WO2010004737A1 - うつ病予備群の判定方法 - Google Patents

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creatine kinase
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秋元政信
加藤綾子
中山勉
大橋典男
下位香代子
榊原啓之
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プリマハム株式会社
静岡県公立大学法人
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
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    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N2800/30—Psychoses; Psychiatry
    • G01N2800/304—Mood disorders, e.g. bipolar, depression

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining a pre-depression group based on evaluation by a CES-D scale targeting creatine kinase, particularly creatine kinase-M (muscle type).
  • Non-Patent Document 1 According to a survey by the Ministry of Health, Labor and Welfare, 76.9% of men and 84.2% of women feel stress in their daily lives (see Non-Patent Document 1). In general, as factors of stress, other than physical (cold, radiation, noise, etc.), chemical (drug, vitamin deficiency, O 2 deficiency, etc.), biological (bacterial infection, etc.) factors, environmental and life cycle List changes, work / family issues and complex relationships. Stress can cause various illnesses, such as stress ulcers, fatigue, lifestyle-related diseases, depression, and other factors that are thought to be caused by mental stress in daily life. It has become a social problem.
  • the Hamilton Depression Rating Scale (HRSD) (for example, see Non-Patent Document 2), in which the interviewer makes an oral judgment by means of an interview with a psychiatrist, etc.
  • HRSD Hamilton Depression Rating Scale
  • SDS Depression Self-Assessment Scale (see Non-Patent Document 3, for example) is used clinically
  • the Hamilton-type Depression Rating Scale is used to determine the severity of persons with depression.
  • SDS is characterized in that there is no overlap of scoring ranges between the depression group and the normal group (see, for example, Non-Patent Document 3).
  • a method for diagnosing depression using word information based on fuzzy reasoning and / or other variable analysis has been proposed.
  • a diagnostic agent for depression using specific DNA or the like see, for example, Patent Document 2
  • a diagnostic agent for depression using an antibody against a G protein-coupled receptor protein having a specific amino acid sequence for example, Based on the results of gene expression analysis using messenger RNA derived from the peripheral blood of the subject and the subject, the presence or absence of depression in the subject is determined, and then suffering from depression
  • a method for evaluating depression for example, refer to Patent Document 4
  • identifying the type of depression of a subject determined to be and evaluating the pathological state of depression by type.
  • a method for differentiating men's menopause or depression based on the amount of testosterone and cortisol present in blood or saliva see, for example, Patent Document 5).
  • creatine kinase (EC 2.7.3.2) is a dimeric enzyme that is abundant in muscle tissue and plays a catalytic role in the reaction between creatine and ATP and creatine phosphate and ADP.
  • ATP is decomposed into ADP and Pi by releasing energy stored in the phosphate bond of creatine phosphate by muscle contraction.
  • the reaction of producing ATP from phosphocreatine and ADP is catalyzed by a Lohman reaction.
  • Creatine kinase-BB is a vascular disorder such as dissecting aortic aneurysm. It is reported that creatine kinase-MB can be used for differential diagnosis between unstable angina pectoris and myocardial infarction (for example, see Patent Document 7) for detection and diagnosis of diseases (for example, see Patent Document 6). It is known that creatine kinase-MM leaks into the blood mainly due to muscular fatigue such as intense exercise and shows a high value. Most of the creatine kinases in blood in healthy individuals are MM type derived from muscle, BB type derived from brain is not observed, and the amount of MB derived from myocardium is increased only in the case of myocardial infarction. To do. Therefore, most of the activity of creatine kinase in the serum of healthy individuals is due to the MM type.
  • the present inventors administer a test substance to a non-human mammal before or after stress is applied, and among apolipoprotein E, apolipoprotein A-IV, haptoglobin, and vitamin D-binding protein precursor
  • a screening method for stress-suppressing substances or stress-enhancing substances characterized in that any one or more of them are detected and compared with the case where no test substance is administered for example, see Patent Document 8
  • CK-MM creatine kinase isozyme
  • CK-MM creatine kinase isozyme
  • Torres inhibitor or screening method of stress potentiator proposes.
  • an object of the present invention is to provide a method for easily distinguishing a healthy person from a person who has a high possibility of suffering from depression, although he / she lives in daily life and social life without hindrance and is not aware of being depressed. Is to provide.
  • the present inventors have developed a self-assessment scale (CES-), a technique developed for the purpose of discovering depression in the general population, using healthy women who have no trouble in daily life and social life as subjects.
  • CES- self-assessment scale
  • D scale degree of depression was high by the assessment using the CES-D scale even among subjects who did not interfere with daily life and social life, and that they were in a potential depressed state. It has been found that the group of subjects to be tested can be clearly distinguished from the group of healthy subjects who have a low to moderate degree of depression by evaluation using the CES-D scale.
  • the amounts of apolipoprotein A-IV, apolipoprotein E, haptoglobin, vitamin D-binding protein precursor, and creatine kinase-M in the serum of the subject were measured by sandwich ELISA. It was found that the relative amount of creatine kinase-M in the serum was significantly low in the group of subjects determined to have a high level. On the other hand, the evaluation by total creatine kinase activity showed a decreasing trend with increasing degree of depression, but there was no significant difference between the low to high groups. Based on the above results, it was confirmed that the depression state can be determined more accurately by measuring the total creatine kinase activity and in particular by measuring the relative amount of creatine kinase-M. The present invention has been completed.
  • the present invention is characterized by (1) a method for determining or diagnosing a depression preparatory group characterized by measuring creatine kinase in a sample, and (2) a method for measuring creatine kinase using an antibody.
  • the creatine kinase is creatine kinase-M
  • the method for determining or diagnosing the depression preparatory group according to any one of the above (1) to (3) and (5) the depression preparatory group
  • the method for determining the depression preparatory group of the present invention is not particularly limited as long as it is a method for measuring the amount of creatine kinase in a sample, and a method for directly quantifying the amount of creatine kinase protein or a method for measuring creatine kinase enzyme activity. And a method for quantifying creatine kinase.
