleit pH 7,4, conteniendo 5 mM glucosa y 20 mM HEPES. Después de la adición de los músculos a los viales, la incubación comenzó con una tasa de agitación de 45 ciclos/min. Los viales fueron gaseados con O_{2}/CO_{2} 19:1 durante el periodo completo de incubación. Los músculos fueron preincubados durante 60 minutos: 30 minutos en tampón Krebs Henseleit y 30 minutos en un medio suplementado que contenía 10^{-4} M formoterol, 10^{-4} M clenbuterol o nada, y entonces incubados durante 120 minutos en medio suplementado
fresco.

La degradación proteica total por los músculos aislados fue calculada como la tasa de tirosina liberada en las dos últimas horas de incubación en el medio en presencia de 0,5 mM cicloheximida con el fin de bloquear la reincoporación de tirosina en las proteínas del tejido. La tirosina fue medida fluorimétricamente. El análisis estadístico de los datos fue llevado a cabo por medio del test de la t de Student. Como puede verse en Tabla 6, el formoterol disminuyó un 20% la tasa de degradación proteica (medida como la liberación de tirosina en el medio de incubación), confirmando que la acción de la molécula está basada en un descenso de la tasa proteolítica.

La Tabla 6 muestra las tasas proteolíticas en músculos EDL aislados de ratas control. Fueron medidas en presencia de cicloheximida (0,5 mM) y se expresan como nmoles/g y 2 horas y son media \pm EEM para el número de animales indicados entre paréntesis. Significatividad estadística de los resultados (por el test de la t de Student); \beta_{2}-agonista añadido versus nada ***p<0.001.

TABLA 6

7

Además, la tasa proteolítica fue también disminuida significativamente (12%) en ratas que habían sido previamente pretratadas durante seis días consecutivos con el \beta_{2}-agonista (cfr. Tabla 7).

La Tabla 7 muestra las tasas proteolíticas en músculos EDL aislados de ratas a las que se administró un tratamiento de formoterol (2 mg/kg pc) durante seis días consecutivos previos al sacrificio. Las tasas fueron medidas en presencia de cicloheximida (0,5 mM) y están expresadas como nmoles/g y 2 horas. Significatividad estadística de los resultados (por el test de la t de Student): ratas tratadas versus controles *p<0.05.

TABLA 7

8

Además de los efectos sobre la tasa de degradación proteica en músculos de rata incubados, tanto el formoterol como el clenbuterol influyeron la tasa de síntesis proteica, la cual fue incrementada un 20% tanto por el formoterol como por el clenbuterol (cfr. Tabla 8). La tasa de síntesis de proteína total en músculos aislados se evaluó como se ha descrito previamente (cfr. García-Martinez C. et al., "Interleukin-6 does not activate protein breakdown in rat skeletal muscle" Cancer Lett. 1994, vol. 76, pp. 1-4). Estos resultados están de acuerdo con observaciones similares realizadas en estudios previos que implicaron \beta_{2}-agonistas en músculos de rata incubados (cfr. Rehfeldt C. et al., "The effect of the beta-adrenergic agonist clenbuterol on the growth of skeletal muscles of rats" Arch. Tierernahr 1994, vol. 45, pp. 333-44).

La Tabla 8 muestra la tasa de síntesis proteica en músculos EDL aislados de ratas control. Las tasa sintéticas están expresadas como nmoles de [^{14}C]fenilalanina incorporada por g y 30 min. Significatividad estadística de los resultados (por el test de la t de Student): \beta_{2}-agonista añadido versus ninguna *p<0.05.

TABLA 8

9

Efecto del tratamiento con formoterol en ratones portadores del carcinoma pulmonar de Lewis

El tratamiento con formoterol no alteró el peso del tumor sólido de los huéspedes portadores del modelo del carcinoma pulmonar de Lewis, ni tampoco la comida (controles y portadores de tumor). La hipofagia presente durante el crecimiento del tumor persistió invariable en los animales tratados (cfr. Tabla 9).

En el modelo del carcinoma pulmonar de Lewis la presencia del tumor indujo un gran descenso en el peso de los músculos (13% para gastrocnemius, 21% para tibialis y 18% para soleus) (cfr. Tabla 9). El tratamiento con formoterol incrementó significativamente los pesos de los músculos gastrocnemius (19%), tibialis (13%) y soleus (28%) en los animales no portadores de tumor. Interesantemente, el tratamiento con formoterol tuvo un significativo efecto protector sobre los pesos de los músculos esqueléticos -gastrocnemius (11%), tibialis (11%) y soleus (56%) y en el músculo cardiaco (24%) en los animales portadores de tumor. Con respecto a los tejidos adiposos, el crecimiento del tumor causó grandes reducciones en la masa de tejido adiposo blanco en el modelo del carcinoma pulmonar de Lewis (76%). Una situación similar fue observada para el tejido adiposo marrón (39%). En el modelo del carcinoma pulmonar de Lewis, el formoterol no alteró la masa de tejido adiposo blanco ni en los animales control ni en los portadores del tumor, pero indujo un incremento en la masa del tejido adiposo marrón tanto en los controles como en los portadores de tumor (cfr. Tabla 9).

