WO2005106473A1 - 神経変性疾患治療薬のスクリーニング方法 - Google Patents

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WO2005106473A1
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Yasuki Yoshimoto
Taiji Shimoda
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Ono Pharmaceutical Co Ltd
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the present invention relates to a method of screening for a substance that inhibits the binding between S-100J3 binding protein and S-100 / 3. More specifically, a method for preventing neurodegenerative diseases using the S—100] 3 binding protein and a screening method for Z or a therapeutic agent, a substance obtained by the screening method,
  • the present invention relates to a 0/3 binding protein, an antibody thereof, a polynucleotide encoding the S-1003 binding protein or a polynucleotide complementary to the polynucleotide, a pharmaceutical composition containing the substance, and the like.
  • the cells that make up the parenchyma of the central nervous system include neurons and glial cells, and the number of cells is much greater in glial cells than in neurons.
  • Glial cells play a role in supporting the function of nerve cells. Astrocytes, a type of glial cell, maintain extracellular ionotropic neurotransmitter homeostasis as supporting cells for neurons (Pharmacology and function, pp. 193-228, Academic Press, Inc., (1993 )) And the supply of neurotrophic factors (Hmrmacology and function, pp. 267-308, Academic Press, Inc., (1993)), which play an important role in controlling brain function. It is thought to be acting.
  • neurodegenerative diseases (Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis, etc.) have been thought to be mainly due to abnormalities in nerve cells.
  • glial cells surrounding nerve cells, especially astrocytes, are functionally abnormal has become prominent.
  • S—100 J3 protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37
  • Astrocyte-specific protein that has a calcium-binding site and regulates intracellular calcium concentration, binds to various cytoskeletal proteins, and is involved in changes in cell morphology and release of neurotransmitters (Trends Biochem) Sci, 13, 437-443, (1988)).
  • S-103 is produced by activation of astrocytes and released outside the cell. The released S-103 exhibits trophic and traumatic effects on nerve cells (Progress in Neurobiology, 46, 71-82, (1995)), and also exerts an effect on astrocytes. In addition, it has been reported that it has a growth promoting action and an inducing action of inducible nitric oxide synthase (J. Biological Chemistry, 271.2543-2547, (1996)).
  • S-100] 3 is overexpressed in activated astrocytes during brain injury.
  • the amount of S—100 ⁇ increased in the brain of Alzheimer's patients (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 7611-7615, (1989)), and the increase was in the brain of Alzheimer's patients.
  • senile plaque density J. Neurosci. Res., 398-404, (1994)
  • activated astrocytes with overexpression of S-100i3 exist near the senile plaques in the brain of the Alhaima patient, and the intensity of the expression is correlated with abnormal neuronal process extension. Is reported (J. Neuropathol. Exp.
  • S-100 binding proteins As described above, various proteins are known as S-100 binding proteins. And a method for screening for a prophylactic and / or therapeutic agent for a neurodegenerative disease using an S—100] 3 binding protein that is a specific signaling molecule for S—100] 3. A substance obtained by the method, an S-1000 binding protein, an antibody thereof, and a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the S-100 binding protein or a polynucleotide complementary to the polynucleotide. Drug compositions and the like are not known at present, and it has been desired to provide screening methods and pharmaceutical compositions.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, identified S-100 / 3 binding proteins by the West-Western method, and furthermore, these proteins were identified as S-1000 J3. They found that they were involved in information transmission, and completed the present invention.
  • S—100 binding protein is one amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 36, 84 to 102 and 126, or substantially the same as the amino acid sequence
  • the S—100] 3 binding protein also has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 126. 1
  • the S-100-binding protein has an amino acid sequence selected from one of SEQ ID NOs: 1 to 36, 84 to 102 and 126, or a protein or a partial peptide thereof having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence.
  • the factor induced by the binding of S- 100 j3 binding protein to S- 100 J3 is MCP-1, IL-6, IL-18, A ⁇ , or Ca 2+.
  • the protein which has an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 36, 84 to 102, and 126 or an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence or a partial peptide antibody thereof.
  • composition according to the above 23 which is an agent for preventing and / or treating a neurodegenerative disease.
  • Neurodegenerative diseases include Parkinson's disease, Parkinson's syndrome, striatal substantia nigra, Huntington's disease, chorea-ataxia, progressive supranuclear palsy, diffuse Lewy body disease, basal ganglia Degeneration, Alzheimer's disease, dementia (dementia), spinocerebellar degeneration, motor neuropathy, demyelinating disease, cerebrovascular disorder ⁇ brain tumor ⁇ hypovolemic shock ⁇ traumatic shock ⁇ head injury and Z 24.
  • the pharmaceutical composition according to the above item 24 which is a neurological dysfunction due to cerebrospinal cord injury, a cerebral spinal cord disease due to an infectious disease, a neurological dysfunction due to toxic radiation, a mental illness, epilepsy, Mage syndrome, dystonia, Down syndrome, or a sleep disorder. object,
  • 27. A method for producing a substance that inhibits the binding between S-100jS-binding protein and S-100; 3, which comprises the screening method described in 1 or 8 above.
  • the amino acid sequence substantially identical to S-1000j8 according to the present invention includes about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 9% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37.
  • Amino acid sequences having a homology of 5% or more, and most preferably about 98% or more, can be mentioned.
  • Examples of a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 include, for example, SEQ ID NO: 37 5 008471
  • Examples of substantially the same activity include signal transduction activity, receptor binding activity, and epitope activity.
  • Substantially identical indicates that the properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) identical. Therefore, the signal transduction activity or the receptor binding activity is equivalent (for example, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times).
  • the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
  • the protein of the present invention for example, in addition to the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, some of the amino acids (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5) are used. Deletion, substitution with an arbitrary amino acid, or addition or insertion of an arbitrary amino acid at several positions (preferably 1 to 10 positions, more preferably 1 to 5 positions) in the amino acid sequence And those containing an amino acid sequence obtained by combining them.
  • the position of deletion, substitution, addition, or insertion of an amino acid is not particularly limited.
  • the partial peptide of S-100 according to the present invention is the partial peptide of S-100 according to the present invention described above, which is substantially the same as the partial peptide S-100j according to the present invention. Any peptide may be used as long as it has the same activity. For example, a peptide having at least 10 or more, preferably 30 or more, more preferably 100 or more continuous amino acid sequences of the amino acid sequence of S-100; 3 is included. Further, the partial peptide according to the present invention may be a partial peptide in which some amino acids (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5) in the amino acid sequence have been deleted or substituted with any amino acid.
  • amino acid sequence in which an arbitrary amino acid is added or inserted in several places (preferably 1 to 10 places, more preferably 1 to 5 places) in the amino acid sequence, and a combination thereof. Those containing a amino acid sequence are also included.
  • the position of amino acid lack, substitution, stress [1], or insertion is not particularly limited.
  • the [S-100] 3-binding protein may be any amino acid sequence as long as the protein has an activity of binding to S-100.
  • the S-1 ⁇ -binding protein is preferably an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 36, 84 to 102, and 126 or substantially the same as the amino acid sequence. And more preferably a protein containing an amino acid sequence identical to or substantially identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 126.
  • amino acid sequence identical to or substantially identical to an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 36, 84 to 102, and 126 contains the amino acid sequence ⁇ Protein (hereinafter, referred to as the protein of the present invention) Any amino acid sequence may be used as long as it has an activity of binding to Is 100.
  • the protein according to the present invention includes, for example, the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 1 to 36, 84 to 102, and 126, and a part of the amino acids (preferably 1 ⁇ 10, more preferably 1-5, and more preferably 1-3, and some amino acids (preferably 1-10, more preferably 1-5) , More preferably 1 to 3) substituted with another amino acid, and the amino acid sequence thereof has several amino acids (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and still more preferably 1 to 3). ) Is added or inserted, and those having an amino acid sequence obtained by combining them are also included. 'When the amino acid sequence is deleted, substituted, added or inserted as described above, the position is not particularly limited.
  • SEQ ID NOs: 1 to 36, 84 to 102, and 126 As a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 36, 84 to 102, and 126, SEQ ID NO: 1 To about 85%, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more, and most preferably about 95% or more. Amino acid sequences having a homology of 98% or more.
  • proteins having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 36, 84 to 102, and 126 include, for example, SEQ ID NOs: 1 to 36, 84 to It has an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence described in 102 and 126, and has the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 1 to 36, 84 to 102, and 126.
  • a protein having substantially the same activity as the protein having the same is preferred. Substantially the same activity is as defined above.
  • the partial peptide of the protein according to the present invention (hereinafter, referred to as the partial peptide of the present invention) is the partial peptide of the protein of the present invention, and is substantially the same as the protein of the present invention. Any peptide may be used as long as it has the above activity. For example, a peptide having at least 10 or more, preferably 30 or more, more preferably 100 or more continuous amino acid sequences in the amino acid sequence of the protein according to the present invention is included.
  • the partial peptide according to the present invention may be a partial peptide in which some amino acids (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5) in the amino acid sequence are deleted, or substituted with any amino acid.
  • the position of lack, substitution, addition, or insertion of the amino acid is not particularly limited. Substantially the same activity is as defined above.
  • the protein of the present invention and the partial peptides thereof, the constituent amino acids may have a carboxyl group, and the carboxyl group is amidated or esterified. May be.
  • the ester groups include, for example, alkyl such as methyl, ethyl, propyl, and butyl. 08471
  • a cycloalkyl group such as cyclopentyl or cyclohexinole, or a phenyl group such as phenyl // naphthinole.
  • the amino group of the constituent amino acids may be protected with a formyl group, an acetyl group or the like.
  • those having a sugar chain bonded thereto are also included in the protein and the partial peptide thereof according to the present invention.
  • the protein according to the present invention and their partial peptides, salts with an acid (such as an inorganic acid or an organic acid) or a base (such as an alkali metal salt) are used.
  • an acid such as an inorganic acid or an organic acid
  • a base such as an alkali metal salt
  • Physiologically acceptable acid addition salts are preferred.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, etc.) or organic acids (formic acid, acetic acid, propionic acid, fumaric acid, citric acid, oxalic acid, apple) Acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, succinic acid, maleic acid, tartaric acid, benzoic acid, etc.).
  • inorganic acids hydroochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, etc.
  • organic acids formic acid, acetic acid, propionic acid, fumaric acid, citric acid, oxalic acid, apple
  • Acid methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, succinic acid, maleic acid, tartaric acid, benzoic acid, etc.
  • Factors induced by the binding of S-100 binding protein to S-100] 3 include chemokines, cytokins, peptides, or second messengers. Specific examples include IL-8, IL-6, MCP_1, ⁇
  • the polynucleotide (DNA, RNA or DNAZRNA chimera) encoding the protein or its partial peptide according to the present invention includes a nucleotide sequence encoding the protein or its partial peptide according to the present invention. Anything can be used as long as it is available.
  • the polynucleotide encoding the protein or its partial peptide according to the present invention may be any of genomic DNA, cDNA, synthetic DNA, RNA, cRNA, or DNA-RNA hybrid.
  • the polynucleotide encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof (hereinafter, referred to as the DNA of the present invention) has a sequence number selected from SEQ ID NOs: 38 to 73, 103 to 121, and 127.
  • Base sequence shown In addition to the polynucleotide having a sequence, it has a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with the polynucleotide or a polynucleotide having a complementary sequence thereof, and has substantially the same properties as the protein of the present invention. Any polynucleotide may be used as long as it is a polynucleotide encoding a protein having the same.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 38 to 73, 103 to 121, and a nucleotide sequence selected from the group consisting of 127, and about 90% or more can be mentioned.
  • Hybridization is carried out by a known method, for example, Molecular Cloning (Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., published by Cold Spring Harbor Laboratory Press in 1989) or Current Protocol in Molecular Biology (FM Aus bel et al., published by John Wiley & Sons, Inc.).
  • Stringent conditions include, for example, hybridization at 65 ° C and a washing treatment at 65 ° C with a buffer containing 0.1 XSSC, 0.1% SDS.
  • the DNA according to the present invention may be amplified by chemical synthesis or by a PCR method using a synthetic DNA primer encoding a part of the protein of the present invention or a partial peptide thereof, or It can be obtained by a hybridization method using a synthetic DNA encoding the protein of the present invention or a part of its partial peptide as a probe.
  • cDNA libraries of various human tissues have been marketed and can be used in accordance with the attached instructions.
  • Examples of the thread used for obtaining the DNA according to the present invention by the PCR method or the hybridization method include, for example, a tissue of human in which S-100 is considered to act. , Preferably the brain.
  • the hybridization method can be performed, for example, according to the method described above or the method described in Gene, 10, 63 (1980).
  • the DNA obtained in this manner was obtained by converting a vector DNA containing the DNA.
  • the required amount can be obtained by introducing it into an appropriate host and growing it.
  • Examples of an expression system (host-vector system) for producing a protein or peptide using a genetic recombination technique include, for example, an expression system for bacteria, yeast, insect cells, and mammalian cells.
  • an initiation codon is added to the 5 'end of the polynucleotide encoding the mature protein portion, and the resulting cDNA is converted to an appropriate promoter (eg, trp promoter, 1 ac The promoter is connected downstream of the LPL promoter, T7 promoter, etc.) and inserted into a vector that functions in E. coli (eg, pBR322, pUC18, pUC19, etc.) to produce an expression vector.
  • Escherichia coli eg, E. ColiDHl, E.
  • ColiJM109, ⁇ ⁇ Coli HB101, etc. transformed with the expression vector is cultured in an appropriate medium, and the protein or peptide of interest is extracted from the cells. You can get children.
  • a bacterial signnanolepeptide eg, a signal peptide of pe1B
  • it can produce fusion proteins with other polypeptides.
  • the DNA according to the present invention may be expressed in an appropriate vector (for example, a retrowinoresetter, papillomawinores vector, vaccinia virus vector, SV40-based vector, etc.).
  • An expression vector is prepared by inserting downstream of a promoter (eg, SV40 promoter, LTR promoter, meta-mouth thionein promoter, etc.). Then get Transform appropriate mammalian cells (eg, monkey COS-1 cells, COS-7 cells, Chinese hamster CHO cells, mouse L cells, etc.) with the obtained expression vector, and culture the transformants in an appropriate medium.
  • a promoter eg, monkey COS-1 cells, COS-7 cells, Chinese hamster CHO cells, mouse L cells, etc.
  • the protein of the present invention or its partial peptide is expressed.
  • the DNA of the present invention is inserted downstream of an appropriate promoter (polyhedrin promoter, P10 promoter, etc.) and inserted into a viral vector that functions in insect cells.
  • an appropriate promoter polyhedrin promoter, P10 promoter, etc.
  • a viral vector that functions in insect cells.
  • an expression vector for example, when the virus is Ac NPV, a cell line (S f cell) derived from the larva of night roth moth is used. When the virus is BmNP V, a cell line derived from silkworm (BmN cell) or the like is used. Examples of the Sf cell include Sf9 cell (ATCC CRL1711) and Sf21 cell (Vaughn cell). , JL, InVivo, 1977, Vol. 13, p213_217) As the insects, silkworm larvae, etc. are used. Technology (Bio / Technology), 1988, Vol. 6, p. 47-55.
  • the DNA of the present invention is connected downstream of an appropriate promoter (PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc.), and a vector (pSH19, p SH15) to produce an expression vector.
  • an appropriate promoter PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc.
  • a vector pSH19, p SH15
  • the yeast transformed with the expression solid eg, Saccharomyces 'Celebiche AH22, AH22R-, 20B-12, Schizosaccharomyces ⁇ bomb NC YC 1913, Pichia' Pastoris KM71, etc.
  • the desired protein or peptide can be obtained by culturing in an appropriate medium.
  • the protein or peptide obtained as described above must be isolated and purified by general biochemical methods.
  • a method for screening a substance that inhibits the binding of the protein or its partial peptide to S-100 ⁇ for example, the same or substantially the same as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 126 is used.
