WO2005094866A1 - アディポネクチン発現誘導剤およびその利用 - Google Patents

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Takashi Kadowaki
Toshimasa Yamauchi
Shoko Kitajima
Yusuke Ito
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Toudai Tlo, Ltd.
Nissan Chemical Industries, Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to an adiponectin expression inducer, particularly to an agent capable of inducing adiponectin expression via KLF9, and a drug for preventing or treating a metabolic disease or a heart disease using the same. Furthermore, the present invention relates to a substance capable of inducing the expression of adiponectin, a method for screening a drug for preventing or treating a metabolic disease or a heart disease using the same, and a cell used for the same.
  • Obesity is defined as an increase in the amount of adipose tissue and has a high risk of developing cardiovascular and metabolic disorders such as diabetes, hyperlipidemia and coronary heart disease (Non-Patent Document 1, 2).
  • Adipose tissue itself functions as a tissue that performs triglyceride (TG) storage and free fatty acid (FFA) Z-glycerol release in response to changing energy demands (Non-Patent Document 1).
  • Adipose tissue includes FFA (Non-patent Document 3), adipsin (Non-patent Document 4), tumor necrosis factor ⁇ (Non-patent Document 5), lebutin (Non-patent Document 6), plasminogen-activating factor It is also an important endocrine organ that secretes a number of biologically active substances called ⁇ adivokines '' such as child 1 (Non-Patent Document 7) and resistin (Non-Patent Document 8), and regulates various types of energy homeostasis. Go to
  • Adiponectin or Acrp30 is an adipose tissue-derived hormone having multiple biological functions.
  • plasma adiponectin levels decrease (Non-Patent Document 13).
  • Experimental ability using mice has been confirmed that administration of adiponectin lowers blood glucose concentration and improves insulin resistance (Non-patent Documents 14 to 16).
  • adiponectin is deficient in mice, the pathology of insulin resistance and diabetes appears (Non-Patent Documents 17, 18).
  • Non-Patent Documents 21 and 22 The activity of inducing insulin sensitivity by adiponectin is enhanced through PPARa activation (non-specific References 19 and 20) and acutely through AMP kinase (Non-Patent Documents 21 and 22) are expected to be induced by increased fatty acid oxidation. Endothelial cells (Human aortic endothelial cells: HAEC) and macrophages may have anti-atherogenic properties such as anti-inflammatory effects (Non-Patent Documents 23 and 24). When adiponectin is highly expressed in ApoE-deficient mice, the expression of molecules involved in inflammation decreases, and concomitant improvement of atherosclerosis has been shown (Non-Patent Documents 19 and 25).
  • Non-Patent Documents 17, 26 Recently, it has been reported that cDNAs encoding adiponectin receptors (AdipoR) 1 and 2 have been cloned (Non-Patent Document 27, Patent Document 1). AdipoRl is abundantly expressed in skeletal muscle, whereas AdipoR2 is mainly expressed in the liver. Adi poRl and R2 contain seven transmembrane domains (Non-patent document 27), but are predicted to be structurally and functionally distinct from G protein-coupled receptors (Non-patent documents 28-30) Has been done.
  • AdipoRl and R2 act as receptors for globular and full-length adiponectin, AMPK (Non-Patent Documents 21 and 22), PPAR o; ligand activation (Non-Patent Documents 19 and 20), fatty acid oxidation and glucose uptake by Adiponectin (Non-Patent Documents 19 and 20).
  • Non-patent document 27 Non-patent document 27).
  • Patent document 1 WO2004 / 061108
  • Non-Patent Document l Spiegelman, B.M. & Flier, J.S., Cell 87, 377-389 (1996).
  • Non-Patent Document 2 Friedman, J.M., Nature 404, 632-634 (2000).
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  • Non-Patent Document 4 Hotamisligil, G.S.et.al, Science 259, 87-91, (1993).
  • Non-Patent Document 5 Zhang, Y. et al., Nature 372, 425-432, (1994).
  • Non-Patent Document 6 Shulman, G.I., J. Clin.Invest. 106, 171-176 (2000).
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  • Non-Patent Document 8 Steppan, CM.et al., Nature 409, 307-312 (2001).
  • Non-Patent Document 9 Scherer, P.E. et al "J. Biol. Chem. 270, 26746-26749 (1995).
  • Non-Patent Document 10 Hu, E “Liang, P. & Spiegelman, B.M., J. Biol. Chem. 271,
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  • Non-Patent Document 12 Nakano, Y “et al” J. Biochem. (Tokyo) 120, 802-812 (1996).
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  • Non-Patent Document 14 Fruebis, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 2005-2010
  • Non-Patent Document 15 Yamauchi, T. et al., Nat.Med. 7, 941-946 (2001).
  • Non-Patent Document 16 Berg, A.H. et al "Nat. Med. 7, 947-953 (2001).
  • Non-Patent Document 17 Kubota, N. et al., J. Biol. Chem. 277, 25863-25866 (2002).
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  • Non-Patent Document 20 Yamauchi, T. et al., J. Biol. Chem. 278, 2461-2468 (2003).
  • Non-Patent Document 21 Yamauchi, T. et al "Nat. Med. 8, 1288-1295 (2002).
  • Non-Patent Document 22 Tomas, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16309-16313.
  • Non-Patent Document 23 Ouchi, N. et al., Circulation 103, 1057-1063 (2001).
  • Non-Patent Document 24 Yokota, T. et al, Blood 96, 1723-1732 (2000).
  • Non-Patent Document 25 Okamoto, Y. et al., Circulation 106, 2767-2770 (2002).
  • Non-Patent Document 26 Matsuda, M. et al "J. Biol. Chem. 277, 37487-37491 (2002).
  • Non-Patent Document 27 Yamauchi, T. et al., Nature 423, 762-769 (2003).
  • Non-Patent Document 28 Wess, J., FASEB. J. 11, 346-354 (1997).
  • Non-Patent Document 29 Yokomizo, T. et al., Nature 387, 620-624 (1997).
  • Non-Patent Document 30 Scheer, A. et al, EMBO. J. 15, 3566-3578 (1996).
  • the present invention firstly aims to elucidate the mechanism of action of adiponectin production suppression depending on adipocyte hypertrophy, secondly, to elucidate factors that can increase the expression of adiponectin gene, and thirdly, to elucidate adiponectin It is intended to provide an expression inducer and a therapeutic agent for obesity and related diseases using the same, for example, a cardiovascular disease or a metabolic disease. Make it an issue.
  • adiponectin ZAcrp30 is a hormone secreted by fat cells and acts as an antidiabetic and antiatherogenic adivocaine.
  • Adiponectin Z Acrp30 transcription is reduced in obese adipose tissue, and this reduction is involved in the development of insulin resistance in obesity.
  • the present inventors have created a hypertrophic fat cell model for specifying the position of the promoter region of the adiponectin gene in order to elucidate the mechanism responsible for the transcription control of the adiponectin gene.
  • the promoter activity of a region containing from 1367 base pairs (bp) to +35 bp of a promoter provided with a luciferase gene as a reporter gene was examined. High levels of luciferase activity were detected in adipocytes transfected with a plasmid containing only 156 bp of the adiponectin promoter. On the other hand, in hypertrophic adipocytes, expression of only the reporter gene having 217 bp of the upstream regulatory region of the adiponectin gene was suppressed.
  • ESA electrophoretic mobility shift assay
  • a 32 bp fragment from the start of transcription of the adiponectin gene to positions 188 to 157 is expressed in nuclear extracts prepared from both adipocytes and adipose tissue. It has been shown to bind to proteins. Delayed electrophoretic mobility of 32 bp elements in nuclear extracts prepared from these cells or tissues in small adipocytes compared to large adipocytes, or in adipose tissue of lean mice compared to obese mice There are many substances that cause it to be present. Using the yeast one-hybrid screening method, the nuclear factor that binds to the above 32 bp fragment was identified.
  • KLF9 Kruppel-like factor 9
  • This KLF9 binds to the above element, and its binding amount is determined in vitro and in vivo. And the expression level of KLF9.
  • cotransfection experiments indicated that transient overexpression of KLF9 enhanced adiponectin promoter activity in a dose-dependent and specific manner. Suppression of KLF9 expression by siRNA in vitro and overexpression of KLF9 and knockout of KLF9 in vivo resulted in changes in endogenous adiponectin mRNA.
  • KLF9 regulates the transcription of adiponectin.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating a metabolic disease or a heart disease comprising the adiponectin expression inducer according to 1 or 2 as an active ingredient.
  • a cell for screening adiponectin expression inducing substance which contains a reporter gene having at least the following (1) or (2) a potent element.
  • the cell according to 4 or 5 above which is an adipocyte. 7. The cell according to the above 4 or 5, which is a hypertrophic adipocyte.
  • a method for screening an adiponectin expression inducer comprising the following steps (1) to (3).
  • a screening method for an adiponectin expression inducer comprising the following steps (1) to (3).
  • a method for screening a drug for preventing or treating obesity or a disease related thereto comprising the following steps (1) to (3).
  • a method for screening a drug for preventing or treating obesity or a disease related thereto comprising the following steps (1) to (3).
  • FIG. 1 Triglyceride content (TG) (a), glucose intake (b), and mRNA levels of adiponectin and resistin in 3T3L1 cells during the process of fat cell separation and enlargement It is a graph which shows (c).
  • C The mRNA levels of adiponectin and resistin in 3T3L1 adipocytes during the process of adipocyte sorting and hypertrophy were measured by TaqMan realim reverse transcription-PCR analysis. The results were shown as relative values obtained by standardizing the expression level of adiponectin or resistin based on the 36B4 mRNA level. Data represent the average results obtained from three independent series of experiments. Adipocyte hypertrophy reduces adiponectin mRNA levels in 3T3L1 adipocytes, which leads to a decrease in glucose uptake.
  • FIG. 2 is a view showing the results of measuring adiponectin promoter activity in 3T3L1 cells in the process of dividing and expanding fat cells.
  • a adiponectin promoter activity in 3T3 L1 cells in the process of adipocyte shunting and hypertrophy
  • b adiponectin promoter activity after incubation of 3T3L1 cells 10 days after shunting induction with the indicated concentration of TNF a
  • c TNF Q
  • the (1367 / + 35) -luciferase gene (Luc) expression vector of the adiponectin promoter was temporarily introduced into 3T3L1 cells.
  • the cause of decreased adiponectin promoter activity in hypertrophic adipocytes is a signal transduction pathway other than TNFa.
  • FIG. 3 is a view showing an analysis result of an adiponectin promoter region.
  • a Reporter when a reporter gene having an adiponectin promoter 5 'deletion gene was transfected into a 3T3L1 adipocyte 10 or 19 days after induction (day 10 or 19, respectively) by placing it on a vector and temporarily introducing it.
  • 4 is a graph showing the results of examining (luciferase) activity.
  • b A photograph showing the results of EMSA analysis of a nuclear protein extract prepared from 3T3L1 adipocytes (day 10 or day 19) and using the illustrated adiponectin promoter 5 and the deleted sequence as a 32 P-labeled probe. It is.
  • FIG. Panel d The result of inserting a 188 / -157 fragment upstream of the enhancer-free vector pGL2-tK-Luc and introducing this vector into 3T3L1 adipocytes (day 10 and day 19) and assaying luciferase activity.
  • FIG. Panel d results are expressed as ratios of control vector values. The bars in the results represent the mean SE from three separate experiments. The data in panels b, c represent representative results from three independent series of experiments. In hypertrophic adipocytes, the adiponectin promoter is regulated through a proximal 32 bp promoter element.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of analysis of factors binding to the adiponectin promoter region in nuclear extracts of 3T3L1 adipocytes (day 10). Panels ad, f show the EMSA analysis results.
  • a An antibody that specifically recognizes KLF9 or NF- ⁇ 65, a nuclear extract from 3T3L1 adipocytes (day 10) and 293T cells, and a radiolabeled NF- ⁇ B consensus sequence (p65 site) EMSA analysis results when incubated in the presence or absence
  • b (right panel) Nuclear extract of 3T3L1 adipocytes (2 lanes on the left: day 10, 2 lanes on the right: day 19) and the adiponectin promoter region ( -188Z-157) Labeled 32 bp oligonucleotide probe was incubated in the presence or absence of anti-KLF3 antibody.
  • FIG. 5 is a photograph and a diagram showing the results of analyzing the expression levels of KLF3 and KLF9 in adipocytes.
  • a, b KLF3 mRNA (a, upper) or KLF9 mRNA (a) present in WAT (ac) from 3T3L1 adipocytes, lean control C57BL6 or obesity model obZob mice after the indicated days have passed
  • FIG. 3 shows photographs in which the expression level of (middle) was analyzed by Northern analysis, graphs in which the band intensities were numerically plotted, and photographs showing the results of analyzing the expression level of mKLF9 protein (b) by Western analysis.
  • the arrow in panel b indicates KLF9.
  • FIG. 6 is a diagram and a photograph showing the results of analyzing the effect of KLF9 overexpression on adiponectin expression.
  • a A vector (KLF9 / pcDNA3.1) that expresses KLF in 3T3L1 adipocytes (day 19) and a vector that has a reporter (luciferase) gene downstream of the adiponectin promoter ((1367Z + 35) (“ 1367bp-Luc ”), and analyzed the effect of high expression of KLF9. The results are shown as specific activity when“ Mock ”(pcDNA3.1 only) was set to 1.
  • PDGF is a KLF recognition sequence B: Positive control that induces expression of the KLF family with KLF9 / pcDNA3.1 transfected into 3T3L1 adipocytes (day 19) by the lipofection method. The result of measuring the expression level of KLF9 mRNA by Taq-manPCR.
  • 1/3000 and 1Z1000 indicate the dilution rate when the vector was introduced by the lipofection method, and “0” indicates the case without the introduction c: PDGF-tk-Luc or 32bp-tk-luc as the reporter MKLF5 / pcDNA on retained 3T3L1 adipocytes (day 19)
  • the rate of increase in the expression of the reporter gene when 3.1 or mKLF9 / pcDNA3.1 was introduced is shown as the activity ratio without transfection d: 3T3Ll adipocytes (day 19) using retroviral vector V
  • the vertical axis “mKLF9 / 36B4” indicates the KLF9 mRNA expression rate corrected by the 36B4 mRNA expression level.
  • 3T3L1 adipocyte The results obtained by measuring the adiponectin expression level when the KLF9 gene was stably introduced using a retroviral vector on day 19)
  • e K The LF9 prepare nuclear protein extracts from 3T3L1
  • FIG. 7 is a diagram and a photograph showing the results of analyzing the effect of KLF9 knockdown by siRNA on adiponectin expression.
  • a The amounts of KLF3, KLF9 and adiponectin mRNA after 72 hours and 96 hours after introduction of siRNA against KLF9 into 3T3L1 adipocytes (day 10). The results are shown as relative ratios when the activity was 100% when siRNA was introduced.
  • FIG. 8 A nuclear protein extract was prepared from the WAT of a KLF9 knockout mouse or a control wild-type littermate, and a 32 P-labeled iridescent probe was prepared by using the KLF9 consensus sequence (BTE) or the adiponectin promoter (-188 / -157) sequence. It is a photograph showing the result of performing EMSA analysis by using as an example. Knockout of KLF9 eliminated the KLF9 protein and also eliminated the 32 bp binding protein.
  • [9] is a diagram showing the mechanism by which adipocyte hypertrophy regulates KLF9 expression in adipocytes.
  • TR o thyroid hormone receptor a
  • b TR a mRNA expression level in lean mouse C57BL and obese mouse ob / ob.
  • c The expression level of KLF9 mRNA when treated with the indicated concentration of T3 is shown as a ratio to the expression level of 36B4 mRNA.
  • NAC N-acetyl cysteine
  • FIG. 10 is a view showing that oxidative stress increases with the enlargement of fat cells.
