WO2005097166A1 - ゼラチンゲルを担体とする糖尿病性神経障害治療剤 - Google Patents

ゼラチンゲルを担体とする糖尿病性神経障害治療剤 Download PDF

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WO2005097166A1
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gelatin gel
gelatin
diabetic neuropathy
bfgf
gel
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Inventor
Jiro Nakamura
Yasuhiko Tabata
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Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for diabetic neuropathy containing basic fibroblast growth factor (bFGF). More specifically, the present invention relates to a bFGF-bearing gelatin gel formulation for treating diabetic neuropathy.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • diabetic patients in Japan The number of diabetic patients in Japan is steadily increasing, and it is said that there are 7.40 million diabetic patients strongly suspected, and as many as 16.2 million including those who cannot deny the possibility. .
  • the most important theme is how to prevent the onset and progression of diabetic complications (retinopathy, nephropathy, neuropathy, etc.). It is considered to occur most frequently and early.
  • Diabetic neuropathy not only significantly reduces the quality of life (QOL) of diabetic patients by presenting various clinical symptoms, but also has immeasurable effects on the prognosis of cardiovascular autonomic neuropathy Prevention and early treatment are important.
  • the frequency of diabetic neuropathy reported in diabetic patients to date varies depending on the diagnostic methods and criteria used, the duration of diabetes, age, and the knowledge and experience of the examiner or laboratory technician. However, it is generally said to be 30 to 40%.
  • Various classifications of neuropathy have been proposed, but clinically multiple neuropathy (sensory motor neuropathy and autonomic neuropathy) and single neuropathy (mixed spinal neuropathy and cranial neuropathy) It is roughly divided into.
  • diabetes develops and develops on the basis of hyperglycemia, but neurological dysfunction is caused by various abnormalities caused by hyperglycemia.
  • Representative examples of the abnormalities derived from hyperglycemia are abnormal metabolic factors, vascular factors, and neurotrophic factors.
  • metabolic disorders derived from hyperglycemia are abnormal metabolic factors, vascular factors, and neurotrophic factors.
  • studies on the importance and interrelationship between metabolic factors and vascular factors have been conducted so far, and metabolic disorders caused by hyperglycemia have been studied. It is thought that abnormalities in nerve cell function and abnormal blood flow due to metabolic disorders are intricately entangled in the manifestation of neurological dysfunction. The following are known for typical metabolic disorders and neurotrophic factor disorders.
  • PLC PLC
  • Na + / K + — ATPase activity is decreased, and it is thought that nerve conduction velocity is delayed, that is, it causes neuropathy.
  • Abnormal PKC activity Increased PKC (especially PKC-beta) activity is involved in abnormal blood flow in vascular cells, and decreased PKC (especially PKC-alha) activity in nervous system cells is abnormal cell function It is thought that both are involved in the onset of neuropathy.
  • Neurotrophic factor abnormalities Neurotrophic factors are endogenous substances that maintain the survival, differentiation and function of -Euron.
  • nerve growth factor NG is mainly used for diabetic neuropathy.
  • neurotrophin-1 F and neurotrophin-1 (NT-3). These are thought to improve neuronal function through increased expression of neuroconductive substances such as Supstance P and calcitonin gene-related peptide (CGRP) whose expression is decreased in diabetic conditions.
  • CGRP calcitonin gene-related peptide
  • AR inhibitors which inhibit the activity of the aldose reductase (AR), the rate-limiting enzyme in the polyol pathway, are used in daily practice, but there is no international consensus on their clinical usefulness.
  • AR inhibitors are the most promising drugs that can improve metabolic abnormalities other than polyol metabolism and abnormal blood flow.
  • various drugs having a blood flow improving effect prostaglandin prostaglandin I 2 , niceri tro / re, cilostazonole, sanolepogrelate hydrochloride
  • Potential therapeutic agents in the future include PKC-beta inhibitors, non-enzymatic glycoside inhibitors, antioxidants, nerve growth factor (NGF), etc., but treatment with these agents is still established. Not.
  • bFGF Basic fibroblast growth factor
  • bFGF Basic fibroblast growth factor
  • bFGF Basic fibroblast growth factor
  • bFGF is a cytokine that has an angiogenic effect, and its effectiveness has been reported in studies using ischemia models (International Publication No. 94/27 630 bread fret).
  • bFGF is It has been shown to act as a factor for inducing the proliferation and differentiation of various cells including nervous system cells.
  • bFGF is useful in the treatment of diabetic neuropathy (Nakamura et al., "The effects of bFOF on diabetic neuropathy", The 46th Annual Meeting of the Japanese Diabetes Society, II-J. 3–28, May 1995).
  • the challenge addressed by this article is to provide drugs that can more effectively treat diabetic complications.
  • the present inventors have focused on the therapeutic effect of bFGF on diabetic neuropathy and studied the effect more efficiently.As a result of intensive studies, by carrying out bFGF on gelatin gel, The inventor found that the intended purpose was achieved, and made this invention. That is, the gist of the present invention is as follows.
  • a therapeutic agent for diabetic neuropathy comprising FGF supported on a gelatin gel.
  • a method for treating diabetic neuropathy which comprises administering to a mammal a therapeutically effective amount of bFGF supported on a gelatin gel.
  • [7] A commercial product containing the therapeutic agent according to [1] or [2], and a description of the therapeutic agent stating that the therapeutic agent can or should be used for diabetic neuropathy. package.
  • the therapeutic agent for diabetic neuropathy in which bFGF is carried on a gelatin gel is also simply referred to as “the preparation of the present invention”.
  • the present invention makes it possible to remarkably improve nerve transmission speed and blood flow in nerves, which are indicators of the treatment of diabetic neuropathy, by supporting bFGF on gelatin.
  • B It is useful in improving the availability of FGF as a therapeutic agent for diabetic neuropathy. According to the preparation of the present invention, diabetic neuropathy can be effectively treated.
  • FIG. 1 is a graph showing nerve conduction velocities in the sciatic nerve 10 days after the intramuscular injection of a crosslinked gelatin gel (controller) or bFGF-supported crosslinked gelatin gel into normal rats and STZ-induced diabetic rats.
