WO2005108558A1 - ヒト歯髄細胞の分化誘導方法及び象牙質再生用組成物 - Google Patents

ヒト歯髄細胞の分化誘導方法及び象牙質再生用組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2005108558A1
WO2005108558A1 PCT/JP2005/008734 JP2005008734W WO2005108558A1 WO 2005108558 A1 WO2005108558 A1 WO 2005108558A1 JP 2005008734 W JP2005008734 W JP 2005008734W WO 2005108558 A1 WO2005108558 A1 WO 2005108558A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
dentin
culturing
medium
culture
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/008734
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Akiko Tonomura
Yusuke Ando
Hideaki Kagami
Minoru Ueda
Original Assignee
Hitachi Medical Corporation
National University Corporation Nagoya University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hitachi Medical Corporation, National University Corporation Nagoya University filed Critical Hitachi Medical Corporation
Publication of WO2005108558A1 publication Critical patent/WO2005108558A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/42—Organic phosphate, e.g. beta glycerophosphate

Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing differentiation of human dental pulp cells and a composition for regenerating dentin.
  • the present invention relates to a method for inducing differentiation from human dental pulp cells into odontoblasts, a method for regenerating dentin, and a composition for regenerating dentin. More specifically, the present invention provides for differentiation of human dental pulp cells into odontoblasts by culturing them in the presence of 1,25 (dihydroxy) vitamin D 3 , dexamethasone and J3-glycerose phosphate, The present invention relates to a method for regenerating dentin by culturing and Z-transplanting the cells together with a carrier or the like. The present invention relates to a composition for dentin regeneration obtained by the above culture. The present invention further relates to dentin regenerated by the above method. The present invention further relates to a method for treating a dental patient using odontoblasts or regenerated dentin induced by the above-described method. Background art
  • Root canal treatment is widely used to preserve teeth that have suffered pulpitis or pulp death due to severe caries. It removes dental pulp tissue infected by dental caries and is filled with artificial drugs. If the root canal cannot be completely sealed due to the complicated shape of the root canal and bacteria in the root canal and dentinal tubule cannot be completely removed It is said that teeth that have undergone root canal treatment have a short lifespan because they have a secondary infection and must be treated again. To maintain the teeth for a long period of time, it is necessary to preserve the pulp as much as possible and increase the success rate of root canal treatment. To solve these problems, natural dentin can be completely rebuilt by regenerating natural dentin, closing the exposed part of the medullary cavity due to perforation and caries treatment, It can also be used as a filler in therapy.
  • HAp hydroxyapatite
  • TCP complex of calcium
  • the formation of hard tissue was confirmed from the hematoxylin / eosin-stained image after the extraction, and the RNA extracted from this sample was evaluated by RT-PCR. As a result, mR, a differentiation marker for odontoblasts, was identified. It is disclosed that NA is expressed, that is, the obtained hard tissue was a dentin-like tissue. However, the amount of hard tissue formed is very small and clinical applications require more dentin regeneration.
  • An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems of the conventional technology. That is, an object of the present invention is to provide a method for more efficiently differentiating human dental pulp cells into odontoblasts that form dentin. Another object of the present invention is to provide a method for regenerating as much dentin as possible for clinical application to dental diseases such as dental caries. Furthermore, an object of the present invention is to provide a method for treating dental diseases such as dental caries by using differentiated odontoblasts or regenerated dentin.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that cells capable of differentiating into human pulp cells or human pulp cells can be 1,25 (dihydroxy) vitamin D 3 , dexamethasone and By culturing in the presence of glycerol phosphate, it was demonstrated that differentiation into dentin-forming odontoblasts can be efficiently performed.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • At least one of the isolated human dental pulp cells or the cells capable of differentiating into human dental pulp cells has 1,25 (dihydroxy) vitamin D 3 , dexamethasone, and the presence of glycemic phosphate.
  • the present invention provides a method for producing differentiation-induced odontoblasts, which comprises culturing the cells in culture.
  • the cells are cultured on a carrier.
  • 1, 2 5 concentration in the medium of (dihydroxy) vitamin D 3 is 1 X 1 0 one 8 ⁇ 1 X 1 0- 5 mo 1/1
  • i3- concentration in the medium of glycerin port phosphate is 1 ⁇ 3 O mm o 1/1.
  • the method for producing odontoblasts induced to differentiate comprises: (i) a step of culturing at least one of isolated human dental pulp cells or cells capable of differentiating into human dental pulp cells; (ii) the cells; And (iii) culturing the cells in a medium containing 1,25 (dihydroxy) vitamin D 3 , dexamethasone and 3-glycerophosphate.
  • the support is a ceramic support.
  • a cell composition for dentin regeneration comprising the above-described differentiation-induced odontoblast.
  • a method for regenerating dentin comprising culturing the differentiated odontoblast obtained by the above method.
  • a method for treating a dental patient comprising transplanting a differentiated odontoblast obtained by the above method or dentin regenerated by the above method into a patient. Is done. Brief Description of Drawings
  • FIG. 1 shows the number of cells, the ALPase activity and the time-dependent changes thereof (day 7 and day 10) under the conditions of Comparative Example 1, Comparative Example 2 and Example 1.
  • FIG. 2 shows the number of cells, the ALPase activity and the time-dependent changes thereof (day 7 and day 10) under the conditions of Comparative Example 3, Comparative Example 4 and Comparative Example 5.
  • FIG. 3 shows the cell number and ALPase activity under the conditions of Comparative Example 6, Comparative Example II, and Example 2 and their time-dependent changes (day 7 and day 10).
  • FIG. 4 shows an HE-stained image of a tissue obtained by transplantation of cultured human dental pulp cells.
  • FIG. 5 shows an HE-stained image (differentiation induction (+)) of a tissue obtained by transplantation of cultured human dental pulp cells.
  • the method for producing odontoblasts induced to differentiate according to the present invention comprises: At least one of the cells that can be differentiated into dental pulp cells is cultured in the presence of 1,25 (dihydroxy) vitamin D 3 , dexamethasone, and glycerol phosphate.
  • human dental pulp cells or cells capable of differentiating into human dental pulp cells may be cultured as a single cell composed of one type of cells or as a cell mixture composed of two or more types of cells. Good.
  • Human dental pulp cells or cells that can be differentiated into human dental pulp cells can be collected from human extracted teeth and the like.
  • Human dental pulp cells can be collected, for example, according to the method described in About L, et al., Experimental cell research, 258, 33-41, 2000.
  • Cells that can be separated into human dental pulp cells can be collected, for example, by the following method. Aseptically remove the impacted teeth and store them in a suitable storage solution such as a Phosphate Buffered Saline (hereinafter abbreviated as PBS) solution. Remove the calcified part of the teeth, scalpel the tissue with a scalpel, and wash the tissue with a PBS solution. Next, it is preferable to subject the tissue to enzyme treatment using collagenase dispase. After the enzyme treatment, the cells can be collected by pitting and centrifugation.
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • Culture of cells is had use a usual serum-containing culture medium or serum-free medium used to culture animal cells, culture conditions typical animal cell (e.g., a temperature of 37 ° C from room temperature;. 5% C0 2 Ink Yubeta one Inside). Further, an additive such as ascorbic acid can be added to the medium.
  • the form of the culture is not particularly limited.
  • the culture can be performed by static culture.
  • 25 amount of (dihydroxy) vitamin D 3 is, 1 X 10 one 8 ⁇ 1 X 10- 5 mo in the medium 1 Bruno 1, more preferably 1 X 10- 7 ⁇ : LX l O- 6 mo 1 / 1.
  • the amount of the added syrup of / 3-glycerol phosphate is 1 to 3 Ommo 1/1, more preferably 2 to 1 Ommo 1/1 in the medium.
  • the cells may be cultured on a carrier or without a carrier.
  • the carrier is preferably one that can withstand the time required for dentin formation and that is quickly absorbed thereafter. Further, it is preferable to use a carrier made of a material having high affinity for cells.
  • the material of the carrier is not particularly limited as long as it satisfies the above characteristics.
  • ceramic materials eg, hydroxyapatite (HAp), tricalcium phosphate (-TCP), tetracalcium phosphate
  • PGA Polydalicholic acid
  • PL GA poly (DL-lactide codalycoside)
  • PLLA polylactic acid
  • polycaprolactaton and other synthetic polymer materials or collagen, gelatin, buibrin and other protein materials.
  • naturally occurring materials such as hyaluronic acid and its salts, alginic acid and its salts, ivory, and coral can also be used.
  • the surface may be coated with a collagen solution or fibronectin solution to increase cell adhesion and proliferation. it can.
  • Examples of the form of the carrier include a mesh form, a sponge form, a gel form, a nonwoven fabric form, and a granular form.
  • the carrier is preferably processed into a shape into which cells can be easily transplanted, and is preferably a plate-like or spherical porous body or a hollow body having one open end, so that blood vessels can easily enter from the periphery.
  • the carrier is preferably prepared in a form suitable for the purpose.
