WO2005106020A1 - Verfahren zur vorhersage des individuellen krankheitsverlaufs bei sepsis - Google Patents

Verfahren zur vorhersage des individuellen krankheitsverlaufs bei sepsis Download PDF

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WO2005106020A1
WO2005106020A1 PCT/EP2005/000336 EP2005000336W WO2005106020A1 WO 2005106020 A1 WO2005106020 A1 WO 2005106020A1 EP 2005000336 W EP2005000336 W EP 2005000336W WO 2005106020 A1 WO2005106020 A1 WO 2005106020A1
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sepsis
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patients
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PCT/EP2005/000336
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Stefan Russwurm
Hans-Peter Deigner
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Sirs-Lab Gmbh
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to the use of gene expression profiles obtained in vitro from a patient sample for the creation of criteria for predicting an individual course of the disease of a sepsis, a method for in vitro measurement of such gene expression profiles according to claim 10 and the use of the gene expression profiles and / or of those used for this Probes for switching off and / or for changing the activity of target genes and / or for determining the gene activity for screening active substances against sepsis and / or for evaluating the action against sepsis and / or the active substance quality and / or the active substance integrity in cellular and cell-free sepsis model systems and in sepsis animal models.
  • the present invention relates to new possibilities for predicting the probability of survival and the development of fatal complications of sepsis patients, which can be derived from experimentally verified findings in connection with the occurrence of changes in gene activities (transcription) in patients with sepsis.
  • SIRS and sepsis are very common in patients in intensive care units and significantly contribute to mortality [2 -3].
  • Mortality is approximately 20% in SIRS, approximately 40% in sepsis and increases with the development of multiple Organ dysfunction down to 70-80% [4-6].
  • the morbidity and lethality contribution of SIRS and sepsis is of interdisciplinary clinical medical importance, because it increasingly increases the success of the treatment of the most advanced therapeutic methods in numerous medical specialties (e.g. traumatology, neurosurgery, cardiac / lung surgery, visceral surgery, transplantation medicine, hematology / oncology, etc.
  • sepsis is a disease that is caused by pathogenic microorganisms.
  • molecular control and regulation options close to the site of infection develop a generalized inflammation reaction that encompasses the whole organism and is responsible for the clinical symptoms / diagnostic criteria / SIRS criteria proven by the doctor according to [1].
  • This generalized, inflammatory condition (defined as sepsis according to [1]) is accompanied by signs of activation of various cell systems (endothelial cells, but also all leukocytic cell systems and especially the monocyte / macrophage system).
  • SIRS is the systemic response of the inflammatory system to an infectious or non-infectious stimulus
  • at least two of the following clinical criteria must be met: fever> 38 ° C or hypothermia ⁇ 36 ° C, leukocytosis> 12G / I or leukopenia ⁇ 4G / I or a left shift in the differential blood count, a heart rate of over 90 / min, a tachypnea> 20 breaths / min or a PaC02 (partial pressure of carbon dioxide in the arterial blood) ⁇ 4.3 kPa.
  • Sep Clinical conditions are defined in which the SIRS criteria are met and an infection is causally proven or at least very likely. Severe sepsis is characterized by the additional occurrence of organ malfunctions.
  • Sepsis is the clinical result of complex and highly heterogeneous molecular processes, which are characterized by the inclusion of many components and their interactions at every organizational level of the human body: genes, cells, tissues, organs.
  • the complexity of the underlying biological and immunological processes has generated many types of research studies that span a wide range of clinical aspects.
  • One of the results to be recognized from this was that the evaluation of new sepsis therapies is made more difficult by relatively unspecific, clinically-based inclusion criteria which do not adequately reflect the molecular mechanisms [12].
  • ESICM European Society of Intensive Care Medicine
  • the aim is to establish a system for assessing the severity of sepsis, which enables patients to be classified based on their individual patient response based on their predisposing conditions, the type and extent of the infection, the type and severity of the host response, and the degree of accompanying organ dysfunction .
  • the system described is called PIRO, abbreviated to the English terms for "predisposition”, “insult infection”, “response” and "organ dysfunction”.
  • the individual probability of survival and potential response to therapy can then be derived from this [23].
  • non-infectious conditions that are currently subsumed under [1] under the term SIRS should be classified more precisely according to the individual severity of the SIRS.
  • Biomarkers are also sought for this, which reflect the severity of the SIRS also at the molecular level and enable a clear differentiation from infectious states (currently classified as sepsis according to [1]). Similar stages are already being used successfully by other medical disciplines, for example to classify the various stages of disease in the field of oncology (TNM system, [24]).
  • microarray technology now enable the skilled person to compare 10,000 or more genes and their gene products at the same time.
  • the use of such microarray technologies can now provide information on the status of health, regulatory mechanisms, biochemical interactions and signal transmission networks. Improving understanding of how an organism responds to infections should facilitate the development of enhanced detection, diagnosis, and treatment modalities for sepsis disorders.
  • Microarrays are derived from "Southern blotting" [26], which represents the first approach to immobilize DNA molecules in a spatially responsive manner on a solid matrix.
  • the first microarrays consisted of DNA fragments, often with an unknown sequence, and were spotted on a porous membrane (usually nylon), cDNA, genomic DNA or plasmid libraries were routinely used and the hybridized material was labeled with a radioactive group [27-29].
  • a radioactive group usually used.
  • the starting point for the invention disclosed in the present patent application is the knowledge that the gene activities of surviving sepsis patients differ from gene activities of deceased sepsis patients. These differences in gene activity allow predictions to be made about the likelihood of survival and future development of fatal complications in sepsis patients based on gene expression. This distinction is not possible with the protein markers previously used for diagnosis (e.g. procalcitonin (PCT) or C-reactive protein (CRP)) clinical parameters, but very much for the initiation of specialized intensive medical therapy and thus for improving the individual prognosis for survival meaningful.
  • PCT procalcitonin
  • CRP C-reactive protein
  • the present invention is therefore based on the object of making it possible to predict the future course of the disease in sepsis using gene expression profiles.
  • the present invention relates to the use of gene expression profiles obtained in vitro from a patient sample for the Creation of criteria for predicting an individual course of the disease in sepsis.
  • a preferred embodiment of the invention relates to the use of the gene expression profiles obtained for determining the likelihood of survival in sepsis.
  • the present invention serves for the therapy-accompanying assessment of the course of sepsis and the classification of sepsis patients.
  • the present invention is also useful as an inclusion or exclusion criterion for patients with sepsis in phase 2-4 clinical studies.
  • a preferred embodiment of the invention lies in the creation of gene activity data for further electronic processing and for the production of software for describing the individual prognosis of a sepsis patient, for diagnostic purposes and / or
  • the present invention can also be used to manufacture expert systems and / or to model cellular signaling pathways.
  • a plurality of specific genes and / or gene fragments are used, which are selected from the group consisting of SEQ-ID No. 1 to SEQ-ID No. 247 and gene fragments thereof with at least 5-2000, preferably 20-200, more preferably 20-80 nucleotides.
  • SEQ-ID No. 1 to SEQ-ID No. 247 are also included in the scope of the present invention and are disclosed in detail in the attached 56-soap, 247-sequence sequence, which is therefore part of the description of the present invention and is therefore also part of the disclosure of the invention.