  • Examples of the method for directly quantifying the amount of protein include a method in which a creatine kinase-specific antibody is reacted with creatine kinase and quantified by a known immunochemical measurement, and a method in which creatine kinase in a sample is purified and quantified.
  • Creatine kinases to be measured include creatine kinase-MM (muscle type), creatine kinase-BB (brain type), creatine kinase-MB (hybrid type) isozymes, subunits constituting these, and three types of isozymes.
  • Creatine kinase including all of creatine kinase, and particularly creatine kinase-M.
  • creatine kinase-M means a creatine kinase M-type (muscle type) subunit constituting creatine kinase-MM (muscle type) and creatine kinase-MB (hybrid type), which are isozymes of creatine kinase.
  • the depression preparatory group in the determination method of the present invention can include humans who are in a depressed state who may suffer from depression.For example, although depression has not been diagnosed, People who are in a pre-depressed state or do not feel that there is an obstacle in their daily life and social life, but they are potentially depressed and more likely to suffer from depression than usual Examples include humans and humans who are actually suffering from early depression. Furthermore, since even the preliminary group can be detected, it can be said that there is a possibility that it can be used for the diagnosis of depression.
  • the above depression has been tried in various ways.
  • the degree of sadness is disproportionate to the event and persists for a long time. When it occurs.
  • Symptoms of general depression include sleep disorders, loss of appetite, medical conditions such as bodily illness that cause you to crawl inside, barely eat, eat, and fall asleep.
  • a variety of situations such as a situation in which the movement becomes dull and no spontaneous action is taken, or a situation in which the person is not able to concentrate on things because of a strong feeling of guilt or self-denial (see, for example, the latest Merck Manual Medical Encyclopedia version)
  • it may be classified into, for example, nonpsychotic depression, psychotic depression, bipolar depression, schizoaffective depression.
  • creatine kinase particularly creatine kinase M amount is measured using an antibody
  • creatine kinase, particularly creatine kinase M is immunologically utilizing an antigen-antibody binding reaction.
  • the method is not particularly limited as long as it is a method for measuring by an optical measuring method, and examples thereof include immunological measuring methods such as immunochromatography and ELISA using an anti-creatine kinase antibody labeled with a labeling substance.
  • creatine kinase-MM when measured using a second antibody that recognizes the same epitope as the first antibody, only creatine kinase-MM is targeted, and measured using a second antibody that recognizes an epitope different from the first antibody.
  • Creatine kinase-MM and creatine kinase-MB are targeted, but in any case, creatine kinase-MM is substantially measured because creatine kinase activity in serum is mostly due to MM type. Will be.
  • Specific examples of the labeling substance include enzymes such as alkaline phosphatase and HRP, Fc regions of antibodies, fluorescent substances such as GFP, and the like.
  • antibodies that specifically bind to creatine kinase used in the present invention include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, humanized antibodies and the like, These can be prepared by a conventional method using the above creatine kinase as an antigen. Among them, a monoclonal antibody is preferable in view of its specificity.
  • An antibody that specifically binds to creatine kinase-M can be prepared by a conventional method using creatine kinase-MM as an antigen.
  • creatine kinase-BB is not recognized, and creatine kinase-M is specifically bound. It is preferably an antibody that recognizes.
  • creatine kinase M for example, creatine kinase M, a fragment containing creatine kinase-MM or an epitope, or the protein was expressed on the membrane surface in an animal (preferably non-human) using a conventional protocol.
  • a hybridoma method (Nature 256, 495-497, 1975) that results in an antibody produced by a continuous cell line culture, Any method such as trioma method, human B cell hybridoma method (Immunology Today 4, 72, 1983) and EBV-hybridoma method (Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985) Can be used.
  • the method for purifying and quantifying creatine kinase in a sample in the method for determining a depression preparatory group of the present invention is a known protein purification method such as salting out, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, etc.
  • the creatine kinase in the sample can be separated and purified by means or electrophoresis using SDS, polyacrylamide gel or the like, and the obtained protein can be quantified by a known quantitative method.
  • the creatine kinase enzyme activity is measured to quantify creatine kinase.
  • a reversible reaction catalyzed by creatine kinase and converting creatine and ATP into creatine phosphate and ADP is performed. The method of using is mentioned.
  • a method of measuring the increase in NADPH produced by conjugating with a glucose-6-phosphate-NADP system catalyzed by -6-phosphate dehydrogenase is used, and a colorimetric method, a fluorescence method, A known measurement method such as the UV method can be employed.
  • Examples of the sample used in the method for determining the preliminary depression group of the present invention include blood, serum, plasma, saliva, tears, nasal discharge, urine, and other body fluids, with serum and plasma being preferred.
  • serum as a sample
  • blood is collected from the brachial vein of the subject, and the obtained blood is allowed to stand overnight at 4 ° C., then centrifuged, and the supernatant is used as serum as ⁇ 80.
  • anti-creatine kinase-M monoclonal primary antibody as an immobilized antibody is placed in an ELISA plate, stored overnight at 4 ° C., immobilized, washed with PBST, and blocked with 1% BSA.
  • the serum of the subject is diluted as necessary, reacted with the immobilized anti-creatine kinase-M monoclonal antibody, washed with PBST, and then used as a biotin-labeled antibody with the anti-creatine kinase-M monoclonal second antibody. Color was developed and the absorbance was measured with a plate reader, and creatine kinase-M in serum was measured using a standard graph created based on a separately prepared control. And a method of calculating the amount.
  • the subject To determine whether or not you are in a pre-depression group after measuring creatine kinase, compare the measured value to a preset reference value, and if the subject's creatine kinase serum concentration is low, the subject It can be evaluated that it falls under the reserve group. In particular, highly reliable evaluation can be performed by measuring creatine kinase-M. In addition, the degree of depression is low in clinically used methods for diagnosing depression, such as oral assessment of interviews by interviewers and self-filled depression assessments during interviews with psychiatrists. If the subject's creatine kinase serum concentration is significantly low when compared with the subject determined to be, it can be evaluated that the subject falls under the depression preparatory group.
  • the above-described clinically used method for diagnosing depression is specifically the clinical center and a reliable depression diagnostic self-assessment scale (The Center for Epidemiologic Studies Depression) Scale) (also referred to as “CES-D scale”) (original version NIMH National Institute of Mental Health, Locka et al. Japanese version by Satoru Shima, published by Chiba Test Center).
  • CES-D scale original version NIMH National Institute of Mental Health, Locka et al. Japanese version by Satoru Shima, published by Chiba Test Center.
  • the degree of depression is, for example, when the score on the CES-D scale is less than 11, the degree of depression is low, and when the score is 11 to 16, the degree of depression is moderate, and is 17 or more. In some cases, determining that the degree of depression is high is considered statistically highly correlated with depression.
  • the degree of depression was diagnosed as low, but creatine kinase-M serum This is useful in that it provides an opportunity for a subject having a concentration equal to or lower than a reference concentration to perform a test for further diagnosis of depression. This is because the determination based on the CES-D scale is a subjective test and can be answered incorrectly, and there is a possibility that the understanding is insufficient and the answer is ambiguous (see the same book).
  • a test was conducted to evaluate the relationship between CES-D determination and various candidate biomarkers for detecting depression before the depression (preliminary depression group).
  • the subject is a highly reliable CES-D scale that is widely used in clinical diagnosis of depression (The Center for Epidemiologic Studies Depression Scale) Depression State Self-Evaluation Scale (Original NIMH National Institute of Mental Health) Locka et al. Japanese version written by Satoru Shima, published by Chiba Test Center), the score of each individual on the CES-D scale was calculated. The details are shown in FIG. If the score on the CES-D scale is considered to be statistically high, the degree of depression is low, and if it is 11-16, the degree of depression is moderate, 17 or more In some cases, the method of judging the degree of depression as high was used. In this case, 26 people had a low degree of depression, 39 people had a moderate degree, and 29 people had a high degree of depression (see FIG. 1).
  • CK activity was determined by referring to the enzyme activity method described in the literature (Japan Clinical Chemistry Society; recommended method for measuring enzyme activity in human serum, clinical chemistry, 19, 184-207, 1990). Analyzed by Hitachi LABOSPECT008 using “Shikarikid CK” sold by Chemical Co., Ltd.
  • the method for determining the CK activity value in a sample directly proportional to it by spectroscopically measuring the increase rate of NADPH is 1) JSCC standardization correspondence method. By calibrating with a calibration curve ERM (trace calibration), it agrees with the measured value by the JCCLS-SOP method. Trace Calibrate is based on the Japanese / Regular Appeals Standard; 2) Measurements in double kinetic mode can avoid the effects of hemolysis; 3) Stable data over time; It has the characteristics. The results are shown in FIG.
  • Anti-haptoglobin Anti Haptoglobin MFG101
  • Anti Haptoglobin MFG102 Anti-haptoglobin
  • Cosmobio as a solid-phased antibody
  • Anti Haptoglobin MFG102 Anti-haptoglobin MFG102
  • Cosmobio as a biotin-labeled antibody
  • apolipoprotein A-IV the expression levels of apolipoprotein A-IV, apolipoprotein E, haptoglobin, and vitamin D-binding protein precursor in serum were determined to have a low to high degree of depression in CES-D. There was no significant difference between the groups of subjects.
  • the depression preparatory group can be determined not by measuring the total creatine kinase activity but by an immunological technique using an anti-creatine kinase-M antibody, for example, a simple test method such as ELISA or immunochromatography. It was. There were no patients with depression in this subject, and the amount of creatine kinase-M was measured by ELISA to confirm that the subject was in a potentially depressed state prior to depression.
  • the creatine kinase-M can be a more sensitive indicator for detecting early depression without subjective symptoms. It was confirmed to be effective as a different biochemical biomarker.

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Abstract

支障なく日常生活や社会生活を送っており、抑うつ状態にあるという自覚がないが、うつ病に罹患する可能性が高いヒトと健常なヒトを容易に区別する方法を提供するものである。血清等の試料中のクレアチンキナーゼ－Ｍを、抗クレアチンキナーゼ－ＭＭモノクローナル抗体を用いて、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定し、この測定値を予め設定された基準値と比較して、被検者のクレアチンキナーゼ－Ｍ血清濃度が低い場合に、被検者がうつ病予備群（ＣＥＳ－Ｄスケールによるスコアが１７以上）に該当すると評価する。また、上記サンドイッチＥＬＩＳＡによる測定値が一定レベル以下、例えば４ｐｐｍ、好ましくは３ｐｐｍ以下であれば、うつ病予備群に該当すると評価する。

Description

うつ病予備群の判定方法
　本発明は、クレアチンキナーゼ、特にクレアチンキナーゼ－Ｍ（筋型）を標的としたＣＥＳ－Ｄスケールによる評価に基づくうつ病予備群を判定する方法に関する。
　厚生労働省の調査によると、普段の生活でストレスを感じている人は、男性で７６．９％、女性で８４．２％にも上る（非特許文献１参照）。一般的にストレスの要因としては、物理的（寒冷、放射線、騒音等）、化学的（薬物、ビタミン不足、Ｏ２欠乏等）、生物的（細菌感染等）要因以外に、環境やライフサイクルの変化、仕事・家庭の問題や複雑な人間関係などを挙げることができる。ストレスは様々な病気の原因ともなり、例えば、ストレス性潰瘍、疲労、生活習慣病、うつなど日常生活における精神的ストレスが一因となって発症したと考えられる疾患の罹患率の上昇は、大きな社会問題となっている。なかでも、主要な精神疾患の１つであるうつ病の罹患率は国民の４～５％に達するとの報告もあり、罹患しても治療が行われない場合は自殺に至ることもあるといわれている。したがって、うつ病の発症を未然に防ぐための研究は、医療分野における最重要課題の１つとされている。
　うつ病の診断については、精神科医の問診等により、面接者が口頭で判定を行うハミルトン（Hamilton）式うつ病評価尺度（ＨＲＳＤ）（例えば、非特許文献２参照）や、自己記入式のＳＤＳうつ性自己評価尺度（例えば、非特許文献３参照）が、臨床的に用いられているが、ハミルトン式うつ病評価尺度は、うつ状態にある者に対し重症度を判定するために用いられ、ＳＤＳは、うつ病群と正常群との間に、得点範囲のオーバーラップがないという特徴がある（例えば、非特許文献３参照）。また、ファジイ推論及び／又は他変数分析に基づいた言葉情報を利用したうつ病の診断方法（例えば、特許文献１参照）等も提案されている。
　また、特定のＤＮＡ等を用いたうつ病の診断薬（例えば、特許文献２参照）や、特定のアミノ酸配列を有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質等に対する抗体を用いたうつ病の診断薬（例えば、特許文献３参照）や、被検者の末梢血由来のメッセンジャーＲＮＡを用いた遺伝子発現解析結果に基づいて、該被検者のうつ病に対する罹患の有無を判断し、次いで、うつ病に罹患していると判断された被検者について、そのうつ病のタイプを同定し、該タイプ別にうつ病の病態を評価することを特徴とする、うつ病の評価方法（例えば、特許文献４参照）や、血液又は唾液中に存在するテストステロン及びコルチゾールの量に基づき男性の更年期又はうつ病を鑑別する方法（例えば特許文献５参照）などが、うつ病の生化学的診断・評価法として提案されているが、実用的には採用されていないといえる。
　一方、クレアチンキナーゼ（ＥＣ２．７．３．２）は、筋肉組織中に多く存在する二量体の酵素であり、クレアチンとＡＴＰ及びクレアチンリン酸とＡＤＰの間の反応における触媒の役割を果たし、例えば筋肉では、クレアチンリン酸のリン酸結合に蓄えられているエネルギーが筋収縮により放出されることにより、ＡＴＰがＡＤＰとＰｉに分解される。次に、ローマン（Lohman）反応により、ホスホクレアチンとＡＤＰからＡＴＰを産生する反応を触媒する。クレアチンキナーゼのＢ型（脳型）とＭ型（筋型）の２種類のサブユニットの組合せにより構成されるクレアチンキナーゼアイソザイムとしては、クレアチンキナーゼ－ＭＭ（筋肉型）、クレアチンキナーゼ－ＢＢ（脳型）、クレアチンキナーゼ－ＭＢ（ハイブリット型）の３つのアイソザイムがあるとされ、クレアチンキナーゼ－ＭＭは筋肉に、クレアチンキナーゼ－ＢＢは脳に、クレアチンキナーゼ－ＭＢは心筋に多く含まれる。脳、骨格筋・心筋等が障害を受けた際にかかる原因部位に存在するクレアチンキナーゼが血液中へ流出することが知られており、クレアチンキナーゼ－ＢＢは、解離性大動脈瘤などの血管障害性疾患の検出及び診断（例えば、特許文献６参照）に、クレアチンキナーゼ－ＭＢは不安定狭心症と心筋梗塞との間の鑑別診断（例えば、特許文献７参照）に用いることができることが報告されており、クレアチンキナーゼ－ＭＭは主に激しい運動などの筋肉疲労により血中に漏洩し高値を示すことが知られている。健常人における血液中のクレアチンキナーゼは、そのほとんどが筋肉由来のＭＭ型で、脳由来のＢＢ型は認められず、心筋由来のＭＢ型は心筋梗塞の場合に限り、血液中の存在量が上昇する。よって、健常人の血清中のクレアチンキナーゼの活性はそのほとんどがＭＭ型によるものである。
　うつ病患者について実施された研究で、血清中における全クレアチンキナーゼの酵素活性が、非精神病性大うつ病患者においては高値を示し、精神病性の大うつ病患者においては低値を示すとの興味深い結果が報告された（例えば、非特許文献４参照）。また、この研究では、精神科医が問診によりうつ状態の重症度を判定するハミルトン（Hamilton）式うつ病評価尺度（ＨＲＳＤ）のスコアが上昇して重症度が上昇するに伴い、非精神病性大うつ病患者における血清中の全クレアチンキナーゼ活性が低下することが示された。したがって、クレアチンキナーゼの活性がうつ病の種類やその程度により変化しうることが示唆されたが、かかるうつ病患者のみを対象とした研究では、健常人の正常対照群を設けていない為、クレアチンキナーゼの活性測定から正常対照群とうつ病患者群を選別できるか否かは不明である。また、現在までに、うつ病及びその予備群を客観的かつ的確に診断できる手法は報告されていない。
　その他、本発明者らは、非ヒト哺乳動物に、ストレスを負荷する前後又は同時に、被検物質を投与し、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ-IV、ハプトグロビン、及びビタミンＤ結合タンパク質プリカーサーのうちのいずれか１種以上を検出し、被検物質を投与しない場合と比較・評価することを特徴とするストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法（例えば、特許文献８参照）や、非ヒト哺乳動物に、ストレスを負荷する前後又は同時に、被検物質を投与し、該被検物質を投与した非ヒト哺乳動物の血清からクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ－ＭＭ）又はクレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ－ＭＭ）に特異的に結合する抗体を検出し、被検物質を投与しない場合と比較・評価することを特徴とするストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法（例えば、特許文献９参照）を提案している。
国際公開第２００４／０８０３１２号パンフレット 特開２００３－２５９８８４号公報 特開２００４－２３９７号公報 特開２００５－３１２４３５号公報 特開２００７－２４８２２号公報 国際公開第９８／４０７４９号パンフレット 特許２６２８４２１号公報 特開２００７－２２５６０７号公報 特開２００７－９３５９７号公報
厚生労働省平成１４年国民栄養調査結果 Hamilton M: A rating scale for depression. J Neurol Neurosurg Psychiatry23: 56-62, 1960 ＳＤＳうつ性自己評価尺度、原著者ＪＷ．Ｗ．Ｋ．Ｚｕｎｇ、日本語版著者福田一彦、小林重雄 Segal et al., European Neuropsychopharmacology17, 194‐198, 2007
　うつ病の治療を困難にしている原因の一つは、うつ病に罹患していたとしても、初期症状の場合、本人にその自覚がないままにうつ病が進行してしまうことである。したがって、本発明の課題は、支障なく日常生活や社会生活を送っており、抑うつ状態にあるという自覚がないが、うつ病に罹患する可能性が高いヒトと健常なヒトを容易に区別する方法を提供することにある。
　本発明者らは、日常生活や社会生活において支障がない健常な女性を被検者として、一般人におけるうつ病を発見することを目的として開発された手法である、うつ状態自己評価尺度（ＣＥＳ－Ｄスケール）による判定を行ったところ、日常生活や社会生活において支障がない被検者間においても、ＣＥＳ－Ｄスケールによる評価により抑うつの程度が高度であり、潜在的な抑うつ状態にあると判定される被検者群と、ＣＥＳ－Ｄスケールによる評価により抑うつの程度が低度～中度であり、健常な被検者群とを、明確に区別することができるという知見を得ていた。今回、被検者の血清中のアポリポタンパク質Ａ－IV、アポリポタンパク質Ｅ、ハプトグロビン、ビタミンＤ結合タンパク質プリカーサー、及びクレアチンキナーゼ－Ｍの量をサンドイッチＥＬＩＳＡで測定したところ、ＣＥＳ－Ｄスケールによる評価において抑うつの程度が高レベルと判定された被検者群において、血清中のクレアチンキナーゼ－Ｍの相対量が有意に低いことを見い出した。これに対し、全クレアチンキナーゼ活性による評価は、抑うつの程度の上昇に伴い、減少傾向は示したが、低度～高度群の間で有意差は認められなかった。以上の結果より、全クレアチンキナーゼ活性を測定して抑うつ状態を判定すること、特にクレアチンキナーゼ－Ｍの相対量を測定することによりうつ病の前段階の抑うつ状態をより正確に判定できることを確認し、本発明を完成するに至った。
　すなわち本発明は、（１）試料中のクレアチンキナーゼを測定することを特徴とするうつ病予備群の判定方法又は診断方法や、（２）抗体を用いてクレアチンキナーゼを測定することを特徴とする上記（１）記載のうつ病予備群の判定方法又は診断方法や、（３）ＥＬＩＳＡにより測定することを特徴とする上記（２）記載のうつ病予備群の判定方法又は診断方法や、（４）クレアチンキナーゼが、クレアチンキナーゼ－Ｍであることを特徴とする上記（１）～（３）のいずれかに記載のうつ病予備群の判定方法又は診断方法や、（５）うつ病予備群が、ＣＥＳ－Ｄスケールによるスコアが１７以上の被検者であることを特徴とする上記（１）～（４）のいずれかに記載のうつ病予備群の判定方法又は診断方法に関する。
ＣＥＳ－Ｄの結果を示す図である。 サンドイッチＥＬＩＳＡによる血清中のクレアチンキナーゼ－Ｍの測定結果を示す図である。血清クレアチンキナーゼ－Ｍ量は、抑うつ度の上昇に伴い減少し、特に高度群では低度群と比べて有意に減少した。 サンドイッチＥＬＩＳＡによる血清中のクレアチンキナーゼ－Ｍの測定に用いられたクレアチンキナーゼ（ＣＫ）標準曲線の一例を示す図である。 酵素活性法による血清中の全クレアチンキナーゼ活性の測定結果を示す図である。全クレアチンキナーゼ活性の上昇に伴い、抑うつの程度が減少する傾向は見られたが、何れの群間にも有意な差は見られなかった。 サンドイッチＥＬＩＳＡによる血清中のアポリポタンパク質Ａ－ＩＶ（Ａ）、アポリポタンパク質Ｅ（Ｂ）、ハプトグロビン（Ｃ）、及びビタミンＤ結合タンパク質プリカーサー（Ｄ）の測定結果を示す図である。これらの物質の血清中での発現量は、抑うつ度が低度～高度と判定された被検者の群間において有意差が認められなかった。