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • the screening method of the present invention can be performed, for example, by the following method. That is, a protein according to the present invention or a partial peptide thereof, or a fusion protein obtained by adding Tag (eg, His-Tag, GST, etc.) to the protein or an Atsushi well on which an antibody against the protein is immobilized, in the presence of the test substance Alternatively, after adding S-100 / 3 labeled with biotin or the like in the absence of the protein (however, when the above antibody is used, the protein of the present invention or its partial peptide or T After adding the fusion protein with ag, add S-100 labeled with biotin, etc.), and a commercially available kit for detecting free S-100 / 3 labeled substance such as biotin Alternatively, a method of detecting or quantifying the antibody using an antibody against S-100 ⁇ may be used.
  • Tag eg, His-Tag, GST, etc.
  • the substance that releases S-100] 3 can be selected as a substance that inhibits the binding of the protein of the present invention or a partial peptide thereof to S-100 ⁇ .
  • the method of adding the protein according to the present invention, a partial peptide thereof, or a fusion protein obtained by adding Tag thereto to an Atsushi well having S-100) 3 immobilized thereon is also carried out. be able to.
  • the immobilization of the protein according to the present invention, the partial peptide thereof, the fusion protein having Tag added thereto, or S-100] 3 can be carried out, for example, by immobilizing the protein labeled with biotin and an at-sealing gel. It can be performed by reacting with avidin.
  • the screening method of the present invention is carried out by a method using Biacore. 5008471
  • the screening method of the present invention can be carried out by a method using a chemically amplified luminescence assay. Specifically, biotinylated S-100 and a protein or a partial peptide thereof according to the present invention to which Tag (for example, His-Tag, GST, etc.) is added are prepared by a known method.
  • Tag for example, His-Tag, GST, etc.
  • an Axceptor bead obtained by complexing a Tag antibody and a protein or a partial peptide thereof according to the present invention with Tag in the presence or absence of a test substance, biotinylated S-100j8 and Streptavidin-donor beads are added, and the fluorescence intensity of each is detected or quantified, and the substance whose fluorescence intensity decreases is selected as a substance that inhibits the binding of the protein of the present invention or its partial peptide to S-1003. .
  • the screening method of the present invention can be carried out by a method using Lucifuslase Atsushi. Specifically, an expression vector having a DNA encoding the GAL4 DNA binding domain of yeast or an expression vector having a VP16 activation domain of a viral simplex virus, S-100] 3 and the protein or the protein of the present invention, Each partial peptide was introduced, and a fusion protein consisting of a GAL4 DNA binding domain and S-100] 3, a VP16 activation domain and a protein according to the present invention or a fusion protein consisting of the partial peptide were Create a vector to express.
  • Mammalian cells were screened using a reporter containing these expression vectors, a GAL4 binding region and a sequence encoding firefly luciferase.
  • the luminescence intensity in the presence or absence of the test substance is detected or quantified by various luciferase quantification reagents.
  • a substance that reduces the luminescence intensity as compared to that in the absence of the test substance is selected as a substance that inhibits the binding between the protein of the present invention or its partial peptide and S-100.
  • the screening method of the present invention can be performed by a method using immunoprecipitation.
  • a transformant transformed with DN ⁇ according to the present invention tagged with Tag is prepared by the above-described method, and the transformant (for example, U373MG cells) is cultured on a culture plate. And proliferate.
  • a test substance is added to the cell extract of the transformant, immunoprecipitation is performed with a Tag antibody, and the amount of co-precipitated S-100 is detected or quantified by a method such as Western blotting.
  • a substance that reduces the amount of co-precipitated S-100 compared to that in the absence of the test substance is selected as a substance that inhibits the binding of the protein of the present invention or its partial peptide to S-100. .
  • the screening method of the present invention is based on a method using a fluorescence resonance energy transfer (FRET), a method using a bioluminescence resonance energy transfer (BRET).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • BRET bioluminescence resonance energy transfer
  • the substance whose absorbance or fluorescence intensity decreases compared to the absence of the test substance is defined as the protein of the present invention or its partial peptide and S-100. Is selected as a substance that inhibits the binding of.
  • a vector that expresses a protein obtained by fusing S-100 / 3 to either end of the luciferase gene A transformed cell is produced by a vector expressing the protein poor by fusing the protein according to the above or a partial peptide thereof.
  • a test substance and then a substrate are added to the cell extract to form a color, and a substance whose fluorescence intensity decreases as compared to the absence of the test substance is determined by combining the protein of the present invention or its partial peptide with S-100. Select as a substance that inhibits binding. .
  • the screening method of the present invention can also be carried out by a method using a protein reconstitution assay (PCA); Takeshibashi et al., Experimental Medicine Separate Volume, Protein Experiment Handbook, Yodosha (2003)). it can.
  • PCA protein reconstitution assay
  • the method for screening a substance that changes the amount of factor production induced by the binding of the protein or its partial peptide to S-100 / 3 according to the present invention includes, for example, SEQ ID NO: 1 26.
  • the screening method of the present invention can be performed, for example, by the following method. That is, a transformant transformed with the DNA according to the present invention is prepared by the above method.
  • the transformant eg, U373MG cells
  • the test substance and S-100 ⁇ (for example, carboxymethylated S-100 ⁇ ) are added and cultured.
  • the culture supernatant after 24 hours is collected, and for example, MCP-1 produced as a result of S-1000 stimulation is quantified using a commercially available MCP-1 measurement kit or the like.
  • the substance that decreases the amount of MCP-1 is selected as a substance that changes the amount of factor production induced by the binding of the protein of the present invention or its partial peptide to S-100 / 3. ⁇
  • the substance obtained by the screening method of the present invention is a test substance, for example, A substance or a salt thereof selected from peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc .; A substance that inhibits the binding of the partial peptide to S-103 and / or a factor induced by the binding of S-white matter or its partial peptide according to the present invention to S-103] 3 It is a substance that changes the amount of production. '
  • the substance obtained by the screening method of the present invention is converted to a salt by a known method.
  • a pharmaceutically acceptable salt is preferable.
  • the salt examples include an alkali metal salt, an alkaline earth metal salt, an ammonium salt, an amine salt, and an acid addition salt.
  • the salt is preferably water-soluble.
  • Suitable salts include salts of alkali metals (such as potassium and sodium), salts of alkaline earth metals (such as calcium and magnesium), ammonium salts, and pharmaceutically acceptable organic amines (tetramethylammonium, triethylamine, Methylamine, dimethylamine, cyclopentylamine, benzyl ⁇ / amine, phenetamine, piperidine, monoethanolamine, diethanolamine, tris (hydroxymethyl) aminomethane, lysine, arginine, and ⁇ -methyl-D-glucamine.
  • alkali metals such as potassium and sodium
  • salts of alkaline earth metals such as calcium and magnesium
  • ammonium salts such as sodium salts of alkaline earth metals (such as calcium and magnesium)
  • pharmaceutically acceptable organic amines tetramethylammonium, triethylamine, Methylamine, dimethylamine, cyclopentylamine,
  • the acid addition salt is preferably water-soluble.
  • Suitable acid addition salts include, for example, inorganic salts such as hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, sulfate, phosphate, nitrate, or acetate, lactate, tartrate, Organic salts such as benzoate, citrate, methanesulfonate, ethanesulfonate, benzenesulfonate, toluenesulfonate, isethionate, glucuronate, and dalconate.
  • inorganic salts such as hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, sulfate, phosphate, nitrate, or acetate, lactate, tartrate
  • Organic salts such as benzoate, citrate, methanesulfonate, ethanesulfonate, benzenesulfonate, toluenesulfonate, isethionate,
  • the substance obtained by the screening method of the present invention that is, the substance that inhibits the binding of the protein of the present invention to S-103 and the protein of the present invention or the protein of the present invention that binds to S-; Substances that alter the friction of induced factors 5 008471
  • Examples include the protein of the present invention or a partial peptide thereof, and an antibody that inhibits the binding of the protein of the present invention to S-100. .
  • amino acid sequence preferably selected from SEQ ID NOs: 1 to 36, 84 to 102, and 126 as a substance that inhibits the binding of the protein of the present invention or a partial peptide thereof to S-100 J3
  • 'A a substance that changes the amount of factor production induced by the binding of the protein or its partial peptide of the present invention to S-100J3, preferably SEQ ID NOS: 1 to 36, 84 to 1
  • a protein having an amino acid sequence identical or substantially identical to an amino acid sequence selected from 02 and 126, or a partial peptide thereof, and more preferably an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 126 Or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as
  • the antibody that inhibits the binding of the protein according to the present invention to S-100 is an antibody against the protein according to the present invention or a partial peptide thereof or S-100] 3, and the binding between the two. Those having an inhibitory activity are mentioned.
  • Such an antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibody of the present invention or a partial peptide thereof may be used as an antigen in a known manner (Takeshida et al., Experimental Medicine Supplement, Protein Experiment Handbook, Sheep Tsuchiya (2003)).
  • An antibody that inhibits the binding of the protein of the present invention to S-100 is preferably an amino acid sequence selected from SEQ ID NOS: 1 to 36, 84 to 102, and 126.
  • Examples of the substance that suppresses the expression of the S—100] 3 binding protein include a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide encoding a protein having a binding activity to S—100 jS or a part thereof. Included polynucleotides include, for example, antisense DNA, antisense RNA, SiRNA and the like.
  • the polynucleotide comprising the nucleotide sequence complementary to the polynucleotide encoding the protein according to the present invention or a part thereof may have the DNA according to the present invention inserted into the antisense region of the vector as described above. (Sasaki et al., Separate Volume on Experimental Medicine, Revised Procedures for Biological Experiments, Yodosha (2003)).
  • the amino acid sequence preferably selected from SEQ ID NOs: 1 to 36, 84 to 102, and 126 as a substance that suppresses the expression of the protein according to the present invention, which is an S—100] 3 binding protein
  • Substance Obtained by the Screening Method of the Present Invention, Partial Peptide of the Protein of the Present Invention, Antibody that Inhibits the Binding of the Protein of the Present Invention to S-100 / 3, and Antisense of the DNA of the Present Invention DNA, antisense RNA or Si RNA is useful for the prevention and / or treatment of diseases involving S-100] 3.
  • neurodegenerative diseases include nerve cells (central nerves (eg, cranial nerves, spinal nerves, etc.)) and Z or peripheral nerves (eg, autonomic nervous system (eg, sympathetic nerves, parasympathetic nerves, etc.), motor nerves, etc. System, sensory nervous system)), including all diseases accompanied by degeneration, and is not limited by its etiology. 471
  • Parkinson's disease Parkinson's syndrome, striatum substantia nigra, Huntington's disease, chorea-ataxia, progressive supranuclear palsy, diffuse Lewy body disease, basal ganglia degeneration, Alzheimer's Disease, dementia (dementia) (for example, cerebral vascular dementia (cerebrovascular dementia), Alzheimer's dementia (Alzheimer's dementia), senile dementia (senile dementia), Pick's disease, Frontotemporal dementia (frontotemporal dementia), familial dementia (familial dementia), etc., spinocerebellar degeneration (eg, Oliveb cerebellar atrophy, primary cerebellar cortical atrophy) Syndrome, familial spinocerebellar ataxia (eg, Matsucarde-Joseph's disease, etc.), dentate nucleus pallidum pallidus, atrophic atrophy, familial paraplegia, Friedreich's disease, etc.) For example, amyotrophic lateral
  • neurodegenerative diseases are, for example, Alzheimer's disease, Down's syndrome, multiple sclerosis, neurological dysfunction associated with stroke or cerebral infarction, Parkinson's disease, cerebrospinal disease associated with infection, epilepsy or amyotrophic lateral sclerosis It is.
  • the protein or its partial peptide according to this effort can be used for diagnosis of the above-mentioned diseases.
  • a substance obtained by the screening method of the present invention a partial peptide of the protein of the present invention, an antibody that inhibits the binding of the protein of the present invention to S-100, or an antisense DNA of the DNA of the present invention
  • the antisense RNA or siRNA is usually administered systemically or locally, generally orally or parenterally. Preferred are oral administration, intravenous administration and intraventricular administration. ,
  • the dosage varies depending on the age, body weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, etc., but is generally within the range of 100 g to 100 mg per adult per dose. It may be administered once to several times a day or parenterally once per adult per day, in the range of 10 / ig to 100 mg per day. Of course, as described above, since the dose varies depending on various conditions, a dose smaller than the above dose may be sufficient, or may be required beyond the range. .
  • a substance obtained by the screening method of the present invention a partial peptide of the protein of the present invention, an antibody that inhibits the binding of the protein of the present invention to S-100, or an antisense DNA of the DNA of the present invention;
  • antisense RNA or siRNA solid compositions, liquid compositions and other fibrous compounds for oral administration, injections for parenteral administration, external preparations, suppositories Used as etc.
  • Solid compositions for oral administration include tablets, pills, capsules, powders, granules and the like.
  • Capsules include soft capsules and hard capsules.
  • the one or more active substances may contain at least one inert diluent (e.g., ratatose, mannitol, dulose, hydroxypropylcellulose, microcrystalline cellulose, starch).
  • at least one inert diluent e.g., ratatose, mannitol, dulose, hydroxypropylcellulose, microcrystalline cellulose, starch.
  • the composition pharmacologically excipients other than an inert diluent, for example, a lubricant (eg, magnesium stearate), a disintegrant (eg, calcium cellulose dalycholate), a stabilizer (eg, human serum albumin) , Ratatos, etc.) and solubilizing agents (arginine, aspartic acid, etc.).
  • a lubricant eg, magnesium stearate
  • a disintegrant eg, calcium cellulose dalycholate
  • a stabilizer eg, human serum albumin
  • solubilizing agents arginine, aspartic acid, etc.
  • Tablets or pills may be coated with a gastric or enteric film such as sucrose, gelatin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, etc., if necessary, or with two or more layers. You may. Also included are capsules of absorbable materials such as gelatin.
  • Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs and the like, and commonly used inert diluents (eg, purified water, ethanol). Etc.) may be included. Such compositions may contain, in addition to the inert diluents, wetting agents, suspending agents such as suspending agents, sweetening agents, flavoring agents, fragrances, and preservatives.
  • Injections for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions.
  • aqueous or non-aqueous solutions and suspensions one or more active substances are mixed with at least one inert diluent.
  • the aqueous diluent include distilled water for injection and physiological saline.
  • the non-aqueous diluent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, polysorbate 80 '(registered trademark), and the like.
  • compositions may also contain preservatives, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents, stabilizing agents (eg, human serum albumin, ratatose, etc.), solubilizing agents (eg, arginine, aspartic acid, etc.).
  • preservatives e.g, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents, stabilizing agents (eg, human serum albumin, ratatose, etc.), solubilizing agents (eg, arginine, aspartic acid, etc.).
  • stabilizing agents eg, human serum albumin, ratatose, etc.
  • solubilizing agents eg, arginine, aspartic acid, etc.
  • External preparations for parenteral administration include, for example, ointments, gels, creams, compresses, patches, liniments, sprays, inhalants, sprays, aerosols, eye drops, and Nasal drops and the like can be mentioned. These can be one or more 5 008471
  • compositions for oral administration include sprays which contain one or more active substances and are formulated in a manner known per se.
  • the composition contains, in addition to the inert diluent, a stabilizer such as sodium bisulfite to provide isotonicity, an isotonic agent such as sodium chloride, sodium citrate or citrate. It may be.
  • a stabilizer such as sodium bisulfite to provide isotonicity
  • an isotonic agent such as sodium chloride, sodium citrate or citrate. It may be.
  • the method for producing sprays is described in detail, for example, in US Pat. Nos. 2,868,691 and 3,095,355. '
  • compositions for parenteral administration include suppositories for rectal administration and pessaries for vaginal administration, which contain one or more active substances and are prescribed in a conventional manner. .