  • This sequence listing also includes an assignment of the individual sequences with sequence ID: 1 to sequence ID: 247 to their GenBank Accession No. (Internet access via http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
  • the present invention relates to the use of gene expression profiles obtained in vitro from a patient sample and / or of the probes used for this purpose, which are selected from the group consisting of SEQ-ID No. 1 to SEQ-ID No. 247 and gene fragments thereof with at least 5-2000, preferably 20-200, more preferably 20-80 nucleotides, for switching off and / or for changing the activity of target genes and / or for determining the gene activity for screening active substances against sepsis and / or for evaluating the Effect against sepsis and / or the drug quality and / or drug integrity in cellular and cell-free sepsis model systems and in sepsis animal models.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that a specific gene and / or gene fragment is selected from the group consisting of SEQ-ID No. 1 to SEQ-ID No. 247 and gene fragments thereof with at least 5-2000, preferably 20-200, more preferably 20-80 nucleotides.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that at least 2 to 100 different cDNAs are used.
  • Another embodiment of the invention is characterized in that at least 200 different cDNAs are used.
  • Another embodiment of the invention is characterized in that at least 200 to 500 different cDNAs are used.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that at least 500 to 1000 different cDNAs are used.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that at least 1000 to 2000 different cDNAs are used.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the genes or gene fragments listed in claim 11 and / or sequences derived from their RNA are replaced by synthetic analogs, aptamers and peptide nucleic acids.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the synthetic analogs of the genes comprise 5-100, in particular approximately 70 base pairs.
  • Another embodiment of the invention is characterized in that the gene activities are determined by means of hybridization methods. Another embodiment of the invention is characterized in that the gene activity is determined by means of microarrays.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the gene activity is determined by hybridization-independent methods, in particular enzymatic and / or chemical hydrolysis and / or amplification methods, preferably PCR, subsequent quantification of the nucleic acids and / or of derivatives and / or fragments thereof ,
  • sample is selected from: body fluids, in particular blood, liquor, urine, ascites fluid, seminal fluid, saliva, punctate; Cell content or a mixture thereof.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that cell samples are optionally subjected to a lytic treatment in order to release their cell contents.
  • Marker genes in the sense of the invention are understood to be all derived DNA sequences, partial sequences and synthetic analogs (for example peptido nucleic acids, PNA).
  • the description of the invention relating to the determination of gene expression at the RNA level does not constitute a restriction, but only an exemplary application.
  • RNA from cell lines SIG-M5 served as control samples. All patient samples were co-hybridized with the control sample on a microarray.
  • RNA of the samples was isolated using the PAXGene Blood RNA Kit in accordance with the manufacturer's instructions (Qiagen).
  • the cells were inoculated with 2 ml of Iscove's medium (Biochrom AG) supplemented with 20% fetal calf serum (FCS).
  • FCS fetal calf serum
  • the cell cultures were then incubated for 24 hours at 37 ° C. under 5% CO 2 in 12-well plates.
  • the contents of 18 wells were then divided into 2 parts, each with the same volume, so that finally 3 plates of the same format (36 wells in total) were available.
  • the cultivation was then continued for 24 hours under the same conditions.
  • the resulting cultures of 11 wells from each plate were then combined and centrifuged (1000 ⁇ g, 5 min, room temperature). The supernatant was discarded and the cell pellet was dissolved in 40 ml of the above medium.
  • the subsequent cell count gave the following result: 1, 5 x 107 cells per ml, 10 ml total volume, total number of cells: 1, 5 x 108. Since the number of cells was not yet sufficient, 2.5 ml of the above cell suspension in 30 ml of the Pour the above medium into a 250 ml (75 cm2) flask (4 flasks in total). After 72 hours of incubation, 20 ml of fresh medium was added to each flask. After the following 24 hour incubation the cells were counted as described above, which gave a total cell count of 3.8 ⁇ 10 8 cells. In order to achieve the desired cell count of 2 x 106 cells, the cells were resuspended in 47.5 ml of the above medium in 4 flasks. After an incubation period of 24 hours, the cells were centrifuged and washed twice with phosphate buffer without Ca 2+ and Mg 2+ (Biochrom AG).
  • Total RNA is isolated using the NucleoSpin RNA L Kit (Machery & Nagel) according to the manufacturer's instructions. The procedure described above was repeated until the required number of cells was reached. This was necessary to achieve the required amount of 6 mg of total RNA, which corresponds to an efficiency of 600 ⁇ g RNA per 108 cells.
  • the complementary cDNA was then produced from the total RNA of the patient and control samples by means of reverse transcription with substitution of the dTTP fraction by synthesized aminoallyl-deoxyuridine triphosphate (AA-dUTP).
  • AA-dUTP synthesized aminoallyl-deoxyuridine triphosphate
  • the RNA / cDNA complex was converted into single-strand cDNA by RNA hydrolysis.
  • the cDNA samples were then labeled with the fluorescent dyes Cy3 and Cy5 (Amersham) by chemical binding to AA-dUTP.
  • a microarray from SIRS-Lab was used for the hybridization of the samples. 5308 different polynucleotides, each with a length between 55-70 base pairs, are immobilized on the microarray used. Each polynucleotide represents a human gene. The spots, including a large number of different control spots, were immobilized within 28 subarrays, each subarray being arranged in a grid of 15x15 spots.
  • the hybridization was carried out using the hybridization station HS 400 (Tecan) according to the manufacturer's instructions.
  • the hybridization solution consisted of 3.5 x SSC (1xSSC contains 150 mM NaCI and 15 mM sodium citrate), 0.3% SDS, 25% formamide, each 0.8 ⁇ g / ⁇ l cot-1 DNA, yeast tRNA and polyA and the respective cDNA samples.
  • the arrays were hybridized at 42 ° C for 10.5 hours.
  • the subsequent washing procedure follows the following program: adding washing buffer I (2xSSC, 0.003% SDS) to the hybridization chamber, washing for 1.5 minutes at room temperature, adding washing buffer II (1xSSC) in the hybridization chamber, washing with washing buffer II for 1.5 minutes Room temperature, addition of wash buffer III (0.2xSSC) in the hybridization chamber, washing with wash buffer III for 1.5 minutes at room temperature.
  • the surface of the microarrays was then dried under nitrogen at a pressure of 2.5 bar for 2.5 minutes at 30 ° C.
  • the hybridization signals of the processed microarrys were then read using the GenePix 4000B (Axon) scanner and the expression ratios of the differentially expressed genes were determined using the GenePix Pro 4.0 (Axon) software.
  • the average intensity of a spot was determined as the median value of the associated spot pixels.
  • the median of the pixels of the local background was subtracted from the median of the spot pixels.
  • the signals were transformed using hyperbolic arc sinus. The normalization took place according to the approach of Huber et al. [39].
  • the additive and multiplicative bias within a microarray was estimated from 70% of the available gene samples. For the analysis, the transformed relative ratios of the signals of the patient samples against the control were calculated.
  • the two-tailed two-sample Student test per gene was used for the comparison. Both samples contained the values of the patient groups surviving and non-surviving patients. For the selection of the differentially expressed genes, the associated p-value and the number of nonexistent values were evaluated.
  • the associated p-value for the group of selected genes was less than 0.05, with at least 5 evaluable signals per patient group being included in the evaluation.