La Tabla 9 muestra la ingesta de comida, los pesos de los tejidos y el crecimiento tumoral en ratones portadores del carcinoma pulmonar de Lewis. La ingesta de comida está expresada en g y se refiere a la ingestión durante el periodo del experimento previo al sacrificio, que tuvo lugar 15 días después de la inoculación del tumor. Los pesos de los tejidos están expresados como mg/100 g de peso corporal inicial. La carcasa está expresada como g/100 g de peso corporal inicial. El peso del tumor está expresado en g. Los símbolos son como en la Tabla 1.

TABLA 9

10

Como se muestra en Tabla 10, los ratones portadores del tumor mostraron una expresión incrementada para los genes de la poliubiquitina en relación con los correspondientes animales control: más de 2 veces (2,4 kb) y 3 veces (1,2 kb) (cfr. Fig. 3). Cuando los ratones portadores del tumor recibieron formoterol, esta activación fue suprimida (cfr. Tabla 10). Interesantemente, resultados similares fueron hallados para la subunidad C8 del proteasoma, cuya expresión estuvo incrementada significativamente como resultado del crecimiento del tumor, y el tratamiento con formoterol suprimió esta activación de la expresión génica (cfr. Tabla 10 y Fig. 3). Con respecto a los otros sistemas proteolíticos, el crecimiento del tumor también resultó en un incremento en la expresión del sistema m-calpaína dependiente de calcio (2 veces), pero el tratamiento con formoterol no suprimió esta activación en el modelo del carcinoma pulmonar de Lewis (cfr. Tabla 10 y Fig. 3). Finalmente, el ligero incremento en el contenido de ARNm observado en los ratones portadores del carcinoma pulmonar de Lewis en la catepsina B lisosomal no fue revertido por el tratamiento con formoterol (cfr. Tabla 10 y Fig. 3).

La Tabla 10 muestra la expresión génica (ARNm) de los diferentes sistemas proteolíticos en músculos gastrocnemius de ratones portadores del carcinoma pulmonar de Lewis. Esta fue detectada después de la hibridación con sondas de ADNc. La corrección de carga se hizo con blots con la sonda de la subunidad ribosomal 18S de rata. Las autorradiografías fueron sometidas a densitometría de barrido. Los símbolos son como en la Tabla 1.

TABLA 10

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La expresión génica de tanto la UCP2 como la UCP3 estaba incrementada en el músculo gastrocnemius como consecuencia del crecimiento del tumor pulmonar de Lewis. En el músculo gastrocnemius el contenido de ARNm de la UCP2 estuvo elevado 3 veces, mientras que el de la UCP3 estuvo incrementado 2 veces (sin alcanzar significatividad). Cuando los ratones portadores de tumor recibieron formoterol, esta activación fue suprimida en la expresión de ambos genes (cfr. Tabla 11).

La Tabla 11 muestra la expresión génica (ARNm) de las proteínas desacopladoras (UCP2 y UCP3) en músculos gastrocnemius de ratones portadores del carcinoma pulmonar de Lewis. Esta fue detectada después de la hibridación con sondas de ADNc. La corrección de carga se hizo con blots con la sonda de la subunidad ribosomal 18S de rata. Las autorradiografías fueron sometidas a densitometría de barrido. Los símbolos son como en la Tabla 1.

TABLA 11

12

Claims

1. Uso del formoterol o una sal farmacéuticamente aceptable, o un solvato farmacéuticamente aceptable de cualquiera de ellos, para la preparación de un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico del desgaste muscular y/o de un síndrome caquéctico, ambos asociados a un estado catabólico en mamíferos, incluyendo humanos.

2. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es la enfermedad de Crohn.

3. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es cáncer.

4. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida.

5. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es una infección.

6. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es la diabetes.

7. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es un estado de inmobilización.

8. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es una quemadura severa.

9. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es debido a la ingravidez.

10. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es la vejez.

11. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es la enfermedad pulmonar obstructiva crónica.

12. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es una patología cardiovascular.

13. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es una patología hepática.

14. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es la artritis reumatoide.

15. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es un desorden nutricional.

16. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es la acidosis.

17. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es una enfermedad neuromuscular.

18. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es la enfermedad de Alzheimer.

19. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es el hiperadrenocortisolismo.

20. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es el hipertiroidismo.

21. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es el síndrome de Cushing.

22. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es una atrofia y/o una distrofia muscular.

23. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es la colitis ulcerosa.

24. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es el síndrome de la fatiga crónica.

25. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es el fallo renal.

26. Uso según la reivindicación 1, donde el estado catabólico es la cirrosis hepática.

27. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-26, donde el compuesto utilizado es el fumarato de formoterol o el fumarato de formoterol dihidrato.