WO2005100581A1 - 新規イソクロマン化合物とその抗癌剤等への利用 - Google Patents

新規イソクロマン化合物とその抗癌剤等への利用 Download PDF

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Yoshiyuki Mizushina
Akitsu Ogawa
Fumio Sugawara
Hiromi Yoshida
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Nippon Kayaku Co Ltd
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the present invention relates to a novel isochromandy conjugate and its use.
  • the novel compound of the present invention exhibits selective toxicity to human cancer cell types and can be used as a drug such as an anticancer drug, and can also be used as a functional food effective for prevention and treatment of cancer.
  • a drug such as an anticancer drug
  • Non-patent literature l Pietra, F. Nat. Prod. Rep. 1997, 14, 453—464
  • Non-Patent Document 2 Cuomo, V .; Palomba, I .; Perretti, A .; Guerriero, A .; D 'Am brosio, M .; Pietra, F. J. Mar. Biotechnol. 1995, 2, 199
  • An object of the present invention is to find a novel compound which is present in nature and exhibits a useful physiological activity.
  • the present invention focuses on marine microorganisms that have not yet been sufficiently explored, It is to isolate 'identify new industrially useful compounds.
  • novel compounds having an anticancer activity particularly novel compounds having a selectively high anticancer activity according to the type of cancer, and have developed anticancer drugs, medicines, functional foods and the like using the compound. Provision is also an object of the present invention.
  • the present inventor has conducted intensive studies in view of the above problems, and as a result, has found that the marine microorganism Aspergillus A new isochroman compound separated and purified from Aspergillus pseudodeflectus (ie, pseudodeflectusin, described below). S It exhibits high growth inhibition selectively against human cancer cell types.
  • the LDH-cytotoxicity test found that the compound exhibited cytotoxicity against cancer cells and had an effect of reducing the intracellular daltathione level, and the like, and completed the present invention. .
  • the present invention includes the following inventions A) to E) as industrially and medically useful inventions.
  • a compound represented by the following formula (1) that is, pseudo defiectusin: 9-hydroxy-7-methyl-2 (metnylethylidene) -furano [3, 2—H] isochroman—one—or its pharmacologically acceptable salts.
  • An anticancer agent comprising a compound represented by the above formula (1) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition comprising a compound represented by the above formula (1) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • a microorganism belonging to the genus Aspergillus and having the ability to produce the compound pseudodeflectin described in A) above is cultured, and the compound pseudodeflectin is accumulated in the culture solution.
  • a method for producing a compound pseudo-deflectasin which comprises collecting the same.
  • the substance and its pharmacologically acceptable salt are novel anticancer substances. It can be used for pharmaceuticals, functional foods, etc.
  • the isochromandiated conjugate according to the present invention has a strong growth inhibitory activity against floating cancer cells, and is therefore used as an effective anticancer agent against cancers such as leukemia (lymphomas and hematologic malignancies). Can be expected.
  • the isochromandiated conjugate according to the present invention may have useful physiological activities in addition to the anticancer activity, and can be expected to have various industrial uses such as pharmaceuticals, foods, and cosmetics. It is.
  • the present inventor has purified a compound from an extract of the marine microorganism Aspergillus' Aspergillus pseudodeflectus Hiji005 strain (Accession No. Analysis by NMR spectroscopy (HR-ESIMS), nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum, 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum, etc., revealed that the compound has a novel isochroman having the structure of the above formula (1). It was determined to be a compound, and was named "pseudodeflectusin" as a new substance obtained from Aspergillus pseudodeflectus.
  • the Hiji005 strain was obtained from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary Center (1-1, Higashi 1-chome, Chuo-shi, Ibaraki Prefecture, Japan). ⁇ —200008 and transferred to the International Deposit on February 9, 2005 under the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for Patent Procedure under the accession number FERM BP-10229.
  • the novel isochroman compound pseudodeflectusin of the present invention can be separated and purified from naturally occurring microorganisms such as Aspergillus species, but the method for producing the compound of the present invention is not limited thereto. Alternatively, they may be produced by chemical synthesis, or may be produced by subjecting a substance obtained from a natural product to a treatment such as a reaction using the substance as a starting material.
  • novel conjugation product pseudodeflectusin of the present invention selectively inhibits the growth of human cancer cell types (cell lines), and thus can be expected to be an anticancer agent with few side effects. Furthermore, as an anticancer drug having a novel function, a synergistic effect of cancer treatment is expected when used in combination with existing anticancer drugs.