  • antisense DNA, antisense RNA or siRNA of the DNA according to the present invention is used for prevention or treatment of a disease associated with S—100.
  • NA, antisense RNA or SiRNA can be administered to humans or mammals according to a standard method after inserting alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector or an adenovirus vector. They can be used as they are, or formulated as physiologically acceptable carriers such as auxiliary ribosomes (ribosomes, HVJ ribosomes, etc.) for promoting their introduction into cells.
  • the DNA according to the present invention or a polynucleotide comprising a sequence complementary thereto or a part thereof, for example, is used as a probe to detect the DNA or mRNA according to the present invention. Therefore, the above-mentioned S-100 can be used as a reagent for examining related diseases. When a genetic factor is suspected as a cause of a disease associated with S-100; 3, genetic diagnosis can be performed using these factors.
  • the antibody against the protein or the partial peptide thereof according to the present invention relates to the present invention. Since S100 can detect such a protein, the above-mentioned S-100] 3 can be used as a reagent for testing a related disease.
  • the screening method of the present invention can be carried out in a kit comprising the necessary reagents.
  • a kit comprising the necessary reagents.
  • the protein or preparation of a partial peptide thereof according to the present invention may be used as immobilized on the test vessel, the labeled ligand, [3 H], [1 2 5 1], [1 4 C ], [3 5 S] labeled present invention S-l 0 0 like;. 8 a suitable solvent or buffer may ,, ligand standard solution be used after dissolved in 0 1% ⁇ shea serum albumin Alternatively, a solution obtained by dissolving S-1000j3 in PBS containing may be used. As a measurement method, a buffer for measurement is added to a sample of the protein or partial peptide according to the present invention, and a test substance and a labeled ligand are added and reacted. After removing the reaction solution and washing with a washing buffer, the radioactivity is measured using a liquid scintillation counter.
  • the screening kit of the present invention contains the protein of the present invention or a partial peptide thereof, but may also contain the protein of the present invention or an antibody against the partial peptide thereof.
  • the screening kit of the present invention includes a cell capable of producing the protein of the present invention or a partial peptide thereof.
  • those containing a transformant for example, an animal cell or the like transformed with the DNA of the present invention are also included.
  • the screening method of the present invention comprises a substance which can be used for prevention and / or treatment of a disease associated with S-100] 3, a partial peptide of the protein of the present invention, an antibody against the same, or Antisense DNA of DNA according to the invention, 5008471
  • Fig. 1 shows the mRNA expression level of S-100 binding protein FLJ12587 in healthy subjects and Parkinson's disease tissues (N: healthy subjects, PARK: Parkinson's disease)
  • Figure 2 shows the mRNA expression level of the S-100] 3-binding protein DKFZ p76 1 HO421 in healthy subjects, amyotrophic lateral sclerosis and Alzheimer's disease tissue (N: healthy subjects, AL S: amyotrophic lateral sclerosis, A 1 z: Alzheimer's disease).
  • FIG. 3 shows the mRNA expression level of the S-100 / 3 binding protein POGZ1 in healthy human and Alzheimer's disease tissues (N: healthy human, Alz: Alzheimer's disease).
  • FIG. 4 shows the expression level of: mRNA of S-100 / 3-binding protein MGC15730 in a healthy human Alzheimer's disease tissue (N: healthy human, A1z: Alheimer's disease).
  • Fig. 5 shows the mRNA expression level of the S-100] 3-binding protein FKRP in healthy subjects, amyotrophic lateral sclerosis and Alzheimer's disease tissues (N .: healthy subjects,. ALS: amyotrophic lateral cord). Sclerosis, A1Z : Alzheimer's disease).
  • FIG. 6 shows the binding between the BAP28.2 protein and the S ⁇ 1003 protein (Mock: negative control).
  • Example 1 Identification of S-100 binding protein by West-Western method. 5008471
  • NCB IID AC 01 1291, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 40
  • RP 1 -287021 NCB IID: AL 136319, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 41
  • RP 3-509 I 19 NCB IID : AL 12 JP2005 / 008471
  • NCB IID SEQ ID NO: 5
  • CTC-286 C20 CTC-286 C20
  • RP11-444D3 NCB IID: AL087322, SEQ ID NO: 7, Sequence
  • ZNF 140-1 ikerotein NCB IID: AF 1 556 56, column No. 8, SEQ ID No. 45
  • RP 11 1-4—45 1 G1 NCB IID: AC 01 3727, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 46
  • RP 4-550H1 NCB IID: AL 035420, SEQ ID No. 10, SEQ ID No.
  • NCB IID AL 83 1955, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 64), Z incfingerrotei n. 3 1 15 BP (NCB I ID: AJ 1 32592, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 65), FLJ 43968 ( NCB I ID: AK125956, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 66), CG I-043 (NCB IID: AF 15 1801, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 67), DKFZ p 761 HO 421 (NCB IID: AL 831813, Sequence No.
  • NCB IID: NM—014412, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 72) (hereinafter referred to as force-binding protein), MGC 15730 (NCCB IID: NM) — 032880, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 73), MG C40157 (NCB IID: BC 027986, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 103), FL J 351 13 (NCB I ID: AK092432, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 104) ), SNO oncogene (NCB IID: X15219, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 105), FLJ4223 (NC BIID: AK124207, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 106), FLJ35109 (NCB IID: AK092428, SEQ ID NO: 88, arrangement number
  • NCB IID CQ 737853, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 1 1 1), -S terilealha mo tifd oma in 6 (NCBI ID: BC01 2981, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 1 12) , CG I—024 (NCB IID: AF 1 32958, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 113), TR IB 2 homo 1 og 2 (NC BIID: NM—0-21643, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 1 14 ) N Fu ku tinrelated protein (NCB IID: NM-024301, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 115) (hereinafter referred to as FKRP;), ZNF 37A (NCB ID: AJ 492195, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 1) 16), FL J 4,5802
  • BAP 28. 1 and referred) and BAP 28 (NCB IID: XM one 3758 53 1.2, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: i 27) (hereinafter, referred to as BAP 28. 2).. These clones were identified as S-100] 3-binding proteins.
  • the medium was replaced with Dulbecco's modified medium containing 1.0% fetal bovine serum, and the cells were cultured at 37 ° C for 24 hours. Then, the medium was replaced with a serum-free Dulbecco's modified medium, cultured for 24 hours, and then replaced with a serum-free Dulbecco's modified medium containing 10 / zmo 1ZL carboxymethylated 100 ⁇ . The culture supernatant of was recovered, and MCP-1 was quantified by ELISA. The results of measuring the amount of MCP-1 produced by stimulating carboxymethylated S-1H0] 3 with a negative control or S-100 j3 signaling protein SinRNA introduced are shown. Shown in 1.
  • the prepared vector was introduced into cells by lipofection.
  • the medium was replaced with Dulbecco's modified medium containing 10% fetal calf serum, and cultured at 37 ° C for 24 hours.
  • the medium was replaced with a serum-free Dulbecco's modified medium, and after culturing for 48 hours, the medium was replaced with a serum-free Dulbecco's modified medium containing 10 / zmo 1 ZL carboxymethylated S-100] 3.
  • the culture supernatant after 24 hours was collected, and M-CP-1, IL-16, and IL-8 in the culture supernatant were quantified by ELISA.
  • Tables 2-5 FL J 12587 and MG C 15730 suppressed the production of MCP-1.
  • BAP28.2 also enhanced the production of MCP-1, IL-6, and IL-8.
  • CDNA was prepared from 1 g of human total RNA according to a known method.
  • the total RNA used was human substantia nigra (Ambion), human substantia nigra (Ambion), human normal human cerebral cortex (Ambion), human amyotrophic lateral sclerosis Cerebral cortex (Ambion) and human Alzheimer's disease cerebral cortex (Biochain).
  • the catenin-binding protein, CG 1-043, POGZl, CUB / Su shi 1, DKFZ p761H0421 s FL J12587, and MGC 15730 are subjected to PCR of the cDNA region and electrophoresis on agarose gel. Performed semi-quantitatively. The primers used for PCR are shown below.
  • U373MG cells cultured in Dulbecco's modified medium containing 10% fetal bovine serum were seeded at 4 ⁇ 10 4 cells / well in a 24-well plate, and cultured at 37 ° C. once.
  • SiRNA was introduced into cells according to a known method. The sequence of the sense strand of the siRNA used is shown below.
  • the medium was replaced with a Dulbecco's modified medium containing 10% fetal bovine serum, and the cells were cultured at 37 ° C for 24 hours. Then, serum-free Dulbecco's modification: After replacing with if ground and culturing for 24 hours, 1 ⁇ / zmo 1ZL of carboxymethylated S- 100 j8 or 0.3 ng / niL recombinant IL-1 1 ] 3 was added to a serum-free Dulbecco's modified medium. After 24 hours, the culture supernatant was collected, and MCP-1 in the culture supernatant was quantified by ELISA.
  • Table 6 shows the measurement results.
  • BCP 28.2 and FKRP suppressed the production of MCP-1.
  • Table 7 shows the results of measuring the amount of MCP-1 produced by puncturing with recombinant IL-1 [3] 3 in a negative control or in a state in which S-100 ⁇ binding protein S RNA was introduced.
  • BAP 28..2 did not inhibit MCP-1 production upon IL-1; 8 stimulation.
  • CDNA was prepared from 1 ⁇ g of human total RNA according to a known method. 'The RNAs used were human healthy human cerebral cortex (Ambion), human amyotrophic lateral sclerosis cerebral cortex (Ambion), and human Alzheimer's disease cerebral cortex (Biochhanin). After cDNA preparation, PCR was performed, and semiquantitative determination was performed by electrophoresis on an agarose gel. The following primers were used for FKRP PCR.
  • the medium was replaced with Dulbecco's modified medium containing 10% fetal bovine serum and hypoxanthine thymidine, and cultured at 37 ° C for 72 hours.
  • the cells were collected with a zel scraper. The collected cells were concentrated by centrifugation, disrupted by sonication, suspended in lO / igZmL of Tris buffer containing S-100i3 and lmM calcium, and incubated at 4 ° C for 2 hours. . Next, it was added to protein G agarose and incubated at 4 ° C for 2 hours.
  • the protein according to the present invention has a binding activity to S-100 / 3, and is involved in S-100 signal transduction. Useful for screening of substances that inhibit 100/3 signal transmission. 05 008471
