WO2005092082A1 - 単子葉植物の種子の形質転換法 - Google Patents

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Seiichi Toki
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National Institute Of Agrobiological Sciences
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation

Definitions

  • the present invention relates to a method for transforming monocotyledonous seeds via agrobacterium.
  • One of the means for improving a plant is a "transformation method", in which a desired recombinant gene for modifying a trait is introduced into a plant. Efficient and rapid transformation methods are crucial in the molecular breeding of useful plants, especially cereals, which are staple foods.
  • Examples of the direct transformation method include, for example, the elect-portion method [Non-patent Documents 1 and 2], the particle gun method [Non-patent Document 3], and the polyethylene glycol (PEG) method [Non-patent Document 4]. Is mentioned.
  • the electoral poration method and the particle gun method have been generally used for transforming monocotyledonous plants as a method capable of relatively efficiently introducing genes.
  • Examples of the indirect transformation method include an Agrobacterium-mediated transformation method (hereinafter, may be referred to as an Agrobacterium transformation method).
  • Agrobacterium is a type of plant pathogenic bacteria. When infected with a plant, Agrobacterium has the property of incorporating a T DNA region present on its own plasmid (eg, Ti plasmid or Ri plasmid) into the plant.
  • a T DNA region present on its own plasmid (eg, Ti plasmid or Ri plasmid) into the plant.
  • Agrobacterium transformation method integration of this T DNA region into a plant is used as a means for introducing a gene into a plant. Briefly, plants are infected with an agrobacterium containing the desired recombinant gene. After infection, the desired recombinant gene is transferred from the Agrobacterium territory into plant cells and Incorporated in Nom.
  • the Agrobacterium transformation method has been well established for dicotyledonous plants, and a number of stable transformed plants expressing the desired recombinant gene have been produced to date. .
  • Patent No. 2649287 discloses a method of transforming rice and maize into Agrobacterium territory [Patent Document 1]. This method requires the use of a decultured cultured tissue (for example, callus) as a plant sample for transformation with an agrobacterium. Therefore, prior to infection with agrobacterium, dedifferentiation usually takes 3-4 weeks to produce dedifferentiated tissue from the plant sample to be transformed (eg, leaf sections). Requires an induction period.
  • a decultured cultured tissue for example, callus
  • the method for transforming monocotyledonous plants disclosed in Japanese Patent No. 3141084 is a method using germinated seeds that have been germinated by preculture for four to five days after sowing in a medium containing 2,4D. Reference 2].
  • the transformation method disclosed in Patent Document 2 is an excellent method in that the transformation of monocotyledonous plants can be performed in a shorter time than the transformation method described in Patent Document 1, but still, It was thought that pre-culture for about four to five days was essential before infection with Agrobacterium.
  • Patent Document 1 Patent No. 2649287
  • Patent Document 2 Patent No. 3141084
  • Non-Patent Document l Shimamoto K. et al., Nature, 338: 274-276, 1989
  • Non-Patent Document 2 Rhodes C.A. et al., Science, 240: 204-207, 1989
  • Non-patent document 3 Christou P. et al., Bio / Technology 9: 957-962, 1991
  • Non-patent document 4 Datta, SK et al., Bio / Technology ⁇ 8: 736-740, 1990
  • Non-patent document 5 Portrykus et al., BIOZTECHNOLOGY , 535-542, 1990
  • Non-Patent Document 6 Raineri, DM, et al., BioZTechnology, 8: 33-38, 1990.
  • the present invention is intended to solve the above problems.
  • An object of the present invention is to provide an improved method for transforming monocotyledonous plants into Agrobacterium, and to provide a faster transformation method than conventional methods. According to the method of the present invention, it is possible to produce a transformed sickle much more efficiently and more rapidly than the conventional Agrobacterium transformation method.
  • the present inventors are able to transform monocotyledonous seeds cultured for 13 days in the presence of plant growth factors via agrobacterium.
  • the inventors have completed the present invention by finding out.
  • the present invention provides the following.
  • a method for transforming a monocotyledonous plant comprising the step of infecting a monocotyledonous plant seed with an Agrobacterium containing a desired recombinant gene, wherein the seed is a medium containing a plant growth factor. Germinated seeds germinated by preculture for 1 to 3 days after sowing.
  • the present invention relates to a method for transforming a monocotyledonous plant, which comprises a step of infecting an intact seed with an agrobacterium containing a desired recombinant gene.