  • a mold is obtained using an impression material after the desired form is made of resin. After that, the desired form can be reproduced by removing the resin mold and pouring the synthetic material that makes up the carrier.
  • the method of the present invention can include the following three steps.
  • step (iii) a step of culturing the cells in a medium containing 1, 25 (dihydroxy) vitamin D 3 , dexamethasone and —glycemic phosphate (differentiation induction):
  • the above step (i) is performed in the subsequent steps. This is a culture performed to obtain the number of cells required to regenerate the cells.
  • Culturing the cells in step (i) is performed using normal serum-containing or serum-free medium used for culturing animal cells under normal animal cell culture conditions (eg, room temperature to 37 ° C; 5% CO2). 2 Incubator etc.).
  • an additive such as ascorbic acid can be added to the medium.
  • the form of the culture is not particularly limited.
  • the culture can be performed by static culture.
  • the cells obtained in the step (i) can be stored frozen, and the cells obtained by thawing and growing when necessary can be used for the operations after the step (ii). According to this method, it is not necessary to collect cells every time dentin is regenerated, and the burden on the patient can be reduced.
  • step (ii) is a step of growing cells on a carrier.
  • the cells seeded on the carrier adhere to the carrier and proliferate.
  • the cell culture in step (ii) can also be performed using normal serum-containing or serum-free medium used for animal cell culture under normal animal cell culture conditions (eg, room temperature to 37 ° C; 5% C0 2 in an incubator).
  • the culture period is preferably 1 to 30 days, and more preferably 5 to 25 days.
  • step (iii) is a step of promoting the induction of differentiation into odontoblasts.
  • the amounts of 1,25 (dihydroxy) vitamin D 3 , dexamethasone and j3-glycerol phosphate are as described above in this specification.
  • human dental pulp cells or cells capable of differentiating into human dental pulp cells are seeded on a carrier, or if necessary, cultured after seeding, and the cultured cells are directly transplanted into a patient together with the carrier. Is also good.
  • the isolated human dental pulp cells or cells capable of differentiating into human dental pulp cells are cultured and expanded, and then seeded on a carrier, or, if necessary, cultured after seeding. Implanted with the carrier and elephant in the body Regenerate the dentin.
  • the isolated human dental pulp cells or cells capable of differentiating into human dental pulp cells are cultured and cultured, and then seeded on a carrier, or, if necessary, cultured after seeding. And dentin can be regenerated in the body of the transplanted animal.
  • the type of the transplanted animal is not particularly limited, but is preferably a mammal, and for example, a rodent such as a mouse (eg, a nude mouse) or a rat (eg, a nude rat) can be used.
  • the site of transplantation is not particularly limited, and includes, for example, subcutaneous back.
  • a dental disease such as dental caries.
  • Dentin can be formed by continuing to grow dentin after being transplanted to a dental patient.
  • Comparative Example 1 Measurement of the number of cultured human dental pulp cells and ALPase activity (conditions without added factors)
  • the pulp tissue was cut into approximately two thigh pieces with a scalpel and washed five times with a PBS solution.
  • Washed tissue using enzyme solution of 2 mg / ml collagenase dissolved in DMEM medium was enzymatically treated for 50 minutes.
  • the obtained tissue was pipetted using a 25 ml pipe for 10 minutes.
  • Cells were collected by centrifuging 25 ml of the supernatant.
  • the obtained cells were mixed with DMEM medium and Nutrient Mixture F-12 at a ratio of 1: 1 (hereinafter abbreviated as DMEM / F12).
  • the cells were washed 5 times with a medium containing 15% serum, and then washed with a 70-m cell strainer. The cells were collected by centrifugation.
  • ⁇ -Nitrophenyl phosphate tablets sets (manufactured by SIGMA) were used. After 7 days and 10 days after cell seeding, aspirate the culture supernatant from the plate, wash with PBS solution, and add 800 ⁇ l of paranitrophenyl phosphate (hereinafter abbreviated as PNPP) solution to each well. The mixture was added and reacted at 37 ° C. under 5% CO 2 for 6 minutes. The reaction was stopped by adding an equal volume of 0.2N NaOH solution, 200 ⁇ l was added to a 96-well plate, and the absorbance at 415 nm was measured using a microplate reader (GENios, manufactured by TECAN).
  • PNPP paranitrophenyl phosphate
  • Cell Counting Kit-8 (manufactured by Dojindo Laboratories) was used for cell count measurement. After 7 days and 10 days from the cell seeding, aspirate the culture supernatant of the plate, add 1 ml of DMEM / F12 medium to each well, and add 100 1 of Cell Counting Kit-8 solution to each well. The color reaction was carried out at 37 ° C. and 5% CO 2 for 60 minutes. The reagent solution after the reaction was diluted 4-fold with distilled water, 200 zl was added to a 96-well plate, and the absorbance at 450 nm was measured using a microplate reader (GECANs manufactured by TECAN).
  • Comparative Example 2 Measurement of cell number and ALPase activity of human dental pulp cells cultured with addition of TGF- / S 1 and 1,25 (dihydroxy) vitamin D 3 (P. Pavasant et al., Archives of Oral Biology, 2003, 48, 717-722)
  • Comparative Example 2 In Comparative Example 2 below, (1) collection and storage, (2) cell recovery, and (4) measurement were performed under the same conditions as in Comparative Example 1, and only static culture under different conditions and results were performed. It will be described in detail.
  • the pulp tissue was cut into small pieces of about 2 mm with a scalpel and washed five times with a PBS solution.
  • the washed tissue was treated with an enzyme solution of 2 mg / ml collagenase dissolved in DMEM medium for 50 minutes.
  • the obtained tissue was pipetted using a 25 ml pipe for 10 minutes.
  • Cells were collected by centrifuging 25 ml of the supernatant. Obtained cells was mixed with DMEM medium and Nutrient Mixture F-12 at a ratio of 1: 1 (hereinafter referred to as DMEM / F12).
  • the medium was washed 5 times with a medium containing 15% serum, and then filtered through a 70 ⁇ ⁇ cell strainer. The cells were collected by centrifugation.
  • Recovered cells subjected to culture in addition to 37 ° C, 5% C0 2 under a Asukorubi phosphate at a concentration of 100 ⁇ ⁇ 1 / 1 to 15% serum-containing DMEM / F12 medium, a 4 times passaged cells After detachment from the cell culture flask with trypsin-EDTA, 1 ⁇ 10 4 cells / well were seeded on a 12-well plate, and then static culture was performed at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • p-Nitrophenyl phosphate tablets sets (manufactured by SIGMA) were used. After 7 days and 10 days after the cell seeding, aspirate the culture supernatant of the plate, wash with PBS solution, and add para-tropinyl phosphate (hereinafter abbreviated as PNPP) solution to each well at 800 ⁇ 1. The mixture was added and reacted at 37 ° C. under 5% CO 2 for 6 minutes. The reaction was stopped by adding an equal volume of 0.2N NaOH solution, 200 1 was added to a 96-well plate, and the absorbance at 415 nm was measured using a microplate reader (GENios, manufactured by TECAN).
  • PNPP para-tropinyl phosphate
  • Cell Counting Kit-8 (manufactured by Dojindo Laboratories) was used for cell count measurement. After 7 days and 10 days after cell seeding, aspirate the culture supernatant of the plate, add 1 ml of DMEM / F12 medium to each well, and add Count ⁇ of Cell Counting Kit-8 solution to each well. The color reaction was carried out at 37 ° C. and 5% CO 2 for 60 minutes. After the reaction, the reagent solution was diluted 4-fold with distilled water, added to a 96-well plate, and the absorbance at 450 nm was measured using a microplate reader (GENios, manufactured by TECAN).
  • Comparative Example 4 Measurement of cell number and ALPase activity in human dental pulp cells cultured with dexamethasone and potassium dihydrogen phosphate (S. Gronthos et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97 (25): conditions described in 13625-13630)
  • Comparative Example 4 (6) collection and storage, (7) cell recovery, and (9) measurement was performed under the same conditions as in Comparative Example 3, and only the static culture under different conditions and the results will be described in detail.
  • Recovered cells subjected to culture in addition to 37 ° C, 5% C0 2 under a Asukorubi phosphate at a concentration of ⁇ ⁇ ⁇ (viii) in the 15% serum-containing DMEM / F12 medium, triple four times passaged cells After detachment from the cell culture flask with thin-EDTA, 1 ⁇ 10 4 cells / well were seeded on a 12-well plate.
  • the culture 100 ⁇ raol / 1 ⁇ scan Col bottles acid, 10- 8 mol / lDexamethasone 2.
  • Comparative Example 5 3 glycerin port cell numbers of phosphoric acid and dexamethasone human dental pulp cells cultured by adding the ALPase measurement of the activity (1, 2 5 (dihydric Dorokishi) vitamin D 3 only without adding conditions)
  • Comparative Example 5 In Comparative Example 5 below, (6) collection and preservation, (7) cell recovery, and (9) measurement were performed under the same conditions as in Comparative Example 3, and only static culture under different conditions and results were performed. It will be described in detail.