  • a substance obtained by the screening method of the present invention a partial peptide of the protein of the present invention, an antibody that inhibits the binding of the protein of the present invention to S-1OOiS, and a protein encoding the protein of the present invention.
  • the polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide or a part thereof is useful for the prevention and / or treatment of a disease associated with S-100J3.
  • the antibody against the protein or the partial peptide thereof according to the present invention, or the DNA or the antisense DNA thereof according to the present invention is useful for diagnosis of the above-mentioned diseases.

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Abstract

S-100β結合蛋白質とS-100βを被験物質の非存在下と存在下で接触させ、それぞれの場合のS-100β結合蛋白質とS-100βの結合量を測定し、比較するS-100β結合蛋白質とS-100βとの結合を阻害する物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法により得られる物質、本発明に係る蛋白質の部分ペプチド、本発明に係る蛋白質とS-100βの結合を阻害する抗体、および本発明に係る蛋白質をコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドは、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患などの治療、及び前記疾患の診断に有用である。

Description

神経変性疾患治療薬のスクリ一 ング方法 技術分野
本発明は S— 1 0 0 J3結合蛋白質と S— 1 0 0 /3との結合を阻害する物質 のスクリーニング方法に関する。 さらに詳しく言えば、 S— 1 0 0 ]3結合蛋 白質を用いた神経変性疾患の予防明および Zまたは治療薬のスクリ一二ング方 法、 そのスクリーニング方法で得られ田る物質、 S— 1 0 0 /3結合蛋白質、 そ の抗体、 S— 1 0 0 3結合蛋白質をコード書するポリヌクレオチドもしくはそ のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、 前記物質を含有する医薬 組成物などに関する。 背景技術
中枢神経系の実質を構成する細胞には神経細胞とグリア細胞があり、 細胞 数はグリァ細胞が神経細胞よりはるかに多い。 グリァ細胞は神経細胞の働き を支持する役割を担っている。 グリア細胞の一種であるァストロサイトは、 神経細胞の支持細胞として細胞外のィオンおょぴ神経伝達物質の恒常性維持 (Pharmacology and function, pp. 193-228, Academic Press, Inc., (1993)) や神経栄養因子の供給（Hmrmacology and function, pp. 267-308, Academic Press, Inc., (1993)) などの機能を有していることから、 脳機能を制御する重 要な役割を演じていると考えられる。
従来、 神経変性疾患 （アルツハイマー病、 筋萎縮性側索硬化症など） の成 因は主に神経細胞の異常にあると考えられてきた。 し力 し、 近年神経細胞を 取り囲むグリア細胞、 特にァストロサイトの機能的異常にあるとの考えが有 力になってきた。
S— 1 0 0 J3 (配列番号 3 7で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質） は ァストロサイト特異的タンパク質であり、 カルシウム結合部位を有し細胞内 カルシウム濃度の調節、 種々の細胞骨格蛋白と結合し細胞の形態変化や神経 伝達物質の遊離等に関与している （Trends Bioc em Sci, 13, 437-443, (1988)) 。 S— 1 0 0 3はァストロサイトの活性化により産生され細胞外に 放出される。 放出された S— 1 0 0 3は、 神経細胞に対し栄養因子的な作用 および傷害因子的な作用 (Progress in Neurobiology, 46, 71-82, (1995)) を 示し、 またァストロサイトに対しては増殖促進作用や誘導型一酸化窒素合成 酵素の発現作用を有することが報告されている （J. Biological Chemistry, 271. 2543-2547, (1996)) 。
また、 S— 1 0 0 ]3は脳傷害時、 活性化されたァストロサイトにおいて過 剰発現することが知られている。 アルツハイマー患者の脳内で S— 1 0 0 β 量が増加しており （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 7611-7615, (1989)) 、 そ の増加量はアルツハイマー患者の脳における老人斑密度と相関があることが 報告されている （J. Neurosci. Res., ， 398-404, (1994)) 。 さらにアルッハ イマ一患者の脳における老人斑近傍には S— 1 0 0 i3の過剰発現を伴った活 性化したァストロサイトが存在し、 その発現強度は神経の異常突起伸展との 間に相関が見られることが報告されている （J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55, 273-279, (1996))。その他にも、脳卒中 (Stroke, 30, 1190-1195， (1999))、 頭部外傷 (Neurosurgery, 45, 477-483, (1999))、多発性硬化症（Acta Neurol Scand, 96, 142-144, (1997)) 、 ダウン症 （Pro Natl. Acad. Sci. USA, 86， 7611-7615, (1989)) などの患者の血清中もしくは脳髄液中で S— 1 0 0 ]3量 の増加がみられる。
このように S— 1 0 0 J3と神経変性疾患との関連は強く示唆されている。 また、 S— 1 0 結合蛋白質として、 後期糖化反応生成物受容体 （R A G E)を初めとする種々の蛋白質が知られているが（Mol Cell Biol, 23, 4870-81, (2003)) 、 その特異的な結合蛋白質おょぴ S—l 0 0 3による細胞内情報伝 達系に関与する分子等、 その詳細な作用メカニズムは未だ明らかではない。 1
発明の開示
先に述べたように、 S— 1 0 0 結合蛋白質として種々の蛋白質が知られ ている。 し力 し、 S— 1 0 0 ]3に特異的な情報伝達分子である S— 1 0 0 ]3 結合蛋白質を利用した神経変性疾患の予防および/または治療薬のスクリ一 ユング方法、 そのスクリ一二ング方法で得られる物質、 S— 1 0 0 J3結合蛋 白質、 その抗体、 および S— 1 0 0 結合蛋白質をコードするポリヌクレオ チドまたはそのポリヌクレオチドに相捕的なポリヌクレオチドを含有する医 薬組成物などについては現在知られておらず、 そのスクリーニング方法、 そ の医薬組成物などの提供が望まれていた。
本発明者らは、 上記課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、 ウェスト 一ウェスタン法により S— 1 0 0 /3結合蛋白質を同定し、 さらに、 これらの 蛋白質が S— 1 0 0 J3の情報伝達に関与することを見出し、 本発明を完成し た。
すなわち、 本発明は、
1 . S— 1 0 0 結合蛋白質と S— 1 0 0 βとの結合を阻害する物質のスク リーユング方法、
2 . S - 1 0 0 /3結合蛋白質と S— 1 0 0 との結合量を被験物質非存在下 と存在下とで比較する前記 1記載のスクリーニング方法、
3 . S— 1 0 0 /3結合蛋白質と S— 1 0 0 を被験物質の非存在下と存在下 で接触させ、 それぞれの場合の S— 1 0 0 /3結合蛋白質と S— 1 0 0 )3の結 合量を測定し、 比較する前記 1記載のスクリーニング方法、
4 . S— 1 0 0 結合蛋白質が、 配列番号 1乃至 3 6、 8 4乃至 1 0 2およ び 1 2 6から選択される 1つのアミノ酸配列もしくはその配列と実質的に同 —のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドである前記 1記載 のスクリーユング方法、
5 . S— 1 0 0 ]3結合蛋白質が、 配列番号 1 2 6で示されるアミノ酸配列も 1
しくはその配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部 分ぺプチドである前記 1または 4記載のスクリ一-ング方法、
6. EL I SA、 免疫沈降アツセィ、 蛍光共鳴エネルギー転移、 バイオルミ ネッセンス共鳴エネルギー転移、 ルシフェラーゼアツセィ、 レポーターアツ セィまたはタンパク再構成アツセィを用いる前記 1記載のスクリーニング方 法、
7. S— 100 結合蛋白質と S— 100 を被験物質の非存在下と存在下 で接触させ、 それぞれの場合の S— 1003結合蛋白質と S— 100 ]3の結 合量を EL I SA、 免疫沈降アツセィ、 蛍光共鳴エネルギー転移、 バイオル ミネッセンス共鳴エネルギー転移、 ルシフェラーゼアツセィ、 レポーターァ ッセィまたはタンパク再構成ァッセィで測定し比較する前記 3記載のスクリ 一ユング方法、
8. S- 100 結合蛋白質と S— 100 ]3が結合することで誘発される因 子の産生量を変化させる物質のスクリーニング方法、
9. S— 100 結合蛋白質と S— 100 J3が結合することで誘発される因 子の産生量を被験物質非存在下と存在下とで比較する前記 8記載のスクリ一 ユング方法、
10. S— 100 結合蛋白質と S— 100 を被験物質の非存在下と存在 下で接触させ、 それぞれの場合において誘発される因子の産生量を測定し比 較する前記 9記載のスクリーニング方法、
1 1. S— 100 結合蛋白質が、 配列番号 1乃至 36、 84乃至 102お よび 126から 1つ選択されるァミノ酸配列もしくはその配列と実質的に同 一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドである前記 8記載 のスクリーニング方法、
12. S— 100 /3結合蛋白質が、 配列番号 126で示されるアミノ酸配列 もしくはその配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその 部分べプチドである前記 8または 1 1記載のスクリ一 ング方法、 1 3. EL I S Aを用いる前記 8記載のスクリーニング方法、
14. 配列番号 1 26で示されるアミノ酸配列もしくはその配列と実質的に 同一のァミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分べプチドを産生する能力 を持つ細胞に S— 1 00 βを接触させ、 被験物質の非存在下と存在下におい て誘発される JV1CP— 1の産生量を EL I SAで測定し、 比較する前記 1 0 記載のスクリ一二ング方法、
1 5. S- 1 00 3結合蛋白質と S— 1 00 j8との結合を阻害する物質、
1 6. S- 1 00 3結合蛋白質と S— 1 00 が結合することで誘発される 因子の産生量を変化させる物質、
1 7. S— 1 00 j3結合蛋白質と S— 1 00 J3が結合することで誘発される 因子が MCP— 1、 I L— 6、 I L一 8、 A β、 または C a 2+である前記 1 6記載の物質、
1 8. 配列番号 1乃至 3 6、 84乃至 1 02および 1 26から選択されるァ ミノ酸配列もしくはその配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有する蛋白質 またはその部分ペプチドである前記 1 5または 1 6記載の物質、
1 9. 配列番号 1乃至 3 6、 84乃至 1 02、 および 1 2 6から選択される アミノ酸配列もしくはその配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白 質またはその部分べプチドの抗体である前記 1 5または 1 6記載の物質、
20. S- 1 00 ]3結合蛋白質の発現を抑制する物質、
2 1. 配列番号 1乃至 3 6、 84乃至 1 02、 および 1 26から選択される ァミノ酸配列もしくはその配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有する蛋白 質またはその部分ぺプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配 列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドである前記 20記載の物 質、
22. ポリヌクレオチドが S i RNAまたはアンチセンス DNAである前記 2 1記載の物質、 ' 23. 前記 1 5、 1 6および/または 20記載の物質を有効成分として含有 2005/008471
する医薬組成物、
2 4 . 神経変性疾患の予防および/または治療剤である前記 2 3記載の医薬 組成物、 '
2 5 . 神経変性疾患が、 パーキンソン病、 パーキンソン症候群、 線条体黒質 変性症、 ハンチントン病、 舞踏病—無定位運動症、 進行性核上麻痺、 びまん 性レビー小体病、大脳皮質基底核変性症、ァルツハイマー病、認知症 (痴呆症）、 脊髄小脳変性症、 運動神経症、 脱髄性疾患、 脳血管障害 ·脳腫瘍 ·血液量減 少性ショック ·外傷性ショック ·頭部損傷および Zまたは脳脊髄外傷に伴う 神経機能障害、感染症に伴う脳脊髄疾患、毒物 '放射線による神経機能障害、 精神疾患、 てんかん、 メージ症候群、 ジストニア、 ダウン症、 睡眠障害であ る前記 2 4記載の医薬組成物、
2 6 . S— 1 0 0 ]3結合蛋白質と S— 1 0 0 j3との結合を阻害する物質のス クリーエング用キット、
2 7 . 前記 1または 8記載のスクリーユング方法を含むことを特徴とする S - 1 0 0 jS結合蛋白質と S— 1 0 0 ;3との結合を阻害する物質の製造方法、 2 8 . 前記 2 7記載の製造方法で得られた物質を用いることを特徴とする S - 1 0 0 /3結合蛋白質と S— 1 0 0 /3との結合を阻害する方法、
2 9 . 哺乳動物に対して、 S— 1 0 0 ]3結合蛋白質と S— 1 0 0 ]3との結合 を阻害する物質の有効量投与することを特徴とする神経変性疾患の予防およ び Zまたは治療方法、 および
3 0 . 神経変性疾患の予防および Zまたは治療剤を製造するための S— 1 0 0 ]3結合蛋白質と S— 1 0 0 ^との結合を阻害する物質の使用に関する。 本発明に係る S— 1 0 0 j8と実質的に同一のアミノ酸配列としては、 配列 番号 3 7で示されるアミノ酸配列と約 8 5 %以上、 好ましくは約 9 0 %以上、 より好ましくは約 9 5 %以上、 最も好ましくは約 9 8 %以上の相同性を有す るアミノ酸配列などが挙げられる。 配列番号 3 7に記載のアミノ酸配列と実 質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号 3 7 5 008471
に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号 7 に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質 などが好ましい。 実質的に同質の活性としては、 例えば、 シグナル情報伝達 活性、 受容体結合活性、 ェピトープ活性などが挙げられる。 実質的に同質と は、 それらの性質が性質的に （例えば、 生理学的に、 または薬理学的に） 同 質であることを示す。 従って、 シグナル情報伝達活性または受容体結合活性 が同等 （例えば、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 1〜1 0倍、 よ り好ましくは 0 . 5 ~ 2倍）であることが好ましいが、 これらの活性の程度、 蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
また、 本発明の蛋白質としては、 例えば、 配列番号 3 7に記載のアミノ酸 配列からなるもの以外に、 その一部のアミノ酸 （好ましくは 1〜1 0個、 よ り好ましくは 1〜5個） が欠失したもの、 任意のアミノ酸と置換したもの、 そのアミノ酸配列の数力所 （好ましくは 1〜1 0力所、 より好ましくは 1〜 5力所） に任意のアミノ酸が付加または揷入されたもの、 およびそれらを組 み合わせたアミノ酸配列を含有するものも含まれる。 ここで、 アミノ酸の欠 如、 置換、 付加、 または揷入の位置は特に限定されない。
本発明に係る S— 1 0 0 の部分ぺプチドとしては、 上記の本発明に係る S— 1 0 0 の部分ぺプチドであって、 上記の本宪明に係る S— 1 0 0 j3と 実質的に同質の活性を有するものであればいずれのペプチドでもよい。 例え ば、 S— 1 0 0 ;3のァミノ酸配列のうち少なくとも 1 0個以上、 好ましくは 3 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上の連続したアミノ酸配列を有する ペプチドなどが含まれる。 また、 本発明に係る部分ペプチドとしては、 その アミノ酸配列中の一部のアミノ酸 （好ましくは 1〜1 0個、 より好ましくは 1〜5個） が欠失したもの、 任意のアミノ酸と置換したもの、 そのアミノ酸 配列の数力所 （好ましくは 1〜1 0力所、 より好ましくは 1〜5力所） に任 意のアミノ酸が付加または挿入されたもの、 およびそれらを組み合わせたァ ミノ酸配列を含有するものも含まれる。 ここで、 アミノ酸の欠如、 置換、 付 力 [1、 または揷入の位置は特に限定されない。
S - 1 0 0 ]3結合蛋白質とは、 該蛋白質が S— 1 0 0 との結合活性を有 している限り、 如何なるアミノ酸配列であってもよい。
S— 1 Ο Ο 結合蛋白質としては、 好ましくは配列番号 1乃至 3 6、 8 4 乃至 1 0 2、 および 1 2 6から選択されるアミノ酸配列と周一もしくはその 配列と実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質であり、 より好ましく は配列番号 1 2 6で示されるァミノ酸配列と同一もしくはその配列と実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質である。
配列番号 1乃至 3 6、 8 4乃至 1 0 2、 および 1 2 6から選択されるアミ ノ酸配列と同一もしくはその配列と実質的に同一のアミノ酸配列は、 そのァ ミノ酸配 ^を含有する蛋白質 （以下、 本発明に係る蛋白質と呼ぶ。 ） I s 一 1 0 0 との結合活性を有している限り、 如何なるァミノ酸配列であって あよい。
また、 本幾明に係る蛋白質とは、 例えば、 配列番号 1乃至 3 6、 8 4乃至 1 0 2、 および 1 2 6記載のアミノ酸配列からなるもの以外に、 その一部の アミノ酸 （好ましくは 1〜 1 0個、 より好ましくは 1〜5個、 さらに好まし くは 1 ~ 3個） が欠失したもの、 その一部のアミノ酸 （好ましくは 1〜1 0 個、 より好ましくは 1〜5個、 さらに好ましくは 1〜3個） が他のアミノ酸 と置換したもの、 そのアミノ酸配列に数個のアミノ酸 （好ましくは 1〜1 0 個、 より好ましくは 1〜 5個、 さらに好ましくは 1〜 3個） が付加または揷 入されたもの、 およびそれらを組み合わせたァミノ酸配列を有するものも含 まれる。'上記のようにアミノ酸配列が欠失、 置換、 付加または揷入されてい る場合、 その位置は特に限定されない。
配列番号 1乃至 3 6、 8 4乃至 1 0 2、 および 1 2 6で示されるアミノ酸 配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、 配列番号 1 乃至 3 6、 8 4乃至 1 0 2、 および 1 2 6に記載のアミノ酸配列と約 8 5 % 以上、 好ましくは約 9 0 %以上、 より好ましくは約 9 5 %以上、 最も好まし くは約 9 8 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。 配列番 号 1乃至 3 6、 8 4乃至 1 0 2、 および 1 2 6に記載のアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号 1乃至 3 6、 8 4乃至 1 0 2、 および 1 2 6に記載のアミノ酸配列と実質的に同一 のァミノ酸配列を有し、 配列番号 1乃至 3 6、 8 4乃至 1 0 2、 および 1 2 6に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白 質などが好ましい。 実質的に同質の活性は、 上記と同義である。
本努明に係る蛋白質の部分ペプチド （以下、 本発明に係る部分ペプチドと 呼ぶ。 ） とは、 上記の本発明の蛋白質の部分ペプチドであって、 上記の本発 明の蛋白質と実質的に同質の活性を有するものであればいずれのペプチドで もよい。 例えば、 本発明に係る蛋白質のアミノ酸配列のうち少なくとも 1 0 個以上、 好ましくは 3 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上の連続したァ ミノ酸配列を有するペプチドなどが含まれる。 また、 本発明に係る部分ぺプ チドとしては、 そのアミノ酸配列中の一部のアミノ酸 （好ましくは 1〜1 0 個、 より好ましくは 1〜5個） が欠失したもの、 任意のアミノ酸と置換した もの、 そのアミノ酸配列の数力所 （好ましくは 1〜1 0力所、 より好ましく は 1〜 5力所） に任意のァミノ酸が付加または揷入されたもの、 およびそれ らを組み合わせたアミノ酸配列を含有するものも含まれる。 ここで、 ァミノ 酸の欠如、 置換、 付加、 または揷入の位置は特に限定されない。 実質的に同 質の活性としては、 上記と同義である。
また、 本発明に係る S— 1 0 0 、 本発明に係る蛋白質、 およびそれらの 部分べプチドは、 その構成アミノ酸がカルボキシル基を持っていてもよく、 そのカルボキシル基はアミド化またはエステル化されていてもよい。 そのェ ステル基には、 例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチルなどのアルキル 08471
基、 フェニ^/、 ナフチノレなどのァリノレ基、 シクロペンチル、 シクロへキシノレ などのシクロアルキル基などによりエステルイ匕されたものが含まれる。 また、 構成アミノ酸のアミノ基はホルミル基、 ァセチル基などで保護されていても よい。 また、 糖鎖が結合しているものなども本宪明に係る蛋白質およびその 部分ペプチドに含まれる。
本発明に係る S— 100 、 本発明に係る蛋白質、 およびそれらの部分ぺ プチドの塩としては、 酸 （無機酸や有機酸など） または塩基 （アルカリ金属 塩など） などとの塩が用いられるが、 生理学的に許容される酸付加塩が好ま しい。 このような塩としては、 例えば、.無機酸 （塩酸、 リン酸、 硫酸、 臭化 水素酸など） との塩、 または有機酸 （蟻酸、 酢酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 クェン酸、 蓚酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 コハ ク酸、 マレイン酸、 酒石酸、 安息香酸など） との塩などが用いられる。
S— 100 結合蛋白質と S— 100 ]3が結合することで誘発される因子 としては、 ケモカイン、 サイト力イン、 ペプチド、 またはセカンドメッセン ジャーが挙げられる。 具体的には、 I L— 8、 I L— 6、 MCP_1、 Α|8、 Ca2+等が挙げられる。 ■ .