  • the seed is infected in an intact state and no treatment is required, such as preparing callus of the plant sample to be transformed!
  • the seed that is subjected to infection with Agrobacterium may be a seed on day 13 after sowing. Also, at the time of infection, the seed may be in a germinated state.
  • the monocotyledon to be transformed is preferably a gramineous plant, and more preferably a rice (Oryza sativa L.). Rice can be either Indy or Japonica.
  • an improved method for transforming monocotyledonous plants via agrobacterium In the method of the present invention, intact seeds of a plant intended to be transformed are infected with an agrobacterium containing the desired recombinant gene.
  • the use of the present invention makes it possible to produce a transformant more efficiently and more quickly.
  • FIG. 1 shows the binary vector used in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the structure of PCAMBIA1390-sGFP.
  • FIG. 2 is a photograph showing a transformant obtained as a result of performing transformation using intact seeds that have been pre-cultured for one day. (Upper: 7 days of selection, Middle: 14 days of selection, Lower: 14 days of regeneration)
  • FIG. 3 is a photograph showing a transformant obtained as a result of performing transformation using intact seeds that had been pre-cultured for 2 days. (Upper: 7 days of selection, Middle: 14 days of selection, Lower: 14 days of regeneration)
  • Fig. 4 is a photograph showing a transformant obtained as a result of performing transformation using intact seeds that have been pre-cultured for 3 days. (Upper: 7 days of selection, Middle: 14 days of selection, Lower : Regeneration day 20)
  • FIGS. 5A and 5B show the relationship between the pre-culture days and the GFP-expressing tissue appearance rate (GFP expression rate in the figure) on day 6 (FIG. 5A) and day 13 (FIG. 5B) of selection.
  • 4 is a graph summarizing the relationship between the number of days of preculture and the appearance rate of a tissue that can grow in the presence of a drug (growth rate in the figure).
  • FIG. 5C is a graph summarizing the relationship between the number of days of preculture and the rate at which regenerated plants are obtained.
  • FIG. 6 is a diagram showing a probe used for Southern hybridization.
  • plant growth factor refers to a factor that promotes the growth of plant cells.
  • Plant growth factors include, but are not limited to, auxins, gibberellins, cytokinins, and other plant hormones.
  • auxins include, but are not limited to, 2,4D, indoleacetic acid (IAA).
  • a "plant” to which the method of the present invention is applied is a monocotyledonous plant.
  • Preferred monocotyledonous plants include grasses (eg, rice and corn).
  • the most preferred plant to which the method of the present invention is applied is rice, especially japonica rice.
  • Plant means a plant and a seed obtained from the plant, unless otherwise specified.
  • an appropriate plant expression vector containing the desired recombinant gene is constructed.
  • a plant expression vector is used in the art. Can be produced using gene recombination techniques well known to those skilled in the art.
  • a pBI or pPZP vector is used to construct a plant expression vector for use in the Agrobacterium transformation method.
  • Preferably used force is not limited to these.
  • a desired recombinant gene refers to any polynucleotide desired to be introduced into a plant.
  • the desired recombinant gene in the present invention is not limited to one isolated from nature, and may include a synthetic polynucleotide.
  • the synthetic polynucleotide can be obtained, for example, by synthesizing or modifying a gene having a known sequence by a method well known to those skilled in the art.
  • the desired recombinant gene in the present invention includes, for example, any polynucleotide which is desired to be expressed in a transformed plant and which is endogenous or exogenous to the plant, When regulation of gene expression is desired, a polynucleotide containing an antisense sequence of the target gene can be used.
  • the desired recombinant gene may include its own promoter (ie, a promoter to which the gene is operably linked in nature) in an operable manner, Alternatively, when it does not contain its own promoter or when it is desired to further contain a promoter other than its own promoter, it is operably linked to any appropriate promoter. Promoters that can be used include constitutive promoters, and promoters that are selectively expressed in parts of plants, as well as inducible promoters.
  • regulatory elements can be further ligated in an operable state in host plant cells.
  • the regulatory elements may suitably include a selectable marker gene, a plant promoter, a terminator, and an enhancer. It is well known to those skilled in the art that the type of plant expression vector and the type of regulatory element used can vary depending on the purpose of transformation.
  • the "selection marker gene” can be used to facilitate selection of a transformed plant.
  • the hygromycin phosphotransferase (HPT) gene for conferring hygromycin resistance, the neomycin phosphotransferase II (NPTII) gene for conferring kanamycin resistance, and the bialaphos gene for conferring bialaphos resistance The power at which a drug-resistant gene such as a phosphinothricin acetyltransferase (PAT) gene can be suitably used.
  • PAT phosphinothricin acetyltransferase
  • the present invention is not limited thereto.
  • Plant promoter refers to a plant-expressed promoter operably linked to a selectable marker gene.
  • Examples of such promoters include, but are not limited to, the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter and the promoter of the nopaline synthase.
  • Terminator 1 is a sequence that is located downstream of a region encoding a protein of a gene and is involved in termination of transcription when DNA is transcribed into mRNA and addition of a poly A sequence.
  • Examples of terminators include, but are not limited to, CaMV35S terminator and terminator of the nopaline synthase gene (Tnos).
  • Ennon-sense can be used to enhance the expression efficiency of the target gene.
  • an enhancer region containing an upstream sequence in the CaMV35S promoter is preferable.
  • a plurality of genes can be used per one plant expression vector.
  • the Agrobacterium used for the transformation of monocotyledonous plants can be any bacteria belonging to the genus Agrobacterium, preferably Agrobacterium tumefaciens.
  • the Agrobacterium is transformed (eg, by electroporation) with a plant expression vector containing the desired recombinant gene.
  • the desired recombinant gene can be introduced into a plant by infecting a seed with the transformed agrobacterium.
  • the introduced recombinant gene is integrated into the genome of the plant.
  • the genome in plants includes not only nuclear chromosomes but also genomes contained in various organelles (eg, mitochondria, chloroplasts, etc.) in plant cells.
  • the seed of the plant intended for transformation is pre-cultured in an intact state after removing the chaff.
  • "Intact" with respect to seeds means that the seeds have been subjected to artificial manipulations such as removing ovules and damaging the scutellum!
  • the seeds are seeded on a medium (for example, N6D medium) containing an appropriate concentration of auxin (for example, 2,4D), typically 1 to 3 times a day. It can be kept warm for days. this The temperature at that time is typically 25-35 ° C, preferably 27-32 ° C.
  • a medium for example, N6D medium
  • auxin for example, 2,4D
  • the seeds are sterilized and then washed thoroughly with water. The seed can then be infected with the transformed agrobacterium under aseptic manipulation.
  • seeds are incubated in the dark, typically for 2 to 15 days, preferably 3 days.
  • the temperature at this time is typically 26 to 28 ° C, preferably 28 ° C.
  • a suitable disinfectant eg, carbecillin, claforan
  • Transformed seeds are selected on the basis of a selection marker (eg, drug resistance such as hygromycin resistance).
  • the selected transformed seeds are transferred to a regeneration medium (eg, MS medium) containing an appropriate plant regulator, and stored for an appropriate period. Can be warmed.
  • a regeneration medium eg, MS medium
  • the redifferentiated transformant is transferred to a rooting medium (for example, an MS medium without a plant regulator). After root development has been confirmed, the transformants can be potted.
  • the desired recombinant gene introduced into the plant acts for an intended purpose in the plant (for example, expression of a new trait of interest or control of expression of a certain endogenous gene). obtain.
  • Whether or not the desired recombinant gene has been introduced into the plant can be confirmed using a method well known to those skilled in the art.
  • This confirmation can be performed using, for example, Northern plot analysis. Specifically, extract the total RNA from the leaf force of the regenerated plant, perform electrophoresis on denatured agarose, and plot on an appropriate membrane. By hybridizing a labeled RNA probe complementary to a part of the transgene on this plot, the mRNA of the gene of interest can be detected.
  • the expression of the target endogenous gene can be tested using, for example, the Northern blot analysis described above.
  • the expression of the target endogenous gene is significantly suppressed compared to its expression in a non-transformed control plant, it was confirmed that the desired recombinant gene was introduced into the plant and acted on the control of the expression Is done.
  • Conventional methods usually require a 3-4 week induction period of dedifferentiation prior to infection with Agrobacterium.
  • the method of the present invention does not require a step of inducing dedifferentiation, so that the number of days required to produce a transformed monocotyledonous plant can be reduced.
  • the time required for selection in the conventional method can be shortened, and the influence of culture mutation can be reduced.