  • the pulp tissue was cut into small pieces of about 2 mm with a scalpel and washed five times with a PBS solution.
  • the washed tissue was treated with an enzyme solution of 2 mg / ml collagenase dissolved in DMEM medium for 50 minutes.
  • the obtained tissue was pipetted for 10 minutes using a pipette for 25 ml.
  • Cells were collected by centrifuging 25 ml of the supernatant.
  • the obtained cells were mixed with DMEM medium and Nutrient Mixture F-12 at a ratio of 1: 1 (hereinafter abbreviated as DMEM / F12).
  • the cells were washed five times with a medium containing 15% serum, and then washed with a 70-cell strainer. Cells were collected by filtration and centrifugation.
  • Recovered cells 15% serum-containing DMEM / F12 medium 100 mu mol / 1 at a concentration by adding Asukorubi phosphate and 37 ° C, 5% C0 row cultured in 2 conditions Les , 2 KaiTsugidai cells were trypsin - after separating from the flasks for cell culture in EDTA, after a 1 X 10 4 cells / well plated on 12 ⁇ El plates, a static culture at 37 ° C, 5% C0 2 under the conditions Done.
  • PNPP PBS solution
  • Paranitorofu two Berlin acid solution was added by 800 mu 1 to each Uweru and reacted for 6 minutes at 37 ° C, 5% C0 2 under the conditions .
  • the reaction was stopped by adding an equal volume of 0.2N NaOH solution, 200 ⁇ l was added to a 96-well plate, and the absorbance at 415 nm was measured using a microplate reader (GEMos, manufactured by TECAN).
  • the cell count was measured using Cell Counting Kit-8 (manufactured by Dojindo Laboratories). After 7 days and 10 days from the cell seeding, aspirate the culture supernatant from the plate, add 1 ml of DMEM / F12 medium to each well, and add 100 ⁇ l of Cell Counting Kit-8 solution to each well. The color reaction was carried out at 37 ° C. and 5% CO 2 for 60 minutes. The reagent solution after the reaction was diluted 4-fold with distilled water, added 200/1 to a 96-well plate, and the absorbance at 450 nm was measured using a microplate reader (TECios GENios). (15) Result
  • Comparative Example 7 jS glycerin port cell numbers of phosphoric acid and dexamethasone human dental pulp cells cultured by adding the ALPase measurement of the activity (1, 2 5 (dihydroxy) vitamin D 3 only without adding conditions)
  • Example 1 Measurement of cell number and ALPase activity of human dental pulp cells cultured with addition of differentiation-inducing factors
  • Example 1 (1) collection and preservation, (2) cell collection, and (4) measurement were performed under the same conditions as in Comparative Example 1, and only static culture under different conditions and results were performed. It will be described in detail.
  • Example 2 Measurement of cell number and ALPase activity of human dental pulp cells cultured with the addition of differentiation-inducing factors
  • (11) collection and storage, (12) cell recovery, and (14) measurement were performed under the same conditions as in Comparative Example 6; Only the results are detailed.
  • the culture was supplemented with 100 ⁇ mol / 1 ascorbic acid, 10 "3 ⁇ 41 / 11 1,25 (dihydroxy) vitamin D 3 , 10 mmol / l ⁇ -Glycerophosphate, 10-ol / 1 Dexamethasone Static culture was performed using serum-containing DMEM / F12 medium under two conditions of 37 ° C and 5% C02.
  • Comparative Example 6 without adding an additive factor conditions
  • Comparative Example 7 (1, 2 5 (Jihido port carboxymethyl) vitamin D 3 only without the addition condition) Comparing and Example 2, the conditions of Example 2 In this case, ALPase activity, which is an indicator of the ability to differentiate into dental pulp cells and form dentin, is significantly increased (Fig. 3). That is, it is apparent from the results of FIGS. 2 and 3 that the conditions of Example 2 are better than those described in S. Gronthos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97. (25): 13625-13630. Is effective.
  • Comparative Example 8 Transplantation experiment without step of promoting differentiation induction into odontoblasts
  • the wisdom tooth extracted for treatment was scraped with a turbine to expose the pulp, and the pulp tissue was aseptically collected and stored in a PBS solution containing 10% antibiotics.
  • the pulp tissue was cut into small pieces of about 2 mm with a scalpel and washed five times with a PBS solution.
  • the washed tissue was treated with an enzyme solution of 2 mg / ml collagenase dissolved in DMEM medium for 50 minutes.
  • the obtained tissue was pipetted using a 25 ml pipe for 10 minutes. Cells were collected by centrifuging the supernatant of 25 ⁇ 1.
  • the obtained cells were washed five times with a medium containing 15% serum in DMEM / F12 medium, filtered through a 70 ⁇ m cell strainer, and centrifuged to collect the cells.
  • Recovered cells subjected to culture in addition to 37 ° C, 5% C0 2 under a Asukorubi phosphate at a concentration of 100 / mol / 1 in 15% serum-containing DMEM / F12 medium, once passaged cells
  • a cell suspension of 5.0 x 10 6 cells / ⁇ ⁇ ⁇ with DMEM / F12 medium containing 15% serum and add ⁇ ⁇ with a 96-well plate.
  • / - after seeding the TCP multi hole body 130 mg was performed 37 ° C, 5% C0 5 hours 4. static culture at 2 conditions.
  • the cells adhered to the carrier After the cells adhered to the carrier, they were transferred to a 6-well plate and grown on the carrier in DMEM / F12 medium containing 15% serum for 13 days.
  • Nude mouse KSN was used as a transplant animal.
  • the skin on the back of the nude mouse was incised, the carrier seeded with the cells was placed subcutaneously, and the skin was sutured.
  • Example 3 Transplantation experiment including the step of promoting the induction of differentiation into odontoblasts
  • the wisdom tooth extracted for treatment was scraped with a turbine to expose the pulp, and the pulp tissue was aseptically collected and stored in a PBS solution containing 10% antibiotics.
  • the pulp tissue was cut into small pieces of about 2 mm with a scalpel and washed five times with a PBS solution.
  • the washed tissue was treated with an enzyme solution of 2 mg / ml collagenase dissolved in DMEM medium for 50 minutes.
  • the obtained tissue was pipetted using a 25 ml pipe for 10 minutes.
  • Cells were collected by centrifuging 25 ml of the supernatant.
  • the obtained cells were washed five times with a medium containing 15% serum in DMEM / F12 medium, filtered through a 70-m cell strainer, and centrifuged to collect the cells.
  • Recovered cells subjected to culture in addition to 37 ° C, 5% C0 2 under a Asukorubi phosphate at a concentration of 100 mu mol / 1 in 15% serum-containing DMEM / F12 medium, once passaged cells
  • Asukorubi phosphate at a concentration of 100 mu mol / 1 in 15% serum-containing DMEM / F12 medium
  • - after seeding the TCP multi hole body 130 mg was performed 3 7 ° C, 5% C0 5 hours 4. static culture at 2 conditions.
  • the cells were transferred to a 6-well plate and grown on the carrier in DMEM / F12 medium containing 15% serum for 7 days.
  • Nude mouse KSN was used as a transplant animal.
  • the skin on the back of the nude mouse was incised, and the dentin regenerating composition obtained above was placed under the skin, and the skin was combined.
  • Samples were collected 6 weeks after transplantation.