  • Fig. 2 is a graph showing intraneuronal blood flow in the sciatic nerve 10 days after intramuscular injection of cross-linked gelatin gel (controller) or cross-linked gelatin gel carrying bFGF into normal rats and STZ-induced diabetic rats. is there.
  • the homologue may be used as bFGF in the present invention.
  • bFGF and / or its homologues can be isolated and purified from those produced in microorganisms or cultured cells by natural or recombinant techniques, or they can be chemically modified. Alternatively, it can be obtained by biological modification.
  • human bFGF or a homolog thereof is particularly preferred.
  • the homolog of FGF means a polypeptide of the following [I] or [II].
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence substantially identical to bFGF produced in a mammal;
  • a substantially identical amino acid sequence refers to one in which 1 to 6 amino acids in the amino acid sequence have been substituted by another amino acid and which has the biological activity of bFGF.
  • homologue of [II] for example, a polypeptide having 155 amino acids described in Japanese Patent Publication No. 63-50O843 may be used. This polypeptide has a 9 amino acid segment added to the N-terminus of human bFGF.
  • polypeptide of 147 amino acids with K4et- added at the N-terminus or a polypeptide of 157 amino acids with a segment of 11 amino acids added at the N-terminus described in JP-T-63-501953 Polypeptides may be used.
  • Particularly preferred bFGFs include traufermin (genetical recombination).
  • one type of bFGF may be used alone, or two or more types may be used in combination. Further, as described above, there are a plurality of homologs of bFGF, and these homologs may be used alone or in combination.
  • microorganisms such as Escherichia coli or cultured cells must be produced by genetic recombination technology.
  • bFGF or its homologs produced in b When a gene for producing FGF or a homolog thereof (in this case, generally the polypeptide of the above [I]) is incorporated into a microorganism or a cultured cell, the gene produced from the microorganism or the cultured cell is generally b
  • the N-terminus and / or C-terminus of FGF is the C-terminus, or the N-terminus and / or C-terminus of the polypeptide of (I) above, with an additional amino acid segment added, The polypeptide of [II] described above.
  • gelatin used as a raw material of the gelatin gel in the present invention
  • any commonly available gelatin may be used.
  • examples of such gelatin include anorecal-treated gelatin (acid gelatin) having an isoelectric point of about 5 and acid-treated gelatin (alkali gelatin) having an isoelectric point of about 9; In view of this, an acidic gelatin having an isoelectric point of about 5 is preferred.
  • Gelatin is not limited to one kind, and raw materials and those having different physical properties such as solubility, molecular weight, isoelectric point and the like may be appropriately mixed and used.
  • the cross-linking agent for cross-linking the gelatin used in the present invention is not particularly limited as long as it has no toxicity to living organisms and is not limited to O.
  • 1-ethyl-3- (3-dimethylamido / propyl) carbodiimide hydrochloride are particularly preferred.
  • Gelatin may also be cross-linked by heat treatment or ultraviolet or electron beam irradiation.
  • the shape of the crosslinked gelatin gel used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a columnar shape, a prismatic shape, a sheet shape, a disk shape, a spherical shape, a particle shape, a granular shape, and a paste shape.
  • a columnar shape When used as an implant, they are preferably cylindrical, prismatic, sheet-like, or disk-shaped, and when used as an injectable preparation, they are preferably spherical, particulate, granular, or paste-like.
  • the water content of the resulting crosslinked gelatin gel is 50-99 wZw%.
  • the water content of the gel refers to the ratio of the weight of water in the gel to the total weight of the gel when wet.
  • the paste-like crosslinked gelatin gel can be prepared by a method similar to the above-mentioned method for preparing the columnar, prismatic, sheet, or disk-shaped crosslinked gelatin gel.
  • a spherical, particulate, or granular crosslinked gelatin gel can be mixed with a stirring motor (for example, Three One Motor, EYE LA mini DC S tirrer, etc., manufactured by Shinto Kagaku) and a Teflon (registered trademark) stirring propeller.
  • a stirring motor for example, Three One Motor, EYE LA mini DC S tirrer, etc., manufactured by Shinto Kagaku
  • Teflon registered trademark
  • aqueous gelatin solution was placed in a device that was attached to a round-bottomed flask and fixed, and an oil such as olive oil was added thereto and stirred at a speed of about 200 to 600 rpm to obtain a WZO type emulsion.
  • An aqueous solution of a cross-linking agent is added to this, or an aqueous solution of gelatin is preliminarily prepared in olive oil (for example, vortexmixer Advantec TME-21, homogenizer o1 ytron PT10-35, etc.).
  • the mixture was dropped into olive oil to prepare a micronized W / O emulsion, to which an aqueous solution of a crosslinking agent was added, a crosslinking reaction was performed, and a crosslinked gelatin gel was recovered by centrifugation. Wash with acetone, ethyl acetate, etc., then wash with IPA, ethanol, etc. and dry. Next, it can be prepared by adding 10 OmM glycine to an aqueous solution containing Tween 80 and suspending the particles therein to stop the crosslinking reaction. The obtained crosslinked gelatin gel particles are sequentially washed with distilled water containing IPA and Tween 80, distilled water, and the like, and used for preparation of a pharmaceutical preparation.
  • the average particle size of the obtained crosslinked gelatin gel particles is 1 to 100 Om, and particles having a required size are appropriately sieved and used according to the purpose. When administered by intramuscular injection, it is preferable to use particles having an average particle size of 10 to 150 / zm. That's right.
  • the mean particle size means the mean size of particles estimated by sieving.
  • the water content of the obtained crosslinked gelatin gel particles is about 50 to 99 wZw%, and a preferable water content can be appropriately prepared.
  • the water content of the gel indicates the ratio of the weight of water in the gel to the total weight of the gel when wet.
  • ultrasonic irradiation (within cooling, within about 1 minute: preferable) may be performed.
  • fine crosslinked gelatin gel having an average particle diameter of 20 m or less can be obtained by pre-milking.
  • Another method for preparing a spherical or particulate crosslinked gelatin gel is as follows.
  • the average particle size and the water content of the crosslinked gelatin gel particles obtained by this alternative method are the same as those obtained by the above method.
  • Crosslinking reaction conditions should be appropriately selected, but the reaction temperature is preferably 0 to 40 ° C, and the reaction time is preferably 1 to 48 hours.
