WO2005106000A1 - UTILISATION DU GENE CODANT LA CHAINE β DE LA PROTEINE C4BP DANS LA PRODUCTION DE PROTEINES DIMERIQUES RECOMBINANTES - Google Patents

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WO2005106000A1
WO2005106000A1 PCT/FR2005/001007 FR2005001007W WO2005106000A1 WO 2005106000 A1 WO2005106000 A1 WO 2005106000A1 FR 2005001007 W FR2005001007 W FR 2005001007W WO 2005106000 A1 WO2005106000 A1 WO 2005106000A1
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protein
chain
fragment
polypeptide
heterologous
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Application number
PCT/FR2005/001007
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Jacques Henri Max Cohen
Stéphane OUDIN
Xavier Dervillez
Annelise Gimenez
Béatrice DONVITO
Marcelle Tonye-Libyh
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Universite De Reims Champagne-Ardenne
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the invention relates to a process for obtaining recombinant dimeric proteins, using a nucleic acid encoding the C-terminal fragment of the ⁇ chain of the C4BP protein comprising amino acid residues 193 to 252 or a functional variant thereof. fragment, said fragment allowing the covalent association of the heterologous polypeptides to which it is fused.
  • the invention also relates to the dimeric proteins which can be obtained by the method and the cells for carrying out the method.
  • biomolecules of interest in biotechnology include antigens, antibodies or their fragments, in particular their fragments comprising all or part of the variable chains, enzymes, hormones, cytokines or growth factors for the production of vaccines, diagnostic kits or molecules with therapeutic activity.
  • a particular method consists, for example, in adding, at one end of a recombinant peptide, a heterologous peptide, called a "linker" peptide, which can be easily used for disulfide, amino or acid bonds.
  • Another approach consists in chemically coupling a biotinyl group, which then makes it possible to couple any substance linked to streptavidin.
  • the dimerization domains chosen are, for example, the domains of antibodies CL and CHI, calmodulin or the peptide binding the corresponding calmodulin, or else streptavidin (Miiller et al., FEBS Lett, 1998 422: 259-264, Neri et al. , BioTechnology, 1995, 13: 373-377).
  • the most frequently used method consists in expressing a single nucleic acid encoding two polypeptides linked together by a peptide linker.
  • the peptide linker has the drawback of being potentially immunogenic and may therefore not satisfy all of the applications targeted for a dimeric protein, in particular a protein intended to be administered to humans or animals.
  • the present invention proposes to remedy, at least in part, the drawbacks of the methods described above for the production of recombinant dimeric proteins.
  • the C4BP protein is involved in coagulation and the complement system.
  • the majority form of C4BP is composed of 7 identical ⁇ chains of 75 Kd and a ⁇ chain of 45 Kd.
  • the ⁇ and ⁇ chains respectively contain 8 and 3 SCR domains (Short Consensus Repeat), these motifs being found in many complement regulating proteins and consisting of 50-70 amino acids organized in ⁇ sheets.
  • Application EP 2 227 030 also describes the production of recombinant heteromultimeric proteins by the use of C-terminal fragments of the ⁇ and ⁇ chains of the C4BP protein in fusion with polypeptides of interest.
  • the use of the ⁇ chain of the C4BP protein independently of its use in association with the ⁇ chain of the C4BP protein, has on the other hand never been described for the production of multimeric proteins, and especially for the production of dimeric proteins.
  • the inventors have now surprisingly found that the expression in a heterologous system of a nucleic acid encoding in fusion the C-terminal fragment of the ⁇ chain of the C4BP protein and a polypeptide of interest, allows the production of Recombinant dimeric proteins, the monomers of which are covalently linked.
  • the invention relates to a process for obtaining a recombinant dimeric protein, comprising: a) the transfection of host cells with a vector allowing the expression of a nucleotide sequence encoding a fusion polypeptide, said fusion polypeptide comprising at least the fragment consisting of amino acids of positions 193 to 252 of the ⁇ chain of the human C4BP protein or a functional variant of this fragment by deletion, addition or substitution of one or more amino acids, retaining the capacity to form a protein at least dimeric, said fusion polypeptide further comprising a polypeptide heterologous to said ⁇ chain, b) culturing the transfected cells under conditions suitable for the expression of the nucleotide sequence coding for the fusion polypeptide and the covalent association of two fusion polypeptides in vivo to form a dimeric protein, c) recovery of dimeric proteins formed.
  • the heterologous system In order to obtain a dimeric and non-hexa- or heptameric protein, preferably the heterologous system must not contain nucleic acid allowing the expression or overexpression of the C-terminal fragment of the ⁇ chain of the C4BP protein, involved in polymerization of C4BP.
  • polypeptide heterologous to the ⁇ chain it is necessary to understand any polypeptide characterized by the fact that the sequence of this polypeptide is not naturally associated with the fragment of the ⁇ chain to which it is fused.
  • it is a polypeptide which does not not only present, the ability to associate covalently with another polypeptide to form a homodimer or a heterodimer.
  • heterologous polypeptides examples include enzymes, factors for regulating enzymatic activity, receptor ligands, haptens, antigens, antibodies, antibody fragments, receptors, in particular monochain receptors. or protein drug acceptors.
  • sequences of a heterologous polypeptide can be chosen, for example, from the active principles of medicaments, including immunotoxins, antioxidants, antibiotics, growth factors, intracellular hormones, cytokines, toxins, neuromediators, antimicrobial agents, in particular , antiviral, antibacterial and antiparasitic, or anti-tumor or any other therapeutic or prophylactic agent of interest.
  • polypeptide sequences will be chosen in particular from immunoglobulins and antibody fragments, in particular the fragments corresponding to variable domains or to immunologically active parts of these domains, such as scFv (single chain Fragment variable), dimeric enzymes such as fumarylacetoacetate hydrolase, or dimeric receptors such as the C3Bi receptor (CD11 + CD18).
  • scFv single chain Fragment variable
  • dimeric enzymes such as fumarylacetoacetate hydrolase
  • dimeric receptors such as the C3Bi receptor (CD11 + CD18).
  • polypeptide sequence of the ⁇ chain of the human C4BP protein is described in Hillarp and Dahlbâck (1990, PNAS, Vol. 87, pp 1183-1187), as well as the sequence of the cDNA encoding it.
  • a sequence of the ⁇ chain of the C4BP protein and its cDNA is also described in the NCBI database under the accession number NM_000716, the protein numbering of which is used here.
  • the fragment corresponding to positions 193-252 is identified by reference to this sequence and can for example be obtained by PCR amplification from a human cDNA library by choosing primers specifically hybridizing to the corresponding ends of the sequence coding for the desired fragment of the ⁇ chain. It can alternatively be obtained by any suitable method known to the man of the wary.
  • fragment 193-252 or “fragment 193-252 of the ⁇ chain” means, unless otherwise specified, the fragment consisting of the consecutive chain of amino acids of positions 193 to 252 of the ⁇ chain of the human C4BP protein.
  • the fragment 193-252 of the ⁇ chain of the human C4BP protein has the following polypeptide sequence:
  • a nucleic acid sequence corresponding to this polypeptide sequence is also described by Hillarp and Dahlbâck (1990, PNAS, Vol. 87, pp 1183-1187).
  • a sequence coding for a functional variant of the fragment 193-252 retaining the capacity to form at least one dimer, for example a homodimer or heterodimer, a trimer, a tetramer or any multimer containing a varied number of fusion polypeptides.
  • the expression “functional variant of the fragment 193-252” is intended to mean a polypeptide sequence modified with respect to the sequence of the fragment 193-252 of the ⁇ chain, by deletion, substitution or addition of one or more amino acids, said modified sequence nevertheless retaining the capacity to form proteins at least dimeric by the process of the invention. More specifically, the production of dimeric proteins using a sequence encoding a functional variant of the fragment 193-252 must be at least 80% equal to that obtained with a native sequence encoding the fragment 193-252, preferably at least 90% , in an identical expression system. Preferably, the variant is such that more than 80% of the fusion polypeptides which contain it are produced in the form of dimers in a eukaryotic expression system according to the invention. •
  • a functional variant corresponds in particular to a fragment of the ⁇ chain containing the fragment 193-252 and also containing an adjacent sequence of the ⁇ chain upstream of this fragment, including for example the last SCR sequence (residues 136-192) and / or 4 or 5 amino acids [GS]. Sequences encoding longer fragments of the ⁇ chain, or even the entire ⁇ chain, can also be used. For certain applications, it is preferable to avoid using a sequence encoding a ⁇ chain capable of binding the protein S participating in coagulation.
  • the chosen sequence codes for a fragment containing the first two SCR motifs of the ⁇ chain
  • these will preferably be mutated versions by addition, deletion or substitution of amino acids, so as to eliminate the possibility of interaction with the protein S.
  • the addition of the SCR motifs and / or domains [GS] can be carried out in order to modify, for example to increase, the flexibility of the fusion polypeptide thus obtained or also to allow the fusion polypeptide or the polypeptide heterologous to adopt a conformation suitable for the formation of multimers, particularly dimers, and appropriate for its biological activity (fixation, catalysis of the enzymatic reaction, interaction with the drug).
  • a sequence encoding a variant of the fragment 193-252 of the ⁇ chain is a sequence whose nucleic acid corresponding is capable of hydriding under stringent conditions with the sequence encoding the fragment 193-252 as described by Hillarp and Dahlbâck (1990, PNAS, Vol. 87, pp 1183-1187).
