WO2005121336A1 - 環境dnaの精製方法及び環境dnaからのタンパク質をコードする遺伝子の効率的なスクリーニング方法 - Google Patents

環境dnaの精製方法及び環境dnaからのタンパク質をコードする遺伝子の効率的なスクリーニング方法 Download PDF

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WO2005121336A1
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phage
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Masaji Okamoto
Kenichi Tanaka
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Toagosei Co., Ltd.
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    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures

Definitions

  • the present invention provides a method for purifying DNA from an environmental sample (hereinafter referred to as “environmental DNA”) and a method for efficiently screening a gene encoding a protein from environmental DNA.
  • DNA used in genetic engineering is usually prepared by extraction and purification from purely cultured microorganisms and cells.
  • the contaminants in the preparation are limited to substances derived from the culture medium, microbial organisms and the like.
  • Today, methods for purifying DNA from these contaminants have been established for various cases.
  • environment refers to, for example, soil, sludge, sewage, rivers, lakes, marshes, seawater, the sea floor, the inside and surface of tissues of insects, animals and plants, and the environment where microorganisms such as excreta live.
  • “Environmental sample” means a sample taken from the environment. That is, unlike the case of pure culture of microorganisms and cells, when extracting and purifying DNA from environmental samples such as soil and sludge, it is necessary to separate DNA from various contaminants derived from environmental samples. is there.
  • soil contains a large amount of a substance called humic.
  • Humin is a natural organic substance in which the remains of animals and plants undergo microbial degradation, and the degradation products polymerize. Humin does not have a single molecular structure like ordinary chemicals.
  • the elemental composition of humin is, for example, about 58% carbon, about 4% hydrogen, and 1.5-6.0% nitrogen, with the majority of the rest being oxygen, and containing less than 2% ash.
  • Humin is classified into humic acid, fulvic acid and hymatomelanoic acid, all of which are alkali-soluble.
  • the humic acid is extracted with an aqueous solution and then acidified, and the soluble component at pH 1 is fulvic acid,
  • the alcohol-soluble component obtained by extracting the precipitate with alcohol is hymatomelanoic acid, and the insoluble component is humic acid.
  • Humic acid derived from plants is sometimes called humic acid.
  • humic acids include those derived from marine and lake zooplankton.
  • humic acid has a similar molecular weight distribution and electric charge to DNA, when purifying DNA from environmental samples, it acts together with DM and becomes a major obstacle.
  • Purification of the DNA may conveniently ultraviolet - can be determined in the visible portion of the absorbance waveforms and ⁇ 260 ⁇ / 280 ⁇ ⁇ ratio Oyobie 260 nm / 230 nm ratio.
  • the ratio of L 260 nm / 280 nm and the ratio of ⁇ 260 nm 230 nm decrease, respectively.
  • Non-Patent Document 3 As shown in Table 1, the ⁇ 260 nm / 280 nm ratio and the ⁇ 260 nm / 230 nm ratio of the purified soil DNA in the conventional methods for purifying soil DNA are up to about 1.2 and 1.4, respectively. Is low.
  • Non-Patent Document 3 shown in Table 1 the effect of separating DNA and humic acid according to the type of the gel filtration carrier was examined, and it was reported that Sepharose 2B was most useful.
  • Patent Document 1 discloses that the soil is first sonicated and extracted with a buffer containing Tris-HC1, EDTA, NaCl, and polyvinylpyrrolidone, then dissolved in TE buffer, and then purified using four purification protocols. It describes recovering soil DNA. The purity is evaluated by subjecting the purified soil DNA to PCR. Of the four protocols, protocol A (using only Elutip d columns (anion exchange resin)) and protocol B (using Sephacrl S200 (gel filtration) followed by Elut ip d column) No recovery or no PCR product was detected in the PCR. In protocol D (using a Microspin Sephacryl S400 HR column followed by an Elutip d column), PCR products were detected in the PCR.
  • protocol A using only Elutip d columns (anion exchange resin)
  • protocol B using Sephacrl S200 (gel filtration) followed by Elut ip d column
  • protocol D using a Microspin Sephacryl S400 HR column followed by
  • the purity of the soil DNA purified by the conventional method for purifying soil DNA was insufficient to the extent that it could be used as type II in PCR.
  • Non-Patent Document 8 By collecting DNA directly from environmental samples and culturing it into a library without culturing microorganisms, it is now possible to access previously untouched genes, greatly increasing the opportunity for cloning useful genes. Can be expected. Therefore, a method for purifying high-purity environmental DNA that can be used for producing a desired enrichable library is desired.
  • Non-Patent Document 9 Many enzymes used in industry today have been isolated and identified by screening microorganisms with the desired catalytic activity from soil. A common procedure of the screening method is pure culture of microorganisms. Individual microorganisms are cultured in various media and conditions, and colonies are selected at random.
  • predetermined microorganisms are selected by subjecting them to selective sieving such as antibiotics and auxotrophy.
  • a microorganism having the target enzyme can be selected. For example, when trying to obtain a thermostable enzyme, select only those microorganisms that can grow in an environment near 100 ° C. On the other hand, to obtain highly active enzymes at low temperatures, select microorganisms that grow well at low temperatures.
  • selection is carried out in a medium in which substrate decomposition can be identified by halo or color reaction.
  • select microorganisms that grow in media where the specific substrate targeted is the sole carbon or nitrogen source.
  • microorganisms that can be cultured in a laboratory are said to be less than 1% of all microorganisms that exist in the environment such as soil, so that many microorganisms cannot be cultured in the environment. Exists.
  • Patent Document 2 ⁇ 3 and non-patent literature
  • the outline of the approach is to first extract DNA from environmental samples such as soil. Is purified. Next, the purified DNA is ligated to an appropriate vector, and a library is introduced into an appropriate host. In addition, a clone having the desired gene is searched for from the prepared library.
  • the library created by recovering DNA from environmental samples is a library consisting of a mixed genome derived from various types of organisms, unlike a library derived from a single organism.
  • the density of microbes in the environment depends on the environment. For example, the surface soil present dense, 10 8 to 10 1Q number of microorganisms present in the soil of lg at not many (non-patent document 1 3).
  • Non-Patent Document 15 a library made from environmental samples has a very diverse and highly complex structure. Such a library is sometimes called a metagenomic library (Non-Patent Document 15).
  • one important parameter in the conventional gene library is the number of genes or the genome size of the target organism species and the library size required to cover 100% of the number of genes or the genome size.
  • a gene library is constructed to clone the amylase gene from a Bacillus strain producing a useful amylase.
  • the gene library for isolating the amylase gene is as follows if the average insert of one clone is 5 Kbp. total about 10 times 50Mbp library, that may be made to include 10 4 independent clones.
  • the number of clones to be included in the gene library can be determined.
  • a metagenome library is a highly complex mixed genomic library containing genes of more than thousands of microorganisms. Therefore, when trying to isolate a target gene from a metagenomic library, it is necessary to screen a huge number of clones. As described above, the metagenome library can be expected to isolate genes with unknown functions, but has a very high throughput. It is important to do this on a computer.
  • a vector is a cosmid vector or a BAC vector that can contain a large DNA fragment of 20 to 100 Kbp.
  • the target gene can be easily recovered intact.
  • the DNA in the metagenomic library is from an unknown microorganism. It is well known that the mechanisms involved in regulating gene expression differ depending on the species. For example, the Shine-Dalgarno sequence upstream of the start codon is complementary to the 16S ribosomal RNA sequence, and the distance to the start codon of the sequence affects the translation initiation frequency. The Shine-Dalgarno sequence upstream of many E. coli genes is not recognized in Bacillus subtilis.
  • the phage display library method is a method including the following steps. First, a peptide with a random amino acid sequence fused to the coat protein is displayed on the phage surface. Next, a group of clones having a sequence that binds to the ligand protein is selected from the phage group displaying the peptides by abundance selection and amplified. By repeating this selection and amplification cycle, the desired clone is enriched (increase the S / N ratio). In the phage display library method, a phage displaying a peptide is related to a gene encoding a peptide. Further, 1 since the phage can be amplified, a single operation.
  • Non-Patent Document 17 For example, using a random peptide library, identification of an antibody epitope or search for an oligopeptide having a novel biological activity has been performed.
  • monoclonal antibodies can be obtained in a short time using an antibody library. The body is obtained.
  • antibodies with higher affinity have been created using antibody libraries.
  • attempts have been made to obtain enzymes from enzyme variant libraries.
  • Patent Document 18 JP-T-2003-520578
  • Patent Document 2 JP 2000-513933 A
  • Patent Document 3 Special Table 2001-520055
  • Non-Patent Document 1 C. Joe-Chan et al., J. Microbiol., 34 (3): 229, 1996
  • Non-patent document 2 DN Miller et al., Appl. Environ. Microbiol., 65 (11): 4715, 1999 Non-patent document 3 DN Miller, J, Microbiological Methods, 44, 49, 2000 Non-patent document 4 C. Schar-Gurtner et al. , J. Microbiol. Methods, 45:77,
  • Non Patent Literature 9 Hiromichi Ota, “Biocatalyst and Green Chemistry”, Chemical Engineering, vol.46, no.7, p49—53, 2001
  • Non-Patent Document 10 Rondon, ⁇ ⁇ R., Et al., Appl. Environ. Microbiol., 66 (6): 2541-7, 2000
  • Non-Patent Document 1 MacNeil, I. et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 3 (2): 301-8, 2001.
  • Non-patent Document 1 3 Supervised by Tadayuki Imanaka “Large Development of Microbial Utilization” N.T. p. 250-254, 2002
  • Non-Patent Document 14 Torsvik V. et al., Appl. Environ. Microbiol., 56 (3): 782-7, 1990
  • Non-Patent Document 15 Handel sman J, Rondon MR, Brady SF, Clardy J, Goodman RM, Chem. Biol., 5 (10): R245-9, 1998
  • Non-Patent Document 16 Band L, Henner DJ., DNA., 3 (1): 17-21, 1984
  • Non-Patent Document 1 7 Smith, GP, Curr.Opin.Biotechnol., 2 (5): 668-73, 1991
  • Non-Patent Document 18 Mattheakis, LC, Bhatt, RR and Dower, WJ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91,. 9022, 1994 Disclosure of the Invention
  • the present inventors have conducted intensive studies.As a result, DNA was recovered from environmental samples and subjected to gel filtration chromatography and / or ion-exchange chromatography. It has been found that environmental DNA derived from a sample can be obtained. Furthermore, a phage display library and an in vitro expression library of environmental DNA derived from environmental samples were prepared, and the library described above was prepared. The present inventors have found that, by performing screening based on the interaction between Li and a ligand, it is possible to efficiently screen a gene encoding a protein, and have completed the present invention.
  • the present invention includes the following.
  • a method for screening a gene encoding a protein which comprises creating a display library of environmental DNA derived from an environmental sample and screening based on the interaction between the library and a ligand.
  • a method for purifying environmental DNA derived from an environmental sample comprising collecting DNA from the environmental sample, and subjecting the DNA to gel filtration chromatography and / or ion-exchange chromatography.
  • a method for screening a gene encoding a protein according to (1) characterized in that the method is purified by:
  • the method of purifying the gene encoding the protein according to (2), wherein the method for purifying environmental DNA derived from the environmental sample includes recovering the DNA from the environmental sample and subjecting the recovered DNA to partial degradation.
  • a DNA fragment enriched by the screening method of the gene encoding the protein according to (1) is amplified, collectively transferred to an expression vector, introduced into a host, and based on the activity expressed from the inserted gene. To screen the desired clones,
  • (11) A method for screening a gene encoding the protein according to (1), using a combination of two or more ligands and / or carriers.
  • a method for purifying environmental DNA derived from an environmental sample comprising recovering the DNA from the environmental sample, and subjecting the DNA to gel filtration chromatography and / or ion-exchange chromatography.
  • the method for purifying environmental DNA derived from an environmental sample according to the present invention is a method comprising recovering DNA from the environmental sample and subjecting the DNA to gel filtration chromatography and / or ion exchange chromatography. According to the method for purifying environmental DNA according to the present invention, high-purity environmental DNA can be obtained.
  • the term "environment” refers to, for example, microorganisms such as soil, sludge, sewage, rivers, lakes, marshes, seawater, the seabed, the inside and surface of tissues, insects, animals, and plant individuals, and excreta. Means the environment.
  • the “environmental sample” is a sample collected from the environment, more preferably a sample collected from soil, sludge, the seabed, or the like, and particularly preferably a sample containing humic acid.
  • An environmental sample is a sample taken from the environment. It is preferable that the pull is not cultured by adding a medium or the like.
  • environmental DNA means DNA obtained from an environmental sample.
  • soil DNA means DNA obtained from a soil sample in an environmental sample.
  • display library means a phage display library and an in vitro expression library.
  • the term “crushing” means an operation of releasing DNA from cells such as microorganisms in the environmental sample to the outside of the environmental sample, including the case where the environmental sample is in the form of a mass.
  • DNA is recovered from an environmental sample. This method is outlined below.
  • any means may be used as long as DNA in microorganisms existing in the environmental sample can be extracted.
  • pulverization may be used as a DNA extraction means.
  • crushing means for example, bead beating, sonication and the like can be used.
  • the environmental sample is suspended in an appropriate amount (for example, an equivalent amount of the environmental sample) of the buffer.
  • the buffer include Tris-HCl and PBS.
  • the pH of the buffer is preferably neutral to weak alkali, that is, pH 7 to 9, and more preferably pH 7 to 8.
  • the salt concentration of the buffer is preferably 0.1 M to 2 M, more preferably 1 M to 2 M.
  • a surfactant such as TritonX-100, Tween20, Nonidet P-40 to the buffer, the dispersion of the environmental sample can be improved.
  • glass beads are added to the environmental sample and pulverized.
  • the amount of the glass beads used is preferably 1/3 to 2 times the weight of the environmental sample, more preferably 1/2 to the same weight.
  • the particle size of the glass beads to be added is preferably 50 to 1000 ⁇ m, and 100 ⁇ ! More preferably it is ⁇ 500 m.
  • the container containing the suspension and the glass beads is sealed and shaken with stirring.
  • the beads may be made of a material other than glass as long as the beads are hard.
  • microbial cells contained in the environmental sample can be disrupted.
  • French press or ultrasonic treatment By providing, the cells such as microorganisms may be crushed.
  • the supernatant containing environmental DNA is recovered, for example, by centrifugation or filtration.
  • a general method such as phenol treatment or ethanol precipitation
  • proteins contained in the supernatant can be removed and environmental DNA can be extracted.
  • environmental DNA is adsorbed to the glass beads by changing the salt concentration of the suspension to a high concentration of 1 to 2 M after shaking and stirring. After the adsorption, the glass beads to which the environmental DNA has been adsorbed are washed, and the DNA is eluted, whereby the environmental DNA can be recovered.
  • the recovered environmental DNA when the recovered environmental DNA is further reduced in molecular weight, the recovered environmental DM is reacted with a deoxyribonuclease (hereinafter, referred to as “DNase”). , It may be partially disassembled.
  • DNase those having low specificity such as type I nuclease are preferable, and examples thereof include DNase I.
  • the environmental DNA may be subjected to sonication to physically cut the environmental DNA to reduce the molecular weight.
  • the conditions for the partial digestion are selected so that the target DNA size can be obtained after final purification.
  • the conditions for obtaining many environmental DNA fragments of 2 Kbp size using DNase I include the reaction conditions shown in Table 2 below.
  • Buffer composition 30m NaOAc, pH 5.2, 10mM MgCl 2
  • the recovered environmental DNA is gel-filtered.
  • the exclusion limit in gel filtration chromatography is preferably 10 a or more, preferably 5 ⁇ 10 6 Da or more, in dextran equivalent.
  • the gel filtration carrier and / or column used for gel filtration chromatography includes, for example, Sephacry] S-300HR, Sephacryl S-400HR, Sephacryl S-500HR, Sepharose CL4B, Sepharose CL6B, Superose 6 and Superosel2. S.
  • a carrier and / or a column for high performance liquid chromatography hereinafter, referred to as “HPLC”) may be used as long as it has the above exclusion limit.
  • Buffers used in gel filtration chromatography include, for example, TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, ImM EDTA), TES (10 mM Tris-HC1, pH 8.0, ImM EDTA, 0.2 M NaCl) and the like. Is mentioned.
  • the fraction obtained by elution contains environmental DNA can be confirmed, for example, by subjecting a portion of the fraction to agarose gel electrophoresis. it can. Further, the purity elution positions of the obtained fractions environmental DNA measures the absorbance of the fractions, ultraviolet - absorbance waveform in the visible part, be determined by e 260n m / 280mn ratio Oyobie 260 nm / 230 nm ratio Can be. A part of each fraction may be subjected to agarose gel electrophoresis, and a fraction containing environmental DNA of a desired size may be selected.
  • a fraction containing environmental DNA obtained by gel filtration chromatography may be subjected to ion exchange chromatography in order to further increase the purity of environmental DNA.
  • a weak anion exchange resin such as DE.AE.
  • adsorb environmental DNA in a buffer with low ionic strength of about 50 mM Ts-HC1 (pH 8.0), ImM EDTA, and 0.2 M NaCl and use the same buffer with a salt concentration of about 0.5 M NaCl to protect the environment. Wash and remove impurities other than DNA, and elute environmental DNA with the same buffer at a salt concentration of about 1.0M NaCl.
  • the purity of the obtained environmental DNA can be determined by measuring the absorbance and using the absorbance waveform of the ultraviolet-visible region, the ⁇ 260 nm / 280 nm ratio, and the ⁇ 260 nm / 230 nm ratio. it can. Separation of environmental DNA from contaminants such as humic acid and proteins when the ratio of 260nm / 280nm is 1.8-2.0 and / or when the ratio of 260nm / 230nni is 2.0 or more It can be determined that environmental DNA with high purity has been obtained.
  • the order of gel filtration mouth chromatography and ion exchange chromatography may be reversed from the above description or may be used alone.
  • a DNA fragment is cut out from the gel after agarose gel electrophoresis, and purified using a commercially available spin column, for example, QIA QUICK of Qiagen Co., Ltd. be able to.
  • the environmental DNA can be purified so that the size of the environmental DNA is 0.5 kbp to 5 kbp, more preferably 0.6 to 4 kbp, and particularly preferably 0.8. ⁇ 3 kbp.
  • environmental DNA having high purity can be obtained.
  • various reactions such as genetic engineering processing for preparing a gene library, for example, restriction enzyme treatment, PCR, ligation, transformation, packaging into phage particles, and in vitro transcription / translation, contamination easily influenced.
  • the environmental DNA obtained by the method for purifying environmental DNA according to the present invention has high purity and can be used without any inconvenience in the above-described various reactions.
  • the screening method for the gene encoding the protein according to the present invention prepares a display library of environmental DNA, and allows the display library to interact with the ligand. It is a method that involves screening the clones that recognize ligands based on their action. According to the screening method of the present invention, a large number of clones can be collectively searched from environmental DNA for a gene encoding a protein recognizing a ligand. Can be screened.
  • the “gene encoding a protein” means a gene or gene fragment encoding a protein having activity or function.
  • Examples of the environmental DNA used in the screening method according to the present invention include environmental DNA purified by the above-described method for purifying environmental DNA according to the present invention.
  • a display library of environmental DNA is prepared.
  • Methods for selecting desired clones from the display library include the phage display method and the ribosome display method (C. Matthekis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, .9022, 1994).
  • Emmanoresion method (Tawfik DS & Griffth, AD, Nat. Biotechnol., 16, p. 652-656, 1998.), STABLE 3 ⁇ 4 (Doi, N. and Yanagawa, H., FEBS Lett., 457, p. 227) -230, 1999), in vitro virus method (Roberts, RW & Szostak, JW, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94, p. 12297).
  • environmental DNA is ligated to a vector.
  • the vector that can be used include ⁇ -type phage, T7-type phage, M13-type phage, and ⁇ 4-type phage.
  • Environmental DNA can be blunt-ended, and an adapter can be ligated so as to be compatible with a restriction site of a vector or a multicloning site.
  • environmental DNA can be inserted into a gene encoding a protein that can be expressed in a host, or into a nucleotide sequence encoding the ⁇ -terminal or C-terminal of the protein.
  • environmental DNA is inserted into a gene encoding a coat protein in a phage or into a base sequence encoding the ⁇ -terminal or C-terminal of the coat protein. This allows a protein or peptide encoded by environmental DNA to be displayed on a phage as a fusion protein with a coat protein.
  • proteins or peptides encoded by environmental DNA are presented on fur.
  • the vector can contain, for example, a gene expression control region, a reporter gene and a selection marker in addition to the environmental DNA.
  • the gene expression control region include a cis element such as a promoter, a translation initiation signal, and an enhancer.