  • pseudodeflectusin When the cytotoxicity of the above pseudodeflectusin was examined by LDH-cytotoxicity test, the pseudodeflectusin showed strong cytotoxicity against HeLa cells, which are cancer cells (see Fig. 2). In addition, pseudodeflectusin had the effect of reducing the amount of intracellular glutathione on HeLa cells (see FIG. 3). Intracellular daltathione has also been reported to be associated with resistance to apoptosis inducer ⁇ anti-cancer agents, suggesting that a decrease in intracellular daltathione level may lead to the development of cytotoxicity.
  • the novel compound pseudodeflectusin of the present invention induced cell death. It is also useful as an apoptosis inducer.
  • the novel compound of the present invention may also have useful physiological activities, and can be expected to be used in various industries such as pharmaceuticals, foods, and cosmetics.
  • the novel compounds of the present invention can also be used as biochemical reagents and the like.
  • the present invention also includes a pharmacologically acceptable salt of the pseudodeflectusin.
  • pharmacologically acceptable salts include hydrohalides such as hydrofluoride and hydrochloride, and sulfates. And inorganic salts such as nitrates, alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts, sulfonates, and organic acid salts.
  • the compound of the present invention when used for a drug, as an embodiment, the compound of the present invention may be used as a lead compound in a drug development process. Good.
  • the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt when used as a pharmaceutical, it may be used alone or in combination with a pharmaceutically acceptable additive such as an excipient, a diluent, and a solubilizing agent. It is safely administered orally or parenterally (systemic administration, topical administration, etc.) in the form of powders, granules, tablets, cablets, capsules, injections, suppositories, ointments and the like. The dosage varies depending on the route of administration, the age of the patient and the actual condition to be prevented or treated. For example, when administered orally to an adult, the daily dose of the active ingredient is 0.01 mg to 2000 mg, preferably 0.1 mg to: LOOOmg and can be administered once or several times a day.
  • a pharmaceutically acceptable additive such as an excipient, a diluent, and a solubilizing agent.
  • Oral preparations such as tablets, capsules, granules, fine granules, powders and the like can be prepared in a conventional manner using, for example, starch, lactose, sucrose, trenodulose, mannitol, carboxymethylcellulose, corn starch, inorganic salts and the like. It is manufactured according to. In this type of preparation, a binder, a disintegrant, a surfactant, a lubricant, a fluidity promoter, a flavoring agent, a coloring agent, a flavor, and the like can be appropriately used.
  • parenteral preparations the dosage is adjusted according to the patient's age, body weight, degree of disease, and the like, and is administered by, for example, intravenous injection, intravenous drip infusion, subcutaneous injection, intramuscular injection, and the like.
  • This parenteral preparation is manufactured according to a conventional method, and distilled water for injection, physiological saline and the like can be generally used as a diluent. Further, if necessary, a bactericide, a preservative, and a stabilizer may be added. In addition, from the viewpoint of stability, this parenteral preparation is frozen after filling in vials and the like, and is usually freeze-dried.
  • the liquid can be prepared again from the freeze-dried product immediately before use by removing water by the treatment. Further, if necessary, an isotonic agent, a stabilizer, a preservative, and a soothing agent may be added.
  • an isotonic agent, a stabilizer, a preservative, and a soothing agent may be added.
  • the amount of the compound of the present invention in these preparations is not particularly limited and can be set arbitrarily.
  • parenteral preparations examples include liquid preparations for external use, coating preparations such as ointments, suppositories for rectal administration, and the like, which are also produced according to a conventional method.
  • the content of the compound of the present invention or the pharmacologically acceptable salt in the preparation varies depending on the preparation, but is usually 0.1 to: LOO% by weight! / ,.
  • the compound of the present invention may be encapsulated in a carrier such as ribosome and administered in vivo using a known DDS (drug delivery system)! /.
  • a carrier or the like that specifically recognizes a cancer cell or the like at the target site is used, the compound of the present invention can be efficiently transported to the target site, which is effective.
  • the compound of the present invention When the compound of the present invention is used in foods (edible compositions), the compound of the present invention is added to foods and drinks as a raw material for various drinks and various processed foods, and dextrin, lactose, starch, etc. It can be processed into pellets, tablets, granules, etc., together with excipients, flavors, pigments, etc., or coated with gelatin or the like and molded into capsules to be used as health foods or health foods.
  • Example 1 Isolation of a novel isochromandiy conjugate of the marine microbial power parasitic on seaweed 'Extraction of the novel isochromandiy conjugate of the present invention from purified marine microorganisms parasitic on the following procedure' Purified and its structure was determined.