本発明に係る蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチ ド （DNA、 RNA、 または DNAZRNAキメラ） としては、 本発明に係 る蛋白質またはその部分ぺプチドをコ一ドする塩基配列を含有するものであ る限り、 いかなるものであってもよい。
本発明に係る蛋白質またはその部分ぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチ ドは、 ゲノム DNA、 cDNA、 合成 DNA、 RNA、 c RNA、 または D NA— RNAハイブリッドのいずれであってもよい。
本発明に係る蛋白質またはその部分ぺプチドをコードするポリヌクレオチ ド（以下、本発明に係る DNAと呼ぶ。 ） としては、配列番号 38乃至 73、 103乃至 121、 および 127から選択される配列番号で示される塩基配 列を有するポリヌクレオチド以外に、 そのポリヌクレオチドまたはその相補 的な配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする塩基配列を有し、 本亮明に係る蛋白質と実質的に同じ性質を有す る蛋白質をコードするポリヌクレオチドである限り、 いかなるものであって もよい。 そのようなポリヌクレオチドとしては、 配列番号 3 8乃至 7 3、 1 0 3乃至 1 2 1、 および 1 2 7からなる群から選択される配列番号で示され る塩基配列と約 9 0 %以上、 '好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基 配列を有するポリヌクレオチドなどが挙げられる。 ハイプリダイゼーション は、 公知の方法、 例えば、 Molecular Cloning (Sambrook, J., Fritsch, E. F. および Maniatis, T.著、 Cold Spring Harbor Laboratory Pressより 1989年 に宪刊）または Current Protocol in Molecular Biology (F. M. Aus belら編、 John Wiley & Sons, Inc.より発刊） に記載の方法などに従って行なうことが できる。 ストリンジェントな条件としては、 例えば、 6 5 °Cでのハイプリダ ィゼーション、および 0.1 X S S C、0.1%の S D Sを含む緩衝液による 6 5 °C での洗浄処理を挙げることができる。
本発明に係る D NAは、 化学合成によって、 または本発明に係る蛋白質ま たはその部分べプチドの一部をコードする合成 D NAプライマーを用いて P C R法に,よって.増幅することによって、 あるいは本発明に係る蛋白質または その部分ぺプチドの一部をコードする合成 D N Aをプロープとしたハイプリ ダイゼーシヨン法によって得ることができる。 また、 最近では、 ヒ トの種々 の組織の c D NAライブラリ一が巿販されており、 これらを使用して添付の 説明書に従って行なうことができる。 本発明に係る D NAを P C R法あるい はハイブリダイゼーション法によつて取得するために使用する糸且織としては、 例えば、 ヒ トの組織のうち、 S—1 0 0 が作用すると考えられる組織、 好 ましくは脳が挙げられる。 ハイプリダイゼーシヨンの方法は、 例えば、 上記 の方法または Gene, 10， 63 (1980)に記載の方法に従って行なうことができる。 このようにして得られた D NAは、 その D NAを含有するベクター D NAを 適当な宿主に導入し、 これを増殖させることによって、 必要量得ることがで きる。
本発明に係る蛋白質またはその部分ぺプチドを取得する方法としては、
(1) 生体または培養細胞から精製単離する方法、
(2) ペプチド合成する方法、 または
(3) 遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、
などが挙げられるが、 工業的には （3) の方法が好ましい。
遺伝子組み換え技術を用いて蛋白質またはぺプチドを生産するための発現 系 （宿主一ベクター系） としては、 例えば、 細菌、 酵母、 昆虫細胞、 および 哺乳動物細胞の発現系等が挙げられる。
例えば、 大腸菌で発現させる場合には、 成熟蛋白部分をコードするポリヌ クレオチドの 5' 末端に開始コドン （ATG) を付加し、 得られた cDNA を、 適当なプロモーター （例えば、 t r pプ モーター、 1 a cプロモータ 一、 ； L P Lプロモーター、 T 7プロモーター等） の下流に接続し、 大腸菌内 で機能するベクター （例えば、 pBR 322、 pUC 18、 pUC 1 9等） に揷入して発現ベクターを作製する。 次に、 この発現ベクターで形質転換し た大腸菌 （例えば、 E. ColiDHl、 E. ColiJM109、 Ε· Coli HB101株等） を 適当な培地で培養して、 その菌体より目的とする蛋白質またはペプチドを得 るこどができる。 また、 バクテリアのシグナノレペプチド （例えば、 p e 1 B のシグナルペプチド） を利用すれば、 ペリブラズム中に目的とする蛋白質ま たはペプチドを分泌することもできる。 さらに、 他のポリペプチドとのフユ ージヨン .プロテイン （fusion protein) を生産することもできる。
また、 哺乳動物細胞で発現させる場合には、 本宪明に係る DN Aを適当な ベクター（例えば、 レトロウイノレスベタター、パピローマウイノレスべクタ一、 ワクシニアウィルスベクター、 SV40系ベクター等） 中の適当なプロモー ター （例えば、 SV40プロモーター、 LTRプロモーター、 メタ口チォネ インプロモーター等） の下流に揷入して発現ベクターを作製する。 次に、 得 られた発現べクターで適当な哺乳動物細胞 （例えば、 サル C O S— 1細胞、 COS— 7細胞、 チャイニーズハムスター CHO細胞、 マウス L細胞等） を 形質転換し、 形質転換体を適当な培地で培養することによって、 本発明に係 る蛋白質またはその部分ペプチドが発現される。 さらに、 その他のポリぺプ チド、 例えば抗体の定常領域 （Fc portion) をコードする cDNA断片と連 結する'ことによって、 フュージ ン 'プロテイン （fusion protein) を生産す ることもできる。
また、 昆虫細胞で発現させる場合には、 本発明に係る DNAを適当なプロ モーター （ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモーター等） の下流に接 続し、 昆虫細胞で機能するウィルスベクターに揷入して発現ベクターを作製 する。 昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾 の幼虫由来株化細胞 （S f 細胞） が用いられる。 ウイ ^"スが BmNP Vの場 合は、蚕由来株化細胞.（BmN細胞）などが用いられる。 S f 細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （Vaughn, J. L.， ィ ン'ヴィポ （InVivo) ， 1977年， 第 13卷， p213_217) が用いられる。 昆虫 としては、 カイコの幼虫などが用いられる。 昆虫細胞または昆虫を形質転換 するには、 例えば、 バイオ テクノロジー （Bio/Technology) ， 1988年， 第 6巻， p47-55に記載の方法に従って行なうことができる。
また、 酵母で発現させる場合には、 本発明に係る DNAを適当なプロモー ター （PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター等） の下流に接続し、 酵母で機能するベクター （p SH 19、 p SH15等） に揷入して発現ベクターを作製する。 次に、 この発現 ベタタ一で形質転換した酵母 （例えば、 サッカロミセス 'セレビシェ AH 2 2、 AH 22 R―、 20 B— 12、 シゾサッカロミセス■ボンべ NC YC 19 13、 ピッキァ 'パストリス KM71等） を適当な培地で培養して、 目的と する蛋白質またはペプチドを得ることができる。 以上のようにして得られた '蛋白質またはペプチドは、 一般的な生化学的方法によって単離精製すること 8471
ができる。
本宪明に係る蛋白質またはその部分ペプチドと S— 1 0 0 βとの結合を阻 害する物質のスクリーニング方法としては、 例えば配列番号 1 2 6で示され るァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を有する蛋白質 またはその部分べプチドの結合量を被験物質の存在下と非存在下とで E L I S A (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) によつて it較することによ り実施することができる。
さらに、 本発明のスクリーニング方法は、 例えば、 以下の方法により行な うこともできる。 すなわち、 本発明に係る蛋白質もしくはその部分ペプチド もしくはそれらに T a g (例えば、 H i s— T a g、 G S Tなど） を付した 融合蛋白質またはこれらに対する抗体を固定したアツセィ用ゥエルに、 被験 物質の存在下または非存在下で、 ピオチンなどで標識した S— 1 0 0 /3を添 加した後 （ただし、 上記抗体を用いる場合には、 本発明に係る蛋白質もしく はその部分べプチドもしくはそれらに T a gを付した融合蛋白質を添加した 後、 ピオチンなどで標識した S— 1 0 0 を添加する。 ） 、 遊離している S — 1 0 0 /3をビォチンなどの標識体を検出する市販のキットもしくは S— 1 0 0 βに対する抗体を用いて検出または定量する方法が挙げられる。 かかる 場合、 S— 1 0 0 ]3を遊離させる物質を、 本発明に係る蛋白質またはその部 分ペプチドと S— 1 0 0 βとの結合を阻害する物質として選択することがで きる。 また、 S— 1 0 0 )3を固定化したアツセィ用ゥエルに、 本発明に係る 蛋白質もしくはその部分べプチドもしくはそれらに T a gを付した融合蛋白 質を添加する方法によっても、 同様に実施することができる。 本発明に係る 蛋白質もしくはその部分ぺプチドもしくはそれらに T a gを付した融合蛋白 質または S— 1 0 0 ]3の固定化は、 例えば、 ビォチンで標識したそれら蛋白 質とアツセィ用ゥエルに固定したアビジンとを反応させることによって行な うことができる。
本発明のスクリーニング方法は、 B i a c o r eを用いた方法で実施する 5008471
ことができる。 具体的には、 本発明に係る蛋白質またはその部分ペプチドに
Ta gをつけたものを作製し、 抗 T a g抗体を固定化したセンサーチップに 捕捉してセンサー表面を調製する。これに S— 1' 000と被験物質を添加し、 B i a c o r eを用いて、 本発明蛋白質または部分べプチドと S— I O O JS の結合量や力イネティックスを相互作用センサーグラムで測定する。 定量的 な速度論的検討から本発明に係る蛋白質またはその部分ぺプチドとの結合能 を減少させる物質を、 本発明に係る蛋白質またはその部分ペプチドと S— 1 00 との結令を阻害する物質として選択する。
本発明のスクリーユング方法は、 化学増幅型ルミネッセンスアツセィを用 いた方法で実施することができる。 具体的には、 ビォチン化された S— 10 0 および本発明に係る蛋白質またはその部分ペプチドに T a g (例えば、 H i s— T a g、 GSTなど） を付けたものを公知の方法により作製する。 Ta g抗体を複合ィ匕させたァクセプタービーズと T a g付きの本発明に係る 蛋白質またはその部分ぺプチドの混合物に、 被験物質の存在下または非存在 下で、 ピオチン化 S— 100 j8およびストレプトアビジン一ドナービーズを 加え、 それぞれの蛍光強度を検出または定量し、 蛍光強度が減少する物質を 本発明に係る蛋白質またはその部分べプチドと S— 100 3の結合を阻害す る物質として選択する。
本 明のスクリーユング方法は、 ルシフ千ラーゼアツセィを用いた方法で 実施することができる。 具体的には、 酵母の GAL4DNA結合ドメインを コードする DNAを持つ発現ベクターどへルぺスシンプレックスウィルスの VP 16活性化ドメインを持つ発現ベクターに、 S— 100 ]3と本発明に係 る蛋白質またはその部分べプチドをそれぞれ揷入し、 G A L 4 D N A結合ド メインと S— 100 ]3からなる融合蛋白質と VP 16活性化ドメインと本発 明に係る蛋白質またはその部分べプチドからなる融合蛋白質をそれぞれ発現 するベクターを作製する。 哺乳動物細胞を、 これらの発現ベクターと GAL 4結合領域とホタルルシフェラーゼをコードする配列を持つたレポータ一べ クタ一で形質転換し、 被験物質の存在下または非存在下での発光強度を各種 ルシフェラーゼ定量試薬によって検出または定量する。 被験物質の非存在下 と比べ、 発光強度を減少させる物質を本発明に係る蛋白質またはその部分ぺ プチドと S— 1 0 0 との結合を阻害する物質として選択する。
本発明のスクリーニング方法は、 免疫沈降を用いた方法で実施することが できる。 具体的には、 T a gを付けた本発明に係る D N Αで形質転換された 形質転換体を上記の方法により作製し、 その形質転換体 （例えば、 U 3 7 3 MG細胞など） を培養プレートに撒き、 増殖させる。 その形質転換体の細胞 抽出液に被験物質を加え、 T a gの抗体で免疫沈降を行ない、 ウェスタンブ ロッテイングなどの方法により共沈する S—1 0 0 量を検出または定量す る。 被験物質の非存在下と比べて共沈される S— 1 0 0 量を減少させる物 質を、 本発明に係る蛋白質またはその部分ペプチドと S— 1 0 0 の結合を 阻害する物質として選択する。
本発明のスクリーニング方法は、 蛍光共鳴エネルギー転移 ( F R E T ： fluorescence resonance energy transier) あるレ、 fまノ ィオノレ ネッセンス共 FJ fェ >ノレギー 移 (B R E T : bioluminescence resonance energy transfer ) を用いた方法 （竹縛ら， 実験医学別冊， タンパク質実験ハンドブック， 羊土 社 (2003年)） で実施することができる。 具体的には、 色素 ·蛍光生産性基質 を変換するレポーター蛋白質 （例えば、 ーラクタマーゼ、 ガラクトシター ゼなど） または蛍光標識蛋白質を 2つに断片化した一方に S— 1 0 0 ]3が、 もう一方に本発明に係る蛋白質またはその部分べプチドが融合された形態で 発現するべクタ一をそれぞれ作製する。 両発現べクタ一によつて形質転換さ れた培養細胞において、 被験物質の非存在下に比べ吸光度もしくは蛍光強度 が減少する物質を本発明に係る蛋白質またはその部分ペプチドと S— 1 0 0 との結合を阻害する物質として選択する。
また、 ルシフェラーゼ遺伝子のいずれかの末端に S— 1 0 0 /3を融合させ た蛋白質を発現するベクターと、 蛍光標識蛋白質のいずれかの末端に本宪明 に係る蛋白質またはその部分ペプチドを融合させた蛋白貧を発現するべクタ 一によつて、 形質転換された細胞を作製する。 この細胞抽出液に被験物質、 続いて基質を加えて発色させ、 被験物質の非存在下に比べ蛍光強度が減少す る物質を本発明に係る蛋白質またはその部分ペプチドと S— 1 0 0 との結 合を阻害する物質として選択する。 .
本発明のスクリーニング方法は、 タンパク再構成ァッセィ （protein fragment complementation assay ( P C A) ；竹縛ら， 実験医学別冊， タン パク質実験ハンドプック， 羊土社 (2003年)） を用いた方法でも実施すること ができる。
本発明に係る蛋白質またはその部分べプチドと S— 1 0 0 /3が結合するこ とによつて誘発される因子の産生量を変化させる物質のスクリ一ユング方法 としては、 例えば、 配列番号 1 2 6で示されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またほその部分ぺプチドを細胞 に産生させ、 被験物質の存在下と被存在下において S— 1 0 0 βで細胞を刺 激し、 誘発されてくる因子、 例えば、 M C P— 1や I L一 6などの産生量を E L I S Αによって比較することにより実施することができる。
さらに、 本発明のスクリーニング方法は、 例えば、 以下の方法により行な うことができる。 すなわち、 本亮明に係る D NAで形質転換された形質転換 体を上記の方法により作製する。 その形質転換体 （例えば、 U 3 7 3 MG細 胞など） を培褰プレートに撒き、 増殖させる。 ここに被験物質と S— 1 0 0 β (例えば、 カルボキシメチル化 S— 1 0 0 βなど） を加えて培養する。 2 4時間後の培養上清を回収し、 例えば、 S— 1 0 0 0刺激の結果として産生 される M C P— 1を、 市販の M C P— 1測定キットなどを用いて定量する。 M C P— 1量を減少させる物質を本発明に係る蛋白質またはその部分ぺプチ ドと S— 1 0 0 /3が結合することによって誘 される因子の産生量を変化さ せる物質として選択する。 ·
本発明のスクリ一ユング方法により得られる物質とは、被験物質、例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞 抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などから選ばれた物質またはそ の塩であり、 本発明に係る蛋白質またはその部分ペプチドと S— 1 0 0 3と の結合を阻害する物質および/または本宪明に係る S白質またはその部分ぺ プチドと S— 1 0 0 ]3との結合することによって誘発される因子の産生量を 変化させる物質である。 '
本発明のスクリーニング方法により得られる物質は、 公知の方法で塩に変 換される。 塩としては薬学的に許容される塩が好ましい。
塩としてほ、 アルカリ金属塩、 アルカリ土類金属塩、 アンモニゥム塩、 ァ ミン塩、 酸付加塩等が挙げられる。
塩は、 水溶性のものが好ましい。 適当な塩としては、 アルカリ金属 （カリ ゥム、 ナトリウム等） の塩、 アルカリ土類金属 （カルシウム、 マグネシウム 等） の塩、 アンモユウム塩、 薬学的に許容される有機アミン （テトラメチル アンモユウム、 トリェチルァミン、 メチルァミン、 ジメチルァミン、 シクロ ペンチルァミン、 ベンジ^/アミン、 フエネチ ァミン、 ピぺリジン、 モノエ タノールァミン、 ジエタノールァミン、 トリス （ヒドロキシメチル） ァミノ メタン、 リジン、 アルギニン、 Ν—メチルー D—グルカミン等） の塩が挙げ られる。
酸付加塩は水溶性であることが好ましい。 適当な酸付加塩としては、 例え ば塩酸塩、 臭化水素酸塩、 ヨウ化水素酸塩、 硫酸塩、 リン酸塩、 硝酸塩のよ うな無機酸塩、 または酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、 クェン酸塩、 メタンスルホン酸寧、 エタンスルホン酸塩、 ベンゼンスルホン酸塩、 トルェ ンスルホン酸塩、 イセチオン酸塩、 グルクロン酸塩、 ダルコン酸塩のような 有機酸塩が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質、 すなわち本宪明に係る 蛋白質と S— 1 0 0 3の結合を阻害する物質および Ζまたは本発明に係る蛋 白質と S— ; L 0 0 3の結合によって誘発される因子の摩生を変化させる物質 5 008471
としては、 本発明に係る蛋白質またはその部分ペプチド、 および本発明に係 る蛋白質と S— 1 0 0 の結合を阻害する抗体等が挙げられる。 .