  • the excised sample was fixed in a 10% formalin solution and embedded in paraffin according to a conventional method to prepare a continuous tissue section. Thereafter, the sections were stained with HE and observed histologically.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Dental Tools And Instruments Or Auxiliary Dental Instruments (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

　本発明の目的は、う蝕などの歯科疾患患者を治療することを可能にするヒト歯髄細胞の象牙芽細胞への分化誘導方法および象牙質の再生方法を提供することである。本発明によれば、分離したヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも１種類を１，２５（ジヒドロキシ）ビタミンＤ3、デキサメタゾン及びβ−グリセロホスフェートの存在下で培養することを含む、分化誘導された象牙芽細胞の製造方法が提供される。

Description

明細書
ヒト歯髄細胞の分化誘導方法及び象牙質再生用組成物 技術分野
本発明は、ヒト歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導方法、象牙質の再生方法、 及び象牙質再生用組成物に関する。より詳細には、本発明は、ヒト歯髄細胞を 1， 2 5 (ジヒ ドロキシ） ビタミン D 3、 デキサメタゾン及ぴ J3—グリセ口ホスフエ 一トの存在下で培養することにより象牙芽細胞に分化させ、 該細胞を担体等と一 緒に培養および Zまたは移植することにより象牙質を再生する方法に関する。 本 発明は上記培養により得られる象牙質再生用組成物に関する。 本発明はさらに、 上記方法により再生された象牙質に関する。 本発明はさらに、 上記方法により分 化誘導された象牙芽細胞もしくは再生された象牙質を用いて歯科患者を治療する 方法に関する。 背景技術
現代社会は高齢化社会であり、 数年後には日本国民人口の約 2 0 %が 6 5歳以 上の高齢者になることが予想されている。 これら高齢者の大多数は、 一部又は全 部の歯牙を喪失しており、 多くの人は可綴式義歯 （いわゆる入れ歯） を使用して いる。 従来の義歯は、 着脱が必要で装着感もよくないなどの実際的問題のみなら ず、 心理的にも老化の象徴といった印象があり、 できれば義歯を使用したくない というのが患者の一般的認識である。 さらに、 全ての歯牙を喪失した場合に、 総 義歯を装着すると、 その咀嚼能力は通常の天然歯牙の約 5分の 1となることが知 られている。 さらに、 脳に対する咀嚼刺激は痴呆防止の効果があり、 咀嚼力の低 下は痴呆の促進になることが明らかになってきている。
歯牙喪失の理由としてう蝕や歯周疾患が挙げられる。 重度のう蝕により歯髄炎 や歯髄壌死を起こした歯牙を温存するための治療としては根管治療が広く行なわ れている。 これはう蝕により感染した歯髄組織を除去し、 人工的な薬剤で充填さ せる治療法であるが、 根管が複雑な形状をしているために根管内を完全に密閉す ることができず、 根管及ぴ象牙細管內の細菌を完全に除去できていない場合、 二 次感染を起こし再度治療をしなければならなく、 根管治療を行った歯牙の寿命は 短いと言われている。 歯牙を長期間維持するためには歯髄を可及的に温存し、 根 管治療の成功率を上げる必要がある。 これらの問題を解決するためにも天然の象 牙質を再生させれば完全に密閉することができるようになり、 髄腔の穿孔やう蝕 の治療による露髄部を閉鎖させることや、 根管治療での充填材としても利用する ことが可能となる。
天然の象牙質を再生させて治療に使用する方法が提案され、 検討が行なわれて いる。例えば、 S. Gronthosら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97 (25) : 13625 - 13630 には、 培養ヒト歯髄細胞をハイドロキシァパタイト （以下、 HAp と略す） とリン 酸三カルシウム （以下、 一 TCP と略す） の複合体の粉体に播種した試料をヌー ドマウス皮下へ移植して 6週間後に摘出することが開示されている。 そして、 摘 出後のへマトキシリン /ェォシン染色像から硬組織の形成が確認され、 さらにこ の試料から抽出した R N Aを、 R T— P C Rを用いて評価したところ、 象牙芽細 胞の分化マーカーの mR N Aが発現していること、 すなわち、 得られた硬組織が 象牙質様組織であったことが開示されている。 ただし、 形成された硬組織の量は 非常に少なく、 臨床応用にはより多量の象牙質再生が求められる。
さらに P. Pavasant ら、 Archives of Oral Biology, 2003, 48, .717-722には、 ヒ ト歯髄細胞に 1， 2 5— （ジヒドロキシ） ビタミン D 3と T G F— jSを添加する ことにより、 硬組織形成の指標であるアル力リホスファターゼ活性が上昇するこ とが示されてレ、る。 し力 しな力 Sら、 P. Pavasant ら、 Archives of Oral Biology, 2003, 48, 717-722 におけるアル力リホスファターゼ活性は不十分なもの であり、また、 T G F— i3などのぺプチド性因子は高価で供給性に問題がある上、 速やかに失活するか、 もしくは至適濃度を維持することが困難であり、 実用上満 足できる方法ではない。 発明の開示
本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。 即ち、 本発明は、 より効率的にヒ ト歯髄細胞から象牙質を形成する象牙芽細胞に 分化させる方法を提供することを解決すべき課題とした。 また、 本発明は、 う蝕 などの歯科疾患への臨床応用に可能なほど多量な象牙質を再生する方法を提供す ることを解決すべき課題とした。 さらに本発明は、 分化誘導された象牙芽細胞又 は再生した象牙質を用いてう蝕などの歯科疾患を治療する方法を提供することを 解決すべき課題とした。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意検討した結果、 ヒト歯髄細胞又 はヒ ト歯髄細胞に分化可能な細胞を 1， 2 5 (ジヒドロキシ） ビタミン D 3、 デ キサメタゾン及ぴ j3—グリセ口ホスフェートの存在下で培養することにより、 象 牙質を形成する象牙芽細胞への分化を効率良く行うことができることを実証した。 本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、 本努明によれば、 分離したヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な 細胞のうち少なくとも 1種類を 1 , 2 5 (ジヒドロキシ） ビタミン D 3、 デキサ メタゾン及ぴ —グリセ口ホスフェートの存在下で培養することを含む、 分化誘 導された象牙芽細胞の製造方法が提供される。
好ましくは、 細胞を担体上で培養する。
好ましくは、 1， 2 5 (ジヒドロキシ） ビタミン D 3の培地中の濃度は 1 X 1 0一8〜 1 X 1 0— 5 m o 1 / 1であり、デキサメタゾンの培地中の濃度は 1 X 1 0 一9〜 1 X 1 0— 6 m o 1 Z 1であり、 i3—グリセ口ホスフェートの培地中の濃度は 1〜3 O mm o 1 / 1である。
好ましくは、本発明による分化誘導された象牙芽細胞の製造方法は、 （i )分離 したヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも 1種類を 培養する工程、 （ii) 当該細胞を担体に播種して培養する工程、 及び （iii) 当該 細胞を 1， 2 5 (ジヒドロキシ） ビタミン D 3、 デキサメタゾン及び 3—グリセ 口ホスフェートを含む培地中で培養する工程、 を含む。 好ましくは、 担体がセラミック系担体である。
本発明の別の側面によれば、 上記方法により得られる、 分化誘導された象牙芽 細胞が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した分化誘導された象牙芽細胞を含む、 象牙質再生用細胞組成物が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記方法により得られる分化誘導された象 牙芽細胞を培養することを含む、 象牙質の再生方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記方法により再生された象牙質が提供さ れる。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記方法により得られる分化誘導された象 牙芽細胞、 又は上記方法により再生された象牙質を患者に移植することを含む、 歯科患者の治療方法が提供される。 図面の簡単な説明
図 1は、比較例 1、比較例 2および実施例 1の条件下での細胞数と ALPase活性 およびその経時変化 （7日目、 1 0日目） を示す。
図 2は、比較例 3、比較例 4および比較例 5の条件下での細胞数と ALPase活性 およびその経時変化 （7日目、 1 0日目） を示す。
図 3は、比較例 6、比較例 Ίおよび実施例 2の条件下での細胞数と ALPase活性 およびその経時変化 （7日目、 1 0日目） を示す。
図 4は、 培養ヒト歯髄細胞の移植により得られた組織の HE染色像を示す。 図 5は、 培養ヒ ト歯髄細胞の移植により得られた組織の HE染色像 （分化誘導 ( + ) ) を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による分化誘導された象牙芽細胞の製造方法は、 ヒト歯髄細胞またはヒ ト歯髄細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも 1種類を 1， 25 (ジヒドロキシ） ビタミン D 3、 デキサメタゾン及ぴ ーグリセ口ホスフェートの存在下で培養す ることを特徴とする。