  • stringent conditions is meant the conditions which allow the specific hybridization of two single-stranded DNA sequences at approximately 65 ° C. for example in a solution of 6 x SSC, 0.5% SDS, 5X Denhardt's solution and 100 ⁇ g of non-specific DNA or any other solution of equivalent ionic strength and after washing at 65 ° C, for example in a solution of at most 0.2 x SSC and 0.1% SDS or any other solution of ionic strength equivalent.
  • the nucleotide sequence (polynucleotide) coding for a functional variant of the above-mentioned fragment 193-252 and hybridizing under stringent conditions with the sequence coding said fragment has, in the part which hybridizes, a length at least equal to 50%, preferably at least 80%, of the length of the sequence encoding the fragment 193-252.
  • the nucleotide sequence (polynucleotide) coding for a functional variant of the above-mentioned fragment 193-252 and hybridizing under stringent conditions with the sequence coding for said fragment has, in the part which hybridizes, substantially the same length as the sequence encoding the above fragment 193-252.
  • a functional variant is a modified sequence of the fragment 193-252, in which one or more amino acids which are not essential for the dimerization function have been deleted or substituted and / or one or more amino acids essential for the dimerization have been replaced by amino acids of equivalent functional groups (conservative substitution). It is in particular recommended that the two cysteines, located at positions 201 and 215, as well as the peptide structure around these cysteines, be preserved to allow the formation of disulfide bridges necessary for dimerization, for example by conservation at least 3 amino acids upstream and downstream of each cysteine.
  • a functional variant can also be obtained by inserting a sequence heterologous to the ⁇ chain, and in particular domains of the ⁇ chain of C4BP, between the cysteines responsible for dimerization, or on the contrary by suppressing certain amino acids present between these same cysteines.
  • a functional variant can be produced by the specific modification of certain amino acids, and in particular the substitution of a cysteine responsible for dimerization by a neutral amino acid in terms of involvement in the dimerization process (for example the acids amino acids A, V, F, P, M, I, L and W), and at the same time the substitution of another amino acid by a cysteine so as to maintain the capacity for forming intracatenary and / or intercatenarian disulfide bridges between the cysteines.
  • a cysteine responsible for dimerization by a neutral amino acid in terms of involvement in the dimerization process for example the acids amino acids A, V, F, P, M, I, L and W
  • substitution of another amino acid by a cysteine so as to maintain the capacity for forming intracatenary and / or intercatenarian disulfide bridges between the cysteines.
  • the modifications made to the ⁇ chain of the C4BP protein can in particular be determined to modify, in particular improve, the accessibility of the heterologous polypeptide in the fusion polypeptide, for example by modifying the flexibility of the fusion polypeptide.
  • amino acids of the fragment 193-252 are thus deleted or replaced, and better still, less than 25%, or even better still, less than 10% (for example 5 amino acids or less) or less than 5% (1 or 2 amino acids).
  • sequences encoding the C-terminal fragment of the ⁇ chain and encoding the polypeptide of interest _ are fused and cloned into an appropriate expression vector.
  • the fusion polypeptide encoded by the nucleotide sequence contains in its N-terminal part, the heterologous polypeptide and in its C-terminal part, the fragment of the ⁇ chain of the C4BP protein.
  • the expression vector is chosen according to the host cell into which the construct is introduced.
  • the expression vector is chosen from vectors allowing expression in eukaryotic cells, and in particular from chromosomal, or episomal or virus-derived vectors, and in particular vectors derived from plasmids, from yeast chromosomes, or viruses such as baculoviruses, papoviruses or SV40, retroviruses, or their combinations, in particular phagemids and cosmids.
  • it is a vector allowing the expression of baculovirus, capable of infecting insect cells.
  • the sequence encoding the fusion polypeptide comprises • also preferably in the part 5 ', a sequence encoding a signal peptide for secretion of the fusion polypeptide.
  • the sequence of a signal peptide is a sequence of 15 to 20 amino acids, rich in hydrophobic amino acids (Phe, Leu, Ile, Met and Val).
  • signal peptide particular mention will be made of the signal sequence gp67 as used in the expression vector chosen in the experimental part.
  • the vector comprises all the sequences necessary for the expression of the sequence encoding the fusion polypeptide.
  • it comprises an appropriate promoter, chosen as a function of the cell into which the construct is to be introduced.
  • a host cell means a cell capable of expressing a gene carried by a nucleic acid heterologous to the cell and which has been introduced into the genome of the cell by a transfection method.
  • a host cell is a eukaryotic cell.
  • a eukaryotic host cell is in particular selected from the cells of yeasts, such as S. cerevisiae, filamentous fungal cells, such as Aspergillus sp., insect cells such as S2 cells of Drosophila, or Sf9 of Spodoptera, mammalian cells or plant cells.
  • mammalian cell lines such as CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, HepG2 cells or also L (TK-) cells.
  • said host cells are chosen from eukaryotic cell lines, preferably they are Sf9 insect cells.
  • transfection methods are for example described in Sambrook et al., 2001 (Molecular Cloning: A laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor, laboratory press, Cold Spring Harbor, New York).
  • the host cell allows the co-expression of two fusion polypeptides, a first fusion polypeptide A, consisting of the fusion of a fragment 193-252 or of a variant functional of this fragment with a polypeptide of interest A ', and a second fusion polypeptide B, consisting of the fusion of a fragment 193-252 or of a functional variant of this fragment with a polypeptide of interest B'.
  • the co-expression of the two fusion polypeptides allows, in addition to the production of homodimers A-A and B-B, the production of heterodimers A-B.
  • polypeptides of interest A ′ and B ′ are chosen, independently of one another, from the group consisting of enzymes, factors regulating enzymatic activity, receptor ligands, haptens, antigens, antibodies, antibody fragments, medicaments, receptors, in particular mono-chain receptors or protein drug acceptors.
  • the expression “chosen independently of one another” means that the two polypeptides of interest A ′ and B ′ (or heterologous polypeptides) can be of different nature, that is to say for example one is a enzyme, the other a receptor or on the contrary of the same nature, that is to say two ligands, two antibodies or mono-chain receptors.
  • the process for obtaining it also allows the production of heterodimers, in which the first and second heterologous polypeptides of these heterodimers each have an antibody site different from that of the other polypeptide, a ligand different from that of the other polypeptide or a different mono-chain receptor than that of the other polypeptide.
  • heterologous polypeptides By the term “different” when referring to examples of heterologous polypeptides, is meant a protein sequence in which the primary sequence (amino acid sequence) of one of the heterologous polypeptides is different by at least one amino acid from the sequence primary of the other polypeptide.
  • the primary sequences may be different for all the amino acids although the proteins are of the same nature, for example two enzymes, two antigens or two haptens.
  • the term “different” also covers heterologous polypeptides having the same primary sequence, but having different post-translational modifications, for example in terms of acetylation, amidation, biotinylation, carboxylation, hydroxylation, methylation, phosphorylation or sulfation, or by adding lipids (isoprenylation, palmitoylation and myristoylation), carbohydrates (glycosylation) or polypeptides (ubiquitination).
  • antibody site means the protein sequences necessary for the recognition of a given antigen, and in particular the variable domains (heavy and / or light chains) of an immunoglobulin.
  • protein protein acceptor any amino acid, peptide chain (at least two consecutive amino acids) or set of amino acids (at least two non-consecutive amino acids) interacting with a drug.
  • the invention also relates to a process for obtaining heterodimers, said process comprising:
  • a first fusion polypeptide said fusion polypeptide comprising the fragment 193-252 of the ⁇ chain of the human C4BP protein or a functional variant of this fragment and a first polypeptide heterologous to said ⁇ chain
  • a second fusion polypeptide said fusion polypeptide comprising at least the fragment 193-252 of the ⁇ chain of the human C4BP protein or a functional variant of this fragment and a second polypeptide heterologous to said ⁇ chain whose sequence is different from that of the first heterologous polypeptide
  • the invention also relates to a recombinant dimeric or heterodimeric protein, capable of being obtained by one of the production methods described above.
  • the invention relates in particular to a recombinant dimeric protein characterized in that it consists of two fusion polypeptides, each fusion polypeptide comprising at least the fragment 193-252 of the ⁇ chain of the human C4BP protein or a functional variant of this fragment and a polypeptide heterologous to said ⁇ chain.
  • the recombinant dimeric protein according to the invention is characterized in that said fusion polypeptides. are associated by covalent bond between two cysteines of the fragment of the ⁇ chain of the C4BP protein.
  • each monomer of the dimeric protein comprises the fragment of the ⁇ chain of the C4BP protein fused at the C-terminal end of a polypeptide heterologous to said ⁇ chain.
  • the heterologous polypeptide is chosen from the group consisting of enzymes, factors regulating enzymatic activity, receptor ligands, haptens, antigens, antibodies, antibody fragments, drugs , receptors, in particular mono-chain receptors or protein drug acceptors.
  • the antibody fragment comprises all or part of the variable regions of an antibody, functional for the Antigen-Antibody binding.
  • the invention also relates to a recombinant heterodimeric protein, characterized in that it consists of first and second fusion polypeptides, each fusion polypeptide comprising at least one fragment consisting of amino acids from positions 193 to 252 of the ⁇ chain of the human C4BP protein or a functional variant of this fragment by deletion, addition or substitution of one or more amino acids retaining the capacity to form an at least dimeric protein, said first fusion polypeptide further comprising a polypeptide heterologous to said ⁇ chain, and the second fusion polypeptide comprising a second heterologous polypeptide to said ⁇ chain different from the first heterologous polypeptide.
  • the fragment of the ⁇ chain of the human C4BP protein comprising at least the amino acids of positions 193 to 252, of the first and second fusion polypeptides, or a functional variant of this fragment, are respectively fused to the C-terminus of the first polypeptide of the second heterologous polypeptides.