本発明に係る蛋白質またはその部分ペプチドと S— 1 0 0 J3の結合を阻害 する物質として好ましくは配列番号 1乃至 3 6、 8 4乃至 1 0 2、 および 1 2 6から選択されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配 列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドであり、 より好ましくは配列番 号 1 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配 列を含有する蛋白質またはその部分ぺプチドである。
'本発明に係る蛋白質またはその部分ペプチドと S— 1 0 0 J3が結合するこ とによって誘発される因子の産生量を変化させる物質として、 好ましくは配 列番号 1乃至 3 6、 8 4乃至 1 0 2、 および 1 2 6から選択されるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはそ の部分べプチ であり、 より好ましくは配列番号 1 2 6で表されるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはそ の部分ペプチドである。
本発明に係る蛋白質と S— 1 0 0 の 合を阻害する抗体としては、 本発 明、に係る蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたは S— 1 0 0 ]3に対する抗体 であって、 両者の結合を阻害する活性を有するものが挙げられる。 そのよう な抗体は、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体のいずれであってもよ く、 本発明に係る蛋白質またはその部分ぺプチドを抗原として、 公知の方法 (竹縛ら， 実験医学別冊， タンパク質実験ハンドブック， 羊土社 (2003年)） により製造することができる。
本発明に係る蛋白質と S— 1 0 0 の結合を阻害する抗体として好ましぐ は、 配列番号 1乃至 3 6、 8 4乃至 1 0 2、 および 1 2 6から選択されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質ま たはその部分べプチドに対する抗体であり、 かつ本発明に係る蛋白質と S— 1 0 0 βの結合を阻害する抗体である。
S— 1 0 0 ]3結合蛋白質の発現を抑制する物質としては、 S— 1 0 0 jSと の結合活性を有している蛋白質をコードするポリヌクレオチドと相補的な 塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、例えばァンチセ ンス D NA、 アンチセンス R NA、 S i R NA等が挙げられる。 . 本発明に係る蛋白質をコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列 またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドは、 本発明に係る D NAを 上記のようなべクターのァンチセンス領域に揷入することで製造すること ができる （佐々木ら， 実験医学別冊， 改訂バイオ実験の進め方， 羊土社 (2003 年)） 。
S— 1 0 0 ]3結合蛋白質である本発明に係る蛋白質の発現を抑制する物質 として好ましくは配列番号 1乃至 3 6、 8 4乃至 1 0 2、 および 1 2 6から 選択されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有 する蛋白質をコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一 部を含有してなるポリヌクレオチド、 例えばアンチセンス D NA、 アンチセ ンス R NA、 S i R NA等である。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質、 本発明に係る蛋白質の 部分べプチド、 本発明に係る蛋白質と S— 1 0 0 /3の結合を阻害する抗体、 および本発明に係る D NAのアンチセンス D NA、 アンチセンス R NAまた は S i R NAは、 S— 1 0 0 ]3が関与する疾患の予防および または治療に 有用である。
S— 1 0 0 ^が関与する疾患とは神経変性疾患などが挙げられる。 本明細 書中、 神経変性疾患とは、 神経細胞 （中枢神経 (例えば、 脳神経、 脊髄神経 等） および Zまたは末梢神経 （例えば、 自律神経系 （例えば、 交感神経、 副 交感神経等） 、運動神経系、知覚神経系）） の変性を伴う疾患全てを包含し、 その病因によって限定されるものではなく、 一般的に神経変†生疾患とされて 471
いるパーキンソン病、 パーキンソン症候群、 線条体黒質変性症、 ハンチント ン病、 舞踏病一無定位運動症、，進行性核上麻痺、 びまん性レビー小体病、 大 脳皮質基底核変性症、 アルツハイマー病、 認知症 （痴呆症） （例えば、 脳血 管性認知症 （脳血管性痴呆症） 、 アルツハイマー型認知症 （アルツハイマー 型痴呆症） 、 老年性認知症 （老年性痴呆症） 、 ピック病、 前頭側頭葉型認知 症 （前頭側頭葉型 ¾呆症） 、 家族性認知症 （家族性痴呆症） 等） 、 脊髄小脳 変性症 （例えば、 ォリーブ橋小脳萎縮症、 晚発性小脳皮質萎縮症、 家族性脊 髄小脳失調症 （例えば、 マツカードジヨセフ病等） 、 歯状核赤核淡蒼球ルイ 体萎縮症、家族性瘗性対麻痺、 フリードライヒ病等） 、運動神経病（例えば、 筋萎縮性側索硬化症、家族性筋萎縮性側索硬化症等）、脱髄性疾患（例えば、 多発性硬化症、 汎発硬化症、 急性散在性脳脊髄炎、 急性小脳炎、 横断性脊髄 炎、 ギラン ·バレー症候群等） だけでなく、 脳血管障害 （例えば、 脳卒中、 脳梗塞 （例えば、 脳血栓、 脳塞栓等） 、 一過性脳虚血発作、 再灌流障害、 脳 出血（例えば、 高血圧性脳内出血、 クモ膜下出血等） 等） '脳腫瘍 （例えば、 星状膠細胞腫、 脳膿瘍等） ·血液量減少性ショック ·外傷性ショック ·頭部 損傷および Zまたは脳脊髄外傷 （例えば、 脳挫傷 ·貫入 ·せん断 ·圧迫 '裂 傷、 分娩時外傷、 乳児むち打ち揺さぶり症候群等） に伴う神経機能障害、 感 染症に伴う脳脊髄疾患 （例えば、 髄膜炎、 インフルエンザ脳症、 クロイツフ エルドーヤコプ病、 エイズ 症による痴呆等） 、 毒物 （ヒ素、 カドミウム、 有機水銀、 サリン、 ソマン、 タブン、 V Xガス等） '放射線等による神経機 能障害、 精神疾患 （例えば、 神経症、 心身症、 不安、 統合失調症、 躁うつ病 等）、てんかん、 メージ症候群、 ジストニア、 ダウン症、 睡眠障害（例えば、 過眠、 ナルコレプシ一、 睡眠時無呼吸症候群等) 等をも含むものとする。 神 経変性疾患として好ましくは、 例えば、 アルツハイマー病、 ダウン症、 多発 性硬化症、 脳卒中または脳梗塞に伴う神経機能障害、 パーキンソン病、 感染 症に伴う脳脊髄疾患、 てんかんまたは筋萎縮性側索硬化症である。
また、 本努明に係る蛋白質もしくはその部分ペプチド、 それらに対する抗 体、 または本発明に係る D N Aもしくはそのアンチセンス D NAは、 上記疾 患の診断に使用することができる。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質、 本発明に係る蛋白質の 部分べプチド、 本宪明に係る蛋白質と S— 1 0 0 の結合を阻害する抗体、 または本発明に係る D N Aのアンチセンス D NA、 アンチセンス R NAまた は S i R N Aは、 通常、 全身的または局所的に、 一般的には経口または非経 口の形で投与される。 好ましくは、 経口投与、 静脈内投与および脳室内投与 である。 ，
投与量は、 年齢、 体重、 症状、 治療効果、 投与方法、 処理時間等に'より異 なるが、 通常、 成人一人あたり、 一回につき、 1 0 0 gから 1 0 O m gの 範囲で、 一日一回から数回瘙ロ投与されるかまたは、 成人一人あたり、 一回 にっき、 1 0 /i gから 1 0 O m gの範囲で、 一日一回から数回非経口投与さ れる。 もちろん前記したように、 投与量は種々の条件により変動するので、 上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、 また範囲を越えて必要な場 合もある。 .
本発明のスクリーニング方法により得られる物質、 本発明に係る蛋白質の 部分ぺプチド、 本発明に係る蛋白質と S— 1 0 0 の結合を阻害する抗体、 または本発明に係る D N Aのアンチセンス D NA、 アンチセンス R NAまた は S i R N Aを投与する際には、 経口投与のための固体組成物、 液体組成物 およびその他の糸且成物、 非経口投与のための注射剤、 外用剤、 坐剤等として 用いられる。
経口投与のための固体組成物には、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 散剤、 顆粒 剤等が含まれる。 カプセルには、 ソフトカプセルおよびハードカプセルが含 まれる。
このような固体,袓成物においては、 一つまたはそれ以上の活性物質が、 少 なくとも一つの不活性な希釈剤 （例えば、 ラタトース、 マンュトール、 ダル コース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 微結晶セルロース、 デンプン、 ポ JP2005/008471
リビエルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）と混合される。 組成物〖ま、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、潤滑剤 （ス テアリン酸マグネシウム等）、崩壌剤（繊維素ダリコール酸カルシウム等）、 安定化剤 （ヒト血清アルブミン、 ラタト ス等） 、溶解補助剤 （アルギニン、 ァスパラギン酸等） を含有していてもよい。
錠剤または丸剤は、 必要により白糖、 ゼラチン、 ヒドロキシプロピルセル ロース、 ヒ ドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等の胃溶性あるい は腸溶性のフィルムで被膜してもよいし、また 2以上の層で被膜してもよい。 さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
経口投与のための液体組成物は、 薬学的に許容される乳濁剤、 溶液剤、 懸 濁剤、 シロップ剤、 エリキシル剤等 含み、 一般に用いられる不活性な希釈 剤 （例えば、 精製水、 エタノール等） を含んでいてもよい。 この様な組成物 は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような捕助剤、甘味剤、風味剤、 芳香剤、 防腐剤を含有していてもよい。
非経口投与のための注射剤としては、 無菌の水性または非水性の溶液剤、 懸濁剤、 乳濁剤を包含する。 水性または非水性の溶液剤、 懸濁剤としては、 一つまたはそれ以上の活性物質が、 少なくとも一つの不活性な希釈剤と混合 される。 水性の希釈剤としては、 例えば注射用蒸留水おょぴ生理金塩水が挙 げられる。 非水性の希釈剤としては、 例えばプロピレングリコール、 ポリエ チレングリコール、 ォリーブ油のような植物油、 エタノールのようなアルコ ール類、 ポリソルベート 8 0' (登録商標） 等が挙げられる。
このような組成物は、 さらに防腐剤、 湿潤剤、 乳化剤、 分散剤、 安定化剤 (例えば、 ヒト血清アルブミン、 ラタトース等） 、 溶解補助剤 （例えば、 ァ ルギニン、 ァスパラギン酸等） のような捕助剤を含んでいてもよい。
非経口投与のための外用剤としては、 例えば、 軟膏剤、 ゲル剤、 クリーム 剤、 湿布剤、 貼付剤、 リニメント剤、 噴霧剤、 吸入剤、 スプレー剤、 エアゾ ル剤、 点眼剤、 およぴ点鼻剤等が挙げられる。 これらはひとつまたはそれ以 5 008471
上の活性物質を含み、 公知の方法または通常使用されている処方により製造 される。
経口投与のためのその他の組成物としては、 ひとつまたはそれ以上の活性 物質を含み、 それ自体公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。 この組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定剤と 等張性を与えるような安定化剤、 塩化ナトリウム、 クェン酸ナトリウムある いはクェン酸のような等張剤を含有していてもよい。 スプレー剤の製造方法 は、 例えば米国特許第 2,868,691号および同第 3，095，355号明細書に詳しく 記載されている。 '
非経口投与のための上記以外の組成物としては、 ひとつまたはそれ以上の 活性物質を含み、 常法により処方される直腸内投与のための坐剤および膣内 投与のためのペッサリー等が含まれる。
本発明に係る D NAのアンチセンス D NA、 アンチセンス R N Aまたは S i R N Aを S— 1 0 0 . ]3が関連する疾患の予防おょぴ または治療に使用す る場合は、 そのアンチセンス D NA、 アンチセンス R NAまたは S i R NA を単独あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウィルスベクターなどの適 当なベクターに挿入した後、 定法に従って、 ヒトゃ哺乳動物に投与すること ができる。 それらは、 そのままで、 あるいは細胞への導入を促進するための 補助斉 ΰ (リボソーム、 HV Jリボソームなど） などの生理学的に認められる 担体とともに製剤化して用いることができる。
本発明に係る D NA、 もしくはそれらに相補的な配列またはその一部を含 有してなるポリヌクレオチドは、 例えば、 プローブとして使用することによ り、 本発明に係る D N Aまたは mR NAを検出することができるので、 上記 した S— 1 0 0 が関連する疾患を検査する試薬として使用することができ 'る。 S— 1 0 0 ;3が関連する疾患の原因として、 遺伝的要因が疑われる場合 には、 これらを用いて遺伝子診断を行なうことができる。
本発明に係る蛋白質またはその部分ぺプチドに対する抗体は、 本発明に係 る蛋白質を検出することができるので、 上記した S— 1 0 0 ]3が関連する疾 患を検査する試薬として使用することができる。
本発明.のスクリーニング方法は、 これに必要な試薬からなるキットにおい て、 実施することができる。 具体的には、
a ) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液、
b ) 本発明に係る蛋白質またはその部分ぺプチドの標品、
c ) 擇識リガンド、 および
d ) リガンド標準液を含むキットが挙げられる。
ここで、 本発明に係る蛋白質またはその部分ペプチドの標品は試験容器に 固定化したものを用いてもよく、標識リガンドとしては、 [3 H]、 [1 2 5 1 ]、 [1 4 C]、 [3 5 S ] などで標識した本発明 S—l 0 0；8を適当な溶媒または 緩衝液に溶解したものを用いてもよく、，リガンド標準液は 0 . 1 %ゥシ血清 アルブミンを含む P B Sに S— 1 0 0 j3を溶解したものを用いてもよい。 測定方法としては本発明に係る蛋白質または部分ぺプチドの標品に測定用 緩衝液を加え、 被験物質と標識リガンドを添加して反応させる。 反応液を除 去し、 洗浄用緩衝液で洗浄した後、.液体シンチレーシヨンカウンターを用い て放射活性を測定する。
本発明のスクリーニング用キットは、 本宪明に係る蛋白質またはその部分 ぺプチドを含有するが、 本発明に係る蛋白質またはその部分ぺプチドに対す る抗体を含んでいてもよい。 また、 本発明のスクリーニング用キットには、 本発明に係る蛋白質またはその部分べプチドを産生する能力を有する細胞
(好ましくは、 本発明に係る D N Aで形質転換された形質転換体 （例えば、 動物細胞など） を含有するものも含まれる。 '
[発明の効果]
本発明のスクリ一ユング方法は、 S— 1 0 0 ]3が関与する疾患の予防およ ぴ Zまたは治療に使用できる物質、 本発明に係る蛋白質の部分ペプチド、 そ れらに対する抗体、 または本発明に係る D NAのアンチセンス D NA、 アン 5008471
チセンス RNAまたは S i RNAの開発 使用することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 健常人およびパーキンソン病組織における S— 100 結合蛋白 質 F L J 12587の mRNA発現量を示す （N：健常人、 PARK：パー キンソン病）