本発明においてヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞は、 1 種類の 細胞から成る単一の細胞として培養してもよいし、 2種類以上の細胞からなる細 胞混合物として培養してもよい。
ヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞は、 ヒトの抜去歯等から採取 することができる。 ヒ ト歯髄細胞は、 例えば About L,他 Experimental cell research, 258, 33-41, 2000 に記載の方法に従って採取することができる。 また、 ヒト歯髄細胞に分ィヒ可能な細胞は、 例えば以下の方法で採取することができる。 埋伏歯を無菌的に取り出し、 Phosphate Buffered Saline (以下 PBSと略す） 溶液 などの適当な保存液で保存する。 歯牙の中の石灰化した部分を取り除き、 メスに て組織を小片にして、 PBS溶液などを用いて組織を洗浄する。 次いで、 コラゲナ ーゼゃディスパーゼを用いて組織を酵素処理することが好ましい。 酵素処理後、 ピぺッティング操作と遠心操作により細胞を回収することができる。
細胞の培養は、 動物細胞の培養に用いる通常の血清入り培地や無血清培地を用 いて、.通常の動物細胞の培養条件 （例えば、 室温から 37°Cの温度； 5%C02インキ ュベータ一内など） の下で行なうことができる。 また、 培地には、 ァスコルビン 酸などの添加剤を加えることも可能である。 培養の形態は特に限定されないが、 例えば、 静置培養で行なうことができる。
1, 25 (ジヒドロキシ） ビタミン D3の添加量は、 培地中に 1 X 10一8〜 1 X 10— 5mo 1ノ 1、 より好ましくは 1 X 10— 7〜： L X l O—6mo 1/ 1であ る。
また、デキサメタゾンの添加量は、培地中に 1 X 10— 9〜1 X 10— 6mo 1 / 1、 より好ましくは 1 X 10一8〜 1 X 10— 7mo lZlである。
更に、/ 3—グリセ口ホスフェートの添カ卩量は、培地中に 1〜3 Ommo 1/1、 より好ましくは 2〜 1 Ommo 1 / 1である。 本発明において、 細胞の培養は担体上で行ってもよいし、 担体無しで培養して もよい。担体としては、象牙質の形成に必要とされる時間を耐久することができ、 かつその後、 速やかに吸収されるものが好ましい。 さらに、 細胞と高い親和性を 有する材料からなる担体を使用することが好ましい。
担体の素材は、 上記特性を満たすものであれば特に限定されないが、 例えば、 セラミック系の材科 （例えば、 ハイドロキシアパタイト （HAp)、 リン酸三カルシ ゥム（ ー T C P )、 リン酸四カルシウム）、ポリダリコール酸（P G A)、ポリ （D Lーラクチドーコーダリコシド） （P L GA)、 ポリ乳酸（P L L A)、 ポリ力プロ ラタトンなどの合成高分子材料、 またはコラーゲン、 ゼラチン、 ブイブリンなど の蛋白質材料、あるいはヒアルロン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、象牙、 サンゴなどの天然由来材料を使用することもできる。
P G A、 P L L A、 P L G Aまたはポリ力プロラクトンなどの合成材料を使用 する場合には、 細胞の接着及ぴ増殖性を高めるために、 表面にコラーゲン溶液又 はフイブロネクチン溶液などをコートして使用することもできる。
上記の担体の形態としては、 メッシュ形態、 スポンジ形態、 ゲル形態、 不織布 形態、 粒状形態などが可能である。
担体は細胞を移植しやすい形状に加工したものが好ましく、 板状、 球状の多孔 体あるいは中空で一端が開放されており、 周囲から血管が進入しやすくなってい るものが好ましい。
担体は、目的に適合した形態のものを作製することが好ましい。このためには、 目的とする形態をレジンで作製した後に印象材を用いて型を取得する。 その後、 レジンの型を取り出し、 担体を構成する合成材料を流し込むことによって目的の 形態を再現することができる。
本発明の一実施態様によれば、 本発明の方法は、 以下の 3工程を含むことがで きる。
( i ) 分離したヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞のうち少なくと も 1種類を培養する工程 （一次培養） ； (ii) 当該細胞を担体に播種して培養する工程 （二次培養） ；及ぴ
(iii) 当該細胞を 1， 2 5 (ジヒドロキシ） ビタミン D 3、 デキサメタゾン及び —グリセ口ホスフェートを含む培地中で培養する工程 （分化誘導） ： 上記の工程 （i)は、 以後の工程において象牙質を再生するのに必要な数の細胞 を得るために行う培養である。 工程（i) における細胞の培養は、動物細胞の培養 に用いる通常の血清入り培地や無血清培地を用いて、 通常の動物細胞の培養条件 (例えば、 室温から 37°Cの温度； 5%C02ィンキュベータ一内など） の下で行なう ことができる。 また、 培地には、 ァスコルビン酸などの添加剤を加えることも可 能である。 培養の形態は特に限定されないが、 例えば、 静置培養で行なうことが できる。また、工程（i)で得られた細胞は、凍結保存しておくことも可能であり、 必要時に解凍して增殖させたものを、 上記工程（ii)以降の操作に使用することも できる。 この手法によれば、 象牙質再生を行う度に細胞を採取する必要がなくな り、 患者の負担を軽減することができる。
上記の工程（ii)は、担体上で細胞を増殖させる工程である。担体に播種した細 胞は、 担体に接着して、 増殖する。 工程 （ii) における細胞の培養も、 動物細胞 の培養に用いる通常の血清入り培地や無血清培地を用いて、 通常の動物細胞の培 養条件 （例えば、 室温から 37°Cの温度； 5%C02インキュベーター内など） の下で 行なうことができる。 培養期間としては、 好ましくは 1〜 3 0日、 さらに好まし くは 5〜2 5日である。
上記の工程 （iii) は、 象牙芽細胞への分化誘導を促進する工程である。 1， 2 5 (ジヒドロキシ） ビタミン D 3、 デキサメタゾン及び j3—グリセ口ホスフエ一 トの使用量は本明細書中上記した通りである。
本発明の方法では、 ヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞を担体に 播種して、 または必要に応じて播種後培養し、 該培養細胞を担体と一緒に直接患 者に移植しても良い。 あるいはさらに好ましくは、 分離したヒ ト歯髄細胞又はヒ ト歯髄細胞に分化可能な細胞を培養して増殖させた後に担体に播種して、 または 必要に応じて播種後培養し、 次いで該培養細胞を担体と一緒に移植し、 体内で象 牙質を再生させることができる。
あるいはまた、 分離したヒト歯髄細胞若しくはヒト歯髄細胞に分化可能な細胞 を培養して增殖させた後に担体に播種して、 または必要に応じて播種後培養し、 次レ、で該培養細胞を担体と一緒に移植動物に移植し、 該移植動物の体内で象牙質 を再生させることができる。 移植動物の種類は特に限定されないが、 好ましく は哺乳動物であり、例えば、 マウス （ヌードマウスなど）、 ラット （ヌードラット など） などのげつ歯類動物を使用することができる。 移植の部位は特に限定され ず、 例えば、 背部皮下などが挙げられる。
上記した本発明の方法により分化誘導された象牙芽細胞及び本発明の方法によ り再生した象牙質は、う蝕などの歯科疾患を有する患者に移植することによって、 該歯科患者を治療することができる。即ち、象牙質を用いる歯科疾患の治療方法、 例えば、 髄腔の穿孔ゃ露髄部の治療、 根管治療などへの適用も本発明の範囲内の ものである。 歯科患者に移植された後も象牙質の成長を継続させることにより、 象牙質を形成させることができる。
以下の実施例により本努明をさらに具体的に説明するが、 本発明は実施例によ つて限定されるものではない。 実施例
比較例 1 ：培養ヒ ト歯髄細胞の細胞数と ALPase活性の測定（添加因子を加えない 条件）
( 1 ) 採取保存
医師によるインフォームドコンセントの得られた患者（29歳女性） の智歯を使 用した。 治療のため抜歯した智歯をタービンで削り、 歯髄を露出させ、 無菌的に 歯髄組織を採取し、 10%抗生剤入り PBS溶液にて保存した。
メスにて歯髄組織を約 2腿の小片にし、 PBS溶液にて 5回洗浄した。
( 2 ) 細胞回収
2mg/mlコラゲナーゼを DMEM培地に溶解した酵素溶液を用いて、 洗浄した組織 を 50分間酵素処理した。得られた組織を 25ml用のピぺットを用いて 10分間ピぺ ッティングした。 25mlの上澄み液を遠心分離して細胞を回収した。得られた細胞 を DMEM培地と Nutrient Mixture F - 12を 1 ： 1で混合した （以下 DMEM/F12と略 す） 培地に 15%血清を入れた培地にて 5回洗浄した後、 70 mセルス トレイナー でろ過し、 遠心分離することによつて細胞を回収した。
( 3 ) 静置培養
回収した細胞を 15%血清入り DMEM/F12培地に 100 μ ΐηο1/1の濃度でァスコルビ ン酸を添加して 37°C、 5%C02条件下で培養を行なレ、、 2回継代した細胞をトリプ シン- EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、 12ゥヱルプレートに I X 104 個/ well播種をした後、 37°C、 5%C02条件下で静置培養を行なった。
( 4 ) 測定
ALPase活性の測定には ρ- Nitrophenyl phosphate tablets sets (SIGMA社製） を使用した。 細胞播種後、 7日間および 10日間経過したプレートの培養上清を吸 引除去し、 PBS溶液で洗浄した後、パラニトロフエニルリン酸（以下 PNPPと略す） 溶液を各ゥエルに 800 μ 1ずつ添加して、 37°C、 5% C02条件下で 6分間反応させ た。 0. 2Nの NaOH溶液を等量加えて反応を停止させ、 96穴プレートに 200 μ 1添加 し、 マイクロプレートリーダー （TECAN社製 GENios) を用いて 415nmの吸光度を 測定した。
細胞数の測定には Cell Counting Kit- 8 (同仁化学研究所社製） を用いた。 細 胞播種後、 7 日間および 10 日間経過したプレートの培養上淸を吸引除去し、 DMEM/F12培地を各ゥヱルに lmlずつ加え、 Cell Counting Kit- 8溶液を各ゥエル に 100 1ずつ添加して、 37°C、 5%C02条件下で 60分間呈色反応を行なった。 反 応後の試薬溶液を蒸留水で 4倍希釈して、 96穴プレートに 200 z l添加し、 マイ クロプレートリーダー（TECAN社製 GEMos)を用いて 450nmの吸光度を測定した。