  • seaweed (Sargassum fusiforme) collected from Izu Miura Peninsula was washed with sterile water !, cut into small pieces, and immersed in 3.6% saline, and then immersed in Difco's potato dextrose agar medium; Then,
  • 3 ⁇ 4 (Aspergillus pseudodeflectus 3 ⁇ 4amon & Mouchacca: the same as Aspergillus pseudodeflectus Hiji005 strain described above (accession number FERM BP-10229)) was isolated. The isolated strain was further cultured in a potato dextrose medium (24 gZL) in the dark and in a stationary state for three weeks. After that, 4 L of the culture solution was filtered through a Buchner funnel. After removing the cells, extraction was performed with methylene chloride to obtain 424.3 mg of a crude extract from the organic layer.
  • the fraction A contained Compound 2 (7-methyl-2- (1-methylethylethlidene) -furo [3,2-H] having the chemical structure of the following formula (2). isoquinoiine-3-one) was identified.
  • Compound 2 is described in Kohno, J .; Hiramatsu, H .; Nishio, M .; Sakurai, M .; Okuda, T .; Komatsubara, S. Tetrahedron 1999, 55, 11247. V, reported as TMC-120B isolated from Aspergillus urtus !, identical to the structure of the substance and was a known substance. In the examples described below, this compound 2 was used in order to compare the physiological activity with the compound 1.
  • Example 3 Compound 1 and Compound 2 Inhibit Growth of Human-Derived Cancer Cells
  • FIG. 1 is a graph showing the results of the above experiments.
  • black circles indicate the results of Compound 1
  • white circles indicate the results of Compound 2.
  • (A) to (c) are the results of human-derived cancer cell lines NUGC-3, HeLa, and HL-60, respectively.
  • Compound 1 exerts a cell growth inhibitory effect on three types of human cancer cell lines, NUGC-3, HeLa, and HL-60, in a concentration-dependent manner. Among them, HL-60 has a 50% inhibitory concentration. It was most strongly inhibited at 39 M.
  • Compound 1 is considered to have selectivity for human-derived cancer cell types.
  • Compound 2 exerted no growth inhibition on all human-derived cancer cell lines.
  • LDH activity in the culture supernatant and the total LDH amount of the remaining cells were measured. Thereby, both cell death during cell culture and cell growth inhibition can be measured.
  • LDH activity was measured using LDH-Cytotoxicity Test Co., Ltd. of Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Assuming that the total LDH amount was 100%, the LDH activity released in the culture supernatant of the cells cultured in the presence and absence of Compound 1 (control) was shown as a percentage of the total LDH amount (see FIG. 2).
  • Intracellular daltathione was measured by an enzymatic cycling method. After adding Compound 1 to the medium and culturing the HeLa cells for 48 hours, the cells were collected and a crude cell extract was prepared using a 5% TCA solution. The crude cell extract was neutralized with 0.5N NaOH, and the reaction solution (dissolved in 0.2 mM DTNB, 0.3 mM NADPH, 1.5 mU glutathione reductase, and IM phosphate buffer (pH 7.5)) was dissolved. The reaction was started by the addition, and the rate of change in absorbance at 405 nm was measured. The amount of daltathione was determined by calculating the calibration linear force.
  • FIG. 3 shows the experimental results. As shown in the figure, assuming that the total intracellular GSH content in the control group (without carbohydrate added with i-Danied compound 1) was 100%, the cells added with compound 1 reduced to about 70%. Intracellular daltathione has also been reported to be associated with resistance to apoptosis inducers and anticancer agents, suggesting that a decrease in intracellular daltathione leads to the development of cytotoxicity! /.
  • the present invention relates to a novel isochromandy conjugate, which can be used as an anticancer agent as described above, and can be industrially used as a drug, food, and biochemical reagent. It can be widely used.
  • FIG. 1] (a) to (c) are graphs showing the results of examining the growth inhibitory effects of the novel isochroman compounds of the present invention on human-derived cancer cell lines NUGC-3, HeLa, and HL-60, respectively. is there. Each data is the average of four independent experiments.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of examining the cytotoxicity of the novel isochromandiated conjugate of the present invention by an LDH-cytotoxicity test. Data are the average of four independent experiments.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of examining whether the amount of intracellular daltathione was reduced by the novel isochromandy conjugate of the present invention. Data are the average of four independent experiments.