  • the first and second heterologous polypeptides are chosen, independently of one another, from the group consisting of enzymes, factors regulating enzymatic activity, receptor ligands, haptens, antigens, antibodies, fragments of antibodies, drugs, receptors, especially monochemical receptors or protein drug acceptors.
  • the heterodimers are characterized in that the first and the second heterologous polypeptides are different ligands, different antibody sites or different monochain receptors.
  • the heterodimeric protein comprises a first heterologous polypeptide which is an antibody and a second heterologous polypeptide which is a drug.
  • the heterodimeric protein comprises a first heterologous polypeptide which is an antibody and a second heterologous polypeptide which is a protein drug acceptor.
  • the recombinant heterodimeric protein according to the invention is characterized in that said fusion polypeptides are associated by covalent bond between two cysteines of the fragment of the ⁇ chain of the C4BP protein.
  • the invention also relates to a recombinant eukaryotic cell allowing the synthesis of a dimeric or heterodimeric protein as defined above, and characterized in that it is capable of being obtained by the implementation of step (a ) of the process for obtaining the invention defined above.
  • the recombinant eukaryotic cell according to the invention is an insect cell, preferably an Sf9 cell line.
  • the invention also relates to the use, in a method for producing a recombinant dimeric protein, of a nucleic acid encoding a fusion polypeptide, said fusion polypeptide comprising at least the fragment 193-252 of the ⁇ chain of the C4BP protein or a functional variant of this fragment and a polypeptide heterologous to said ⁇ chain.
  • the invention relates to the use, in a process for producing a recombinant heterodimeric protein, of two nucleic acids: a) a first nucleic acid encoding a first fusion polypeptide, said first fusion polypeptide comprising at least the fragment consisting of amino acids from positions 193 to 252 of the ⁇ chain of the human C4BP protein or a functional fragment variant by addition, deletion or substitution of one or more amino acids, retaining the ability to form a heterodimeric protein, said first polypeptide a fusion further comprising a first polypeptide heterologous to said ⁇ chain, and b) a second nucleic acid encoding a second fusion polypeptide, said second fusion polypeptide comprising at least the fragment consisting of amino acids of positions 193 to 252 of the ⁇ chain of human C4BP protein or a functional fragment variant by addition, deletion or substitution of one or more amino acids, retaining the capacity to form a heterodimeric protein, said second fusion polypeptide further
  • the C4BP protein used for carrying out the invention is advantageously the human C4BP protein.
  • FIG. 1 is a diagram of the plasmid PAcgp76c into which has been introduced the nucleic acid coding for the fusion polypeptide consisting of the recognition site of GPA (glycophorin A) (scFv) and of a C-terminal fragment of the ⁇ chain C4BP protein (C4BPBeta).
  • GPA glycophorin A
  • C4BPBeta C-terminal fragment of the ⁇ chain C4BP protein
  • Figure 2 is an autoradiogram of a Western Blot after revelation using a labeled anti-scFv antibody.
  • Well 1 culture supernatant of sF9 cells infected with a virus containing the nucleic acid encoding anti-GPA scFv fused with the fragment
  • Well 2 culture supernatant of sF9 cells infected with a virus containing the nucleic acid encoding anti-GPA ScFv in fusion with the C-terminal fragment of the ⁇ chain of the C4BP protein. Production of scFv / C4BP ⁇ heptamers.
  • Well 3 culture supernatant of sF9 cells infected with a virus containing the nucleic acid encoding an unrelated recombinant protein
  • Figure 3 illustrates the result of the agglutination test
  • Figure 4 is an autoradiogram of a supernatant protein gel after immunoprecipitation using an anti-CR1 J3D3 antibody. Lane A shows electrophoresis under non-reducing conditions and lane B shows electrophoresis under reducing conditions. EXAMPLES: Production of a recombinant dimeric anti-GPA protein in Sf9 insect cells
  • a sequence encoding a fusion polypeptide consisting of the recognition site of the anti-GPA antibody (R18) (ScFv) and of a C-terminal fragment of the ⁇ chain (residues 137 to 252 of the ⁇ chain) has been introduced in the expression vector for baculovirus (pAcgp67) (Pharmingen, San Diego, USA; Stewart LMD, Hirst M., Nature 1991; 352: 85-88).
  • Figure 1 shows schematically the plasmid obtained.
  • the plasmid was co-transfected with linearized Baculogold DNA (Becton Dickinson, Le Pnt de Claix, France) in Sf9 insect cells in order to obtain recombinant viruses.
  • the insect cells (6.10 6 Sf9 cells) were infected with the recombinant viruses (6.10 7 viruses) in 10 ml of culture medium and incubated for 5 days at 27 ° C. according to the conventional method, for example described in the manual. instruction "Baculovirus Expression System”, May 99, Pharmingen, San Diego, USA, and in Guide to “Baculovirus Expression Vector Systems and Insect Cell Culture Techniques", Invitrogen, Cergy Pontoise France.
  • the culture supernatants were then concentrated 15 times on YM-20 centricon (Millipore, St Quentin en Yvelines, France) and then subjected to SDS-PAGE electrophoresis on a 4-15% Tris-HCl gradient gel (BioRad, Marnes la Coquette , France) in native conditions.
  • the Western Blot was revealed by an anti-ScFv antibody.
  • FIG. 2 The results show that the majority of the polypeptides containing the fragment ScFv in fusion with the C-terminal fragment of the ⁇ chain (well 1) migrate in the form of dimeric proteins with a molecular weight of approximately 85 kDa.
  • the polypeptides containing the ScFv fragment in fusion with the C-terminal fragment of the ⁇ chain (well 2) migrate in the form of hetpameric proteins with a molecular weight greater than 200 kDa.
  • the supernatants were collected 4 days (D4) and 6 days (D6) after infection.
  • the assay of the medium and previously concentrated supernatants was carried out with a spectrophometer at 280 nm.
  • the proteins are subjected to an electrophoresis on polyacrylamide gel. denaturing with SDS (acrylamide 4-15%, Tris HCI) then this gel is colored with Coomassie blue. A measurement is then carried out on the gel in order to estimate the percentage of the quantity of proteins contained in each strip relative to the total quantity of proteins.
  • concentration of total proteins obtained is as follows: On D4, 0.65 g / l of ScFv ⁇ proteins. On D6, 0.63 g / l of ScFv ⁇ proteins.
  • the percentage of the peak corresponding to the band of interest is evaluated at 5.7% of the total amount on D4, and 7.3% of the total amount on D6, ie 47 mg / liter of dimeric proteins of interest produced.
  • the yield obtained is approximately 76 ⁇ g of dimeric proteins / 10 ⁇ cells.
  • the ScFv antiglycophorin A model shows that it is possible to produce recombinant dimeric proteins in insect cells, and to obtain their secretion in a single molecular form, at a concentration of practical interest. 5. Functional test of the protein scFv / C4BP ⁇ : hemagglutination
  • the proteins produced are capable of agglutinating the erythrocytes and therefore of recognizing glycophorin A.
  • red blood cells are washed three times in PBS.
  • the culture supernatants are brought into contact with the red cells, incubated for 45 minutes at 37 ° C. then placed on a DiaMed-ID NaCI column, Enzyme test and cold agglutinins (DiaMed, Paris) and centrifuged.
  • CR1 Receptor 1 complement
  • erythrocytes which is involved in the capture and elimination of immune complexes.
  • the density of CR1 is reduced in pathologies such as AIDS or Systemic Lupus Erythematosus.
  • CHO cells transfected with an expression vector pKC3 J. Virol., 50, 1984, 606-6114 expressing a CR1 / C4BP ⁇ fusion polypeptide were cultured overnight in the presence of 32 Smethionine-cysteine. The culture supernatants are then immunoprecipitated by the anti-CR1 J3D3 monoclonal antibody. The immunoprecipitated proteins are then subjected to a PAGE-SDS electrophoresis (4% acrylamide) under non-reducing (lane A) and reducing (lane B) conditions (see FIG. 4).
  • Two different proteins are immunoprecipitated, one with a molecular weight of 200 kDa (monomer) and the other with a molecular weight of 375 kDa (dimer). When reduced, these two molecules have the same molecular weight.

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Abstract

L'invention est relative à un procédé d'obtention de protéines dimériques recombinantes, utilisant un acide nucléique codant le fragment C-terminal de la chaîne β de la protéine C4BP comprenant les résidus d'acides aminés 193 à 252 ou un variant fonctionnel de ce fragment, ledit fragment permettant l'association covalente des polypeptides hétérologues auxquels il est fusionné. L'invention porte également sur les protéines dimériques susceptibles d'être obtenues par le procédé et les cellules pour la mise en œuvre du procédé.

Description

A
UTILISATION DU GENE CODANT LA CHAINE β DE LA PROTEINE C4BP DANS LA PRODUCTION DE PROTEINES DIMERIQUES RECOMBINANTES
L'invention est relative à un procédé d'obtention de protéines dimériques recombinantes, utilisant un acide nucléique codant le fragment C-terminal de la chaîne β de la protéine C4BP comprenant les résidus d'acides aminés 193 à 252 ou un variant fonctionnel de ce fragment, ledit fragment permettant l'association covalente des polypeptides hétérologues auxquels il est fusionné. L'invention porte également sur les protéines dimériques susceptibles d'être obtenues par le procédé et les cellules pour la mise en oeuvre du procédé.