  • Reporter genes include, for example, fluorescent and luminescent genes such as GFP luciferase, and protein genes that serve as antigens for easy-to-use antibodies.
  • the selection marker for example, Amp 1 ⁇ Tet r, CnT , Kn, AUR1 - antibiotic resistance genes such as C and the like.
  • the method of inserting the gene expression control region, the reporter gene, the selection marker, etc. into the vector is the same as the above-described method of inserting the environmental DNA vector.
  • a transformant can be obtained by introducing a recombinant vector containing environmental DNA into a host.
  • the host is not particularly limited as long as the above recombinant vector can be propagated.
  • the method for introducing the above-described recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria. Examples include phage infection, a method using calcium ions, and an electroporation method.
  • the recombinant vector containing environmental DNA can be amplified by growing the transformant.
  • the vector used in the recombinant vector is a phage DNA such as a phage, T7 phage or T4 phage
  • the transformant is infected by infecting a host such as E. coli after the completion of the packaging reaction. can do.
  • the transformed phage DNA can be amplified by growing the transformed Escherichia coli.
  • an amplified phage can be obtained.
  • the amplified phage can be used directly as a library.
  • the phage display library whether or not the phage has environmental DNA can be confirmed by PCR such as plaque PCR.
  • translation is performed from rust RNA or transcription and translation from ⁇ type DNA using a cell extract without using cells to obtain a library.
  • the environmental DNA is linked to a plasmid vector, or has a promoter and translation initiation signal, so that it can be expressed as a protein in a cell extract. Used.
  • the target ligand for the display library of environmental DNA can be immobilized on the immobilization carrier.
  • the ligand of interest can be labeled.
  • ligands include, for example, high molecular enzyme substrates such as polysaccharides, proteins, lipids, etc .; NADH, NADPH, FMN, SAM, acetyl CoA, ATP, ADP, cAMP, GST, Coenzymes such as riboflavin; enzyme inhibitors such as amylazein inhibitors and protease inhibitors; low molecular enzyme substrates such as sugars, amino acids, and fats; metabolites in vivo; drugs such as pharmaceuticals.
  • ligands include sugars such as cyclodextrin, amylose and acabose.
  • a ligand when screening an enzyme or enzyme fragment from a display library of environmental DNA, a ligand is a substrate, a coenzyme, or an inhibitor. When screening for a hydrolase having a high activity, the screening is performed under conditions that bind to the ligand but do not degrade the ligand. Further, when insoluble particles such as starch-cellulose are used as the ligand, the ligand can be used as it is as a solid phase.
  • the immobilized carrier examples include beads such as agarose beads, imino beads, hydrophilic beads and magnetic beads, and plates for enzyme immunoassay (EIA).
  • beads such as agarose beads, imino beads, hydrophilic beads and magnetic beads, and plates for enzyme immunoassay (EIA).
  • EIA enzyme immunoassay
  • commercially available agarose beads for example, manufactured by Sigma-Aldrich
  • already supporting various substances can be used as they are. In that case, the substance carried on the agarose beads becomes the ligand.
  • the target ligand interacts with the immobilized carrier, and the target ligand is bound to the immobilized carrier.
  • a ligand can be covalently bonded using functional groups such as an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, an epoxy group and a tosyl group disposed on the surface of the immobilized carrier.
  • the functional group of the immobilization carrier is a carboxyl group, for example, a covalent bond can be formed between the functional group and an amino group present in the ligand to be immobilized, that is, an amine coupling can be formed.
  • the carboxyl group is converted to PDEA to convert the free ligand existing in the target ligand.
  • the digand is previously reacted with PDEA (2- (2-pyridinyldithio) ethaneamine hydrochloride) to convert the carboxyl group into PDEA.
  • the carboxyl group of the immobilization carrier After activating the carboxyl group of the immobilization carrier, the carboxyl group is reacted with cystamine dihydrochloride, and then converted to thiol group by reduction with dithiothreitol (DTT). Then, a covalent bond (disulfide bond) is formed between the carboxyl group converted to PDEA and the thiol group on the side of the immobilized carrier. That is, a surface thiol cutting can be formed.
  • DTT dithiothreitol
  • clones bound to the ligand can be eluted based on the label.
  • Labeling includes, for example, labeling with a biotin or a fluorescent substance.
  • the ligand of interest is biotinylated and the ligand interacts with the display library in solution. Then, clones bound to the ligand can be eluted using streptavidin beads.
  • screening is performed based on the interaction between the display library and the ligand.
  • the interaction means an affinity binding between the display library and the ligand, an enzymatic reaction and the like. Screening is done by affinity selection.
  • the affinity selection consists of steps such as binding reaction, washing and elution.
  • the pH of the buffer may be selected from general biochemical buffers in the range of pH 2 to 12 depending on the purpose. For example, even if phage survival in the phage display library is in an unacceptable buffer pH range, affinity selection of only 1 sitar is possible.
  • the immobilized carrier supporting the ligand may be contained in about 0.1 to 5% of a proteinaceous blocking agent such as BSA, skim milk, gelatin or collagen, if necessary.
  • a proteinaceous blocking agent such as BSA, skim milk, gelatin or collagen
  • the binding reaction in affinity selection can be performed at -10 ° C to 80 ° C depending on the purpose.
  • the reaction time of the binding reaction may be from 1 minute to 24 hours depending on the desired binding characteristics and Kon value.
  • the phage display library infects a host such as E. coli and operates using a lysate obtained by lysing the host. If the lysate contains a substance that inhibits the binding reaction with the ligand, remove the inhibitor using a gel filtration membrane with an appropriate pore size or dialysis, and use the buffer by replacing the buffer. be able to. Alternatively, the phage in the lysate may be precipitated with polyethylene daricol or the like, and the supernatant may be replaced.
  • washing is performed by mixing with a washing buffer of about 10 to 50 times the volume of the immobilized carrier supporting the ligand for at least 1 minute, and then replacing the buffer.
  • the number of times of this exchange can be, for example, 1 to 20 times.
  • Removal of the washing buffer is performed by centrifugal precipitation of the immobilized carrier carrying the ligand or centrifugal filter, followed by suction removal.
  • the washing buffer may be removed using a filter unit and a spin column or vacuum system. Washing using magnetic beads with the two-phase distribution method is also possible.
  • the affinity selection it is generally preferable to elute competitively under mild conditions using a ligand solution that competes with the target ligand. Strong conditions, such as low ⁇ or high ⁇ , high or low temperatures, or including urea or detergents, that break the interaction between the ligand of interest and the clones in the display library as needed Elution with a buffer is also possible. If the eluent is inconvenient for the host in the subsequent operation, the elution operation is not performed, and the eluent can be added to the host bacterium while being bound to the bead.
  • This eluate is usually subjected to clonal amplification.
  • affinity selection may be performed using a different ligand to improve selectivity.
  • the phage clone in the eluate obtained from the phage display library can be amplified by infecting a host such as E. coli. If the eluate contains the target ligand or a solution that competes with the target ligand is used, It inhibits the W amplification cycle and can be removed by infecting the host with the phage clone and then centrifuging the phage-infected host.
  • a solution that competes with the ligand or ligand can be removed from the lysate by buffer replacement. Amplification of the phage clone can be confirmed by monitoring the phage titer of the lysate.
  • gene amplification is performed by PCR or the like.
  • the screened environmental DNA is amplified by PCR such as plaque PCR using the product of the phage clone or PCR as type III. Then, the amplified DNA is subjected to agarose gel electrophoresis to confirm environmental DNA. Furthermore, the base sequence of environmental DNA can be determined by sequence analysis of environmental DNA.
  • the phage display library when used as the display library, proteins and peptides expressed from environmental DNA are displayed as fusion proteins on the phage surface. You.
  • the resulting environmental DNA is not a complete coding sequence and may ordinarily lack some N-terminal or C-terminal sequences. Therefore, in order to obtain a complete coding region from the sequence information of the environmental DNA contained in the obtained phage clone, the upstream or downstream coding is performed in the same manner as in RACE (Rapid Amplification of cDNA ends). Need to make up for the recording area.
  • the phage display library before screening One also contained clones that did not fuse due to the presence of untranslated regions.
  • an outward primer and an adapter sequence or a primer containing a phage DNA sequence are used based on the sequence information obtained from the clone. Then, perform PCR using the phage display library DNA before screening as type III.
  • the upstream or downstream coding region is obtained in this way, for example, the recombinant PCR method (Higuchi, R., (“Recombinant PCR”), PCR Protocols, p. 177-183, edited by MA Innis et al. Academic Press, Inc., 1990) to obtain a complete coding region.
  • the sequence information of the environmental DNA contained in the obtained phage clone is checked against the gene database at the base sequence level or the amino acid sequence level, and the homology analysis is performed, whereby the protein encoded by the environmental DNA is obtained. Function or activity can be predicted.
  • a transformant When a gene or gene fragment is isolated from environmental DNA and identified, a transformant is obtained by introducing the gene or gene fragment into a host as described above. By expressing the protein or peptide encoded by the gene or gene fragment in the transformant, the function or activity of the protein or peptide can be investigated.
  • the enriched population may contain clones that retain not only the complete coding region but also a region that can exhibit catalytic activity.
  • inserts of the enriched population are collectively amplified using a primer having a common sequence such as an adapter sequence or a vector sequence, and amplified by a PCR method or the like. Then, this is ligated to an appropriate intracellular expression vector or secretion expression vector, and the transformants can be obtained as a whole to obtain an enriched mini-expression library.
  • a primer having a common sequence such as an adapter sequence or a vector sequence
  • the frequency of the target clones can be expected to be improved, for example, because the clone population has already been enriched, for example, by about 1000 times as a clone population that recognizes and binds to the specific ligand. .
  • the activity can be detected as follows. For example, when looking for the hydrolysis activity of sugars and protein / fat, a water-insoluble substrate such as starch, casein, oil or fat is mixed with the medium and cultured, and the degraded clear zone or halo is searched. In addition, a pH indicator, a color reaction for measuring various enzyme activities, a fluorescent reaction, a luminescence reaction reagent, an antibody, and the like, which are used in conventional enzyme screening, can be used.
  • a gene encoding a target protein can be efficiently screened from a display library prepared from environmental DNA.
  • a phage display library is used in the screening method according to the present invention, a phage clone group bound to a ligand can be concentrated and amplified. Therefore, the desired protein The labor and time required for selecting the gene coding for can be greatly saved.
  • FIG. 1A shows an absorbance waveform of a pure DNA preparation ( ⁇ phage) as a positive control collected by UltraClean.
  • Figure 1 1 shows the absorbance waveform of the soil DNA collected by UltraClean.
  • FIG. 2 shows the absorbance waveform of the fraction containing soil DNA after gel filtration chromatography.
  • FIG. 3 shows an agarose gel electrophoresis pattern of soil DNA subjected to partial degradation by DNasel.
  • FIG. 4A shows the 280 nm absorbance of each fraction during FPLC.
  • FIG. 4B shows an agarose gel electrophoresis pattern of each fraction after FPLC.
  • FIG. 5 shows the absorbance spectrum of the purified soil DNA compared to the purified phage DNA.
  • FIG. 6 shows an agarose gel electrophoresis pattern of purified soil DNA.
  • FIG. 7 shows a scheme of ligation of a blunt-ended soil DNA and an adapter.
  • FIG. 8 shows an agarose gel electrophoresis pattern of a DNA fragment purified from the gel after ligation of the adapter.
  • FIG. 9 shows an agarose gel electrophoresis pattern of library # 17.
  • FIG. 10A shows the transition of the titer of the phage solution in each round.
  • FIG. 10B shows the change in the recovery rate with respect to the number of input phages in each round.
  • Figure 11 shows the agarose gel electrophoresis pattern of each round of plaque PCR product.
  • FIG. 12 shows an alignment between the amino acid sequence of P31 and a homology sequence in a conserved database.
  • FIG. 13A shows an alignment with the amino acid sequence of a protein having the first homology with the amino acid sequence of P31.
  • FIG. 13B shows the alignment with the amino acid sequence of the protein whose homology with the amino acid sequence of P31 is position 2.
  • FIG. 13C shows the alignment with the amino acid sequence of a protein having homology to the amino acid sequence of P31 at position 3.
  • FIG. 13D shows an alignment with the amino acid sequence of a protein having homology to the amino acid sequence of P31 at position 4.
  • FIG. 14A shows binding of P31-displayed phage clones to ⁇ - and ⁇ -CD-Sepharose 6B beads compared to control wild-type phage T7SC1.
  • FIG. 14B shows the binding of P31-displayed phage clones to j3- and ⁇ -CD-Sepharose 6B beads compared to control Sepharose 6B beads (S6B).
  • FIG. 14C shows the inhibition of binding of P31-displayed phage clones and ⁇ -CD-Sepharose 6B beads by 1% starch. '
  • FIG. 15 shows an alignment between the amino acid sequence of AE1 and the amino acid sequence of a protein having a homologous sequence.
  • FIG. 16 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of the gene encoding P31.
  • FIG. 17 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of the gene containing the insert DNA in AE1.
  • Figure 18 shows the amino acid sequence of ⁇ -xylosidase and gnorecosidase of the EC 3.2.1 family and the amino acid sequence of the protein encoded by the single gene fragment obtained in Example 7. Shows the alignment with the sequence.
  • FIG. 19 shows an alignment of the amino acid sequence of E.C. 3.2.3.3, darcoamylase with the amino acid sequence of the protein encoded by one gene fragment obtained in Example 7.
  • FIG. 20 shows the base sequence of one kind of gene fragment obtained in Example 7 and the amino acid sequence of the protein encoded thereby.
  • FIG. 21 shows the nucleotide sequence of the gene fragment of the species obtained in Example 7 and the amino acid sequence of the protein encoded thereby.
  • Figure 22 shows the correlation between the amino acid sequence of EC 4.2.1.16, dTDP glucose dehydratase and the protein encoded by the gene fragment obtained in Example 8. Indicate the intention.
  • FIG. 23 shows the nucleotide sequence of the gene fragment obtained in Example 8 and the amino acid sequence of the protein encoded thereby.
  • FIGS. 1A and 1B show the absorbance waveforms obtained as a result of the measurement.
  • FIG. 1A shows the absorbance waveform of a pure DNA preparation ( ⁇ phage) as a positive control.
  • FIG. 1B shows the absorbance waveform of soil DNA.
  • the ratio of 260 nm / 230 nm was 1.49 for pure DNA preparation (phage) and 0.95 for soil DNA.
  • Sepharose CL4B (Amersham-Pharmacia) 3 ml: TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, ImM EDTA)
  • Figure 2 shows the UV absorption waveform of the fraction.
  • the solid line of A is a reference line
  • the broken line of B is a pure DNA preparation (phage DNA).
  • the ratio of 260 nm / 230 nm and 260 nm / 280 nm of Fr. # 4 was 1.83 and 1.57, respectively.
  • the 260 nm / 230 nm and ⁇ 260 nm / 280nni ratios of Fr. # 8 were 2.0 and 1.1, respectively.
  • gel filtration in the fractionation range was effective in separating most of the humic acid because of the high ⁇ 260 ⁇ / 230 ⁇ ratio.
  • gel filtration in this fractionation range was effective in improving the degree of purification, it was found that proteins were mixed and insufficient due to the low 260 nm / 280 nm ratio.
  • each lane is a sample treated with the following DNasel concentration (U / ml): Lane 1: 245 U / ml, Lane 2: 122 U / ml, Lane 3: 61 U / ml, lane 4: 30.6 U / ml, lane 5: 15.3 U / ml and lane 6: 0 U / ml. Lanes M and 7 are marked with a molecular weight marker (1 Kb ladder marker).
  • the soil DNA obtained in 1-1 was treated with DNase I (15 U / ml) under the conditions shown in Table 4 and partially degraded to obtain a 2 Kbp DNA fragment.
  • DNase I 15 U / ml
  • a sample containing a 2 Kbp DNA fragment was subjected to FPLC using a gel filtration column Superose 6 (Amersham-Pharmacia).
  • FPLC f was performed under the conditions shown in Table 5 below. Table 5
  • TES (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, lmM EDTA, 0.2 M NaCl): 0.3 ml / min,
  • Figure 4A shows the FPLC chart (280 nm absorbance of each fraction). Also, and Fr. # 6 ⁇
  • the agarose gel electrophoresis pattern of # 11 is shown in FIG. 4B.
  • FIG. 5 shows the absorbance spectrum pattern of the obtained DNA.
  • Eluent 1 indicates purified DNA of the DNA pool
  • E (cone.) And E (dil.) Indicate phage-DNA of a pure DNA preparation.
  • FIG. 5 shows the electrophoresis pattern of the purified DNA (lane 4 ) of the DNA pool. As can be seen from Fig. 6, no decomposition occurred, and the major area was around 2 Kbp.
  • the Hind adapter was prepared by annealing the following synthetic oligonucleotides HdAd5 and pHdAd3.
  • HdAd5 5'-HO-AGCTTAGTGAGTGAGTCCT 3 '(SEQ ID NO: 1)
  • pHdAd3 5'-pAGGACTCACTCACTA 3 '(SEQ ID NO: 2)
  • an Eco adapter was prepared by annealing the following synthetic oligonucleotide pEcoRIL3 and EcoRIAd5.
  • pEcoRIL3 5'-pGTCGACGCGGCCGCG 3 '(SEQ ID NO: 3)
  • the annihilation of the ter was confirmed by 5% polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Example 2 The end of the soil DNA purified in Example 1 by ion exchange mouth chromatography was blunt-ended using a TAKARA Blunting Kit. Next, 2.5 g of soil DNA, 1.0 ⁇ 10 ⁇ buffer and 4.01 of distilled water were added to a 0.5 ml tube. After incubating this solution at 75 ° C for 5 minutes, T4 DNA polymerase was added, and the mixture was gently stirred with a pipette. Furthermore, after incubating the solution at 37 ° C for 5 minutes, the enzyme was inactivated by vigorous stirring with a vortex mixer. After adding TE buffer 401 to the solution, the entire solution was transferred to a 1.5 ml tube.
  • FIG. 7 shows the scheme of ligation of the blunt-ended soil DNA to the adapter.
  • blunt-ended soil DNA 4.4 ⁇ 1, distilled water 11.6 ⁇ 1, and blunt-ended soil Eco and Hind adapters (2.0 ⁇ l each) were mixed at about 100 times the molar number of DNA.
  • This DNA solution was subjected to extraction of phenol and phlegm form, and then to ethanol precipitation. Then, the precipitate was dissolved in TE buffer.
  • lane M indicates a molecular weight marker
  • lane IS11C indicates an adapter-ligated product IS11C containing a 0.5 to 1.3 Kbp fragment.
  • Lane IS11B indicates an adapter-ligated product IS11B containing a fragment of 1.3 to 2. OKbp.
  • the adapter-ligated product excised from the gel was extracted using QIAGEN's Mini Elute Gel Extraction Kit according to the manual.
  • the adapter ligation product was inserted into the vector pUC9 Eco / Hind, and then E. coli (COMPETENT High DH5 (T0Y0B0)) Was transformed.
  • E. coli COMPONENT High DH5 (T0Y0B0)
  • insert DNA The adapter ligated product (hereinafter referred to as “insert DNA”) and the vector DNA (T7 SELECT 10-3b) were mixed as shown in Table 6 below to obtain a preferred insert / vector ratio.
  • Table 6 Library # 17 (insert / vector );
  • Vector DNA solution 50 ⁇ 1 (0.5 ⁇ g: 21.5 fmol)
  • glycogen 2 / z1 and lZlO volume of 3M NaOAc were added to the mixture. Furthermore, 2.5 times the amount of cold ethanol was added, and the mixture was left under ice cooling to precipitate DNA. The precipitate was collected by centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes, washed with 75% ethanol, and the remaining ethanol was removed under reduced pressure.
  • insert DNA (adapter ligated product) IS11B insert DNA (adapter ligated product) IS11B and vector DNA were coprecipitated.
  • the titer of the library # 16 is 9. 1 X 10 7 pfu / ml , also, the titer of the library one # 17 2. 37 X 10 It was 8 pfu / ml.
  • Plaque PCR was performed to determine the insertion frequency of libraries # 16 and # 17.
  • the phage solutions of libraries # 16 and # 17 are seeded on a plate, the plaque formed on each plate is pierced with a toothpick, and the reaction mixture for PCR (primer; 0.1 lpmol, Ex Taq enzyme) ; 0.0313) was suspended in 15-20 ⁇ l.
  • Novagen # 7 up and T7 down were used.
  • the PCR reaction was performed using a thermal cycler, 1) 1 cycle; 96 ° C / 3 minutes, 2) 33 cycles; 94 ° C / 30 seconds, 50 ° C / 30 seconds, 72 ° C / 2 minutes, and 3) One cycle; 72 ° C / 10 min.
  • FIG. 9 shows the results of agarose gel electrophoresis of library # 17.