  • FIG. 11 is a view showing that the antioxidant activity decreases with the enlargement of fat cells.
  • the bar is
  • the present invention first provides an adiponectin expression inducer.
  • the present inventors have found that KLF9 induces adiponectin expression. That is, the adiponectin expression inducer of the present invention comprises a KLF9 protein or a DNA capable of expressing KLF9 as a component.
  • KLF9 is a type of protein belonging to a superfamily called a kurtzpel-like zinc finger protein.
  • An example of a specific amino acid sequence of KLF9 is shown in SEQ ID NO: 2.
  • KLF9 of the present invention is not limited to this. Proteins include heterologous homologs and variants having similar functions having the same function, and variants having the same function by artificially modifying the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 appropriately. Can also be obtained. Therefore, a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having an activity of inducing an adiponectin gene is also encompassed in KLF9 of the present invention. .
  • KLF9 can be obtained from cells and tissues of humans and mice. For example, even small adipocytes have high expression of KLF9, and thus can be isolated from unadulterated adipocytes and tissues as a material. Alternatively, it can also be conveniently obtained by connecting the DNA described in SEQ ID NO: 1 to an expression vector and expressing it in a cell system or a cell-free system.
  • substitution of amino acids can be mentioned. It is considered that substitution between amino acids having similar properties is likely to maintain protein activity.
  • Groups of amino acids corresponding to conservative substitutions include, for example, basic amino acids (eg, lysine, arginine, histidine), acidic amino acids (eg, aspartic acid, glutamic acid), and uncharged polar amino acids (eg, glycine, asparagine, glutamine, serine).
  • non-polar amino acids eg, alanine, palin, leucine, isoleucine, proline
  • non-polar amino acids eg, alanine, palin, leucine, isoleucine, proline
  • examples include phenylalanine, methionine, tryptophan
  • e-branched amino acids eg, threonine, valine, isoleucine
  • aromatic amino acids eg, tyrosine, furalanine, triptophan, histidine.
  • non-conservative substitutions of amino acid sequences are sometimes effective.
  • non-conservative substitutions can be made to improve the activity of inducing adiponectin expression in the KLF9 protein, and such improved KLF9 proteins are also included in the present invention.
  • a DNA similar to the DNA described in SEQ ID NO: 2 is cloned by hybridization to obtain the obtained DNA protein.
  • Methods can be mentioned. Specifically, DNA encoding KLF9 shown in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof is used as a probe, and DNA hybridizing with the DNA is isolated. If hybridization is performed under stringent conditions, highly homologous DNA is selected as the base sequence, and the resulting isolated protein may have a protein functionally equivalent to KLF9. Is high.
  • a highly homologous base sequence can show, for example, 70% or more, preferably 90% or more identity.
  • the stringent conditions include, for example, conditions such as 6 ⁇ SSC, 40% formamide, hybridization at 25 ° C., and IX SSC, washing at 55 ° C.
  • Stringency depends on conditions such as salt concentration, formamide concentration, or temperature. It is obvious that those skilled in the art can set these conditions so as to obtain a necessary stringency.
  • KLF9 derived from a mouse as shown in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 an animal species other than a mouse, that is, human, rat, porcupine, pig
  • an animal species other than a mouse that is, human, rat, porcupine, pig
  • the homolog of KLF9 encoded by a polynucleotide that can also provide the strength of an animal species such as a goat will constitute a functionally equivalent protein.
  • a method for obtaining a protein functionally equivalent to KLF9 includes the method of SEQ ID NO:
  • Examples include a method in which the DNA described in 1 is modified, and a protein is synthesized based on the modified DNA.
  • the protein encoded by a protein obtained by artificially modifying mouse KLF9 (SEQ ID NO: 2) or a polynucleotide isolated using the above-described techniques such as hybridization and hybridization is usually used.
  • High homology refers to sequence identity of at least 30% or more, preferably 50% or more, more preferably 80% or more (eg, 95% or more).
  • the identity of the nucleotide sequence or amino acid sequence can be determined using a homology search site using the Internet.
  • DDBJ Japan DNA Data Bank
  • Homology search is available
  • NCBI National Enter for Biotechnology Information
  • KLF9 a protein functionally equivalent to KLF9 actually has the same function as KLF9 described in SEQ ID NO: 2, that is, whether it has adiponectin expression-inducing activity, was confirmed using luciferase analysis and the like described in Examples of the present application. I can do it.
  • Another component of the adiponectin expression inducer of the present invention is a DNA encoding KLF9 or a vector carrying the DNA.
  • An example of the DNA encoding KLF9 is a DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • DNA also has homologs and variants having similar nucleotide sequences having the same function as proteins, and also has the same function by artificially modifying the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Such a DNA having a sequence similar to SEQ ID NO: 1 can be defined as, for example, a DNA that hybridizes with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions.
  • the "DNA that hybridizes under stringent conditions” is, as described above, a DNA that uses the DNA encoding KLF9 shown in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof as a probe and can hybridize thereto.
  • the stringent conditions are, as an example, as described above, for example, 6 ⁇ SSC, 40% formamide, hybridization at 25 ° C., and washing at 1 ⁇ SSC, 55 ° C. And! /, I.e. conditions are not limited to this!
  • the DNA encoding KLF9 may be used in the form of a fragment, or may be used by connecting it to a vector.
  • the vector can be appropriately selected depending on the purpose.
  • vectors that can function in mammalian cells such as humans such as retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, and lentiviruses Virus vectors, pcDNAI, pcDNAI / Amp (Invitrogen) and the like.
  • the modes of use of the adiponectin expression inducer of the present invention include (1) induction of endogenous or exogenous adiponectin gene expression in experimental animals, and (2) expression of endogenous or exogenous adiponectin gene present in cultured cells. And (3) induction of adiponectin gene expression in a cell-free system.
  • an adiponectin expression inducer containing, as a component, DNA encoding KLF9 held in a vector.
  • Gene transfer into cells, tissues, and the like can be performed using viral vector administration or existing transfer techniques (e.g., electroporation, lipofection, calcium phosphate precipitation).
  • a vector containing DNA or a KLF9 protein may have a shift as a component.
  • adiponectin expression inducer of the present invention is an effective agent for functional analysis of adiponectin because it can induce adiponectin expression in experimental animals, cultured cells, and cell-free systems.
  • Adiponectin is also an important factor involved in obesity or related diseases, for example, metabolic diseases such as diabetes and cardiovascular diseases such as arteriosclerosis. Therefore, this drug greatly contributes to the study of such diseases.
  • the present invention secondly relates to a pharmaceutical composition for preventing and treating obesity or diseases related thereto, comprising the above-mentioned adiponectin expression inducer as an active ingredient.
  • adiponectin is an important factor involved in obesity or related diseases such as type 2 diabetes, metabolic diseases such as insulin resistance and cardiovascular diseases such as arteriosclerosis. Many of these diseases have hypoadiponectinemia. Therefore, by combining the above-mentioned adiponectin expression inducer as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier as appropriate, it can be applied as a pharmaceutical composition for treating obesity or a disease related thereto. can do.
  • the disease targeted by the pharmaceutical composition of the present invention is obesity or a disease related thereto, for example, a metabolic disease, a heart disease and the like.
  • a metabolic disease for example, a metabolic disease, a heart disease and the like.
  • metabolic diseases such as insulin resistance, diabetes and hyperlipidemia
  • cardiovascular diseases such as arteriosclerosis, hypertension, and fatty liver.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is particularly effective when it is accompanied by hypoadiponectinemia or when there is a possibility of causing hypoadiponectinemia.
  • hypoadiponectinemia By improving the cause of these diseases or hypoadiponectinemia caused by these diseases by the adiponectin expression inducer contained in the present pharmaceutical composition, prevention, treatment, alleviation of the disease, etc. of the above diseases can be achieved. it can.
  • the adiponectin expression inducer is as described above.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” means excipients, diluents, extenders, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers or other additives and the like. By using one or more of such carriers, oral or parenteral formulations can be prepared.
  • the dose of the pharmaceutical composition according to the present invention can be appropriately adjusted depending on the target disease or disease state. Generally, it is usually 1 ⁇ g to 20 g per lkg of body weight, more usually 10 g to 500 mg. can do. In the case of injections, the dose can be about 1/10 to 1/100 of the oral dose.
  • the present invention thirdly provides a cell for screening for an adiponectin expression inducer.
  • the present inventors have identified an element to which KLF9 binds within the regulatory region of the adiponectin gene. The binding of KLF9 to this element promotes adiponectin expression. Therefore, by searching for a substance having the same activity as KLF9, it becomes possible to screen for an adiponectin expression-inducing factor in place of KLF9.
  • This factor may be a protein such as KLF9, but is preferably a low molecular weight compound. If it is a low molecular compound, there is a high possibility that it can be used as it is as a lead compound for drug discovery.
  • the first embodiment of the cell of the present invention is a cell holding a reporter gene provided at least upstream with an element to which KLF9 can bind (hereinafter referred to as "KLF9 binding element"). That is, the KLF9 binding element, which is an enhancer element (cis factor) that promotes expression of the adiponectin gene by KLF9, is contained in the cell of the first embodiment. It is provided upstream of one gene.
  • KLF9 binding element which is an enhancer element (cis factor) that promotes expression of the adiponectin gene by KLF9
  • the KLF9 binding element preferably includes, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 corresponding to the region from -188 to -157 upstream of the adiponectin gene.
  • the full length (SEQ ID NO: 3) of the control region of the adiponectin gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 is part thereof (for example, SEQ ID NO: 5). 4) may be provided upstream of the reporter gene.
  • the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 5 can also be modified as long as it is a sequence to which KLF9 binds and retains an activity capable of inducing adiponectin gene expression by KLF9.
  • a variant of the base sequence described in SEQ ID NO: 5 can be a base sequence having a deletion, addition, substitution, or insertion of one or more bases in the base sequence described in SEQ ID NO: 5.
  • the modification of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 5 can be performed using a point mutation introduction technique.
  • a reporter gene is used herein as a concept that is broader than a generally used term that is not particularly limited as long as its expression can be confirmed.
  • a reporter gene in this document is a gene whose expression can be detected using luminescence as an index (eg, luciferase gene, GFP gene, YFP gene, etc.), or a gene whose expression can be detected using enzyme activity as an index (
  • general reporter genes such as lio8-galactosidase gene
  • genes whose expression can be detected using drug sensitivity as an index neomycin resistance gene, hygromycin resistance gene, etc.
  • the adiponectin gene itself is also reported. It can be included in the concept of a porter gene.
  • reporter gene is understood in a broad sense unless otherwise specified.
  • an adiponectin gene having a unique control region (eg, SEQ ID NO: 3, etc.), for example, SEQ ID NO: 6, can be used.
  • the adiponectin gene in this configuration may be replaced by another common reporter gene as described above.
  • other control regions may be deleted so that only the KLF9 binding element (for example, SEQ ID NO: 5) remains in the control regions.
  • the upstream sequence of the reporter gene is linked to the regulatory region of the adiponectin gene.
  • it may be constructed by inserting a KLF9 binding element upstream of a general reporter gene.
  • the adiponectin gene may be a gene that is endogenous to a cell or a gene that is introduced from a foreign source.
  • a second embodiment of the cell of the present invention is a cell further comprising a DNA encoding KLF9 in the first embodiment.
  • the cell of the second embodiment, in which the KLF9 gene is further retained in the first embodiment, is useful for screening for a substance capable of inducing the expression of the adiponectin gene through the induction of the expression of the KLF9 gene.
  • the present inventors have found that the expression of the KLF9 gene, particularly the expression of the transcription level, decreases in correlation with the decrease in the expression of adiponectin during the process of adipocyte hypertrophy.
  • the cell of the second embodiment is useful for the search for a substance that inhibits a substance that suppresses the expression of the KLF9 gene in large or hypertrophic adipocytes, in addition to the usefulness of the cell of the first embodiment. Become.
  • the "DNA encoding KLF9" is the same as the DNA encoding KLF9 described in the description of the adiponectin expression inducer, and the scope of this term is also the same.
  • a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 can be mentioned.
  • the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 can be used as long as it retains the activity capable of inducing the expression of adiponectin. Includes DNA that hybridizes under stringent conditions with the nucleotide sequence.
  • the DNA encoding KLF9 may be endogenous to the cell or may be a cell introduced from a foreign source. These KLF9-encoding DNAs are preferably provided with the upstream control region of the KLF9 gene.
  • the cell type in the first and second embodiments is not particularly limited, but is preferably, for example, derived from a mammalian cell, and is a cell type that normally expresses adiponectin in vivo. There are more preferred,.
  • Cells expressing adiponectin in the living body are, for example, adipocytes.
  • adipocytes When fat cells are used, small fat cells and enlarged fat cells can be appropriately selected and used.
  • differentiation can be induced using adipocytes (eg, 3T3L1 adipocytes) as a starting material with reference to the examples.
  • Adipocyte differentiation can be induced by culturing the cells in a differentiation induction medium.
  • a "reporter gene having a KLF9 binding element upstream in the cells of the first and second embodiments” and a “gene encoding KLF9" in the cells of the second embodiment are introduced into cells from a foreign source.
  • the DNA can be carried on a vector or the like and introduced into cells.
  • the vector in this case can be appropriately selected and used.
  • the present invention relates to a method for screening a substance capable of inducing the expression of adiponectin.
  • the screening method of the first aspect is a method using the cells of the first aspect. Specifically, the following steps (1) to (3) are included.
  • the screening method of the second embodiment is a method using the cells of the second embodiment, and specifically includes the following steps (1) to (3).
  • V and the mode of deviation are common in that a substance capable of inducing the expression of the target adiponectin gene can be searched for, but have characteristics according to the function of the cell used.
  • a substance capable of inducing the expression of the target adiponectin gene can be searched for, but have characteristics according to the function of the cell used.
  • using a cell carrying a reporter gene having a KLF9 binding element! Therefore, it becomes possible to screen for a substance that acts on the KLF9 binding element in place of KLF9 and can induce the expression of adiponectin.
  • a substance that inhibits the suppression of KLF9 expression in hypertrophic fat cells can be screened.
  • the test substance in the first and second embodiments is a protein, a nucleic acid, a low molecular compound. And the like, but there is no particular limitation. They do not matter whether natural or synthetic. Nucleic acids can include nucleic acid (DNA, RNA) decoys that mimic all or part of the KLF9 protein. The nucleic acid may include not only naturally occurring bases but also those synthesized with artificial bases which do not exist in nature. Small molecule compounds may include compound libraries synthesized by combinatorial chemistry.
  • test substance is added to a culture medium for culturing the cells.
  • test substance is a nucleic acid
  • a conventional gene transfer technique for example, a method in which the test substance is covered with a lipid molecule such as ribosome or a salt such as calcium phosphate and introduced by utilizing the phagocytosis of cells, or by electrical stimulation, etc.
  • Methods for introducing cells, microinjection, gene gun and the like can be used.
  • the expression of the reporter gene may be detected at any of a transcription level and a translation level.
  • a transcription level Northern blotting, RT-PCR, real-time PCR, and the like can be used. Those skilled in the art can prepare primers and probes used in these techniques by appropriately designing the basic strength of the reporter gene.
  • a method depending on the properties of the reporter gene product can be used in addition to a detection method using a specific antibody such as Western blotting, immunoprecipitation, ELISA, and RIA.
  • fluorescence such as luciferase or GFP
  • the fluorescence can be detected, and in the case of an enzyme such as j8-galactosidase, detection can be performed based on the reaction with the substrate.
  • an enzyme such as j8-galactosidase
  • detection can be performed based on the reaction with the substrate.
  • expression can be detected by culturing and growing in a drug-containing medium as an index.
  • the expression level of the reporter gene in the presence and absence of the test substance is measured, and the test In the presence of the substance, a test substance that has a high expression of the reporter gene and produces a result is selected.