  • the level of expression ratio of each gene was the criterion for sorting the examined genes. Of interest were the genes that were most overexpressed or underexpressed between the surviving and deceased patients.
  • Table 3 Significantly reduced gene activities in samples from surviving patients with sepsis according to [1], shown as their relative relationship to the corresponding gene activities from non-surviving patients with sepsis according to [1]
  • GenBank Accession Numbers listed in Tables 2 and 3 are each a sequence ID in the 56-page sequence listing attached to this application (Sequence ID: 1 to Sequence ID: 247).
  • Beer DG et al., (2002) Gene-expression profiles predict survival of patients with lung adenocarcinoma. Nature Medicine 8: 816-24

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen für die Erstellung von Kriterien für die Vorhersage eines individuellen Krankheitsverlaufs bei Sepsis. Die Erfindung ist ferner nützlich für die Bestimmung der Überlebenswahrscheinlichkeit bei Sepsis, die therapiebegleitende Verlaufsbeurteilung von Sepsis sowie für die Klassifizierung von Sepsispatienten.

Description

Beschreibung
Verfahren zur Vorhersage des individuellen Krankheitsverlaufs bei Sepsis.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen für die Erstellung von Kriterien zur Vorhersage eines individuellen Krankheitsverlaufs einer Sepsis, ein Verfahren zur in vitro Messung derartiger Genexpressionsprofile gemäß Anspruch 10 sowie die Verwendung der Genexpressionsprofile und/oder von den hierfür verwendeten Sonden zum Ausschalten und/oder zur Aktivitätsveränderung von Zielgenen und/oder zur Bestimmung der Genaktivität zum Screening von Wirkstoffen gegen Sepsis und/oder zur Beurteilung der Wirkung gegen Sepsis und/oder der Wirkstoffqualität und/oder der Wirkstoffintegrität in zellulären und zellfreien Sepsis- Modellsystemen und in Sepsis-Tiermodellen.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung neue Möglichkeiten der Vorhersage der Überlebenswahrscheinlichkeit und der Entwicklung tödlicher Komplikationen von Sepsispatienten, die sich aus experimentell abgesicherten Erkenntnissen im Zusammenhang mit dem Auftreten von Änderungen der Genaktivitäten (Transkription) bei Patienten mit Sepsis ableiten lassen.
Trotz Fortschritten im pathophysiologischen Verständnis und der supportiven Behandlung von Intensivpatienten sind generalisierte inflammatorische Zustände wie SIRS und Sepsis, definiert entsprechend der ACCP/SCCM Konsensuskonferenz aus dem Jahre 1992 [1], bei Patienten auf Intensivstationen sehr häufig auftretende und erheblich zur Sterblichkeit beitragende Erkrankungen [2-3]. Die Sterblichkeit beträgt ca. 20 % bei SIRS, ca. 40 % bei Sepsis und steigt bei Entwicklung von multiplen Organdysfunktionen bis auf 70-80 % an [4-6]. Der Morbiditäts- und Letalitätsbeitrag von SIRS und Sepsis ist von fachübergreifender klinischmedizinischer Bedeutung, denn dadurch werden in zunehmendem Maße die Behandlungserfolge der fortgeschrittensten Therapieverfahren zahlreicher medizinischer Fachgebiete (z.B. Traumatologie, Neurochirurgie, Herz- /Lungenchirurgie, Viszeralchirurgie, Transplantationsmedizin, Hämatologie/ Onkologie, etc.) gefährdet, denen ohne Ausnahme eine Erhöhung des Krankheitsrisikos für SIRS und Sepsis immanent ist. Dies drückt sich auch im kontinuierlichen Anstieg der Häufigkeit der Sepsis aus: zwischen 1979 und 1987 um 139% von 73,6 auf 176 Krankheitsfälle je 100.000 Krankenhauspatienten) [7]. Die Senkung der Morbidität und Letalität einer Vielzahl von schwer erkrankten Patienten ist daher an einen gleichzeitigen Fortschritt in der Vorbeugung, Behandlung und insbesondere der Erkennung und Verlaufsbeobachtung der Sepsis und schweren Sepsis gebunden.
Auf molekularer Ebene wird als Sepsis ein Krankheitsbild bezeichnet, welches durch pathogene Mikroorganismen verursacht wird. Auf dem Boden der Erschöpfung Infektionsort-naher, molekularer Kontroll- und Regulationsmöglichkeiten entwickelt sich eine generalisierte, den ganzen Organismus umfassende Entzündungsreaktion, die für die vom Arzt nachgewiesenen klinischen Symptome/Diagnosekriterien/SIRS-Kriterien nach [1] verantwortlich ist. Dieser generalisierte, inflammatorische Zustand (als Sepsis nach [1] definiert) geht mit Zeichen der Aktivierung verschiedener Zellsysteme (endotheliale Zellen, aber auch aller leukozytären Zellsysteme und vor allem des Monozyten/ Makrophagensystems) einher. Schließlich schädigen molekulare Mechanismen, die eigentlich den Wirt gegen invasive Mikroorganismen schützen sollen, dessen eigene Organe/Gewebe und tragen so entscheidend zur Entwicklung der vom Kliniker gefürchteten Organdysfunktionen bei [8-11]. Der Sepsisbegriff hat im Laufe der Zeit einen erheblichen Bedeutungswandel erfahren. Eine Infektion bzw. der dringliche Verdacht auf eine Infektion sind auch heute noch wesentlicher Bestandteil aktueller Sepsisdefinitionen. Besondere Berücksichtigung findet jedoch dabei die Beschreibung Infektionsort-ferner Organfehlfunktionen im Rahmen der inflammatorischen Wirtsreaktion. Im internationalen Schrifttum haben sich zwischenzeitlich die Kriterien der Konsensuskonferenz des „American College of Chest Physicians/Society of Critical Gare Medicine Consensus Conference (ACCP/SCCM)" aus dem Jahr 1992 am breitesten zur Definition des Sepsis- Begriffs durchgesetzt [1]. Entsprechend dieser Kriterien [1] werden die klinisch definierten Schweregrade „systemic inflammatory response syndrom" (SIRS), „Sepsis", „severe Sepsis" und „septic shock" unterschieden. Als SIRS wird dabei die systemische Antwort des inflammatorischen Systems auf einen infektiösen oder nichtinfektiösen Reiz definiert. Dazu müssen mindestens zwei der folgenden klinischen Kriterien erfüllt sein: Fieber >38°C oder Hypothermie <36°C, eine Leukozytose >12G/I oder eine Leukopenie <4G/I bzw. eine Linksverschiebung im Differentialblutbild, eine Herzfrequenz von über 90/min, eine Tachypnoe >20 Atemzüge/min oder ein PaC02 (Partialdruck des Kohlendioxid im arteriellen Blut) <4,3 kPa. Als Sepsis werden solche klinischen Zustände definiert, bei denen die SIRS-Kriterien erfüllt sind und ursächlich eine Infektion nachgewiesen wird oder zumindest sehr wahrscheinlich ist. Eine schwere Sepsis ist vom zusätzlichen Auftreten von Organfehlfunktionen gekennzeichnet. Häufige Organfehlfunktionen sind Änderungen der Bewusstseinslage, eine Oligurie, eine Laktazidose oder eine Sepsisinduzierte Hypotension mit einem systolischen Blutdruck von weniger als 90 mmHg bzw. ein Druckabfall um mehr als 40 mmHg vom Ausgangswert. Wenn eine solche Hypotension nicht durch die Verabreichung von Kristalloiden und/oder Kolloiden zu beheben ist und es zusätzlich zu einer Katecholaminpflichtigkeit des Patienten kommt, so spricht man von einem septischen Schock. Dieser wird bei etwa 20 % aller Sepsispatienten nachgewiesen.