  • the number of each lane indicates the PCR sample number, and lane M indicates a molecular weight marker.
  • the interview frequency was about 15%.
  • the insertion frequency was about 50%.
  • Library-1 # 16 (300 ⁇ 1) and Library-1 # 17 (150 ⁇ 1) were infected with 5 ml and 10 ml of the host E. coli BLT5615, respectively, and then lysed.Lysate library # 16P1 and library # 17P1 was prepared.
  • the titers of lysate library # 16P1 and library # 17P1 were both about 5 X 10 ⁇ pfu / ml.
  • the frequency of insertion decreased slightly due to the amplification treatment. In library # 16P1, the insertion frequency was about 10%. In library # 17P1, the insertion frequency was about 33%.
  • translated BLASTx converts an amino acid sequence generated by translating a query base sequence in six frames and an amino acid sequence translated from each base sequence registered in the target database in the same manner in six frames. It is a program that performs homology search at the amino acid sequence level by checking. As a result, as shown in Table 7, in about half of the clones, homology between the amino acid sequence encoded by the insert DNA and the amino acid sequence of the functional protein was found. On the other hand, even when 0RF was found in the insert DNA, homology was not found, and there were many insert DNAs encoding proteins of unknown function.
  • Epoxy-activated Sepharose 6B (Lot. 288904) from Amersham Biosciences was used as affinity beads ⁇ carrier. Also, ⁇ -cyclodextrin
  • ⁇ -CD and / 3-CD specifically bind to cyclodextrin glucanotransferase. Therefore, the binding ability of affinity beads was evaluated using a crude purified contizyme (Cyclodextrin Lucanotransferase (CGTase)) (Lot. CGTRZ095184 2L) obtained from Amano Enzyme. It was confirmed that CGTase could specifically bind to 200 mg of CGTase.
  • CGTase Cyclodextrin Lucanotransferase
  • Library # 16P1 and library # 17P1 were used at a titer of 7.6 ⁇ 10 1 G pfu / ml and 5.3 ⁇ 10 10 pfu / ml, respectively.
  • the ⁇ -CD-Sepharose 6B beads prepared in Example 3 were used as affinity beads for screening, and the Sepharose 6B beads were used as a control.
  • a 1.5 ml siliconized tube 2150Z manufactured by Assistist was used as the container. Cleaning for screening Wash buffer 1 (25 mM Tris-HCl pH 7.0 / 0.1 M NaCl / 0.1% Tween20), Wash buffer 2 (50 mM Tris-HCl pH 7. ⁇ / ⁇ .2M NaCl / 0.2% Tween 20) and Wash Buffer 3 (50 mM Tris-HC1 pH 9.5 / 0.2 M NaCl). For elution from the beads, an elution buffer (25 mM Tris-HCl pH 7.0 / 0.1 M NaCl) containing lOmM y -CD was used.
  • Wash buffer 1 25 mM Tris-HCl pH 7.0 / 0.1 M NaCl / 0.1% Tween20
  • Wash buffer 2 50 mM Tris-HCl pH 7. ⁇ / ⁇ .2M NaCl / 0.2% Tween 20
  • Wash Buffer 3 50 mM Tris
  • Novagen BLT5615 cells were used as host cells for T7 phage amplification.
  • TCGTATTCCAGTCAGGTGTG (SEQ ID NO: 5) was designed as a primer for sequencing analysis, and was commissioned to Vex Corporation.
  • Other reagents used were special grade products such as Wako Pure Chemical and SIGMA.
  • Each kind of buffer was prepared by a standard method and sterilized by an autoclave as needed.
  • the operation of amplifying the eluate was performed as follows.
  • the eluate (100 i 1) was added to IPTG-induced BLT5615 Hozuki 500 1.
  • the cells were cultured at 37 ° C for exactly 5 minutes.
  • 4,000 rpn to remove ⁇ -CD! By centrifugation for 2 minutes, the cells to which the phage had adhered were precipitated, and unnecessary supernatant was removed.
  • 500 l of LB / Amp / IPTG medium was added to the precipitated cells, and the cells were cultivated at 37 ° C. until lysis occurred.
  • the general method was as follows. First, 250 ⁇ l of BLT5615 cells, 100 ⁇ l of diluted ⁇ 7 phage solution, 24 ⁇ l of 0.5 ⁇ IPTG solution and 3 ml of top agar heated to 50 ° C were mixed in a tube. Immediately after mixing, the mixture was overlaid on a 9 cm plate containing an LB / Amp medium before the mixture was cooled. After the overlaid agar was solidified, incubation was performed at 37 ° C for 2 hours to generate phage plaques. The phage titer was also calculated from the number of plaques generated and the dilution ratio.
  • the titer of the phage solution was about 1-2 ⁇ 10 10 Pfu / ml.
  • the changes in the titer of the phage solution and the change in the recovery rate relative to the number of input phages in each round are shown in Table 8 and FIGS. Table 8 Rounds Eluted phage (Pfu) recovery (%)
  • PCR reaction was performed using a thermal cycler 1) 1 cycle; 96 ° C / 3 minutes, 2) 33 cycles; 94 ° C / 30 seconds, 50 ° C / 30 seconds, 72 ° C / 2 minutes, and 3 cycles 1) One cycle; 72 ° C / 10 min.
  • each lane is a black PCR product of the phage solution obtained in each round.
  • the protein of the Snfl protein kinase complex and P31 were identical in 24 amino acids out of 73 amino acids and had 33% homology. When similar amino acids were included, 37 amino acids were identical and had 50% homology. From the above, the homology with the conserved sequence strongly suggested that P31 is a part of the protein having a sugar recognition function.
  • the alignment of the top 4 candidates with p31 is shown in Fig. 13A ⁇ ! )Pointing out toungue.
  • the E (Expect) value is a numerical value between 0 and 1 and is a parameter indicating the probability of coincidence. The closer the E value is to 0, the higher the reliability. Generally, when the E value is hit at about 10-1Q , it is considered that the protein has a similar function with a considerably high probability. Homology with P31 shown in FIG.
  • 1 3A is one of Tanno click protein hypothetical protein - E value (Tenoremotoga maritima (Thermotoga maritima)) was 4 X 10- 11. Therefore, it is suggested that the protein containing P31 is likely to be a protein having the same function as hypothetical protein.
  • GLP_546_85055_84318 (Giardia Iambia) with homology to P31 shown in 3B ATCC 50803 contains an AMP kinase motif associated with isoamylase (http://kr.expasy.org/ cgi—bin / niceprot. See pl? Q7R2K2).
  • Ami-mouth pullulanase (Geo) at homology positions 3 and 4 shown in Figs.
  • Nosylas stearothermophilus (Geobacil lus stearothermophi lus) and punolan hydrolase type III (Thermococcus aggr egans) are 1,4- ⁇ -glucan branching enzymes, amycotic pullulanases Met.
  • the above results suggested that the protein containing P31 may be a protein having a sugar recognition function.
  • the obtained phage clone displaying P31 was purified and the ⁇ -CD binding profile was examined.
  • WIT buffer 25 mM Tris-HCl ⁇ 7.0, 0.1 0 NaCl and 0.1 lTeen 20
  • WIT buffer 20 ⁇ l of ⁇ -CD-Sepharose 6B beads were mixed and shaken at room temperature for 1 hour. Next, the mixture was centrifuged at 12000 rpm for 2 minutes, and the supernatant was removed. Further, W1T buffer 5001 was added to the ⁇ -CD-Sepharose 6B beads, and the mixture was shaken with a mixer for 5 minutes.
  • the mixture was centrifuged at 12000 rpm for 2 minutes to wash. Such a washing operation was performed five times in total. The last washing operation was performed using a W1 buffer (25 mM Tris-HCl ⁇ 7.0, 0.1 ⁇ NaCl) containing no Tween.
  • the phage concentration present in the supernatant was then calculated in plaque assay. Further, a binding test between a P31-displaying phage clone and ⁇ -CD-Sepharose 6B beads in the presence of 1% starch was performed.
  • the starch was prepared by dissolving a 10% suspension of solubilized starch (Wako Pure Chemical Industries) at 60 ° C and adding 1/10 volume. In the same manner, the / 3-CD binding profile of the P31-displayed phage clone was examined.
  • Wild-type phage T7SC1 was used as a control for P31-displayed phage clones. Further, Sepharose 6B beads (S6B) were used as a control for ⁇ -CD-Sepharose 6B beads and / 3-CD-Sepharose 6B beads.
  • Table 9 shows the binding of P31-displayed phage clones to] 3-CD-Sepharose 6B beads.
  • Table 10 shows P31 Figure 4 shows binding of phage clones to ⁇ -CD-Sepharose 6B beads.
  • FIG. 14A shows the binding of P31-displayed phage clones to j3- and ⁇ -CD-Sepharose 6B beads compared to the control wild-type phage T7SC1.
  • FIG. 14B shows the binding of P31-displayed phage clones to i3- and ⁇ -CD-Sepharose 6B beads compared to control Sepharose 6B beads (S6B).
  • FIG. 14C shows the inhibition of binding of P31-displaying phage clones to-and CD-Sepharose 6B beads by 1% starch.
  • Table 9 shows the binding of P31-displayed phage clones to] 3-CD-Sepharose 6B beads.
  • Table 10 shows P31
  • the P31-displayed phage clone bound about 1700-fold to i3-CD-Sepharose 6B beads and about 450-fold to ⁇ -CD-Sepharose 6B beads as compared to the control wild-type phage.
  • the phage clones displaying P31 showed 3-CD-Sepharose 6B beads and y-CD-Sepharose 6B beads, respectively. They bound 10-fold and 35-fold.
  • the phage solution after three rounds of panning obtained in Example 4 above was plated, and the nucleotide sequence of the randomly selected single plaque insulin DNA was examined, and a sequence highly homologous to aldose-1-epimerase was identified. (FIG. 17, SEQ ID NOS: 8 and 9). This clone was designated as AE1. .
  • FIG. 15 shows the results.
  • the amino acid sequence of the protein (SEQ ID NO: 9) encoded by the gene containing the insert DNA in AE1 (SEQ ID NO: 8) has the amino acid sequence names QUB70, Putative aldose- 1-epimerase (EC 5.1.3.3) [ YIHR] ( Shigella. off Into shin Li (Shigella flexneri)) and had homology with a very low E-value (1 x 10- 32).
  • the gene containing the insert DNA in AE1 may be a novel aldose-1-epimerase gene.
  • aldose-1-epimerase is an enzyme that converts sp-D-glucose into jS-D-glucose. Therefore, AE1 was considered to recognize and bind to Dulcos, a constituent unit of CD and amylose.
  • Amylose 4.50E + 07 1.01E + 06 As shown in Table 1.1, AE1 bound 67 times to the amylose resin as compared to the wild-type phage T7SC1. From the above, it was suggested that the gene product containing the insert DNA in AE1 recognized and bound glucose, which is a constituent unit of cyclodextrin pamylose, in agreement with the result of the sequence homology described above.
  • Escherichia coli BLT5615 (1.5 ml) induced with ImM IPTG was infected with 15 ⁇ l of the library # 17-1 and cultured with shaking for 1 hour to obtain a lysate. The obtained lysate was centrifuged at 10,000 ⁇ g for 10 minutes. After centrifugation, the resulting supernatant was designated as library # 17-2.
  • the recovered 1 was infected to E. coli BLT5615 (1 ml) induced with lmM IPTG, and the lysate was treated in the same manner as described above, and the second cycle was performed. After 4 washes, adding 500 mu 1 of W2T g R, and Kaka ⁇ was collected fractions obtained at 5 minutes (about 5xl0 5 pfu).
  • the collected fractions were appropriately diluted, plaque assembled in the same manner as in Example 4, and plaque PCR was performed.
  • 1 shows the alignment of the protein encoded by the gene fragment (SEQ ID NO: 10 ⁇ -darcosidase homologous clone) with the amino acid sequence (SEQ ID NO: 11) of the protein encoded by the homologous clone.
  • SEQ ID NO: 10 ⁇ -darcosidase homologous clone the amino acid sequence of the protein encoded by the homologous clone.
  • the Query sequence is the amino acid sequence of the protein encoded by the obtained gene fragment
  • the Sbjct sequence is the amino acid sequence of / 3-xylosidase and dalcosidase of the EC3.2.1 family.
  • FIG. 20 shows the nucleotide sequence of the gene fragment (SEQ ID NO: 10) and the amino acid sequence of the protein encoded thereby (SEQ ID NO: 1).
  • 1 shows the alignment with the amino acid sequence of the protein encoded by No. 12 (base sequence of dalcoamylase homologous clone) (SEQ ID NO: 13: amino acid sequence of dalcoamylase homologous clone).
  • the Query sequence is the amino acid sequence of the protein encoded by the obtained gene fragment
  • the Sbjct sequence is E. 3.2.1.3, the amino acid sequence of dalcoamylase.
  • FIG. 21 shows the nucleotide sequence of the gene fragment (SEQ ID NO: 12) and the amino acid sequence of the protein encoded thereby (SEQ ID NO: 13).
  • Amicon microcon YM-100 (cut off) was used to remove small molecules that could compete with the ligand used for panning from library # 17P2 (400/1) obtained in Example 7.
  • plaque assay was performed in the same manner as in Example 4, and plaque PCR was performed.
  • the nucleotide sequence of the insert obtained by plaque PCR was examined for 7 clones.
  • EC 4.2.1.16 dTDP glucose dehydratase (TrEMBL access ion # Q5V3C6, Haloarcula) was identified as a highly homologous sugar-related enzyme.
  • the Query sequence is the amino acid sequence of the protein encoded by the obtained gene fragment
  • the Sb jet sequence is the amino acid sequence of EC 4.2.1.16 dTDP glucose dehydratase. is there.
  • ' indicates the nucleotide sequence of the gene fragment (SEQ ID NO: 14) and the amino acid sequence of the protein encoded thereby (SEQ ID NO: 15).
  • SEQ ID NOs: 1-4 are synthetic oligonucleotides.
  • SEQ ID NO: 5 is a primer.
  • SEQ ID NO: 6 is the nucleotide sequence of the gene encoding P31.
  • SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence of P31.
  • SEQ ID NO: 8 is the nucleotide sequence of a gene containing the insert DNA in AE1.
  • SEQ ID NO: 9 is the amino acid sequence of a protein encoded by a gene containing the insert DNA in AE1.
  • n represents a, g, c or t (location: 25 and 84).
  • SEQ ID NO: 10 is the nucleotide sequence of a / 3-dalcosidase homologous clone.
  • SEQ ID NO: 11 is the amino acid sequence of a / 3_darcosidase homologous clone.
  • SEQ ID NO: 12 is the nucleotide sequence of a 'Dalcoamylase homologous clone.
  • SEQ ID NO: 13 is the amino acid sequence of a Dalcoamylase homologous clone.
  • SEQ ID NO: 14 is the nucleotide sequence of a glucose dehydratase homologous clone.
  • 'SEQ ID NO: 15 is the amino acid sequence of a Darcosis dehydratase homologous clone.