La possibilité de produire une protéine d'intérêt dans un système d'expression hétérologue constitue une application majeure de la biologie moléculaire. En particulier, la production de protéines d'intérêt dans des systèmes hétérologues permet d'obtenir des rendements de production élevés à moindre coût et de limiter les risques de contamination par des éléments indésirables, par exemple, virus ou prions comparativement aux méthodes de purification de protéines natives.
A titre d'exemples de biomolécules recombinantes d'intérêt en biotechnologie, on citera les antigènes, les anticorps ou leurs fragments, en particulier leurs fragments comportant tout ou partie des chaînes variables, les enzymes, les hormones, les cytokines ou les facteurs de croissance pour la production de vaccins, de kits de diagnostic ou de molécules à activité thérapeutique.
Parmi ces molécules biologiques, nombreuses sont celles qui, pour présenter l'activité biologique recherchée, voire pour présenter une activité biologique optimale, doivent s'assembler sous la forme d'un dimère. Pour leur production, il est donc nécessaire de s'assurer que l'étape de dimérisation est correctement effectuée. Selon la nature des monomères, l'assemblage en dimère a lieu spontanément après la synthèse des monomères, en général dans le réticulum endopiasmique, avant leur sécrétion dans le milieu extracellulaire. Cependant, dans certains cas, notamment lorsque les dimères sont mal ou non assemblés, il est nécessaire de recourir à une étape supplémentaire de couplage covalent des monomères. Des méthodes de couplages sont également requises pour la production d'hétérodimères particuliers.
On connaît dans l'état de la technique des méthodes de couplage utilisant un agent de pontage chimique pour l'obtention d'un conjugué. Le couplage est alors obtenu par des liaisons de type maléimide, succinimide, peptidique, disulfide et thioether. On peut en particulier se référer à l'ouvrage « Bioconjugate Techniques de Greg. T. HER ANSON (Académie Press, 1996) ».
Une méthode particulière consiste par exemple à ajouter, à une extrémité d'un peptide recombinant, une peptide hétérologue, dit peptide « linker », qui peut être aisément utilisé pour des liaisons disulfure, aminé ou acide. Une autre approche consiste à coupler chimiquement un groupement biotinyl, qui permet de coupler ensuite toute substance liée à la streptavidine.
Pour une revue générale de ces méthodes de couplage, on pourra se référer par exemple à Methods of Immunological Analysis, Volume 2, René Masseyeff, Winfried Albert, Norman A. Staines VCH. Décembre 1992 ; Handbook of Expérimental immunology, Volume 1, 2nd Edition, Ed. DM. Weir, Blackwell Scientific Publications, Oxford.
Les méthodes existantes, nécessitant une étape de réaction chimique supplémentaire à l'étape de synthèse proprement dite des monomères, sont toutefois mal adaptées à une production à grande échelle des protéines dimériques. En outre, pour certaines applications in vivo, il peut être nécessaire d'éviter l'utilisation d'agents pontants potentiellement immunogènes.
D'autres méthodes ont été proposées pour la production de protéines dimériques, consistant à produire un polypeptide de fusion, le polypeptide de fusion étant constitué du polypeptide d'intérêt et d'un domaine fonctionnel permettant la dimérisation.
Les domaines de dimérisation choisis sont par exemple les domaines des anticorps CL et CHI, la calmoduline ou le peptide liant la calmoduline correspondant, ou encore la streptavidine (Mϋller et al., FEBS Lett, 1998 422 : 259-264, Neri ét al., BioTechnology , 1995, 13 : 373-377).
Enfin, la méthode la plus fréquemment employée consiste à exprimer un seul acide nucléique codant deux polypeptides reliés entre eux par un linker peptidique. Le linker peptidique présente cependant l'inconvénient d'être potentiellement immunogène et peut donc ne pas satisfaire à l'ensemble des applications visées pour une protéine dimérique, notamment une protéine destinée à être administrée à l'homme ou l'animal.
Il existe par conséquent un besoin d'identifier une méthode simple permettant la production de protéines recombinantes dimériques d'intérêt dont l'assemblage se fait spontanément sans recourir à une étape de polymérisation supplémentaire.
Il existe en outre un besoin d'identifier une méthode permettant la production de protéines recombinantes dimériques d'intérêt, dont l'association ne nécessite pas l'utilisation de molécules potentiellement immunogènes.
La présente invention se propose de remédier, du moins en partie, aux inconvénients des méthodes décrites ci-dessus pour la production de protéines dimériques recombinantes. La protéine C4BP est impliquée dans la coagulation et le système du complément. La forme majoritaire de la C4BP est composée de 7 chaînes α identiques de 75 Kd et d'une chaîne β de 45 Kd. Les chaînes α et β contiennent respectivement 8 et 3 domaines SCR (Short Consensus Repeat), ces motifs étant retrouvés dans de nombreuses protéines régulatrices du complément et constitués de 50-70 acides aminés organisés en feuillets β.
Le rôle de la chaîne α dans la polymérisation de la protéine C4BP a été étudié par Kask et al. (Biochemistry, 2002, 41 , 9349-9357). Ces auteurs ont en particulier montré que la partie C-terminale de la chaîne α, notamment sa structure en hélice α et la présence de deux cystéines, est nécessaire à la polymérisation de la protéine C4BP, lorsque la chaîne α est exprimée dans un système hétérologue.
On a par ailleurs décrit la production de polymères constitués de sous-unités de fragment d'anticorps ou de récepteur du complément CR1 fusionnés à la partie C-terminale de la chaîne α de C4BP (Libyh et al., Blood, 1997, 90 : 3978-3983 ; Oudin et al., J. Immunol., 2000, 164, 1505-1513).
La demande EP 2 227 030 décrit également la production de protéines hétéromultimériques recombinantes par l'utilisation des fragments C- terminaux des chaînes α et β de la protéine C4BP en fusion avec des polypeptides d'intérêt.
A la connaissance de la Demanderesse, l'utilisation de la chaîne β de la protéine C4BP, indépendamment de son utilisation en association avec la chaîne α de la protéine C4BP, n'a en revanche jamais été décrite pour la production de protéines multimériques, et en particulier pour la production de protéines dimériques. Les inventeurs ont maintenant constaté de manière surprenante, que l'expression dans un système hétérologue, d'un acide nucléique codant en fusion le fragment C-terminal de la chaîne β de la protéine C4BP et un polypeptide d'intérêt, permettait la production de protéines dimériques recombinantes, dont les monomères sont liés de manière covalente.
Ainsi, l'invention concerne un procédé d'obtention d'une protéine dimérique recombinante, comprenant : a) la transfection de cellules hôtes par un vecteur permettant l'expression d'une séquence nucléotidique codant un polypeptide de fusion, ledit polypeptide de fusion comprenant au moins le fragment constitué des acides aminés des positions 193 à 252 de la chaîne β de la protéine C4BP humaine ou un variant fonctionnel de ce fragment par délétion, addition ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, conservant la capacité de former une protéine au moins dimérique, ledit polypeptide de fusion comprenant en outre un polypeptide hétérologue à ladite chaîne β, b) la culture des cellules transfectées dans des conditions appropriées pour l'expression de la séquence nucléotidique codant le polypeptide de fusion et l'association covalente de deux polypeptides de fusion in vivo pour former une protéine dimérique, c) la récupération des protéines dimériques formées.
Afin d'obtenir une protéine dimérique et non hexa- ou heptamérique, de préférence le système hétérologue ne doit pas contenir d'acide nucléique permettant l'expression ou une surexpression du fragment C-terminal de la chaîne α de la protéine C4BP, impliquée dans la polymérisation de la C4BP.
Au sens de l'invention, par « polypeptide hétérologue à la chaîne β », il faut comprendre tout polypeptide caractérisé par le fait que la séquence de ce polypeptide n'est pas naturellement associée au fragment de la chaîne β auquel il est fusionné. De préférence, il s'agit d'un polypeptide qui ne présente pas seul, la capacité de s'associer de façon covalente avec un autre polypeptide pour former un homodimère ou un hétérodimère.
On citera à titre d'exemples de polypeptide hétérologue, des enzymes, des facteurs de régulation d'activité enzymatique, des ligands de récepteurs, des haptènes, des antigènes, des anticorps, des fragments d'anticorps, des récepteurs, notamment des récepteurs monochaînes ou des accepteurs protéiques de médicament.
Bien entendu, l'homme du métier choisira la séquence d'un polypeptide hétérologue en fonction de l'application qu'il souhaite. Les séquences des polypeptides peuvent être choisies par exemple parmi les principes actifs de médicaments, incluant les immunotoxines, les antioxydants, les antibiotiques, les facteurs de croissance, les hormones intracellulaires, les cytokines, les toxines, les neuromédiateurs, les agents antimicrobiens, en particulier, antiviraux, antibactériens et antiparasitaires, ou antitumoraux ou encore tout autre agent thérapeutique ou prophylactique d'intérêt.
Les séquences de polypeptides seront choisies notamment parmi les immunoglobulines et les fragments d'anticorps, en particulier les fragments correspondant aux domaines variables ou à des parties actives immunologiquement de ces domaines, telles que les scFv (single chain Fragment variable), les enzymes dimériques comme la fumarylacétoacétate hydrolase, ou encore les récepteurs dimériques comme le récepteur pour le C3Bi (CD11+CD18).
La séquence polypeptidique de la chaîne β de la protéine C4BP humaine est décrite dans Hillarp et Dahlbâck (1990, PNAS, Vol. 87, pp 1183-1187), ainsi que la séquence de l'ADNc la codant.