  • the test substance selected here is an important candidate as a substance that can promote the expression of the adiponectin gene.
  • the screening method of the present invention not only can screen adiponectin expression-inducing substances, but also can be used to search for a candidate substance for a drug for preventing or treating obesity or diseases related thereto. It can be applied to The diseases associated with obesity include, as repeatedly described above, for example, diabetes, metabolic diseases such as insulin resistance, and heart diseases such as arteriosclerosis.
  • hypoadiponectinemia is often present. Hypoadiponectinemia If a factor that determines the onset of these diseases or a factor that promotes the progress of the disease, etc., the substance obtained by the above screening method can improve hypoadiponectinemia in patients. It is expected to be able to induce the prevention, treatment and alleviation of obesity or related diseases.
  • test substance based on the KLF9 binding element and the interaction activity as shown in SEQ ID NO: 5.
  • the interaction activity can be measured using, for example, the immunoprecipitation assay described in the Examples or EMSA.
  • IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine
  • DEX dexamethasone
  • NAC Niko SP600125 was purchased from Sigma. All other materials were purchased from the sources indicated in the references (27, 35 and 36).
  • DNA sequencing was performed with the PRISM dye terminator cycle sequencing kit and ABIPRISM310 Genetic Analyzer ⁇ (Applied Biosystems i).
  • mice Animal and blood samples KLF9-deficient mice have already been reported (Morita, M. et al., Mol. Cell. Biol. 23, 2489-2500 (2003).). 15 week old obZob mice and their wild-type C57BLZ6 mice were obtained from Charles River Breeding Laboratories (Wilmington, MA). Mice were housed in colony cages and maintained under a light source for 12 hours in a Z-dark 12 hour cycle. Plasma glucose levels were determined using the glucose B test (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan). Plasma adiponectin levels were determined with the mouse Adiponectin 'Radioimnoassay (RIA) kit (LINCO Research Inc.).
  • RIA mouse Adiponectin 'Radioimnoassay
  • the cDNA library used was provided by A. Saltiel. This library was constructed by inserting the fully differentiated 3T3-L1 adipocyte harvested cDNA into the pGAD-GH GAL4 vector (Ribon, V. et al., Mol. Cell. Biol. 18, 872-879 (1998).). The library contained 10,000,000 transformants, all with cDNA inserts of 1.5-3 kb in size!
  • the embryo cDNA library was fully prepared to transform (32 bp) x3 :: HIS3 reporter yeast strain. Converted. Five million yeast transformants were cultured on 15 mM 3-aminotriazole (SD-, His-, Leu +). After growing for 4-8 days at 30 ° C, 22 putative yeast clones were selected and further analyzed. Two cDNAs encoded the same KLF9.
  • Luciferase atsey was performed using cells cultured in 12-well plates according to previously reported methods (Yamauchi, T. et al., Nature 423, 762-769 (2003)., Shindo, T. et. al., Nat. Med. 8, 856-863 (2002).) 0
  • the luciferase reporter plasmid (0.25 ⁇ ) ⁇ 8 ⁇ - ⁇ (0.1-0.4 g) were introduced simultaneously.
  • the total amount of DNA in each transfection was adjusted to 1.5 gZ / well with control vector DNA.
  • the amount of luciferase activity of the transformants was measured using a standard kit (Promega). The measured values were normalized based on the activity of j8-galactosidase.
  • 293T cells or 3T3L1 adipocytes or white adipose tissue power were also prepared from nucleic acid extracts according to reported methods (Almoguera, C. et al., J. Biol. Chem. 277,
  • the double-stranded oligonucleotide used for the 0 gel mobility shift assay was prepared by annealing both strands.
  • the labeled probe (3,000-10,0 OOcpm) and the nucleic acid extract were reacted with the reaction solution (20 / ⁇ 1: 10 ⁇ Tris HCl (pH 7.6), 50 mM KCl, 0.05 mM EDTA, 2.5 mM MgCl, 8.5% glycerin). , ImM Dietitol, 0.
  • Adiponectin promoter has 1367 bp (1367 pts + 35; SEQ ID NO: 4), 527 bp (527 pts + 35), 217 bp (—217 pts + 35) and 127 bp (—127 pts + 35) Luciferase gene constructs ("pAdiponectinl367-Luc”, "pAdiponectin527-Luc”, “pAdiponectin217-Luc” and "pAdiponectinl27-Luc", respectively) were subcloned in pGL2 basic or pGL2 promoter vector (Promega).
  • a KLF3 or KLF9 expression vector was constructed by binding to the EcoRl / Not site of pCDNA3.1. DNA transfection to 293T or 3T3L1 adipocytes was performed by the lipofection method using “Lipofectamine PLUS” (Gibco BRL).
  • 3T3L1 cells were cultured in DMEM with 10% fetal calf serum and adipogenesis was performed according to previously reported methods (Yamauchi, T. et al., Nat. Genet. 30, 221-226 (2002).). Differentiation induction into sexual cells was performed. Briefly, 3T3L1 cells were first cultured and grown to confluence. Two days later, the medium was replaced with standard differentiation induction medium (containing 0.5 mM IBMX, 1 ⁇ MDEX, 5 ⁇ g / ml insulin, 10% FBS, 50 units Zml penicillin and 50 ⁇ g / ml streptomycin). The medium was changed every two days. Glucose intake was determined by known methods (Yamauchi, T.
  • siRNAs Complementary single-stranded RNAs were synthesized in a manner similar to each other, and annealed with each other to prepare siRNAs.
  • SiRNA was introduced into 3T3L1 adipocytes densely reaching about 60 to 70% using Lipofectamine PLUS (Life Technology) (Yamauchi, T. et al., Nature 423, 762-769 (2003).) O These KLF9 and KLF3
  • the siRNA sequences used were those which have been previously confirmed to be capable of suppressing the expression of KLF9 and KLF3 by their introduction. After 72 and 96 hours of siRNA transfection, the cells were lysed and the expression products were analyzed.
  • RNA from cells or tissues was prepared using TRIzol (Gibco / BRL) according to the manufacturer's instructions.
  • TRIzol Gibco / BRL
  • mRNA was quantified by a real-time PCR method (Yamauchi, T. et al., Nature 423, 762-769 (2003).). Primer sets and probes were set up using software "Primer Express 1.5a” and purchased from ABI (ABI Prism; Perkin-Elmer Applied Biosytems, Foster City, California). The relative amounts were normalized by the amount of the actin transcript in the same cDNA (Yamauchi, T. et al., Nature 423, 762-769 (2003)).
  • Nuclear extracts were prepared according to known methods (Almoguera, C. et al., J. Biol. Chem. 277, 43866-43872 (2002).).
  • a sample of nuclear protein (30 ⁇ g) was obtained from KLF9 (Zhang, D. et al, Endocrinology 143, 62-73 (2002).) Or KLF3 (Crossley, M. et al, Mol. Cell Biol. 16, 1695- 1705 (1996).), followeded by horseradish peroxidase-conjugated mouse or mouse heron IgG and ECL kit (
  • 3T3L1 adipocytes were fixed in 1% formaldehyde.
  • the immobilized chromosome sample was analyzed by a known immunoprecipitation method (Shindo, T. et al., Nat. Med. 8, 856-863 (2002)) with some modifications. Protein A (Upstate) was used to collect sediment.
  • Cayman Chemical Antioxidant Assay was used to measure the total antioxidant capacity of plasma, serum, urine, stool or cell lysates. Water-soluble and fat-soluble antioxidants cannot be separated by this protocol. Therefore, the antioxidant activity of all combinations of components including vitamins, proteins, lipids, daltathione, uric acid, etc. is analyzed. The analysis shows that the antioxidant catmyoglobin in the sample inhibits ABT3 ⁇ 4 (2,2'-Azino-di- [3-ethylbenzthiazoline sulphonatej) -Riki + from ABTS R '+ Is based on measuring The amount of sample induces absorption inhibition at 750 nm according to its concentration. The antioxidant activity in the sample that can inhibit ABTS acidification is quantitatively determined by standardizing with the millimolar concentration of Trolox, compared to the antioxidant activity of water-soluble tocopherol analog Trolox.
  • Example 1 Adiponectin mRNA level is decreased in enlarged 3T3L1 adipocytes
  • Adiponectin mRNA levels are reduced in obesity, which has been reported to play a causal role in the development of obesity-related insulin resistance. It is an object of the present invention to isolate a transcription factor that is responsible for a decrease in adiponectin expression in obesity.
  • V ⁇ in vitro hypertrophic adipocyte model V ⁇ to analyze the effects of adipocyte hypertrophy on adiponectin gene expression.
  • 3T3L1 adipocytes after 19 days of induction of adipocyte differentiation (day 19) have increased triglyceride content (Figure la) and show insulin resistance, such as a decrease in glucose uptake in response to insulin.
  • TNFa which has been shown to reduce adiponectin expression, is increased in hypertrophic adipocytes. Therefore, TNF o; prediction of the causative agent for Do low expression of adiponectin in hypertrophic adipocytes is reasonable (.. Barth, N. et al , Diabetologia 45, 1425-1433 (2002)) 0
  • Example 3 Hypertrophic Adipocyte Regulates Adiponectin Promoter Through Proximal 32 bp Promoter Element to Promote the Adiponectin Gene Unresponsiveness in Hypertrophic Adipocyte Functional 5 'daily analysis was performed to identify regions. Previous studies have shown that deletions from the 1367 to 217 regions have substantially no effect on adiponectin promoter activity in 3T3L1 adipocytes at day 19 ( Figure 3a). In contrast, further ablation of 90 nucleotides in 3T3L1 adipocytes on day 19 restored adiponectin promoter activity. This suggested that -217Z-127 contains essential regulatory elements.
  • the major complex bound to the 32 bp element was more obese than obese C57B6 and day 10 3T3L1 adipocytes, obZob and 19 obese mice. On day 3T3L1 adipocytes were less vigorous (FIG. 3c).
  • the yeast one-hybrid closing approach was used to isolate the transduction factor by down-regulating the adiponectin gene promoter in hypertrophic adipocytes (Almoguera, C. et al, J. Biol. Chem. . 277, 43866-43872 (2002).) was used as the 0 3 2 bp bytes. This sequence was trimerized and incorporated upstream of the HIS3 reporter gene, and introduced into yeast cells (32 bp) x3 :: HIS3 reporter yeast strain. 22 positive colonies were obtained. These clones included different groups. Based on the nucleotide and deduced amino acid sequences, they were divided into two groups.
  • KLF Kurtzpel-like transcription factor
  • EMSA hypershift experiments were performed using specific antibodies that recognize KLF3, KLF9 or NF- ⁇ Bp65.
  • complex I was identified to contain the KLF9 protein in 3T3L1 adipocytes (day 10) (Fig. 4a right, lanes 1 and 2).
  • NF- ⁇ Bp65 FIG. 4a, right, lanes 1 and 3 were not detected in vitro in small adipocytes.
  • the specificity of the KLF9 antibody was confirmed by using a nuclear extract of 293T cells together with a labeled KLF9 consensus site as a probe (FIG. 4c).
  • the function of the KLF3 antibody (left in Fig. 4b) or the function of the NF- ⁇ ( ⁇ 65 antibody (left in Fig. 4a) is as follows. Confirmed by Supershift Atsee used with the ⁇ B consensus site (p65 site). Importantly, the KLF9 antibody reduced the amount of 32bp binding protein (Figure 4d), suggesting that KLF9 is also included in the 32bp binding protein (complex) in vivo.
  • KLF9 actually binds to the endogenous adiponectin promoter region containing the 32 bp site.
  • Fig. 4e shows that purified KLF9 also showed almost the same inhibition of adipocytes or adipose tissue as the inhibition of the 32 bp fragment by the prepared nuclear extract.
  • KLF3 and 9 were more potent in lean control C57BL6 mice than in obese obZob mice. This result was expected to correlate with the amount of the 32 bp binding protein, strongly suggesting that the expression level of KLF9 could regulate the promoter activity of adiponectin and the expression level of adiponectin.
  • Example 7 KLF9 Expression Increased Enhancer and Adiponectin Promoter Activity, Amount of 32 bp Binding Protein, and Adiponectin Expression
  • KLF9 was transiently overexpressed in 3T3L1 adipocytes (day 19) (FIGS. 6a-c) or 3T3L1 adipocytes (day 19) using retrovirus (FIGS. 6d-f), The activity, adiponectin promoter activity, 32 bp binding protein amount, and adiponectin expression level were analyzed (FIG. 6).
  • Overexpression of KLF9 in 3T3L1 adipocytes (day 19) resulted in adiponectin promoter activity (-1367Z + 35) (Fig. 6a), 32bp (-188Z-157) hennoen activity (Fig. 6c right panel).
  • the amount of 32 bp binding protein (FIG. 6e) was increased. It was demonstrated that KLF9 could increase adiponectin promoter activity (FIG. 6a) and that the 32 bp element had high reactivity with KLF9 (FIGS. 6c, e).
  • adipocyte hypertrophy regulates KLF9 expression in adipocytes.
  • KLF9 expression has been reported to be induced by thyroid hormone, which is known to be involved in energy expenditure (Morita, M. et al., Mol. Cell. Biol. 23, 2489-2500 (2003)). .). Therefore, the expression of thyroid hormone receptor ⁇ was first examined in vitro and in vivo.
  • upstream mechanisms that increase KLF9 expression indicate that at least in part, two pathways, one is the thyroid hormone receptor (TR) ⁇ signaling pathway and the other is the expression of TR o; It was suggested that a force that was independent of the stress (depending on the oxidation stress) could also be.
  • TR thyroid hormone receptor
  • the molecular identification of KLF9 is based on the understanding of the molecular mechanism of downregulation of adiponectin ZAcrp30 in obesity and obesity-related diseases such as diabetic atherosclerosis, and the novel molecular targeting of KLF9. It should facilitate the design of new anti-diabetic and anti-atherosclerotic drugs.