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Abstract

環境DNAの精製方法及び環境DNAからの機能タンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法を提供する。環境サンプルからDNAを回収し、回収したDNAをゲル濾過クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーに供することで、環境サンプル由来DNAを精製する。また、環境サンプル由来のDNAのディスプレイライブラリーを作製し、上記ディスプレイライブラリーとリガンドとの相互作用に基づいてスクリーニングすることによって、タンパク質をコードする遺伝子をスクリーニングする。

Description

環境 DNAの精製方法及び環境 DNAからのタンパク質
をコードする遺伝子の効率的なスク リーニング方法 技術分野
本発明は、 環境サンプル由来の DNA (以下、 「環境 DNA」 という）の精製方法及び 環境 DNAからのタンパク質をコードする遺伝子の効率的なスクリーユング方法に 明
関する。 書
背景技術
<土壌からの DNA精製 >
従来、 遺伝子工学において使用する DNAは、 通常、 純粋培養した微生物や細胞 からの抽出及び精製によって調製される。 当該調製の際の夾雑物は、 培地ゃ微生 物等に由来の物質に限られている。 今日では、 それら夾雑物からの DNAの精製方 法は、 種々の場合に応じて確立されている。
以下で使用する 「環境」 とは、 例えば、 土壌、 汚泥、 下水、 河川、 湖沼、 海水、 海底、 昆虫 ·動物 ·植物の個体の組織内部及び表面並びに排泄物などの微生物が 生息している環境を意味する。
「環境サンプル」 とは、 環境から採取したサンプルを意味する。 即ち、 微生物 や細胞等の純粋培養の場合とは異なり、 土壌や汚泥等の環境サンプルから DNAを 抽出及び精製する場合には、 環境サンプルに由来する様々な夾雑物から DNAを分 離する必要がある。 特に、 土壌はフミンと呼ばれる物質を多量に含む。 フミンと は、 動植物の遺体が微生物分解を受け、 その分解物が重合した天然有機物質であ る。 フミンは、 通常の化学物質のような単一の分子構造を有していない。 フミン の元素構成は、 例えば炭素約 58%、 水素約 4%、 窒素 1. 5〜6. 0%であり、 残りの 大半は酸素で、 その他 2 %以下の灰分等を含んでいる。 フミンは、 フミン酸、 フ ルボ酸及びヒマトメラン酸に分類され、 いずれもアルカリ可溶性である。 アル力 リ溶液でフミンを抽出し、次いで酸性にし、 pHlでの可溶成分がフルボ酸であり、 沈殿物をアルコール抽出したアルコール可溶成分がヒマトメラン酸、 その不溶成 分がフミン酸である。 なお、 植物体起源のフミン酸は、 腐植酸と呼ばれる場合も ある。 さらに、 フミン酸には、 海洋や湖沼の動物性プランク トン起源のものも含 まれる。
ところで、 フミン酸は、 DNA と分子量分布や電荷が似ているために、 環境サン プルから DNA を精製する場合には DM と挙動を共にし、 大きな障害となる。 DNA の精製度は、 簡便には、 紫外部-可視部の吸光度波形や λ 260ηηι/280ηηι 比及びえ 260nm/230nm比で判断できる。 DNAはえ 260nmに、 タンパク質はえ 280nmに、 そし てフミン酸は λ 230ηπιに極大吸収がある。 DNAに対してタンパク質ゃフミン酸の混 入が多レ、場合は、それぞれ； L 260nm/280nm比及び λ 260nm 230nm比が低くなる。 DNA の純度は、 目的に応じて選択することができるが、 一般的には、 純度のよい DNA は、 え 260nm/280nm = 1. 8〜2. 0及びえ 260nm/230nm > 2. 0である。
今日まで幾つかの土壌サンプル由来の DNA (以下、 「土壌 DNA」 という）の精製方 法に関する報告がなされている。 それらの報告を、 精製プロ トコールとともに以 下の表 1にまとめた。
くプロトコールの比較〉
Figure imgf000004_0001
* 標準純粋 DNA 1.8 - 1.9 >2.0 not presented :不 れていなし
表 1に示すように、 従来の土壌 DNAの精製方法において、 精製した土壌 DNAの λ 260nm/280nm比及び λ 260nm/230nm比は、最高でそれぞれ 1. 2程度及び 1. 4程度 であり、 純度は低い。 なお、 表 1に示す非特許文献 3においては、 ゲル濾過担体 の種類に応じた DNAとフミン酸との分離効果を検討し、セファロース 2Bが最も有 用であることを報告している。
一方、 特許文献 1には、 まず Tri s- HC1、 EDTA、 NaCl及びポリビニルピロリ ドン を含むバッファーで土壌を超音波処理して抽出した後、 TE バッファーに溶解し、 4つの精製プロ トコールを用いて土壌 DNAを回収することが記載されている。 そ して、 精製した土壌 DNAを PCRに供することで、 純度を評価している。 4つのプ 口 トコールのうち、 プロ トコール A (Elutip d カラム（陰イオン交換樹脂）のみを 使用）及びプロ トコール B (Sephacrl S200 (ゲル濾過）とそれに続いて Elut ip d力 ラムを使用） では、 回収不能であるか又は PCRにおいて PCR産物が検出されなか つた。 また、 プロ トコール D (Microspin Sephacryl S400 HRカラムとそれに続い て Elutip dカラムを使用）では、 PCRにおいて PCR産物が検出された。
以上のように、 従来の土壌 DNAの精製方法において精製された土壌 DNAの純度 は、 PCRにおける铸型として使用できる程度で、 未だ不十分であった。
近年、 実験室において培養可能な微生物は、 土壌などの環境中に存在する全微 生物の 1%足らずであることが認識されている （非特許文献 8 )。 微生物を培養す ることなく、 直接環境サンプルから DNAを回収して、 ライブラリー化することで 従来、 手付かずであった遺伝子にもアクセス可能となり、 有用遺伝子のクロー二 ング機会が飛躍的に増すことが期待できる。 そこで、 目的とするエンリ ッチ可能 なライブラリ一作製に用いることができる高純度の環境 DNAを精製する方法が望 まれる。
'<従来の酵素スクリ一ニング>
従来の酵素スクリーニングによって微生物から見出された種々の酵素は、 食品 加工、 化成品、 医薬、 農薬及びバイオマス等の様々な産業で利用されている。 さ らに、 将来的にも、 環境負荷軽減の社会的要請に伴い、 グリーンケミス トリーが 提唱されていることから、 より多くの工業プロセスへの生体触媒、 すなわち、 酵 素の利用が検討されている （非特許文献 9 )。 今日、 産業で利用されている多くの酵素は、 目的とする触媒活性を有する微生 物を土壌よりスクリ一ニングする方法によって単離 · 同定された。 当該スクリ一 ニング方法の共通する手順は、 微生物の純粋培養である。 個々の微生物を、 種々 の培地や条件下で培養し、 コロニーを無作為に選択する。 あるいは、 培養後、 抗 生物質や栄養要求性などの選択的なふるいに供することで所定の微生物を選択す る。さらに目的の酵素が微生物の生育に必要不可欠である条件を設定することで、 目的の酵素を有する微生物を選択することができる。 例えば、 耐熱性酵素を得よ うとする場合には、 100°C近い環境で生育できる微生物のみを選抜する。 一方、 低 温下で活性の高い酵素を得る場合には、低温下でよく増殖する微生物を選抜する。 また、 標的とする特定の基質を分解又は変換させることができる酵素を得ようと する場合には、ハローや呈色反応により基質分解を識別できる培地で選択を行う。 あるいは、 標的とする特定の基質が唯一の炭素源又は窒素源である培地において 増殖する微生物を選抜する。
<従来の酵素スクリ一ユングの問題点〉
以上のように、 従来の酵素スクリ一二ング方法では微生物の 1次スク リ一ニン グ工程で、 通常、 何千、 何万のものコロニーについてアツセィし、 また微生物の 増殖が確認できるまで 3週間も要する場合がある。 次いで、 1次スク リーニング 工程で得られた微生物が有する目的の酵素の活性を調べ、 十分なレベルの性能を 示すものを選択する。 さらに、 酵素遺伝子を単離する場合には、 選択した微生物 から酵素遺伝子を単離し、 クローニングする必要がある。 従って、 従来の酵素ス クリ一ニング方法ば、 かなりの労力と時間を要するという問題がある。
また、 上述したように、 実験室において培養可能な微生物ば、 土壌などの環境 中に存在する全微生物の 1 %足らずであると云われていることから、環境中には、 培養できない微生物が多く存在する。
<メタゲノムライブラリー >
そこで、 近年、 培養可能な微生物からの酵素スク リーニングに代わり、 微生物 を培養することなく、 微生物を含む環境サンプルを使用することで、 目的の遺伝 資源にアクセスするアプローチがなされている（特許文献 2〜 3及び非特許文献
1 0〜1 2 )。 そのアプローチの概要は、 まず土壌などの環境サンプルから DNA を精製する。 次いで、 精製した DNAを適当なベクターに連結し、 適当な宿主に導 入したライブラリーを作製する。 さらに作製したライブラリーから、 目的の遺伝 子を有するクローンを探すというものである。 環境サンプルから DNAを回収し、 作製したライブラリ一は、通常の 1種の生物に由来するライブラリーとは異なり、 多種類の生物に由来する混合ゲノムから成るライブラリ一である。 環境中の微生 物の存在密度は、 環境によって異なる。 例えば、 表層土壌は存在密度が高く、 多 いところで lgの土壌中に 108〜101Q個の微生物が存在する （非特許文献 1 3 )。 さ らに、 各微生物種の存在比率には差異があるが、 少なく とも数千から 1万に及ぶ 多様 微生物種が環境では混在する（非特許文献 1 4 )。 従って、 環境サンプルか ら作製したライブラリ一は、 極めて多様で複雑度の高い構成となる。 このような ライブラリーは、 メタゲノムライブラリーと呼ばれる場合がある（非特許文献 1 5 )。
ところで、 従来の遺伝子ライブラリーにおいて重要なパラメータ一は、 対象と なる生物種が有する遺伝子数又はゲノムサイズ及び当該遺伝子数又はゲノムサイ ズを 100%包含するのに必要とされるライブラリーサイズである。 例えば、 ある 有用なァミラーゼを生産するバシルス属細菌株からアミラーゼ遺伝子をクロー二 ングすべく、 遺伝子ライブラリーを作製する。 当該細菌株のゲノムサイズが 5Mbp であり、 またアミラーゼ遺伝子が分断される場合も考慮すれば、 アミラーゼ遺伝 子を単離するための遺伝子ライブラリ一は、 1クローンの平均ィンサー卜が 5Kbp とすると、 インサート合計が約 10倍の 50Mbpのライブラリー、 すなわち、 104個 の独立クローンを含むように作製すればよい。 このよ うに、 1 種類の生物種が有 する遺伝子の中から、 目的とする遺伝子の存在が明らかである場合には、 遺伝子 ライブラリーに含むべきクローン数を決定することができる。
く従来のメタゲノムライブラリーの問題点〉
一方、 メタゲノムライブラリ一は、 数千種以上の微生物が有する遺伝子を含む 複雑度の高い混合ゲノムライブラリーである。 従って、 メタゲノムライブラリー から目的の遺伝子を単離しようとする場合には、 膨大な数のクローンをスクリ一 ニングする必要がある。 このように、 メタゲノムライブラリ一は、 これまで未知 の機能を有する遺伝子を単離することが期待できる一方で、 極めてハイスループ ッ トで行うことが重要となる。
既に報告されているメタゲノムライブラリーにおいては、 ベクターは、 20Kbp 〜100Kbpの大きな DNA断片を含むことができるコスミ ドベクターや BACベクター が採用されている。 大きな DNA断片を含むことができるベクターを使用した場合 には、 目的の遺伝子が無傷で回収しやすい。 しかしながら、 メタゲノムライブラ リ一中の DNAは、 未知の微生物由来である。 遺伝子の発現調節に関わる機構は、 生物種によって異なることがよく知られている。 例えば、 開始コドン上流の存在 するシャイン-ダルガルノ（Shine- Dalgarno)配列は 16Sリボソ一ム RNA配列と相補 的であり、 当該配列の開始コ ドンまでの距離は翻訳開始頻度に影響する。 なお、 多くの大腸菌遺伝子の上流に存在するシャイン-ダルガルノ配列は、枯草菌中では 認識されない。 そのため、 大腸菌遺伝子は、 枯草菌に導入した場合には翻訳され なレ、（非特許文献 1 6 )。 このように、 異種遺伝子が、 他の宿主で発現されるとは 限らない。 従って、 メタゲノムライブラリーのスク リーニング手段が発現タンパ ク寳に依存する場合には、 宿主中で転写や翻訳開始シグナルなどが機能する遺伝 子だけが発現することとなる。
くファージディスプレイライブラリー法およびインヒ：トロ発現法 >
一方、ファージディスプレイライブラリー法は、以下の工程を含む方法である。 まず、 コートタンパク質に融合した無作為なアミノ酸配列のぺプチドをファ一ジ 表面上にディスプレイさせる。 次いで、 ペプチドをディスプレイしたファージ集 団から、 アブイ二ティセレクションによってリガンドタンパク質に親和的に結合 する配列を有するクローン群を選抜し、 増幅する。 この選抜と増幅のサイクルを 繰り返すことで、 目的のクローンをエンリ ッチする （S/N比を上げる）。 なお、 フ ァージディスプレイライブラリ一法では、 ぺプチドをディスプレイしたファ一ジ とペプチドをコードする遺伝子とが関連している。 さらに、 ファージは増幅可能 であることから、 1回の操作で 1。〜^12という多数のクローンを検索できる。 フ ァージディスプレイライブラリーは、約 20年前に発表されて以来、種々の応用が なされている （非特許文献 1 7 )。 例えば、 ランダムペプチドライブラリーを用い て、 抗体のェピトープの同定又は新規な生理活性を有するオリゴぺプチドの探索 がなされている。 また、 抗体ライブラリーを用いて、 短期間にモノクローナル抗 体が取得される。 さらに、 抗体ライブラリーを用いて、 より親和性の高い抗体が 創出されている。 あるいは、 酵素変異体ライブラリーから酵素を得る試みがなさ れている。 さらに、 クローン増幅可能なコンビナトリアルライブラリー技術とし てはファージに限らず、リポソームディスプレイ（非特許文献 1 8)に代表される、 より多様度が高い in vitro転写翻訳系での発現をベースとした方法にも採用され ている。 特許文献 1 特表 2003-520578号公報
特許文献 2 特表 2000— 513933号公報
特許文献 3 特表 2001— 520055号公報
非特許文献 1 C. Joe- Chan ら， J. Microbiol. , 34(3) :229， 1996
非特許文献 2 D. N. Miller ら， Appl. Environ. Microbiol. , 65 (11) : 4715， 1999 非特許文献 3 D. N. Miller, J, Microbiological Methods, 44， 49， 2000 非特許文献 4 C. Schabereiter-Gurtner ら， J. Microbiol. Methods, 45: 77，
2001
非特許文献 5 H. Burgmann ら， J. Microbiol. Methods, 45： 7, 2001 非特許文献 6 D. A. Santosa, Molecular Biotechnology, 17： 59, 2001 非特許文献 7 E. M. James ら， FEMS Microbiol. Ecol. , 36： 139, 2001 非特許文献 8 Amann RI， Ludwig W， Schleifer KH. , Microbiol Rev. ,
59(1)： 143-69, 1995
非特許文献 9 太田博道， 「生体触媒とグリーンケミス トリー」 ， ケミカルェン ジニヤリング， vol.46,no.7， p49— 53, 2001
非特許文献 1 0 Rondon, Μ· R.ら， Appl. Environ. Microbiol.， 66(6) :2541-7, 2000
非特許文献 1 ]. MacNeil, I. ら, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. , 3(2)： 301-8, 2001
非特言午文献 1 2 Knietsch A. ら， J. Mol. Microbiol. Biotechnol. , 5(1) : 46-56， 2003
非特許文献 1 3 今中忠行 監修 「微生物利用の大展開」 ェヌ ·ティー ·ェヌ， p. 250-254, 2002
非特許文献 1 4 Torsvik V.ら， Appl. Environ. Microbiol. , 56 (3)： 782 - 7, 1990 非特許文献 1 5 Handel sman J, Rondon MR, Brady SF, Clardy J, Goodman RM, Chem. Biol.， 5 (10)： R245-9, 1998
非特許文献 1 6 Band L, Henner DJ. , DNA.， 3 (1) : 17-21, 1984
非特許文献 1 7 Smith, G. P. , Curr. Opin. Biotechnol. , 2 (5) : 668- 73, 1991 非特許文献 1 8 Mattheakis, L. C. , Bhatt, R. R.及び Dower, W. J. , Proc. Natl . Acad. Sci. USA. , 91, . 9022, 1994 発明の開示
上述したように、従来の土壌 DNAの精製方法により精製された土壌 DNAは、種々 の遺伝子工学的処理に使用するには未だ純度が不十分であった。 そこでファージ パッケージング反応やインビトロ転写翻訳系のような夾雑物感受性の高い反応に も使用可能な高純度環境 DNAを調製する。 一方、 メタゲノムライブラリ一中の遺 伝子は、 未知の微生物に由来するので、 使用した宿主中で発現するか否かは不明 であった。 そのため、 メタゲノムライブラリーにおける遺伝子の中には、 発現効 率が低いもの又は発現しないものが存在するという問題があった。 さらに、 メタ ゲノムライブラリーをスクリーニングする際には、 膨大な数のクローンをスク リ 一-ングする必要があり、 効率的に行うことが望まれる。
そこで、 本発明は、 上述した実状に鑑み、 環境サンプルから夾雑物を除き、 高 純度の環境 DNAを精製する方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、 環境 DNAを用いてディスプレイライブラリーを作製し、 当該ディスプレイライブ ラリ一からタンパク質をコードする遺伝子を効率的にスクリ一-ングする方法を '提供することを目的とする。
上述した目的を達成するため、 本発明者らが鋭意検討した結果、 環境サンプル から DNAを回収し、 DNAをゲル濾過クロマトグラフィー及び/又はイオン交換ク口 マトグラフィ一に供することで、 高純度の環境サンプル由来の環境 DNAを得るこ とができることを見出した。 さらに、 環境サンプル由来の環境 DNAのファージデ イスプレイライブラリーやインビトロ発現ライブラリーを作製し、 上記ライブラ リーとリガンドとの相互作用に基づいてスクリ一エングすることにより、 タンパ ク質をコードする遺伝子を効率的にスクリ一二ングできることを見出し、 本発明 を完成するに至った。
本発明は、 以下を包含する。
( 1 ) 環境サンプル由来の環境 DNAのディスプレイライブラリーを作製し、 前 記ライブラリーとリガンドとの相互作用に基づいてスクリ一二ングすることを含 む、 タンパク質をコードする遺伝子のスク リーニング方法。
(2) 上記環境サンプル由来の環境 DNAが、 環境サンプルから DNAを回収し、 前記 DNA をゲル濾過クロマトグラフィー及び/又はイオン交換ク口マトグラフィ 一に供することを含む環境サンプル由来の環境 DNAの精製方法により精製された ものであることを特徴とする、 （ 1 )記載のタンパク質をコードする遺伝子のスク リーユング方法。
(3) 上記環境サンプル由来の環境 DNAの精製方法が、 グラスビーズを用いて 環境サンプルを破砕することにより DNAを回収することを特徴とする、 （2)記載 のタンパク質をコードする遺伝子のスクリ一二ング方法。
(4) 上記環境サンプル由来の環境 DNAの精製方法が、 環境サンプルから DNA を回収した後、回収した DNAを部分分解に供することを含む、 （2)記載のタンパ ク質をコードする遺伝子のスクリ一二ング方法。
(5) 上記ゲル濾過クロマトグラフィーにおける排除限界が 105Da以上である ことを特徴とする、 （2)記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング 方法。
(6) 上記環境サンプル由来の環境 DNAの精製方法において精製した DNAのサ ィズが 0.5〜5Kbpであることを特徴とする、 （2)記載のタンパク質をコードする 遺伝子のスクリ一-ング方法。
( 7) 上記リガンドが糖類であることを特徴とする、 （1 ) 記載のタンパク質を コードする遺伝子のスクリ一二ング方法。
(8) 上記糖類がシクロデキス トリ ン、 アミロース及びァカボースから成る群 より選択されるものであることを特徴とする、 （ 7)記載のタンパク質をコードす る遺伝子のスク リーニング方法。 (9) 上記スクリーニング前に、 リガンドを固定化担体に固定化する工程を含 む、 （1 ) 記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
( 1 0) ( 1 )記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリ一ユング方法でェ ンリツチした DNA断片を、増幅し、まとめて発現ベクターに移し、宿主に導入し、 挿入遺伝子から発現した活性に基づいて目的クローンをスクリ一エングする方法,
( 1 1 ) 2種以上のリガンドおよび/または担体の組み合わせによる （1 ) 記載 のタンパク質をコードする遺伝子のスクリ一ニング方法。
( 1 2) 環境サンプルから DNAを回収し、 前記 DNAをゲル濾過クロマトグラフ ィー及び/又はイオン交換ク口マトグラフィ一に供することを含む、環境サンプル 由来の環境 DNAの精製方法。
( 1 3) グラスビーズを用いて環境サンプルを破砕することにより DNAを回収 することを特徴とする、 （1 2) 記載の環境サンプル由来の環境 DNAの精製方法。
( 1 4) 環境サンプルから DNAを回収した後、 回収した DNAを部分分解に供す ることを含む、 （1 2) 記載の環境サンプル由来の環境 DNAの精製方法。
( 1 5) 上記ゲル濾過クロマトグラフィーにおける排除限界が 105Da以上であ ることを特徴とする、 （1 2) 記載の環境サンプル由来の環境 DNAの精製方法。
( 1 6) 上記精製した DNAのサイズが 0.5〜5Kbpであることを特徴とする、 （1 2) 記載の環境サンプル由来の環境 DNAの精製方法。
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明に係る環境サンプル由来の環境 DNAの精製方法は、環境サンプルから DNA を回収し、 DMAをゲル濾過クロマトグラフィー及び/又はィオン交換ク口マトダラ フィ一に供することを含む方法である。 本発明に係る環境 DNAの精製方法によれ ば、 高純度の環境 DNAを得ることができる。
' 本発明において 「環境」 とは、 例えば、 土壌、 汚泥、 下水、 河川.、 湖沼、 海水、 海底、 昆虫 ·動物 ·植物の個体の組織内部及び表面並びに排泄物などの微生物が 生息している環境を意味する。
本発明において 「環境サンプル」 とは、 環境から採取したサンプルであり、 更 に土壌、 汚泥、 海底等から採取したサンプルであることが好ましく、 特にフミン 酸を含有するものが好ましい。 また、 環境サンプルとは、 環境から採取したサン プルに培地等を添加して培養したものではないものが好ましい。
本発明において 「環境 DNA」 とは、 環境サンプルから得た DNAを意味する。 本発明において 「土壌 DNA」 とは、 環境サンプル中における土壌サンプルから 得た DNAを意味する。
本発明において 「ディスプレイライブラリー」 とは、 ファージディスプレイラ 'ィブラリ一およびィンビトロ発現ライブラリ一を意味する。
本発明において 「粉砕」 とは、 環境サンプルが塊状である場合、 この塊状を細 かくすることを含むが、 環境サンプル中の微生物等の細胞中から DNAを細胞外に 放出させる操作を意味する。
本発明に係る環境 DNAの精製方法においては、 まず、 環境サンプルから DNAを 回収する。 この方法について概要を記載する。
環境サンプルが塊状である場合にはよく破砕する。 また、 環境サンプル中に存 在する微生物中の DNAを抽出することができれば如何様な手段を用いてもよい。 例えば、 DNA抽出手段として粉砕が挙げられる。 この破砕手段としては、例えば、 ビーズビーティング、 ソニケーション等を用いることができる。