　本発明のうつ病予備群の判定方法としては、試料中のクレアチンキナーゼ量を測定する方法であれば特に制限されず、クレアチンキナーゼのタンパク量を直接定量する方法や、クレアチンキナーゼ酵素活性を測定してクレアチンキナーゼを定量する方法を挙げることができる。タンパク量を直接定量する方法としては、クレアチンキナーゼ特異的抗体をクレアチンキナーゼに反応させて公知の免疫化学的測定により定量する方法や、試料中のクレアチンキナーゼを精製して定量する方法が挙げられる。測定するクレアチンキナーゼとしては、クレアチンキナーゼ－ＭＭ（筋肉型）、クレアチンキナーゼ－ＢＢ（脳型）、クレアチンキナーゼ－ＭＢ（ハイブリット型）の各アイソザイムや、これらを構成するサブユニットや、３種のアイソザイムを全て含む全クレアチンキナーゼが挙げられるが、特にクレアチンキナーゼ－Ｍを対象とすることが好ましい。ここでクレアチンキナーゼ－Ｍは、クレアチンキナーゼのアイソザイムであるクレアチンキナーゼ－ＭＭ（筋肉型）とクレアチンキナーゼ－ＭＢ（ハイブリット型）を構成するクレアチンキナーゼＭ型（筋型）サブユニットを意味する。本発明の判定方法におけるうつ病予備群としては、うつ病を罹患する可能性のある抑うつ状態に陥っているヒトを挙げることができ、例えば、うつ病と診断されてはいないが、うつ病の前段階の抑うつ状態に陥っているヒトや、日常生活や社会生活において支障があると感じることはないが、潜在的に抑うつ状態に陥っており、うつ病に罹患する可能性が通常よりも高いヒトや、実際に初期のうつ病に罹患しているヒト等を挙げることができる。さらには、予備群でさえ検出できるので、うつ病診断にも利用できる可能性が十分にあるといえる。
　上記うつ病とは、様々な定義の方法が試みられているが、例えば、悲しみの程度がその出来事とは不釣り合いに強く、長期にわたり持続する場合であって、日常生活や社会生活において支障が生じている場合をいう。一般的なうつ病の症状としては、睡眠障害の状態や、食欲不振の状態や、内にこもってほとんど口をきかず、食べなくなり、ほとんど眠らなくなるような医学的には植物症状と呼ばれる状態や、動きが鈍くなって自発的な行動を一切しなくなる状態や、強い罪悪感や自己否定の考えにとらわれ、ものごとに集中できなくなる状態など多岐にわたり（例えば、最新メルクマニュアル医学百科家庭版参照）、その症状により、例えば、非精神病性うつ病（nonpsychoticdepression）、精神病性うつ病（psychotic depression）、躁うつ病（bipolar depressed）、統合失調性うつ病（schizoaffective depression）に分類される場合もある。
　本発明のうつ病予備群の判定方法における、抗体を用いてクレアチンキナーゼ、特にクレアチンキナーゼＭ量を測定する方法としては、クレアチンキナーゼ、特にクレアチンキナーゼＭを抗原と抗体の結合反応を利用した免疫学的測定法により測定する方法であれば特に制限されず、例えば、標識物質により標識した抗クレアチンキナーゼ抗体を用いた、イムノクロマト法、ＥＬＩＳＡ等の免疫学的測定法を挙げることができる。クレアチンキナーゼ－Ｍを測定する場合は、具体的には、不溶性担体に結合した抗クレアチンキナーゼ－Ｍモノクローナル抗体（第一抗体）に被検者の血清中のクレアチンキナーゼ－Ｍを捕捉させた後に、不溶性担体に結合したモノクローナル抗体と同じエピトープ又は異なるエピトープを認識する標識モノクローナル抗体（第二抗体）を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡや、不溶性担体に結合した抗クレアチンキナーゼ－Ｍモノクローナル抗体に試料中のクレアチンキナーゼ－Ｍを標識化抗原の存在下で反応させる競合法などの公知の免疫測定法を利用することができるが、高感度であるという点でサンドイッチＥＬＩＳＡが好ましい。上記サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、第一抗体と同一のエピトープを認識する第二抗体を用いて測定すると、クレアチンキナーゼ－ＭＭのみが対象となり、第一抗体と異なるエピトープを認識する第二抗体を用いて測定すると、クレアチンキナーゼ－ＭＭとクレアチンキナーゼ－ＭＢとが対象となるが、いずれにしても血清中のクレアチンキナーゼ活性はそのほとんどがＭＭ型によるものであることから、実質的にクレアチンキナーゼ－ＭＭを測定していることになる。また、上記標識物質としては、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に例示することができる。
　本発明に使用するクレアチンキナーゼに特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記クレアチンキナーゼを抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点で好ましい。クレアチンキナーゼ－Ｍに特異的に結合する抗体は、クレアチンキナーゼ－ＭＭを抗原として用いることで常法により作製することができるが、クレアチンキナーゼ－ＢＢを認識せず、クレアチンキナーゼ－Ｍを特異的に認識する抗体であることが好ましい。
　上記クレアチンキナーゼ、例えばクレアチンキナーゼＭに対する抗体の調製方法としては、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）にクレアチンキナーゼ－ＭＭ若しくはエピトープを含む断片、又は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生させる方法を挙げることができ、例えばモノクローナル抗体の調製においては、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ－ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
　本発明のうつ病予備群の判定方法における、試料中のクレアチンキナーゼを精製して定量する方法は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知のタンパク質精製手段や、ＳＤＳやポリアクリルアミドゲル等を用いた電気泳動法を用いて、試料中のクレアチンキナーゼを分離・精製し、得られたタンパクを公知の定量法により定量して行うことができる。