  • the crosslinked gelatin gel obtained as described above can be dried under reduced pressure or lyophilized.
  • lyophilization for example, place a cross-linked gelatin gel in distilled water and in liquid nitrogen for 30 minutes. After freezing at above or 180 ° C for 1 hour or more, dry it with a freeze dryer for 1 to 3 days.
  • the concentration of the gelatin and the cross-linking agent in preparing the cross-linked gelatin gel should be appropriately selected depending on the desired water content, but the gelatin concentration is 1 to 10 Ow / v%, and the cross-linking agent concentration is 0.01 to 100 wZv%. (Equivalent to 1 to 540 OmM) is preferred.
  • the crosslinked gelatin gel can have a desired water content by changing the concentrations of the raw material gelatin and the crosslinker. To increase the water content, both the gelatin concentration and the cross-linking agent concentration should be lowered. Conversely, to lower the water content, both the gelatin concentration and the cross-linking agent concentration should be increased.
  • an aqueous solution of bFGF is dropped and impregnated on the crosslinked gelatin gel, or the crosslinked gelatin gel is suspended and reswelled in the aqueous solution of bFGF. .
  • the amount of b FGF which can be supported on cross-linked gelatin gel differs by water content or the like of the crosslinked gelatin gel, a crosslinked gelatin gel 1 m g per 0. 1 to 50 0 s.
  • the release time and amount of bFGF released from the gelatin gel depends on the moisture content of the gelatin gel, the physical properties such as the isoelectric point of the gelatin used, the amount of bFGF carried on the preparation, the site to be administered, etc. Depends on various conditions.
  • the bFGF-supported crosslinked gelatin gel preparation obtained as described above can also be lyophilized.
  • freeze-drying for example, after freeze-drying in liquid nitrogen for 30 minutes or more or at 80 ° C for 1 hour or more, the freeze-drying is performed for 1 to 3 days.
  • the preparation of the present invention When the preparation of the present invention is prepared as an injectable preparation, it is appropriately suspended in a medium such as purified water for injection, physiological saline, or a buffer.
  • a medium such as purified water for injection, physiological saline, or a buffer.
  • the buffer include a phosphate buffer, an acetate buffer, and a citrate buffer.
  • dispersants, surfactants, isotonic agents, pH adjusters, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, coloring agents, etc. commonly used in the manufacture of injectable preparations can do.
  • the preparation of the present invention has an excellent healing action for diabetic neuropathy and can be used for the treatment of diabetic neuropathy. Further, the preparation of the present invention can be applied to the treatment of diabetic neuropathy not only in humans but also in other mammals (for example, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, rabbits, higgins, monkeys, etc.).
  • the diabetic neuropathy in the present invention refers to a decrease in the function of peripheral nerves caused by hyperglycemia.
  • Diabetic neuropathy includes polyneuropathy (eg, numbness, cold sensation, neuralgia, paresthesia, swelling, etc.) and autonomic nervous system (eg, abnormal sweating, standing up, constipation, diarrhea, diminished gall bladder contractility, etc.) ), Mononeuropathy (for example, facial neuropathy, extraocular muscle, paralysis of auditory nerve, neuropathy of limbs, etc.), etc., and the preparation of the present invention can be applied to any of these symptoms. Preferably, it can be applied to polyneuropathy.
  • polyneuropathy eg, numbness, cold sensation, neuralgia, paresthesia, swelling, etc.
  • autonomic nervous system eg, abnormal sweating, standing up, constipation, diarrhea, diminished gall bladder contractility, etc.
  • Mononeuropathy for example, facial neuropathy, extraocular muscle, paralysis of auditory nerve
  • the preparation of the present invention can be administered by any administration route such as intravenous administration and intramuscular administration, but intramuscular administration is preferred.
  • a particulate gel carrying bFGF is suspended in an appropriate medium commonly used in the production of injections to prepare an injectable preparation, which is injected intramuscularly.
  • the bFGF-supported gelatin gel may be formed into a columnar shape, a prismatic shape, a sheet shape, a disk shape, or the like, and may be embedded in a nerve injury site.
  • the dosage of the therapeutic agent of the present invention because it varies depending on the subject, the type of indication, the severity of the symptom, the age and condition of the subject, and the like.
  • the amount of FGF is about 0.001 / zg to 10 mg, preferably 1 to: LO00; ug in one treatment site for one treatment site. is there.
  • the number of doses depends on the case, the dose per treatment Normal :! Approximately 10 times. Further, depending on the type and degree of symptoms, administration may be performed 2 to 6 times.
  • aqueous dartalaldehyde solution is added to an aqueous gelatin solution (alkali-treated gelatin having an isoelectric point of around 5 (Type B, manufactured by Nippi Corporation)), poured into a cylindrical ⁇ -shaped mold, and subjected to a crosslinking reaction to form a crosslinked gelatin gel.
  • aqueous gelatin solution alkali-treated gelatin having an isoelectric point of around 5 (Type B, manufactured by Nippi Corporation)
  • Streptozotocin STZ is dissolved in sterile physiological saline to a final concentration of 0.9%, and this solution is intraperitoneally administered to 8-week-old Wistar male rats at 6 Omg / kg body weight. Thus, diabetic rats were produced.
  • B FGF (50 ⁇ g) -supported cross-linked gelatin gel (800 / L) was divided into four equal parts on the right thigh muscle soleus muscle of untreated normal rats and diabetic rats 8 weeks after STZ administration. Then, the solution was intramuscularly administered to four sites (12.5 ⁇ g / 0.2 mL ⁇ 4) at two sites in total.
  • a cross-linked gelatin gel not carrying bFGF was intramuscularly administered to the left thigh muscle soleus muscle.
  • Ten days after the treatment fundus photography and retinal blood flow measurement were performed.
  • Nerve conduction velocity is measured by applying current stimulation from the sciaticnotch and the Achilles tendon, receiving the stimulation at the sole of the foot, and measuring the conduction time of each using a N euroack ERE CT OMYOGRAPH MEM-3202. The nerve conduction velocity was calculated from the distance (distance between the two stimulation sites) and the conduction time (sciaticnotch-Achilles tendon).
  • a needle of an electrode is inserted into the sciatic nerve, where electrolysis occurs and the blood flow is determined from the clearance of the generated hydrogen by using a semiconductor laser tissue blood flow meter M OD ELLB F-221 RSER I It was measured using AL91052.