( 5 ) 結果
測定した結果を、 図 1 (ind (-)） に示す。 比較例 2 ： TGF- /S 1と 1， 2 5 (ジヒドロキシ） ビタミン D 3を添加して培養した ヒト歯髄細胞の細胞数と ALPase活性の測定 （P. Pavasant ら、 Archives of Oral Biology, 2003, 48, 717-722に記載の条件）
なお、 以下の比較例 2においては、 （1 ) 採取保存、 （2 ) 細胞回収、 （4 ) 測定 は、 比較例 1と同じ条件下で行っており、 条件の異なる静置培養と結果について のみ詳述する。
静置培養
回収した細胞を 15%血清入り DMEM/F12培地に 100 μ mol/1の濃度でァスコルビ ン酸を添加して 37°C、 5%C02条件下で培養を行なレ、、 2回継代した細胞をトリプ シン- EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、 12ゥエルプレートに 1 X 104 個/ well播種をした。 培養には Ing/mlTGF - )3 1、 10— 8mol/l 1， 2 5 (ジヒドロキ シ） ビタミン D 3を添加した 15%血清入り DMEM/F12培地を用いて 37。C、 5%C02 条件下で静置培養を行なつた。 測定した結果を、 図 1 (TGF+VD) に示す。 比較例 3：培養ヒト歯髄細胞の細胞数と ALPase活性の測定（添加因子を加えない 条件）
( 6 ) 採取保存
医師によるインフォームドコンセントの得られた患者 （24歳女性） の智歯を使 用した。 治療のため抜歯した智歯をタービンで削り、 歯髄を露出させ、 無菌的に 歯髄組織を採取し、 10%抗生剤入り PBS溶液にて保存した。
メスにて歯髄組織を約 2mmの小片にし、 PBS溶液にて 5回洗浄した。
( 7 ) 細胞回収
2mg/mlコラゲナーゼを DMEM培地に溶解した酵素溶液を用いて、 洗浄した組織 を 50分間酵素処理した。得られた組織を 25ml用のピぺットを用いて 10分間ピぺ ッティングした。 25mlの上澄み液を遠心分離して細胞を回収した。得られた細胞 を DMEM培地と Nutrient Mixture F - 12を 1 : 1で混合した （以下 DMEM/F12と略 す） 培地に 15%血清を入れた培地にて 5回洗浄した後、 70 ^ πιセルストレイナー でろ過し、 遠心分離することによって細胞を回収した。
( 8 ) 静置培養
回収した細胞を 15%血清入り DMEM/F12培地に 100 μ πιο1/1の濃度でァスコルビ ン酸を添加して 37°C、 5%C02条件下で培養を行ない、 4 回継代した細胞をトリプ シン- EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、 12ゥエルプレートに 1 X 104 個/ well播種をした後、 37°C、 5%C02条件下で静置培養を行なった。
( 9 ) 測定
ALPase活性の測定には p-Nitrophenyl phosphate tablets sets (SIGMA社製） を使用した。 細胞播種後、 7日間および 10日間経過したプレートの培養上清を吸 引除去し、 PBS溶液で洗浄した後、パラ-トロフヱ二ルリン酸（以下 PNPPと略す） 溶液を各ゥエルに 800 β 1ずつ添加して、 37°C、 5%C02条件下で 6分間反応させた。 0. 2Nの NaOH溶液を等量加えて反応を停止させ、 96穴プレートに 200 1添加し、 マイクロプレートリーダー （TECAN社製 GENios) を用いて 415nmの吸光度を測定 した。
細胞数の測定には Cell Counting Kit- 8 (同仁化学研究所社製） を用いた。 細 胞播種後、 7 日間および 10 日間経過したプレートの培養上清を吸引除去し、 DMEM/F12培地を各ゥヱルに lmlずつ加え、 Cell Counting Kit- 8溶液を各ゥエル に ΙΟΟ μ Ιずつ添加して、 37°C、 5%C02条件下で 60分間呈色反応を行なった。 反 応後の試薬溶液を蒸留水で 4倍希釈して、 96穴プレートに 200 添加し、 マイ クロプレートリーダー（TECAN社製 GENios)を用いて 450nmの吸光度を測定した。
( 1 0 ) 結果
測定した結果を、 図 2 (ind (-) ) に示す。 比較例 4 ：デキサメタゾンとリン酸ニ水素力リウムなどを添加し、 培養したヒト 歯 髄 細 胞 の 細 胞 数 と ALPase 活性 の 測 定 （ S. Gronthos ら 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97 (25) ： 13625-13630記載の条件） なお、 以下の比較例 4においては、 （6 ) 採取保存、 （7 ) 細胞回収、 （9 ) 測定 は、 比較例 3と同じ条件下で行っており、 条件の異なる静置培養と結果について のみ詳述する。
静置培養
回収した細胞を 15%血清入り DMEM/F12培地に ΙΟΟ μ πιοΙ八の濃度でァスコルビ ン酸を添加して 37°C、 5%C02条件下で培養を行ない、 4回継代した細胞をトリプ シン- EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、 12ゥエルプレートに 1 X 104 個 /well 播種を した。 培養には 100 μ raol/1 ァス コル ビン酸、 10— 8 mol/lDexamethasone 2. 9ramol/ 1 リン酸二水素カリウム、 20mmol/l HEPES ( [2 一 [4一 （2—ヒ ドロキシェチル） 一 1ーピぺラジュル] エタンスルホン酸） を添加 した 15%血清入り DMEM/F12培地を用いて 37°C、 5%C02条件下で静置培養を行な つた。
結果
測定した結果を、 図 2 (Dex+KH2P04) に示す。 比較例 5 ： ]3グリセ口リン酸とデキサメタゾンを添加して培養したヒト歯髄細胞 の細胞数と ALPase活性の測定 （ 1， 2 5 (ジヒ ドロキシ） ビタミン D 3のみ添加 しない条件）
なお、 以下の比較例 5においては、 （6 ) 採取保存、 （7 ) 細胞回収、 （9 ) 測定 は、 比較例 3と同じ条件下で行っており、 条件の異なる静置培養と結果について のみ詳述する。
静置培養
回収した細胞を 15%血清入り DMEM/F12培地に 100 /z mol/lの濃度でァスコルビ ン酸を添カ卩して 37°C、 5°/oC02条件下で培養を行ない、 2回継代した細胞をトリプ シン - EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、 12ゥエルプレートに 1 X 104 個/ well 播種をした。 培養には lOmmol/1 - Glycerophosphate、 10"8mol/ 1 Dexamethasoneを添加した 15°/o血清入り DMEM/F12培地を用いて 37°C、 5%(¾条 件下で静置培養を行なった。
結果
測定した結果を、 図 2 ( β Gly+Dex) に示す。 比較例 6：培養ヒト歯髄細胞の細胞数と ALPase活性の測定（添加因子を加えない 条件）
( 1 1 ) 採取保存
医師によるインフォームドコンセントの得られた患者（22歳女性） の智歯を使 用した。 治療のため抜歯した智歯をタービンで削り、 歯髄を露出させ、 無菌的に 歯髄組織を採取し、 10%抗生剤入り PBS溶液にて保存した。
メスにて歯髄組織を約 2mmの小片にし、 PBS溶液にて 5回洗浄した。
( 1 2 ) 細胞回収
2mg/mlコラゲナーゼを DMEM培地に溶解した酵素溶液を用いて、 洗浄した組織 を 50分間酵素処理した。得られた組織を 25ml用のピペットを用いて 10分間ピぺ ッティングした。 25mlの上澄み液を遠心分離して細胞を回収した。 得られた細胞 を DMEM培地と Nutrient Mixture F - 12を 1 ： 1で混合した （以下 DMEM/F12と略 す） 培地に 15%血清を入れた培地にて 5回洗浄した後、 70 セルス トレイナー でろ過し、 遠心分離することによって細胞を回収した。
( 1 3 ) 静置培養
回収した細胞を 15%血清入り DMEM/F12培地に 100 μ mol/1の濃度でァスコルビ ン酸を添加して 37°C、 5%C02条件下で培養を行なレ、、 2回継代した細胞をトリプ シン- EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、 12ゥエルプレートに 1 X 104 個/ well播種をした後、 37°C、 5%C02条件下で静置培養を行なった。
( 1 4 ) 測定
ALPase活性の測定には p-Nitrophenyl phosphate tablets sets (SIGMA社製） を使用した。 細胞播種後、 7日間および 10日間経過したプレートの培養上清を吸 引除去し、 PBS溶液で洗浄した後、パラニトロフ 二ルリン酸（以下 PNPPと略す） 溶液を各ゥヱルに 800 μ 1ずつ添加して、 37°C、 5%C02条件下で 6分間反応させた。 0. 2Nの NaOH溶液を等量加えて反応を停止させ、 96穴プレートに 200 μ 1添加し、 マイクロプレートリーダー （TECAN社製 GEMos) を用いて 415nmの吸光度を測定 した。
細胞数の測定には Cell Counting Kit-8 (同仁化学研究所社製） を用いた。 細 胞播種後、 7 日間および 10 日間経過したプレートの培養上清を吸引除去し、 DMEM/F12培地を各ゥエルに lmlずつ加え、 Cell Counting Kit- 8溶液を各ゥエル に 100 μ ΐずつ添加して、 37°C、 5%C02条件下で 60分間呈色反応を行なった。 反 応後の試薬溶液を蒸留水で 4倍希釈して、 96穴プレートに 200 // 1添加し、 マイ クロプレートリーダー（TECA 社製 GENios)を用いて 450nmの吸光度を測定した。 ( 1 5 ) 結果
測定した結果を、 図 3 (ind (-) ) に示す。 比較例 7 ： jSグリセ口リン酸とデキサメタゾンを添加して培養したヒト歯髄細胞 の細胞数と ALPase活性の測定 （ 1， 2 5 (ジヒドロキシ） ビタミン D 3のみ添加 しない条件）