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Abstract

　海藻に寄生する海洋微生物から単離精製された新規イソクロマン化合物シュードデフレクタシン（ｐｓｅｕｄｏｄｅｆｌｅｃｔｕｓｉｎ）は、下記の式（１）により表される化学構造を有し、ヒト癌細胞種に対して選択的に高い増殖抑制活性を示し、新規抗癌物質として医薬品、機能性食品等に有用である。 【化１】

Description

明 細 書
新規イソクロマンィ匕合物とその抗癌剤等への利用
技術分野
[0001] 本発明は、新規イソクロマンィ匕合物とその利用に関するものである。本発明の新規 化合物は、ヒト癌細胞種に対して選択的毒性を示し、抗癌剤等の医薬として利用でき るほか、癌の予防及び治療に効果のある機能性食品等としても利用し得るものである 背景技術
[0002] これまでに陸生の微生物から、有用な生理活性をもつ新規化合物が数多く分離精 製され、これらの化合物は、医薬品、飲食品、化粧品などに利用されてきた。このよう に天然から得られた化合物は、人体に対する安全性も比較的高ぐ医薬品等への応 用にも結びつきやすいものである。さらに最近では、海洋微生物の代謝産物からの 有用な新規物質の単離及び発見を目的とする調査研究も盛んになってきている (例 えば、下記の非特許文献 1及び 2参照)。
[0003] 非特許文献 l : Pietra, F. Nat. Prod. Rep. 1997, 14, 453— 464頁
非特許文献 2 : Cuomo, V.； Palomba, I.； Perretti, A.； Guerriero, A.； D' Am brosio, M.； Pietra, F. J. Mar. Biotechnol. 1995, 2, 199頁
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明の課題は、天然に存在し、有用な生理活性を発揮する新規化合物を見出 すことにあり、とりわけ未だ探索が十分進んでいない海洋微生物に着目し、海洋微生 物から産業上有用な新規化合物を単離 '同定することにある。
[0005] また、抗がん作用を有する新規化合物、とりわけ癌の種類に応じて選択的に高い抗 がん作用を有する新規化合物を見出し、同化合物を利用した抗癌剤、医薬、機能性 食品などを提供することも本発明の課題である。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意研究を進めた結果、海洋微生物ァスペルギ ルス ·シユードデフレクタス（Aspergillus pseudodeflectus)から分離精製された新 規イソクロマン化合物（即ち、後述のシユードデフレクタシン（pseudodeflectusin) ) 力 Sヒト癌細胞種に対して選択的に高い増殖抑制を示すこと、また、 LDH—細胞毒性 テストにより、同化合物が癌細胞に対して細胞毒性を示すことや、細胞内ダルタチォ ン量を減少させる作用を有すること、等を見出し、本発明を完成させるに至った。
[0007] 即ち、本発明は、産業上及び医療上有用な発明として、下記 A)〜E)の発明を包 含するものである。
[0008] A)下記式（1)により表される化合物（即ち、後述のシユードデフレクタシン (pseudo defiectusin： 9― hydroxy— 7— methyl— 2— (metnylethylidene)― furano [ 3 , 2—H]isochroman—3— one)、又はその薬理上許容される塩。
[化 1]
Figure imgf000003_0001
[0009] B)上記式（1)により表される化合物、又はその薬理上許容される塩を有効成分とし て含む抗癌剤。
[0010] C)上記式（1)により表される化合物、又はその薬理上許容される塩を有効成分とし て含む医薬用組成物。
[0011] D)ァスペルギルス (Aspergillus)属に属し、上記 A)に記載された化合物シユード デフレクタシン (pseudodeflectusin)を産生する能力を有する微生物を培養し、培 養液中に化合物シユードデフレクタシンを蓄積せしめ、これを採取することを含む化 合物シユードデフレクタシンの製造法。
[0012] E)上記式（1)により表される化合物を産生するァスペルギルス 'シユードデフレクタ ス（Aspergillus pseudodeflectus) Hiji005株（FERM BP— 10229)。 発明の効果
[0013] 上記式（1)の新規イソクロマンィ匕合物には、後述の実施例に示すように、抗癌作用 が認められるので、同物質及びその薬理上許容される塩は、新規抗癌物質として医 薬品、機能性食品等に利用することができる。とりわけ、本発明に係るイソクロマンィ匕 合物は、浮遊系の癌細胞に対して強い増殖抑制活性を示したので、白血病（リンパ 腫'血液性悪性腫瘍)などの癌に対する効果的な抗癌剤としての利用が期待できる。 また、本発明に係るイソクロマンィ匕合物は、抗癌作用のほかにも有用な生理活性を 有している可能性があり、医薬品、食品、さらには化粧品など産業上種々の利用が 期待できるものである。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 以下、本発明の具体的態様等について詳しく説明する。