Une séquence de la chaîne β de la protéine C4BP et son ADNc est également décrite dans la base de données NCBI sous le numéro d'accession NM_000716 dont la numérotation protéique est utilisée ici. Le fragment correspondant aux positions 193-252 est identifié par référence à cette séquence et peut par exemple être obtenu par amplification PCR à partir d'une banque d'ADNc humain en choisissant des amorces hybridant spécifiquement aux extrémités correspondantes de la séquence codant le fragment souhaité de la chaîne β. Il peut alternativement être obtenu par toute méthode appropriée connue de l'homme du méfier.
Pour simplifier la lecture, dans le texte qui suit, on entend par le terme « fragment 193-252 » ou « fragment 193-252 de la chaîne β », sauf précision spécifique, le fragment constitué de l'enchaînement consécutif des acides aminés des positions 193 à 252 de la chaîne β de la protéine C4BP humaine.
Dans un mode de réalisation préféré, le fragment 193-252 de la chaîne β de la protéine C4BP humaine a la séquence polypeptidique suivante :
LIQEAPKPECEKALLAFQESKNLCEAMENFMQQLKESGMTMEELKYSLELK KAELKAKLL.
Une séquence d'acide nucléique correspondant à cette séquence polypeptidique est également décrite par Hillarp et Dahlbâck (1990, PNAS, Vol. 87, pp 1183-1187).
Pour la production de protéines dimériques recombinantes selon l'invention, l'homme du métier peut utiliser également une séquence codant un variant fonctionnel du fragment 193-252, conservant la capacité de former au moins un dimère, par exemple un homodimère ou hétérodimère, un trimère, un tétramère ou tout multimère contenant un nombre varié de polypeptides de fusion.
Au sens de l'invention, on entend par l'expression « variant fonctionnel du fragment 193-252 », une séquence polypeptidique modifiée par rapport à la séquence du fragment 193-252 de la chaîne β, par délétion, substitution ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence modifiée conservant néanmoins la capacité de former des protéines au moins dimériques par le procédé de l'invention. Plus précisément, la production de protéines dimériques en utilisant une séquence codant un variant fonctionnel du fragment 193-252 doit être d'au moins 80% égale à celle obtenue avec une séquence native codant le fragment 193-252, de préférence au moins 90%, dans un système d'expression identique. De préférence, le variant est tel que plus de 80% des polypeptides de fusion qui le contiennent sont produits sous forme de dimères dans un système d'expression eucaryote selon l'invention. •
Dans un premier mode de réalisation particulier, un variant fonctionnel correspond en particulier à un fragment de la chaîne β contenant le fragment 193-252 et contenant également une séquence adjacente de la chaîne β en amont de ce fragment, incluant par exemple la dernière séquence SCR (résidus 136-192) et/ou 4 ou 5 acides aminés [GS]. Des séquences codant des fragments plus longs de la chaîne β, voire toute la chaîne β, peuvent également être utilisées. Pour certaines applications, il est préférable d'éviter d'utiliser une séquence codant une chaîne β capable de lier la protéine S participant à la coagulation. Si la séquence choisie code pour un fragment contenant les deux premiers motifs SCR de la chaîne β, ceux-ci seront de préférence des versions mutées par addition, délétion ou substitution d'acides aminés, de sorte à supprimer la possibilité d'interaction avec la protéine S. L'addition des motifs SCR et/ou domaines [GS] peut être réalisée dans le but de modifier, par exemple d'augmenter, la flexibilité du polypeptide de fusion ainsi obtenu ou encore pour permettre au polypeptide de fusion ou au polypeptide hétérologue d'adopter une conformation appropriée pour la formation des multimères, particulièrement des dimères, et appropriée à son activité biologique (fixation, catalyse de la réaction enzymatique, interaction avec le médicament).
Dans un mode de réalisation particulier, une séquence codant un variant du fragment 193-252 de la chaîne β est une séquence dont l'acide nucléique correspondant est capable d'hydrider dans des conditions stringentes avec la séquence codant le fragment 193-252 telle que décrite par Hillarp et Dahlbâck (1990, PNAS, Vol. 87, pp 1183-1187).
Par « conditions stringentes », on entend les conditions qui permettent l'hybridation spécifique de deux séquences d'ADN simple brin à environ 65°C par exemple dans une solution de 6 x SSC, 0,5% SDS, 5X Denhardt's solution et 100 μg d'ADN non spécifique ou toute autre solution de force ionique équivalente et après un lavage à 65°C, par exemple dans une solution d'au plus 0,2 x SSC et 0,1% SDS ou toute autre solution de force ionique équivalente.
De préférence, la séquence de nucléotides (polynucléotide) codant pour un variant fonctionnel du fragment 193-252 susdit et hybridant dans des conditions stringentes avec la séquence codant ledit fragment a, dans la partie qui hybride, une longueur au moins égale à 50%, de préférence au moins 80%, de la longueur de la séquence codant le fragment 193-252. Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de nucléotides (polynucléotide) codant pour un variant fonctionnel du fragment 193-252 susdit et hybridant dans des conditions stringentes avec la séquence codant ledit fragment a, dans la partie qui hybride, substantiellement la même longueur que la séquence codant le fragment 193-252 susdit.
Dans un autre mode de réalisation, un variant fonctionnel est une séquence modifiée du fragment 193-252, dont un ou plusieurs acides aminés non essentiels à la fonction de dimérisation ont été supprimés ou substitués et/ou un ou plusieurs acides aminés essentiels à la dimérisation ont été remplacés par des acides aminés de groupes fonctionnels équivalents (substitution conservative). Il est en particulier recommandé que les deux cystéines, situées aux positions 201 et 215, ainsi que la structure peptidique autour de ces cystéines, soient conservées pour permettre la formation de ponts disulfures nécessaires à la dimérisation, par exemple par la conservation d'au moins 3 acides aminés en amont et en aval de chaque cystéine.En particulier, un variant fonctionnel peut aussi être obtenu en insérant une séquence hétérologue à la chaîne β, et notamment des domaines de la chaîne α de C4BP, entre les cystéines responsables de la dimérisation, ou au contraire en supprimant certains acides aminés présents entre ces mêmes cystéines. Alternativement, on peut réaliser un variant fonctionnel par la modification ponctuelle de certains acides aminés, et en particulier la substitution d'une cysteine responsable de la dimérisation par un acide aminé neutre en terme d'implication dans le processus de dimérisation (par exemple les acides aminés A, V, F, P, M, I, L et W), et dans le même temps la substitution d'un autre acide aminé par une cysteine de façon à conserver la capacité de formation de ponts disulfures intracaténaires et/ou intercaténaires entre les cystéines. Ces modifications conduisent ainsi à la variation de l'écartement entre les différentes cystéines impliquées dans le processus de multimérisation, notamment dimérisation.
Les modifications apportées à la chaîne β de la protéine C4BP peuvent notamment être déterminées pour modifier, en particulier améliorer, l'accessibilité du polypeptide hétérologue dans le polypeptide de fusion, par exemple en modifiant la flexibilité du polypeptide de fusion.
De façon préférée, moins de 50% des acides aminés du fragment 193-252 sont ainsi supprimés ou remplacés, et mieux, moins de 25%, voire encore mieux, moins de 10% (par exemple 5 acides aminés ou moins) ou moins de 5% (1 ou 2 acides aminés).
Les séquences codant le fragment C-terminal de la chaîne β et codant le polypeptide d'intérêt _ sont fusionnées et clonées dans un vecteur d'expression approprié. De préférence, le polypeptide de fusion codé par la séquence nucléotidique contient dans sa partie N-terminale, le polypeptide hétérologue et dans sa partie C-terminale, le fragment de la chaîne β de la protéine C4BP. Le vecteur d'expression est choisi en fonction de la cellule hôte dans laquelle la construction est introduite. De préférence, le vecteur d'expression est choisi parmi les vecteurs permettant l'expression dans des cellules eucaryotes, et notamment parmi des vecteurs chromosomiques, ou épisomiques ou dérivés de virus, et en particulier des vecteurs dérivés de plasmides, de chromosomes de levures, ou de virus tels que des baculovirus, des papovirus ou SV40, des rétrovirus, ou leurs combinaisons, notamment des phagemides et des cosmides. De préférence, il s'agit d'un vecteur permettant l'expression de baculovirus, capable d'infecter des cellules d'insectes.
Le cas échéant, la séquence codant le polypeptide de fusion comprend • également, préférentiellement dans sa partie 5', une séquence codant un peptide signal pour la sécrétion du polypeptide de fusion. Classiquement, la séquence d'un peptide signal est une séquence de 15 à 20 acides aminés, riche en acides aminés hydrophobes (Phe, Leu, Ile, Met et Val). A titre d'exemples de peptide signal, on citera en particulier la séquence signal gp67 telle qu'utilisée dans le vecteur d'expression choisi dans la partie expérimentale.
Le vecteur comprend toutes les séquences nécessaires à l'expression de la séquence codant le polypeptide de fusion. En particulier, il comprend un promoteur approprié, choisi en fonction de la cellule dans laquelle la construction doit être introduite.
Un exemple de vecteur d'expression pour baculovirus est décrit dans la partie expérimentale.
Au sens de l'invention, on entend par « cellule hôte », une cellule capable d'exprimer un gène porté par un acide nucléique hétérologue à la cellule et qui a été introduit dans le génome de la cellule par une méthode de transfection. De préférence, une cellule hôte est une cellule eucaryote. Une cellule hôte eucaryote est en particulier sélectionnée parmi les cellules de levures, telles que S. cerevisiae, les cellules de champignons filamenteux, telles que Aspergillus sp., les cellules d'insectes telles que les cellules S2 de Drosophila, ou Sf9 de Spodoptera, les cellules de mammifères ou les cellules de plantes.