なお、以下の比較例 7においては、 （1 1 )採取保存、 （1 2 )細胞回収、 （1 4 ) 測定は、 比較例 6と同じ条件下で行っており、 条件の異なる静置培養と結果につ いてのみ詳述する。
静置培養
回収した細胞を 15%血清入り DMEM/F12培地に ΙΟΟ μ mol/1の濃度でァスコルビ ン酸を添加して 37°C、 5°/oC02条件下で培養を行ない、 2回継代した細胞をトリプ シン- EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、 12ゥヱルプレートに I X 104 個/ well 播種をした。 培養には 10mmol/l ]3 - Glycerophosphate、 10— 8mol/ 1 Dexamethasoneを添加した 15%血清入り DMEM/F12培地を用いて 37°C、 5%C02条 件下で静置培養を行なつた。 結果
測定した結果を、 図 3 ( β Gly+Dex) に示す。 実施例 1：分化誘導因子を添カ卩して培養したヒト歯髄細胞の細胞数と ALPase活性 の測定
なお、 以下の実施例 1においては、 （1 ) 採取保存、 （2 ) 細胞回収、 （4 ) 測定 は、 比較例 1と同じ条件下で行っており、 条件の異なる静置培養と結果について のみ詳述する。
静置培養
回収した細胞を 15%血清入り DMEM/F12培地に 100 μ mol/1の濃度でァスコルビ ン酸を添加して 37°C、 5%C02条件下で培養を行ない、 2回継代した細胞をトリプ シン - EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、 12ゥエルプレートに I X 104 個/ well播種をした。培養には 100 mol/1ァスコルビン酸、 10— ol/l 1， 2 5 (ジ ヒ ドロ キシ） ビタ ミ ン D 3、 lOmmol/1 β -Glycerophosphate、 10— 8mol/ 1 Dexamethasoneを添加した 15%血清入り DMEM/F12培地を用いて 37°C、 5%(：02条 件下で静置培養を行なつた。
結果
測定した結果を、 図 1 (VD+ j3 Gly+Dex) に示す。 以上の比較例 1 (添加因子を加えない条件）、比較例 2 (P. Pavasantら、 Archives of Oral Biology, 2003, 48, 717-722に記載の条件）および実施例 1を比較すると、 実施例 1記載の条件の場合、 細胞の分化が進むため細胞の増殖性は低下するが、 歯髄細胞への分化及び象牙質形成能の一指標である ALPase活性は顕著に増加し ている （図 1 )。 実施例 2：分化誘導因子を添加して培養したヒ ト歯髄細胞の細胞数と ALPase活性 の測定 なお、以下の実施例 2においては、 （1 1 )採取保存、 （1 2 )細胞回収、 （1 4 ) 測定は、 比較例 6と同じ条件下で行っており、 条件の異なる静置培養と結果につ いてのみ詳述する。
静置培養
回収した細胞を 15%血清入り DMEM/F12培地に 100 μ mol/1の濃度でァスコルビ ン酸を添加して 37°C、 5%C02条件下で培養を行ない、 2回継代した細胞をトリプ シン- EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、 12ゥエルプレートに 1 X 104 個/ well播種をした。培養には 100 μ mol/1ァスコルビン酸、 10"¾ο1/1 1， 2 5 (ジ ヒ ドロ キシ） ビタ ミ ン D3、 10mmol/l β -Glycerophosphate、 10— ol/ 1 Dexamethasoneを添加した 15%血清入り DMEM/F12培地を用いて 37°C、 5%C02条 件下で静置培養を行なった。
結果
測定した結果を、 図 3 (VD+ j3 Gly+Dex) に示す。 以上の比較例 3 (添加因子を加えない条件）、 比較例 4 (S. Gronthos ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97 (25) ： 13625- 13630に記載の条件) および比較 例 5 ( 1， 2 5 (ジヒドロキシ） ビタミン D 3のみ添加しない条件） を比較する と、比較例 5において歯髄細胞への分化及び象牙質形成能の一指標である ALPase 活性が最も增加している （図 2 )。
更に同様に比較例 6 (添加因子を加えない条件）、 比較例 7 ( 1 , 2 5 (ジヒド 口キシ） ビタミン D 3のみ添加しない条件） および実施例 2を比較すると、 実施 例 2の条件の場合、 歯髄細胞への分化及ぴ象牙質形成能の一指標である ALPase 活性が顕著に増加している （図 3 )。 すなわち、図 2および図 3の結果から明らか に S. Gronthos ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97. (25) ： 13625-13630に記載 の条件より実施例 2の条件の方が効果があることが分かる。 比較例 8 ：象牙芽細胞への分化誘導を促進する工程を含まない移植実験 医師によるインフォームドコンセントの得られた患者 （21歳男性） の智歯を使 用した。 治療のため抜歯した智歯をタービンで削り、 歯髄を露出させ、 無菌的に 歯髄組織を採取し、 10%抗生剤入り PBS溶液にて保存した。
メスにて歯髄組織を約 2mmの小片にし、 PBS溶液にて 5回洗浄した。
2mg/mlコラゲナーゼを DMEM培地に溶解した酵素溶液を用いて、 洗浄した組織 を 50分間酵素処理した。得られた組織を 25ml用のピぺットを用いて 10分間ピぺ ッティングした。 25πι1の上澄み液を遠心分離して細胞を回収した。得られた細胞 を DMEM/F12培地に 15%血清を入れた培地にて 5回洗浄した後、 70 μ mセルス トレ イナ一でろ過し、 遠心分離することによって細胞を回収した。
回収した細胞を 15%血清入り DMEM/F12培地に 100 / mol/1の濃度でァスコルビ ン酸を添加して 37°C、 5%C02条件下で培養を行ない、 1回継代した細胞をトリプ シン- EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、 15%血清入り DMEM/F12培地 にて 5. 0 X 106個/ ΙΟΟ μ Ιの細胞懸濁液に調整し、 96穴プレートで ΗΑρ/ - TCP多 孔体 130mg (日本特殊陶業製） に播種した後、 37°C、 5%C02条件下で静置培養を 4. 5時間行なった。
担体に細胞が接着後、 6穴プレートへ移し、 15%血清入り DMEM/F12培地にて 13 日間担体上で増殖させた。
移植動物としては、 ヌードマウス KSNを用いた。 ヌードマウス背部皮膚を切開 し、 細胞を播種した担体を皮下に入れ、 皮膚を縫合した。
移植後 6週にて試料を採取した。 摘出した試料は、 10%ホルマリン溶液にて固 定し、 常法に従ってパラフィンに包埋して連続組織切片を作成した。 その後、 切 片にへマトキシリン-ェォジン染色 （HE染色） を施し、 組織学的に観察した。 移植後 6週で摘出した移植体は生体に吸収されることなく原型を維持していた。 また、 HE染色した組織を観察した結果、 硬組織は形成しているものの、 幼弱で量 も少なかった （図 4 )。 実施例 3 ：象牙芽細胞への分化誘導を促進する工程を含む移植実験 医師によるインフォームドコンセントの得られた患者 （21歳男性） の智歯を使 用した。 治療のため抜歯した智歯をタービンで削り、 歯髄を露出させ、 無菌的に 歯髄組織を採取し、 10%抗生剤入り PBS溶液にて保存した。
メスにて歯髄組織を約 2mmの小片にし、 PBS溶液にて 5回洗浄した。
2mg/mlコラゲナーゼを DMEM培地に溶解した酵素溶液を用いて、 洗浄した組織 を 50分間酵素処理した。得られた組織を 25ml用のピぺットを用いて 10分間ピぺ ッティングした。 25mlの上澄み液を遠心分離して細胞を回収した。得られた細胞 を DMEM/F12培地に 15%血清を入れた培地にて 5回洗浄した後、 70 mセルス トレ イナ一でろ過し、 遠心分離することによつて細胞を回収した。
回収した細胞を 15%血清入り DMEM/F12培地に 100 μ mol/1の濃度でァスコルビ ン酸を添加して 37°C、 5%C02条件下で培養を行ない、 1回継代した細胞をトリプ シン- EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、 15%血清入り DMEM/F12培地 にて 5. 0 106個/100 1の細胞懸濁液に調整し、 96穴プレートで HAp/ i3 - TCP多 孔体 130mg (日本特殊陶業製） に播種した後、 37°C、 5%C02条件下で静置培養を 4. 5時間行なった。
担体に細胞が接着後、 6穴プレートへ移し、 15%血清入り DMEM/F12培地にて 7 日間担体上で増殖させた。
更に分化誘導因子として 100 μ mol/1ァスコルビン酸、 10— 6mol/lの 1， 2 5 (ジ ヒ ドロ キシ） ビタ ミ ン D 3、 10mmol/l β -Glycerophosphate、 10"8mol/ 1 Dexamethasoneを 15%血清入り DMEM/F12培地に添加した培地にて 6日間培養し、 象牙質再生用組成物を得た。 ' ·
移植動物としては、 ヌードマウス KSNを用いた。 ヌードマウス背部皮膚を切開 し、 上記で得た象牙質再生用組成物を皮下に入れ、 皮膚を鏠合した。
移植後 6週にて試料を採取した。 摘出した試料は、 10%ホルマリン溶液にて固 定し、 常法に従ってパラフィンに包埋して連続組織切片を作成した。 その後、 切 片に HE染色を施し、 組織学的に観察した。
移植後 6週で摘出した移植体は生体に吸収されることなく原型を維持していた。 また、 HE染色した組織を観察した結果、 比較例 8と比較して顕著に象牙質様硬組 織を形成していた （図 5 )。 産業上の利用可能性
本努明の方法を利用して、 培地上で象牙質を形成してから、 あるいは象牙質を 形成するように分化誘導された象牙芽細胞を必要に応じ担体等と共に齒科患者に 移植することにより、 欠損部若しくは根管を充填できるよう象牙質を再生させる ことができる。 この結果、 歯牙を維持することが可能となり二次感染の確率の低 い極めて有効な治療となる。 また、 自らの歯牙を長期間雑持できることから、 患 者の Quality of Life (Q0L) の向上に大きく貢献する。

Claims