  • Fig. 1 shows the measurement results of nerve conduction velocity
  • Fig. 2 shows the measurement results of blood flow in the nerve.
  • the preparation of the present invention can effectively treat diabetic neuropathy.
  • the present invention makes it possible to remarkably improve nerve conduction velocity and blood flow in nerves, which are indicators of the treatment of diabetic neuropathy, as a result of supporting bFGF on gelatin. This is useful in improving the utility as a therapeutic agent for disorders. According to the preparation of the present invention, it is possible to effectively treat diabetic neuropathy. While certain embodiments of the invention have been described above in detail, various modifications and changes may be made to the particular embodiments shown by those skilled in the art without departing substantially from the teachings and advantages of the invention. It is possible to make changes. Accordingly, all such modifications and changes are intended to be included within the spirit and scope of the invention as claimed in the following claims.

Abstract

糖尿病性神経障害をより効果的に治療し得る、塩基性線維芽細胞成長因子をゼラチンゲルに担持させてなる糖尿病性神経障害治療剤を提供する。

Description

明細書
ゼラチンゲルを担体とする糖尿病性神経障害治療剤
技術分野
本発明は塩基性線維芽細胞成長因子 （b F G F ) を含む糖尿病性神経障害治 療剤に関する。 より詳細には、 本発明は糖尿病性神経障害治療用の b F G F担 持ゼラチンゲル製剤に関する。
背景技術
我が国における糖尿病患者数は増加の一途をたどっており、 糖尿病が強く疑 われる患者は 7 4 0万人、 可能性を否定できない患者も含めれば 1 6 2 0万人 にも上ると言われている。 糖尿病患者の診療においては、 糖尿病性合併症 （網 膜症、腎症、神経障害など）の発症や進展を如何に阻止するかが最も重大なテー マであり、 合併症のなかでも神経障害が最も高頻度かつ早期から出現すると考 えられている。
糖尿病性神経障害は、 多彩な臨床症状を呈することにより糖尿病患者の Q O L (Q u a l i t y o f L i f e ) を著しく低下させるだけでなく、 心血 管系自律神経障害の生命予後に及ぼす影響には計り知れないものがあり、 その 予防と早期治療が重要である。 これまでに報告されている糖尿病患者における 糖尿病性神経障害の発症頻度は、 用いた診断方法と基準、 糖尿病罹病期間、 年 齢、 診察者あるいは検査技師の知識と経験度の違いにより様々であるが、 一般 的には 3 0〜4 0 %といわれている。 神経障害分類として様々な分類が提唱さ れているが、 臨床的には多発性神経障害 （感覚運動神経障害および自律神経障 害） と単一性神経障害（混合性脊髄神経障害および脳神経障害）に大別される。 糖尿病性神経障害が高血糖を基盤として発症および進展することは言うまで もないが、 高血糖に起因するさまざまな異常を介して神経機能異常が引き起こ される。 この高血糖由来の異常として代表的なものが、 代謝因子、 血管因子お よぴ神経栄養因子の異常である。 なかでも代謝因子と血管因子の重要性と相互 関連性についての検討がこれまでなされており、 高血糖に起因する代謝障害に よる神経細胞の機能異常と代謝障害に基づく血流異常が、 神経機能異常の発現 に複雑に絡み合つていると考えられている。 代表的代謝異常と神経栄養因子異 常については以下のようなことが知られている。
1 ) ポリオール代謝活性の亢進：神経組織におけるポリオール代謝活性の亢進 によるソルビトール蓄積とミオイノシトール欠乏を介してプロティンキナーゼ
C (PKC)活性の低下ぉょぴNa+/K+— ATP a s e活性の低下を来たし、 神経伝導速度の遅延すなわち神経障害を引き起こすと考えられている。
2) PKC活性異常：血管系細胞においては PKC (特に PKC— b e t a) 活性の亢進が血流異常に関与し、 神経系系田胞においては PKC (特に PKC— a l h a) 活性の低下が細胞機能異常を惹起すると考えられており、 両者が 神経障害の発症に関連していると推察されている。
3) 非酵素的糖化反応の亢進：非酵素的糖化反応の亢進による後期反応生成物 (AGE s) I 神経内血管内皮細胞に作用することにより神経内血管の血流 異常を引き起こす一方で神経系細胞に直接作用することで細胞機能障害を引き 起こすと考えられている。
4) 酸化ストレスの亢進：高血糖による活性酸素の産生亢進と消去能の低下が 酸化ストレスの亢進を引き起こし、 血流障害とともに細胞機能障害を引き起こ すと考えられている。
5) 神経栄養因子異常：神経栄養因子は-ユーロンの生存 ·分化 ·機能を維持 する内因性物質であり、 糖尿病性神経障害に関しては主に神経成長因子 （NG