　本発明のうつ病予備群の判定方法における、クレアチンキナーゼ酵素活性を測定してクレアチンキナーゼを定量する方法としては、クレアチンキナーゼが触媒する、クレアチンとＡＴＰをクレアチンリン酸とＡＤＰに変換する可逆反応を利用する方法が挙げられる。例えば、ｉ）０．１Ｎ塩酸、１００℃の反応条件下、クレアチンとＡＴＰを試料中のクレアチンキナーゼにより反応させて遊離したリン酸を測定する方法や、ii）所定の反応条件下、水素イオン濃度の増減を測定する方法や、iii）クレアチンリン酸とＡＤＰを基質とする試料中のクレアチンキナーゼによる反応を、へキソキナーゼが触媒するグルコースからグルコース-６-リン酸へのリン酸化反応、及び、グルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼが触媒するグルコース-６-リン酸－ＮＡＤＰ系と共役させることにより、生成するＮＡＤＰＨの増加を測定する方法が用いられ、利用する反応に応じて比色法、蛍光法、ＵＶ法等公知の測定方法を採用することができる。
　本発明のうつ病予備群の判定方法に用いられる試料としては、血液、血清、血漿、唾液、涙液、鼻汁、尿等の体液を挙げることができるが、血清、血漿が好ましい。血清を試料として用いる場合は、例えば、被検者の上腕静脈よりそれぞれ採血を行い、得られた血液を４℃にて一晩静置した後、遠心分離し、その上清を血清として－８０℃にて保管後、固相化抗体として、例えば、抗クレアチンキナーゼ－Ｍモノクローナル第一抗体をＥＬＩＳＡプレートに入れ一晩４℃で保存、固相化させ、ＰＢＳＴで洗浄し、１％ＢＳＡでブロッキング後、被検者の血清を必要に応じて希釈し、固相化した抗クレアチンキナーゼ－Ｍモノクローナル抗体と反応させ、ＰＢＳＴ洗浄後、ビオチン標識抗体として抗クレアチンキナーゼ－Ｍモノクローナル第二抗体を用いて発色させプレートリーダーにて吸収度を測定し、別途用意したコントロールに基き作成したスタンダードグラフにより血清中のクレアチンキナーゼ－Ｍの量を算出する方法を挙げることができる。
　クレアチンキナーゼの測定後においてうつ病予備群かどうか判定するには、測定値を予め設定された基準値と比較して、被検者のクレアチンキナーゼ血清濃度が低い場合に、被検者がうつ病予備群に該当すると評価することができ、特に、クレアチンキナーゼ－Ｍの測定を行うことにより、信頼性が高い評価を行うことができる。さらに、精神科医の問診等において、面接者が口頭で行ううつ病評価や、自己記入式のうつ病評価等、臨床的に用いられているうつ病診断手法において、抑うつの程度が低度であると判定された被検者と比較した場合に、被検者のクレアチンキナーゼ血清濃度が有意に低い場合に、被検者がうつ病予備群に該当するとして評価することもできる。上記臨床的に用いられているうつ病診断手法としては、具体的には、臨床において広く用いられており、うつ病診断手法として信頼性の高い、うつ状態自己評価尺度（The Center for Epidemiologic Studies Depression Scale）（「ＣＥＳ－Ｄスケール」ともいう）（原版ＮＩＭＨ米国国立精神保健研究所、Locka et al. 日本語版島悟著、千葉テストセンター発行）による判定方法を例示することができる。かかる方法においては、抑うつの程度は、例えば、ＣＥＳ－Ｄスケールによるスコアが、１１未満である場合は抑うつの程度が低度、１１～１６である場合は抑うつの程度が中度、１７以上である場合は抑うつの程度が高度と判定することが、統計的にうつ病との相関関係が高いと考えられている。また、かかる方法を本発明のうつ病予備群の判定方法と並行して用いることにより、例えば、ＣＥＳ－Ｄスケールによる判定では、抑うつの程度が低度と診断されたが、クレアチンキナーゼ－Ｍ血清濃度が基準濃度以下である被検者について、さらなるうつ病診断に関する検査を行う機会を与えるものであるという点で有用である。ＣＥＳ－Ｄスケールによる判定は、主観的検査であり、誤って答えることも可能であり、理解が不十分で解答があいまいである可能性もあるからである（上記同書参照）。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、以下の実験における被検者は、２つの老人介護施設で介護に携われる女性職員を対象とし、試験開始前に試験内容及び方法などについて十分な説明を行い、同意を得てから実施されたものである。
　ＣＥＳ－Ｄ判定と、うつ病の前段階の抑うつ状態（うつ病予備群）を検出するための各種候補バイオマーカーとの関係を評価するための試験を行った。
［対象者］
　被検者は、女性の看護士及び介護師９４名であった。被検者については日常生活や社会生活において支障がないことを確認し、また、血液検査により、被検者の平均値が基準値内であることを確認した（表１参照）。
［ＣＥＳ－Ｄスケールによる判定による調査］
　被検者は、臨床において広く用いられているうつ病診断手法として信頼性の高いＣＥＳ－Ｄスケールによる判定（The Center for Epidemiologic Studies Depression Scale）抑うつ状態自己評価尺度（原版ＮＩＭＨ米国国立精神保健研究所Locka et al. 日本語版島悟著、千葉テストセンター発行）により各個人のＣＥＳ－Ｄスケールによるスコアを算出した。その詳細を図１に示す。統計的に相関が高いと考えられている、ＣＥＳ－Ｄスケールによるスコアが１１未満である場合は抑うつの程度が低度、１１～１６である場合は抑うつの程度が中度、１７以上である場合は抑うつの程度が高度と判定する方法を用いた。この場合、抑うつの程度が、低度であった者は２６名、中度であった者は３９名、高度であった者は２９名であった（図１参照）。
［採血］
　被検者の上腕静脈より常法に従い採血し、その上清を血清として血糖値等計１２項目について生化学検査を行い９４名の平均値が基準値内であることを確認した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（サンドイッチＥＬＩＳＡによるうつ病の前段階の抑うつ状態を検出するための各種候補バイオマーカーの検出）
［クレアチンキナーゼ－Ｍの測定］
　固相化抗体として抗クレアチンキナーゼ－ＭＭモノクローナル抗体ＣＲ３０１４Ｍ１（フナコシ社製）を、ビオチン標識抗体として抗クレアチンキナーゼ－ＭＭモノクローナル抗体ＣＲ３０１４Ｍ３（フナコシ社製）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、各被検者の血清中クレアチンキナーゼ－Ｍの量を測定した。結果を図２に示す。また、用いた標準曲線の一例を図３に示す。