請求の範囲
1 . 分離したヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞のうち少なく とも 1種類を 1， 2 5 (ジヒドロキシ） ビタミン D 3、 デキサメタゾン及び 一 グリセ口ホスフェートの存在下で培養することを含む、 分化誘導された象牙芽細 胞の製造方法。
2 . 細胞を担体上で培養する、 請求項 1に記載の方法。
3 . 1 , 2 5 (ジヒドロキシ） ビタミン D 3の培地中の濃度が 1 X 1 0— 8〜 1 X 1 0— 5 m o 1 / 1であり、デキサメタゾンの培地中の濃度が 1 X 1 0— 9〜1 X 1 0— 6 m o 1 1であり、 ]3—グリセ口ホスフェートの培地中の濃度が 1〜3 O mm o 1 / 1である、 請求項 1又は 2に記載の方法。
4 . ( i ) 分離したヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞のうち 少なくとも 1種類を培養する工程、（ii)当該細胞を担体に播種して培養する工程、 及ぴ （iii) 当該細胞を 1， 2 5 (ジヒドロキシ） ビタミン D 3、 デキサメタゾン 及ぴ ]3—グリセ口ホスフェートを含む培地中で培養する工程、 を含む、 請求項 1 から 3の何れかに記載の方法。
5 . 担体がセラミック系担体である、 請求項 4に記載の方法。
6 . 分離したヒト歯髄細胞又はヒ ト歯髄細胞に分化可能な細胞のうち少なく とも 1種類を 1， 2 5 (ジヒドロキシ） ビタミン D 3、 デキサメタゾン及び; 3— グリセ口ホスフェートの存在下で培養することを含む分化誘導された象牙芽細胞 の製造方法により得られる、 分化誘導された象牙芽細胞。
7 . 請求項 6に記載の分化誘導された象牙芽細胞を含む、 象牙質再生用細 胞組成物。
8 . 請求項 1から 5の何れかに記載の方法により得られる分化誘導された象 牙芽細胞を培養することを含む、 象牙質の再生方法。
9 . 分離したヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞のうち少なく とも 1種類を 1， 2 5 (ジヒドロキシ） ビタミン D 3、 デキサメタゾン及ぴ3— グリセ口ホスフェートの存在下で培養することを含む分化誘導された象牙芽細胞 の製造方法により得られる分化誘導された象牙芽細胞を培養することを含む象牙 質の再生方法により再生された象牙質。
1 0 . 請求項 1から 5の何れかに記載の方法により得られる分化誘導された 象牙芽細胞、 又は請求項 5記載の方法により再生された象牙質を患者に移植する ことを含む、 歯科患者の治療方法。
PCT/JP2005/008734 2004-05-07 2005-05-06 ヒト歯髄細胞の分化誘導方法及び象牙質再生用組成物 WO2005108558A1 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-138467 2004-05-07
JP2004138467 2004-05-07
JP2005-045417 2005-02-22
JP2005045417A JP2005341961A (ja) 2004-05-07 2005-02-22 ヒト歯髄細胞の分化誘導方法及び象牙質再生用組成物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005108558A1 true WO2005108558A1 (ja) 2005-11-17

Family

ID=35320227

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/008734 WO2005108558A1 (ja) 2004-05-07 2005-05-06 ヒト歯髄細胞の分化誘導方法及び象牙質再生用組成物

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2005341961A (ja)
WO (1) WO2005108558A1 (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4884678B2 (ja) * 2005-02-03 2012-02-29 国立大学法人名古屋大学 ヒト歯髄細胞からの象牙質再生方法
EP2268254A4 (en) * 2007-12-14 2013-12-11 Univ Nova Southeastern METHOD AND KIT FOR THE ADMINISTRATION OF REGENERATIVE ENDODONTIC TREATMENT
WO2010073415A1 (ja) * 2008-12-26 2010-07-01 株式会社 再生医療推進機構 長期冷凍保存する生体細胞の培養能力評価・保存・保証方法
JP5322221B2 (ja) * 2009-03-16 2013-10-23 国立大学法人広島大学 歯冠修復部材
CN102686720B (zh) 2009-11-17 2013-12-04 国立大学法人冈山大学 由牙髓细胞向成牙本质细胞的分化诱导方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAMATANI T ET AL: "Effects of dexamathesone on pulp cells in cultured human teeth.", JPN J ORAL BIOL., vol. 40, no. 5, 1998, pages 549 - 556, XP002998309 *
KASUGAI ET AL: "Characterization of a system of mineralized-tissue formation by rat dental pulp cells in culture.", ARCHIVES OF ORAL BIOLOGY., vol. 38, no. 9, 1993, pages 769 - 777, XP002998308 *
PAVASANT P ET AL: "The synergistic effect of TGF-beta and 1,25-dihydroxyvitamin D3 on SPARC synthesis and alkaline phosphatase activity in human pulp fibroblasts.", ARCH ORAL BIOL., vol. 48, no. 10, 2003, pages 717 - 722, XP002998307 *
RIKITAKE Y ET AL: "Immortalization of human dental pulp cells with transfecting of the plasmid, pMT1-neo.", JOURNAL OF THE STOMATOLOGICAL SOCIETY JAPAN., vol. 56, no. 4, 1989, pages 540 - 561, XP002998310 *
RITCHIE HH ET AL: "Effects of dexamethasone, vitamin A and vitamin D3 on DSP-PP mRNA expression in rat tooth organ culture.", BIOCHIM BIOPHYS ACTA., vol. 1679, no. 3, September 2004 (2004-09-01), pages 263 - 271, XP004557221 *
SAKAMOTO M ET AL: "Effects of beta-glycerophosphate on mineralization of human dental pulp cells.", NICHIDAI KOKU KAGAKU, vol. 30, no. 2, June 2004 (2004-06-01), pages 113 - 119, XP002998311 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2005341961A (ja) 2005-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8679755B2 (en) Method of producing tooth, set of teeth, and method of producing tissue
US8349608B2 (en) Method for production of tooth, and tooth produced by the method
KR101733137B1 (ko) 연골조직 제조를 위한 3차원 오가노이드 블록 제작 방법
JP5554002B2 (ja) 軟骨組織再生シートの作製方法
JP4991203B2 (ja) 歯の製造方法
JP4884678B2 (ja) ヒト歯髄細胞からの象牙質再生方法
EP2329851B1 (en) Method for forming tooth root-periodontal tissue unit and regenerated tooth
WO2005108558A1 (ja) ヒト歯髄細胞の分化誘導方法及び象牙質再生用組成物
CN102131489A (zh) 牙齿缺损部的修复方法及修复材料的制造方法
EP2119767B1 (en) Method for preparation of cartilage cell
JP4991204B2 (ja) 歯の製造方法
EP1550470A1 (en) Method of regenerating tooth germ and regenerated tooth germ
US20070160584A1 (en) Method of bone regeneration
JP4842579B2 (ja) 歯周組織再生用ゲル化組成物
JP4781037B2 (ja) ヒト歯髄細胞の判別及び選択方法
JP2004357567A (ja) 歯胚の再生方法
JP2005270647A (ja) 象牙質の再生方法及びこれに用いる移植物
Hosein Strategies for whole tooth regeneration and possible rejuvenation of adult dental pulp stem cells.
JP2020036550A (ja) 歯根膜又は靭帯細胞の作製方法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase