WO2005093412A1 - ポリアミン、アクロレインの含有量又はポリアミンオキシダーゼ活性又はその蛋白質量を指標とした脳卒中・無症候性脳梗塞の診断方法 - Google Patents

ポリアミン、アクロレインの含有量又はポリアミンオキシダーゼ活性又はその蛋白質量を指標とした脳卒中・無症候性脳梗塞の診断方法 Download PDF

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Kazuei Igarashi
Shiro Ueda
Naokatsu Saeki
Keiko Kashiwagi
Hideyuki Tomitori
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Fuence Co., Ltd.
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    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2871—Cerebrovascular disorders, e.g. stroke, cerebral infarct, cerebral haemorrhage, transient ischemic event

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing stroke and asymptomatic cerebral infarction using the content of polyamine and acrolein, the activity of polyamine oxidase or the amount of protein thereof as an index. Further, the present invention relates to a polyamine, acrolein content or polyamine oxidase solution.
  • the present invention relates to a method for screening stroke / asymptomatic cerebral infarction patients using the activity or the amount of protein as an index.
  • Cerebrovascular disease is the second leading cause of death following malignant neoplasms and heart disease. The number of deaths per year is nearly 10 times that of kidney disease, and the sequelae after illness are extremely large in daily life, including paralysis and immobility. Cause trouble. Stroke, which accounts for the majority of cerebrovascular diseases, is a disease that is difficult to detect and treat early. In most cases, asymptomatic cerebral infarction without subjective symptoms is accidentally detected by diagnostic imaging, and there is no diagnostic tool used for blood and urine tests. . Therefore, development of a simple and highly accurate diagnosis method that does not require expensive equipment such as image diagnosis is desired.
  • polyamine is a biological amine commonly found in a living body, and is represented by spermine, spermidine, spermine and the like. These polyamines are present in cells at high concentrations (on the order of mM) and act as cell growth factors by interacting with nucleic acids in vivo.
  • polyamines are considered to be one of the causative agents of urinary toxins due to the accumulation of polyamines in the plasma of patients with chronic renal failure. Moreover, it is said that it is difficult to sufficiently remove this polyamine by dialysis. Therefore, elucidating the nature of the toxicity induced by polyamines will lead to the development of more effective treatments for uremia.
  • an object of the present invention is to examine whether the content of polyamine or lactolein in a living body changes quantitatively in a cerebrovascular disease such as a stroke.
  • the present invention provides a diagnostic method for detecting and predicting stroke, asymptomatic cerebral infarction.
  • stroke and asymptomatic cerebral infarction can be predicted and detected by measuring the amount of acrolein, the amount of polyamine oxidase activity or the amount of polyamine oxidase protein and the amount of polyamine in plasma.
  • the present invention provides a method for diagnosing stroke, asymptomatic cerebral infarction, It is intended to provide a method for screening asymptomatic cerebral infarction patients.
  • the finding of the present invention is to prevent stroke and asymptomatic cerebral infarction by inhibiting the pathway of producing acrolein from in vivo polyamine by oxidative deamination via polyaminooxidase, and to promote the progression of pathology. It indicates the possibility that it can be stopped.
  • the findings of the present invention also suggest the possibility of obtaining a therapeutic agent for stroke and asymptomatic cerebral infarction by searching for compounds that inhibit polyamine oxidase. It is considered possible.
  • FIG. 1 is a graph comparing the amount of FDP-lysine in plasma between the cerebral infarction / cerebral hemorrhage group, the healthy group, and other brain disease groups.
  • Fig. 2 shows the plasma polyamine oxidase activity in the cerebral infarction It is the graph compared between the normal person group and the other brain disease group.
  • FIG. 3 is a photograph showing the result of analyzing a cross-sectional image of the head by MRI.
  • Fig. 4 is a photograph in which the change over time in the cross-sectional image analysis of the head was examined by MRI and CT.
  • acrolein generated by oxidative degradation of polyamine is abundant in the serum of patients with cerebral infarction and intracerebral hemorrhage.
  • plasma acrolein content, polyamine content, and increased polyamine oxidase activity can be used to predict cerebral infarction and cerebral bleeding.
  • the present invention relates to a method of obtaining a biological sample from a subject, determining the content of the polyamine in the sample or the content of the aldehyde compound formed from the polyamine, or the polyamine oxidase activity in the sample. Alternatively, the amount of protein of polyamine oxidase is measured, and a stroke / asymptomatic cerebral infarction is diagnosed using the measured value as an index.
  • the present invention provides a method for obtaining a biological sample from a subject, wherein the content of the polyamine in the sample or the content of the aldehyde formed from the polyamine, or the activity of the polyamine oxidase or the polyamine oxidase in the sample is determined. This is a method of measuring protein content and screening patients with stroke / asymptomatic cerebral infarction using the obtained measured value as an index.
  • a biological sample to be used for measurement is first collected from a subject.
  • the biological sample used in the present invention is preferably the plasma used in the following examples.
  • other biological samples can be used as appropriate, and such other biological samples include, for example, urine, saliva, cerebrospinal fluid, and bone marrow fluid.