F) とニューロトロフィン一 3 (NT- 3) について報告されている。 これら は、 糖尿病状態で発現が低下したサプスタンス Pおよびカルシト二ン遺伝子関 連ペプチド （CGRP) などの神経伝導物質の発現増加を介して神経機能を改 善すると考えられている。
糖尿病性神経障害に限られたものではないが、 糖尿病性合併症の管理 ·治療 の基本は長期に！:り良好な血糖コントロールを維持することである。 しかしな がら、 日常診療において血糖コントロールを完璧に行うことは不可能であり、 上述の発症機序にのっとった治療法の確立が必要である。
ポリオール経路の律速酵素であるアルドース還元酵素 （A R) の活性を抑制 する A R阻害薬は日常診療に用いられているが、 その臨床的有用性に関する国 際的コンセンサスは得られていない。 しかし、 A R阻害薬はポリオール代謝以 外の代謝異常および血流異常をも改善し得る治療薬として、 最も期待される薬 剤である。 また血流改善作用を有する様々な薬剤 (プロスタグランジン プロスタグランジン I 2、 ニセリ トロー/レ、 シロスタゾーノレ、 塩酸サノレポグレ ラート） 力 多くの患者に使用されている。 今後治療薬として期待される薬剤 として、 P K C— b e t a阻害薬、 非酵素的糖ィ匕反応阻害薬、 抗酸化薬、 神経 成長因子 （N G F ) などが挙げられるがこれらの薬剤による治療は未だ確立さ れていない。
一方、 非可逆性の組織変化を伴った重症の神経障害に対しては、 血糖コント ロールの改善あるいは成因に基づく薬剤による治療はもはや効果が期待できず、 痛みなどの自覚症状に対する対症療法が必要となる。 痛みに対しては鎮痛薬と してサリチル酸や非ステロイド系消炎薬が治療の基本となり、 夜間の激しい痛 みに対してはィンドメタシン坐薬やカルパマゼピン、 フエ-トインといった抗 痙攣薬の投与がなされている。 また三環系およぴ四環系の抗うつ薬の併用も不 眠を伴った症侯性抑うつの解消に効果的といわれている。 また、 経口抗不整脈 薬であるメキシレチンの有効性が明らかとなってきている。
近年新たな経口血糖降下薬およびインスリン製剤が次々に出現し、 よりよい 血糖コント口ールの維持が可能となったことが、 神経障害を含めた糖尿病性合 併症の発症や進展の抑制に繋がることが予想される。 しかしながら、 それだけ では十分とはいえず、 より効果的な糖尿病性合併症の予防および治療法の確立 が切望されている。
塩基性線維芽細胞成長因子 （b F G F ) は、 血管新生作用を有するサイト力 インであり、 虚血モデルを用いた研究によりその有効性が報告されている （国 際公開第 9 4 / 2 7 6 3 0号パンフレツト）。加えて、 b F G Fは、線維芽細胞 およ 神経系細胞を始めとする様々な細胞の増殖およぴ分化誘導因子として作 用することが明らかにされている。 また、 b FGF 糖尿病性神経障害の治療 に有 であるとする報告もなされている（中村ら， 「糖尿病性神経障害に対する b FO Fの効果」， 第 46回日本糖尿病学会要旨集， I I一 J 3— 28， 平成 1 5年 5月）。
発明の開示
本条明が解決しょうとする課題は、 糖尿病性合併 をより効果的に治療し得 る薬 ¾を提供することにある。
本^明者らは、 b FGFの糖尿病性神経障害の治療効果に着目し、 その作用 効果をさらに効率的に発現させるベく、 鋭意検討の結果、 b FGFをゼラチン ゲルに担持させることによって、 所期の目的が達成されることを見出し、 本発 明を 成した。 すなわち、 本発明の要旨は以下のとおりである。
[1] b FGFをゼラチンゲルに担持させてなる、糖尿病性神経障害治療剤。
[2] ゼラチンゲルが架橋ゼラチンゲルである、 [ 1] に記載の治療剤。
[3] ゼラチンゲルに担持させた b FGFの治療上有効量を哺乳動物に投与 するこ とを含む、 糖尿病性神経障害の治療方法。
[4] ゼラチンゲルが架橋ゼラチンゲルである、 [3] 記載の治療方法。
[5] 糖尿病性神経障害の治療剤を製造するための b FGF及ぴゼラチンゲ ルの^:用。
[6] ゼラチンゲルが架橋ゼラチンゲルである、 [5] 記載の使用。
[7] [1] 又は [2] 記載の治療剤、 および当該治療剤を糖尿病性神経障 害に使用することができることまたは使用すべきであることを記載した当該治 療剤に関する記載物を含む商業パッケージ。
以下、 b FGFをゼラチンゲルに担持させてなる糖尿病性神経障害治療剤を 単に 「本発明の製剤」 とも称する。
本発明は、 b FGFをゼラチンに担持させた結果、 糖尿病性神経障害の治療 の指標となる神経伝達速度おょぴ神経内血流量を顕著に改善させることを可能 とし、 b FGFの糖尿病性神経障害の治療剤としての利用'性を向上させた点で 有用である。 本発明の製剤によれば、 糖尿病性神経障害を有効に治療すること ができる。
図面の簡単な説明
図 1は、 正常ラットおよび STZ誘導糖尿病ラットに架橋ゼラチンゲル （コ ントローノレ） または b FGF担持架橋ゼラチンゲルを筋肉内注射した場合の処 置 10日後の坐骨神経における神経伝導速度を表すグラフである。
図 2は、 正常ラットおよび STZ誘導糖尿病ラットに架橋ゼラチンゲル （コ ントローノレ） または b FGF担持架橋ゼラチンゲルを筋肉内注射した場合の処 置 1 0日後の坐骨神経における神経内血流量を表すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
本発明における b FGFとしてはその同族体を用いてもよい。 本発明におけ る b FG Fおよび/ またはその同族体は、 天然あるいは遺伝子組換え技術によ り微生物または培養細胞に産生させたものから単離精製することにより、 ある いはそれらを化学的修飾または生物的修飾することにより得られる。 本発明で 用いる b FGFとしては特にヒト b FGFまたはその同族体が好ましい。
b FG Fの同族体とは、 下記 〔I〕 または 〔I I〕 のポリペプチドを意味す る。
〔 I〕 哺导し動物で産生される b F GFと実質的に同一のァミノ酸配列からなる ポリペプチド。 実質的に同一のアミノ酸配列とは、 アミノ酸配列中の 1〜6個 のアミノ酸が別種のアミノ酸により置換されたもので b FGFの生物活性を有 するものを意味する。