図 2は、 健常人、 筋萎縮性側索硬化症おょぴアルツハイマー病組織におけ る S— 100 ]3結合蛋白質 DKFZ p 76 1 HO 421の: mRNA発現量を 示す （N：健常人、 AL S ：筋萎縮性側索硬化症、 A 1 z ： アルツハイマー 病） 。
図 3は、 健常人およびアルツハイマー病組織における S - 100 /3結合蛋 白質 POGZ 1の mRNA発現量を示す （N：健常人、 A l z ： ァルツハイ マー病） 。
図 4は、 健常人おょぴアルツハイマー病組織における S— 100 /3結合蛋 白質 MGC 1 5730の: mR N A発現量を示す （N：健常人、 A 1 z ：アル ッハイマー病） 。
図 5は、 健常人、 筋萎縮性側索硬化症およびアルツハイマー病組織におけ る S— 100 ]3結合蛋白質 FKRPの mRNA発現量を示す （N.:健常人、. ALS ：筋萎縮性側索硬化症、 A 1 Z ： アルツハイマー病） 。
図 6は、 BAP 28. 2蛋白質と S ^ 100 3蛋白質との結合を示す （M o c k ：陰性対象） 。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、 本発明は何らこ れらに限定されるものではない。
実施例 1 ：ウェストーウェスタン法による S— 100 結合蛋白質の同定 cDNAライプラリーの構築およびウェスト一ウェスタン法は、 細胞工学 5008471
別冊 8新細胞工学実験プロトコール （東京大学医科学研究所制癌研究部編 1993， 秀潤社） に記載されている方法に従って行なった。 すなわち、 ヒト脳 由来 mRNAを調製し、 逆転写酵素を用いて cDNAを合成した後、 大腸菌 由来 DNAポリメラーゼ、 DNAリガーゼ、 RNa s έ Ηを用い第 2鎖の 合成を行なった。 合成終了後、 Τ4 DN Αポリメラーゼにより平滑化を行 なった。 平滑化終了後、 E c o R I リンカーライゲーションを行ない、 E c o R Iおよびアル力リフォスファターゼ処理を行なったラムダ g t 1 1を T 4リガーゼでライゲーシヨンした。 ライブラリ一は公知の方法に従って増幅 した。
ウェスト一ウェスタン法による結合蛋白質の同定は以下のように行 った。 ライブラリーをイソプロピル一 —D—ガラクトピラノシドにて誘導後、 1 5 Omm シャーレ 1枚当たり 5 X 104プラーク発現させ、 PVDF膜に転 写させた。 ブロッキングを行なった後、 10 μ g/mLの S— 100 ]3およ び 1 mM. カルシウムを含むトリス緩衝液に室温で 1時間ィンキュベーショ ンした。 その後、 リン酸緩衝液で PVDF膜を洗浄し、 さらに S— 100 ]3 抗体と室温で 1時間インキュベーションした。 再度、 リン酸緩衝液にて洗浄 し、 西洋ヮサビペルォキシダーゼ結合させたィムノグ口プリン抗体とインキ ュベーシヨンした。 再び、 リン酸緩衝液で PVDF膜を洗浄し、 公知の化学 発光試薬によって陽性クローンを検出した。 陽性クローンは、 SM緩衝液に 単離し、 シークェンスにより同定した。 陽性クローンの名称 （NCB I I Dまたは D D B J I D、 同定したァミノ酸配列、 同定した塩基配列） の形 式で以下に陽性クローンを示す。 RP 3— 495010 (NCB I I D : AL031 1 21、配列番号 1、配列番号 38) 、 RP 1 1— 160O5 (N CB I I D : AC 01 5821, 配列番号 2、 配列番号 39) 、 RP 1 1 - 67 G 7 (NCB I I D : AC 01 1291, 配列番号 3、 配列番号 4 0) 、 RP 1 -287021 (NCB I I D : AL 136319, 配列番 号 4、 配列番号 41) 、 RP 3-509 I 1 9 (NCB I I D ： AL 12 JP2005/008471
1834、 配列番号 5、 配列番号 42) 、 CTC-286 C 20 (NCB I I D : AC0273 14、 配列番号 6、 配列番号 43) 、 RP 1 1— 444 D 3 (NCB I I D : AL087322、 配列番号 7、 配列番号 44 ) 、 ZNF 140- 1 i k e r o t e i n (NCB I I D： AF 1 556 56、 列番号 8、 配列番号 45) 、 RP 1 1— 45 1 G 1 (NCB I I D : AC 01 3727, 配列番号 9、 配列番号 46) 、 RP 4—550H1 (NCB I I D : AL 035420、 配列番号.10、 配列番号 47 ) 、 F L J 1299 1 (NCB I I D : AK023053、 配列番号 1 1、 配列 番号 48) , FL J 22382 (NCB I I D : AK026035、 配列 番号 1 2、 配列番号 49) 、 IMAGE4423 166 (NCB I I D : BC03316 1、 配列番号 13、 配列番号 50 ) 、 I MAGE 52612 13 (NCB I I D : BC036485、配列番号 14、配列番号 51) 、 FL J 41109 (NCB I I D : AK123 104、 配列番号 1 5、 配 列番号 52) 、 F L J 42709 (NCB I I D : A 124699、 配 列番号 16、 配列番号 53) 、 SEC 14- 1 i k e 2 (NCB I I D : BC04833.7、 配列番号 17、 配列番号 54) 、 DKF Z p 31 3 P 0 1 1 (NCB I I D : AL 83,2467,配列番号 18、配列番号 55) 、 I MAGE 2823852 (NCB I ID : BC001 102、 配列番号 19、'配列番号 56) 、 FL J 34134 (NCB I I D： AKO 914 53、 配列番号 20、 配列番号 57) 、 P r e c e r e b e l l i n (NC B I I D : M58583、 配列番号 21、 配列番号 58) 、 FL J 136 73 (NCB I I D： AKO 2375 配列番号 22、 配列番号 59) 、 Sma l l g l u t am i n e— r i c h t e t r a t r l- c o p e p t i d e (NCB I I D : BC000390、 配列番号 23、 配列番号 6 0) , NT2R I 2006071 (NCB I I D : AKO 56262、 配 列番号 24、 配列番号 6 1) 、 FL J 20542 (NCB I I D : NM一 017871、 配列番号 25、 配列番号 62) 、 K I AA0627 (DDB J I D : AB 014527, 配列番号 26、 配列番号 63) 、 DKFZ p
451 G 202 (NCB I I D : AL 83 1955, 配列番号 27、 配列 番号 64) 、 Z i n c f i n g e r r o t e i n. 3 1 15 B P (N CB I ID : AJ 1 32592、 配列番号 28、 配列番号 65) 、 F L J 43968 (NCB I ID : AK125956、 配列番号 29、 配列番号 66) 、 CG I— 043 (NCB I I D : AF 15 1801, 配列番号 3 0、 配列番号 67) 、 DKFZ p 761 HO 421 (NCB I I D : AL 831813, 配列 号 31、 配列番号 68 ) 、' P O G Z 1 (N C B I I D ： NM— 01 5100、 配列番号 32、 配列番号 69) 、 CUB/S u s h i 1 mu l t i p l e d o m a i n 1 r o t e i n (NCB I I D : AF 333704N 配列番号 33、 配列番号 70 ) (以下、 C U B
5 u s h i 1と呼ぶ。 ） 、 FL J 12587 (DDB J I D： BD 286
600、 配列番号 34、 配列番号 71) 、 C a t e n i n b i n d i n g p r o t e i n (NCB I I D : NM— 014412、 配列番号 35、 配 列番号 72) (以下、力テェン結合蛋白質と呼ぶ。 ) 、 MGC 15730 (N CB I I D : NM— 032880、 配列番号 36、 配列番号 73) 、 MG C40157 (NCB I I D : BC 027986、 配列番号 84、 配列番 号 103) 、 FL J 351 1 3 (NCB I ID : AK092432、 配列 番号 85、配列番号 104) 、 SNO o n c o g e n e (NCB I I D : X 15219、 配列番号 86、 配列番号 105) 、 FL J 4221 3 (NC B I I D : AK 124207、 配列番号 87、 配列番号 106) 、 F L J 35109 (NCB I I D : AK092428、 配列番号 88、 配.列番号 107)、 B a s i c t r a n s c r i p t i o n f a c t o r 3 (N CB Γ ID : BC008062、 配列番号 89、 配列番号 108) 、 C I 1 o r f 23 (NCB I I D : NM— 0183 12、 配列番号 90、 配列 番号 109) 、 NAC t r a n s c r i p t i o n f a c t o r (NC B I I D ： AK090650, 配列番号 91、 配列番号 1 10) 、 S e q P T/JP2005/008471
u e n c e 23787 f r om P a t e n t WO 02068579 (NCB I I D : C Q 737853、 配列番号 92、 配列番号 1 1 1) 、 -S t e r i l e a l h a mo t i f d oma i n 6 (N C B I ID : BC01 2981、 配列番号 93、 配列番号 1 12) 、 CG I— 02 4 (NCB I I D : AF 1 32958、配列番号 94、配列番号 1 13) 、 TR I B 2 h omo 1 o g 2 (NC B I I D : NM— 0 -21643、 配列番号 95、 配列番号 1 14) N Fu ku t i n r e l a t e d p r o t e i n (NCB I I D : NM一 024301、 配列番号 96、 配列番 号 1 15) (以下、 FKRPと呼ぶ。 ；） 、 ZNF 37A (NCB I ID : AJ 492195、配列番号 97、配列番号 1 16) 、 FL J 4,5802 (N CB I ID : AK 1 27702、 配列番号 98、 配列番号 117) 、 K I AA0293 (NCB I I D : AB 006631、 配列番号 99、 配列番 号 1 18) 、 T r a n s c r i p t i o n f c t o r 20 (NCB I I D : NM— 005650、 配列番号 100、 配列番号 1 19) 、 T e t r a t r i c o p e p t i d e r e p e a t 3 (NCB I I D : D.830 77、 配列番号 101、 配列番号 1 20) 、 BAP 28 (NCB I I D : XM— 375853. 1、 配列番号 102、 配列番号 121) (以下、 B A P 28. 1と呼ぶ。 ） および BAP 28 (NCB I I D ： XM一 3758 53 1. 2、 配列番号 126、 配列番号 i 27) (以下、 BAP 28. 2と 呼ぶ。 ） 。 以上のクローンを S— 100 ]3結合蛋白質として同定した。
実施例 2 ： S i RNAを用いた S -100 結合蛋白質の機能解析
10 %ゥシ胎児血清を含有したダノレべッコ改変培地で培養した U 373 M G細胞を 1ゥエルあたり 7. 5 X 104個で 24穴プレートに播種し、 37°C でー晚培養した。 次に、 陰性対象、 ： DKlFZ p 45 1 G202、 力テェン結 合蛋白質、 DKFZ p 761H0421、 CG I— 043、 POGZ l、 C UB/S u s h i l、 FL J 1 2587、 および MGC 1 5730の各 S i RNAは公知の方法に従って細胞に導入した。 使用した S i RNAのセンス 鎖の配列を以下 示す。
陰性対象：
5' -GCG CGC UUU GUA GGA UU C G d T d T- 3 ' ' (配列番号 74 )
カテニン結合蛋白質：
5 ' 一 GAG UAC GUG AUG CCC UUA C dTdT— 3' (配列番号 75)
CG I -043 ：
5' -GAC UGG ACA GCA UCG UUG GdTdT— 3' (配列番号 76)
DKFZ 761H042
5 ' -GUA CUA CCA UGC UAA GAA C dT dT- 3' (配列番号 77)
POGZ 1,：
5 ' -GCU GCC ACU GUG GAA UCU GdT dT- 3' (配列番号 78)
CUB/S u s h i 1 ：
5 ' -GCU CCA UGU GGU GGA CAU C dT dT— 3' (配列番号 79)
FL J 12587 :
5 ' -GGA CAC ACU GCU GGA CCU C dTdT- 3' (配列番号 80)
MGC 15730 :
55 -GUG UAA CUU CAA GAC AGA UdT dT— 3， （配列番号 81)
D FZp 451G202
5 ' 一 GGA GCC UAA UGU CCA GUU GdT dT— 3 ' (配列番号 128)
遺伝子導入終了後、 1.0%ゥシ胎児血清を含有したダルベッコ改変培地に 交換し、 37 °Cで 24時間培養した。 次に無血清のダルべッコ改変培地に交 換し、 24時間培養を行なった後、 10 /zmo 1ZLのカルボキシメチル化 100 βを加えた無血清のダルベッコ改変培地に交換した ώ 24時間 後の培養上清を回収し、 EL I SAによって MCP— 1の定量を行なった。 陰性対象または S— 100 j3結令蛋白質の S i RN Aを導入した状態で、 カルボキシルメチル化 S— 1ひ 0 ]3刺激をし、 産生される MC P— 1量を測 定した結果を表 1に示す。 カテニン結合蛋白質、 DKFZ p 76 1H042 l、 POGZ l、 CUB/S u s h i , および CG I— 043は、 MCP ― 1の産生を抑制した。 一方、 DKFZ p 451G202、 F L J 1258 7、 および MGC 15730は、 MC P— 1の産生を增強した。 表 1
Figure imgf000033_0001
(陰性対象を 100%とした時の、 MCP- 1の産生量を％で示した。 （n=4)) 実施例 3 ：強制発現系を用いた S— 100 /3結合蛋白質の機能解析
10 %ゥシ胎児血清を含有したダルべッコ改変培地で培養した U 373 M G細胞を 1ゥエルあたり 7. 5 X 104個で 24穴ブレートに播種し、 37°C でー晚培養した。 次に、 発現ベクターに BAP 28. 2の全長オープンリー ディングフレーム（配列番号 127 :塩基番号 1〜 5190 )を組み込んだ。 2005/008471
作製したべクターはリポフエクションで細胞に導入した。
遺伝子導入終了後、 10%ゥシ胎児血清を含有したダルベッコ改変培地に 交換し、 37 °Cで 24時間培養した。 次に無血清のダルベッコ改変培地に交 換し、 48時間培養を行なった後、 10 /zmo 1 ZLのカルボキシメチル化 S— 100 ]3を含んだ無血清のダルべッコ改変培地に交換した。 24時間後 の培養上清を回収し、 EL I SAによって培養上清中の M—CP— 1、 I L一 6、 および I L— 8の定量を行なった。
陰性対象または S— 100 iS 合蛋白質を強制発現した状態で、 カルボキ シルメチル化 S-100 ;3で刺激をし、 産生される MC P— 1、 I L一 6、 および I L一 8量を測定した結果を表 2〜 5に示す。 FL J 12587、 お よび MG C 1 5730は MC P— 1の産生を抑制した。 また、 B A P 28. 2は MCP— 1、 I L— 6、 および I L— 8の産生を増強した。
表 2
Figure imgf000034_0001
(陰性対象を 100%とした時の、 IL- 6の産生量を0 /0で示した。 （n=4)) 表 5
Figure imgf000035_0001
(陰性対象を 100%とした時の、 IL- 8の産生量を％で示した。 (n=4)) 実施例 4 ： RT— PCR法を用いた疾患組織での S— 100 /3結合蛋白質の 発現解析