  • polyamine means a linear aliphatic hydrocarbon having two or more primary amino groups.
  • Known biological polyamines include putretsin, cadaverine, sunoremidine, sunoremine, 1.3 diaminopronon, calgin, homospermidine, 3-aminomin pill force daverine, norspermine, Examples include, but are not limited to, thermospermine and cardopentamine.
  • preferred polyamines are putretinsin, sple / midine, and spunolemin.
  • polyamine oxidase is an enzyme involved in the oxidation of polyamine.
  • polyamine oxidase means an enzyme that generates hydrogen peroxide by oxidizing diamine or polyamine as a good substrate.
  • Polyamines undergo oxidative deamination with polyamine oxidase, resulting in the formation of aldehydes such as acrolein.
  • the preferred aldehyde compound in the present invention is acrolein, but is not limited thereto.
  • the acrolein content in plasma can be identified by measuring the content of acrolein-added amino acid FDP-lysine (N-formylpiperidino lysine).
  • the content of FDP-lysine can be measured, for example, using ACR-LYSINEADDUCT ELISA SYSTEM (Nippon Yushi Co., Ltd.) according to the attached manual.
  • the acrolein content can be measured in the form of a derivative other than FDP-lysine. It is also possible to directly measure the acrolein content, and such a method is described, for example, in the report of Alarcon et al. (Alarcon RA (1968) Anal. Chem. 40, 1704-1708).
  • acrolein has high reactivity with other molecules, and thus has a problem that the amount of acrolein present in the blood in a free form is small. Therefore, considering that it is easy to measure in the form of FDP-lysine, it is a preferable embodiment to measure acrolein in the form of FDP-lysine in the present invention.
  • patient serum and a standard solution are dispensed into an antigen-fixed plate at 50 ⁇ l / well, and the primary reaction antibody solution is added in the same amount.
  • the primary reaction antibody solution is added in the same amount.
  • remove the solution wash with washing solution, and dispense the secondary reaction antibody solution at 100 ⁇ l / well.
  • wash with washing solution add coloring solution, and let stand at room temperature for 15 minutes to develop color.
  • the amount of plasma Is expressed as the FDP-lysine content per milliliter of patient serum (nmol / ml plasma).
  • the activity of polyamine oxidase was measured, for example, by using lOmM-Tris hydrochloride (pH 7.5), 0.2 mM substrate (spermine, spermidine and peptrescine) and 0.03 ml of patient serum, as shown in the examples below.
  • the reaction can be carried out by incubating 0.15 ml of the reaction mixture at 37 ° C. for 48 hours. To a 0.02 ml reaction mixture, add 5% final concentration of tricloacetic acid (TCA) and centrifuge. A part of the obtained supernatant is used for polyamine assay.
  • Amoxidase activity can be expressed as the amount of spermidine produced by spermine degradation per ml of patient serum (nmol / ml plasma / 48h).
  • the protein content of polyamine oxidase can be measured by, for example, enzyme immunoassay (ELISA) using an antibody specific to polyamine oxidase, Western blotting analysis, immunoprecipitation, or the like.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • Such a technique is a general technique known in the art, and a person skilled in the art can measure the protein content of the enzyme by the above-described technique under appropriate conditions.
  • the antibodies against polyamine oxidase used in these measurements may be either monoclonal antibodies or polyclonal antibodies.
  • a polyclonal antibody against polyamine oxidase can be obtained, for example, by immunizing a heron with a peptide fragment of polyamine oxidase using a conventional peptide antibody preparation technique. It can be obtained by breeding. The production of the peptide antibody can be confirmed by collecting blood from the rabbit that has been injected with the peptide, measuring the antibody titer, and performing a force assay to ensure that the antibody has a sufficient titer. Can be. Techniques for producing peptide antibodies are also described in various experimental books and are well known to those skilled in the art. Thus, various modifications are performed based on the descriptions to obtain polyamine oxidase antibodies. be able to.
  • the content of polyamine in the sample can be determined by high performance liquid chromatography (HPLC). For example, when a polyamine column commercially available from T0S0 is used, retention times (retention times) of polyamines (putretinsin, spermidine, spermine) by HPLC are 7 minutes, 12 minutes, and 25 minutes, respectively.
  • the amount of polyamine can be expressed as the amount of putrescine, spermidine and ⁇ spermine (nmol / ml plasma) contained in 1 ml of patient serum.
  • other ordinary amino acid columns can also be used as appropriate.
  • MR I magnetic resonance imaging
  • the above-mentioned measured values are used as an index for the stroke.
  • ⁇ Asymptomatic cerebral infarction can be diagnosed.
  • patients with stroke / asymptomatic cerebral infarction can be screened using the above measured values as indices. For example, the average value and the variance of the above-mentioned measured values of the healthy subject group are statistically analyzed, and the upper limit of the normal value in the above measured values is set.
  • the findings of the present invention show that the prevention of stroke and the progression of pathological conditions can be prevented by inhibiting the production of lactolein in the living body by inhibiting the activity of polyamine oxidase in plasma. It also suggests the possibilities. Thus, the present invention offers the possibility to open up new ways for treating stroke.
  • a candidate compound that may be effective for treating stroke is administered to an experimental animal, and whether the compound has an activity of inhibiting polyamine oxidase in plasma in the experimental animal is determined. It is possible to search for new drugs that are effective for treatment. Thus, the present invention also provides a new way to search for new drugs that are effective in treating stroke.
  • Example 1 Comparative study of plasma acrolein content in cerebral infarction patients
  • the plasma acrolein content in patients with brain disease was studied.
  • the acrolein content of the collected blood was compared in three groups: healthy subjects, cerebral infarction / intracerebral hemorrhage group, and other brain disease groups.
  • the amount of acrolein in plasma was identified by measuring the content of FDP-lysine (N-formylpiperidino lysine), which is an amino acid added to acrolein. The measurement was performed using ACR-LYSINE ADDUCTELISA SYSTEM (Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) according to the attached manual. The patient's serum and standard solution were dispensed into the antigen-fixed plate at 50 ⁇ l / well, and the same amount of the primary reaction antibody solution was added. After allowing to stand at room temperature for 30 minutes, the solution was removed, washed with a washing solution, a coloring solution was added, and the color was developed by allowing to stand at room temperature for 15 minutes. The absorbance at 450 nm was measured using a plate reader. The amount of acrolein in plasma was represented by the content of FDP-lysine per ml of patient serum (nmol / ml plasma).
  • the amount of FDP-lysine which reflects the amount of plasma urea, is highest in patients with cerebral infarction and intracerebral hemorrhage among the above three groups, and is significantly increased compared to the other groups. It was. Compared to the plasma acrolein level in patients with chronic renal failure,
  • FDP-lysine levels were found to be elevated to levels comparable to those in renal failure patients.
  • Example 2 Comparative study of plasma amoxidase activity in patients with cerebral infarction
  • the polyamine oxidase activity in the patient's plasma used in Example 1 was measured.
  • Figure 2 shows the results.
  • the activity of polyamine oxidase in plasma is determined by the substrate of lOraM-Tris hydrochloride (pH 7.5, 0.2 ⁇ ) ⁇ (spermine, spermidine and putrescine) and a reaction mixture of 0.03 ml of patient serum. The measurement was performed by incubating 15 ml at 37 ° C for 48 hours. Tricloacetic acid (TCA) at a final concentration of 5% was added to 0.02 ml of the reaction mixture, followed by centrifugation. A part of the obtained supernatant was used for a polyamine assay. Amino oxidase activity was expressed as the amount of spermidine produced by spermin degradation per 1 ml of patient serum (nmol / ml plasma / 48h).
  • the polyamine oxidase activity in the plasma of the cerebral infarction and intracerebral hemorrhage group was significantly increased as compared with the healthy group and other brain disease groups. This result was correlated with the amount of acrolein in plasma examined comparatively in Example 1.
  • Example 3 Magnetic resonance rooster diagnostic imaging (MRI) for cross-sectional image analysis of the head
  • Example 4 Comparative study of changes in head cross-sectional images, plasma polyamine oxidase activity, and lactolein content in patients with acute cerebral infarction
  • the plasma polyamine oxidase activity was about twice as high as that of the healthy group and was significantly higher.
  • a cross-sectional image of the head (MRI) on day 2 of the onset and a cross-sectional image of the head one week later (CT) showed a clear infarct image in the left temporal lobe.
  • the plasma polyamine oxidase activity and FDP-Lys content were 7.2 nmol SPD increase / ml plasma and 23. Onmol / ml plasma, respectively.
  • a significant increase in plasma acrolein content was observed along with an increase in plasma polyamine oxidase activity.
  • an increase in plasma polyamine oxidase activity occurs prior to the appearance of an infarct image on MRI or CT.
  • the method of the present invention which comprises measuring the acrolein content, polyamine content, or polyamine oxidase activity or polyamine oxidase protein content in plasma, is useful for the diagnosis of stroke, asymptomatic cerebral infarction, and stroke. Useful for screening patients with asymptomatic cerebral infarction. Further, by utilizing the findings of the present invention, it is possible to prevent stroke and asymptomatic cerebral infarction by inhibiting the pathway for producing lactolein from in vivo polyamine by oxidative deamination through polyamine oxidase. However, it may be possible to prevent the progress of the medical condition. Furthermore, by using the findings of the present invention to search for a compound that inhibits polyamine oxidase, there is a possibility that a therapeutic agent for stroke and asymptomatic cerebral infarction can be obtained.

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Abstract

本発明により、血漿中のアクロレイン含有量、ポリアミン含有量、あるいはポリアミンオキシダーゼ活性又はポリアミンオキシダーゼ蛋白質量の測定を行なうことからなる、脳卒中・無症候性脳梗塞の診断及び、脳卒中・無症候性脳梗塞患者のスクリーニングを行なう方法が提供された。本発明の知見は、ポリアミンオキシダーゼを阻害することにより脳卒中・無症候性脳梗塞を予防したり、病状の進捗を阻止することができる可能性や、ポリアミンオキシダーゼを阻害する化合物を探索することにより、脳卒中・無症候性脳梗塞の治療薬を得ることができる可能性を示唆するものである。

Description

ポリアミン、 ァクロレインの含有量又はポリアミンォキシダーゼ活性又はその蛋 白質量を指標とした脳卒中 ·無症候性脳梗塞の診断方法 技術分野
明
本発明は、 ポリアミン、 ァクロレインの含有量又はポリアミンォキシダーゼ活 性又はその蛋白質量を指標とした脳卒中 ·無症候性脳梗塞の診断方法に関する。 更に本発明は、 ポリアミン、 ァクロレインの含有量又はポリアミンォキシダーゼ 書
活性又はその蛋白質量を指標として脳卒中 ·無症候性脳梗塞の患者をスクリー二 ングする方法に関する。
背景技術
脳血管疾患は悪性新生物、 心疾患に次ぐ死因であり、 その年間死亡数は腎疾患 の 1 0倍近く、 また罹患後の後遺症は麻痺 ·運動不能を伴うなど、 日常生活に極 めて多大な支障を来たす。 脳血管疾患の大半を占める脳卒中は早期発見 ·早期治 療が困難な疾患である。 また自覚症状を伴わない無症候性脳梗塞は、 画像診断に より偶然に発見されるケースが大半であり、 血液 ·尿検査等に利用される診断マ 一力一が存在しないのが現状である。 その為、 画像診断などの高価な機器を必要 としなレ、、 簡易で、 確度の高い診断方法の開発が望まれている。
ところでポリアミンは生体内において普遍的に見出される生体ァミンであり、 スペルミン、 スペルミジン、 スペルミンなどに代表される。 そしてそれらのポリ アミンは細胞内に高濃度 （mMオーダー） に存在し、 生体内において核酸と相互 作用することにより細胞増殖因子として作用する。 一方、 ポリアミンはその代謝 過程で、 細胞にとって毒性の高いァクロレイン （C H 2 = C H— C H O) を産生 する。 このァクロレインは細胞内ではアルデヒドデヒドロゲナーゼにより無毒化 されるが、 細胞外に漏出すると強い毒性を示す。 なお、 慢性腎不全患者の血漿中にはポリアミンが蓄積していること力 ら、 ポリ アミンは尿毒素の原因物質の一つであろうとされている。 そのうえ、 このポリア ミンを透析により十分に取り除くことは困難であるといわれている。 そこでポリ ァミンから誘導される毒性の本体を明らかにすることは、 尿毒症のより有効な治 療薬の開発につながる。
そのような観点から本発明者らは、 ポリアミンよりァクロレインを生成する経 路において作用しているポリアミンォキシダーゼを、 ァミノグァニジンを用いて 阻害することを試みた。 そしてその結果ポリアミンは毒性を示さなくなることが 確認されている （特開 2 0 0 2 - 2 8 1 9 9 9号公報)。組織破壊を伴う疾患にお いては、 細胞内より遊離したポリアミンが血漿中のポリアミンォキシダーゼによ り酸化的脱ァミノ化を受けてァク口レインが大量に産生し、 生成したァクロレイ ンが毒性に関与している可能性が極めて高レ、。
発明の開示
上記で述べたように腎疾患における尿毒症に、 ポリアミンの酸化分解により発 生したァクロレインが関与していることは知られていた。 しかしその他の疾患、 例えば脳卒中などの脳血管疾患にぉレ、てァクロレインが関与しているかどうかの 知見は不足していた。 なお、 脳卒中とは脳血管の病的過程により急激に起こる局 所精神 ·神経症状を表すものであり、 その原因疾患として重要なものには脳梗塞 や脳内出血などが挙げられる。 よって本発明の課題は、 脳卒中などの脳血管疾患 において生体内のポリアミンあるいはァク口レインの含量が量的に変化するか否 かを検討することである。 脳卒中患者においてァク口レインの量に変化が見られ るならば、 ァクロレインを指標にして脳卒中 ·無症候性脳梗塞を診断することが 可能となる。 またポリアミンからァクロレインが生成する過程には血漿中のポリ アミンォキシダーゼが関与しているので、 脳卒中患者においてポリアミンォキシ ダーゼの活性及びその蛋白質量が変化しているか否かを検討することも本発明の 課題である。 本発明者等は、 被験者の血漿中に含まれるァクロレイン含量、 ポリアミン含量 およびポリアミンォキシダ一ゼ活性を測定し、 脳梗塞 ·脳内出血の患者群と、 健 常者群あるいは他の脳疾患の患者群との間に差があるか比較を行なつた。 その結 果、 脳梗塞 ·脳内出血の患者群においては、 健常者群あるいは他の脳疾患の患者 群と比較して、 血漿ァク口レイン含量とポリアミンォキシダーゼ活性が明らカに 高いことが認められた。 その後被験者において磁気共鳴画像診断法 (MR I ) で 頭部断層画像を撮影する事により、 血漿ァクロレイン含量とポリアミンォキシダ ーゼ活†生が高レヽ被験者では梗塞がある事を確認し、本発明を完成させるに至つた。 すなわち本発明は、 脳卒中 ·無症候性脳梗塞の発見 ·予知のための診断方法を 提供するものである。 本発明によれば血漿中のァクロレイン量、 ポリアミンォキ シダーゼ活性又はポリアミンォキシダーゼの蛋白質量、 ポリアミン量を測定する 事により、 脳卒中 ·無症候性脳梗塞の予知、 発見をすることができる。
本発明は、 血漿中のァクロレイン含有量、 ポリアミン含有量、 あるいはポリア ミンォキシダーゼ活性又はポリアミンォキシダーゼの蛋白質量の測定を行なうこ とにより、 脳卒中 ·無症候性脳梗塞の診断及ぴ、 脳卒中 ·無症候性脳梗塞患者の スクリーニングを行なう方法を提供するものである。 本発明の知見は、 ポリアミ ンォキシダーゼを介する酸化的脱ァミノィ匕により生体内ポリアミンからァクロレ ィンを生成する経路を阻害することにより、 脳卒中 ·無症候性脳梗塞を予防した り、 病状の進渉を阻止することができる可能性を示唆するものである。 更に本発 明の知見は、 ポリアミンォキシダーゼを阻害する化合物を探索することにより、 脳卒中 ·無症候性脳梗塞の治療薬を得ることができる可能性をも示唆するもので あり、 種々の応用が可能であると考えられる。
図面の簡単な説明
図 1は、 血漿中の FDP-リジン量を、脳梗塞 ·脳内出血群と、 健常者群及びその 他脳疾患群の間で比較したグラフである。
図 2は、 血漿中のポリアミンォキシダーゼ活性を、 脳梗塞 ·脳内出血群と、 健 常者群及びその他脳疾患群の間で比較したグラフである。
図 3は、 MRIにより頭部の断面画像解析を行った結果を示す写真である。
図 4は、頭部の断面画像解析の経時変化を MRIと CTにより検討した写真である。 発明を実施するための最良の形態
本発明において、 ポリアミンの酸化分解により発生するァクロレインが脳梗 塞 ·脳内出血の患者の血清中に多く存在する事を見出した。 また脳梗塞 ·脳内出 血の発見'予知に、 血漿中のァクロレイン含量、 ポリアミン含量おょぴポリアミ ンォキシダーゼ活性の上昇を用いることができる事を実証した。
よって本発明は、 被験者から生体サンプルを採取し、 該サンプル中におけるポ リアミンの含有量又は該ポリアミンから生成されるアルデヒド体の含有量、 若し くは該サンプル中におけるポリアミンォキシダーゼ活' I生又はポリアミンォキシダ ーゼの蛋白質量を測定し、 得られた測定値を指標として脳卒中 ·無症候性脳梗塞 を診断する方法である。 また本発明は、 被験者から生体サンプルを採取し、 該サ ンプル中におけるポリアミンの含有量又は該ポリアミンから生成されるアルデヒ ド体の含有量、 若しくは該サンプル中におけるポリアミンォキシダーゼ活性又は ポリアミンォキシダーゼの蛋白質量を測定し、 得られた測定値を指標として脳卒 中 ·無症候性脳梗塞の患者をスクリーニングする方法である。
本発明においては被験者から、 まず測定に使用する生体サンプルを採取する。 本発明において使用される生体サンプルは、 好ましくは下記の実施例において使 用している血漿である。 しかし他の生体サンプルも適宜使用することが可能であ り、 その様な他の生体サンプルとして、 例えば尿、 唾液、 脳脊髄液や骨髄液など を挙げることが可能である。
なお本願明細書においてポリアミンとは、 第一級ァミノ基を二つ以上もつ直鎖 の脂肪族炭化水素を意味するものである。 知られている生体ポリアミンには、 プ トレツシン、 カダベリン、 スぺノレミジン、 スぺノレミン、 1. 3 ジアミノプロノ ン、 カルジン、 ホモスペルミジン、 3 -ァミノブ口ピル力ダべリン、 ノルスペルミン、 テルモスペルミン、 カルドペンタミンなどがあるが、 それらに限定されるもので はない。 なお本発明において好適なポリアミンはプトレツシン、 スペ^/ミジン、 スぺノレミンである。
上記のポリアミンは酸化、 ァセチル化、 アミノ基転移、 力ルバモイルイ匕による 代謝を受けるが、 ポリアミンォキシダーゼはポリアミンの酸ィ匕に関与する酵素で ある。 なお本願明細書においてポリアミンォキシダーゼとは、 ジァミンまたはポ リアミンを良い基質として酸ィ匕し、 過酸化水素を発生する酵素を意味するもので ある。 ポリアミンは、 ポリアミンォキシダーゼによる酸ィ匕的脱ァミノ化を受け、 その結果ァクロレインなどのアルデヒド体が生成する。 なお本発明において好適 なアルデヒド体はァクロレインであるが、 それに限定されるものではない。
血漿中のァクロレイン含量は、 ァクロレイン付加アミノ酸である FDP-リジン (N—ホルミルピペリジノ ·リジン）の含有量を測定する事により同定することが できる。 FDP-リジンの含有量は、 例えば ACR- LYSINEADDUCT ELISA SYSTEM (日本 油脂株式会社）を使用し、添付のマニュアルに従って測定することができる。なお ァクロレイン含量は FDP-リジン以外の誘導体の形で測定することも可能である。 またァクロレイン含量を直接測定することも可能であり、 かかる方法は例えば Alarcon らの報告 (Alarcon R. A. (1968) Anal. Chem. 40， 1704-1708) に記載さ れている。 しかしァクロレインは他の分子との反応性が高レ、ために、 遊離の形で 血中に存在する量が少ないという問題がある。 そこで、 FDP-リジンの形で測定す ることが簡便であることも併せて考えると、 本発明において、 FDP -リジンの形で ァクロレインを測定することは好適な態様である。
具体的には、患者血清及び標準液を抗原固定ィ匕プレートに 50 μ I/wellずつ分注 し、さらに一次反応抗体液を同量加える。室温で 30分静置した後、液を取り除き、 洗浄液で洗浄後、二次反応抗体液を 100 μ 1/well分注する。室温で一時間静置後、 洗浄液で洗浄し、発色液を加え室温で 15分静置することで発色させる。プレート リーダ一により、 450nmの吸光度測定をすることにより、 血漿中ァク口レイン量 は、 患者血清 1ml当たりの FDP -リジン含有量 （nmol/ml plasma) として表示され る。
ポリアミンォキシダーゼの活性測定は、例えば下記の実施例において示す様に、 lOmM-Tris塩酸塩（pH7. 5)、 0. 2mMの基質（スペルミン、 スペルミジン及ぴプトレ スシン） 及び 0. 03mlの患者血清の反応混合液 0. 15mlを 37°Cにて 48時間ィンキ ュベーシヨンすることにより行なうことができる。 0. 02mlの反応混合液に最終濃 度 5 %のトリクロ口酢酸 (TCA) を加え、遠心分離する。得られた上清の一部をポ リアミンのアツセィに使用する。 ァミンォキシダーゼ活性は患者血清 lml当たり のスペルミン分解により生成したスペルミジン量 （nmol/ml plasma/48h) で表示 することができる。
ポリアミンォキシダーゼの酵素活性測定方法は種々の報告において記載されて おり、そのような文献として、 Sharminらの報告 (Sharmin et al. , (2001) Biochem. Biophys Res. Commun. 282, 228—235)、 Sakataらの報告 (Sakata et al. , (2003) Biochem. Biophys Res. Commun. 305， 143 - 149)、 Igarashiらの幸告 (Igarashi et al. , (1986) J. Bacteriol. 166， 128 - 134) などを挙げることができる。 かかる報 告の記載を基にして当業者は適宜改変を行うことにより、 ポリアミンォキシダー ゼの酵素活性を測定することができる。
またポリアミンォキシダーゼの蛋白質量は、 例えばポリアミンォキシダーゼに 対して特異的な抗体を用いた酵素免疫測定法 （ELISA)、 ウェスタンダブロッティ ング解析や免疫沈降法などによつて測定することができる。 かかる手法は本技術 分野において公知の一般的な手法であり、 当業者は適切な条件を適宜設定して上 記の手法により酵素の蛋白質量を測定する事ができる。 なおこれらの測定を行う 際に使用されるポリアミンォキシダーゼに対する抗体は、 モノクローナル抗体で もポリクローナル抗体でも良レ、。
ポリアミンォキシダーゼに対するポリクローナル抗体は、 例えば通常のぺプチ ド抗体作製の手法を用いてゥサギをポリアミンォキシダーゼのぺプチド断片で免 疫することにより、 得ることができる。 ペプチド抗体が作製された事は、 ぺプチ ドを投 されたゥサギから採血をしてその抗体価を測定することにより、 抗体が 十分な力価に達している力検定を行うことによって確認する事ができる。 ぺプチ ド抗体作製の手法は種々の実験書などにも記載されており、 当業者に良く知られ ているので、 それらに記載を基に種々の改変を—行ってポリアミンォキシダーゼの 抗体を得ることができる。
試料に含まれるポリアミンの含有量は、 高速液体ク口マトグラフィー （HPLC) により測定することができる。例えば T0S0から市販されているポリアミンカラム を使用した場合には、 ポリアミン類 (プトレツシン、 スペルミジン、 スペルミン） の HPLC上のリテンションタイム (保持時間) は各々 7分、 12分、 25分である。 ポリアミン量は患者血清 1 m 1当たりに含まれるプトレスシン、 スペルミジン及 ぴスペルミン量 （nmol/ml plasma) で表示することができる。 なおその他の通常 のアミノ酸カラムも、 適宜使用することができる。