  • the number of days required to produce a transformed monocotyledonous plant is about 32 days, and a conventional method for transforming agrobacterium (for example, , See Example 2 below), which is about one third of the number of days required (about 90 days).
  • a transformation efficiency of 10 to 15% is obtained.
  • Other rice varieties, such as Dotonkoi and Kitake, can achieve the same high transformation efficiency. Therefore, by using the method of the present invention, it is possible to produce a transformed plant more efficiently and more quickly than the conventional transformation method.
  • Transformation was performed using the japonica variety Nipponbare as a material by the following method.
  • the cells were sterilized with 70% ethanol for 30 seconds and subsequently with 2.5% sodium hypochlorite solution for 20 minutes, and then washed with sterilized water.
  • the hygromycin resistance gene, a marker gene for selecting transformed cells, and the GFP (Green Fluorescent Protein) gene, a reporter of transformed cells, are Agrobacterium tumefaciens EHA105 was transformed with the binary vector pCAMBIA1390-sGFP (FIG. 1) on the DNA and used for experiments.
  • N6D medium containing 2,4-D (Toki, Plant Molecular Biology Report, 15 (1) (1997)) and pre-cultured at 30 ° C under light conditions for 13 days. It was subjected to infection with red grove batterery.
  • the composition of the N6D medium is as follows: Claus, 0. 3gZl casamino acid, 2. 8gZl proline, 2mg / l 2, 4- D , 4gZl Gerurai Bok, ⁇ 5. 8 0
  • Rice seeds pre-cultured for 15 days as described above were directly immersed in a liquid of Agrobacterium territory, and then cultured in 2-6-AS medium (Hiei et al., The Plant Journal (1994) 6 (2), 271-282). ) And co-cultured at 28 ° C in the dark.
  • the composition of the 2N6-AS medium is as follows: N6 inorganic salts and vitamins (Chu CC 1978; Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Science Press Peking, pp. 43-50), lgZl casamino acid, 2mg / 1 2, 4-D, 30gZnyo sugar, 2gZl gellite, acetosyringone 20mgZml). Similar results were obtained when using acetociringone at a concentration of 10 to 40 mgZml.
  • the seed power of the pre-cultured agrobacterium using N6D liquid medium containing 500 mg Zl carbecillin was also washed and flown.
  • the transformed seeds were placed on an N6D medium (selection medium) containing 50 mg Z redigromycin and 500 mg Zl carbesilin as a drug.
  • the appearance of transformed cells on the selection medium was evaluated using the appearance and growth of callus after implantation and the expression of the reporter gene GFP as indices.
  • the composition of the regeneration medium is as follows: (MS medium supplemented with carbe-siline (500 mg ZD and hygromycin (50 mg ZD) (30 g Loose, 30gZl sorbitol, 2gZl casamino acid, 2mgZl strength ricetin, 0.02mg / l NAA, 4gZl gellite, ⁇ 5.7) o
  • the redifferentiated transformant was transferred to a rooting medium (hygromycin (MS medium supplemented with 25 mg ZD and containing no holmon)), root growth was confirmed, and the potted plants were lifted. Southern analysis used)
  • Genomic DNA is extracted from the leaves of the obtained regenerated and non-transformed plants, digested with EcoRI, and mixed with the Xmnl probe (1.4 kb) and the sGFP probe (1.4 kb) shown in Fig. 6. Southern plots were performed using the prepared labeled probes. Southern plots were performed according to the 'hanging' method (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). The results indicated that the plasmid DNA was inserted into the chromosome.
  • FIG. 5A shows the results of Example 1 in which the relationship between the number of days of preculture and the appearance rate of GFP-expressing tissues and the relationship between the number of days of preculture and the appearance rate of tissues that can grow in the presence of a drug are summarized.
  • B From the results in Fig. 5, even in preculture for 1 day, GFP-expressing tissues and tissues that can grow in the presence of the drug appear, but the appearance rate increases as the number of days of preculture increases It was shown.
  • FIG. 5C shows the result of a summary of the relationship between the number of days of preculture and the rate at which a regenerated plant body is obtained.
  • the results in FIG. 5 show that even after 1-day preculture, regenerated plants can be obtained, but the appearance ratio increases as the number of days of preculture increases.