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Abstract

　本発明は、アディポネクチン発現誘導剤およびこれを用いた肥満症およびこれに関連する疾患、例えば、心血管疾患または代謝性疾患の治療薬を提供し、および、アディポネクチン発現誘導剤の探索方法を提供する 　アディポネクチン発現の開始点から－１８８位から－１５７位までの３２bpフラグメントに結合し得るＫＬＦ９がアディポネクチンプロモータ活性を増強させることが示された。従って、本発明は、KLF9を用いてアディポネクチン発現誘導剤として利用し、KLF９の補足療法が肥満症またはこれに関連する疾患、例えば、インスリン抵抗性及び２型糖尿病などの代謝性疾患や心血管疾患の予防・治療に役立つことが示唆される。

Description

アディポネクチン発現誘導剤およびその利用
技術分野
[0001] 本発明はアディポネクチン発現誘導剤に関して、特に KLF9を介してアディポネクチ ンの発現を誘導し得る薬剤およびこれを応用した代謝性疾患または心疾患の予防' 治療用医薬品に関する。さら〖こは、本発明はアディポネクチンの発現を誘導し得る物 質およびこれを応用した代謝性疾患または心疾患の予防'治療用薬剤のスクリー- ング方法およびこれに用いる細胞に関する。
背景技術
[0002] 肥満症は、脂肪組織の量の増加として定義され、糖尿病、高脂質血症及び冠動脈 心疾患のような心血管性及び代謝性障害を発症する危険性が高い (非特許文献 1、 2)。しかし、肥満症とこれら疾患との関連性を説明し得る分子機構は解明されていな い。脂肪組織自体は、変化するエネルギー要求に応じて、トリグリセリド (TG)貯蔵及 び遊離脂肪酸 (FFA) Zグリセロール放出を行う組織として機能する (非特許文献 1) 。また脂肪組織は、 FFA (非特許文献 3)、アジプシン (非特許文献 4)、腫瘍壊死因 子 α (非特許文献 5)、レブチン (非特許文献 6)、プラスミノーゲン活性ィ匕因子阻害因 子 1 (非特許文献 7)及びレジスチン (非特許文献 8)などの「アディボカイン」と呼ばれ る数多くの生物学的活性物質を分泌する重要な内分泌器官でもあり、様々な種類の エネルギー恒常性調節を行って 、る。
[0003] アディポネクチン又は Acrp30 (非特許文献 9 12)は、複数の生物学的機能を有 する脂肪組織由来のホルモンである。肥満症、インスリン抵抗性及び 2型糖尿病では 、血漿アディポネクチンレベルが低下する（非特許文献 13)。アディポネクチンの投 与は、血中グルコース濃度を低下させ、インスリン抵抗性が改善されることをマウスを 用いた実験力も確認されて 、る（非特許文献 14— 16)。逆にマウスでアディポネクチ ンを欠損させると、インスリン抵抗性及び糖尿病の病態が表れることも報告されている (非特許文献 17、 18)。
[0004] アディポネクチンによるインスリン感受性誘導活性は、 PPAR a活性化を通じ (非特 許文献 19、 20)、また急性的には AMPキナーゼを通じて (非特許文献 21、 22)、脂 肪酸酸化の増大により誘導されると予想されている。内皮細胞 (Human aortic endothelial cells: HAEC)及びマクロファージでは、抗炎症効果のような抗ァテロ一 ム特性を有する可能性がある（非特許文献 23、 24)。アポ E欠損マウスにおいてアデ ィポネクチンを高発現させると、炎症に関与する分子の発現が低下し、これに付随し てァテローム性動脈硬化症の改善が示された (非特許文献 19、 25)。アディポネクチ ン欠損マウスでは、新たな脈管内膜の形成増大が見られた (非特許文献 17、 26)。 最近、アディポネクチンレセプター（AdipoR) 1、 2をコードしている cDNAがクロー ユングされたことが報告されている（非特許文献 27、特許文献 1)。 AdipoRlは、骨 格筋で豊富に発現されるのに対して、 AdipoR2は、主として肝臓で発現される。 Adi poRl及び R2は、 7個所の貫膜通ドメインを含むが（非特許文献 27)、 Gタンパク質結 合レセプターとは構造的にも機能的にも区別できる (非特許文献 28— 30)と予測さ れている。 AdipoRl及び R2は、球状（globular)及び全長アディポネクチンに対する レセプターとして働き、 AMPK (非特許文献 21、 22)、 PPAR o;リガンド活性化 (非特 許文献 19、 20)及びアディポネクチンによる脂肪酸酸化やグルコース摂取 (非特許 文献 27)の増大を誘導する。
特許文献 1： WO2004/061108
非特許文献 l : Spiegelman, B.M. & Flier, J.S., Cell 87, 377-389 (1996).
非特許文献 2 : Friedman, J.M., Nature 404, 632-634 (2000).
非特許文献 3 : White, R.T. et al, J. Biol. Chem. 267, 9210-9213 (1992).
非特許文献 4 : Hotamisligil, G.S. et.al, Science 259, 87-91, (1993).
非特許文献 5 : Zhang, Y. et al., Nature 372, 425-432, (1994).
非特許文献 6 : Shulman, G.I., J. Clin. Invest. 106, 171-176 (2000).
非特許文献 7 : Shimomura, I. et al., Nat. Med. 2, 800-803 (1996).
非特許文献 8 : Steppan, CM. et al., Nature 409, 307-312 (2001).
非特許文献 9 : Scherer, P.E. et al" J. Biol. Chem. 270, 26746-26749 (1995).
非特許文献 10 : Hu, E" Liang, P. & Spiegelman, B.M., J. Biol. Chem. 271,
10697-10703 (1996). 非特許文献 l l : Maeda, K. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 221, 286-296 (1996).
非特許文献 12 : Nakano， Y" et al" J. Biochem. (Tokyo) 120, 802-812 (1996).
非特許文献 13 : Hotta， K. et al., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 20, 1595-1599,
2000.
非特許文献 14 : Fruebis, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 2005-2010
(2001) .
非特許文献 15 :Yamauchi, T. et al., Nat. Med. 7, 941-946 (2001).
非特許文献 16 : Berg, A.H. et al" Nat. Med. 7, 947 - 953 (2001).
非特許文献 17 : Kubota， N. et al., J. Biol. Chem. 277, 25863-25866 (2002).
非特許文献 18 : Maeda， N. et al" Nat. Med. 8,731-737 (2002).
非特許文献 19 : Kersten, S. et al, Nature 405, 421-424 (2000).
非特許文献 20 :Yamauchi, T. et al., J. Biol. Chem. 278, 2461-2468 (2003).
非特許文献 21 :Yamauchi, T. et al" Nat. Med. 8, 1288-1295 (2002).
非特許文献 22 : Tomas， E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16309-16313
(2002) .
非特許文献 23 : Ouchi, N. et al., Circulation 103， 1057-1063 (2001).
非特許文献 24 :Yokota, T. et al, Blood 96， 1723-1732 (2000).
非特許文献 25 : Okamoto, Y. et al., Circulation 106， 2767-2770 (2002).
非特許文献 26 : Matsuda, M. et al" J. Biol. Chem. 277, 37487-37491 (2002).
非特許文献 27 :Yamauchi, T. et al., Nature 423, 762-769 (2003).
非特許文献 28 :Wess， J.， FASEB. J. 11, 346-354 (1997).
非特許文献 29 :Yokomizo， T. et al., Nature 387, 620-624 (1997).
非特許文献 30 : Scheer, A. et al, EMBO. J. 15， 3566-3578 (1996).
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
肥満症で見られるアディポネクチン産生の低下は、インスリン抵抗性、糖尿病、心血 管疾患のような肥満症関連疾患の発症を決定付ける要因となると考えられている。し かし、その根底にある分子的決定因子は、未だに解明されていない。そこで、本発明 は、第一に、脂肪細胞肥大に依存したアディポネクチン産生抑制の作用機作を解明 すること、第二に、アディポネクチン遺伝子の発現を上昇させ得る因子を解明すること 、第三にアディポネクチン発現誘導剤およびこれを用いた肥満症およびこれに関連 する疾患、例えば、心血管疾患または代謝性疾患の治療薬を提供すること、第四に 、アディポネクチン発現誘導剤の探索方法を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0007] 上述の通り、アディポネクチン ZAcrp30は脂肪細胞より分泌されるホルモンであり 、抗糖尿病性及び抗ァテローム性アディボカインとして作用する。アディポネクチン Z Acrp30の転写は、肥満症の脂肪組織で低下し、この低下は肥満症におけるインスリ ン抵抗性への発展に関与する。本発明者らは、アディポネクチン遺伝子の転写制御 を担うメカニズム解明のために、アディポネクチン遺伝子のプロモータ領域の位置を 特定するための肥大脂肪細胞モデルを作成した。このモデル細胞を用いて、ルシフ エラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として備えたプロモータの一 1367塩基対 (bp)か ら + 35bpまでを含む領域のプロモータ活性を調べた。アディポネクチンプロモータの 僅か 156bpを含むプラスミドを導入した脂肪細胞で高レベルのルシフェラーゼ活性が 検出された。一方、肥大脂肪細胞では、アディポネクチン遺伝子の上流調節領域の 217bpを備えたリポーター遺伝子のみ発現の抑制が示された。
[0008] 電気泳動移動度シフトアツセィ (EMSA)では、アディポネクチン遺伝子の転写開 始点から— 188位から— 157位までの 32bpフラグメントが、脂肪細胞および脂肪組 織との双方からそれぞれ調製した核抽出物中のタンパク質と結合することが示された 。大型脂肪細胞に比して小型脂肪細胞において、又は肥満したマウスに比して痩せ たマウスの脂肪組織において、これら細胞または組織より調製された核抽出物に、 3 2bpエレメントの電気泳動度を遅延させる物質が多く存在して 、た。酵母 one-hybrid スクリーニング法を用いて、上記 32bpフラグメントに結合する核内因子を特定した。 one-hybridスクリーニングで得られた 6個の陽性因子をさらに EMSA及び染色体免 疫沈降アツセィにより解析し、クルツペル (Kruppel)様因子 9 (以下、「KLF9」と略す） を同定した。この KLF9は上記エレメントに結合し、その結合量は、 in vitro及び in vivo での KLF9の発現レベルと相関していた。加えて、コトランスフエクシヨン実験から、 K LF9の一過的な過剰発現によりアディポネクチンプロモータ活性を用量依存的かつ 特異的に増強させることが示された。 in vitroでの siRNAによる KLF9発現抑制並び に KLF9過剰発現及び in vivoでの KLF9ノックアウトによって、内在性アディポネクチ ン mRNAが変化するという結果が得られた。このことより KLF9によりアディポネクチ ンの転写調節が行われていることを確認した。これら結果は、大型化した肥大脂肪細 胞に KLF9を補足することにより、肥満症またはこれに関連する疾患、例えば、インス リン抵抗性及び 2型糖尿病などの代謝性疾患や心血管疾患の予防'治療薬となり得 ることを示唆する。さらに、 KLF9が上記疾患に対する創薬のターゲットとして重要で あることを示す。本発明はこれら知見に基づくものであり、具体的には以下に示す通 りである。
1.下記（1)または（2)記載のタンパク質を含有する、アディポネクチン発現誘導剤。
(1)配列番号： 2記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質
(2)配列番号： 2記載のアミノ酸配列において、一以上のアミノ酸の欠失、置換、付カロ または挿入を有するアミノ酸配列力 なるタンパク質
2.下記（1)または（2)記載の DNAまたは該 DNAを保持したベクターを含有する、ァ ディポネクチン発現誘導剤。
(a)配列番号： 1記載の塩基配列を有する DNA
(b)配列番号： 1記載の塩基配列とストリンジヱントな条件でノ、イブリダィズする DNA。
3.上記 1または 2に記載のアディポネクチン発現誘導剤を有効成分とする、代謝性 疾患または心疾患の予防 ·治療用医薬糸且成物。
4.下記（1)または（2)力もなるェンノヽンサ一エレメントを少なくとも備えたレポーター 遺伝子を保持した、アディポネクチン発現誘導物質のスクリ一ユング用細胞。
(1)配列番号： 5記載の塩基配列力 なる DNA
(2)配列番号 : 5記載の塩基配列において、 1塩基以上の欠失、付加、置換または挿 入を有する塩基配列からなる DNA
5.さらに KLF9をコードした DNAを保持した、上記 4記載の細胞。
6.脂肪細胞である、上記 4または 5記載の細胞。 7.肥大脂肪細胞である、上記 4または 5記載の細胞。
8.下記（1)から（3)の工程を含む、アディポネクチン発現誘導物質のスクリーニング 方法。
(1)上記 4記載の細胞に被検物質を作用させる工程
(2)レポーター遺伝子の発現を検出する工程
(3)被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の 場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
9.下記（1)から（3)の工程を含む、アディポネクチン発現誘導物質のスクリーニング 方法。
(1)上記 5記載の細胞に被検物質を作用させる工程
(2)レポーター遺伝子の発現を検出する工程
(3)被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の 場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
10.下記（1)から（3)の工程を含む、肥満症またはこれに関連する疾患の予防，治療 用薬剤のスクリーニング方法。
(1)上記 4記載の細胞に被検物質を作用させる工程
(2)レポーター遺伝子の発現を検出する工程
(3)被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の 場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
11.下記（1)から（3)の工程を含む、肥満症またはこれに関連する疾患の予防，治療 用薬剤のスクリーニング方法。
(1)上記 5記載の細胞に被検物質を作用させる工程
(2)レポーター遺伝子の発現を検出する工程
(3)被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の 場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
図面の簡単な説明
[図 1]脂肪細胞の分ィ匕及び肥大過程の 3T3L1細胞におけるトリグリセリド含有量 (TG ) (a)、グルコース摂取（b)、並びにアディポネクチン及びレジスチンの mRNAレベル (c)を示すグラフである。（c)脂肪細胞の分ィ匕及び肥大過程における 3T3L1脂肪細 胞中のアディポネクチン及びレジスチンの mRNAレベルは、 TaqManリアルィム逆転 写— PCR分析より測定した。結果は 36B4mRNAレベルを基準としてアディポネクチ ン又はレジスチンの発現レベルを標準化した相対値として示した。データは、 3回の 独立した一連の実験力 得られた平均的な結果を表す。脂肪細胞肥大は 3T3L1脂 肪細胞におけるアディポネクチン mRNAレベルを低下させ、この mRNAの低下に伴 つてグルコース取込が低下する。
[図 2]脂肪細胞の分ィ匕及び肥大過程の 3T3L1細胞におけるアディポネクチンプロモ ータ活性を測定した結果を示す図である。 a :脂肪細胞の分ィ匕及び肥大過程の 3T3 L1細胞におけるアディポネクチンプロモータ活性、 b :分ィ匕誘導後 10日目の 3T3L1 細胞を指示した濃度の TNF aとともにインキュベーションした後のアディポネクチン プロモータ活性、 c :TNF Q; (3ng/ml)処理または非処理の分化誘導後 10日目および 分化誘導後 19日目の 3T3L1細胞を抗 TNF a抗体とともにインキュベーションした 後のアディポネクチンプロモータ活性の結果をそれぞれ示す。 3T3L1細胞には、ァ ディポネクチンプロモータの (-1367/+35)-ルシフェラーゼ遺伝子（Luc)発現ベクター を一時的に導入した。 (b)における結果は、 TNF- a非添加時の活性を 100%とした 場合の相対値として示す。（b)におけるバーは、それぞれ、平均士 SE (n= 5〜7)を 表す (* : Pく 0. 05、 ** : Pく 0. 01 ;非処理細胞と比較)。肥大脂肪細胞におけるアディポ ネクチンプロモータ活性の低下の原因は、 TNF a以外のシグナル伝達経路が存在 する。
[図 3]アディポネクチンプロモータ領域の解析結果を示す図である。 a :誘導 10又は 1 9日後（それぞれ、第 10日又は第 19日）の 3T3L1脂肪細胞にアディポネクチンプロ モータ 5 '欠失体を備えたレポーター遺伝子をベクターに載せて一時的に導入した際 のレポーター (ルシフェラーゼ)活性を検討した結果を示すグラフである。 b： 3T3L1 脂肪細胞 (第 10日又は第 19日）から核タンパク質抽出物を調製し、図示したアディ ポネクチンプロモータ 5，欠失配列を32 P標識ィ匕プローブとして、 EMSA分析した結果 を示す写真である。示したデータは、 3回の独立した一連の実験から得られた代表的 な結果を表す。 c： 3T3L1脂肪細胞 (第 10日又は第 19日）から核タンパク質抽出物 又は痩せた対照 C57若しくは肥満モデル obZobマウスから WAT (White Adipose Tissue ;白色脂肪組織)を調製し、アディポネクチンプロモータ（— 188Z— 157)配 列を32 P標識ィ匕プローブとして用いた EMSA分析に付した結果を示す写真である。 d ：ェンハンサーなしのベクター pGL2-tK-Lucの上流に一 188/— 157フラグメントを 挿入し、このベクターを 3T3L1脂肪細胞 (第 10日及び第 19日）に導入してルシフエ ラーゼ活性を検定した結果を示すグラフである。パネル dの結果は対照ベクターの値 の比として表す。結果におけるバーは 3回の別個の実験の平均士 SEを表す。パネル b、 cのデータは、 3回の独立した一連の実験力 得られた代表的な結果を表す。肥 大脂肪細胞では、近位 32bpプロモータエレメントを通じてアディポネクチンプロモー タが調節される。
[図 4]3T3L1脂肪細胞 (第 10日）の核抽出物中のアディポネクチンプロモータ領域に 結合する因子を解析した結果を示す写真である。パネル a〜d、 fは EMSA分析結果 を示す。 a : 3T3Ll脂肪細胞 (第 10日）および 293T細胞からの核抽出物と、放射性 標識化 NF— κ B共通配列（p65部位）とを、 KLF9又は NF— κ Βρ65を特異的に認 識する抗体存在下または不存在下でインキュベーションした際の EMSA分析結果、 b : (右パネル） 3T3L1脂肪細胞 (左側 2レーン:第 10日、右側 2レーン:第 19日）の核 抽出物とアディポネクチンプロモータ領域（― 188Z— 157)の標識 32bpオリゴヌク レオチドプローブとを抗 KLF3抗体存在下、非存在下でインキュベーションした結果、 (左パネル） 293T細胞からの核抽出物と KLFオリゴ (KLFコンセンサス配列）とを抗 KLF3抗体存在下、非存在下でインキュベーションした際の EMSA分析結果、 c : 3T 3L1脂肪細胞 (第 10日）からの核抽出物を KLF9コンセンサス配列（BTE)とを抗 KL F9抗体存在下、非存在下で反応させた結果、 d :痩せた対照 C57BL6 (B6)若しくは 肥満モデル ob/obマウスからの WATを 32bpフラグメントおよび抗 KLF9抗体と反 応させた結果、 f： B6若しくは肥満モデル obZobマウスからの WATまたは精製 FLA G— tagKLF9を 32bpフラグメントとインキュベーションした結果を示す。各図面中の 矢印は、スーパーシフトした特異的複合体を示す。 e： 3T3L1脂肪細胞 (第 10日）内 の内在性アディポネクチンプロモータに結合して 、る KLF9の染色体免疫沈降アツ セィの結果を示す写真である。データは、 3回の独立した一連の実験から得られた代 表的な結果を表す。 EMSA分析により、 32bp結合複合体には in vitro及び in vivoで KLF9を含むことが明らかにされた。
[図 5]脂肪細胞内の KLF3および KLF9の発現レベルを解析した結果を示す写真お よび図である。 a、 b :分化誘導から示された日数を経過した 3T3L1脂肪細胞、痩せ た対照 C57BL6若しくは肥満モデル obZobマウスからの WAT (a〜c)中に存在す る KLF3mRNA (a、上段）または KLF9mRNA(a、下段）の発現量をノーザン分析 により解析した写真およびそのバンド強度を数値ィ匕したグラフ、 mKLF9タンパク質（ b)の発現量をウェスタン分析により解析した結果を示す写真である。パネル bにおけ る矢印は KLF9を示す。パネル aに示すグラフにおけるバーはそれぞれ、平均士 SE ( n= 3〜5)を表す。 KLF9発現は、脂肪細胞分化の際に増大したが、脂肪細胞肥大 の際には低下した。
[図 6]KLF9過剰発現によるアディポネクチン発現に与える効果を解析した結果を示 す図および写真である。 a: 3T3Ll脂肪細胞 (第 19日）に KLFを発現するベクター（ KLF9/pcDNA3.1)と、アディポネクチンプロモータ（（一 1367Z + 35)の下流にレポ 一ター（ルシフェラーゼ）遺伝子を備えたベクター（「1367bp- Luc」 )を導入し、 KLF9 高発現の影響を解析した結果を示す。結果は「Mock」（pcDNA3.1のみ）を 1とした場 合の比活性として示した。 PDGFは KLF認識配列を備え KLFファミリーの発現を誘導 する陽性のコントロールである。 b : 3T3Ll脂肪細胞（第 19日）に KLF9/pcDNA3.1を リポフエクシヨン法により導入した際の KLF9mRNA発現量を Taq-manPCRにより測定 した結果を示す。 1/3000、 1Z1000はリポフエクシヨン法でベクター導入した際の希 釈率を示し、「0」は非導入の場合を示す。 c :レポーターとして PDGF—tk— Lucまたは 32bp- tk- lucを保持した 3T3L1脂肪細胞（第 19日）に mKLF5/pcDNA3.1または m KLF9/pcDNA3.1を導入した際のレポーター遺伝子の発現上昇率を、非導入の場 合の活性比として示す。 d: 3T3Ll脂肪細胞 (第 19日）にレトロウイルスベクターを用 V、て KLF9遺伝子を安定的に導入した際の KLF9の発現量を測定した結果を示す。 縦軸「mKLF9/36B4」は、 36B4mRNA発現量で補正した KLF9mRNA発現率を 意味する。 f : 3T3L1脂肪細胞 (第 19日）にレトロウイルスベクターを用いて KLF9遺 伝子を安定的に導入した際のアディポネクチン発現量を測定した結果を示す。 e： K LF9をレトロウイルスを用いて導入された 3T3L1脂肪細胞 (第 19日）からの核タンパ ク質抽出物を調製し、アディポネクチンプロモータ（― 188/— 157)配列を32 P標識 化プローブとして用いた EMSA分析に付した結果を示す写真である。図中に示すバ 一は、それぞれ平均士 SE (n= 5〜7)を表す。 KLF9は、ェンハンサー及びアディポ ネクチンプロモータの活性、 32bp結合タンパク質の量、並びにアディポネクチンの発 現を増大させた。
[図 7]siRNAにより KLF9をノックダウンしたした際のアディポネクチン発現への影響 を解析した結果を示す図および写真である。 a :KLF9に対する siRNAを 3T3L1脂 肪細胞 (第 10日）に導入後、 72時間、 96時間経過後の KLF3、 KLF9及びアディポ ネクチン mRN Aの量を示す。結果はそれぞれ siRNAを導入して ヽな 、際の活性を 1 00%とした際の相対割合で示した。 b： 3T3L1脂肪細胞 (第 10日）に siRNAを導入 後 72時間または 96時間経過後の細胞力も核タンパク質抽出物を調製し、アディポネ クチンプロモータ（― 188/— 157)配列を32 P標識化プローブとして用いた EMSA 分析結果を示す写真である。 siRNAによる KLF9発現の抑制は、 32bp結合タンパク 質の量及びアディポネクチンの発現を in vitroで低下させた。
[図 8]KLF9ノックアウトマウス又は対照の野生型同腹仔の WATから核タンパク質抽 出物を調製し、 KLF9共通配列（BTE)又はアディポネクチンプロモータ（― 188/ - 157)配列を32 P標識ィ匕プローブとして用いて EMS A分析を行った結果を示す写 真である。 KLF9のノックアウトは、 KLF9タンパク質を消失させ、 32bp結合タンパク 質も消失させた。
圆 9]脂肪細胞肥大が脂肪細胞における KLF9発現を調節する機序を示す図である 。 a : 3T3Ll脂肪細胞 (第 10日又は第 17日）における TR o; (甲状腺ホルモンレセプ ター a ) mRNA発現量、 b :痩せたマウス C57BLおよび肥満マウス ob/obにおける TR a mRNA発現量を示す。 c：図示された濃度の T3で処理した際の KLF9mRNA 発現量を 36B4mRNA発現量との比として示す。 d、 e : 3T3Ll脂肪細胞 (第 6日、第 13)、抗酸化剤の N—ァセチルシスティン（NAC) (20mM)、 JNKインヒビターの SP6 00125または NAC (SP)で処理した 3T3L1脂肪細胞（第 19日）における KLF9また はアディポネクチンの mRNA発現量を示す。なお図において、 NAC (SP)は、 NAC および SP600125で処理した群である。
[図 10]脂肪細胞の肥大化に伴い酸化ストレスが上昇することを示す図である。
[図 11]脂肪細胞の肥大化に伴い抗酸ィ匕活性が低下することを示す図である。バーは
、それぞれ、平均士 SE (n=6)を表す (**: P< 0. 01 ;非処理細胞と比較)。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 以下、実施形態に挙げて本発明を説明する。本発明は、第一にアディポネクチン 発現誘導剤を提供する。本願発明者らにより、 KLF9がアディポネクチンの発現を誘 導することが見出された。すなわち、本発明のアディポネクチン発現誘導剤は、 KLF 9タンパク質または KLF9を発現し得る DNA等を構成成分とする。
[0012] KLF9はクルツペル様ジンクフィンガータンパク質と称されるスーパーファミリーに属 するタンパク質の一種である。 KLF9の具体的なアミノ酸配列の一例を配列番号： 2 に示す力 本発明の KLF9はこれに限定されない。タンパク質には同一の機能を有 する類似の配列力 なる異種ホモログや変異体が存在し、また、配列番号： 2記載の アミノ酸配列を人為的に適宜改変することによって、同一の機能を有する変異体を得 ることもできる。従って、配列番号： 2に示すアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が 欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつアディポネクチン遺伝子を誘 導する活性を有するタンパク質も本発明の KLF9に包含される。
[0013] KLF9はヒト、マウスなどの細胞、組織より得ることができる。例えば、脂肪細胞でも 小型のものは KLF9の発現が高いことから、分ィ匕が進んでいない脂肪細胞、組織を材 料として単離することができる。また簡便には配列番号： 1記載の DNAを発現ベクター に接続し、細胞系、無細胞系で発現させて得ることもできる。
[0014] 一方、配列番号： 2記載のアミノ酸配列からなる KLF9と機能的に同等なタンパク質 を得る手法として、アミノ酸を人為的に置換することが挙げられる。性質的に似たアミ ノ酸同士の置換はタンパク質の活性が維持されやす 、と考えられる。保存的置換に 相当するアミノ酸のグループとしては、例えば、塩基性アミノ酸 (例えばリジン、アルギ ニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばァスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性 アミノ酸（例えばグリシン、ァスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、シ スティン）、非極性アミノ酸（例えばァラニン、パリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、 フエ-ルァラニン、メチォニン、トリプトファン）、 e分岐アミノ酸（例えばスレオニン、バ リン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フ -ルァラニン、トリプ トフアン、ヒスチジン)などが挙げられる。逆にアミノ酸配列の非保存的置換も場合によ つては有効である。例えば、非保存的置換によって、 KLF9タンパク質におけるアディ ポネクチン発現誘導活性を上昇等し得る改良を加えることも可能であり、該改良 KLF 9タンパク質も本発明に含まれる。
[0015] KLF9と機能的に同等なタンパク質を得る他の方法として、配列番号： 2記載の DNA と類似する DNAをハイブリダィゼーシヨンによりクローユングして、得られた DNA力 タ ンパク質を得る方法を挙げることができる。具体的には、配列番号： 1に示す KLF9を コードする DNA、あるいはその断片をプローブとし、これとハイブリダィズする DNAを 単離する。ハイブリダィゼーシヨンをストリンジェントな条件下で実施すれば塩基配列 としては相同性の高い DNAが選択され、その結果として単離されるタンパク質には KLF9と機能的に同等なタンパク質が得られる可能性が高い。相同性の高い塩基配 列とは、たとえば 70%以上、望ましくは 90%以上の同一性を示すことができる。
なお、上記ストリンジヱントな条件とは、例えば 6 X SSC、 40%ホルムアミド、 25°Cでの ハイブリダィゼーシヨンと、 I X SSC、 55°Cでの洗浄といった条件を示すことができる。 ストリンジエンシーは、塩濃度、ホルムアミドの濃度、あるいは温度といった条件に左 右される力 当業者であればこれらの条件を必要なストリンジエンシーを得られるよう に設定することは自明である。
[0016] ノ、イブリダィゼーシヨンを利用することによって、例えば、配列番号： 2記載のァミノ 酸配列に示すようなマウス由来の KLF9、マウス以外の動物種、すなわちヒト、ラット、 ゥサギ、ブタ、あるいはャギ等の動物種力も得ることができるポリヌクレオチドがコード する KLF9のホモログは、機能的に同等なタンパク質を構成するであろう。
[0017] 上記手法以外にも KLF9と機能的に同等なタンパク質を得る方法として、配列番号:
1記載の DNAを改変し、改変した DNAを基にタンパク質を合成する方法などが挙げら れる。マウス KLF9 (配列番号： 2)に人為的に改変を加えたタンパク質や、上記のよう なノ、イブリダィゼーシヨン技術等を利用して単離されるポリヌクレオチドがコードするタ ンパク質は、通常、ヒト KLF9 (配列番号： 2)とアミノ酸配列において高い相同性を有 する。高い相同性とは、少なくとも 30%以上、好ましくは 50%以上、さらに好ましくは 80%以上 (例えば、 95%以上）の配列の同一性を指す。塩基配列やアミノ酸配列の 同一性は、インターネットを利用したホモロジ一検索サイトを利用して行うことができる [例えば日本 DNAデータバンク（DDBJ)において、 FASTA、 BLAST, PSI- BLAST、お よび SSEARCH等の相同性検索が利用できる [例えば日本 DNAデータバンク（DDBJ )のウェブサイトの相同性検索（Search and Analysis)のページ；
http://www.ddbj.nig.ac.Jp/E— mau/homology—j.ntml]。ま 7こ、 Nationalし enter for Biotechnology Information (NCBI)において、 BLASTを用いた検索を行うことができる (例えば NCBIのホームページのウェブサイトの BLASTのページ；
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/; Altschul, S.F. et al, J. Mol. Biol, 1990, 215(3):403-10; Altschul, S.F. & Gish, W" Meth. EnzymoL, 1996, 266:460-480; Altschul, S.F. et al" Nucleic Acids Res., 1997, 25:3389—3402) ]。
KLF9と機能的に同等なタンパク質が、実際に配列番号： 2記載の KLF9と同等な機 能、すなわち、アディポネクチン発現誘導活性を有するかを確認は、本願実施例に 示すルシフェラーゼ解析などを用いて実施し得る。
[0018] 本発明のアディポネクチン発現誘導剤のもう一つの構成成分は、 KLF9をコードした DNAまたは該 DNAを保持したベクターである。 KLF9をコードした DNAの例として、配 列番号： 1に示す塩基配列力もなる DNAを挙げることができる。 DNAもタンパク質と同 様に同一の機能を有する類似の塩基配列からなるホモログや改変体が存在し、また 、配列番号： 1記載の塩基配列を人為的に改変することによって、あるいは同一の機 能を有する変異体をクローユングすることによつても得ることもできる。こうした配列番 号： 1に類似する配列を備えた DNAは、例えば、配列番号： 1記載の塩基配列とストリ ンジェントな条件でノヽイブリダィズする DNAと定義することができる。
[0019] 「ストリンジェントな条件でハイブリダィズする DNA」とは、上述した通り、配列番号： 1 に示す KLF9をコードする DNA、あるいはその断片をプローブとし、これとハイブリダィ ズし得る DNAである。また、上記ストリンジェントな条件とは、一例を示せば、上述した 通り、例えば 6 X SSC、 40%ホルムアミド、 25°Cでのハイブリダィゼーシヨンと、 1 X SSC、 55°Cでの洗浄と!/、つた条件などであるがこれに限定されな!、。 KLF9をコードした DNAは断片の状態で用いてもよぐまたベクターに接続しても用 いてもよい。ベクターは目的に応じて適宜選択し得る。例えば、ヒト細胞、組織内のァ ディポネクチン遺伝子の発現を誘導する目的では、ヒトなどの哺乳動物細胞等で機 能し得るベクター、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随 伴ウィルスベクター、レンチウィルスベクター、 pcDNAI、 pcDNAI/Amp (Invitrogen社） 等がある。
[0020] 上記本発明のアディポネクチン発現誘導剤の使用態様は、 (1)実験動物における 内因性あるいは外来性アディポネクチン遺伝子発現の誘導、 ( 2)培養細胞内に存在 する内因性あるいは外来性アディポネクチン遺伝子発現の誘導、（3)無細胞系での アディポネクチン遺伝子の発現誘導などが挙げられる。
上記使用態様（1)、（2)の場合には、例えば、ベクターに保持させた KLF9をコード した DNAを構成成分としたアディポネクチン発現誘導剤を用いることが好適である。 細胞、組織等への遺伝子導入は、ウィルスベクターの投与や既存の導入技術 (エレ タトロポーレーシヨン法、リポフエクシヨン法、リン酸カルシウム沈殿法等）を用いて行う ことができる。また、使用態様（3)の場合には、 DNAを保持したベクターまたは KLF9 タンパク質の 、ずれを構成成分とするものであってもよ!/、。
[0021] 上記本発明のアディポネクチン発現誘導剤は、実験動物、培養細胞さらには無細 胞系にお 、てアディポネクチンの発現を誘導し得ることから、アディポネクチンの機能 解析の有効な薬剤となる。また、アディポネクチンは肥満症またはこれに関連する疾 患、例えば、糖尿病などの代謝疾患および動脈硬化症などの心血管性疾患に関与 する重要な因子である。従って、本薬剤はこうした疾患の研究に大きく寄与する。
[0022] また、本発明は第二に上記アディポネクチン発現誘導剤を有効成分とする、肥満 症またはこれに関連する疾患の予防 ·治療用医薬組成物に関する。上述した通り、ァ ディポネクチンは肥満症またはこれに関連する疾患、例えば 2型糖尿病、インスリン 抵抗性などの代謝疾患および動脈硬化症などの心血管性疾患に関与する重要な因 子である。これら疾患の多くでは低アディポネクチン血症がみられる。従って、上記ァ ディポネクチン発現誘導剤を有効成分として、適宜、薬学的に許容され得る担体と配 合することにより、肥満症またはこれに関連する疾患の治療用医薬組成物として応用 することができる。
[0023] 本発明の医薬糸且成物が対象とする疾患は、肥満症またはこれに関連する疾患、例 えば、代謝性疾患、心疾患などである。具体的には、インスリン抵抗性、糖尿病及び 高脂血症などの代謝性疾患、動脈硬化症、高血圧、脂肪肝などの心血管性疾患な どである。さらに言えば、これら疾患のうち、特に低アディポネクチン血症を伴う場合 あるいは低アディポネクチン血症を生じるおそれがある場合に本発明の医薬組成物 が有効となる。これら疾患の原因またはこれら疾患に伴って生じる低アディポネクチン 血症を本医薬組成物中に含まれるアディポネクチン発現誘導剤により改善することに より、上記疾患の予防、治療、病体の緩和などを図ることができる。
[0024] アディポネクチン発現誘導剤は上記で説明した通りである。「薬学的に許容され得 る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤あるいは その他の添加剤等を意味する。そのような担体の一つ以上を用いることにより、経口 あるいは非経口製剤を調製し得る。本発明による医薬組成物の投与量は、対象疾患 や病態に応じて適宜調整することができる力 一般的には、体重 lkgあたり通常 1 μ g から 20g、より一般的には 10 g〜500mgとすることができる。また注射剤の場合は経 口投与の 10分の 1〜100分の 1程度を投与量の目安とすることができる。
[0025] 本発明は、第三にアディポネクチン発現誘導剤のスクリーニングのための細胞を提 供する。本発明者らは、アディポネクチン遺伝子の制御領域内に KLF9が結合する エレメントを同定している。そして、このエレメントに KLF9が結合することによりアディ ポネクチンの発現が促進される。したがって、 KLF9と同様な活性を有する物質を探 索することにより KLF9に代わるアディポネクチン発現誘導因子をスクリーニングする ことが可能となる。この因子が KLF9などのようなタンパク質であってもよいが、好ましく は低分子化合物である。低分子化合物であれば、そのまま創薬のリード化合物として 利用し得る可能性が高い。
[0026] 本発明の細胞の第一の態様は、 KLF9が結合し得るエレメント（以下、「KLF9結合ェ レメント」と称する）を少なくとも上流に備えたレポーター遺伝子を保持した細胞である 。すなわち、第一の態様の細胞内には、 KLF9によるアディポネクチン遺伝子の発現 を促進するェンハンサーエレメント（シス因子）である KLF9結合エレメントがレポータ 一遺伝子の上流に備えられて 、る。
[0027] KLF9結合エレメントは、好適には、アディポネクチン遺伝子の上流— 188から— 15 7の領域に対応する配列番号： 5記載の塩基配列を挙げることができる。しかし、この 配列に限定されるものではなぐ配列番号： 5記載の塩基配列を有するアディポネク チン遺伝子の制御領域の全長（配列番号： 3)ある 、はその一部（一例として挙げれ ば、配列番号: 4)がレポーター遺伝子の上流に備えられているものであってもよい。 さらには KLF9が結合し、且つ、 KLF9によるアディポネクチン遺伝子発現を誘導し得 る活性を保持している配列であれば、配列番号： 5記載の塩基配列を改変することも できる。配列番号: 5記載の塩基配列の改変体をより具体的に定義すると、配列番号 : 5記載の塩基配列において 1塩基以上の欠失、付加、置換または挿入を有する塩 基配列とすることができる。なお、こうした配列番号: 5記載の塩基配列の改変は点変 異導入技術を用いて実施し得る。
[0028] レポーター遺伝子は、その発現を確認し得る遺伝子であれば特に限定なぐ一般 に用いられている用語よりも広い概念として本書では用いる。具体的には、本書にお けるレポーター遺伝子は、発光を指標に発現を検出し得る遺伝子 (例えば、ルシフエ ラーゼ遺伝子、 GFP遺伝子、 YFP遺伝子など）、酵素活性を指標に発現を検出し得る 遺伝子（ι8—ガラクトシダーゼ遺伝子など）、薬剤の感受性を指標に発現を検出し得 る遺伝子 (ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子など)など一般的 なレポーター遺伝子（マーカー遺伝子）の他に、アディポネクチン遺伝子そのものもレ ポーター遺伝子の概念に含めることができる。なお、本書においては、特に断りがな い限り「リポーター遺伝子」は広義に解する。
[0029] すなわち、「KLF9結合エレメントを上流に備えたレポーター遺伝子」として、固有の 制御領域 (例えば、配列番号 3など）を備えたアディポネクチン遺伝子、例えば、配列 番号： 6を用いることができる。この構成におけるアディポネクチン遺伝子を他の上述 したような一般的なレポーター遺伝子に置換してもよい。さらに、これら構成において 、制御領域のうち KLF9結合エレメント（例えば、配列番号： 5)のみ残すように他の制 御領域を欠失させてもよい。また、一般のレポーター遺伝子が搭載されたプラスミドを 基に、レポーター遺伝子の上流配列をアディポネクチン遺伝子の制御領域につなぎ 変えて構築してもよぐまた、一般のレポーター遺伝子の上流に KLF9結合エレメント を挿入して構築してもよい。なお、アディポネクチン遺伝子をレポーター遺伝子として 用いる場合には、アディポネクチン遺伝子は細胞に内在する遺伝子あるいは外来か ら導入された遺伝子の ヽずれであってもよ 、。
[0030] 本発明の細胞の第二の態様は、上記第一の態様にさらに KLF9をコードした DNAを 保持した細胞である。第一の態様にさらに KLF9遺伝子を保持させた第二の態様の 細胞は、 KLF9遺伝子の発現誘導を介してアディポネクチン遺伝子の発現を誘導し 得る物質のスクリーニングに有用となる。本願発明者らは、脂肪細胞の肥大化の過程 でアディポネクチンの発現が低下することと相関して KLF9遺伝子の発現、特に、転 写レベルの発現が低下することを見出している。従って、第二の態様の細胞は、第一 の態様の細胞の有用性に加えて、大型あるいは肥大脂肪細胞において KLF9遺伝 子の発現を抑制している物質を阻害する物質の探索などに有用となる。
[0031] 「KLF9をコードした DNA」は、上記アディポネクチン発現誘導剤の説明にお ヽて記 載した KLF9をコードした DNAと同一であり、この用語が意味する範囲も同様である。 要するに、 KLF9をコードした DNAの一例として配列番号： 1記載の塩基配列からなる DNAを挙げることができる力 アディポネクチンの発現を誘導し得る活性を保持する 範囲で、配列番号： 1の塩基配列にこの塩基配列とストリンジ ントな条件でノ、イブリ ダイズする DNAが含まれる。なお、 KLF9をコードした DNAは細胞に内在しているもの であっても、外来から導入した細胞であってもよい。これら KLF9をコードした DNAは、 上流に KLF9遺伝子元来の制御領域を備えて 、ることが好ま U、。
[0032] 上記第一および第二の態様における細胞種は、特に限定はないが、例えば、哺乳 動物細胞由来であることが好ましく、さらに通常生体内でアディポネクチンを発現して V、る細胞種であることがより好まし 、。生体内でアディポネクチンを発現して 、る細胞 は、一例を挙げれば、脂肪細胞である。脂肪細胞を用いる場合には、小型脂肪細胞 、大型化した肥大脂肪細胞を適宜選択して用いることができる。例えば、第二の態様 の細胞で、 KLF9の発現を抑制して 、る生体分子を阻害する物質の探索を行う場合 には、アディポネクチンの発現が低下して 、る大型化脂肪細胞を用いることができる 。大型脂肪細胞の調製は、 obZobマウスなど力も脂肪細胞を単離調製する以外に、 分ィ匕が進んで 、な 、脂肪細胞 (例えば、 3T3L1脂肪細胞など)を出発材料として、 実施例を参照して分化誘導を行!ヽ調製することもできる。脂肪細胞の分化誘導は、 分化誘導培地で細胞を培養することにより実施することができる。
[0033] また、第一、第二の態様の細胞における「KLF9結合エレメントを上流に備えたレポ 一ター遺伝子」や第二の態様の細胞における「KLF9をコードする遺伝子」を外来から 細胞に導入する場合、この DNAをベクター等に担持させて細胞に導入することがで きる。この場合のベクターは適宜選択して使用することができる。
[0034] 本発明は第四に、アディポネクチンの発現を誘導し得る物質のスクリーニング方法 に関する。第一の態様のスクリーニング方法は、上記第一の態様の細胞を用いた方 法である。具体的には、次の（1)から（3)の工程が含まれる。
(1)上記第一の態様の細胞に被検物質を作用させる工程
(2)レポーター遺伝子の発現を検出する工程
(3)被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の 場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
[0035] 第二の態様のスクリーニング方法は上記第二の態様の細胞を用いた方法であり、 具体的には、次の（1)から（3)の工程が含まれる。
( 1 )上記第二の態様の細胞に被検物質を作用させる工程、
(2)レポーター遺伝子の発現を検出する工程
(3)被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の 場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
[0036] V、ずれの態様も目的であるアディポネクチン遺伝子の発現を誘導し得る物質を探 索し得る点で共通するが、用いる細胞の機能に応じた特徴を有する。例えば、第一 の態様では、 KLF9結合エレメントを備えたレポーター遺伝子を保持した細胞を用い て！、ることから、 KLF9に代わって KLF9結合エレメントに作用しアディポネクチンの発 現を誘導し得る物質をスクリーニングすることが可能となる。また、第二の態様では、 さらに KLF9をコードした DNAを保持した細胞を用いていることから、例えば、肥大脂 肪細胞において KLF9の発現抑制を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
[0037] 上記第一および第二の態様における被検物質は、タンパク質、核酸、低分子化合 物などを挙げることができるが、特に限定はない。また、これらは天然、合成の別は問 わない。核酸には、 KLF9タンパク質の全体をあるいは一部を模倣した核酸 (DNA、 RNA)デコイを含めることができる。また、核酸は天然に存在する塩基のほか、天然に は存在しな 、人工的な塩基により合成したものも含めることができる。低分子化合物 には、コンビナトリアルケミストリ一により合成された化合物ライブラリーなどを含めるこ とがでさる。
[0038] 細胞への被検物質の作用は、一例として、細胞を培養して!/ヽる培地に被検物質へ の添加することが挙げられる。被検物質が核酸の場合には、通常の遺伝子導入技術 、例えば被検物質をリボソームなどの脂質分子、リン酸カルシウムなど塩で覆い細胞 の食作用を利用して導入する方法、電気的な刺激などにより細胞へ導入する方法、 マイクロインジェクション、ジーンガンなどを用いることができる。
[0039] レポーター遺伝子の発現の検出は、転写レベル、翻訳レベルの発現のいずれを検 出してもよい。転写レベルの発現検出は、ノーザンブロッテイング、 RT-PCR法、リアル タイム PCRなどを用いることができる。これら手法に用いるプライマー、プローブは、当 業者であればレポーター遺伝子の塩基力 適宜デザインして作成することはできる。 翻訳レベルの発現検出は、ウェスタンブロッテイング法、免疫沈降法、 ELISA、 RIAな ど特異抗体を用いた検出方法の他に、レポーター遺伝子産物の性質に応じた方法 を用いることができる。ルシフェラーゼ、 GFPなどの蛍光を発する場合には、その蛍光 を検出することにより、 j8 -ガラクトシダーゼなどの酵素の場合には、基質との反応に 基づき検出することができる。さらに、薬剤耐性マーカーの場合には、薬剤含有培地 中に培養し、生育することを指標に発現を検出することができる。発現量を定量化す る場合には、上記特異的な抗体を用いたいずれかの検出手法や、強度を測定し得る 蛍光を指標とする方法を用いることが好まし ヽ。
[0040] 第一、第二の態様のいずれも、最終的には、被検物質存在下と非存在下における レポーター遺伝子の発現量を測定し、被検物質非存在下に比して被検物質存在下 にお 、てレポーター遺伝子の発現が高 、結果をもたらす被検物質が選択される。こ こで選択された被検物質は、アディポネクチン遺伝子の発現を促進し得る物質として 重要な候補となる。 また、上記本発明のスクリーニング方法は、アディポネクチン発現誘導物質をスクリ 一二ングし得るのみならず、さらには、肥満症またはそれに関連した疾患の予防 '治 療用の薬剤の候補物質を探索するために応用することができる。肥満症に関連した 疾患としては、上記において繰返し記載している通り、例えば、糖尿病、インスリン抵 抗性などの代謝性疾患、動脈硬化症などの心疾患などである。これら疾患では、低 アディポネクチン血症が見られる場合多く存在する。低アディポネクチン血症力 これ ら疾患の発症を決定づける一要素、あるいは病態の進行を進める要因等となってい る場合には、上記スクリーニング方法により得られる物質は、患者における低アディポ ネクチン血症を改善させ、肥満症またはこれに関連する疾患の予防、治療、病体の 緩和を誘導し得ることが期待される。
[0041] なお、上記スクリーニング方法の他に簡便なスクリーニング方法として、配列番号： 5 に示すような KLF9結合エレメントと相互作用活性を指標に被検物質を選択する方法 もある。相互作用活性は、例えば実施例に示された免疫沈降アツセィや、 EMSAなど を用いて測定し得る。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書 に組み入れられる。
実施例
[0042] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。なお、本実施例で用いた材料および方法について以下に 説明する。
〔材料及び方法〕
1. 材料及び一般的方法
3—イソブチルー 1ーメチルキサンチン（IBMX)及びデキサメタゾン（DEX)、 NAC 並び〖こ SP600125は、シグマ社から購入した。その他の材料は、すべて、引用文献（ 27、 35及び 36)に示された供給源から購入した。 DNA配列決定は、 PRISM染料タ ーミネーターサイクル配列決定キット及び ABIPRISM310ジェネティックアナライザ ~~ (Applied Biosystems i)で実施した。
[0043] 2. 動物及び血液サンプルアツセィ KLF9欠損マウスは既に報告されている（Morita, M. et al.， Mol. Cell. Biol. 23, 2489-2500 (2003).)。 15週齢の obZobマウス及びその野生型の C57BLZ6マウス は、 Charles River Breeding Laboratories (Wilmington, MA)力ら入手した。マウスは、 コロニーケージ内に収容し、光源下 12時間 Z暗所 12時間の周期を維持した。血漿 グルコースレベルは、グルコース B試験 (和光純薬ィ匕学、大阪市)を用いて決定した。 血漿アディポネクチンレベルは、マウスアディポネクチン'ラジオィムノアッセィ（RIA) キット（LINCO Research Inc.)によって決定した。
[0044] 3. cDN Aライブラリー
cDNAライブラリ一は、 A. Saltielから提供されたものを用いた。このライブラリ一は完 全に分化した 3T3— L1脂肪細胞力 採取した cDNAを pGAD- GH GAL4ベクター内 に挿入することにより構築された（Ribon, V. et al.， Mol. Cell. Biol. 18, 872-879 (1998).)。ライブラリーにはすべてが 1. 5〜3kbの大きさの cDNAインサートを有する 、 10,000,000個体の形質転換体が含まれて!/、た。
[0045] 4. 酵母における one- hybridクローユング
酵母における one-hybridクローユングの一般的方法及び関連する実験的操作は、 すでに報告されている手順で実施した（Almoguera, C. et al, J. Biol. Chem. 277, 43866-43872 (2002).) 0 one- hybridクロー-ングのために YM4271 (Clontech社）の 酵母誘導株を構築した。具体的には、プラスミド pHISi (Clontech社)の Xbal部位 (タレ ノウ DNAポリメラーゼで末端充填）と EcoRl部位との間に、下記に示すアディポネク チンプロモータ配列由来の 32塩基（一 188位〜 157位、図 3b、配列番号： 5)から なるトップ鎖オリゴヌクレオチドとその相補鎖とのアニーリングによって生成された DN Aフラグメントを揷人した。
5'— GAAGCCCAAGCTGGGTTGTACCAGGTTCCCTA— 3' (トップ鎖） 上記反応産物を YM4271 (Clontech社）に形質転換し、上記アニーリング断片が 三量体となったインサートを含む HIS3リポーター遺伝子コンストラクト（（G4HSE) x3 ：： HIS 3)を含むクローンを得た。
one-hybridスクリーニングのため、 1,660,000のプライマリークローンの増幅後に、胚 cDNAライブラリ一力も調製した DNAで（32bp) x3 : :HIS3リポーター酵母株を形質 転換した。 500万の酵母形質転換体を 15mM3—アミノトリアゾール（SD―、 His―、 Leu+)上で培養した。 30°Cで 4〜8日間増殖させた後、 22の陽性と推定される酵母 クローンを選び、更に分析した。二つの cDNAが、同じ KLF9をコードしていた。
[0046] 5. ルシフェラーゼアツセィ
ルシフェラーゼアツセィは、以前に報告した方法に従い 12ゥエルプレートで培養し た細胞を用いて実施した（Yamauchi, T. et al., Nature 423, 762-769 (2003).、 Shindo, T. et al., Nat. Med. 8, 856-863 (2002).) 0それぞれ指定量の発現プラスミド とともに、ルシフェラーゼリポータープラスミド（0. 25 μ ) ΑΧβρ8ν- β
Figure imgf000024_0001
(0. 1〜0. 4 g)を同時に導入した。各トランスフエクシヨンでの DNAの総量を、対照のベクター DNAで 1. 5 gZゥエルに調整した。形質転換体のルシフェラーゼ活性の量を標準 的キット（Promega)により測定した。測定値は j8—ガラクトシダーゼ活性を基準に標 準化した。
[0047] 6. ゲル移動度シフトアツセィ（Electrophoresis mobility shift assay: EMSA)
ゲル移動度シフトアツセィは、以前に記載したとおりに実施した (Almoguera, C. et al" J. Biol. Chem. 277, 43866-43872 (2002).) 0
293T細胞若しくは 3T3L1脂肪細胞又は白色脂肪組織力も核酸抽出物を報告さ れている方法に従い調製した（Almoguera, C. et al., J. Biol. Chem. 277,
43866-43872 (2002).) 0ゲル移動度シフトアツセィに用いた二本鎖オリゴヌクレオチド は、両鎖をアニーリングすることによって調製した。標識化プローブ（3, 000-10, 0 OOcpm)および核酸抽出物を反応液（20 /ζ 1: 10πιΜトリス HCl(pH7. 6)、 50mMKCl 、 0. 05mMEDTA、 2. 5mMMgCl、 8. 5%グリセリン、 ImMジチォ卜レイトール、 0.
2
5 μ g/mlのポリ (dl-dC)、 0. 1%トリトン X及び lmg/mlの脱脂乳）中で混合し、氷上 で 30分間インキュベーションした。 DNA—タンパク質複合体を、 4. 6%ポリアクリル アミド上、 140V、 4°Cで 1時間分画した。ゲルを乾燥し、 BAStationソフトウェア付きの BAS 2000フィルター（富士写真フィルム）に露光させた。
競合実験の場合には、標識ィ匕 DNAに対して少なくとも 100倍過剰モルの非標識 化 DNAを先ず上記反応液に加え、その後、標識ィ匕プローブをカ卩えた。スーパーシフ ト実験では、最初に、 KLF9、 KLF3又は NF— κ Βρ65に対するポリクローナル抗体 (2〜10 g)とともに氷上でインキュベーションして、ゲルシフト反応を行った。
[0048] 7. レトロウイルスの生成及び感染
107個の Plat— Eパッケージング細胞（Morita, S. et al., Gene Ther. 7, 1063-1066 (2000).)に 10 gのマウス KLF9を Lipofectamine PLUS (Life Technology)を用いて一 時的に導入し、 24時間のインキュベーションの後に上清（10ml)を採集した。 10 g/mlのポリプレン (臭化へキサジメトリン、 Sigma社)を添加して 20倍希釈した上清を用 い、推定多重感染度 0. 3にて 3T3L1脂肪細胞を感染させた。
[0049] 8. プラスミド
アディポネクチンプロモータの 1367bp ( 1367力ら + 35 ;配列番号： 4)、 527bp ( 527力ら + 35)、 217bp (— 217力ら + 35)及び 127bp (— 127力ら + 35)のフラグ メントを有するルシフェラーゼ遺伝子構成体（それぞれ、「pAdiponectinl367-Luc」、 「 pAdiponectin527- Luc」、「pAdiponectin217- Luc」及び「pAdiponectinl27- Luc」 ) pGL2ベーシック又は pGL2プロモータベクター（Promega社）内にサブクローユングし た。
[0050] 9. 哺乳動物細胞での発現
pCDNA3. 1の EcoRl/Not部位に結合することによって、 KLF3又は KLF9発現べ クタ一を構成した。 293T又は 3T3L1脂肪細胞への DNAトランスフエクシヨンは「 Lipofectamine PLUS」（Gibco BRL)を用いたリポフエクシヨン法によって実施した。
[0051] 10. 3T3L1細胞による研究
3T3L1細胞を 10%ゥシ胎児血清とともに DMEM中で培養し、すでに報告されて いる方法に従って（Yamauchi, T. et al. , Nat. Genet. 30, 221-226 (2002).)、脂肪合 成性細胞への分化誘導を行った。簡略的に説明すると、先ず、 3T3L1細胞を培養し 、密集するまで増殖させた。 2日後、培地を標準分化誘導培地 (0. 5mMIBMX、 1 μ MDEX、 5 μ g/mlのインスリン、 10%FBS、 50単位 Zmlのペニシリン及び 50 μ g/ml のストレプトマイシン含有）に交換し、一両日ごとに培地交換を行った。既知の方法で グルコース摂取を決定した（Yamauchi, T. et al., Nat. Med. 8, 1288-1295 (2002).)。 細胞溶解物を抽出し、その TG含量を、既知の方法 (Yamauchi, T. et al., Nat. Med. 7, 941-946 (2001).)で決定した。 [0052] 11. RNA干渉
相補的な一本鎖 RNAをそれぞれィ匕学的に合成し、互いにアニーリングして siRNA を調整した。 60〜70%程度まで密集した 3T3L1脂肪細胞に Lipofectamine PLUS ( Life Technology)を用いて siRNAを導入した（Yamauchi, T. et al.， Nature 423, 762-769 (2003).) oこれら KLF9及び KLF3に対する siRNA配列は、それぞれ予め その導入により KLF9および KLF3の発現を抑制し得ることが確認できているものを用 いた。 siRNAのトランスフエクシヨン 72、 96時間後に、細胞を溶解して発現産物等の 解析を行った。
[0053] 12. リアルタイム PCRによる転写体のノーザンブロット分析及び定量的分析
細胞又は組織からのトータル RNAの調製は、 TRIzol (Gibco/BRL)を用い、製造者 のインストラクションに従って行った。ノーザンブロット分析のために、各群のトータル RNAを等量づっ分取し、これらをプールして（総量 10 μ g)、ホルマリン変性ァガロー ス電気泳動にかけた。泳動後、ナイロン膜（Hybond N ;Amersham Pharmacia Biotech )に転写した。フィルタ一は、マウス KLF9及びマウス KLF3cDNAを [32P] dCTPで 標識ィ匕した cDNAプローブそれぞれとハイブリダィズさせた。得られたバンドを BAStationソフトウェア付きの BAS2000フィルター（富士写真フィルム）に感光させ視 覚化した。 mRNAの定量は、リアルタイム PCR法により実施した（Yamauchi, T. et al.， Nature 423, 762-769 (2003).)。プライマーセット及びプローブは、ソフトウェア「 Primer Express 1.5a」を用いて設十し、 ABI (ABI Prism； Perkin- Elmer Applied Biosytems, Foster City, California)から購入した。相対的な量は同じ cDNA中のァク チン転写物の量で標準化した（Yamauchi, T. et al.， Nature 423, 762-769 (2003).)。
[0054] 13. 核抽出物の調製及び免疫プロット分析
既知の方法に従って（Almoguera, C. et al.， J. Biol. Chem. 277, 43866-43872 (2002).)、核抽出物を調製した。核タンパク質（30 μ g)のサンプルは、 KLF9 (Zhang, D. et al, Endocrinology 143, 62-73 (2002).)又は KLF3 (Crossley, M. et al, Mol. Cell Biol. 16, 1695-1705 (1996).)に対するゥサギ免疫グロブリン G (IgG)、次いで、 セィヨウヮサビペルォキシダーゼ結合マウス又はゥサギ IgG及び ECLキット（
Amersham Pharmacia Biotech)による免疫ブロット法により解析された。 [0055] 14. 染色質免疫沈降アツセィ
休止状態の 3T3L1脂肪細胞を 1%ホルムアルデヒド中で固定ィ匕した。固定化され た染色体サンプルは既知の免疫沈降法（Shindo, T. et al.， Nat. Med. 8, 856-863 (2002).)に多少の変更を加えた方法で解析した。沈降物を回収するためにプロティ ン A (Upstate)を用いた。
[0056] 15.抗酸化活性の測定
カイマン化学抗酸化性解析（Cayman Chemical Antioxidant Assay)を血漿（plasma) 、血清、尿、便あるいは細胞溶解物のトータル抗酸ィ匕能を測定するために使用した。 水溶性および脂溶性抗酸化剤はこのプロトコールで分けることができな 、。そのため 、ビタミン、タンパク質、脂質、ダルタチオン、尿酸などを含む成分全てを組合わせた 抗酸化活性が分析される。解析は、試料中の抗酸化剤カ^トミオグロビン（ metmyoglobin)に る ABT¾ (2,2'— Azino— di— [3— ethylbenzthiazoline sulphonatej)力ら ABTSR'+への酸ィ匕を阻害する活性を測定することに基づいている。試料の量は、その 濃度に従い 750nmにおける吸収阻害を誘導する。試料中における ABTSの酸ィ匕を阻 害し得る抗酸化活性は、水溶性トコフエロール類似体である Troloxの抗酸ィ匕活性と 対比し、ミリモル濃度の Trolox,で標準化することより定量ィ匕する。
[0057] 〔実施例 1〕アディポネクチン mRNAレベルは、肥大した 3T3L1脂肪細胞で低下して いる
アディポネクチン mRNAレベルは、肥満症で低下しており、それが、肥満症関連ィ ンスリン抵抗性の発達の原因となる役割を果たすことが報告されている。本発明の課 題は、肥満症におけるアディポネクチン発現の低下の原因となる、転写因子を単離 することである。この課題に検討するために、 in vitroでの肥大脂肪細胞モデルを用 Vヽ、脂肪細胞肥大化がアディポネクチン遺伝子の発現に与える影響を解析した。 興味深いことに、脂肪細胞分化の誘導 19日後（第 19日）の 3T3L1の脂肪細胞は、 トリグリセリド含量が増大し（図 la)、インスリンに応答してグルコース摂取の低下のよう なインスリン抵抗性を示し（図 lb)、レジスチンのようなアディボカインを誘導する一層 高度なインスリン抵抗性を発現し（図 lc)、さらには、脂肪細胞分化の誘導 10日後（ 第 10日）の 3T3L1脂肪細胞と比較して、アディポネクチン mRNA発現が低下する（ 図 lc)ことが見出された。 mRNAレベルで観察された変化と同様に、脂肪細胞肥大 はアディポネクチンのタンパク発現レベルも低下して 、た (データ示されず)。これらよ り肥大脂肪細胞におけるアディポネクチン遺伝子の発現低下の原因は、転写レベル の低下であることを示唆する。
[0058] 〔実施例 2〕肥大脂肪細胞で低下したアディポネクチンの発現の原因には、 TNF a以 外のシグナル伝達経路が関与する
以前のアディポネクチン遺伝子の 5，フランキング領域のプロモータ分析によって、 脂肪細胞特異的な発現を誘導する CZEBP転写因子が特定された (Schaffler, A. et al, Biochim. Biophys. Acta. 1399, 187—197 (1998).、 Saito, K. et al, Biol. Pharm. Bull. 22, 1158-1162 (1999).)。しかし、肥満症で観察される肥大脂肪細胞におけるァ ディポネクチン発現低下を決定づける上流因子がどこにあるかは、同定されて ヽな ヽ 。興味深いことに、ルシフェラーゼ遺伝子に連結させたアディポネクチンプロモータ 領域の— 1367から + 35までを含む領域のプロモータ活性は、前駆脂肪細胞 (第 0 日）又は大型脂肪細胞 (第 19日）と比較して、小型の脂肪細胞 (第 10日）の方が高く (図 2a)、それはアディポネクチンの発現レベルと相関した。
アディポネクチン発現を低下させることが示されている TNF aは肥大脂肪細胞で 増加する。そのため、 TNF o;が肥大脂肪細胞におけるアディポネクチンの発現を低 下させる原因因子であるとの予測は合理的である（Barth, N. et al., Diabetologia 45, 1425-1433 (2002).) 0
小型脂肪細胞 (第 10日）を TNF aとともにインキュベーションすることは、実際に、 アディポネクチン遺伝子のプロモータ活性を低下させた（図 2b)。しかし、 TNF o;を 抗体により中和した場合の効果は、肥大脂肪細胞 (第 19日）で低下したアディポネク チン遺伝子のプロモータ活性に対して何ら影響を与えな力つた（図 2c)。これらデー タは、肥大脂肪細胞におけるアディポネクチン発現の低下の原因となるシグナル伝 達経路として、 TNF a以外が存在し得ることを示唆した。
[0059] 〔実施例 3〕肥大脂肪細胞は、近位 32bpプロモータエレメントを通じてアディポネクチ ンプロモータを調節して 、る 肥大脂肪細胞におけるアディポネクチン遺伝子の不応答性に関与するプロモータ 領域を特定するために、ファンクショナル 5'デイリーシヨン解析を実施した。これまで の研究で— 1367から— 217領域の欠損は、第 19日目の 3T3L1脂肪細胞における アディポネクチンプロモータ活性に対して実質的に影響しないことが明らかにされた（ 図 3a)。対照的に、第 19日目の 3T3L1脂肪細胞において、さらに 90ヌクレオチドを 欠質させると、アディポネクチンプロモータ活性が回復した。このことから— 217Z— 127に必須の調節エレメントが含まれることが示唆された。
転写因子が結合するエレメントを同定するために、 EMSAを用いて、ファンクショナ ル 5，デイリーシヨン解析を更に実施した。 EMSAを用いた 217/— 127プロモー タ領域の解析において、第 19日の 3T3L1脂肪細胞よりも第 10日目の 3T3L1脂肪 細胞で一つの主要な複合体がこのエレメントに多く結合することが示された（図 3b)。 — 217から— 189領域の欠失は、第 10日目の 3T3L1脂肪細胞由来の核抽出物中 の結合タンパク質の量に実質的に影響しな力つた（図 3b)。対照的に、さらに 32ヌク レオチドを欠質させると、第 10日目の 3T3L1脂肪細胞内での結合タンパク質の量を 顕著に減少させ（図 3b)、—188Z— 157が必須結合エレメントを含むことを示唆し た。重要なことに、 32bpのエレメント（― 188Z— 157)に結合した主要複合体は、瘦 せた対照の C57B6マウスおよび第 10日の 3T3L1脂肪細胞よりも、肥満モデルであ る obZobマウスおよび第 19日目の 3T3L1脂肪細胞では少な力つた（図 3c)。
このプロモータ領域のェンハンサー特性を詳細に調べるために、このエレメントをプ 口モータ系に組み込み、機能解析を行った（図 3d)。この— 188Z— 157エレメントの 存在は、第 10日目の 3T3L1脂肪細胞では、対照である pGL-2-tk-Lucベクターのみ と比較して基底転写活性を 5倍上昇させたが、第 19日目の細胞では同様の上昇は 観察されなかった（図 3d)。
〔実施例 4〕 32bpエレメント結合タンパク質の酵母 one-hybridクローユング
肥大脂肪細胞にぉ 、てアディポネクチン遺伝子プロモータの下方調節して 、るトラ ンス因子を単離するために、酵母 one-hybridクローユングアプローチを用いた（ Almoguera, C. et al, J. Biol. Chem. 277, 43866-43872 (2002).) 0 32bpをバイトとし て用いた。この配列を三量体ィ匕して HIS3レポーター遺伝子の上流に組み込み、酵母 細胞に導入して（32bp) x3：： HIS3リポーター酵母株を作成した。 22の陽性コロニーを得た。これらクローンは、異なる群が含まれていた。ヌクレオチ ド及び推定アミノ酸の配列から、二つの群に分けられた。一つの群は、 10個の独立し た cDNA単離体と 2個の独立した cDNA単離体とでそれぞれ、クルツペル様転写因 子（KLF)ファミリー（Shindo, T. et al, Nat. Med. 8, 856-863 (2002).、 Morita, M. et al, Mol. Cell. Biol. 23, 2489-2500 (2003).) 3及び 9に属する転写因子をコードして いた。他の一群は、 4個の独立した cDNA単離体によるもので、転写因子である NF - κ Bp65 (Suzawa, M. et al. , Nat. Cell Biol. 5, 224-230 (2003).)をコードしている。 〔実施例 5〕EMSAにより、 32bpの結合複合体は、 KLF9を含むことが in vitro及び in vivoで明らかにされた
32bpに結合する核内因子を更に特定するために、 KLF3、 KLF9又は NF— κ Bp 65を認識する特異的な抗体を用いて、 EMSA超シフト実験を実施した。これらの研 究で、 3T3L1脂肪細胞 (第 10日）内で複合体 Iが、 KLF9タンパク質を含むことが特 定された（図 4a右、レーン 1及び 2)。対照的に、 KLF3 (図 4b)はもとより NF— κ Bp6 5 (図 4a右、レーン 1及び 3)も、 in vitroでは小型脂肪細胞内では検出されな力つた。 対照 EMSAでは、 293T細胞の核抽出物をプローブである標識 KLF9コンセンサス 部位とともに用いることにより、 KLF9抗体の特異性が確認された（図 4c)。 KLF3抗 体（図 4b左）又は NF— κ Βρ65抗体（図 4a左）の機能は、コグネイトタンパク質である 核抽出物を発現する 293Tを、それぞれ、放射性標識プローブとして KLF3コンセン サス部位又は NF— κ Bコンセンサス部位 (p65部位）とともに用いたスーパーシフト アツセィにより確認された。重要なことに、 KLF9抗体は 32bp結合タンパク質の量を 減少させ（図 4d)、 in vivoでも 32bp結合タンパク質 (複合体）に KLF9が含まれること を示唆した。
これらの結果を確認するために、 EMSA競合解析を実施した。複合体 Iは、過剰量 の KLF共通配列である BTEによって完全に競合阻害されることが見出された。（デ ータ示されず)。対照的に、 NF - κ B共通配列は、明らかに、効果的ではな力つた（ データ示されず)。
これらの知見を更に確認するために、染色対免疫沈降アツセィを実施した。 KLF9 は、実際に、 32bp部位を含む内在性アディポネクチンプロモータ領域に結合するこ とが見出された（図 4e)。さらに、精製した KLF9によっても、脂肪細胞又は脂肪組織 力も調製した核抽出物による 32bpフラグメントの阻害とほぼ同じ阻害が見られた（図 4 f) o
[0062] 〔実施例 6〕KLF9の発現は脂肪細胞の分ィ匕に従い増大し、一方、脂肪細胞の肥大 に従い低下した
次に、脂肪細胞の分化の過程、及び脂肪細胞の肥大化の過程における KLF3及 び 9の発現を調べた。 KLF9の発現は、脂肪細胞の分ィ匕の過程で増大したが、脂肪 細胞の肥大の過程では逆に低下した（図 5a、下)。対照的に、 KLF3の発現レベル は、脂肪細胞の分化と肥大との双方の過程で低下した（図 5a、上)。さらに、 KLF9の mRNAレベル（図 5a)及びタンパク質レベル（図 5b)は肥満した obZobマウスよりも、 痩せた対照 C57BL6マウスで高力つた。この結果は 32bp結合タンパク質の量と相関 すると予想され、 KLF9の発現レベルがアディポネクチンのプロモータ活性、及びァ ディポネクチンの発現レベルを調節し得るという可能性が強く示唆された。
[0063] 〔実施例 7〕KLF9の発現は、ェンハンサー及びアディポネクチンプロモータ活性、 32 bp結合タンパク質の量、並びにアディポネクチン発現を増大させた
3T3L1脂肪細胞 (第 19日）（図 6a〜c)又はレトロウイルスを用いて 3T3L1脂肪細 胞 (第 19日）内で（図 6d〜； f)、 KLF9を一過的に過剰発現させ、ェンハンサー活性、 アディポネクチンプロモータ活性、 32bp結合タンパク質量、およびアディポネクチン 発現量を解析した（図 6)。 3T3L1脂肪細胞 (第 19日）での KLF9の過剰発現は、ァ ディポネクチンプロモータ活性（— 1367Z + 35) (図 6a)、 32bp (— 188Z—157) ェンノヽンサ一活性（図 6c右パネル)及び 32bp結合タンパク質の量（図 6e)を増大させ た。 KLF9は、アディポネクチンプロモータ活性を増大し得ること（図 6a)及び 32bpェ レメントが KLF9に高い反応性を有すること（図 6c、 e)を立証した。
さらに、 3T3L1脂肪細胞内でのレトロウイルスによる KLF9の定常的な過剰発現（ 図 6d)は、アディポネクチン発現を増大させた（図 6f)。これらのデータは、 3T3L1脂 肪細胞（第 19日）における KLF9の過剰発現力 32bp結合タンパク質の量、 32bpェ ンハンサー活性、アディポネクチンプロモータ活性及びアディポネクチン発現を 3T3 L1脂肪細胞 (第 10日）で観察されたレベルまで回復できることを示唆した。 [0064] 〔実施例 8〕siRNAによる KLF9発現の抑制は、 32bp結合タンパク質の量及びアディ ポネクチン発現を in vitroで低下させた
次に、アディポネクチン発現に対する KLF9の機能的重要性を調べるために、 KL F9発現を低下させた際の効果を検討した。 KLF9発現抑制の手法として、 siRNA( Miyagishi, M. & Taira, K. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).)を用いた。 siRNA による KLF9発現の抑制（図 7a)は、 KLF3発現には大きな影響はな力つた（図 7a)。 一方、 32bp結合タンパク質の発現レベルは、 KLF9発現抑制により、顕著に低下し（ 7b)、これと同時に、 3T3L1脂肪細胞 (第 10日）におけるアディポネクチン発現を大 幅に低下させた（図 7a)。これらのデータは、 KLF9が 32bpェンハンサー結合タンパ ク質複合体の形成及びアディポネクチン発現に必要であることを示す。
[0065] 〔実施例 9〕遺伝子ターゲテイングによる KLF9発現の破壊は、 32bp結合タンパク質 の量及び血漿アディポネクチンレベルを in vivoで低下させた
次に、 in vivoでのアディポネクチン発現と KLF9との機能的関連性を調べるために 、 KLF9ノックアウトマウスの表現型を解析した（図 8a) (Morita, M. et al.， Mol. Cell. Biol. 23, 2489-2500 (2003).)。興味深いことに、 32bp結合タンパク質は、 KLF9ノック アウトマウス「WAT」由来の核抽出物中には検出されなかった（図 8b)。重要なことに 、KLF9ノックアウトマウスの体重は対照の野生型同腹仔よりも少なかったにもかかわ らず、 KLF9ノックアウトマウスの血漿アディポネクチンレベルは対照の野生型同腹仔 よりも低力つた（図 c)。対照的に、 KLF3ノックアウトマウスとその対照の野生型同腹 仔との間では、血漿アディポネクチンレベルの差は無かった（データ示されず)。これ らのデータは、 KLF9が in vivoでアディポネクチンレベルの調節に重要な役割を果た すことを示唆した。
[0066] 〔実施例 10〕脂肪細胞の肥大化が脂肪細胞における KLF9発現を調節する機序 次に、脂肪細胞の肥大化が脂肪細胞における KLF9発現を調節する機序であるか 否かを解析した。 KLF9発現は、エネルギー消費に関与することが知られている甲状 腺ホルモンにより誘導されると報告されている（Morita, M. et al.， Mol. Cell. Biol. 23, 2489-2500 (2003).)。そのため、先ず甲状腺ホルモンレセプター αの発現を in vitro 及び in vivoで調べた。興味深いことに、甲状腺ホルモンレセプター αの発現レベル は、 3T3L1大型脂肪細胞 (第 19日）又は肥満モデル obZobマウスでは、それぞれ、 3T3L1小型脂肪細胞 (第 10日）又は痩せた対照の C57BL6マウスと比較すると低 下していた（図 9a、 b)。その上、甲状腺ホルモンと 3T3L1脂肪細胞 (第 19日）とのィ ンキュベーシヨンは、 KLF9発現を増大させた（図 9c)。
KLF9プロモータが AP— 1部位を含むと報告されている（Chen, A. et al.， Mol. Cell. Biol. 20, 2818-2826 (2000).)ことから、酸化ストレスが脂肪細胞肥大による KLF 9の発現制御に関与し得るとの仮説を立てた。興味深いことに、 c junN末端キナー ゼ (JNK) /ストレス活性化タンパク質キナーゼ（SAPK)のインヒビターは、また抗酸 化性 N ァセチルシスティン（NAC)とともに、 KLF9 (図 9d)と同時にアディポネクチ ン（9e)の発現を増大させた。これらの発現増大には甲状腺ホルモンレセプター aの 関与はな力つた (データ示されず)。これらのデータは、 KLF9発現を増大させる上流 の機序が、少なくとも部分的には、二つの経路（一方は、甲状腺ホルモンレセプター（ TR) αシグナル伝達経路であり、他方は、 TR o;の発現とは無関係である力 酸化ス トレスに依存する）力もなる可能性があることが示唆された。
[0067] 上記仮説をさらに確認するために、脂肪細胞の肥大化過程における酸化ストレスの 推移を測定した。 3T3— L1細胞 (第 10日目および第 18日目）から抽出したゲノム DNAを分解し、ゲノム DNA分解産物中に存在する 8-OHdG (dGの酸化型）の量を特 異抗体による ELISAによって測定した。 8-OHdGの量は分ィ匕に伴 、増加して 、た（図 10)。肥大化に伴う 8-OHdGの増加の原因を解析するために、脂肪細胞肥大化に伴 ぅ抗酸化活性の推移を調べた。抗酸化活性は、 3T3- L1細胞 (第 10日目および第 18 日目）の融解物中における、メトミオグロブンによる ABITのラジカルィ匕を防ぐ活性とし て検出した。脂肪細胞の肥大化に伴い抗酸ィ匕活性が低下することが示された（図 11
) o
産業上の利用可能性
[0068] KLF9の分子的特定は、肥満症及び糖尿病ゃァテローム性硬化症のような肥満症 関連疾患におけるアディポネクチン ZAcrp30の下向調節の分子的機序の理解と、 KLF9を分子的標的とする新規な抗糖尿病及び抗ァテローム性硬化症薬の設計を 促進するはずである。

Claims

請求の範囲 [1] 下記（1)または（2)記載のタンパク質を含有する、アディポネクチン発現誘導剤。
(1)配列番号： 2記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質
(2)配列番号： 2記載のアミノ酸配列において、一以上のアミノ酸の欠失、置換、付カロ または挿入を有するアミノ酸配列力 なるタンパク質
[2] 下記（1)または（2)記載の DNAまたは該 DNAを保持したベクターを含有する、アディ ポネクチン発現誘導剤。
(a)配列番号： 1記載の塩基配列を有する DNA
(b)配列番号： 1記載の塩基配列とストリンジヱントな条件でノ、イブリダィズする DNA。
[3] 請求項 1または 2に記載のアディポネクチン発現誘導剤を有効成分とする、代謝性疾 患または心疾患の予防 ·治療用医薬糸且成物。
[4] 下記（1)または（2)力もなるェンノヽンサ一エレメントを少なくとも備えたレポーター遺 伝子を保持した、アディポネクチン発現誘導物質のスクリ一二ング用細胞。
(1)配列番号： 5記載の塩基配列力 なる DNA
(2)配列番号 : 5記載の塩基配列において、 1塩基以上の欠失、付加、置換または挿 入を有する塩基配列からなる DNA
[5] さらに KLF9をコードした DNAを保持した、請求項 4記載の細胞。
[6] 脂肪細胞である、請求項 4または 5記載の細胞。
[7] 肥大脂肪細胞である、請求項 4または 5記載の細胞。
[8] 下記（1)から（3)の工程を含む、アディポネクチン発現誘導物質のスクリーニング方 法。
( 1 )請求項 4記載の細胞に被検物質を作用させる工程
(2)レポーター遺伝子の発現を検出する工程
(3)被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の 場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
[9] 下記（1)から（3)の工程を含む、アディポネクチンの発現の誘導をし得る物質のスクリ 一ユング方法。
( 1 )請求項 5記載の細胞に被検物質を作用させる工程 (2)レポーター遺伝子の発現を検出する工程
(3)被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の 場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
[10] 下記（1)から（3)の工程を含む、肥満症またはこれに関連する疾患の予防，治療用 薬剤のスクリーニング方法。
( 1 )請求項 4記載の細胞に被検物質を作用させる工程
(2)レポーター遺伝子の発現を検出する工程
(3)被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の 場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
[11] 下記（1)から（3)の工程を含む、肥満症またはこれに関連する疾患の予防，治療用 薬剤のスクリーニング方法。
( 1 )請求項 5記載の細胞に被検物質を作用させる工程
(2)レポーター遺伝子の発現を検出する工程
(3)被検物質を作用させた場合のレポーター遺伝子の発現が、被検物質非作用の 場合のレポーター遺伝子の発現より高い被検物質を選択する工程
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