下記の実施例においては、 被験者の同意の下、 磁気共鳴画像診断法 (MR I ) により、 頭部断層画像を得て梗塞の有無を検討した。 その結果下記の実施例に示 すように、 健常者群において高い値を示した被験者において、 脳梗塞の所見が認 められた。
よって、 脳卒中の患者において血漿中のァクロレイン含量、 ポリアミン含量あ るいはポリアミンォキシダーゼ活性は健常者と比較して高レ、という本発明の知見 を利用して、 上記の測定値を指標として、 脳卒中 ·無症候性脳梗塞を診断するこ とができる。 また本発明において得られた知見を利用して、 上記の測定値を指標 として脳卒中 ·無症候性脳梗塞の患者をスクリ一ユングすることもできる。 例え ば健常者群の上記の指標となる測定値の平均値と分散を統計学的に解析し、 上記 測定値における正常値の上限を設定する。 その値を基にして、 より高い値を示す 被験者は脳卒中 ·無症候性脳梗塞である可能性が高いと診断することも可能であ ろう。 また本発明の知見は、 血漿中のポリアミンォキシダーゼ活†生を阻害することに より生体におけるァク口レインの生成を抑制することにより、 脳卒中の予防や病 状の進涉を阻止することができる可能性も示唆するものである。よつて本発明は、 脳卒中の治療に関する新たな途を開く可能性を提供するものである。
更に、脳卒中の治療に有効である可能性がある候補化合物を実験動物に投与し、 該化合物が該実験動物において血漿中のポリアミンォキシダーゼを阻害する活性 を有するかを測定することにより、 脳卒中の治療に有効である新たな薬剤を探索 できると考えられる。 よって本発明は、 脳卒中の治療に有効な新たな薬剤を探索 するための新たな途をも提供するものである。
実施例
次に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、 本発明はこれらに限定 されるものではない。
実施例 1：脳梗塞患者に於ける血漿ァクロレイン含有量の比較検討
脳疾患患者における血漿ァクロレイン含有量を検討した。 健常人、 脳梗塞 ·脳 内出血群、 その他脳疾患群の 3群に分けて、 採取した血液のァクロレイン含有量 を比較した。
血漿中ァクロレイン量は、 ァクロレイン付カ卩アミノ酸である FDP-リジン （N— ホルミルピペリジノ · リジン） の含有量を測定する事で同定した。 ACR- LYSINE ADDUCTELISA SYSTEM (日本油脂株式会社）を用い、 添付のマニュアルに従って測定 した。患者血清及び標準液を抗原固定ィ匕プレートに 50 μ I/wellずつ分注し、更に 一次反応抗体液を同量加えた。室温で 30分静置後、液を取り除き、洗浄液で洗浄 し、発色液を加え室温で 15分静置することで発色させた。プレートリーダ一によ り、 450nmの吸光度測定をした。 血漿中ァクロレイン量は患者血清 1ml当たりの FDP-リジン含有量 (nmol/ml plasma)で表示した。
図 1に示されるように血漿ァク口レイン量を反映する FDP-リジン量は、上記の 3群の中で脳梗塞 ·脳内出血患者が最も高く、 他の群に比べ有意に上昇が見られ た。 また慢性腎不全患者の血漿中ァクロレイン量と比較しても、 脳梗塞患者の
FDP-リジン量は、 腎不全患者と同等レベルまで上昇している事が判明した。 実施例 2 ：脳梗塞患者における血漿ァミンォキシダーゼ活性の比較検討
実施例 1で用いた患者血漿中のポリアミンォキシダーゼ活性を測定した。 その 結果を図 2に示す。 血漿中のポリアミンォキシダーゼの活性は、 lOraM-Tris塩酸 塩 （pH7. 5)、 0. 2π)Μ の基質 （スペルミン、 スペルミジン及ぴプトレスシン） 及ぴ 0. 03mlの患者血清の反応混合液 0. 15mlを 37°Cにて 48時間ィンキュベーションす ることにより測定した。 0. 02ml の反応混合液に最終濃度 5%のトリクロ口酢酸 (TCA)を加え、遠心分離した。得られた上清の一部をポリアミンのァッセィに使用 した。 ァミンォキシダーゼ活性は患者血清 1ml当たりの、 スペルミン分解により 生成したスペルミジン量 （nmol/ml plasma/48h) で表示した。
脳梗塞 ·脳内出血群の血漿中のポリアミンォキシダーゼ活性は、 健常者群及ぴ その他脳疾患群と比較して有意に上昇していた。 この結果は、 実施例 1で比較検 討した血漿中ァクロレイン量と相関性を有していた。
実施例 3 ：磁気共鳴酉像診断法 （MRI) による頭部断面画像解析
被験者の許可'同意を得て、 MRI により頭部の断面画像解析を行い、 脳梗塞の 有無を調べた。 健常者 （図 3 A)、 脳梗塞患者 （図 3 B )、 および病名の診断はつ いていないが血漿中のァク口レイン量とポリアミンォキシダーゼ活性が極めて高 い値を示した被験者 （図 3 C) における MRI断層写真を示す。 図 3 Cに示される ように、 血漿中のァク口レイン量とポリアミンォキシダーゼ活性が高かった患者 では、 両側前頭'側頭頂および基底核に多発性の梗塞が認められた。 また脳の萎 縮および動脈硬化も認められた。