本発明者は、海藻に寄生する海洋微生物ァスペルギルス 'シユードデフレクタス (A spergillus pseudodeflectus) Hiji005株（受託番号 FERM BP— 10229)の抽 出物から化合物を精製し、その構造を高分解能エレクトロスプレーイオンィ匕質量分析 (HR— ESIMS)、 —核磁気共鳴 (NMR)スペクトル、及び、 13C—核磁気共鳴ス ベクトル等により解析した結果、その化合物が前記式（1)の構造を有する新規イソク ロマン化合物であると判断し、 Aspergillus pseudodeflectusから得られた新規物 質として「pseudodeflectusin (シユードデフレクタシン）」と命名した。なお、 Hiji005 株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つ く ί 市東 1丁目 1番地 1 中央第 6)【こ、 2004年 4月 19曰【こ受託番号 FERM Ρ— 20 008号として受託され、 2005年 2月 9日に特許手続き上の微生物の寄託の国際的承 認に関するブダペスト条約に基づいて受託番号 FERM BP— 10229号として国際 寄託へ移管された。
[0015] 上記 pseudodeflectusinの精製方法について簡単に説明すると、まず伊豆にて採 取した海藻（Sargassum fusiforme)力 Difco社製ポテトデキストロース寒天培地 に菌 (Aspergillus sp. )を単離し、得られた菌株をポテトデキストロース培地（24g /L)にて暗所、静置条件で三週間培養した。そして、 4Lの培養液を塩化メチレンで 抽出し、 442. 3mgの粗抽出物を得た。この粗抽出物をへキサン:酢酸ェチル =4 : 1 〜1 : 4のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製し、 3. 4mgの画分 Aと 284. 2mgの画分 Bを得た。次に、画分 Bをクロ口ホルム：メタノール = 19 : 1でシリカゲル力 ラムクロマトグラフィーを行い、その後、クロ口ホルム：メタノール = 99 : 1〜95： 5でシリ 力ゲルカラムクロマトグラフィーを行い、画分 Cにおいて 1. 2mgの化合物を分離精製 した。構造解析の結果から、この化合物は前記式（1)の構造を有する新規イソクロマ ン化合物（即ち、 pseudodeflectusin)であると判断された。
[0016] このように、本発明の新規イソクロマン化合物 pseudodeflectusinは、ァスペルギ ルス種など天然に存在する微生物等から分離精製することができるが、本発明の化 合物の製造方法としてはこれに限定されるものではなぐ化学合成により製造してもよ Vヽし、天然物から得られた物質を出発物質として反応等の処理を施して製造してもよ い。
[0017] 上記 pseudodeflectusinについて、ヒト癌細胞に対する増殖抑制活性を MTTアツ セィにより検討したところ、癌細胞の種類に応じて選択的に高い増殖抑制活性を示し た（図 1参照)。具体的には、使用した 3種類のヒト癌細胞 (HL— 60 (白血球細胞）、 NUGC— 3 (胃癌細胞)及び HeLa (子宮癌細胞)）のうち、 HL— 60に対して最も強 い増殖抑制活性を示し、 NUGC— 3、及び HeLaに対しても増殖抑制活性を示した（ 50%阻害濃度はそれぞれ 39 M、 49 Μ、 47 )。
[0018] 本発明の新規ィ匕合物 pseudodeflectusinは、ヒト癌細胞種 (細胞株）に対して選択 的に増殖抑制を示すため、副作用の少ない抗癌剤になることが期待できる。さらに、 新規な機能を有する抗癌剤として、既存の抗癌剤との併用により癌治療の相乗効果 が期待される。
[0019] LDH—細胞毒性テストにより、上記 pseudodeflectusinの細胞毒性を検討したとこ ろ、 pseudodeflectusinは癌細胞である HeLa細胞に対して強!、細胞毒性を示した（ 図 2参照）。また、 pseudodeflectusinは、 HeLa細胞に対し細胞内グルタチオン量 を減少させる作用を有して 、た（図 3参照)。細胞内ダルタチオンはアポトーシス誘導 剤ゃ抗がん剤に対する耐性と関係しているとの報告もあり、細胞内ダルタチオン量の 減少が細胞毒性の発現につながつている可能性が考えられた。
[0020] このように本発明の新規化合物 pseudodeflectusinは、細胞死を誘導したことから アポトーシス誘導剤としても有用である。本発明の新規ィ匕合物はそのほかにも有用な 生理活性を有している可能性があり、医薬品、食品、さらには化粧品など産業上種々 の利用が期待できるものである。勿論、本発明の新規化合物を生化学試薬などに利 用することも可能である。