Parmi les cellules de mammifères, on citera en particulier, les lignées cellulaires de mammifères, telles que les cellules CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, HepG2 ou encore les cellules L(TK-).
Dans un mode de mise en œuvre préféré, lesdites cellules hôtes sont choisies parmi des lignées cellulaires eucaryotes, de préférence il s'agit des cellules d'insectes Sf9.
Toute méthode de transfection connue de l'homme du métier pour l'obtention de cellules exprimant un acide nucléique hétérologue peut être utilisée pour la mise en œuvre de l'étape (a) du procédé. Des méthodes de transfection sont par exemple décrites dans Sambrook et al., 2001 (Molecular Cloning : A laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor, laboratory press, Cold Spring Harbor, New York).
Dans un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, la cellule hôte permet la co-expression de deux polypeptides de fusion, un premier polypeptide de fusion A, constitué de la fusion d'un fragment 193-252 ou d'un variant fonctionnel de ce fragment avec un polypeptide d'intérêt A', et un second polypeptide de fusion B, constitué de la fusion d'un fragment 193-252 ou d'un variant fonctionnel de ce fragment avec un polypeptide d'intérêt B'. Dans ce mode de réalisation particulier, la co-expression des deux polypeptides de fusion permet outre la production des homodimères A-A et B-B, la production d'hétérodimères A-B.
Les polypeptides d'intérêt A' et B' sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, dans le groupe constitué des enzymes, des facteurs de régulation d'activité enzymatique, des ligands de récepteurs, des haptènes, des antigènes, des anticorps, des fragments d'anticorps, des médicaments, des récepteurs, notamment des récepteurs monochaînes ou des accepteurs protéiques de médicament.
L'expression « choisis indépendamment l'un de l'autre » signifie que les deux polypeptides d'intérêt A' et B' (ou polypeptides hétérologues) peuvent être de nature différente, c'est à dire par exemple l'un est une enzyme, l'autre un récepteur ou au contraire de même nature, c'est à dire deux ligands, deux anticorps ou de récepteurs monochaînes. Lorsque la nature des polypeptides hétérologues est identique, il n'en demeure pas moins que les deux polypeptides peuvent être différents par exemple dans leur composition protéique ou dans leurs modifications post-traductionnelles ; Ainsi, le- procédé d'obtention permet également la production d'hétérodimères, dans lesquels les premier et second polypeptides hétérologues de ces hétérodimères comportent chacun un site anticorps différent de celui de l'autre polypeptide, un ligand différent de celui de l'autre polypeptide ou un récepteur monochaîne différent de celui de l'autre polypeptide.
Par le terme « différent » quant on se réfère à des exemples de polypeptides hétérologues, on entend une séquence protéique dont la séquence primaire (séquence en acides aminés) de l'un des polypeptides hétérologues est différente par au moins un acide aminé de la séquence primaire de l'autre polypeptide. Par exemple, les séquences primaires peuvent être différentes pour l'ensemble des acides aminés bien que les protéines soient de même nature, par exemple deux enzymes, deux antigènes ou deux haptènes. Alternativement, le terme « différent » couvre également des polypeptides hétérologues ayant la même séquence primaire, mais possédant des modifications post-traductionnelles différentes, par exemple en terme d'acétylation, d'amidation, de biotinylation, de carboxylation, d'hydroxylation, de méthylation, de phosphorylation ou de sulfatation, ou par l'ajout de lipides (isoprénylation, palmitoylation et myristoylation), de glucides (glycosylation) ou de polypeptides (ubiquitination). Par l'expression « site anticorps », on entend les séquences proteiques nécessaires à la reconnaissance d'un antigène donné, et notamment les domaines variables (des chaînes lourdes et/ou légères) d'une immunoglobuline.
Par « accepteur protéique de médicament », on entend tout acide aminé, chaîne peptidique (au moins deux acides aminés consécutifs) ou ensemble d'acides aminés (au moins deux acides aminés non consécutifs) interagissant avec un médicament.
Ainsi, l'invention porte également sur un procédé d'obtention d'hétérodimères, ledit procédé comprenant :
a. la transfection de cellules hôtes par un ou plusieurs vecteurs permettant l'expression d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques codant : i. un premier polypeptide de fusion, ledit polypeptide de fusion comprenant le fragment 193-252 de la chaîne β de la protéine C4BP humaine ou un variant fonctionnel de ce fragment et un premier polypeptide hétérologue à ladite chaîne β, et ii. un second polypeptide de fusion, ledit polypeptide de fusion comprenant au moins le fragment 193-252 de la chaîne β de la protéine C4BP humaine ou un variant fonctionnel de ce fragment et un second polypeptide hétérologue à ladite chaîne β dont la séquence est différente de celle du premier polypeptide hétérologue,
b. la culture des cellules transfectées dans des conditions appropriées pour l'expression de la ou des séquences nucléotidiques codant le premier et le second polypeptides de fusion et l'association de deux polypeptides de fusion in vivo pour former une protéine hétérodimérique,
c. la récupération des protéines hétérodimériques formées. L'invention vise également une protéine dimérique ou hétérodimérique recombinante, susceptible d'être obtenue par l'un des procédés d'obtention décrits ci-dessus.
L'invention porte en particulier sur une protéine dimérique recombinante caractérisée en ce qu'elle est constituée de deux polypeptides de fusion, chaque polypeptide de fusion comprenant au moins le fragment 193-252 de la chaîne β de la protéine C4BP humaine ou un variant fonctionnel de ce fragment et un polypeptide hétérologue à ladite chaîne β.
Dans un mode de réalisation particulier, la protéine dimérique recombinante selon l'invention est caractérisée en ce que lesdits polypeptides de fusion . sont associés par liaison covalente entre deux cystéines du fragment de la chaîne β de la protéine C4BP.
De préférence, chaque monomère de la protéine dimérique comprend le fragment de la chaîne β de la protéine C4BP fusionné à l'extrémité C- terminale d'un polypeptide hétérologue à ladite chaîne β.
Dans un mode de réalisation particulier, le polypeptide hétérologue est choisi dans le groupe constitué des enzymes, des facteurs de régulation d'activité enzymatique, des ligands de récepteurs, des haptènes, des antigènes, des anticorps, des fragments d'anticorps, des médicaments, des récepteurs, notamment des récepteurs monochaînes ou des accepteurs proteiques de médicament. Par exemple, le fragment d'anticorps comporte tout ou partie des régions variables d'un anticorps, fonctionnel pour la liaison Antigène- Anticorps.
L'invention porte également sur une protéine hétérodimérique recombinante, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un premier et d'un second polypeptides de fusion, chaque polypeptide de fusion comprenant au moins un fragment constitué des acides aminés des positions 193 à 252 de la chaîne β de la protéine C4BP humaine ou un variant fonctionnel de ce fragment par délétion, addition ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés conservant la capacité de former une protéine au moins dimérique, ledit premier polypeptide de fusion comprenant en outre un polypeptide hétérologue à ladite chaîne β, et le second polypeptide de fusion comprenant un second polypeptide hétérologue à ladite chaîne β différent du premier polypeptide hétérologue.
Dans un mode de réalisation particulier, le fragment de la chaîne β de la protéine C4BP humaine, comprenant au moins les acides aminés des positions 193 à 252, du premier et du second polypeptides de fusion, ou un variant fonctionnel de ce fragment, sont respectivement fusionnés à l'extrémité C-terminale du premier polypeptide du second polypeptides hétérologues.
Les premier et second polypeptides hétérologues sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, dans le groupe constitué des enzymes, des facteurs de régulation d'activité enzymatique, des ligands de récepteurs, des haptènes, des antigènes, des anticorps, des fragments d'anticorps, des médicaments, des récepteurs, notamment des récepteurs monochaînes ou des accepteurs proteiques de médicament.
Ainsi, les hétérodimères sont caractérisés en ce le premier et le second polypeptides hétérologues sont des ligands différents, des sites anticorps différents ou des récepteurs monochaînes différents.
Dans un mode de réalisation préféré, la protéine hétérodimérique comprend un premier polypeptide hétérologue qui est un anticorps et un second polypeptide hétérologue qui est un médicament. Dans un autre mode de réalisation préféré, la protéine hétérodimérique comprend un premier polypeptide hétérologue qui est un anticorps et un second polypeptide hétérologue qui est un accepteur protéique de médicament. Dans un mode de réalisation particulier, la protéine hétérodimérique recombinante selon l'invention est caractérisée en ce que lesdits polypeptides de fusion sont associés par liaison covalente entre deux cystéines du fragment de la chaîne β de la protéine C4BP.
L'invention concerne également une cellule eucaryote recombinante permettant la synthèse d'une protéine dimérique ou hétérodimérique telle que définie ci-dessus, et caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par la mise en œuvre de l'étape (a) du procédé d'obtention de l'invention définie plus haut. Dans un mode de réalisation particulier, la cellule eucaryote recombinante selon l'invention est une cellule d'insecte, de préférence une lignée cellulaire Sf9.
L'invention porte également sur l'utilisation, dans un procédé de production d'une protéine dimérique recombinante, d'un acide nucléique codant un polypeptide de fusion, ledit polypeptide de fusion comprenant au moins le fragment 193-252 de la chaîne β de la protéine C4BP ou un variant fonctionnel de ce fragment et un polypeptide hétérologue à ladite chaîne β.