〔I I〕 Pf乳動物で産生される b FGFの N末端おょぴノまたは C末端、 ある いは上記 〔I〕 のポリペプチドの N末端おょぴノまたは C末端に、 追加のアミ ノ酸セグメントが追加されたポリペプチド。 追加のアミノ酸セグメントとは、 1〜1 2個のアミノ酸からなり、 b FGFの生物活性またま上記 〔I〕 のポリ ぺプチドの生物活性を損なわないものを意味する。 ヒト b FGFはアミノ酸 146個のポリペプチドであるが、 本突明の製剤に おいては、 ヒ ト bFGFの同族体 （前記 〔I〕 の同族体） として、 例えば特表 平 2— 504468号公報に記載のアミノ酸 146個のポリペプチドを用いて もよい。 このポリペプチドは、 ヒ ト b FGFのアミノ酸配列を構成する 69位 のシスティン （Cy s) および 87位のシスティン （Cy s) がそれぞれセリ ン （S e r) により置換されたものである。
また、 前記 〔 I I〕 の同族体として、 例えば特表昭 63- 50 O 843号公 報に記載のアミノ酸 155個のポリペプチドを用いてもよい。 このポリべプチ ドは、 ヒト b FGFの N末端にアミノ酸 9個のセグメントが付加されたもので ある。
また、 N末端に K4e t—が付加されたアミノ酸 147個のポリペプチドや、 特表昭 63-501 953号公報に記載の N末端にアミノ酸 11個からなるセ グメントが付加されたアミノ酸 157個のポリべプチドを用いてもよい。
特に好ましい b FGFとしては、 トラフエルミン （遺伝子組換え） が挙げら れる。
本発明の製剤においては、 一種類の b FGFを単独で使用してもよいし、 複 数種を併用しても い。 さらに、 前述したように、 b FGFの同族体は複数種 あるが、 これらの同族体についても、 それぞれを単独で使用してもよいし、 併 用してもよい。
なお、 生体内に: ける b FGFの存在量は極微量であるため、 本発明の製剤 を商業的に安定して供給する上からは、 遺伝子組換え技術により大腸菌等の微 生物または培養細泡に産生させた b F G Fまたはその同族体を使用することが 特に好ましい。 b FGFまたはその同族体 （この場合は一般に前記 〔I〕 のポ リペプチド） を産 させるための遺伝子を微生物または培養細胞に組み込んだ 場合、 この微生物または培養細胞から産生されるものは、 一般に、 b FGFの N末端および/ま fこは C末端、 または上記 〔I〕 のポリペプチドの N末端およ び/または C末端 ίこ、 追加のアミノ酸セグメントが付加したもの、 すなわち前 述した 〔I I〕 のポリペプチドである。
本発明にお るゼラチンゲルの原料となるゼラチンの種類には特に制限はな く、 通常入手できるものでよい。 そのようなゼラチンとしては、 例えば、 等電 点 5付近のァノレカリ処理ゼラチン（酸性ゼラチン）、等電点 9付近の酸処理ゼラ チン （アルカリ ゼラチン） などが挙げられるが、 b F G Fとの親和'性の点で、 等電点 5付近 O酸性ゼラチンが好ましい。 ゼラチンは、 一種類のみではなく、 原料や、 溶解'生、 分子量、 等電点等の物性の異なるものを適宜混合して用いて もよい。
本発明で用 ヽ得るゼラチンを架橋するための架橋剤としては、 生体に対する 毒性がないも Oであれば特に限定されないが、 例えば、 グルタルァノレデヒド、 1ーェチルー 3 — ( 3—ジメチルァミノプロピル） カルポジィミド塩酸塩や 1 —シクロへキンノレ一 3— ( 2—モルホリノエチル) カルポジィミ ド一メ トー p —トルエンスノレホナート等の水溶性カルポジイミ ド、 ビスエポキシィヒ合物、 ホ ルマリンなど力 S好ましく、 グルタルアルデヒドおよび 1—ェチル一 3— ( 3 - ジメチルァミ /プロピル） カルポジィミド塩酸塩が特に好ましい。
ゼラチンはまた、 熱処理または紫外線照射もしくは電子線照射によって架橋 してもよい。
本発明で用いる架橋ゼラチンゲルの形状は特に制限はなく、例えば、円柱状、 角柱状、 シート状、 ディスク状、 球状、 粒子状、 粒状、 ペースト状などが挙げ られる。インプラントとして用いる場合には、 円柱状、角柱状、シート状、ディ スク状のもの 好ましく、 注入可能な製剤として用いる場合には、 球状、 粒子 状、 粒状、 ペースト状のものが好ましい。
円柱状、 角 ¾状、 シート状、 ディスク状の架橋ゼラチンゲルは、 ゼラチン水 溶液に架橋剤フ 溶液を添加する力 \あるいは架橋剤水溶液にゼラチンを添加し、 所望の形状の鑤型に流し込み、 架橋反応させて調製することができる。 また、 成形したゼラチンゲルをそのまま、 あるいは乾燥後に架橋剤水溶液を添加して もよい。 架橋 応を停止させるには、 エタノールァミン、 グリシン等のアミノ 基を持つ低分子物質に接触させるか、 または pH2. 5以下の水溶液を添カロす る。得られた架橋ゼラチンゲルは、蒸留水、エタノール、 2—プロパノール（以 下、 I PAと称する）、 アセトン等により洗浄し、 製剤調製に供される。
得られる架橋ゼラチンゲルの含水率は、 50〜99 wZw%である。ここで、 ゲルの含水率とは、 湿潤時のゲル全重量に対するゲル中の水分重量の割合を示 す。
ペースト状の架橋ゼラチンゲルは、 上述の円柱状、 角柱状、 シート状、 ディ スク状の架橋ゼラチンゲルの調製方法と類似の方法で調製することができる。 球状、 粒子状、 粒状の架橋ゼラチンゲルは、 例えば、 撹拌用モーター （例え ば、新東科学社製、スリーワンモーター、 EYE L A m i n i D. C. S t i r r e r等） とテフロン （登録商標） 製撹拌用プロペラを三つ口丸底フラ スコに取り付け、 これらを固定した装置に、 ゼラチン水溶液を入れ、 ここにォ リーブ油等の油を加えて 200〜600 r pm程度の速度で撹样し、 WZO型 ェマルジヨンとし、 これに架橋剤水溶液を添加するか、 ゼラチン水溶液を予め ォリーブ油中にて前乳ィ匕 （例えば、 v o r t e x m i x e r A d v a n t e c TME— 2 1、ホモジナイザー o 1 y t r o n PT 1 0— 3 5等） しておいたものをォリーブ油中に滴下し、 微粒子化した W/O型ェマルジョン を調製し、 これに架橋剤水溶液を添加し、 架橋反応させ、 遠心分離により架橋 ゼラチンゲルを回収し、 アセトン、 酢酸ェチル等で洗浄し、 さらに I PA、 ェ タノール等で洗净して乾燥させる。 次に、 Twe e n 80を含む水溶液に 1 0 OmMグリシンを加え、 その中に粒子を懸濁させることで架橋反応を停止させ ることにより調製することができる。 得られた架橋ゼラチンゲ /レ粒子は、 I P A、 Twe e n 80を含む蒸留水、 蒸留水等で順次洗浄し、 製剤調製に供され る。