次いで、 環境サンプルを適当量（例えば、 環境サンプルと等量）のバッファーに 懸濁する。バッファーとしては、例えば、 Tris- HC1や PBS等が挙げられる。なお、 バッファーの pHは、 中性から弱アルカリ、 すなわち、 pH7〜9が好ましく、 より 好ましくは pH7〜8とする。また、バッファーの塩濃度は、 0. 1M〜2Mが好ましく、 より好ましくは 1M〜2M とする。 さらにバッファーに Tri tonX-100、 Tween20、 Nonidet P-40等の界面活性剤を添加することで、 環境サンプルの分散をよくする ことができる。
次に、 上記懸濁液に対して、 グラスビーズを環境サンプルに加えて粉砕処理を 行う。 このグラスビーズの使用量は、環境サンプルに対し 1/3〜2倍重量が好まし く、 より好ましくは 1/2〜同重量である。 添加するグラスビーズの粒径は、 50〜 1000 μ mが好ましく、 100 π！〜 500 mであることがより好ましい。
懸濁液及びグラスビーズを含む容器を密閉し振盪攪拌する。 ビーズは硬質であ ればグラス以外の材質でもよい。 当該操作により、 環境サンプルに含まれる微生 物の菌体を破砕することができる。 あるいは、 フレンチプレスや超音波処理等に 供することで、 微生物などの菌体を破砕してもよい。
環境サンプルに含まれる微生物の菌体を破砕した後に、 例えば、 遠心分離又は 濾過により、 環境 DNAを含む上清を回収する。 回収した上淸をフエノール処理や エタノール沈殿等の一般的な方法に供することで、 上清に含まれるタンパク質を 除去し、 環境 DNAを抽出することができる。 あるいは、 上記において、 懸濁液を グラスビーズとともに振盪攪拌した場合には、 振盪攪拌後、 懸濁液の塩濃度を 1M 〜2Mの高濃度に換えることで、 ガラスビーズに環境 DNAを吸着させる。 吸着後、 環境 DNA が吸着したガラスビーズを洗浄し、 DNA溶出処理することで、 環境 DNA を回収することができる。 このことから環境 DNAを吸着できるガラスビーズを用 いることにより、 環境サンプルから容易に環境 DNAを得ることができる。 このこ とから、本発明において、このようなガラスビースを用いることがより好ましい。 本発明に係る環境 DNAの精製方法において、 回収した環境 DNAをさらに低分子 化する場合には、回収した環境 DMをデォキシリボヌクレアーゼ（以下、 「DNァー ゼ」 という）と反応させることで、 部分分解してもよレ、。 DN ァーゼとしては、 タ ィプ Iヌク レアーゼのような特異性の低いものが好ましく、 例えば、 DNァーゼ I が挙げられる。 あるいは、 環境 DNAを超音波処理に供し、 物理的に環境 DNAをせ ん断することで、 低分子化してもよい。 なお、 部分分解の条件は、 最終的に精製 した際に、 目的とする DNAサイズが得られる条件を選択する。 例えば、 DNァーゼ Iを使用して、 2Kbpサイズの環境 DNA断片が多く得られるための条件は、 以下の 表 2に示す反応条件が挙げられる。
反応条件
バッファ一組成 30m NaOAc, pH5. 2， 10mM MgCl2
DNA濃度 450 μ g/ml
DNase I 15 U/ml
反応温度と時間 25。Cで 15分 一方、 本発明に係る環境 DNAの精製方法では、 回収した環境 DNAをゲル濾過ク ロマトグラフィ一に供する。 ゲル濾過クロマトグラフィ一における排除限界は、 デキス トラン換算で、 10 a以上、 好ましくは 5 X 106 Da以上であることが好ま しい。 ゲル濾過クロマトグラフィーに使用する、 ゲル濾過担体及び/又はカラムと しては、 例えば、 Sephacry] S- 300HR、 Sephacryl S- 400HR、 Sephacryl S- 500HR、 Sepharose CL4B、 Sepharose CL6B、 Superose 6及び Superosel2など力 S挙げられ る。さらに、上記排除限界を有するものであれば、高速液体クロマトグラフィー（以 下、 「HPLC」 という）用の担体及び/又はカラムを用いてもよい。
ゲル濾過ク口マトグラフィ一で使用するバッファーとしては、例えば、 TE (10mM Tris-HCl, pH8. 0, ImM EDTA)、 TES (lOmM Tris— HC1， pH8. 0， ImM EDTA, 0. 2M NaCl) 等が挙げられる。
環境 DNAをゲル濾過クロマトグラフィーに供した後、 溶出することで得られた 画分が環境 DNAを含むか否かは、 例えば、 画分の一部をァガロースゲル電気泳動 に供することで確認することができる。 また、 得られた画分の環境 DNAの純度溶 出位置は、 画分の吸光度を測定し、 紫外部-可視部の吸光度波形、 え 260nm/280mn 比及びえ 260nm/230nm 比で判断することができる。 各画分の一部をァガロースゲ ル電気泳動に供し、 目的のサイズの環境 DNAを含む画分を選択してもよい。
本発明に係る環境 DNAの精製方法では、さらに環境 DNAの純度を上げるために、 ゲル濾過クロマトグラフィ一によつて得られた環境 DNAを含む画分をイオン交換 クロマトグラフィ一に供してもよい。樹脂は DE.AEのような弱陰イオン交換樹脂を 用いることが好ましい。 例えば、 50mM T s - HC1 (pH8. 0)、 I mM EDTA, 0. 2M NaCl 程度の低イオン強度のバッファ一で環境 DNAを吸着させ、 同バッファーで塩濃度 0. 5M NaCl程度のもので環境 DNA以外の不純物を洗浄除去し、 同バッファーで塩 濃度 1. 0M NaCl程度のもので環境 DNAを溶出する。
' イオン交換クロマトグラフィーに供した後、 得られた環境 DNAの純度は、 吸光 度を測定し、 紫外部-可視部の吸光度波形、 λ 260nm/280nm 比及び λ 260nm/230nm 比で判断することができる。 え 260nm/280nm比が 1. 8〜2. 0である場合に、 及び/ 又はえ 260nm/230nni比が 2. 0以上である場合に、 フミン酸及びタンパク質等の夾 雑物から環境 DNAを分離でき、 純度の高い環境 DNAが得られたと判断することが できる。 本発明に係る環境 DNAの精製方法では、 ゲル濾過ク口マトグラフィ一とイオン 交換クロマトグラフィ一との順番を上記記載と逆にしてもよく、 単独で用いても よい。 本発明に係る環境 DNAの精製方法において、 ゲル濾過クロマトグラフィー とイオン交換ク口マトグラフィ一とを用いるものが好ましい。
本発明に係る環境 DNAの精製方法では更にサイズを限定する場合には、 ァガロ ースゲル電気泳動後にゲルから DNA断片を切り出し、 市販のスピンカラム、 例え ばキアゲン（株）の QIA qu i ckで精製することができる。
本発明に係る環境 DNAの精製方法では、 例えば、 環境 DNAのサイズが 0. 5kbp〜 5kbpとなるように精製することができ、 更に好ましくは 0. 6〜4kbpであり、 特に 好ましくは 0. 8〜3kbpである。
以上のように、本発明に係る環境 DNAの精製方法によれば、純度の高い環境 DNA を得ることができる。 遺伝子ライブラリーの作製のための遺伝子工学的な処理、 例えば制限酵素処理、 PCR、 連結、 形質転換、 ファージ粒子へのパッケージング及 び in v i tro転写翻訳などの種々の反応においては、 夾雑物の影響を受けやすい。 本発明に係る環境 DNAの精製方法によって得られた環境 DNAは、純度が高いので、 上述した種々の反応において不都合なく使用することができる。
一方、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子のスクリ一ユング方法（以下、 「本発明に係るスクリーニング方法」 という）は、環境 DNAのディスプレイライブ ラリーを作製し、 上記ディスプレイライブラリーとリガンドとの相互作用に基づ いてリガンド認識クローン群をェンリ ツチしてスクリーユングすることを含む方 法である。 本発明に係るスクリーニング方法によれば、 リガンドを認識するタン パク質をコ一ドする遺伝子を環境 DNAの中より、 多数のクローンを一括して検索 することができるので、 短期間で省力的にスクリーニングすることができる。 こ とで、 「タンパク質をコードする遺伝子」 とは、活性や機能を有するタンパク質を コードする遺伝子又は遺伝子断片を意味する。
本発明に係るスク リーニング方法で使用する環境 DNAとしては、 例えば上述し た本発明に係る環境 DNAの精製方法で精製された環境 DNAが挙げられる。
本発明に係るスクリ一二ング方法では、 まず環境 DNAのディスプレイライブラ リ一を作製する。 ディスプレイライブラリーから所望のクローンを選抜する方法として、 ファー ジディスプレイ法、 リボソームディスプレイ法（し C. Matthekis et al. , Proc. Natl. Acad. Sc i. USA. , 91， . 9022, 1994)、 エマノレジョン法（Tawf ik D. S. & Griffth, A. D.， Nat. Biotechnol. , 16, p. 652-656, 1998. )、 STABLE ¾ (Doi, N. and Yanagawa, H. , FEBS Lett. , 457, p. 227-230, 1999)、 インビトロウィルス法 (Roberts, R. W & Szostak, J. W.， Proc. Natl. Acad. Sci . USA. , 94, p. 12297) 等が挙げられる。
ディスプレイライブラリ一の作製においては、 まず環境 DNAをベクターに連結 させる。 このベクターとして使用できるものとしては、 λ系ファ一ジ、 T7系ファ ージ、 M13系ファージ及び Τ4系ファージ等が挙げられる。
環境 DNAをベクターに挿入するには、 適当な制限酵素で環境 DNAを切断し、 次 いでこれを適当なベクタ一 DNA の制限酵素切断部位又はマルチクローユングサイ トに挿入して、ベクターに連結する方法が挙げられる。環境 DNAを平滑末端化し、 ベクタ一の制限酵素切断部位又はマルチクローニングサイ トに適合するようにァ ダプターを連結することもできる。
また、 ベクターにおいて、 宿主で発現し得るタンパク質をコードする遺伝子の 内部あるいは当該タンパク質の Ν 末端又は C 末端をコードする塩基配列に環境 DNA を挿入することもできる。 例えば、 ファージディスプレイライブラリ一にお いては、 ファージ中のコートタンパク質をコードする遺伝子の内部あるいは当該 コ一トタンパク質の Ν末端又は C末端をコードする塩基配列に環境 DNAを挿入す る。 このことにより、 環境 DNAによってコードされるタンパク質又はペプチドを コートタンパク質との融合タンパク質として、 ファ一ジ上に提示させることがで きる。 従って、 環境 DNAによってコードされるタンパク質又はペプチドはファー 上に提示される。
さらにベクターは、 環境 DNAの他に、 例えば、 遺伝子発現制御領域、 レポータ 一遺伝子及び選択マーカーを含むことができる。 遺伝子発現制御領域としては、 例えば、 プロモーター、 翻訳開始シグナル、 ェンハンサーなどのシスエレメント 等が挙げられる。 レポーター遺伝子としては、 例えば、 GFP ゃルシフェラーゼの ような蛍光、 発光遺伝子、 利用しやすい抗体の抗原となるタンパク質遺伝子等が 挙げられる。 選択マーカーとしては、 例えば、 Amp1^ Tetr, CnT、 Kn、 AUR1 - C等の 抗生物質耐性遺伝子等が挙げられる。 なお、 遺伝子発現制御領域、 レポーター遺 伝子及び選択マーカ一等のベクターへの挿入方法は、 上述した環境 DNAのべクタ 一の挿入方法と同様である。
次いで、 環境 DNAを含む組換えベクターを、 宿主中に導入することにより、 形 質転換体を得ることができる。 宿主としては、 上記組換えベクターを増殖させる ことができるものであれば特に限定されるものではない。
細菌への上記組換えベクターの導入方法は、 細菌に DNAを導入する方法であれ ば特に限定されない。 例えば、 ファージ感染、 カルシウムイオンを用いる方法、 エレク トロポレーシヨン法等が挙げられる。
次いで、 形質転換体を増殖させることで、 環境 DNAを含む組換えベクターを増 幅することができる。
なお、 組換えべクタ一に使用したベクターがえファージ、 T7 ファージ及び T4 ファージなどのファージ DNAである場合には、 パッケージング反応終了後に、 大 腸菌等の宿主に感染させることで、 形質転換することができる。 次いで、 形質転 換した大腸菌を増殖させることで、 組換えファージ DNAを増幅させることができ る。 次いで、 宿主を溶菌させることで、 増幅したファージを得ることができる。 ファージディスプレイライブラリーでは、 増幅したファージをそのままライブ ラリーとして使用することができる。 ファージディスプレイライブラリ一におい て、 ファージが環境 DNAを有するか否かは、 プラーク PCR等の PCRにより確認す ることができる。
インビト口発現ライブラリ一においては、 細胞は用いずに細胞抽出液を用いて 銹型 RNAから翻訳または铸型 DNAから転写翻訳を行わせライブラリーとする。 環 境 DNAは細胞抽出液中でタンパク質として発現できるよう、 プラスミ ドベクター と連結したり、 プロモータ一や翻訳開始信号を保有し、 融合タンパク質相手をコ 一ドする DNA断片と連結して铸型として用いる。
一方、 本発明に係るスクリーニング方法では、 環境 DNAのディスプレイライブ ラリーに対する対象のリガンドを固定化担体に固定化することができる。 あるい は、 対象のリガンドを標識化することができる。 本発明に係るスクリーユング方法において、リガンドとしては、例えば多糖類、 タンパク質、 脂質等のような高分子の酵素基質； NADH、 NADPH、 FMN、 SAM、 ァセチ ル CoA、 ATP、 ADP、 cAMP、 GST、 リボフラビン等のような補酵素； ァミラーゼィン ヒ ビター、 プロテアーゼインヒビタ一等の酵素インヒ ビター；糖、 アミノ酸、 脂 肪等のような低分子酵素基質；生体内代謝産物；医薬品等の薬物等が挙げられる。 特に、 リガンドとしては、 シクロデキストリン、 アミロース及びァカボース等の 糖類が挙げられる。
例えば、 環境 DNAのディスプレイライブラリーから、 酵素又は酵素断片をスク リーニングする場合には、 基質や補酵素や阻害剤をリガンドとする。 なお、 活性 の高い加水分解酵素をスクリ一二ングする場合には、 リガンドとは結合するが、 リガンドが分解されない条件でスクリーニングを行う。 さらに、 デンプンゃセル ロースのような不溶性粒子をリガンドとする場合には、 当該リガンドをそのまま 固相として使用することができる。
2 種以上のリガンドビーズや担体の使用を組み合わせて、 両方のリガンドを認 識する集団や片方のリガンドのみ認識する集団の選抜、 または担体自体に結合す るものの除去を行うことができる。
固定化担体としては、 例えば、 ァガロースビーズ、 ィムノビーズ、 親水性ビー ズ及び磁性ビーズなどのビーズ、並びに酵素免疫測定法（EIA)用のプレート等が挙 げられる。 あるいは、既に様々な物質を担持した市販のァガロースビーズ（例えば Sigma- Aldrich製）をそのまま使用することもできる。 その場合には、 当該ァガロ ースビーズに担持された物質がリガンドとなる。
本発明に係るスクリ一ニング方法では、 固定化担体に対して対象のリガンドを 相互作用させ、 当該対象のリガンドと固定化担体とを結合させる。 例えば、 固定 化担体表面に配したアミノ基、 カルボキシル基、 水酸基、 エポキシ基及びトシル 基などの官能基を利用して、 リガンドを共有結合させることができる。 固定化担 体の官能基がカルボキシル基である場合、 例えば固定化対象のリガンドに存在す るァミノ基と官能基との間で共有結合を形成、 すなわちアミンカップリングを形 成することができる。 また、 固定化担体の官能基がカルボキシル基である場合、 カルボキシル基を PDEA化することにより、対象のリガンドに存在する遊離のチォ ール基と反応基との共有結合を形成、 すなわちリガンドチオールカツプリングを 形成することができる。さらに、対象のリガンドがカルボキシル基を有する場合、 予め当該ジガンドを PDEA (2- (2-pyr idinyld i thio) ethaneam ine hydrochlor ide) と反応させてカルボキシル基を PDEA化する。 また、固定化担体のカルボキシル基 を活性化させた後に、 当該カルボキシル基を cystami ne di hydrochlorideと反応 させ、その後 di thi othre i tol (DTT)で還元することによりチオール基に変換する。 そして、 PDEA化したカルボキシル基と、 固定化担体側のチオール基との間で共有 結合 （ジスルフィ ド結合） を形成する。 すなわち、 サーフェスチオールカツプリ ングを形成することができる。
また、 本発明に係るスクリーニング方法では、 対象のリガンドを標識化するこ とで、当該標識に基づいてリガンドに結合したクローンを溶出することができる。 標識化としては、 例えば、 ピオチン化や蛍光物質等による標識が挙げられる。 例 えば、 対象のリガンドをピオチン化し、 溶液中でリガンドとディスプレイライブ ラリーとを相互作用させる。 次いで、 ストレプトアビジンビーズを用いて、 当該 リガンドに結合したクローンを溶出することができる。
本発明に係るスクリ一ユング方法では、 ディスプレイライブラリーとリガンド との相互作用に基づいてスク リーニングする。 ここで相互作用とは、 ディスプレ イライブラリーとリガンドとの親和的結合や酵素反応等を意味する。 スクリー二 ングは、 ァフィ二ティーセレクションにより行われる。 ァフィ二ティーセレクシ ヨンは、 結合反応、 洗浄及び溶出等の工程より成る。
バッファーには、 ΈΙΑと同様に疎水性相互作用によるノイズを軽減するために、 0. 05〜1 %程度の Tween20、 Tri ton- X100及び NP- 40などの非極性界面活性剤を添 加することができる。 バッファーの pHは、 pH2〜12の範囲で目的に応じて一般的 'な生化学バッファーを選択すればよい。 例えば、 ファージディスプレイライブラ リー中のファージの生存が許容できないバッファーの pHの範囲であっても、 1サ イタルのみのァフィ二ティーセレクションは可能である。
一方、 リガンドを担持する固定化担体は、必要に応じて、 0. 1〜5%程度の BSA、 スキムミルク、 ゼラチン又はコラーゲンなどのタンパク質性ブロッキング剤中で
1 時間以上置き、 ブロッキングする。 低分子リガンドによってはブロッキングし ない方が好ましい場合もある。
ァフィ二ティーセレクションにおいての結合反応は、目的に応じて- 10°C〜80°C で行うことができる。 また、 この結合反応の反応時間は、 目的とする結合特性や Kon値に応じて 1分〜 24時間の間で行えばよい。 通常、 ファージディスプレイラ イブラリーは、 大腸菌等の宿主に感染させ、 この宿主が溶菌した溶菌液を用いて 操作する。 この溶菌液中にリガンドとの結合反応を阻害するような物質が含まれ ている場合は、 適当な孔サイズのゲル濾過膜又は透析により当該阻害物質を除去 し、 バッファーを置換することにより使用することができる。 あるいは、 この溶 菌液中のファージをポリエチレンダリコール等で沈殿させ、 上清を交換したもの を用いてもよい。
ァフィ二ティーセレクションにおいて洗浄は、 リガンドを担持する固定化担体 の体積の 10倍〜 50倍程度の洗浄バッファーで 1分以上混合し、 バッファーを交 換する。 この交換の回数は、 例えば 1回〜 20回とすることができる。 洗浄バッフ ァ一の除去は、 リガンドを担持する固定化担体の遠心沈殿または遠心フィルター ' 後、 吸引除去などで行う。 あるいは、 フィルターユニッ トとスピンカラムまたは バキュアム方式によって洗浄バッファーを除去してもよい。 また 2相分配法ゃ磁 気ビーズを利用した洗浄もできる。
一方、 ァフィ二ティーセレクションにおいて溶出は、 一般的には、 対象のリガ ンドと競合するリガンド溶液を用いて、 温和な条件で競合的に溶出するのが好ま しい。 必要に応じて対象のリガンドとディスプレイライブラリ一中のクローンと の相互作用を壊すような、 強い条件、 例えば低い ρΗ若しくは高い ρΗ、 高温下若 しくは低温下、 又は尿素や界面活性剤等を含むバッファーで溶出することも可能 である。 また溶出剤が以後の操作で宿主に不都合な場合は溶出操作は行わず、 ビ ーズに結合したまま、 宿主細菌に添加することもできる。
この溶出液は、 通常はクローン増幅に供する。 また、 選択性を向上させるため に更に異なるリガンドを用いてァフィ二ティーセレクションを行ってもよい。 ファージディスプレイライブラリーより得られた溶出液中のファージクローン は、 大腸菌などの宿主に感染させることで増幅することができる。 なお、 溶出液 に対象のリガンドを含む場合又は対象のリガンドと競合する溶液を用いた場合は、 W 増幅サイクルを阻害するので、 ファージクローンを宿主に感染後、 ファージ感染 宿主を遠心分離することによりこれを除去することができる。 あるいは、 ファー ジ感染宿主を溶菌した後、 溶菌液からバッファー置換により、 リガンド又はリガ ンドと競合する溶液を除去することができる。 ファージクローンの増幅は、 溶菌 液のファージカ価をモニターすることにより確認することができる。
一方、 ファージを利用しないディスプレイライブラリーの場合には、 PCR 等に より遺伝子増幅を行う。
ファージクローンの増幅又は遺伝子の PCR等による増幅後、 ファージクローン 又は PCR等の産物を鎵型としたプラーク PCR等の PCRにより、 スクリ一二ングさ れた環境 DNAを増幅する。 次いで、 この増幅したものをァガロースゲル電気泳動 に供することで、 環境 DNAを確認することができる。 さらに、 環境 DNAの配列決 定分析により、 環境 DNAの塩基配列を決定することができる。
本発明に係るスクリ一二ング方法において、 ディスプレイライブラリ一がファ ージディスプレイライブラリ一を用いた場合には、 環境 DNAから発現されるタン パク質やペプチドは、 ファージ表面上に融合タンパク質として提示される。 得ら れた環境 DNAは、 完全なコーディング配列ではなく、 通常、 N末端配列又は C末 端配列を一部欠いている場合がある。 そこで、 得られたファージクローンが有す る環境 DNAの配列情報から、 完全なコーディング領域を得るために、 RACE (Rapid Ampl if icat ion of c DNA ends) と同様の手順で、 上流もしくは下流のコーディン グ領域を補う必要がある。 スクリーニング前のファージディスプレイライブラリ 一には、 非翻訳領域があるために融合しなかったクローンも含まれている。 その ため、 上流もしくは下流のコーディング領域の配列情報を得るためには、 クロ一 ンから得た配列情報に基づいて、 外側に向かうプライマーとアダプタ一配列又は 'ファージ DNA配列を含むプライマ一とを用いて、 スクリ一二ング前のファージデ イスプレイライブラリ一 DNAを铸型として PCRを行う。
このようにして上流又は下流のコーディング領域が得られたら、 例えば、 切り つなぎゃリコンビナント PCR法（Higuchi, R.， （"Recombinant PCR」， PCR Protocol s, p. 177-183, M. A. Innis ら編， Academic Press, Inc.， 1990)によって連結し、 完 全なコーディング領域を得ることができる。 W また、 得られたファージクローンが有する環境 DNAの配列情報を、 塩基配列レ ベル又はァミノ酸配列レベルで遺伝子データベースと照合し、 相同性分析を行う ことで、 当該環境 DNAがコ一ドするタンパク質の機能又は活性を予測することが できる。
環境 DNAから遺伝子又は遺伝子断片を単離し、 同定した場合には、 上述したよ うに、 当該遺伝子又は遺伝子断片を宿主に導入することで、 形質転換体を得る。 形質転換体において当該遺伝子又は遺伝子断片がコードするタンパク質又はぺプ チドを発現させることで、 当該タンパク質又はべプチドが有する機能や活性を調 ベることができる。
ェンリツチされた集団の中には、 完全なコーディング領域ではなく とも触媒活 性を発揮できる領域を保持したクローンが含まれていることがある。 更に省力化 できる手法として、 エンリッチされた集団のインサートに対して、 アダプター配 列かベクター配列のような共通配列のプライマーを用いてまとめて PCR法などで 増幅する。 そして、 これを適当な細胞内発現ベクターまたは分泌発現ベクターに 連結し、 形質転換体をまとめて得て、 エンリ ッチされたミニ発現ライブラリーと することもできる。 これらを'、 従来法のように目視で選抜できるような試薬を含 む寒天培地で活性クローンを選抜することができる。 従来法と異なる点は、 既に 特定リガンドを認識して結合するクローン集団として例えば 1 0 0 0倍程度、 ェ ンリ ツチされている点で、 目的クローンの頻度向上が期待できる。 .