Enfin, l'invention concerne l'utilisation, dans un procédé de production d'une protéine hétérodimérique recombinante, de deux acides nucléiques : a) un premier acide nucléique codant un premier polypeptide de fusion, ledit premier polypeptide de fusion comprenant au moins le fragment constitué des acides aminés des positions 193 à 252 de la chaîne β de la protéine C4BP humaine ou un variant fonctionnel de fragment par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, conservant la capacité de former une protéine hétérodimérique, ledit premier polypeptide de fusion comprenant en outre un premier polypeptide hétérologue à ladite chaîne β, et b) un second acide nucléique codant un second polypeptide de fusion, ledit second polypeptide de fusion comprenant au moins le fragment constitué des acides aminés des positions 193 à 252 de la chaîne β de la protéine C4BP humaine ou un variant fonctionnel de fragment par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, conservant la capacité de former une protéine hétérodimérique, ledit second polypeptide de fusion comprenant en outre un second polypeptide hétérologue à ladite chaîne β dont la séquence est différente de celle du premier polypeptide hétérologue .
La protéine C4BP utilisée pour la réalisation de l'invention est avantageusement la protéine C4BP humaine.
Les exemples qui suivent permettent d'illustrer certains modes de réalisation préférés du procédé de l'invention et de comprendre plus aisément sa mise en œuvre, sans toutefois limiter la portée de l'invention.
DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 est un schéma du plasmide PAcgp76c dans lequel a été introduit l'acide nucléique codant le polypeptide de fusion constitué du site de reconnaissance de la GPA (glycophorine A) (scFv) et d'un fragment C- terminal de la chaîne β de la protéine C4BP (C4BPBeta).
La figure 2 est un autoradiogramme d'un Western Blot après révélation à l'aide d'un anticorps anti-scFv marqué.
Puits 1 : surnageant de culture de cellules sF9 infectées par un virus contenant l'acide nucléique codant scFv anti-GPA fusionné avec le fragment
C-terminal de la chaîne β de la protéine C4BP. Production de monomères et dimères (en majorité) scFv/C4BPβ.
Puits 2 : surnageant de culture de cellules sF9 infectées par un virus contenant I' acide nucléique codant ScFv anti-GPA en fusion avec le fragment C-terminal de la chaîne α de la protéine C4BP. Production d'heptamères scFv/C4BPα.
Puits 3 : surnageant de culture de cellules sF9 infectées par un virus contenant l'acide nucléique codant une protéine recombinante non relatée,
Témoin négatif.
La figure 3 illustre le résultat du test d'agglutination
Colonne 1 : Anticorps anti-glycophorine A, Témoin positif
Colonne 2 : Surnageant cellules sF9 infectées par un virus recombinant
(protéine non relatée), Témoin négatif
Colonne 3 : Surnageant cellules sF9 infectées par un virus recombinant scFv antiGPA/C4BPβ, agglutination des hématies.
La figure 4 est un autoradiogramme d'un gel de protéines de surnageants après immunoprécipitation à l'aide d'un anticorps anti-CR1 J3D3. La piste A montre une électrophorèse en conditions non réductrices et la piste B montre une électrophorèse en conditions réductrices. EXEMPLES : Production d'une protéine recombinante dimérique anti- GPA dans des cellules d'insectes Sf9
1. Préparation du plasmide permettant l'expression d'un polypeptide de fusion
Une séquence codant un polypeptide de fusion constitué du site de reconnaissance de l'anticorps anti-GPA (R18) (ScFv) et d'un fragment C- terminal de la chaîne β (résidus 137 à 252 de la chaîne β) a été introduite dans le vecteur d'expression pour baculovirus (pAcgp67) (Pharmingen, San Diego, USA ; Stewart L.M.D, Hirst M., Nature 1991 ; 352 :85-88). La figure 1 présente de façon schématique le plasmide obtenu.
2. Transfection des cellules d'insectes Sf9
La plasmide a été co-transfecté avec l'ADN Baculogold linéarisé (Becton Dickinson, Le Pnt de Claix, France) dans les cellules d'insectes Sf9 en vue d'obtenir des virus recombinants.
3. Production de protéines dimériques ScFv anti-GPA/C4BPβ dans des cellules d'insectes Sf9
Les cellules d'insectes (6.106 cellules Sf9) ont été infectées par les virus recombinants (6.107 virus) dans 10 ml de milieu de culture et incubées 5 jours à 27°C selon la méthode classique par exemple décrite dans le manuel d'instruction « Baculovirus Expression System », May 99, Pharmingen, San Diego, USA, et dans Guide to « Baculovirus Expression Vector Systems and Insect Cell Culture Techniques », Invitrogen, Cergy Pontoise France. Les surnageants de culture ont ensuite été concentrés 15 fois sur centricon YM- 20 (Millipore, St Quentin en Yvelines, France) puis soumis à une électrophorèse SDS-PAGE sur gel à gradient 4-15% Tris-HCI (BioRad, Marnes la Coquette, France) en conditions natives. Le Western Blot a été révélé par un anticorps anti-ScFv. Les résultats sont présentés à la figure 2. Le résultat montre que la majorité des polypeptides contenant le fragment ScFv en fusion avec le fragment C-terminal de la chaîne β (puits 1) migrent sous la forme de protéines dimériques d'un poids moléculaire d'environ 85 kDa. Les polypeptides contenant le fragment ScFv en fusion avec le fragment C-terminal de la chaîne α (puits 2) migrent sous la forme de protéines hetpamériques d'un poids moléculaire supérieur à 200 kDa.
4. Estimation de la concentration en protéines dimériques scFv/C4BPβ
Les surnageants ont été récupérés 4 jours (J4) et 6 jours (J6) après l'infection. Le dosage du milieu et des surnageants préalablement concentrés a été réalisé au spectrophomètre à 280nm.
Les protéines sont soumises à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide . dénaturant au SDS (acrylamide 4-15%, Tris HCI) puis ce gel est coloré au bleu de Coomassie. Une mesure est ensuite réalisée sur le gel afin d'estimer le pourcentage de la quantité des protéines contenues dans chaque bande par rapport à la quantité totale de protéines. La concentration en protéines totales obtenues est la suivante : A J4, 0,65 g/l de protéines ScFv β. A J6, 0,63 g/l de protéines ScFv β.
Le pourcentage du pic correspondant à la bande d'intérêt est évalué à 5,7% de la quantité totale à J4, et 7,3% de la quantité totale à J6, soit 47 mg/litre de protéines dimériques d'intérêt produites.
Ainsi, rapporté au nombre de cellules, à J6, le rendement obtenu est d'environ 76μg de protéines dimériques /10δ cellules.
Le modèle ScFv antiglycophorine A montre qu'il est possible de produire des protéines dimériques recombinantes dans des cellules d'insecte, et d'obtenir leur sécrétion dans une seule forme moléculaire, à une concentration d'intérêt pratique. 5. Test fonctionnel de la protéine scFv/C4BPβ : hémagglutination
Afin de vérifier que les dimères produits sont fonctionnels, il a été vérifié que les protéines produites étaient capables d'agglutiner les érythrocytes et donc de reconnaître la glycophorine A.
Pour ce faire, les globules rouges sont lavés trois fois dans du PBS. Les surnageants de culture sont mis en contact avec les hématies, incubés 45 minutes à 37°C puis mis sur colonne DiaMed-ID NaCI, Enzyme test and cold agglutinins (DiaMed, Paris) et centrifugés.
Le résultat présenté à la figure 3 montre que les protéines produites sont capables d'agglutiner les érythrocytes et sont donc fonctionnelles (colonne
3).
6. Production d'une protéine dimérique CR1/C4BPβ
Le CR1 (complément Receptor 1) est une glycoprotéine transmembranaire des érythrocytes qui intervient dans la capture et l'élimination des complexes immuns. La densité de CR1 est diminuée dans des pathologies comme le SIDA ou le Lupus Erythémateux Disséminé.
Les cellules CHO transfectées avec un vecteur d'expression pKC3 (J. Virol., 50, 1984, 606-614) exprimant un polypeptide de fusion CR1/C4BPβ ont été cultivées une nuit en présence de 32Sméthionine-cystéine. Les surnageants de culture sont ensuite immuno-précipités par l'anticorps monoclonal anti- CR1 J3D3. Les protéines immuno-précipitées sont ensuite soumises à une électrophorèse PAGE-SDS (4% d'acrylamide) en conditions non réductrices (piste A) et réductrices (piste B) (voir figure 4). Deux protéines différentes sont immunoprécipitées, une d'un poids moléculaire de 200 kDa (monomère) et l'autre d'un poids moléculaire de 375 kDa (dimère). Une fois réduite, ces deux molécules ont le même poids moléculaire.