　また、全クレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性を、文献（日本臨床化学会；ヒト血清中酵素活性測定の勧告法、臨床化学、19、184－207、1990）記載の酵素活性法を参考にして、関東化学株式会社で販売している「シカリキッド　ＣＫ」を用いて日立　LABOSPECT008により分析した。このＮＡＤＰＨの増加速度を分光学的に測定することにより、それに直接比例する検体中のＣＫ活性値を求める方法は、１）JSCC標準化対応法。検量線ＥＲＭ（トレースキャリブ）で検量することにより、JCCLS-SOP法による測定値に一致する。トレースキャリブは、日本・常用控訴標準物質を基準とし、値付けを行っている；２）ダブルカイネティックモードで測定することにより、溶血の影響が回避できる；３）長時間にわたり、データが安定；という特徴を有する。結果を図４に示す。
［アポリポタンパク質Ａ－IVの測定］
　固相化抗体に抗アポリポタンパク質Ａ－IV(Ａ４－１８Ａ３)ＢＭＬ００１（フナコシ社製）を、ビオチン標識抗体に抗アポリポタンパク質Ａ－IV(Ａ４－１１Ｇ１２)ＢＭＬ００３（フナコシ社製）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、各被検者の血清中のアポリポタンパク質Ａ－IVの量を測定した。結果を図５Ａに示す。
［アポリポタンパク質Ｅの測定］
　固相化抗体として抗アポリポタンパク質Ｅ（Ｅ－７Ｃ８)ＢＭＬ０１０（フナコシ社製）を、ビオチン標識抗体として抗アポリポタンパク質Ｅ(Ｅ－３Ｄ２)ＢＭＬ０１２（フナコシ）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、各被検者の血清中アポリポタンパク質Ｅの量を測定した。結果を図５Ｂに示す。
［ハプトグロビンの検出］
　固相化抗体として抗ハプトグロビン（Anti Haptoglobin　MFG101)（コスモバイオ）を、ビオチン標識抗体として抗ハプトグロビン（Anti Haptoglobin　MFG102)（コスモバイオ）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、各被検者の血清中抗ハプトグロビンの量を測定した。結果を図５Ｃに示す。
［ビタミンＤ結合タンパク質プリカーサーの検出］
　Vitamin D Binding Protein,Human,ELISAKitKIT034（コスモバイオ）を用いて、各被検者の血清中抗ビタミンＤ結合タンパク質プリカーサーの量を測定した。結果を図５Ｄに示す。
［結果］
　図２より明らかなように、ＣＥＳ－Ｄにおいて抑うつ度が高度と判定された被検者の群におけるクレアチンキナーゼ－Ｍの平均値は、ＣＥＳ－Ｄスケールによる判定において抑うつの程度が低度と判定された被検者の群におけるクレアチンキナーゼ－Ｍの値と比較して有意に低いものであった。このように、抗体を用いたＥＬＩＳＡによる血清クレアチンキナーゼ－Ｍ量は、抑うつの程度の上昇に伴い減少し、特に高度群では低度群と比べて有意に減少した。これに対して、全クレアチンキナーゼ活性も、抑うつの程度の上昇に伴い減少する傾向がみられ、抑うつの程度が高レベルの群でクレアチンキナーゼ活性の平均値が低い傾向が認められたが、何れの群間にも有意な差は見い出されなかった。（図４参照）。また、表２に示すように、ＣＥＳ－Ｄスコアを低、中、高の３群に分けた血液検査の結果では、全ての平均値が正常値の範囲内に入っていたことから、ＣＥＳ－Ｄスコアは身体的な要因から異なったものではないものと考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　また、図５から明らかなように、血清中のアポリポタンパク質Ａ－ＩＶ、アポリポタンパク質Ｅ、ハプトグロビン、及びビタミンＤ結合タンパク質プリカーサーの発現量は、ＣＥＳ－Ｄにおいて抑うつ度が低度～高度と判定された被検者の群間において有意差が認められなかった。
　以上のとおり、全クレアチンキナーゼ活性測定ではなく、抗クレアチンキナーゼ－Ｍ抗体を用いる免疫学的手法、例えば、ＥＬＩＳＡやイムノクロマト法などの簡便な検査方法により、うつ病予備群を判定できることが明らかとなった。今回の被検者の中にはうつ病患者は認められず、クレアチンキナーゼ－Ｍの量をＥＬＩＳＡで測定することにより、被検者がうつ病の前段階の潜在的な抑うつ状態にあることを判定でき、また、クレアチンキナーゼ－Ｍが、自覚症状がない初期のうつ病も検出するためのより鋭敏な指標となりうる可能性を有し、従来の臨床に用いられてきたうつ病評価尺度とは異なる、生化学的バイオマーカーとして有効であることを確認した。さらに、クレアチンキナーゼ－Ｍの有意に低い被検者と、ＣＥＳ－Ｄスコアが１７以上である抑うつ度が高度である被検者との間に強い相関関係があることから、これまで精神科医の問診で判定されていたうつ病診断を客観的に判定することが可能であることが示唆された。
　本発明の判定方法に用いられるクレアチンキナーゼ、特にクレアチンキナーゼＭの血中濃度は、うつ病の前段階の抑うつ状態である場合に低下するため、被検者がうつ病予備群であるか否かを判定することができ、うつ病の早期発見や治療が生化学的バイオマーカーを用いた物質レベルで可能となる。このように、精神的なストレス社会といわれる現代社会において、こころの病を物質レベルで判定できる本手法はうつ状態を客観的に判定でき、今後、ストレス社会の緩和のために大きく貢献することが期待される。

Claims (5)

  1. 試料中のクレアチンキナーゼを測定することを特徴とするうつ病予備群の判定方法。
  2. 抗体を用いてクレアチンキナーゼを測定することを特徴とする請求項１記載のうつ病予備群の判定方法。
  3. ＥＬＩＳＡにより測定することを特徴とする請求項２記載のうつ病予備群の判定方法。
  4. クレアチンキナーゼが、クレアチンキナーゼ－Ｍであることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載のうつ病予備群の判定方法。
  5. うつ病予備群が、ＣＥＳ－Ｄスケールによるスコアが１７以上の被検者であることを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載のうつ病予備群の判定方法。
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