Sepsis ist das klinische Ergebnis von komplexen und stark heterogenen molekularen Vorgängen, die gekennzeichnet sind durch eine Einbeziehung von vielen Komponenten und deren Wechselwirkungen auf jeder organisatorischen Ebene des menschlichen Körpers: Gene, Zellen, Gewebe, Organe. Die Komplexität der zugrunde liegenden biologischen und immunologischen Prozesse haben viele Arten von Forschungsstudien hervorgerufen, die einen weiten Bereich klinischer Aspekte umfassen. Eines der hieraus zu erkennenden Ergebnisse war, dass die Bewertung neuer Sepsis-Therapien durch relativ unspezifische, klinisch-basierte Einschlusskriterien, welche die molekularen Mechanismen in nicht ausreichender Weise wiedergeben, erschwert wird [12]. Gleichfalls bestehen auf Grund der mangelnden Spezifität der heutigen Sepsis- und SIRS- Diagnose beim Kliniker große Unsicherheiten, ab welchem Zeitpunkt ein Patient einer spezialisierten Therapie, beispielsweise mit Antibiotika, die ihrerseits beträchtliche Nebenwirkungen haben können, zugeführt werden soll [12]. So zeigte eine von der European Society of Intensive Care Medicine (ESICM) durchgeführte Umfrage, dass 71 % der befragten Ärzte Unsicherheit bei der Diagnosestellung einer Sepsis, trotz langjähriger klinischer Erfahrungen, hatten [22].
Bahnbrechende Entdeckungen in Molekularbiologie und Immunologie während der letzten zwei Jahrzehnte ließen ein vertieftes, mehr an den grundlegenden Mechanismen orientiertes Verständnis der Sepsis entstehen. Das dadurch entstandene Wissen um relevante Targets bildete wiederum die Basis für die Entwicklung gezielter und adjuvanter Therapiekonzepte, welche hauptsächlich auf der Neutralisierung wesentlicher Sepsismediatoren beruhen [13-16]. Eine Ursache für das Scheitern fast aller immunmodulatorischer Therapieansätze in klinischen Studien - trotz Effektivität im Tierexperiment - wird in der nur schlechten Korrelation zwischen den klinischen, eher symptomatisch orientierten Diagnosekriterien und den grundlegenden Mechanismen einer generalisierten Immunantwort gesehen [12, 17-18].
Rückblickend erstaunt dies nicht, da bereits gesunde Menschen bei alltäglichen Verrichtungen Veränderungen der Herz- bzw. Atemfrequenz aufweisen können, welche per Definition bereits die Diagnose eines SIRS zuließen. Bei Berücksichtigung unserer heutigen biomedizinischen Möglichkeiten muss es als Anachronismus erscheinen, dass jährlich 751.000 Patienten in den USA anhand o.g. ACCP/SCCM Kriterien diagnostiziert, klassifiziert und behandelt werden. Von namhaften Autoren wird deshalb schon lange kritisiert, dass zu Lasten einer verbesserten Sepsisdiagnose in der vergangenen Dekade zuviel Energie und finanzielle Ressourcen für die Suche nach einem „magic bullet" der Sepsistherapie aufgewendet wurden [19]. Auch fordern kürzlich publizierte Expertenmeinungen, dass zu einem besseren pathophysiologischen Verständnis der Sepsis eine Modifizierung der Konsensuskriterien nach [1] erforderlich ist [20-21]. Außerdem besteht unter vielen Medizinern Einigung darüber, dass die Konsensuskriterien nach [1] keiner spezifischen Definition von Sepsis entsprechen. So zeigte eine von der European Society of Intensive Care Medicine (ESICM) durchgeführte Umfrage, dass 71 % der befragten Ärzte Unsicherheit bei der Diagnosestellung einer Sepsis, trotz langjähriger klinischer Erfahrungen, hatten [22].
Aufgrund der oben genannten Probleme mit der Anwendung der Konsensuskriterien nach [1] werden unter Intensivmedizinern Vorschläge für eine sensitivere und spezifische Definitionen der verschiedenen Schweregrade der Sepsis diskutiert [2,23]. Neu ist dabei vor allem, dass molekulare Veränderungen direkt in die Beurteilung der Schwere einer Sepsis, aber auch den Einschluss in innovative Behandlungsverfahren der Sepsis (wie z.B. die Therapie mit aktiviertem rekombinanten Protein C) einbezogen werden sollen. Dieser Konsensusprozess [23], der gegenwärtig von fünf internationalen Fachgesellschaften getragen wird, ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch längst nicht abgeschlossen. Ziel ist die Etablierung eines Systems zur Schweregradbeurteilung der Sepsis, das es ermöglicht, Patienten anhand ihrer individuellen Patientenreaktion auf der Basis ihrer prädisponierenden Bedingungen, der Art und des Ausmaßes der Infektion, der Art und der Schwere der Wirtsantwort sowie des Grads der begleitenden Organdysfunktionen zu klassifizieren. Das beschriebene System wird mit PIRO, abkürzt nach den englischen Begriffen für „Predisposition", „Insult Infection", „Response" und „Organ dysfunction", bezeichnet. Davon kann dann die individuelle Wahrscheinlichkeit des Überlebens sowie des potentiellen Ansprechens auf die Therapie abgeleitet werden [23]. Gleichfalls sollen nichtinfektiöse Zustände, die gegenwärtig nach [1] unter dem Begriff SIRS subsummiert werden, entsprechend der individuellen Schwere des SIRS genauer klassifiziert werden. Auch hierfür werden Biomarker gesucht, die die Schwere des SIRS auch auf molekularer Ebene widerspiegeln und eine klare Abgrenzung von infektiösen Zuständen (gegenwärtig als Sepsis nach [1] klassifiziert) ermöglichen. Ähnliche Stadieneinteilungen werden bereits heute von anderen medizinischen Fachdisziplinen mit Erfolg angewendet, beispielsweise zur Klassifizierung der verschiedenen Krankheitsstadien im Bereich der Onkologie verwendet (TNM System, [24]).