活性の検出方法としては、 次のようにすることができる。 例えば、 糖やタンパ ク質ゃ脂肪の加水分解活性を探す場合は、 デンプン、 カゼイン、 油脂などの水不 溶性基質を培地に混合して培養し、 分解されたクリァ一ゾーンまたはハローを探 す。 その他、 従来の酵素スク リーニングに用いられる、 pH指示薬や種々の酵素活 性測定用の呈色反応、 蛍光反応、 発光反応試薬、 抗体などが利用できる。
以上のように本発明に係るスクリ一ユング方法によれば、 環境 DNAから作製し たディスプレイライブラリ一から目的のタンパク質をコードする遺伝子を効率的 にスクリーニングすることができる。 本発明に係るスクリーニング方法において ファージディスプレイライブラリ一を採用した場合には、 リガンドと結合したフ ァージクローン群を濃縮し、 増幅することができる。 従って、 目的のタンパク質 をコードする遺伝子を選抜する際の労力と時間が大幅に節約することができる。 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2004-170161号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1 Aは、 UltraCleanで回収した陽性対照である純粋 DNA標品（ λファージ）の 吸光度波形を示す。
図 1 Βは、 UltraCleanで回収した土壌 DNAの吸光度波形を示す。
図 2は、 ゲル濾過クロマトグラフィー後の土壌 DNAを含む画分の吸光度波形を 示す。
図 3は、 DNaselによる部分分解に供した土壌 DNAのァガロースゲル電気泳動パ ターンを示す。
図 4 Aは、 FPLCの際の各画分の 280nm吸光度を示す。
図 4 Bは、 FPLC後の各画分のァガロースゲル電気泳動パターンを示す。
図 5は、 精製ファージえ DNA と比較した精製土壌 DNAの吸光度スぺク トノレノ タ ーンを示す。
図 6は、 精製土壌 DNAのァガロースゲル電気泳動パターンを示す。
図 7は、 末端平滑化土壌 DNAとアダプターとの連結のスキームを示す。
図 8は、 アダプター連結後にゲルから精製した DNA断片のァガロースゲル電気 泳動パターンを示す。
図 9は、 ライブラリ一 #17のァガロースゲル電気泳動パターンを示す。
図 1 0 Aは、 各ラウンドのファージ溶液の力価推移を示す。
図 1 0 Bは、 各ラウンドのインプッ トファージ数に対する回収率推移を示す。
' 図 1 1は、 各ラウンドのプラーク PCR産物のァガロースゲル電気泳動パターン を示す。
図 1 2は、 P31 のアミノ酸配列と保存データベースの相同性配列とのァライン メントを示す。
図 1 3 Aは、 P31 のアミノ酸配列との相同性が 1位であるタンパク質のアミノ 酸配列とのアラインメントを示す。 図 1 3 Bは、 P31 のアミノ酸配列との相同性が 2位であるタンパク質のアミノ 酸配列とのァラインメントを示す。
図 1 3 Cは、 P31 のアミノ酸配列との相同性が 3位であるタンパク質のアミノ 酸配列とのァラインメントを示す。
図 1 3 Dは、 P31 のアミノ酸配列との相同性が 4位であるタンパク質のアミノ 酸配列とのァラインメントを示す。
図 1 4 Aは、 対照の野生型ファージ T7SC1 と比較した P31提示ファージクロー ンの β -及び γ -CD-セファロース 6B ビーズへの結合を示す。
図 1 4 Bは、 対照のセファロース 6B ビーズ（S6B)と比較した、 P31提示ファー ジクローンの j3 -及び γ - CD-セファロース 6B ビーズへの結合を示す。
図 1 4 Cは、 1%デンプンによる P31提示ファージクローンと 及び γ -CD-セ ファロース 6B ビーズとの結合阻害を示す。 '
図 1 5は、 AE1 のアミノ酸配列と相同性配列を有するタンパク質のアミノ酸配 列とのァラインメントを示す。
図 1 6は、 P31をコードする遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を示す。
図 1 7は、 AE1 中のィンサ一ト DNAを含む遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列 を示す。
図 1 8は、 E. C. 3. 2. 1ファミ リ一の β -キシロシダーゼ、 グノレコシダ一ゼのァミ ノ酸配列と実施例 7で得られた 1種の遺伝子断片によってコードされるタンパク 質のァミノ酸配列とのァラインメントを示す。
図 1 9は、 E. C. 3. 2. 1. 3,ダルコアミラーゼのアミノ酸配列と実施例 7で得られ た 1種の遺伝子断片によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列とのァライ ンメントを示す。
' 図 2 0は、 実施例 7で得られた 1種の遺伝子断片の塩基配列及びこれによつて コードされるタンパク質のァミノ酸配列を示す。
図 2 1は、 実施例 7で得られた ]種の遺伝子断片の塩基配列及びこれによつて コードされるタンパク質のァミノ酸配列を示す。
図 2 2は、 E. C. 4. 2. 1. 16, dTDP グルコース脱水酵素のアミノ酸配列と実施例 8 で得られた遺伝子断片によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列とのァラ インメントを示す。
図 2 3は、 実施例 8で得られた遺伝子断片の塩基配列及びこれによつてコード されるタンパク質のアミノ酸配列を示す。 発明を実施するための最良の形態
〔実施例〕
以下、 実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、 本発明の技術的範囲は これら実施例に限定されるものではない。
〔実施例 1〕 環境 DNAの精製
1— 1. 土壌からの DNA抽出
つくば巿大久保の森林において、落葉下表層土から下に 10cmの位置にある黒色 腐葉土を、 2001年 11月に採取した。 この土壌サンプル 16gと UltraClean™； Soi l DNA ki t Mega Prep (MoBio Lab. , Inc. ) , Catalog#12900— 10, Lot #SD1 I13 とを 用いて、 マニュアルに従って、 DNAを抽出し、 約 1. 4mgの DNAが得られた。 得ら れた DNA溶液はやや褐色に着色していた。
土壌から得られた DNA (以下、 「土壌 DNA」 という）を、 吸光度測定に供した。 測 定の結果、 得られた吸光度波形を図 1 A及び Bに示す。 図 1 Aは、 陽性対照である 純粋 DNA標品（λファージ）の吸光度波形である。 一方、 図 1 Bは、 土壌 DNAの吸 光度波形である。
また、え 260nm/230nm比は、純粋 DNA標品（えファージ）が 1. 49、土壌 DNAが 0. 95 であった。
1— 2. ゲル濾過ク口マトグラフィ一による土壌 DNAの予備検討
次に、上記 1— 1で得られた土壌 DNA溶液をゲル濾過クロマトグラフィーに供し 。
ゲル濾過クロマトグラフィーは、 以下の表 3に示す分析条件で行った。 表 3
： 土壌 DNA (95 β g)溶液 270 μ 1
： Sepharose CL4B (Amersham-Pharmacia) 3ml ： TE (lOmM Tris-HCl, pH8. 0, ImM EDTA)
：約 350 μ 1 ゲル濾過ク口マトグラフィ一は、 フロースルー画分である Fr. # 4力、ら土壌 DNA の溶出が始まり、 およそ Fr. # 10まで続いた。 土壌 DNA溶液に含まれる褐色物質 は、 主に低分子側に分布した。
画分の UV吸収波形を図 2に示す。 なお、 図 2において、 Aの実線は基準線であ り、 B の破線は純粋 DNA 標品（えファージ DNA)である。 また、 Fr. # 4 のえ 260nm/230nm及びえ 260nm/280nm比はそれぞれ、 1. 83及び 1. 57であった。さらに、 Fr. # 8のえ 260nm/230nm及び λ 260nm/280nni比はそれぞれ、 2. 0及び 1. 1であった。 以上の結果から、 当該分画範囲のゲル濾過は、 λ 260ηπι/230ηπι 比が高いことか ら、 大部分のフミン酸を分離するのに有効であった。 しかし、 当該分画範囲のゲ ル濾過は精製度の向上に有効ではあるものの、 え 260nm/280nm比が低いこと力 ら、 タンパク質が混在しており、 不十分であることが判った。
1 - 3. 土壌 DNAの部分分解の条件検討
上記 1—1で得られた土壌 DNAを用いて、 DNaselによる部分分解で 2Kbpが最も 多く生じる条件を調べた。 DNァ一ゼ I以外の反応条件は、 以下の表 4に示す通り であった。 反応は、 5mMEDTAを添加することで停止させた。 表 4 反応条件
ノくッファ—組成 30mM NaOAc, pH5. 2, 10mM MgCl2
DNA濃度 450 μ g/ml
反応温度と時間 25°Cで 15分 反応生成物をァガロースゲル電気泳動に供した。 結果を図 3に示す。 図 3にお いて、 各レーンは、 以下に示す DNasel濃度（U/ml)で処理したサンプルである ； レ ーン 1： 245 U/ml、 レーン 2： 122 U/ml、 レーン 3 : 61 U/ml、 レーン 4： 30. 6 U/ml、 レーン 5： 15. 3 U/ml及びレーン 6： 0 U/ml。 また、 レーン M及び 7は、 分子量マ —カー（1Kb ladder marker)でめる。
図 3から判るように、 約 15 U/ml (すなわち、 レーン 5 の 15. 3 U/ml)の濃度の DNァーゼ Iで土壌 DNAを処理した場合に、 2Kbpの DNA断片が最も多く生じること が判った。
1 -4. 土壌 DNAの FPLCによる精製
上記 1—1で得られた土壌 DNAを、 表 4に示す条件下で、 DNァーゼ I (15U/ml) で処理し、 部分分解することで、 2Kbpの DNA断片を得た。 次いで、 土壌由来夾雑 物と低分子 DNAを除く 目的で、 2Kbpの DNA断片を含むサンプルを、 ゲル濾過用力 ラム Superose 6 (Amersham— Pharmacia)を用レヽた FPLC tこ供した。 なお、 FPLC fま、 下記の表 5に示す条件で行った。 表 5
FPLC分析条件
DNァ一ゼ Iで部分分解した土壌 DNA (100 i g)を含む溶液 100
： Superose 6 (排除限界 4x 107Da) φ 10mm x 300mm
： TES (lOmM Tris-HCl, pH8. 0, lmM EDTA, 0. 2M NaCl) ： 0. 3ml/分 、
：約 lml
： Photometric scaning, AGE (Agarose Gel Electrophoresi s)
FPLCのチヤ一ト（各画分の 280nm吸光度）を図 4 Aに示す。 また、 及び Fr. # 6〜
# 11のァガロースゲル電気泳動パターンを図 4 Bに示す。
図 4 Aから判るように、 DNAは Fr. #7以降に溶出した。 なお、 図 4 Bに示すァガ ロースゲル電気泳動パターンから、 Fr. #16以降の吸収は DNA由来ではないことを 確認した。
図 4 Bに示すァガロース電気泳動の結果に基づいて、 0. 5Kbp以下の DNA断片を 避けるために、 小断片の少ない Fr. #7〜# 9を回収し、 プールした。 精製度指標の 吸光度比は、 λ 260/280=約 1. 7及びえ 260/ 30=約 0. 55であった。
1 - 5. イオン交換クロマトグラフィーによる精製
上記 1—4で得られた Fr. # 7〜# 9の DNAプールの純度をさらに上げるために、 上記 DNAプーノレ 4. 5mlを、 QIAGEN Plasmid Midi k it (100)を添付マニュアルに従 つて使用し、精製した。得られた DNAの吸光度スぺク トルパターンを図 5に示す。 図 5において、 Eluent 1が DNAプールの精製 DNA、 え（cone. )及びえ（dil. )が、 純 粋な DNA標品のファージぇ DNAを示す。
図 5から判るように、 吸光度スぺク トルパターンに関して、 最終精製 DNAは、 純粋な DNA標品のファージぇ DNA と比較して全く遜色なかった。 最終精製 DNAの 吸光度比は、 ；L 260nm/280nm=1. 91及び λ
Figure imgf000029_0001
12であり、従来の精製土 壌 DNAと比べて、高純度な土壌 DNAが得られた。図 6は、 DNAプールの精製 DNA (レ ーン 4)の電気泳動パターンを示す。 図 6から判るように、 分解は起きておらず、 2Kbp付近がメジャーとなっている。
〔実施例 2〕 メタゲノムディスプレイライブラリ一の作製
2 - 1. アダプターの調製
Hindアダプターを、 以下の合成ォリゴヌクレオチド HdAd5 と pHdAd3 とをァニ —リングさせるこ で作製した。
HdAd5： 5' -HO-AGCTTAGTGAGTGAGTCCT 3' (配列番号 1 )
pHdAd3： 5' -pAGGACTCACTCACTA 3' (配列番号 2 )
' (Pはリン酸化を表す）
また、 Ecoアダプターを、以下の合成オリゴヌクレオチド pEcoRIL3と EcoRIAd5 とをァニーリングさせることで作製した。
pEcoRIL3 ： 5' -pGTCGACGCGGCCGCG 3' (配列番号 3 )
(pはリン酸化を表す）
EcoRIAd5 ： 5' - HO- AATTCGCGGCCGCGTCGAC 3' (配列番号 4 ) Hindアダプターの作製において、 HdAd5(15;U 1)及び PHdAd3 (15 x 1) (各々終濃度 37.5μΜ)並びに 20XSSC(10/x 1)を混合した。 一方、 Ecoアダプターの作製におい て、 pEcoRIL3(15// 1)及び EcoRIAd5(15// 1) (各々終濃度 37.5^Μ)並びに 20XSSC (10/ l) を混合した。 次にこれらの溶液を、 Thermal cyclerを用いて 96°Cにて 3分間インキュベートし、 1時間かけて 60°Cまで温度を下げた。次いで、溶液を、 60°Cにて 30分間ィンキュベ一 した後、 1時間かけて 40°Cまで温度を下げた。 さ らに、 溶液を、 40°Cにて 30分インキュベートした後、 直ちに 25°Cまで温度を下 げ、 10分間インキュベートすることで、 Hind及び Ecoアダプターを得た。 ァダプ
、」 ターのァニール化は、 5%ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動で分析することで確認 した。
2-2. 土壌 DNAの末端平滑化
実施例 1においてイオン交換ク口マトグラフィ一により精製した土壌 DNAを、 TAKARA Blunting Kitを用いて末端平滑化を行った。 次いで、 0.5 mlチューブに、 土壌 DNA2.5 g、10Xバッファー 1·0Μ 1及び蒸留水 4.0 1を加えた。この溶液を、 75°Cにて 5分間インキュベートした後、 T4 DNAポリメラーゼ Ι.Ομ Ι を加え、 ピ ぺッ トを用いて穏やかに攪拌した。 さらに、 溶液を 37°Cにて 5分間インキュベー トした後、 ボルテックスミキサーにて激しく攪拌して酵素を失活させた。 溶液に TEバッファー 40 1を添加した後、 全溶液を 1.5mlチューブに移し替えた。
当該溶液に等量のフエノールを加えて 2回抽出を行った後、 等量のクロロホル ムを加えて抽出を行い、 DNA水溶液約 90// 1 を得た。 この DNA水溶液にグリコー ゲン 2. 1及び 3MNa0Ac 9.0 1を加えて、 よく攪拌した。 さらに 2.5倍容量の 冷エタノールを添加して DNA溶液に加えて、 DNAを沈殿させ、 15， OOOrpmにて 10 分間遠心を行つた。次いで、上清を除き、沈殿物を 75%ェタノールにて洗浄した。 土タノ一ルを完全に除いた後、 沈殿物を TEバッファー 10/i 1に溶解し、 末端平滑 化 DNA溶液を得た。
2— 3. 末端平滑化土壌 DNAへのアダプター連結
末端平滑化土壌 DNAとアダプターとの連結を、 TAKARA DNA ligation kit Ver.2 を用いて行った。 末端平滑化土壌 DNAとアダプターとの連結のスキームを図 7に 示す。 まず、 末端平滑化土壌 DNA4.4^ 1、 蒸留水 11.6 μ 1、 並びに末端平滑化土壌 DNAの約 100倍モル数の Eco及び Hindアダプター （各 2. 0 μ 1) を混合した。 混合 液に等量 （20 μ 1) の Solutionll溶液および 2倍量 （40 1) の Solution I溶液 を添加し、 16°Cにて 30 分間インキュベーションを行うことで、 末端平滑化土壌 DNAにアダプターを連結させた。 この DNA溶液をフエノール及びク口口ホルム抽 出に供した後、 さらにエタノール沈殿に供した。 次いで、 沈殿物を TEバッファー に溶解した。
2 -4. ァガロースゲル電気泳動による連結産物の精製
未反応のアダプターを除くために、上記 2— 3で得られたアダプタ一連結産物を ァガロースゲル電気泳動に供し、 同一ゲル内に流した分子量マーカーを指標に、 0. 5〜1. 3Kbp及び 1. 3〜2. OKbpの断片を切り出した （図 8 )。 図 8において、 レー ン Mは分子量マーカ一を示し、 レーン IS11Cは 0. 5〜1. 3Kbpの断片を含むァダプ ター連結産物 IS11Cを示す。 また、 レーン IS11Bは 1. 3〜2. OKbpの断片を含むァ ダプター連結産物 IS11Bを示す。
ゲルから切り出したアダプター連結産物を、 QIAGEN 社の Mini Elute Gel Extraction Kitをマニュアルに従って用いて抽出した。 調製したアダプター連結 産物に含まれる土壌腿由来のィンサ一ト DNAを形質転換効率に従って評価する ために、 アダプター連結産物をベクター pUC9 Eco/Hind に挿入し、 次いで大腸菌 (COMPETENT High DH5ひ （T0Y0B0) )に形質転換した。 この際、 陽性対照 DNAとして 精製プラスミ ド由来の cry 1. 5Kb Eco/Hind DNA断片と比較して、 アダプター連結 産物の lOOfmol当たりの形質転換効率が 30%程度であることが確認された。
2 - 5. 土壌 DNA由来ィンサ一ト DNAとベクター DNAとのェタノール共沈殿
好ましいィンサート /ベクター比となるようにアダプター連結産物（以下、 「ィ ンサ一ト DNA」 とレヽう）とベクター DNA (T7 SELECT 10- 3b)を以下の表 6に示すよう 'に混合した。 表 6 ライブラリー #17 (インサート /ベクター = ) ；
ベクター DNA溶液 ： 50 μ 1 (0. 5 μ g： 21. 5fmol) ィンサート DNA (アダプター連結産物） IS11C： 2 x l (86fmol)
次いで、 混合液にグリコーゲン 2 /z 1 と lZlO容量の 3M NaOAcを添加した。 さ らに、 2. 5倍量の冷エタノールを添加して、 氷冷下で放置し、 DNAを沈殿させた。 沈殿物を 15, 000rpm、 10分間遠心することで回収し、 75%エタノールにて洗浄し た後、 残存するエタノールを減圧下で除去した。
なお、 ィンサート DNA (アダプター連結産物） IS11Bのライブラリー # 16に関し ても、 同様にィンサート DNA (アダプター連結産物） IS11Bとベクター DNAとを共沈 殿させた。
2— 6. 土壌 DNA由来ィンサート DNAとベクター DNAとの連結
上記インサート DNAとベクター DNAとの共沈殿物に、 滅菌蒸留水（S. D. W. ) ； 3. 0 μ 1、 10χノくッファー ； 0· 5 μ 1、 10mM ATP； 0. 5 μ 1及び Τ4 DNA リガーゼ； 1. 0 1 を加えて全量を 5. 0 1 とした。 この反応液を、 16°Cで 17時間、 エアーインキュ ベータ—内にてインキュベートすることにより、 インサート DNA とベクター DNA との連結反応を行った。 反応後、 溶液を次のパッケージング操作に備えて、 減圧 下で 2. 5 μ 1まで濃縮した。
2 - 7. Τ7 ファージへのパッケージング
Packaging extract (Novagen T7 Select 10— 3 cloning kit) 12. 5 1に、 上 己 2 一 6で得られたィンサ一ト DNA IS11Cを含む組換えベクター 2. 5 1を加え、 泡立 たないように気をつけながら合わせた。 この溶液を 22°Cで 2時間ィンキュベート した。 2時間後、 反応を停止させるために、 溶液に LB培地 135 1 を加え、 総量 150 i 1 のィンサート DNA IS11Cをパッケージングした T7 ファージパッケージ一 ング溶液 （以下、 「ライブラリー # 17」 という） を得た。
一方、 インサート DNA IS11Bに関しては、 ライブラリー # 17の 2倍スケールで 行い、ィンサート DNA IS11Bをパッケージングした T7ファージパッケージーング 溶液 （以下、 「ライブラリー # 16」 という） を得た。
Novagen のマニュアルに従いプラークアツセィにより力価を確認したところ、 ライブラリー #16の力価が 9. 1 X 107pfu/mlであり、 また、 ライブラリ一#17の力 価が 2. 37 X 108pfu/mlであった。
2 - 8. ィンサーション頻度
ライブラリー # 16と # 17のインサーション頻度を調べるために、プラーク PCR を行った。 まずライブラリー # 16及び # 17のファ一ジ液をプレートに播き、各プ レート上に形成されたプラークを妻楊枝にて突き、 PCR用 Reaction Mixture (プ ライマ一； 0. lpmol, Ex Taq enzyme ; 0. 0313を含む） 15〜20 μ 1に懸濁した。 その 際プライマーは Novagen社の Τ7 upおよび T7 downを用いた。 PCR反応は、 サー マルサイクラ一を用いて、 1) 1サイクル； 96°C/3分、 2) 33サイクル； 94°C/30秒、 50°C/30秒、 72°C/2分、 及び 3) 1サイクル； 72°C/10分で行った。 反応終了後、 PCRサンプル 5 μ 1に BPB dye 1 // 1を添加し、 0. 8°/。ァガロースゲルにて 100Vで 35 ^間電気泳動し、 インサート DNAを含むファージの割合を算出した。 ライブラリ 一 # 17のァガロースゲル電気泳動の結果を図 9に示す。 図 9において、 各レーン の番号は PCRサンプル番号を示し、 またレーン Mは分子量マーカーを示す。 ライ ブラリー #16において、 インサ一シヨン頻度は約 15%であった。 一方、 ライブラ リ一 #17において、 ィンサーション頻度は約 50%であった。
2 -9. ライブラリ一の増幅
ライブラリ一 #16 (300 μ 1 )及びライブラリ一 #17 (150 μ 1)を、各々 5ml及び 10ml の宿主大腸菌 BLT5615 に感染させた後、 溶菌化させ、 溶菌液ライブラリー #16P1 及びライブラリ一 #17P1を調製した。溶菌液ライブラリ一 #16P1及びライブラリー #17P1 の力価は、 双方とも約 5 X lO^pfu/mlであった。 一方、 増幅処理によりィ ンサーシヨン頻度はやや低下した。 ライブラリー #16P1 において、 インサーショ ン頻度は約 10%であった。 また、 ライブラリー #17P1において、 インサーシヨン 頻度は約 33%であった。
2— 10. ィンサー卜 DNA塩基配列の解析
ライブラリー # 17P1の中で、 フ。ラーク PCRによりインサート DNAを含むことが 確認された 20クローンの PCR産物の塩基配列を平均 460塩基ほど調べた。 その DNA配列を Genbankなどの既知塩基配列データベースに対して BLASTnによる相同 性検索に供した （2002年 7月現在）。 その結果を表 7に示す。