ヒ ト t o t a l RNA 1 gより公知の方法に従って cDNAを調製 した。 用いた RNAは、 To t a l RNAはヒト健常人黒質 （Amb i o n社） 、 ヒ トパーキンソン病黒質 （Amb i o n社） 、 ヒト健常人大脳皮質 (Amb i o n社）、 ヒト筋萎縮性側索硬化症大脳皮質（Amb i o n社）、 およぴヒトアルツハイマー病大脳皮質 （B i o c h a i n社） である。 c D NA調製後、 カテニン結合蛋白質、 CG 1—043、 POGZ l、 CUB/ Su s h i 1、 DKFZ p 761H0421s FL J 12587, および M GC 1 5730は、 cDNA領域をPCRし、 ァガロースゲルに電気泳動を 行なうことにより半定量を行なった。 P C Rに使用したプライマーを以下に 示す。
カテニン結合蛋白質：
5 ' 一 ATG GCT TCA GAA GAG CTA CAG AA A GAT CTA- 3 (配列番号 129)
5 ' -TCA AAA TTC CGT GTC TC C TTT GG C TTG CTT— 3 (配列番号 130)
CG I— 043 ：
5 ' 一 TTC AAC ACT ATG GAA GAT TTC TT A C CG GAC— 3 (配列番号 131)
5 ' -CCT CTT CAT TTA CTT CAA TCA GG T TTG CAT- 3 (配列番号 132)
POGZ 1 ： 2005/008471
5 ' 一 TGT GTC GCT ATA GCA CCT GCT GT T CTC GAG— 3 (配列番号 82)
5， -
—3， （配列番号 83)
CUB/S u s h i 1 ：
5 ' 一 GGA GGA GAT TCC . AGT CGC TGC T C C TGC TTC一 3' (配列番号 133)
5 ' 一 GTG GCC TTC CAA GAT GTA GCC AG G GAG G C A— 3 ' (配列番号 134)
DKF Z p 761 HO 42
5 ' -CTT TGC TGT TAG CCA GTT TGG TT G TGC CAC- 3 ' (配列番号 135)
5 ' -AGA TCT ACA GGG AGG CTA AAC TT G AGG CTG- 3 ' (配列番号 136)
FL J 12587 ：
5 ' 一 ACC CCT CGG AGA ACA GGT GGA CG A TCA AGG- 3 ' (配列番号 137)
5 ' —TGC TCC T'CA CGC GGG CAG GTG CT T CCA G G T - 3 ' (配列番号 138)
MGC 15730 :
5 ' 一 CTG GAG GAA AAC CAG CAC CCA TG G TTT ATT— 3， (配列番号 139)
5 ' 一 TCA CTG TCA GGG CGA GCA CCA AG G TGA GCC- 3' (配列番号 140)
種々の疾患組織における S— 100 /3結合蛋白質の mRNA発現量の比較 をした結果、 ヒトパーキンソン病黒質において F L J 12587の mRNA 量の減少が認められた。 また、 ヒト筋萎縮性側索硬化症大脳皮質において、 JP2005/008471
DKFZ p 761H0421の mRNA量の増加が認められた。 さらに、 ヒ トァルツハイマー病大脳皮質において、 POGZ l、 DKFZp 76 1 HO 421、 および MGC 1 5730の mRNA量の増加が認められた （図 1〜 -4) 。
実施例 5 ： S i R Aを用いた S_ 100 J3結合蛋白質 BAP 28. 2およ び FKRPの機能解析
10%ゥシ胎児血清を含有したダルベッコ改変培地で培養した U373M G細胞を 1ゥエルあたり 4X 104個で 24穴プレートに播種し、 37°Cで一 晚培養した。 次に、 S i RN Aは公知の方法に従って細胞に導入した。 使用 した S i RNAのセンス鎖の配列を以下に示す。
陰性対象：
5 ' -GCG CGC UUU GUA GGA UUC GdTdT— 3' (配列番号 74)'
BAP 28. 2 ：
5 ' -GCA GAU UGA GAA GAA CUG GdTdT— 3' (配列番号 122)
FKRP ：
5 ' 一 GCA AC C ACU UGC ACG UGG AdTdT— 3， ' (配列番号 123)
遺伝子導人終了後、 10%ゥシ胎児血清を含有したダルべッコ改変培地に 交換し、 37 °Cで 24時間培養した。 次に無血清のダルべッコ改変: if地に交 換し、 24時間培養した後、 1Ό /zmo 1ZLのカルポキシメチル化一 S— 100 j8または、 0. 3 n g/niLリコンビナント I L一 1 ]3を加えた無血 清のダルベッコ改変培地に交換した。 24時間後の培養上清を回収し、 EL I SAによって培養上清中の MCP— 1,を定量した。
陰性対象または S— 100 ]3結合蛋白質の S i RNAを導入した状態で、 カルボキシルメチル化 S— 100 ]3で刺激をし、 産生される MC P— 1量を T/JP2005/008471
測定した結果を表 6に示す。 BAP 28. 2、 および FKRPにおいて、 M CP- 1の産生を抑制した。 陰性対象または S— 100 β結合蛋白質の S i RNAを導入した状態で、 リコンビナント I L一 1 ]3で刺 ¾をし、 産生され る MC P— 1量を測定した結果を表 7に示す。 BAP 28..2は、 I L一 1 ；8刺激による MCP— 1の産生を^ Ϊ1制しなかった。
Figure imgf000038_0001
(リコンビナント I L— 1 ]3刺激 (n=4)) 実施例 6 ： RT— PCR法を用いた疾患組織での S— 100 ]3結合蛋白質 F KR.Pの発現解析
ヒ ト t o t a l RNA 1 μ gから公知の方法に従って c D N Aを調製 した。 '用いた RNAは、 ヒト健常人大脳皮質 （Amb i o n社） 、 ヒ ト 筋 萎縮性側索硬化症 大脳皮質 （Amb i o n社） 、 およびヒトァルツハイマ 一病大脳皮質 （B i o c h a i n社） である。 cDNA調製後、 PCRを行 ない、 ァガロースゲルに電気泳動を行なうことにより半定量を行なった。 ま た、 FKRPの PCRには下記のプライマーを使用した。
55 -GGT GCA GCT G C T GGA CTT GAC CT T C— 3 , (配列番号 124)
5 ' -TCA GCC GCT TCC CGT CAG ACT C A G C一 3， （配列番号 1 25) JP2005/008471
種々の疾患組織における S— 100 i3結合蛋白質の： mRNA発 ¾量の比較 をした結果、 ヒト筋萎縮性側索硬化症大脳皮質およびヒトアルツハイマー病 大脳皮質において、 FKRPの mRNA量の増加が認められた （図 5) 。 実施例 7 ： BAP 28タンパクと S— 100 ]3タンパクとの結合評価 ' CHO細胞を 10 %ゥシ胎児血清およびヒポキサンチン チミジンを含有 したダルべッコ改変培地で培養した後： 7. 5X 104個で 24穴プレ トに 播種した。 37。Cでー晚培養した後、 BAP 28. 2の全長オープンリーデ イングフレーム （配列番号 127 ： 1〜5190) を組み込んだ発現べクタ • をリボフ クシヨンによって細胞に導入した。
遺伝子導入終了後、 10%ゥシ胎児血清およびヒポキサンチン チミジン を含有したダルベッコ改変培地に交換し、 37°Cで 72時間培養した。 細胞 をリン酸緩衝液で洗浄後、 ゼルスクレーパーにより細胞を回収した。 回収し た細胞は遠心濃縮後、 超音波で破砕し、 l O/i gZmLの S— 100 i3およ び lmMカルシウムを含むトリス緩衝液に懸濁して、 4°Cで 2時間インキュ ベーシヨンをした。 次に、 プロテイン Gァガロースに添加し、 4°Cで 2時間 インキュベーションした。 遠心後、 上清を回収しプロテイン Gァガロースへ の非特異的吸着タンパクを除去した。次に、これらを S—100 ]3抗体と 4°C で 16時間インキュベーションした。 続いてプロテイン Gァガロースを添加 し、 4°Cで 2時間インキュベーションした。 プロテイン Gァガロースは、 1 mMカルシウムを含むトリス緩衝液で洗浄した後、 SDS— PAGEを行な つた。 ゲルを銀染色した結果、 S— 100 抗体で B A P 28. 2が共沈す ることが確認された。 産業上の利用可能性
本発明に係る蛋白質は、 S— 100 /3との結合活性を有し、 さらに、 S— 100 の情報伝達に関与しているので、 S— 100 ]3との結合を阻害する 物質や S— 100 /3の情報伝達を阻害する物質のスクリーユングに有用であ 05 008471
る。 また、 本発明のスクリーニング方法により得られる物質、 本発明に係る 蛋白質の部分ペプチド、 本発明に係る蛋白質と S— 1 O O iSの結合を阻害す る抗体、 およぴ本発明に係る蛋白質をコードするポリヌクレオチドと相補的 な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドは、 S— 1 0 0 J3が関与する疾患の予防および または治療に有用である。 また、 本発明に 係る蛋白質またはその部分ぺプチドに対する抗体、 または本発明に係る D N Aまたはそのアンチセンス D NAは、 上記疾患の診断に有用である。

Claims

請 求 の' 範 囲
1. S— 1 00 ]3結合蛋白質と S— 1 00 βとの結合を阻害する物質のス クリーニング方法。
2. S— 1 00 結合蛋白質と S— 1 00 |3との結合量を被験物質非存在 下と存在下とで比較する請求の範囲 1記載のスクリ一ユング方法。
3. S— 1 00 J3結食蛋白質と S— 1 00 を被験物質の非存在下と存在 下で接触させ、 それぞれの場合の S— 1 00.i3結合蛋白質と S— 1 00 ;3の 結合量を測定し、 比較する請求の範囲 1記載のスクリ一ユング方法。
4. S— 1 00 ]3結合蛋白質が、 配列番号 1乃至 3 6、 84乃至 1 0 2お よび 1 26から選択'される 1つのアミノ酸配列もしくはその配列と実質的に 同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドである請求の範 囲 1記載のスクリーニング方法。
5. S- 1 00 ]3結合蛋白質が、 配列番号 1 2 6で示されるァミノ酸配列 もしくはその配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその 部分ぺプチドである請求の範囲 1または 4記載のスクリ一ユング方法。
6. EL I SA、 免疫沈降アツセィ、 蛍光共鳴エネルギー転移、 バイオル ミネッセンス共鳴エネルギー転移、 ルシフェラーゼアツセィ、 レポ ターァ ッセィまたはタンパク再構成ァッセィを用いる請求の範囲 1記載のスクリ一 ユング方法。
7. S- 1 00 ]3結合蛋白質と S— 1 00 |3を被験物質の非存在下と存在 下で接触させ、 それぞれの場合の S— 100 )3結合蛋白質と S— 10 Q βの 結合量を EL I SA、 免疫沈降アツセィ、 蛍光共鳴エネルギー転移、 バイオ ルミネッセンス共鳴エネルギー転移、 ルシフェラーゼアツセィ、 レポーター 了ッセィまたはタンパク再構成ァッセィで測定し比較する請求の範囲 3記載 のスクリーニング方法。
8. S— 100 /3結合蛋白質と S— 100 /3が結合することで誘発される 因子の産生量を変化させる物質のスクリーニング方法。
9. S—100 ]3結合蛋白質と S— 100 ]3が結合することで誘発される 因子の産生量を被験物質非存在下と存在下とで比較する請求の範囲 8記載の スクリーニング方法。
10. S— 100 ]3結合蛋白質と S— 100 βを被験物質の非存在下と存 在下で接触させ、 それぞれの場合において誘発される因子の産生量を測定し 比較する請求の範囲 9記載のスクリ一ユング方法。
1 1. S— 100 結合蛋白質が、 配列番号 1乃至 36、 84乃至 102 および 126から 1つ選択されるアミノ酸配列もしくはその配列と実質的に 同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分べプチドである請求の範 囲 8.記載のスクリ一二ング方法。
12. S— 100 結合蛋白質が、 配列番号 126で示されるアミノ酸配 列もしくはその配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはそ の部分ぺプチドである請求の範囲 8または 1 1記載のスクリ一ユング方法。
13. EL I S Αを用いる請求の範囲 8記載のスクリーニング方法。
14. 配列番号 1 26で示されるァミノ酸配列もしくはその配列と実質的 に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドを産生する能 力を持つ細胞に S— 100 を接触させ、 被験物質の非存在下と存在下にお いて誘発される MCP— 1の産生量を EL I SAで測定し、 比較する請求の 範囲 10記載のスクリ一ユング方法。
15. S— 100 結合蛋白質と S— 100 βとの結合を阻害する物質。
16. S- 100 jS結合蛋白質と S— 100 J3が結合することで誘発され る因子の産生量を変化させ 物質。
17. S- 100 ]3結合蛋白質と S— 100 ]3が結合することで誘発され る因子が MCP— 1、 I L— 6、 I L一 8、 Α]3、 または C a 2+である請求 の範囲 16記載の物質。 ，
18. 配列番号 1乃至 36、 84乃至 102および 126から選択される アミノ酸配列もしくはその配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有する蛋白 質またはその部分ペプチドである請求の範囲 1 5または 1 6記載の物質。
19. 配列番号 1乃至 36、 84乃至 102、 および 126から選択され るアミノ酸配列もしくはその配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有する蛋 白質またはその部分ペプチドの抗体である請求め範囲 15または 16記載の 物質。
20. S- 100 J3結合蛋白質の発現を抑制する物質。
2 1 . 配列番号 1乃至 3 6、 8 4乃至 1 0 2、 および 1 2 6から選択され るアミノ酸配列もしくはその配列と実質的に同一のァミノ酸配列を有する蛋 ' 白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基 配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドである請求の範囲 2 0 記載の物質。
2 2 . ポリヌクレオチドが S i R NAまたはアンチセンス D NAである請 求の範囲 2 1記載の物質。 .
2 3 . 請求の範囲 1 5、 1 6および/または 2 0記載の物質を有効成分と して含有する医薬組成物。
2 4 . 神経変性疾患の予防および/または治療剤である請求の範囲 2 3記 載の医薬組成物。
2 5 . 神経変性疾患が、 パーキンソン病、 パーキンソン症候群、 線条体黒 質変性症、 ハンチントン病、 舞踏病一無定位運動症、 進行性核上麻痺、 ぴま ん性レビー小体病、 大脳皮質基底核変性症、 アルツハイマー病、 認知症 (痴呆 症)、 脊髄小脳変性症、 運動神経症、、脱髄性疾患、 脳血管障害■脳腫瘍 ·血液 量減少性ショック ·外傷性ショック ·頭部損傷およびノまたは脳脊髄外傷に 伴う神経機能障害、 感染症に伴う脳脊髄疾患、 毒物 '放射線による神経機能 障害、 精神疾患、 てんかん、 メージ症候群、 ジストニア、 ダウン症、 睡眠障 害である請求の範囲 2 4記載の医薬組成物。
2 6 . S— 1 0 0 ]3結合蛋白質と S— 1 0 0 ]3との結合を阻害する物質の スクリーユング用キット。
2 7 . 請求の範囲 1または 8記載のスクリ一ユング方法を含むことを特徴 とする S— 1 0 0 ]3結合蛋白質と S— 1 0 0 ]3との結合を阻害する物質の製 造方法。
2 8 . 請求の範囲 2 7記載の製造方法で得られた物質を用いることを特徴 とする S— 1 0 0 結合蛋白質と S— 1 0 0 J3との結合を阻害する方法。
2 9 . 哺乳動物に対して、 S— 1 0 0 ]3結合蛋白質と S— 1 0 0 との結 合を阻害する物質の有効量投与することを特徴とする神経変性疾患の予防お よび Zまたは治療方法。
3 0 . 神経変性疾患の予防および Zまたは治療剤を製造するための S _ 1 0 0 結合蛋白質と S— 1 0 0 ^との結合を阻害する物質の使用。
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