Verglichen mit den Konsensuskriterien nach [1] sollen in der Zukunft zusätzliche molekulare Parameter in die Diagnosestellung einbezogen werden [23], um so eine verbesserte Korrelation der molekularen inflammatorischen/ immunologischen Wirtsantwort mit dem Schweregrad der Sepsis zu ermöglichen, aber auch Aussagen zur individuellen Prognose abzuleiten. Nach solchen molekularen Biomarkern wird derzeit von verschiedenen wissenschaftlichen und kommerziellen Gruppen intensiv gesucht, da bisherige Parameter wie z.B. die Bestimmung des C-reaktiven Proteins oder des Procalcitonins nicht allen klinischen Anforderungen gerecht werden und insbesondere nur schlecht in der Lage sind, zwischen Überlebenden und NichtÜberlebenden einer Sepsis zu unterscheiden [25]. Auch aufgrund der unzureichenden Spezifität und Sensivität der Konsensuskriterien nach [1] und des mangelhaften oder verspäteten Nachweises der Ursache der Infektion besteht daher ein dringender Bedarf für neue diagnostische Verfahren, welche die Fähigkeit des Fachmanns verbessern sollen, den Krankheitsverlauf bei Sepsis frühzeitig vorherzusagen, im klinischem Verlauf vergleichbar zu gestalten und bezüglich der individuellen Prognose und dem Ansprechen auf spezifische Behandlungen Aussagen abzuleiten.
Technologische Fortschritte, insbesondere die Entwicklung der Microarray- Technologie, versetzen den Fachmann nun in die Lage, 10000 oder mehr Gene und deren Genprodukte gleichzeitig zu vergleichen. Die Anwendung solcher Microarray-Technologien kann nun Hinweise auf den Status von Gesundheit, Regulationsmechanismen, biochemischer Wechselwirkungen und Signalübertragungsnetzwerken geben. Das Verbessern des Verständnisses darüber, wie ein Organismus auf Infektionen reagiert, sollte die Entwicklung von verstärkten Erkennungs-, Diagnose- und Behandlungsmodalitäten für Sepsis- Erkrankungen erleichtern.
Microarrays stammen vom „Southern blotting" [26] ab, was die erste Herangehensweise darstellt, DNA-Moleküle in einer räumlich ansprechbaren Art und Weise auf einer festen Matrix zu immobilisieren. Die ersten Microarrays bestanden aus DNA-Fragmenten, oft mit unbekannter Sequenz, und wurden auf eine poröse Membran (normalerweise Nylon) punktweise aufgebracht. Routinegemäß wurden cDNA, genomische DNA oder Plasmid- Bibliotheken verwendet, und das hybridisierte Material wurde mit einer radioaktiven Gruppe markiert [27-29]. Kürzlich hat es die Verwendung von Glas als Substrat und Fluoreszenz zur Detektion zusammen mit der Entwicklung neuer Technologien für die Synthese und für das Aufbringen der Nukleinsäuren in sehr hohen Dichten erlaubt, die Nukleinsäurearrays zu miniaturisierten bei gleichzeitiger Erhöhung des experimentellen Durchsatzes und des Informationsgehaltes [30-32].
Weiterhin ist aus WO 03/002763 bekannt, dass die Messung der Genexpression mittels Microarrays grundsätzlich für die Diagnose von Sepsis und sepsisähnlichen Zuständen verwendet werden können.
Eine Begründung für die Anwendbarkeit der Microarray-Technologie wurde zunächst durch klinische Untersuchungen auf dem Gebiet der Krebsforschung geliefert. Hier haben Expressionsprofile ihre Nützlichkeit bei der Identifizierung von Aktivitäten einzelner Gene oder Gengruppen gezeigt, die mit bestimmten klinischen Phänotypen korrelieren [33]. Durch die Analyse vieler Proben, die von Individuen mit oder ohne akute Leukämie oder diffusen B-Zell Lymphomen stammten, wurden Genexpressionsmarker (RNA) gefunden und anschließend für die klinisch relevante Klassifizierung dieser Krebsarten angewandt [33,34]. Golub et al. haben herausgefunden, daß verlässliche Vorhersagen nicht aufgrund von irgendeinem einzelnen Gen gemacht werden können, aber daß Vorhersagen, die auf der Veränderung der Transkritiption von 53 Genen (ausgewählt aus über 6000 Genen, die auf den Arrays vertreten waren) basieren, sehr genau sind [33].
Alisadeh et al. [34] untersuchten große B-Zell Lymphome (DLBCL). Die Autoren erarbeiteten Expressionsprofile mit einem „Lymphochip", einem Microarray, der 18 000 Klone komplementärer DNA trug und entwickelt worden war, um Gene zu überwachen, die in normale und abnormale Lymphozytenentwicklung involviert sind. Unter Anwendung von Cluster- Analysen waren sie in der Lage, DILBCL in zwei Kategorien einzuteilen, welche starke Unterschiede bezüglich der Überlebenschancen der Patienten aufzeigten. Die Genexpressionsprofile dieser Untergruppen entsprachen zwei bedeutsamen Stadien der B-Zelldifferenzierung.
Die Anwendung von Genexpressionsprofilen, die mittels Microarrays erarbeitet wurden, für die Vorhersage des Krankheitsverlaufs bei Leukämie wurde von Yeoh E. et al. beschrieben [35]. Aus verschiedenen anderen Studien an Krebspatienten sind ebenfalls weitere Beispiele für die Nutzung von Genexpressionsprofilen für die Vorhersage der Überlebenswahrscheinlichkeit bekannt [36-38]. Diese Untersuchungen belegen, dass mittels Messung der Genexpressionsprofile die Wahrscheinlichkeit des Rückfalls der Patienten vorhergesagt werden kann. Dies wäre von erheblicher klinisch-medizinischer Bedeutung, da solchen Patienten einerseits ein höheres Maß an Aufmerksamkeit z.B. durch häufigere Vorstellungstermine im Rahmen der Tumornachsorge entgegengebracht werden könnte. Im Ergebnis könnte ein Rückfall früher diagnostiziert und gezielt behandelt werden. Andererseits könnten Patienten, die ein Genexpressionsprofil aufweisen, das nicht auf eine erhöhtes Rückfallrisiko schließen lässt, weniger häufig einbestellt werden. Auch könnten solche Genexpressionsprofile in Entscheidungen über ein mehr oder weniger aggressives Vorgehen zur Therapie des Tumorleidens einbezogen werden. Als Konsequenz der Ergebnisse wurden von den Autoren vorgeschlagen, Genexpressionsprofile regelmäßig bei Tumorpatienten zu erheben, um so frühzeitig deren individuelles Risiko auf therapiebezogene Komplikationen zu identifizieren [35].
Die Verwendung von Genexpressionsprofilen zur Vorhersage des individuellen Krankheitsverlaufs bei Sepsis und insbesondere zur Vorhersage des individuellen Risikos zur Entwicklung tödlicher Komplikationen wurde noch nicht beschrieben. Die grundsätzliche Verwendbarkeit von Genexpressionsprofilen, welche beispielsweise mittels der Microarray-Technik erhalten werden können, zur Diagnose von SIRS, generalisierten inflammatorischen Entzündungen, Sepsis und schwerer Sepsis ist in den nicht vorveröffentlichten deutschen Patentanmeldungen DE 103 40 395.7, DE 103 36 511.7, DE 103 150 31.5 sowie 10 2004 009 952.9, auf die hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird, der Anmelderin der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Ausgangspunkt für die in der vorliegenden Patentanmeldung offenbarten Erfindung ist die Erkenntnis, daß sich die Genaktivitäten von überlebenden Sepsispatienten von Genaktivitäten verstorbener Sepsispatienten unterscheiden. Diese Unterschiede der Genaktivitäten lassen es somit zu, Vorhersagen für die Wahrscheinlichkeit des Überlebens und der zukünftigen Entwicklung tödlicher KompOlikationen bei Sepsispatienten anhand der Genexpression zu treffen. Diese Unterscheidung ist mit den bisher zur Diagnose verwendeten Proteinmarkem (z.B. Procalcitonin (PCT) oder C- Reaktives Protein (CRP)) klinischen Parametern nicht möglich, aber für die Einleitung einer spezialisierten intensivmedizinischen Therapie und damit für das Verbessern der individuellen Prognose für das Überleben sehr bedeutungsvoll.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine Vorhersage des zukünftigen Krankheitsverlaufs bei Sepsis unter Verwendung von Genexpressionsprofilen zu ermöglichen.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 , 10 und 23 gelöst.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen für die Erstellung von Kriterien für die Vorhersage eines individuellen Krankheitsverlaufs bei Sepsis.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung der erhaltenen Genexpressionsprofilen für die Bestimmung der Überlebenswahrscheinlichkeit bei Sepsis.