Ces résultats confirment la production de protéines majoritairement sous la forme de dimères par le procédé de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'obtention d'une protéine dimérique recombinante, comprenant a. la transfection de cellules hôtes par un vecteur permettant l'expression d'une séquence nucléotidique codant un polypeptide de fusion, ledit polypeptide de fusion comprenant au moins le fragment constitué des acides aminés des positions 193 à 252 de la chaîne β de la protéine C4BP humaine ou un variant fonctionnel de ce fragment par délétion, addition ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, conservant la capacité de former une protéine au moins dimérique, ledit polypeptide de fusion comprenant en outre un polypeptide hétérologue à ladite chaîne β, b. la culture des cellules transfectées dans des conditions appropriées pour l'expression de la séquence nucléotidique codant le polypeptide de fusion et l'association covalente de deux polypeptides de fusion in vivo pour former une protéine dimérique, c. la récupération des protéines dimériques formées.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les cellules transfectées ne contiennent pas d'acide nucléique permettant l'expression d'une séquence nucléotidique codant le fragment C- terminal de la chaîne α de la protéine C4BP impliquée dans la polymérisation de la protéine C4BP.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit polypeptide hétérologue est choisi dans le groupe constitué des enzymes, des facteurs de régulation d'activité enzymatique, des ligands de récepteurs, des haptènes, des antigènes, des anticorps, des fragments d'anticorps, des médicaments, des récepteurs, notamment des récepteurs monochaînes ou des accepteurs proteiques de médicament.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le fragment 193-252 de la chaîne β de la protéine C4BP humaine a la séquence suivante : LIQEAPKPECEKALLAFQESKNLCEAMENFMQQLKESGMTMEELKY SLELKKAELKAKLL
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'une séquence codant un variant fonctionnel du fragment 193-252 de la chaîne β est une séquence dont l'acide nucléique correspondant est capable d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence codant le fragment 193-252 de la chaîne β de la protéine C4BP humaine.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'un variant fonctionnel est une séquence modifiée du fragment 193-252 de la chaîne β, dont un ou plusieurs acides aminés non essentiels à la fonction de dimérisation ont été supprimés et/ou un ou plusieurs acides aminés essentiels à la dimérisation ont été remplacés par des acides aminés de groupes fonctionnels équivalents.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce moins de 50% des acides aminés du fragment 193-252 ont été supprimés ou remplacés, et de préférence, moins de 25%, avantageusement moins de 10%.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que lesdites cellules hôtes sont choisies parmi des lignées cellulaires eucaryotes, de préférence des cellules d'insectes Sf9.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le vecteur est un vecteur d'expression recombinant pour baculovirus.
10. Procédé d'obtention d'hétérodimères, ledit procédé comprenant : a. la transfection de cellules hôtes par un ou plusieurs vecteurs permettant l'expression d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques codant : i. un premier polypeptide de fusion, ledit polypeptide de fusion comprenant le fragment 193-252 de la chaîne β de la protéine C4BP humaine ou un variant fonctionnel de ce fragment et un • premier polypeptide hétérologue à ladite chaîne β, et . ii. un second polypeptide de fusion, ledit polypeptide de fusion comprenant au moins le fragment 193-252 de la chaîne β de la protéine C4BP humaine ou un variant fonctionnel de ce fragment et un second polypeptide hétérologue à ladite chaîne β dont la séquence est différente de celle du premier polypeptide hétérologue, b. la culture des cellules transfectées dans des conditions appropriées pour l'expression de la ou des séquences nucléotidiques codant le premier et le second polypeptides de fusion et l'association de deux polypeptides de fusion in vivo pour former une protéine hétérodimérique, c. la récupération des protéines hétérodimériques formées.
11. Procédé d'obtention d'hétérodimères selon la revendication 10, dans lequel lesdits premier et second polypeptides hétérologues sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, dans le groupe constitué des enzymes, des facteurs de régulation d'activité enzymatique, des ligands de récepteurs, des haptènes, des antigènes, des anticorps, des fragments d'anticorps, des médicaments, des récepteurs, notamment des récepteurs monochaînes ou des accepteurs proteiques de médicament.
12. Procédé d'obtention d'hétérodimères selon l'une quelconque des revendications 10 à 11 , lesdits premier et second polypeptides hétérologues des hétérodimères comportant chacun un site anticorps différent de l'autre polypeptide, un ligand différent de l'autre polypeptide ou un récepteur monochaîne différent de l'autre polypeptide.
13. Protéine dimérique recombinante, susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.
14. Protéine dimérique recombinante, caractérisée en ce qu'elle est constituée de deux polypeptides de fusion, chaque polypeptide de fusion comprenant au moins un fragment constitué des acides aminés des positions 193 à 252 de la chaîne β de la protéine C4BP humaine ou un variant fonctionnel de ce fragment par délétion, addition ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés conservant la capacité de former une protéine au moins dimérique, ledit polypeptide de fusion comprenant en outre un polypeptide hétérologue à ladite chaîne β.
15. Protéine dimérique recombinante selon la revendication 14, caractérisée en ce que le fragment de la chaîne β de la protéine C4BP humaine comprenant au moins les acides aminés des positions 193 à 252, ou un variant fonctionnel de ce fragment, est fusionné à l'extrémité C-terminale du polypeptide hétérologue.
16. Protéine dimérique selon l'une quelconque des revendications 14 à 15, caractérisée en ce que le polypeptide hétérologue est choisi dans le groupe constitué des enzymes, des facteurs de régulation d'activité enzymatique, des ligands de récepteurs, des haptènes, des antigènes, des anticorps, des fragments d'anticorps, des médicaments, des récepteurs, notamment des récepteurs monochaînes ou des accepteurs proteiques de médicament.
17. Protéine dimérique selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisée en ce que le polypeptide hétérologue est un fragment d'anticorpscomportant tout ou partie des régions variables d'un anticorps fonctionnel pour la liaison Antigène-Anticorps.
18. Protéine hétérodimérique recombinante, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un premier et d'un second polypeptides de fusion, chaque polypeptide de fusion comprenant au moins un fragment constitué des acides aminés des positions 193 à 252 de la chaîne β de la protéine C4BP humaine ou un variant fonctionnel de ce fragment par délétion, addition ou substitution d'un ou plusieurs acides concernant la capacité de former une protéine dimérique, ledit premier polypeptide de fusion comprenant en outre un polypeptide hétérologue à ladite chaîne β, et le second polypeptide de fusion comprenant un second polypeptide hétérologue à ladite chaîne β différent du premier polypeptide hétérologue.
19. Protéine hétérodimérique recombinante selon la revendication 18, caractérisée en ce que le fragment de la chaîne β de la protéine C4BP humaine, comprenant au moins les acides aminés des positions 193 à 252, du premier et du second polypeptides de fusion, ou un variant fonctionnel de ce fragment, sont respectivement fusionnés à l'extrémité C-terminale du premier polypeptide du second polypeptides hétérologues.
20. Protéine hétérodimérique selon l'une quelconque des revendications 18 à 19, caractérisée en ce que le premier et le second polypeptides hétérologues sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, dans le groupe constitué des enzymes, des facteurs de régulation d'activité enzymatique, des ligands de récepteurs, des haptènes, des antigènes, des anticorps, des fragments d'anticorps, des médicaments, des récepteurs, notamment des récepteurs monochaînes ou des accepteurs proteiques de médicament.
21. Protéine hétérodimérique selon la revendication 20, caractérisée en ce que le fragment d'anticorps comporte tout ou partie des régions variables d'un anticorps fonctionnel pour la liaison Antigène-Anticorps.
22. Protéine hétérodimérique selon l'une quelconque des revendications 18 à 21 , caractérisée en ce que le premier et le second polypeptides hétérologues sont des ligands différents.
23. Protéine hétérodimérique selon l'une quelconque des revendications 18 à 21 , caractérisée en ce que le premier et le second polypeptides hétérologues sont des sites anticorps différents.
24. Protéine hétérodimérique selon l'une quelconque des revendications 18 à 21 , caractérisée en ce que le premier et le second polypeptides hétérologues sont des récepteurs monochaînes différents.
25. Protéine hétérodimérique selon l'une quelconque des revendications 18 à 21 caractérisée en ce que le premier polypeptide hétérologue est un anticorps et le second polypeptide hétérologue est un médicament.
26. Protéine hétérodimérique selon l'une quelconque des revendications 18 à 21 caractérisée en ce que le premier polypeptide hétérologue est un anticorps et le second polypeptide hétérologue est un accepteur protéique de médicament.
27. Protéine dimérique ou hétérodimérique recombinante selon la revendication 14 à 26, caractérisée en ce que lesdits polypeptides de fusion sont associés par liaison covalente entre deux cystéines du fragment de la chaîne β de la protéine C4BP humaine.
28. Cellule eucaryote recombinante permettant la synthèse d'une protéine dimérique ou hétérodimérique selon l'une des revendications 14 à 27, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par la mise en œuvre de l'étape (a) du procédé tel que défini à la revendication 1.
29. Cellule eucaryote selon la revendication 28, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule d'insecte, de préférence il s'agit d'une lignée cellulaire Sf9.
30. Utilisation, dans un procédé de production d'une protéine dimérique recombinante, d'un acide nucléique codant un polypeptide de fusion, ledit polypeptide de fusion comprenant au moins le fragment constitué des acides aminés des positions 193 à 252 de la chaîne β de la protéine C4BP humaine ou un variant fonctionnel de fragment par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, conservant la capacité de former une protéine au moins dimérique, ledit polypeptide de fusion comprenant en outre un polypeptide hétérologue à ladite chaîne β.
31. Utilisation, dans un procédé de production d'une protéine hétérodimérique recombinante, a) d'un premier acide nucléique codant un premier polypeptide de fusion, ledit premier polypeptide de fusion comprenant au moins le fragment constitué des acides aminés des positions 193 à 252 de la chaîne β de la protéine C4BP humaine ou un variant fonctionnel de fragment par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, consentant la capacité de former une protéine hétérodimérique, ledit premier polypeptide de fusion comprenant en outre un premier polypeptide hétérologue à ladite chaîne β et b) d'un second acide nucléique codant un second polypeptide de fusion, ledit second polypeptide de fusion comprenant au moins le fragment constitué des acides aminés des positions 193 à 252 de la chaîne β de la protéine C4BP humaine ou un variant fonctionnel de fragment par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, conservant la capacité de former une protéine hétérodimérique, ledit second polypeptide de fusion comprenant en outre un second polypeptide hétérologue à ladite chaîne β dont la séquence est différente de celle du premier polypeptide hétérologue .
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