Abstract

　単子葉植物のアグロバクテリウムを介する形質転換法を提供すること。 　所望の組換え遺伝子を含むアグロバクテリウムを介して、単子葉植物を形質転換する方法が提供される。この形質転換方法では、単子葉植物の種子を植物成長因子を含む培地に播種後１～３日間前培養して発芽させた後、その種子をアグロバクテリウムによって感染させる工程を包含する。この方法によって、イネを含む単子葉植物を迅速に形質転換することが可能となる。

Description

単子葉植物の種子の形質転換法
技術分野
[0001] 本発明は、単子葉植物の種子のァグロパクテリゥムを介した形質転換方法に関する
背景技術
[0002] 植物を改良するための手段の 1つとして「形質転換法」が挙げられ、形質を改変す るための所望の組換え遺伝子が植物に導入される。効率の良い、迅速な形質転換 法は、有用な植物、特に、主食として重要な食糧である穀物を、分子育種するにおい て極めて重要である。
[0003] 穀物の多く（例えば、イネ、コムギ、ォォムギ、およびトウモロコシ）は、単子葉植物に 分類される。単子葉植物を形質転換するために、これまでに種々の形質転換法が開 発されている。形質転換法は、直接的な形質転換法と間接的な形質転換法とに大き く分けられる。
[0004] 直接的な形質転換法としては、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [非特許文献 1お よび 2]、パーティクルガン法 [非特許文献 3]ならびにポリエチレングリコール (PEG) 法 [非特許文献 4]が挙げられる。エレクト口ポレーシヨン法およびパーティクルガン法 は、遺伝子を比較的効率良く導入し得る方法として、単子葉植物を形質転換するた めに一般に使用されてきた。
[0005] 間接的な形質転換法としては、ァグロパクテリゥムを介した形質転換法 (以下、ァグ ロバクテリウム形質転換法と呼ぶことがある）が挙げられる。ァグロバタテリゥムは、植 物病原細菌の一種である。ァグロバタテリゥムは、植物に感染すると、自らが有するプ ラスミド (例えば、 Tiプラスミドまたは Riプラスミド)上に存在する T DNA領域を、植 物に組込む性質を有する。ァグロパクテリゥム形質転換法では、植物に遺伝子を導 入するための手段として、この T DNA領域の植物への組込みを利用する。簡潔に は、植物は、所望の組換え遺伝子含むァグロパクテリゥムで感染される。感染後、所 望の組換え遺伝子は、ァグロバタテリゥムから植物細胞内に移入され、そして植物ゲ ノムに組込まれる。
[0006] ァグロパクテリゥム形質転換法は、双子葉植物については、十分に確立されており 、現在までに、所望の組換え遺伝子を発現する安定な形質転換植物が数多く作出さ れている。
[0007] 対照的に、ァグロパクテリゥム形質転換法を単子葉植物に適用することは、従来、 一般に困難であるとされてきた。例えば、 Portrykusら [非特許文献 5]は、ァグロパク テリゥムは、単子葉植物に感染しないと報告している。しかし、他方で、ァグロバタテリ ゥムを使用して単子葉植物を形質転換する試みは数多く行われ、その結果、ァグロ ノ クテリゥム形質転換法を単子葉植物に適用できる可能性が見出されてきた。
[0008] 例えば、 Raineriらは、イネの胚盤部分を取り出し、傷をつけて、脱分化を誘導する 培地に置床し、数日後に、その胚盤部分をァグロパクテリゥムで感染した。その結果 、正常な再分ィ匕個体を得るまでには至らな力つたものの、外来遺伝子が導入された カルスを誘導することに成功した [非特許文献 6]。
[0009] 特許 2649287号は、イネおよびトウモロコシについての、ァグロバタテリゥム形質転 換法を開示する [特許文献 1]。この方法では、ァグロパクテリゥムで形質転換するた めの植物試料として、脱分ィ匕した培養組織 (例えば、カルス)を使用することを必要と する。このため、ァグロバタテリゥムでの感染の前に、形質転換しょうとする植物試料（ 例えば、葉切片)から脱分化された培養組織を作製するために、通常、 3— 4週間の 脱分化誘導期間を必要とする。
[0010] 特許 3141084号に開示される単子葉植物の形質転換方法は、 2, 4 Dを含む培 地に播種後 4一 5日間前培養して発芽させた発芽種子を用いる方法である [特許文 献 2]。特許文献 2に開示される形質転換方法は、特許文献 1に記載される形質転換 方法よりも短時間で単子葉植物の形質転換を行なうことができる点で、優れた方法で あるが、依然として、ァグロバタテリゥムの感染前に、 4一 5日間程度の前培養が必須 であると考えられていた。
[0011] 上記のように、従来技術におけるァグロパクテリゥムを介する単子葉植物の形質転 換においては、ァグロバタテリゥムを感染させることができる植物組織'植物細胞の調 製 (例えば、単子葉植物細胞のカルス化）に長時間費やす必要があった。そのため、 単子葉植物細胞の分子育種の効率ィ匕においては、その調製のために時間が障害と なっていた。そのため、形質転換に必要な時間を短縮することは、分子育種の実用 ィ匕においては、非常に重要である。