[0021] 本発明には上記 pseudodeflectusinの薬理上許容される塩も含まれる力 このよう な薬理上許容される塩としては、フッ化水素酸塩、塩酸塩などのハロゲン化水素酸塩 、硫酸塩、硝酸塩などの無機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、ス ルホン酸塩、及び、有機酸塩を例示することができる。
[0022] 本発明の化合物（pseudodeflectusin又はその薬理上許容される塩）を医薬品に 利用する場合、その一態様として、本発明の化合物を医薬品開発過程におけるリー ド化合物として利用するものであってもよい。
[0023] 本発明の化合物又は薬理学的に許容される塩を医薬品として使用する場合は、単 独又は単体、賦形剤、希釈剤、溶解補助剤等の製薬上許容しうる添加剤と混合して 粉剤、顆粒剤、錠剤、カブレット剤、カプセル剤、注射剤、座剤、軟膏剤等の製剤形 態で、経口又は非経口的 (全身投与、局所投与等）に安全に投与される。投与量は 投与経路、患者の年齢並びに予防又は治療すべき実際の症状等により異なるが、例 えば成人に経口投与する場合、有効成分として 1日 0. 01mg〜2000mg、好ましく は 0. lmg〜： LOOOmgとすること力 Sでき、 1日 1〜数回に分けて投与できる。
[0024] 錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤は、例えば、デンプン、乳糖 、白糖、トレノヽロース、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機 塩類等を用いて常法に従って製造される。この種の製剤には、結合剤、崩壊剤、界 面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用すること ができる。
[0025] 非経口剤の場合、患者の年齢、体重、及び疾患の程度などに応じて用量を調節し 、例えば、静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射などによって投与する。この非経口 剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水等を用 いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。ま た、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥 処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。 さらに必要に応じて、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤を加えてもよい。これら 製剤中の本発明の化合物の配合量は特に限定されるものではなく任意に設定できる
。その他の非経口剤の例として、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための 坐剤等が挙げられ、これらも常法に従って製造される。なお、製剤中の本発明の化 合物又は薬理上許容しうる塩の含量は、製剤により種々異なるが、通常 0. 1〜： LOO 重量％であることが好まし!/、。
[0026] なお、公知の DDS (ドラッグ ·デリバリー 'システム）を利用し、例えば、本発明の化 合物をリボソームなどの運搬体に封入して体内投与してもよ!/、。このとき標的部位の 癌細胞等を特異的に認識する運搬体などを利用すれば、標的部位に本発明の化合 物を効率よく運ぶことができ効果的である。
[0027] 本発明の化合物を食品（食用組成物）に用いる場合は、各種飲料や各種加工食品 の原材料として本発明の化合物を飲食品に添加したり、必要に応じてデキストリン、 乳糖、澱粉等の賦形剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、 またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や保健食品等として利 用できる。
実施例
[0028] 以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら 実施例によって何ら限定されるものではない。
[0029] 実施例 1：海藻に寄生する海洋微生物力 の新規イソクロマンィ匕合物の単離 '精製 海藻に寄生する海洋微生物から、本発明の新規イソクロマンィ匕合物を以下のような 手順で抽出'精製し、その構造を決定した。
[0030] まず、伊豆三浦半島にて採取した海藻（Sargassum fusiforme)を滅菌水で洗!、 、小片に切り刻み、 3. 6%食塩水に浸漬後、 Difco社製ポテトデキストロース寒天培 地にて； i¾r し、 |¾ (Aspergillus pseudodeflectus ¾amon & Mouchacca :上 述の Aspergillus pseudodeflectus Hiji005株（受託番号 FERM BP— 10229 )と同じ)を単離した。単離した菌株は、さらにポテトデキストロース培地（24gZL)に て暗所、静置条件で三週間培養した。その後、 4Lの培養液をブフナー漏斗でろ過し 、菌体を取り除いた後、塩化メチレンで抽出し、有機層から 442. 3mgの粗抽出物を 得た。