ライブラリ-—#17に含まれるインサート DNAの相同性解析
クローン 解析した ORF* Blastn** Blastx又は Tblastx seach** フレーム 相同性 E-値
No. (aa) サーチ Top hit species Top hit entity
1 392 - 一 一 -
2 503 厶 - ethanosarcia acetivorans Genome +1 36% 3E-12
3 380 - ― inorhizobium meliloti fransposase - 3 57% 3E-42
4 148 - 一 Streptomyces coelicolor Genome - 2 63% 2E-34
5 381 ◎ - 一 -
6 331 - 一 Clostridium perfringens Transketorase 一 1 57% 1 E- 21
7 219 △ - ■ - -
8 262 - - 一 -
9 479 Δ 一 Thermoaerobactor Membrane protein - 3 50% 1 E-29 tengcongensis
10 277 △ 一 一 -
1 1 123 - 一 Escherichia coli O - 157 Genome -1 40% 1 E-04
1 2 127 Δ - - 一
13 450 - - - -
14 636 一 一 Clostridium perfringens Folyl-polyglutamate - 1 60% 1 E-27 synthase
15 497 一 - 一 -
16 459 一 一 Rastoniasolanacerum GSPE-related protein - 3 40% 1 E-07
17 204 - - -
18 145 - 一
19 663 一 一 MesonzoDium loti mlr5040 protein 一 1 48% 2E-58
20 451 一 一 Burkhoderia mallei dTDP - 4一 ketorhamnose +3 47% 5E-16 reductase
* (-)；フォワード方向に ORFなし、◎；インフレーム ORF、 △； 1塩基フレームシフトを有する ORF
** (-）有意なヒットなし
表 7に示すように、 相同性分析の結果、 全てのインサート DNAの塩基配列は相 同性の高い意味のあるヒッ トはなく、 新規な DNAであった。 この結果は、 土壌中 微生物の約 99%が未同定であることを裏付けており、 それらの遺伝資源をディス プレイライブラリ一化できることが確認された。
次に T7 SELECT10- 3b のディスプレイタンパク質の融合の相手である GenelOB と順方向の 50アミノ酸以上のオープンリーディングフレーム（0RF)の有無を調べ た。 表 7に示すように、 2クローン（クローン No. 5及び 17)は、 in-frameで 0RF が融合していた。 また、 PCR産物の 1本鎖のみを配列決定しているため、 配列精 度は完全ではなかった。 そこで、 1塩基のフレームシフト 0RFも数えると、 7クロ ーン（クローン No. 2、 5、 7、 9、 10、 12及び 17)において、 0RF融合の可能性があ つた。
次いで、 インサート DNAを含むクローンについて、 translated BLASTxによる 相同性検索を行った。 translated BLASTxは、 クエリー塩基配列を 6通りのフレ ームで翻訳して発生するァミノ酸配列と対象となるデータベースに登録されてい る各塩基配列を同様に 6通りのフレームで翻訳したアミノ酸配列とを照合して、 アミノ酸配列レベルで相同性検索を行うプログラムである。 その結果、 表 7に示 すように、 クローンの約半数において、 インサート DNAがコードするアミノ酸配 列と機能タンパク質のアミノ酸配列との相同性が見出された。 一方、 インサート DNAにおいて 0RFが見出された場合でも、 相同性が見つからず機能不明のタンパ ク質をコードするィンサート DNAが多く存在した。
〔実施例 3〕 シクロデキス トリン-セファロース 6B ビーズの調製
ァフィ二ティ一ビーズ甩担体として、 アマシャムバイオサイエンス社のェポキ シ活性化セファロース 6B (Lot. 288904)を用いた。 また、 γ -シクロデキス トリ ン
'(以下、 「γ - CD」 という）を和光純薬より購入した。乾燥ビーズ 3gを量り取り dH20 で膨潤し、 洗浄した。 dH20をカップリングバッファー （O. OlM NaOH, pH12. 4) に 置換した後、 Ί -CD, ビーズ及び力ップリングバッファーを 25cm2細胞用フラスコ に移し変え、 攪拌しながら 45°Cにて 20時間反応を行った（γ - CD/ビーズ/バッフ ァー = 1. 3g/5ml/10ml →200 μ mol es y - CD/ml ゲル（活性基の 5〜10倍量））。 ― 方、 同様にして、 /3 -シクロデキストリン（以下、 「]3 -CD」 という）とセファロース 6Bビーズとを力ップリングさせた（ - CD/ビーズ/バッファ一 = 0. 178g/5ml/10ml → 30 / mol es /3 - CD/mlゲル（活性基の 0. 75〜1· 5倍量)）。 この際、 /3 - CDは溶解 度が低いため充分な量の添加ができないため、 γ -CD の場合と異なり、 45°Cにお ける 20時間の反応後、 |3 -CDを含むバッファーの入れ替えを行うことで追加し、 45°Cにてさらに 8時間反応させた。
カップリング終了後、 ビーズをカラムに詰め、 dH20で充分に洗浄し、 余分な γ -CD又は ]3 -CDや力ップリングバッファ一を完全に除いた。次いで、 ブロッキング バッファー （1Mエタノールァミン， pH8. 0) を用いて溶液置換した後、 ビーズを再 度フラスコに移し、 ブロッキングバッファー存在下で攪拌しながら、 45°Cで 20 時間ブロッキング反応を行った。 ブロッキング反応終了後、 ビーズをカラムに詰 め、 dH20で充分に洗浄した後、 洗浄バッファー 1 (0. 1M酢酸ナトリ ウム（pH4. 0) Z 0. 5M NaCl)及び洗浄バッファー 2 (0. 1M Tris-HCl (pH8. 0) /0. 5M NaCl)にて、 交互 に洗浄する操作を 4回繰り返した。 最後に dH20にて十分に洗浄することで、 ァフ ィニティ―ビーズ -CD-セファロース 6Bビーズ又は β -CD-セファロース 6Bビー ズ）を得た。
γ -CD及び /3 - CDは、シクロデキストリングルカノ トランスフェラ一ゼと特異的 に結合する。 そこで、 ァフィ二ティービーズの結合能を、 天野ェンザィムより入 手した粗精製コンチザィム（シクロデキス トリングルカノ トランスフェラーゼ (CGTase) ) (Lot. CGTRZ095184 2L)用いて評価した結果、 べッ ド体積 100 / 1のビー ズ当たり、 CGTase 200mgと特異的に結合できることが確認された。
〔実施例 4〕 ァフィ二ティースクリーニング
4- 1. ァフィ二ティースクリーニングに使用する材料
ァフィ二ティースクリーニングにおいては、 以下の材料を用いた。 ライブラリ 一 #16P1 及びライブラリー #17P1 を、 それぞれ 7. 6 x 101Gpfu/ml 及び 5. 3 x 1010pfu/ml の力価で使用した。 また、 スクリーニング用ァフィ二ティービーズと して、実施例 3で調製した γ - CD -セファロース 6Bビーズを用い、対照としてセフ ァロース 6Bビーズを用いた。
さらに、 容器壁面へのタンパクの非特異的吸着を抑制するために、 容器は、 ァ シスト社の 1. 5mlシリコナイズチューブ 2150Zを用いた。 スク リ一二ング用洗浄 バッファ一として、 洗浄バッファー l (25mM Tris-HCl pH 7. 0/0. 1M NaCl/0. 1 % Tween20)、 洗浄バッファー 2 (50mM Tris-HCl pH7. θ/θ. 2M NaCl/0. 2%Tween20) 及び洗浄バッファー 3 (50mM Tris- HC1 pH9. 5/0. 2M NaCl)を用いた。 ビーズからの 溶出には、 lOmM y -CD を含む溶出バッファー（25mM Tris-HCl pH7. 0/0. 1M NaCl) を用いた。
T7ファージの増幅用宿主細胞として、 Novagen社の BLT5615細胞を用いた。 PCR試薬 fま、 TaKaRa社の Ex Taq enzyme, Ex Taqノ ッファー、 dNTPmix及び SIGMA genosys社に製造依頼した T7 upおよび T7 down (オリジナルは Novagen社） プラ ィマーを用レヽ 7こ。
ライブラリー DNA の配列決定分析には、 配列決定分析用プライマーとして TCGTATTCCAGTCAGGTGTG (配列番号 5 )を設計して、 （株）ベックスに依頼した。 その 他試薬類は和光純薬や SIGMA等の特級品を使用した。 また各種バッファ一類は標 準的な手法にて調製し、 必要に応じてォートクレーブによる滅菌を行った。
4— 2. ァフィ二ティ一スク リーニング
CD-セファロース 6B ビーズ （50%スラ リー） 40 μ 1 を、 1. 5ml シリ コナイズ チューブにとり、 洗浄バッファー 1 (500 1)を添加して、 ビ一ズを平衡化した。 次 いで、 チューブを 12， 000rpmにて遠心し、 ビーズを沈殿させた後、 上清を取り除 いた。
次に、ライブラリー #16P1及ぴライブラリー ίί17Ρ1を各 50 z lずつ別々のチュー ブに添加し、 回転ミキサーを用いて、 室温下 40rpmで 1時間攪拌し、 ビーズへの 吸着を行った。 1時間後、 チューブを 12, OOOrpmに 2分間遠心して、 ビーズを沈 殿させ、 上清を取り除いた。 さらに、 ビーズに洗浄バッファー 1 (500 を添加し て、 Tube Mixerにて 5分間攪拌洗浄した。 5分後、 チューブを 12, OOOrpmにて 2 ^間遠心して、 ビーズを沈殿させ、 上清を取り除いた。 この洗浄操作を 5回繰り 返した。
チューブ器壁に非特異に吸着しているファージの影響を取り除くため、 新たな シリコナイズチュ一ブにビーズを移し、 チューブを 12， OOOrpmにて遠心し、 ビー ズを沈殿させて、 上清を取り除いた。 次いで、 ビーズに結合したファージを溶出 するために、 チューブに上記溶出バッファ一 1 を加え、 Tube Mixer にて 5 分間攪拌した。 5分後、 チューブを 12， OOOrpmにて遠心することでビーズを沈殿 させ、 上清を溶出液として回収した。
次に、 この溶出液の増幅操作を以下のように行った。 IPTGで誘導した BLT5615 細月 500 1に、 溶出液 100 i 1 を加えた。 BLT5615細胞に溶出液中のファージを 吸着させるために、 37°Cにて正確に 5分間培養した。 5分間後、 γ - CDを除くため に 4，000rpn！、 2分の遠心操作にてファ一ジが付着した菌体を沈殿させて、 不要な 上清部分を取り除いた。次に、沈殿させた菌体に LB/Amp/IPTG培地 500 lを加え た後、 溶菌が生じるまで 37°Cにて旋回培養した。 溶菌が生じたら、 12，000rpm、 10分間の遠心操作にて不純物を沈殿させ、 上清のファージ溶液を回収した。 この ファージ溶液のうち 100 X 1を更なる増幅操作に使用した。同様にして 7ラウンド まで増幅操作を繰り返した。なお、最終ラウンドであるラウンド 7の増幅操作は、 菌体と上清を分けずに溶菌を行った。
次いで、 T7ファージプラークを、 9cmシャーレ 1枚あたり 200個出現させるよ うに、 各ラウンド毎のファージ溶液を希釈して用いた。 一般的な方法は次の通り であった。まず BLT5615細胞 250 μ 1、希釈した Τ7ファージ溶液 100 μ 1、0. 5Μ IPTG 溶液 24 μ 1及び 50°Cに加温したトップア一ガー 3mlを、 チューブ内にて混ぜ合わ せた。 混和後、 直ちに当該混合液が冷めないうちに、 LB/Amp培地を含む 9cmプレ ート上に重層した。 重層した寒天が固化した後、 37°Cにて 2時間のインキュベー シヨンを行い、 ファージプラークを生じさせた。 なお、 生じたプラーク数と希釈 率からファージのカ価も算出した。
ファージ溶液の力価は約 1〜2 X 1010Pfu/ml であった。 各ラウンドのファージ 溶液の力価推移とインプッ トファージ数に对する回収率推移を、 表 8及び図 1 0 A (力価推移）及び 1 O B (回収率推移）に示した。 表 8 ラウンド 溶出したファージ（Pfu) 回収率（％)
1 1.24E+05 0.0019
2 4.64E+05 0.01
3 2.26E+07 0.48
4 1.00E+08 2.8
5 4.80E+07 3.2
6 1.14E+08 10.5
7 1.26E+08 12.2
表 8と図 1 O A及び 1 O B力、ら半 IJるように、 4ラウンドまでは、 ラウンド毎にフ ァージ溶液の力価と回収率の上昇が認められ、 4ラウンド以降横ばいとなった。 次に、 得られたファージがィンサート DNAを含むものがどの程度存在している のか、 また当該ィンサート DNAがパンユングのラゥンド毎にどのように変化する のかを調べるために、 プラーク PCRを行った。
まずプレート上のファージプラーク 1 個を妻楊枝にて突き、 PCR 用 Reaction Mixture (プライマー； 0. lpmol, Ex Taq enzyme ; 0. 03 liを含む） 15〜20 1に懸 濁した。 なお、 プライマーは Novagen社の T7up及び T7downを用いた。 PCR反応 は、 サーマルサイクラ一を用いて 1) 1サイクル； 96°C/3分、 2) 33サイクル； 94°C /30秒、 50°C/30秒、 72°C/2分、 及び 3) 1サイクル； 72°C/10分で行った。 反応終 了後、 PCRサンプル 5 μ 1に BPBdye 1 μ 1を添加し、 0. 8%ァガロースゲルにて 100V で 35分間電気泳動し、 ファージ中のィンサート DNAを比較した。結果を図 1 1に 示す。 図 1 1において、 各レーンは、 各ラウンドで得られたファージ溶液のブラ ーク PCR産物である。
図 1 1から判るように、 3 ラウンドまでは異なるサイズのインサート DNAが数 個に 1個の割合で見出されたが、 4ラウンド以降においては、 ほとんどが 0. 7Kbp の同一インサート DNAのバンドが見出された。 この結果は、 ァフィ二ティセレク ションの結果として特定のクローンの濃縮が起きたことを示す。
この 0. 7kbpのィンサ一ト DNAの塩基配列（配列番号 6 )を配列決定した結果、 88 アミノ酸 （配列番号 7 ) からなる 0RFが確認された （図 1 6 )。 このクローンおよ び 0RFを P31 と名付けた。 P31について、 米国 NCBI (National Center for Biology Information)の相同性 検索プログラム BLAST (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST) を使用してデータ ベース検索を行った。 結果を図 1 2に示す。 図 1 2に示すように、 P31 は保存配 列データベース （Conserved Domain DB) の 2候補にヒッ トした。 1つは、 炭水化 物の輸送及び代謝に関与する Snfl プロテインキナーゼ複合体（Snfl protein kinase complex assembly)のタンノヽ0ク質であり、 もう 1つ ίま、 1， 4一 α—ク、'ノレカン分 岐酵素であった。 ヒッ トしたタンパク質は、 双方とも炭水化物を認識する機能を 有していた。
Snflプロティンキナーゼ複合体のタンパク質と P31 とは、ァラインメント部分 において、 73アミノ酸中 24アミノ酸が同一であって、 33%の相同性を有してい た。 また、 類似アミノ酸を含めると、 37アミノ酸が一致し、 50%の相同性を有し ていた。 以上から、 保存配列との相同性により、 P31 が糖認識機能を有するタン パク質の一部であることが強く示唆された。
さらに、 Blastp検索により全ての配列データベースの検索した結果、 上位 4候 補と p31 とのアラインメントを図 1 3 A〜！）に示した。図 1 3 A〜Dにおいて示すァ ライメントの結果において、 E(Expect)値とは 0〜1の間の数値であり、 偶然一致 する確率を示すパラメーターである。 E値が 0に近い程、 信頼度が高い。 一般的 には、 E値が約 10— 1Qでヒッ トした場合には、 かなり高い確率で同様の機能を有す るタンパク質であると考えられる。 図 1 3Aに示す P31 との相同性が 1位である タンノ ク質 hypothetical protein (テノレモトガ-マリチマ (Thermotoga maritima) ) の E値は、 4 X 10-11であった。 従って、 P31 を含むタンパク質は、 hypothetical protein と同様の機能を有するタンパク質 ある可能性が高いことが示唆される, なお、 図 1 3 Aに示すタンパク質 hypothetical proteinは、 0型糖鎖分解酵素と
'推 定 さ れ て レ、 る タ ン ノヽ。 ク 質 で あ っ た
(http://www. ebi. ac. uk/ego/DisplayGoTerm?id=GO:0004553 参照）。 また、 図 1
3Bに示す P31 との相同性が 2位の GLP_546_85055_84318(ジアルジァ . ランブリ ァ（Giardia Iambi ia) ) ATCC 50803は、 イソアミラーゼと会合する AMPキナーゼの モチーフを含む (http://kr. expasy. org/cgi— bin/niceprot. pl?Q7R2K2参照）。 さ らに、図 1 3C及び Dに示す相同性 3位及び 4位であるアミ口プルラナーゼ（ゲォ ノ シラス ·ステァロサーモフィラス (Geobac i l lus stearothermophi lus) )及びプノレ ラ ンヒ ドロ ラーゼ III 型（テルモコ ッカス · ァグレガンス （Thermococcus aggr egans) )は 1， 4- α -グルカン分岐酵素であるアミ口プルラナーゼであった。 以上の結果から、 P31 を含むタンパク質は、 糖認識機能を有するタンパク質で ある可能性が示唆された。
〔実施例 5〕 P31のリガンド結合.プロフィール
得られた P31 を提示するファージクローンを純化し、 γ - CD結合プロフィール を調べた。
純ィ匕した P31 提示ファージクローン溶解物 100 /i l、 WIT バッファー（25mM Tris-HCl ρΗ7· 0、 0. 1Μ NaCl及び 0. l %T een 20) 100 μ 1及び WITバッファ一で平 衡化した γ -CD-セファロース 6Bビーズ 20 μ 1を混合し、 室温で 1時間振盪した。 次いで、 混合液を 12000rpmで 2分間遠心し、 上清を除いた。 さらに、 γ - CD-セフ ァロース 6B ビーズに W1T ノ ッファー 500 1 を添加して、 ミキサ一で 5分間振盪 した。 混合液を 12000rpmで 2分間遠心して、 洗浄した。 このような洗浄操作を計 5回行った。 なお、 最後の洗浄操作においては、 Tweenを含まない W1バッファー (25mM Tris-HCl ρΗ7· 0、 0. 1Μ NaCl)を用いて行った。
洗浄後、 γ - CD-セファロース 6Bビーズに、 W1バッファー 100 /z 1に溶解した 80mM γ -CDを添加して、 5分間混合した。 混合した後、 混合液を 12000rpmにて 5分間 遠心し、 上清を回収した。
次いで、 上清に存在するファージ濃度をプラークアツセィにおいて算出した。 さらに、 1%デンプン存在下での P31提示ファージクローンと γ - CD-セファロース 6Bビーズとの結合試験を行った。デンプンは、可溶化デンプン（和光純薬）の 10% 懸濁液を 60°Cで保温して溶解したものを 1/10容量添加した。なお、同様にして、 P31提示ファージクローンの /3 - CD結合プロフィールを調べた。
P31提示ファージクローンに対する対照として野生型ファージ T7SC1を用いた。 さらに、 γ - CD-セファロース 6Bビーズ及び /3 -CD-セファロース 6Bビーズに対す る対照としてセファロース 6Bビーズ（S6B)を用いた。
結果を表 9及び 1 0並びに図 1 4 A〜Cに示す。 表 9は、 P31提示ファージクロ ーンの ]3 - CD-セファロース 6B ビーズへの結合を示す。 一方、 表 1 0は、 P31提示 ファージクローンの γ- CD-セファロース 6B ビーズへの結合を示す。 図 1 4 Aは、 対照の野生型ファージ T7SC1 と比較した P31 提示ファージクローンの j3-及び γ - CD-セファロース 6B ビーズへの結合を示す。 図 1 4Bは、対照のセファロース 6B ビーズ（S6B)と比較した、 P31 提示ファージクローンの i3-及び γ - CD-セファロー ス 6B ビーズへの結合を示す。 さらに、 図 1 4Cは、 1%デンプンによる P31提示 ファージクローンと -及び CD-セファロース 6B ビーズとの結合阻害を示す。 表 9
(PFU) (PFU)
ファージ ビーズ 処理 インプット 溶出 回収率
P31 S6B 4.00E+08 1.40E+06 0.0350%
P31 /8CD 4.00E+08 1.40E+07 0.3475%
P31 PCD 1%デンプン 4.00E+08 4.40E+06 0.1100%
T7SC1 jSCD— 4.60E+09 3.00E+05 _ 0.0002% 表 1 0
(PFU) (PFU)
ファージ ビーズ 処理 インプット 溶出 回収率
P31 S6B 8.50E+08 2.60E+06 0.02740%
P31 -CD 8.50E+08 9.20E+07 0.96840%
P31 -CD 1%デンプン 8.50E+08 1.80E+07 0.18950%
T7SC1 r-CD 4.60E+09 4.60E+05 0.00200%
図 1 4Aに示すように、 P31提示ファージクローンは、対照の野生型ファージと 比べ、 i3- CD-セファロース 6B ビーズに約 1700倍、 γ -CD-セファロース 6B ビーズ に約 450倍結合した。 また、 図 1 4Bに示すように、 対照のセファロース 6B ビー ズ '（S6B)と比較して、 P31提示ファ一ジクローンは、 3- CD-セファロース 6B ビー ズ及び y -CD-セファロース 6Bビーズにそれぞれ 10倍及び 35倍結合した。さらに、 図 1 4Cに示すように、 - CD-セファロース 6Bビーズ及び -CD-セファロース 6B ビーズへの P31提示ファージクローンの特異的結合は、 1%デンプンの存在によつ て 70〜80%阻害された。野生型ファージと P31クローンの違いはィンサート部分 であり、 対照の S6B ビーズと CDビーズの違いは CD部分の有無である。 CDとデ ンプンの共通点は 1, 4-α_グルカンである。 以上の結果から、 P31のィンサ ~トか ら発現するタンパク質は、配列相同性のみならず、 1,4- ct -グルカンを認識して結 合することが示された。
〔実施例 6〕 新規アルドースェピメラーゼ類似遺伝子断片の取得
上記実施例 4で得られたパンニングの 3ラウンド後のファージ溶液をプレーテ ィングし、 ランダムに選択したシングルプラークのィンサ一ト DNAの塩基配列を 調べ、 アルドース -1 -ェピメラーゼと相同性の高い配列を見出した （図 1 7、 配列 番号 8および 9)。 このクローンを AE1 とした。 .