実施例 4：急性期脳梗塞患者における頭部断面画像、 血漿ポリアミンォキシダー ゼ活性およびァク口レイン含有量の変化についての比較検討
急性期脳梗塞患者 1名について、 発症当日 （1日）、 2日目および一週間後 （7 日） における頭部断面画像 (MRI, CT) の変ィ匕と、 それに伴う血漿ポリアミンォキ シダーゼ活性およびァク口レイン含有量の変化を調べた。 頭部断面画像の写真を 図 4に示す。 発症当日では、 T2強調 MRIおよび CTに明瞭な梗塞像は見られなか つた。 一方発症当日の血漿ポリアミンォキシダーゼ活性と FDP- Lys量は、 それぞ れ 6. 6nmol SPD増加/ ml血漿と 18. 4nmol/ml血漿であった。 この結果から、 血漿 ポリアミンォキシダーゼ活性は健常者群の 2倍程度であり、 有意に高値であるこ とが確認された。発症 2日目の頭部断面画像 (MRI)と一週間後の頭部断面画像 (CT) では、 左側頭葉に明瞭な梗塞像が認められた。 発症一週間後の血漿ポリアミンォ キシダーゼ活性と FDP - Lys量は、それぞれ 7. 2nmol SPD増加/ ml血漿と 23. Onmol/ml 血漿であった。 よつて血漿ポリアミンォキシダーゼ活性の上昇と共に、 血漿ァク ロレイン含有量の有意な増カ卩も認められた。 以上に示されるように、 急性期梗塞 患者においては血漿ポリアミンォキシダーゼ活性の上昇が、 MRIもしくは CTにお ける梗塞像の出現に先立つて起こることが確認された。
産業上の利用可能性
血漿中のァクロレイン含有量、 ポリアミン含有量、 あるいはポリアミンォキシ ダーゼ活性又はポリアミンォキシダーゼ蛋白質量の測定を行なうことからなる本 発明の方法は、 脳卒中 ·無症候性脳梗塞の診断、 及び、 脳卒中 ·無症候性脳梗塞 患者のスクリーユングに有用である。 また本発明の知見を利用して、 ポリアミン ォキシダーゼを介する酸化的脱ァミノ化により生体内ポリアミンからァク口レイ ンを生成する経路を阻害することにより、脳卒中 ·無症候性脳梗塞を予防したり、 病状の進渉を阻止することができる可能性がある。更に本発明の知見を利用して、 ポリアミンォキシダーゼを阻害する化合物を探索することにより、 脳卒中 '無症 候性脳梗塞の治療薬を得ることができる可能性がある。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 被験者から生体サンプルを揉取し、 該サンプル中におけるポリアミンの含有 量又は該ポリアミンから生成されるアルデヒ ド体の含有量、 若しくは該サンプル 中におけるポリアミンォキシダーゼ活†生又はポ'リァミンォキシダーゼの蛋白質量 を測定し、 得られた測定値を指標として脳卒中 ·無症候性脳梗塞を診断する過程 からなる、 脳卒中 ·無症候性脳梗塞の診断方法。
2 . 前記ポリアミンがスペルミン、 スペルミジンまたはプトレツシンである、 請 求項 1記載の方法。
3 . ポリアミンから生成される前記アルデヒ ド体がァクロレインである、 請求項 1記載の方法。
4 . 被験者から生体サンプルを採取し、 該サンプル中におけるポリアミンの含有 量又は該ポリアミンから生成されるアルデヒド体の含有量、 若しくは該サンプル 中におけるポリアミンォキシダーゼ活性又はポリアミンォキシダーゼの蛋白質量 を測定し、 得られた測定値を指標として脳卒中 ·無症候性脳梗塞の患者をスクリ 一二ングする過程からなる、 脳卒中 .無症候性脳梗塞の患者のスクリーニング方 法。
5 . 前記ポリアミンがスペルミン、 スペルミジンまたはプトレツシンである、 請 求項 4記載の方法。
6 . ポリアミンから生成される前記アルデヒ ド体がァクロレインである、 請求項 4記載の方法。
7 . 被験者から採取した生体サンプルにおける前記ポリアミンォキシダーゼ活性 又は前記ポリアミンォキシダーゼの蛋白質量の統計学的に有意な変化が、 該被験 者において撮影した頭部診断画像で脳卒中 .無症候性脳梗塞の兆候ないしは発症 に特徴的な像が認められる前に起こることを特徴とする、 請求項 1から請求項 3 のいずれか一つ請求項記載の方法。
8 . 被験者から採取した生体サンプルにおける前記ポリアミンォキシダーゼ活性 又は前記ポリアミンォキシダーゼの蛋白質量の統計学的に有意な変化が、 該被験 者において撮影した頭部診断画像で脳卒中 ·無症候性脳梗塞の兆候ないしは発症 に特徴的な像が認められる前に起こることを特徴とする、 請求項 4から請求項 6 のレ、ずれか一つ請求項記載の方法。 -
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