得られる架橋ゼラチンゲル粒子の平均粒子径は、 1〜100 O mであり、 目的に応じて適宜必要なサイズの粒子をふるい分けして使用する。 筋肉内注射 により投与する場合には平均粒子径 1 0〜1 50 /zmの粒子を用いるのが好ま しい。 ここで 、う平均粒子径とは篩過により類推される粒子の平均径を意味す る。 また、 得られる架橋ゼラチンゲル粒子の含水率は 5 0〜 9 9 wZw%程度 であり、適宜好ましい含水率のものを調製できる。ここで、ゲルの含水率とは、 湿潤時のゲル全重量に対するゲル中の水分重量の割合を示す。
架橋ゼラチンゲル粒子が凝集する場合には、 例えば、 超音波照射 （冷却下、 1分以内程度:^好ましい） 等を行ってもよい。
なお、 前乳ィ匕することによって、 平均粒子径 2 0 m以下の微粒子状の架橋 ゼラチンゲルを得ることもできる。
球状、 粒子状の架橋ゼラチンゲルを調製する別法として次のような方法もあ る。
上記の方法と同様の装置にォリーブ油を入れ、 2 0 0〜 6 0 0 r p m程度の 速度で撹拌し、 ここにゼラチン水溶液を滴下し、 WZO型ェマルジヨンを調製 し、 これを冷 ¾3後アセトン、 酢酸ェチル等を加えて撹拌し、 遠心分離によりゼ ラチン粒子を回収する。 回収したゼラチン粒子をさらにァセ トン、 酢酸ェチル 等、 次いで I P A、 エタノール等で洗浄後、 乾燥させる。 乾燥ゼラチン粒子を 0 . l % T w e e n 8 0を含む架橋剤水溶液に懸濁し、 緩やかに撹拌しながら 架橋反応させ、 使用した架橋剤に応じて 0 . 1 % T w e e n 8 0を含む 1 0 0 mMグリシン水溶液または 0 . 1 % T w e e n 8 0を含む 0 . 0 0 4 N H C 1などにて洗净して架橋反応を停止することにより架橋ゼラチンゲル粒子を得 ることができる。
本別法で得られる架橋ゼラチンゲル粒子の平均粒子径ぉよび含水率は、 上記 の方法で得られるものと同様である。
架橋反応条件は適宜選択すべきものであるが、 反応温度は 0〜4 0 °C、 反応 時間は 1〜4 8時間が好ましい。
上記のよう〖こして得られた架橋ゼラチンゲルは減圧乾燥または凍結乾燥させ るこ.ともできる。
凍結乾燥は、 例えば架橋ゼラチンゲルを蒸留水に入れ、 液体窒素中で 3 0分 以上または一 80°Cで 1時間以上凍結させた後に凍結乾燥機で 1〜 3日間乾燥 させることにより行う。
架橋ゼラチンゲルを調製する際のゼラチンと架橋剤の濃度は、 所望の含水率 により適宜選択すべきであるが、 ゼラチン濃度 1〜10 Ow/v%、 架橋剤濃 度 0. 0 1〜100wZv% (1〜540 OmMに相当） が好ましい。
架橋ゼラチンゲルは、 原料であるゼラチンと架橋剤の濃度を変化させること により所望の含水率とすることができる。 含水率を高くするには、 ゼラチン濃 度、 架橋剤濃度共に低くし、 逆に含水率を低くするにはゼラチン濃度、 架橋剤 濃度共に高くすればよい。
上記のようにして調製した架橋ゼラチンゲルに b FG Fを担持させるには、 b FGF水溶液を架橋ゼラチンゲルに滴下して含浸させるか、 架橋ゼラチンゲ ルを b F G F水溶液中に懸濁して再膨潤させる。
架橋ゼラチンゲルに担持させることができる b FGFの量は、 架橋ゼラチン ゲルの含水率等により異なるが、 架橋ゼラチンゲル 1 m g当たり 0. 1〜50 0 sである。
なお、 ゼラチンゲルからの b FGFの放出時間おょぴ放出量は、 ゼラチンゲ ルの含水率、 用いたゼラチンの等電点等の物性、 製剤に担持される b FGFの 量、 投与される部位などの種々の条件により異なる。
上記のようにして得られた b FGF担持架橋ゼラチンゲル製剤は、 凍結乾燥 することもできる。 凍結乾燥する場合には、 例えば、 液体窒素中で 30分以上 また 一 80°Cで 1時間以上凍結させた後に、 凍結乾燥機で 1〜3日間乾燥さ せることにより行う。
本発明の製剤を注入可能な製剤とする場合には、注射用精製水、生理食塩水、 緩衝液などの媒体に適宜懸濁する。 緩衝液としては、 リン酸緩衝液、 酢酸緩衝 液、 クェン酸緩衝液などが挙げられる。 さらに必要に応じ、 注射可能な製剤の 製造に通常使用される、 分散剤、 界面活性剤、 等張化剤、 pH調整剤、 無痛化 剤、 安定化剤、 保存剤、 着色剤などを適宜配合することができる。 本発明の製剤は、 優れた糖尿病性神経障害治癒作用を有しており、 糖尿病性 神経障害の治療に用いることができる。 また本発明の製剤は、 ヒトのみならず その他の哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ハムスター、 ゥサギ、 ネコ、 ィ ヌ、 ゥシ、 ヒッジ、 サルなど） における糖尿病性神経障害の処置にも適用可能 である Q
本発明における糖尿病性神経障害とは、 高血糖に起因する末梢神経の働きの 低下を 味する。 糖尿病性神経障害は、 多発性神経障害 （例えば、 しびれ、 冷 感、神経痛、感覚麻痺、 こむらがえりなど）、 自律神経障害（例えば、発汗異常、 立ちく らみ、 便秘、 下痢、 胆のう収縮能低下など）、 単一性神経障害 （例えば、 顔面神經、外眼筋、聴神経の麻痺、四肢の神経障害など） などに分類されるが、 本発明の製剤はこれらいずれの症状にも適用され得る。 好ましくは、 多発性神 経障害に適用され得る。