配列に関して、上記と同様に、 NCBI (National Center for Biology Information) の相同性検索プログラム BLASTp (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST) を使用 してデータベース検索を行った。その結果を図 1 5に示す。図 1 5に示すように、 AE1 中のィンサート DNAを含む遺伝子（配列番号 8)によってコードされるタンパ ク質のアミ ノ酸配列（配列番号 9 )は、 アミ ノ酸配列名 QUB70、 Putative aldose- 1-epimerase (EC 5.1.3.3) [YIHR] (シゲラ . フ レタ スネ リ （Shigella flexneri))と極めて低い E値（1 x 10— 32)で相同性を有していた。 従って、 AE1 中 のインサート DNAを含む遺伝子 （配列番号 8) は、 新規アルドース -1-ェピメラー ゼ遺伝子である可能性が示唆された。 なお、 アルドース- 1 -ェピメラーゼはひ -D - グルコースを jS-D-グルコースに変換する酵素である。 従って、 AE1は、 CDやアミ ロースの構成単位であるダルコースを認識して結合したと考えられた。
そこで、実施例 5の P31提示ファージクローンと CD-セファロース 6Bビーズと の結合と同様にして、 AE1のアミロース樹脂（New England Biolabs)への結合を調 ベた。 溶出は、 20mMマルトースを用いて行った。 なお、 対照ファージとして、 野 生型ファージ T7SC1を使用した。 結果を表 1 1に示す。 表 1 1
(PFU) (PFU)
ファージ 樹脂 インプット 溶出 回収率
アミロース 2.40E+08 8.00E+04
Figure imgf000044_0001
アミロース 4.50E+07 1.01E+06 表 1 .1に示すように、 野生型ファージ T7SC1 と比較して、 AE1 は、 ァミロース 樹脂に 67倍結合した。 以上より、 上述した配列相同性の結果と一致して、 AE1中 のィンサート DNAを含む遺伝子産物は、 シクロデキストリンゃァミロースの構成 単位であるグルコースを認識して結合したことが示唆さ ήた。
本方法による 3 ラウンドは 2 日で終了し、 シングルクローンの取得と解析は 3 13程度で終了する。 以上のように、 メタゲノムをディスプレイライブラリ化し、 リガンドを用いたァフィ二ティエンリ ツチメントのサイクルにより、 土壌中の未 利用の遺伝資源から培養工程を経ることなく、 リガンドを認識する機能タンパク 質遺伝子群断片が、 短時日で効率よくクローニングできることが示された。
〔実施例 7〕 アミロース磁性ビーズを用いたァフィ二ティスクリーニング
ImM IPTGで誘導をかけた大腸菌 BLT5615 (1. 5ml)に 15 μ 1のライブラリ一 #17Ρ1 を感染し、 1時間振とう培養を行うことで溶菌液を得た。得られた溶菌液を 10， 000 X gで 10分間遠心した。 遠心後、 得られた上清をライブラリー ίί17Ρ2とした。
ライブラリー #17P2 (400 / 1)からパンエングに用いるリガンドと競合し得る低 分子を除くために、 Amicon microcon YM- 100 (カツ トオフ MwlOO, 000) を用いて、 3回遠心を行い、バッファ一 W2T (25mM Tris-HCl, pH7. 0, 0. 2M NaCl, 0. 1% Tween20) に置換し、 200 1 とした。 これに W2TgR (W2T+0. 2% gelatin, 200 g/ml yeastRNA) でフ、、口ッ3 rングした Amylose magnetic beads (New England Biolabsノ lmg 添ノ J卩 し、 アミロースと親和性を持つファージと結合反応をさせるために懸濁状態で 1 時間放置した。 1時間の放置後、 強力なマグネッ ト （Dynal MPC-S) を用いてビー ズと反応液を分離した。 次にこれに対して 500 μ 1の W2TgRを添加、 懸濁し、 5分 置いてビーズを分離した。 これを 4回繰り した。 次に 500 μ 1の W2TgRを添カ卩、 懸濁し、 5分置いてビーズを分離し回収した。
' 回収した 1を、 lmM IPTGで誘導をかけた大腸菌 BLT5615 (lml)に感染させ、 溶菌液を上述同様に処理し、 2サイクル目を行った。 4回洗浄後、 500 μ 1の W2TgR を添加、 懸溺し、 5分置いて得られた分画 （約 5xl05pfu) を回収した。
回収した分画を適当に希釈して、 実施例 4と同様にしてプラークアツセィを行 い、 さらにプラーク PCRを行った。 プラーク PCRで得られたインサートの塩基配 列を 8 クローンについて調べた結果、 相同性の高い糖関連酵素として E. C. 3. 2. 1 フアミ リーの /3 -キシロシダーゼ、 グノレコシダ一ゼ （TrEMBL accession #Q9A3Z6, caulobactor crescentus xylosidase, homology 48%, E=8E- 51)、 t. C.3.2.1.3, グノレコアミラーゼ (TrEMBL accession #Q98EK2, Rhizobium loti glucoamylase, homology 36%, E=3E-11)とそれぞれ考えられる遺伝子断片が 2種得られた。
図 1 8には、 E. 3.2.1 ファミ リーの /3 -キシロシダーゼ、 ダルコシダ一ゼ j rEMBL accession iQ9A3Z6, caulobactor crescentus xylosidase, homology 48%, E=8E-51) のアミノ酸配列と得られた 1種の遺伝子断片（配列番号 1 0 β- ダルコシダーゼ相同クローンの塩基配列）によってコードされるタンパク質のァ ミノ酸配列（配列番号 1 1： ]3 -ダルコシダーゼ相同クローンのアミノ酸配列）との アラインメントを示す。 なお、 図 1 8において、 Query 配列が、 得られた遺伝子 断片によってコー ドされるタンパク質のァミノ酸配列であり、 Sbjct 配列が E. C.3.2.1ファミリ一の /3-キシロシダーゼ、 ダルコシダーゼのアミノ酸配列であ る。 また、 図 2 0には、 当該遺伝子断片の塩基配列（配列番号 1 0)及びこれによ つてコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号]. 1 )を示す。
さらに、図 1 9には、 E. C.3.2.1.3,グノレコアミラ一ゼ（TrEMBL accession #Q98E 2 Rhizobium loti glucoamylase, homology 36% E=3E- 11)のアミノ酸配列と得られ たもう 1種の遺伝子断片（配列番号 1 2：ダルコアミラーゼ相同クローンの塩基配 列）によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号 1 3 ： ダルコアミ ラーゼ相同クローンのアミノ酸配列）とのァラインメントを示す。 なお、図 1 9に おいて、 Query 配列が得られた遺伝子断片によってコードされるタンパク質のァ ミノ酸配列であり、 Sbjct配列が E. 3.2.1.3，ダルコアミラーゼのアミノ酸配列 である。 また、 図 2 1には、 当該遺伝子断 の塩基配列（配列番号 1 2)及びこれ によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号 1 3)を示す。
' 〔実施例 8〕 ス卜レプトアビジン磁性ビーズを用いたァフィ二ティスク リーニン グ
実施例 7で得られたライブラリ一 #17P2(400/ 1)からパンニングに用いるリガ ンドと競合し得る低分子を除くために、 Amicon microcon YM - 100 (カツ トオフ
MwlOO, 000)を用いて、 3回遠心を行い、バッファー W2T(25mM Tris— HC1, pH7.0， 0.2M
NaCl, 0.1% Tween20) に置換 し、 200 1 と した。 これに 2mM a 1-3， a 1一 6- D - mannotriose - biot in (14 - atom spacer, DEXTRA Laboraroi es, Ltd. )を 10 μ 1添加混合し、室温に 1. 5時間置いた。次に、これに W5TgR (25mM Tri s-HCl, pH7. 0， 0. 5M NaCl, 0. 1% Tween20, 0. 2% gelat in, 200 μ g/ml yeastRNA)でブロッキング した Streptavid in magnet ic beads (New England B iolabs) lmgを添カ卩し、 親扣性 を持つファージと結合反応をさせるために懸濁状態で 1時間放置した。 1時間の 放置後、 マグネッ ト （Dyna l MPC - S) を用いてビーズと反応液を分離した。 次にこ れに対して 500 μ 1の W5TgRを添加、 懸濁し、 5分置いてビーズを分離した。 これ を 5回镍り返した。 次に 200 μ 1 の lOniM mannose を含む W5TgRを添加、 懸濁し、 5分置いてビーズを分離し、 上清を回収した。
回収した上清を適当に希釈して、 実施例 4と同様にしてプラークアツセィを行 い、 さらに、 プラーク PCRを行った。 プラーク PCRで得られたインサートの塩基 配列を 7 ク ローンについて調べた結果、 相同性の高い糖関連酵素と して E. C. 4. 2. 1. 16， dTDPグルコース脱水酵素 (TrEMBL access ion #Q5V3C6, Haloarcula mari smortui, dTDP- glucose 4， 6 - dehydratase, homology 66%, E=4E - 59) と考え られる遺伝子断片が 1種得られた。
図 2 2には、 E. 4. 2. 1. 16, dTDP グルコース脱水酵素 （TrEMBL access ion #Q5V3C6， Haloarcula mari smortui, dTDP - glucose 4, 6— dehydratase, homology 66%, E=4E-59) のアミノ酸配列と得られた遺伝子断片（配列番号 1 4 ： ダルコ一 ス脱水酵素相同クローンの塩基配列）によってコードされるタンパク質のアミノ 酸配列（配列番号 1 5 ： グルコース脱水酵素相同クローンのアミノ酸配列)とのァ ラインメン トを示す。 なお、 図 2 2において、 Query 配列が得られた遺伝子断片 によってコー ドされるタンパク質のアミ ノ酸配列であり 、 Sb jet 配列が E. C. 4. 2. 1. 16, dTDP グルコース脱水酵素のアミノ酸配列である。 また、 図 2 3に 'は、 当該遺伝子断片の塩基配列（配列番号 1 4 )及びこれによつてコードされるタ ンパク質のアミノ酸配列（配列番号 1 5 )を示す。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性 本発明に係る環境サンプル由来の環境 DNAの精製方法によれば、 高純度の環境 サンプル由来の DNAを得ることができる。 得られた環境サンプル由来の DNAは、 高純度であるため、 あらゆる遺伝子工学的処理に使用することができる。 一方、 本発明に係るタンパク質をコ一ドする遺伝子のスクリ一二ング方法によれば、 環 境サンプル由来の環境 DNAから作製したディスプレイライブラリ一から目的のタ ンパク質をコードする遺伝子群を、 所望するリガンドを用いてェンリ ツチする (S/N 比を向上する） ことにより短期間で省力的にスクリーニングすることがで さる。 配列表フリーテキス ト
配列番号 1 〜 4は、 合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号 5は、 プライマーである。
配列番号 6は、 P31をコードする遺伝子の塩基配列である。
配列番号 7は、 P31のアミノ酸配列である。
配列番号 8は、 AE 1中のィンサート DNAを含む遺伝子の塩基配列である。
配列番号 9は、 AE 1 中のィンサート DNAを含む遺伝子によってコードされるタ ンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号 8において、 nは、 a、 g、 c又は tを表す（存在位置： 25及び 84)。 配列番号 1 0は、 /3 -ダルコシダーゼ相同クローンの塩基配列である。
配列番号 1 1は、 /3 _ダルコシダーゼ相同クローンのァミノ酸配列である。 配列番号 1 2は、 'ダルコアミラーゼ相同クローンの塩基配列である。
配列番号 1 3は、 ダルコアミラーゼ相同クローンのアミノ酸配列である。 配列番号 1 4は、 グルコース脱水酵素相同クローンの塩基配列である。
' 配列番号 1 5は、 ダルコ一ス脱水酵素相同クローンのアミノ酸配列である。

Claims

請求の範囲
1 - 環境サンプル由来の環境 DNAのディスプレイライブラリーを作製し、 前記ライブラリーとリガンドとの相互作用に基づいてスクリ一ユングする、 ことを含む、 タンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
2 . 上記環境サンプル由来の環境 DNAが、
環境サンプルから DNAを回収し、
前記 DNA をゲル濾過クロマトグラフィー及び/又はイオン交換クロマトグラフ ィ一に供する、
ことを含む環境サンプル由来の環境 DNAの精製方法により精製されたものである ことを特徴とする、 請求項 1記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリー二 ング方法。
3 . 上記環境サンプル由来の環境 DNAの精製方法が、 グラスビーズを用いて 環境サンプルを破砕することにより DNAを回収することを特徴とする、 請求項 2 記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーユング方法。
4 . 上記環境サンプル由来の環境 DNAの精製方法が、 環境サンプルから DNA を回収した後、 回収した DNAを部分分解に供することを含む、 請求項 2記載のタ ンパク質をコードする遺伝子のスクリ一ユング方法。
5 . 上記ゲル濾過クロマトグラフィ一における排除限界が 105Da以上である ことを特徴とする、 請求項 2記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリー二 ング方法。
6 . 上記環境サンプル由来の環境 DNAの精製方法において精製した DNAのサ ィズが 0. 5〜5Kbpであることを特徴とする、 請求項 2記載のタンパク質をコード する遺伝子のスク リーニング方法。
7 . 上記リガンドが糖類であることを特徴とする、 請求項 1記載のタンパク 質をコ一ドする遺伝子のスクリ一ユング方法。
8 . 上記糖類がシクロデキス トリン、 アミロース及びァカボースから成る群 より選択されるものであることを特徴とする、 請求項 7記載のタンパク質をコー ドする遺伝子のスク リーニング方法。
9 . 上記スク リーニング前に、 リガンドを固定化担体に固定化する工程を含 む、 請求項 1記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリ一二ング方法。
1 0 . 請求項 1記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリ一二ング方法 でエンリ ッチした DNA断片を、 増幅し、 まとめて発現ベクターに移し、 宿主に導 入し、 揷入遺伝子から発現した活性に基づいて目的クローンをスクリ一二ングす る方法。
1 1 . 2種以上のリガンドおよび/または担体の組み合わせによる請求項 1記 載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリ一ユング方法。
1 2 . 環境サンプルから DNAを回収し、
前記 DNA をゲル濾過クロマトグラフィー及び/又はイオン交換クロマトダラフ ィ一に供する、
ことを含む、 環境サンプル由来の環境 DNAの精製方法。
1 3 . グラスビーズを用いて環境サンプルを破砕することにより DNAを回収 することを特徴とする、 請求項 1 2記載の環境サンプル由来の環境 DNAの精製方 法。 ■
1 4 . 環境サンプルから DNAを回収した後、 回収した DNAを部分分解に供す ることを含む、 請求項 1 2記載の環境サンプル由来の環境 DNAの精製方法。
1 5 . 上記ゲル濾過クロマトグラフィーにおける排除限界が 10¾a以上であ ることを特徴とする、請求項 1 2記載の環境サンプル由来の環境 DNAの精製方法。
1 6 . 上記精製した DNAのサイズが 0. 5〜5Kbpであることを特徴とする、 請 求項 1 2記載の環境サンプル由来の環境 DNAの精製方法。
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