Ferner dient die vorliegende Erfindung der therapiebegleitenden Verlaufsbeurteilung von Sepsis sowie der Klassifizierung von Sepsispatienten.
Die vorliegende Erfindung ist ferner nützlich als Ein- oder Ausschlußkriterium von Patienten mit Sepsis in klinische Studien der Phasen 2-4.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung liegt in der Erstellung von Genaktivitätsdaten für die elektronische Weiterverarbeitung sowie zur Herstellung von Software für die Beschreibung der individuellen Prognose eines Sepsispatienten, für Diagnosezwecke und/oder
Patientendatenmangement-sytstemen.
Die vorliegende Erfindung kann auch zur Herstellung von Expertensystemen und/oder zur Modellierung von zelluläreren Signalübertragungswegen verwendet werden.
Zur Erstellung des Genexpressionsprofiles gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Mehrzahl von spezifischen Genen und/oder Genfragmenten verwendet, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 247 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden. Diese Sequenzen mit der Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 247 sind durch den Umfang der vorliegenden Erfindung mit umfaßt und sind dem angefügten 56 -seifigen, 247 Sequenzen umfassenden, Sequenzprotokoll, das somit Bestandteil der Beschreibung der vorliegenden Erfindung ist, im Einzelnen offenbart und ist somit ebenfalls Bestandteil der Offenbarung der Erfindung. Dieses Sequenzprotokoll beinhaltet zudem eine Zuordnung der einzelnen Sequenzen mit der Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 247 zu deren GenBank Accession Nr. (Internet-Zugang über http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen und/oder von den hierfür verwendeten Sonden, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 247 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden, zum Ausschalten und/oder zur Aktivitätsveränderung von Zielgenen und/oder zur Bestimmung der Genaktivität zum Screening von Wirkstoffen gegen Sepsis und/oder zur Beurteilung der Wirkung gegen Sepsis und/oder der Wirkstoffqualität und/oder der Wirkstoffintegrität in zellulären und zellfreien Sepsis- Modellsystemen und in Sepsis-Tiermodellen.
Hierzu können ebenfalls hybridisierungsfähige synthetische Analoga der aufgelisteten Sonden verwendet werden.
Ferner kann man bei Sepsispatienten die Genaktivitäten in einer biologischen Flüssigkeit bestimmen und aus deren „Wert" Schlüsse hinsichtlich des Krankheitsverlaufs, der Überlebenswahrscheinlichkeit, des Therapieverlaufs oder der Ein- oder Ausschlussmöglichkeit der Sepsispatienten für klinische Studien ziehen. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß ein spezifisches Gen und/oder Genfragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 247 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens 2 bis 100 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die in Anspruch 11 aufgelisteten Gene oder Genfragmente und/oder von deren RNA abgeleiteten Sequenzen ersetzt werden durch synthetische Analoga, Aptamere sowie Peptidonukleinsäuren.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die synthetischen Analoga der Gene 5-100, insbesondere ca. 70 Basenpaare umfassen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Genaktivitäten mittels Hybridisierungsverfahren bestimmt wird. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Genaktivität mittels Microarrays bestimmt wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Genaktivität durch Hybridisierungs-unabhängige Verfahren, insbesondere enzymatische und/oder chemische Hydrolyse und/oder Amplifikationsverfahren, vorzugsweise PCR, anschließende Quantifizierung der Nukleinsäuren und/oder von Derivaten und/oder Fragmenten derselben, bestimmt wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Liquor, Urin, Ascitesflüssigkeit, Seminalflüssigkeit, Speichel, Punktat; Zellinhalt oder eine Mischung davon.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß Zellproben gegebenenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.
Es ist dem Fachmann klar, daß die in den Ansprüchen dargelegten einzelnen Merkmale der Erfindung ohne Einschränkung beliebig miteinander kombinierbar sind.
Als Markergene im Sinne der Erfindung werden alle abgeleiteten DNA- Sequenzen, Partialsequenzen und synthetischen Analoga (beispielsweise Peptido-Nukleinsäuren, PNA) verstanden. Die auf Bestimmung der Genexpression auf RNA-Ebene bezogene Beschreibung der Erfindung stellt keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.
Die auf Blut bezogene Beschreibung der Erfindung stellt nur eine beispielhafte Anwendung der Erfindung dar. Als biologische Flüssigkeiten im Sinne der Erfindung werden alle Körperflüssigkeiten des Menschen verstanden. Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung eines Ausführungsbeispiels. Ausführungsbeispiel
Untersuchungen zur differentiellen Genexpression bei Sepsis zur Unterscheidung von nichtÜberlebenden und überlebenden Patienten.
Für die Messung der differentiellen Genexpression bei Sepsis zur Unterscheidung von nichtÜberlebenden und überlebenden Patienten wurden Untersuchungen von Vollblutproben von 28 Patienten, welche auf operativen Intensivstationen behandelt wurden, durchgeführt.
Es wurden Vollblutproben von 12 überlebenden (9 männliche und 3 weibliche Patienten) und 16 verstorbenen Patienten (13 männliche und 3 weibliche Patienten) während deren gesamten Aufenthalts auf der Intensivstation abgenommen (Patientenproben). Jeder dieser Patienten entwickelte im Rahmen seiner intensivmedizinischen Betreuung eine Sepsis unterschiedlich schwerer Ausprägung. Genexpressionsprofile wurden von denjenigen Patientenproben ausgewertet, die am Behandlungstag mit dem schwersten Sepsisgrad nach [1] während der ersten septischen Komplikation (manche Intensivpatienten erleiden mehr als eine Sepsis im Behandlungsverlauf) entnommen wurden. Ausgewählte Charakteristika der Patienten mit Sepsis sind in Tabelle 1 dargestellt. Dabei werden Angaben zum Alter, Geschlecht, der Ursache der Sepsis (siehe Diagnose) sowie klinischer Schwere am Aufnahmetag auf Intensivstation, gemessen anhand des im klinischen Schrifttum gut belegten APACHE-Il-Scores sowie am Behandlungstag von dessen Proben Genexpressionsprofile erhoben wurden, gemessen anhand des im klinischen Schrifttum gut belegten SOFA-Scores (beide Scores jeweils in Punkten), gemacht. Gleichfalls sind die Plasmaproteinspiegel von Procalcitonin (PCT), einem neuartigen Sepsismarker, am Behandlungstag von dessen Proben Genexpressionsprofile erhoben wurden und der individuelle Überlebensstatus angegeben.