本発 の製剤は、 静脈内投与、 筋肉内投与など任意の投与経路で投与され得 るが、 筋肉内投与が好ましい。 例えば、 b F G Fを担持させた粒子状のゲルを 注射剤の製造において慣用されている適当な媒体に懸濁し注射可能な製剤とし これを筋肉内に注射する。また、 b F G F担持ゼラチンゲルを円柱状、角柱状、 シート状、 ディスク状などに成形して、 神経障害部位に埋設してもよい。
本発 の治療剤の投与量は、 対象や適応症の種類、 症状の程度、 対象の年齢 や病態 &こより異なるので特定することは困難であるが、 例えば、 ヒ トにおける 糖尿病' 神経障害の処置の場合には、 b F G F量で、 1箇所の処置部位に対し て 1回の処置あたり、 およそ 0 . 0 0 1 /z g〜1 0 m g、 好ましくは 1〜： L O 0 0 ;u gの範囲である。 投与回数は症例、 1回の処置あたりの投与量にもよる 力 通常:！〜 1 0回程度とする。 さらに症状の種類や程度によって、 2〜6回 投与してもよい。
実施例
以下、 実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれに限定され るものではない。 架橋ゼラチンゲルの作製 （含水率 9 9 %)
ゼラチン水溶液（等電点 5付近のアルカリ処理ゼラチン（タイプ B、 （株）ニッ ピ製）） に、 ダルタルアルデヒド水溶液を添加し、 円柱状の铸型に流し込み、架 橋反応させて架橋ゼラチンゲルを調製した。 この架橋ゼラチンゲルをグリシン 水溶液に浸しながら架橋停止反応を行った後、さらに注射用水に浸して洗浄し、 凍結乾燥させて架橋ゼラチンゲルを作製した。
注射剤の作製
上記の凍結乾燥させた架橋ゼラチンゲルに、 5 O gZ8 0 0 L濃度の b F GF水溶液を添カ卩し、 b F GFを含浸させ、 注射剤 （b F GF担持架橋ゼラ チンゲル） を作製した。
実験方法
ス トレプトゾトシン (S T Z) を 0. 9 %の終濃度になるように滅菌生理食 塩水に溶解し、 この溶液を 8週齢の W i s t a r系雄性ラットに体重 1 k g当 たり 6 O m g腹腔内投与することにより糖尿病ラットを作製した。 未処置の正 常ラットおよび S TZ投与 8週後の糖尿病ラットの右側大腿筋おょぴヒラメ筋 に、 b F G F (5 0 μ g) 担持架橋ゼラチンゲル （8 0 0 / L) を 4等分し、 2ケ所ずつ計 4力所 （1 2. 5 μ g/0. 2mL X 4 ) に筋肉内投与した。 コ ントロールとして左側大腿筋おょぴヒラメ筋に b F GFを担持させていない架 橋ゼラチンゲルを筋肉内投与した。 処置 1 0日後に眼底撮影、 網膜血流測定を 行った。 神経伝導速度は、 s c i a t i c n o t c hとアキレス腱部より電 流刺激を行い、 その刺激を足底部で受け取りそれぞれの伝導時間を N e u r o a c k ERE CT OMYOGRAPH MEM— 3 2 0 2を用いて測定 し、 その後刺激部位の距離を測定し、 距離 （2点の刺激部位の距離） 伝導時 間 （s c i a t i c n o t c h—アキレス腱部） より神経伝導速度を算出し た。 神経内血流量の測定は、 坐骨神経に電極の針を刺し、 そこで電気分解を起 こし発生させた水素のクリアランスより血流量を半導体レーザー組織血流計 M OD E L L B F- 2 2 1 R S ER I AL 9 1 0 5 2を用いて測定した。 弒果
眼底検査では全群において網膜症の発症は認められなかった。 また網膜血流 量は、 糖尿病ラットにおいて低下が認められた b F G F投与による変化は認 められなかった。
神経伝導速度の測定結果を図 1に、 神経内血流量の測定結果を図 2に、 それ ぞれ示す。
図 1およぴ図 2の結果から、 b F G F担持ゼラチン製剤の投与は、 正常ラッ トの神経伝導速度おょぴ神経内血流量には影響を与えず、 糖尿病ラットにおい てのみ、 糖尿病に起因する神経伝導速度の低下おょぴ神経内血流量の低下を有 意に改善したことがわかる。
以上の結果から、 本発明の製剤は糖尿病性神経障害を効果的に治療し得るこ とが判明した。
産業上の利用可能'
本発明は、 b F G Fをゼラチンに担持させた結果、 糖尿病性神経障害の治療 の指標となる神経伝導速度おょぴ神経内血流量を顕著に改善させることを可能 とし、 b F G Fの糖尿病性神経障害の治療剤としての利用性を向上させた点で 有用である。 本発明の製剤によれば、 糖尿病性神経障害を有効に治療すること 力 Sできる。 以上、 本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、 当業者であれ 示された特定の態様には、 本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲 で様々な修正と変更をなすことは可能である。 従って、 そのような修正及ぴ変 更も、 すべて後記の請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれる ものである。
本出願は、 日本で出願された特願 2 0 0 4— 1 1 6 1 0 9 (出願日 ： 2 0 0 4 年 4月 9ョ） を基礎としており、 その内容は本明細書に全て包含される。

Claims

請求の範囲
1 . 塩基性線維芽細胞成長因子をゼラチンゲルに担持させてなる、 糖尿病性 神経障害治療剤。
2 . ゼラチンゲルが架橋ゼラチンゲルである、 請求項 1記載の治療剤。
3 . ゼラチンゲルに担持させた塩基性線維芽細胞成長因子の治療上有効量を 哺乳動物に投与することを含む、 糖尿病性神経障害の治療方法。
4 . ゼラチンゲルが架橋ゼラチンゲルである、 請求項 3記載の治療方法。
5 . 糖尿病性神経障害の治療剤を製造するための塩基性線維芽細胞成長因子 及ぴゼラチンゲルの使用。
6 . ゼラチンゲルが架橋ゼラチンゲルである、 請求項 5記載の使用。
7 . 請求項 1又は 2記載の治療剤、 および当該治療剤を糖尿病性神経障害に 使用することができることまたは使用すべきであることを記載した当該治療剤 に関する記載物を含む商業パッケージ。
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