[0012] 従って、従来法よりも迅速に植物細胞を形質転換する方法の確立が望まれている。
特許文献 1：特許 2649287号
特許文献 2 :特許 3141084号
非特許文献 l : Shimamoto K.ら、 Nature, 338 : 274-276, 1989
非特許文献 2 : Rhodes C. A.ら、 Science, 240 : 204-207, 1989
非特許文献 3 : Christou P.ら、 Bio/Technology 9： 957— 962、 1991 非特許文献 4 : Datta, S. K.ら、 Bio/Technologyゝ 8 : 736—740、 1990 非特許文献 5 : Portrykusら、 BIOZTECHNOLOGY, 535—542, 1990 非特許文献 6 :Raineri, D. M.ら、 BioZTechnology, 8 : 33—38、 1990 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0013] 本発明は、上記課題の解決を意図するものである。本発明の目的は、単子葉植物 のァグロパクテリゥム形質転換法を改良し、従来法よりも迅速な形質転換方法を提供 することにある。本発明の方法によれば、従来のァグロパクテリゥム形質転換法よりも 効率良ぐはるかに迅速に、形質転鎌物を作出することが可能である。
課題を解決するための手段
[0014] 本発明者らは、従来の知見に反して、植物成長因子存在下で 1一 3日間培養した 単子葉植物の種子に対して、ァグロパクテリゥムを介した形質転換が可能であること を見出すことによって、本発明を完成した。
[0015] 従って、本発明は以下を提供する。
1.単子葉植物の形質転換方法であって、所望の組換え遺伝子を含むァグロバクテ リウムで、単子葉植物の種子を感染する工程を包含し、ここで、該種子は植物成長因 子を含む培地に播種後 1一 3日間前培養して発芽させた発芽種子である、方法。
2.前記種子が無傷の種子である、項目 1に記載の方法。
3.前記植物成長因子がオーキシンである、項目 1に記載の方法。 4.前記植物成長因子が 2, 4— Dである、項目 1に記載の方法。
5.前記単子葉植物が、イネ科植物である、項目 1に記載の方法。
6.前記イネ科植物が、イネである、項目 5に記載の方法。
[0016] 本発明は、単子葉植物の形質転換方法に関し、所望の組換え遺伝子を含むァグロ ノ クテリゥムで、無傷の種子を感染する工程を包含する。本発明の方法において、種 子は、無傷の状態で感染され、形質転換しょうとする植物試料のカルスを調製するな どの処理は必要とされな!/、。
[0017] ァグロバタテリゥムでの感染に供される種子は、播種後 1一 3日目の種子であり得る 。また、感染の時点で、種子は、発芽した状態であり得る。
[0018] 形質転換される単子葉植物は、好ましくはイネ科植物であり、より好ましくはイネ (Or yza sativa L. )である。イネは、インディ力種であっても、ジャポニカ種であってもよ い。
発明の効果
[0019] 本発明によれば、改良された、ァグロパクテリゥムを介した単子葉植物の形質転換 方法が提供される。本発明の方法においては、形質転換を意図される植物の無傷の 種子が、所望の組換え遺伝子を含むァグロパクテリゥムで感染される。本発明の使用 により、より効率良ぐそしてより迅速に、形質転 ^¾物を作出することが可能となる。 図面の簡単な説明
[0020] [図 1]図 1は、本発明の実施例 1において使用したバイナリーベクター
PCAMBIA1390- sGFPの構造を示す模式図である。
[図 2]図 2は、 1日間の前培養を行った無傷の種子を用いて形質転換を行った結果得 られた形質転換体を示す写真である。（上段:選抜 7日目、中段:選抜 14日目、下段 ：再分化 14日目）
[図 3]図 3は、 2日間の前培養を行った無傷の種子を用いて形質転換を行った結果得 られた形質転換体を示す写真である。（上段:選抜 7日目、中段:選抜 14日目、下段 ：再分化 14日目）
[図 4]図 4は、 3日間の前培養を行った無傷の種子を用いて形質転換を行った結果得 られた形質転換体を示す写真である。（上段:選抜 7日目、中段:選抜 14日目、下段 ：再分化 20日目）
[図 5]図 5Aおよび 5Bは、選抜 6日目（図 5A)および 13日目（図 5B)における、前培 養日数と GFP発現組織出現率（図中の GFP発現率)との関係、および前培養日数と 薬剤存在下で増殖可能な組織の出現率 (図中の増殖率)との関係をまとめたグラフ である。図 5Cは、前培養日数と再分化植物体が得られる割合との関係をまとめたグ ラフである。