Als Kontrollproben dienten die totale RNA aus Zelllinien SIG-M5. Alle Patientenproben wurden mit der Kontrollprobe jeweils auf einem Microarray ko-hybridisiert.
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Tabelle 1 : Daten der Patientengruppe (Fortführung)
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Experimentelle Beschreibung:
Nach Abnahme des Vollblutes wurde die totale RNA der Proben unter Anwendung des PAXGene Blood RNA Kit gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) isoliert.
Zellkultivierung
Für die Zellkultivierung (Kontrollproben) wurden 19 Kryozellkulturen (SIGM5)
(eingefroren in flüssigem Stickstoff) genutzt. Die Zellen wurden jeweils mit 2 ml Iscove's Medium (Biochrom AG) beimpft ergänzt mit 20% fetalen Kälber Serum (FCS). Die Zellkuturen wurden anschliessend für 24 Stunden bei 37° C unter 5% C02 in 12-well Platten inkubiert. Danach wurde der Inhalt von 18 Wells in 2 Teile mit jeweils dem gleichen Volumen geteilt, sodass schliesslich 3 Platten des gleichen Formats (insgesamt 36 Wells) zur Verfügung standen. Die Kultivierung wurde anschliessend für 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen fortgeführt. Im Anschluss daran wurden die resultierenden Kulturen von 11 Wells jeder Platte vereint und zentrifugiert (1000 x g, 5 min, Raumtemperatur). Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 40 ml des o.g. Mediums geloest. Diese 40 ml geloeste Zellen wurden in zwei 250 ml Kolben zu gleichen Teilen aufgeteilt und nach 48 Stunden Inkubation und Zugabe von 5 ml des o.g. Mediums wiederum inkubiert. Von den restlichen 2 ml der zwei verbleibendenden Platten wurden 80 μl in leere Wells der gleichen Platten gegeben, welche bereits vorher mit 1 ml des o.g. Mediums präpariert waren. Nach 48 Stunden Inkubation wurde nur eine der 12 Well-Platten wie folgt prozessiert: Aus jedem Well wurden 500 μl entnommen und vereint. Die daraus resultierenden 6 ml wurden in einen 250 ml Kolben gegeben, welcher ca. 10 ml frisches Medium enthielt. Dieses Gemisch wurde mit 1000 x g 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und in 10 ml des o.g. Mediums geloest. Die anschliessende Zellzählung ergab folgendes Ergebnis: 1 ,5 x 107 Zellen pro ml, 10 ml Gesamtvolumen, Gesamtzahl der Zellen: 1 ,5 x 108. Da die Zellzahl noch nicht ausreichend war, wurden 2,5 ml des o.g. Zellsuspension in 30 ml des o.g. Mediums in einen 250 ml (75 cm2) Kolben gegeben (insgesamt 4 Kolben). Nach 72 Sunden Inkubationszeit wurden jeweils 20 ml frischen Mediums in die Kolben gegeben. Nach folgender 24-stündiger Inkubation erfolgte die Zellzählung wie oben beschrieben, die eine Gesamtzellzahl von 3,8 x 108 Zellen ergab. Um die gewünschte Zellzahl von 2 x 106 Zellen zu errreichen wurden die Zellen in 47,5 ml des o.g. Mediums in 4 Kolben resuspendiert. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wurden die Zeil zentrifugiert und zweimal mit Phosphatpuffer ohne Ca2+ und Mg2+ (Biochrom AG) gewaschen.
Die Isolation der totalen RNA erfolgt mittels des NucleoSpin RNA L Kits (Machery&Nagel) entsprechend den Angaben des Herstellers. Die oben beschriebene Prozedur wurde wiederholt bis die erforderliche Zellzahl erreicht wurde. Dies war erforderlich, um die erforderliche Menge von 6 mg totale RNA zu erreichen, was etwa einer Effϊziens von 600 μg RNA pro 108 Zellen entspricht.
Reverse Transkription / Markierung / Hybridisierung
Anschliessend wurde aus der totalen RNA der Patienten- und Kontrollproben mittels Reverser Transkription die komplementäre cDNA unter Substitution der dTTP-Fraktion durch synthetisiertes Aminoallyl-deoxyuridintriphosphat (AA- dUTP) hergestellt. Durch RNA-Hydrolyse wurde der RNA/cDNA-Komplex in Einzelstrang-cDNA umgewandelt. Im Anschluss daran wurden die cDNA- Proben mit den Fluoreszenzfarbstoffen Cy3 und Cy5 (Amersham) durch chemische Bindung an AA-dUTP markiert.
Für die Hybridisierung der Proben wurde ein Microarray der Firma SIRS-Lab verwendet. Auf dem verwendeten Microarray sind 5308 verschiedene Polynukleotide mit jeweils einer Länge zwischen 55-70 Basenpaaren immobilisiert. Jedes Polynukleotid repräsentiert ein humanes Gen. Die Spots wurden inklusive einer Vielzahl verschiedener Kontrollspots innerhalb von 28 Subarrays immobilisiert, wobei jedes Subarray in einem Raster von 15x15 Spots angeordnet war. Die Hybridisierung wurde unter Nutzung der Hybridisierungsstation HS 400 (Tecan) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Der Hybridisierungsloesung setzte sich zusammen aus 3,5 x SSC (1xSSC beinhaltet 150 mM NaCI und 15 mM Natriumzitrat), 0,3% SDS, 25% Formamid, jeweils 0,8 μg/μl cot-1 DNA, Hefe tRNA und polyA und den jeweiligen cDNA-Proben. Die Arrays wurden 10,5 Stunden bei 42°C hybridisiert. Die anschliessende Waschprozedur folgt folgendem Programm: Zugabe von Waschpuffer I (2xSSC, 0,003%SDS) in die Hybridisierungskammer, 1 ,5 Minuten waschen bei Raumtemperatur, Zugabe von Waschpuffer II (1xSSC) in Hybridisierungskammer, Waschen mit Waschpuffer II für 1 ,5 Minuten bei Raumtemperatur, Zugabe von Waschpuffer III (0,2xSSC) in Hybridisierungskammer, Waschen mit Waschpuffer III für 1 ,5 Minuten bei Raumtemperatur. Danach wurde die Oberfläche der Microarrays unter Stickstoff bei einem Druck von 2,5 bar für 2,5 Minuten bei 30°C getrocknet.
Die Hybridisierungssignale der prozessierten Microarrys wurden anschliessend unter Nutzung des Scanners GenePix 4000B (Axon) ausgelesen und die Expressionsverhältnisse der differentiert exprimierten Gene mittels der Software GenePix Pro 4.0 (Axon) bestimmt.
Auswertung:
Für die Auswertung wurde die mittlere Intensität eines Spots als der Medianwert der zugehörigen der Spotpixel bestimmt.
Korrektur systematischer Fehler:
Von dem Mediän der Spotpixel wurde der Mediän der Pixel des lokalen Hintergrunds abgezogen. Für alle weiteren Berechnungen wurden die Signale mittels arcus sinus hyperbolicus transformiert. Die Normalisierung erfolgte nach dem Ansatz von Huber et al. [39]. Dabei wurde der additive und der multiplikative Bias innerhalb eines Microarrays aus 70% der vorhandenen Genproben geschätzt. Für die Analyse wurden die transformierten relativen Verhältnisse der Signale der Patientenproben gegen die Kontrolle berechnet.