[0031] この粗抽出物に対して三回シリカゲルカラムクロマトグラフィー（関東ィ匕学社製、シリ 力ゲル 60N球状'中性)を行い、含有物質を分離精製した。具体的には、まずへキサ ン：酢酸ェチル =4 : 1〜1 :4でシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、 3. 4mgの 画分 Aと 284. 2mgの画分 Bを得た。次に、画分 Bについてクロ口ホルム：メタノール = 19 : 1でシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、その後クロ口ホルム：メタノール = 99 : 1〜95： 5でシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、画分 Cにおいて 1. 2m gの非晶質固体の化合物 1を得た。後述の構造解析の結果、この化合物 1は、前記 式（1)の化学構造を有する新規イソクロマンィ匕合物であると判断し、本発明者はこの 新規化合物を「pseudodeflectusin」と命名した。
[0032] 他方、構造解析の結果、上記画分 Aには、下記式 (2)の化学構造を有する化合物 2 (7— methyl— 2— ( 1― methylethylethlidene)— furo[3, 2— H] isoquinoiine - 3 -one)が同定された。
[化 2]
Figure imgf000008_0001
[0033] この化合物 2の構造は、文献 Kohno, J. ； Hiramatsu, H. ； Nishio, M. ； Sakura i, M. ;Okuda, T. ； Komatsubara, S. Tetrahedron 1999, 55, 11247頁にお V、て、 Aspergillus urtusから単離された TMC— 120Bとして報告されて!、る物質 の構造と同じであり、既知物質であった。後述の実施例では、化合物 1との生理活性 を比較するため、この化合物 2を使用した。
[0034] 実施例 2 :新規イソクロマンィ匕合物の構造決定
上記方法により得られたィ匕合物 1の旋光度を測定し、旋光度 [ひ] 23- 2= + 11° (c =0. 18, MeOH)を得た。
[0035] 化合物 1の構造を決定するため、同化合物を高分解能エレクトロスプレーイオンィ匕 質量分析（HR— ESIMS)に供した。 mZz283. 0950 (M+H+)、理論値 283. 09 40という結果から、化合物 1は分子式 C H Oであることが示された。
15 16 4
[0036] 化合物 1について、溶媒に CDC1を、内部標準として TMSを用いて、 H— NMR、
3
13C— NMRを測定し、以下の表 1に掲げるデータを得た。
[表 1]
¾( Hz)
2 145.2
3 183.2
3a 122.0
4 7.61 d (8.0) 123.8
5 6.88 d (8.0) 122.7
5a 143.8
6 2.77 dd (17.4, 3,8) 36.0
2.73 6d (17.4f 10.4)
7 4.46 ddq {10.4, 6.Z 3.8) 62.9
9 6.27 d (4.0) 87.8
9a 119.5
9b 162.0
10 1.39 d (6.2) 21.1
11 132.3
12 2.12 s 20.3
13 2.36 s 17.4
OH 3.07 d (4.0) [0037] また化合物 1の IR ^ベクトルを測定したところ、以下の値が得られた。 IR(film)： 33
38. 18, 3019. 98, 1690. 30, 1644. 98, 1607. 38, 1436. 71, 1289. 18, 1
119. 48, 1079. 94, 1022. 09, 855. 28, 669. 18。
[0038] こうして得られたデータをもとに HMBCスペクトル解析、 COSYスペクトル解析によ つて構造解析を進めた結果、化合物 1は、下記の構造を有するものと判断された (な お、式中の各数値は表 1の炭素原子の番号に対応する）。
[0039] [化 3]
Figure imgf000010_0001
[0040] 実施例 3：化合物 1及び化合物 2のヒト由来癌細胞増殖抑制効果
化合物 1及びィ匕合物 2がヒト由来の癌細胞増殖抑制作用を有するかどうか検討した 実験では、ヒト胃癌細胞株である NUGC— 3細胞、ヒト子宫癌細胞株である HeLa 細胞、及びヒト白血球細胞株である HL— 60細胞の 3種類の癌細胞を使用し、種々 の濃度の化合物 1又は化合物 2を添加してインキュベーションし、 48時間後、各癌細 胞の生存率を MTTアツセィにより決定した。