Das bedeutet für das j-te Gen (j=1 ,...,5308) des n-ten Patienten (n=1 28) ergab die Berechnung den Wert Gj,n = arcsinh(Scy5(j,n)) - arcsinh(Scy30',n)), wobei [SCy3(j,n), SCy5(j,n)] das zugehörige Signalpaar bezeichnet. War für einen Patienten ein Spot nicht auswertbar (keine nachweisbare Signalintensität in beiden Kanälen), so wurde der zugehörige Wert als nicht vorhanden (.missing value') gekennzeichnet. Statistischer Vergleich:
Für den Vergleich wurde der zweiseitige Zwei-Stichproben Student-Test pro Gen verwendet. Beide Stichproben enthielten die Werte der Patientengruppen überlebende Patienten bzw. nichtÜberlebenden Patienten. Für die Auswahl der differenziert exprimierten Gene wurde der zugehörige p-Wert und die Anzahl der nicht vorhandenen Werte bewertet.
Ergebnisse:
Für die Gruppe der ausgewählten Gene war der zugehörige p-Wert kleiner als 0.05, wobei in die Auswertung mindestens 5 auswertbare Signale pro Patientengruppe eingingen.
Die Höhe des Expressionsverhältnisses jedes Gens stellte das Kriterium für eine Sortierung der untersuchten Gene dar. Von Interesse waren die Gene, die zwischen den überlebenden und verstorbenen Patienten am meisten überexprimiert bzw. unterexprimiert wurden.
Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, dass 65 Gene den Patientenprobe gefunden wurden, die in den nicht überlebenden Patienten gegenüber den überlebenden Patienten signifikant überexprimiert waren. Weiterhin ist aus Tabelle 3 ersichtlich, dass 182 Gene der nicht überlebenden Patienten gegenüber den überlebenden Patienten signifikant unterexprimiert waren. Aus den Ergebnissen wird deutlich, dass die in Tabelle 2 und Tabelle 3 aufgeführten Genaktivitäten zwischen überlebenden und nichtÜberlebenden Patienten bei Sepsis (klassifiziert nach [1]) unterscheiden. Somit stellen die aufgeführten Genaktivitäten Marker für eine Vorhersage der Überlebenswahrscheinlichkeit und der Entwicklung tödlicher Komplikationen von Sepsispatienten dar. Tabelle 2: Signifikant gesteigerte Genaktivitäten in Proben von überlebenden Patienten mit Sepsis nach [1], dargestellt als deren relatives Verhältnis zu den korrespondierenden Genaktivitäten von nicht überlebenden Patienten mit Se sis nach 1
Tabelle 2 - Fortsetzung
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Tabelle 3: Signifikant reduzierte Genaktivitäten in Proben von überlebenden Patienten mit Sepsis nach [1], dargestellt als deren relatives Verhältnis zu den korrespondierenden Genaktivitäten von nicht überlebenden Patienten mit Sepsis nach [1]
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Tabelle 3- Fortsetzung 1
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Tabelle 3- Fortsetzung 2
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Tabelle 3- Fortsetzung 3
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Tabelle 3- Fortsetzung 4
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Diese in Tabelle 2 und 3 charakteristischen Veränderungen sind für die erfindungsgemäße Verwendung gemäß Anspruch 1 ausnutzbar.
Die in den Tabellen 2 und 3 aufgeführten GenBank Accession Nummern (Internet-Zugang über http://www.ncbi.nim.nih.gov/) der einzelnen Sequenzen sind in dem dieser Anmeldung angefügten 56-seitigen Sequenzprotokol im Einzelnen jeweils einer Sequenz ID (Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 247) zugeordnet.
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Claims

Ansprüche
1. Verwendung von in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen für die Erstellung von Kriterien für die Vorhersage eines individuellen Krankheitsverlaufs bei Sepsis.
2. Verwendung nach Anspruch 1 für die Bestimmung der Überlebenswahrscheinlichkeit bei Sepsis.
3. Verwendung nach Anspruch 1 für die therapiebegleitende Verlaufsbeurteilung von Sepsis.
4. Verwendung nach Anspruch 1 für die Klassifizierung von Sepsispatienten.
5. Verwendung nach Anspruch 4 als Ein- oder Ausschlußkriterium von Patienten mit Sepsis in klinische Studien der Phasen 2-4.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Erstellung von Genaktivitätsdaten für die elektronische Weiterverarbeitung.
7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von Software für die Beschreibung der individuellen Prognose eines Sepsispatienten, für Diagnosezwecke und/oder Patientendatenmangementsytsteme, verwendet werden.
8. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Genaktivitätsdaten zur Herstellung von Expertensystemen und/oder zur Modellierung von zelluläreren Signalübertragungswegen verwendet werden.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei zur Erstellung des Genexpressionsprofiles ein spezifisches Gen und/oder Genfragment verwendet wird, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 247 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden.
10. Verfahren zur in vitro Messung von Genexpressionsprofilen zur Verwendung gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1-9 dadurch gekennzeichnet, dass man in Sepsispatienten die Genaktivität einer Mehrzahl von bestimmten, mit Sepsis in Zusammenhang stehenden Genen in einer Patientenprobe bestimmt, wobei die Sepsis-spezifischen Gene und/oder Genfragmente ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 247 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens 2 bis 100 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15 dadurch gekennzeichnet, daß die in Anspruch 10 aufgelisteten Gene oder Genfragmente und/oder von deren RNA abgeleiteten Sequenzen ersetzt werden durch synthetische Analoga, Aptamere, Spiegelmere sowie Peptido- und Morpholinonukleinsäuren.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die synthetischen Analoga der Gene 5-100, insbesondere ca. 70 Basenpaare umfassen.
18. Verfahren nach Anspruch 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Genaktivitäten mittels Hybridisierungsverfahren bestimmt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivität mittels Miroarrays bestimmt wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivität durch Hybridisierungs- unabhängige Verfahren, insbesondere enzymatische und/oder chemische Hydrolyse und/oder Amplifikationsverfahren, vorzugsweise PCR, anschließende Quantifizierung der Nukleinsäuren und/oder von Derivaten und/oder Fragmenten derselben, bestimmt wird.
21 . Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Liquor, Urin, Ascitesflüssigkeit, Seminalflüssigkeit, Speichel, Punktat; Zellinhalt oder eine Mischung davon.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß Zellproben gegebenenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.
23. Verwendung von in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen und/oder von den hierfür verwendeten Sonden, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 247 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden, zum Ausschalten und/oder zur Aktivitätsveränderung von Zielgenen und/oder zur Bestimmung der Genaktivität zum Screening von Wirkstoffen gegen Sepsis und/oder zur Beurteilung der Wirkung gegen Sepsis und/oder der Wirkstoffqualität und/oder der Wirkstoffintegrität in zellulären und zellfreien Sepsis-Modellsystemen und in Sepsis-Tiermodellen.
24. Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass hybridisierungsfähige synthetische Analoga der in Anspruch 23 aufgelisteten Sonden verwendet werden.
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