[0041] 図 1は、上記実験結果を示すグラフであり、各グラフにお 、て、黒色丸印は化合物 1 、白色丸印は化合物 2の結果を示す。 （a)〜（c)は、それぞれ、ヒト由来癌細胞株 NU GC— 3、 HeLa,及び HL— 60の結果である。化合物 1は NUGC— 3, HeLa,及び HL— 60の 3種類のヒト癌細胞株に対して濃度依存的に細胞増殖抑制効果を発揮し 、その中でも HL— 60に対しては 50%阻害濃度が 39 Mと最も強く阻害した。化合 物 1は、ヒト由来癌細胞種に対する選択性があると考えられる。 [0042] 化合物 2は、すべてのヒト由来癌細胞株に対して増殖抑制を示さな力つた。
[0043] 実施例 4：遊離乳酸脱水素酵素 (LDH)活性の測定
化合物 1を培地に添カ卩して HeLa細胞を 48時間培養した後、培養上清中の LDH 活性及び残存細胞の総 LDH量を測定した。これにより、培養中における細胞死と、 細胞の増殖抑制の双方が測定できる。 LDH活性の測定は和光純薬工業株式会社 の LDH—細胞毒性テストヮコーを用いて測定した。総 LDH量を 100%とし、化合物 1存在下及び非存在下 (コントロール)で培養した細胞の培養上清中に遊離した LD H活性を総 LDH量に対する割合で示した（図 2参照)。
[0044] 同図に示すように、化合物 1の存在下で培養することにより遊離 LDH活性は増加し 、コントロール群と比較して約 4倍の増加を示した。以上の結果から、化合物 1は癌細 胞に対する細胞毒性を示すことが明らかとなった。
[0045] 実施例 5：細胞内総ダルタチオン (GSH)量の測定
細胞内ダルタチオンは酵素的サイクリング法により測定した。化合物 1を培地に添 カロして HeLa細胞を 48時間培養した後、細胞を回収し、 5%TCA溶液を用いて、細 胞粗抽出液を調製した。この細胞粗抽出液を 0. 5N NaOHで中和し、反応液 (0. 2mM DTNB、0. 3mM NADPH、 1. 5mUグルタチオンレダクターゼ、 0. IM ン酸緩衝液 (pH7. 5)に溶解)を添加することにより反応を開始し、 405nmの吸光度 変化速度を測定した。ダルタチオン量は検量線力 計算することにより求めた。
[0046] 上記実験結果が図 3に示される。同図に示すように、コントロール (ィ匕合物 1非添カロ )群における細胞内総 GSH量を 100%とすると、化合物 1を添カ卩した細胞では約 70 %まで減少した。細胞内ダルタチオンはアポトーシス誘導剤や抗癌剤に対する耐性 と関係しているとの報告もあり、細胞内ダルタチオン量の減少が細胞毒性の発現につ ながって!/、ることが示唆された。
[0047] 以上の結果から、化合物 1で細胞を処理することにより、細胞内ダルタチオン量が 減少し、細胞死が誘導され、 LDH活性が上昇したものと考えられる。
産業上の利用可能性
[0048] 以上のように、本発明は新規イソクロマンィ匕合物に関するものであり、前述したとお り、抗癌剤として利用できるほか、医薬品、食品、さらには生化学試薬等として産業上 幅広く利用することができるものである。
図面の簡単な説明
[図 l] (a)〜（c)は、それぞれ、ヒト由来癌細胞株 NUGC— 3、 HeLa、及び HL— 60 に対する本発明の新規イソクロマン化合物の増殖抑制効果を調べた結果を示すダラ フである。各データは独立に 4回行った実験の平均値である。
[図 2]LDH—細胞毒性テストにより、本発明の新規イソクロマンィ匕合物の細胞毒性を 検討した結果を示すグラフである。データは独立に 4回行った実験の平均値である。
[図 3]本発明の新規イソクロマンィ匕合物による細胞内ダルタチオン量の減少の有無を 検討した結果を示すグラフである。データは独立に 4回行った実験の平均値である。

Claims

Figure imgf000013_0001
[2] 請求項 1記載の式（1)により表される化合物、又はその薬理上許容される塩を有効 成分として含む抗癌剤。
[3] ヒト癌細胞 HL— 60、 NUGC— 3及び Z又は HeLaに対して有効な請求項 2記載の 抗癌剤。
[4] 請求項 1記載の式（1)により表される化合物、又はその薬理上許容される塩を有効 成分として含む医薬用組成物。
[5] ァスペルギルス (Aspergillus)属に属し、請求項 1記載の化合物シユードデフレクタ シン (pseudodeflectusin)を産生する能力を有する微生物を培養し、培養液中に化 合物シユードデフレクタシンを蓄積せしめ、これを採取することを含む化合物シユード デフレクタシンの製造方法。
[6] ァスペルギルス ·シユードデフレクタス（Aspergillus pseudodeflectus) Hiji005 株（FERM BP— 10229)。
[7] 請求項 1記載の式（1)により表される化合物又はその塩を含む機能性食品。
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