[図 6]図 6は、サザンハイブリダィゼーシヨンに用いたプローブを示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0021] 以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及 しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書 において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味 で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明 細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野 の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明 細書 (定義を含めて)が優先する。
[0022] (用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
[0023] 本明細書において使用する場合、「植物成長因子」とは、植物細胞の成長を促進 する因子をいう。植物成長因子としては、オーキシン、ジベレリン、サイトカイニン、お よび他の植物ホルモンが挙げられる力 これらに限定されない。オーキシンとしては、 2, 4 D、インドール酢酸 (IAA)が挙げられる力 これらに限定されない。
[0024] 本発明の方法が適用される「植物」は、単子葉植物である。好ましい単子葉植物と しては、イネ科植物（例えば、イネおよびトウモロコシ）が挙げられる。本発明の方法が 適用される最も好ましい植物は、イネであり、特に、ジャポニカイネである。また「植物 」は、特に他で示さない限り、植物体、および植物体から得られる種子を意味する。
[0025] (植物発現用ベクターの作製）
単子葉植物に所望の組換え遺伝子を導入するために、所望の組換え遺伝子を含 む適切な植物発現用ベクターが構築される。このような植物発現用ベクターは、当業 者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。ァグロパクテリゥム形質転換 法において使用するための植物発現用ベクターの構築には、例えば、 pBI系または p PZP系のベクターが
好適に用いられる力 これらに限定されない。
[0026] 「所望の組換え遺伝子」は、植物に導入されることが所望される任意のポリヌクレオ チドをいう。本発明における所望の組換え遺伝子は、天然から単離されたものに限定 されず、合成ポリヌクレオチドも含み得る。合成ポリヌクレオチドは、例えば、配列が公 知の遺伝子を、当業者に周知の手法によって合成または改変することにより入手し得 る。本発明における所望の組換え遺伝子としては、例えば、形質転換される植物に おいて発現が所望される、その植物に対して内因性または外因性である任意のポリ ヌクレオチド、および植物においてある内因性遺伝子の発現制御が所望される場合 の、その標的となる遺伝子のアンチセンス配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
[0027] 植物において発現が意図される場合、所望の組換え遺伝子は、自己のプロモータ 一（すなわち、天然において該遺伝子が作動可能に連結しているプロモーター）を作 動可能な様式で含むか、または自己のプロモーターを含まない場合もしくは自己の プロモーター以外のプロモーターをさらに含むことが所望される場合、任意の適切な プロモーターと作動可能に連結される。使用され得るプロモーターとしては、構成的 プロモーター、および植物体の一部において選択的に発現するプロモーター、なら びに誘導性のプロモーターが挙げられる。
[0028] 植物発現用ベクターにおいて、さらに種々の調節エレメントが宿主植物の細胞中で 作動し得る状態で連結され得る。調節エレメントは、好適には、選抜マーカー遺伝子 、植物プロモーター、ターミネータ一、およびェンハンサーを含み得る。使用される植 物発現用ベクターのタイプおよび調節エレメントの種類が、形質転換の目的に応じて 変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
[0029] 「選抜マーカー遺伝子」は、形質転換植物の選抜を容易にするために使用され得 る。ハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォトランスフェラ ーゼ (HPT)遺伝子、およびカナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンフォス フォトランスフェラーゼ II (NPTII)遺伝子、およびビアラフォス耐性を付与するための フォスフィノスリシンァセチルトランスフェラーゼ (PAT)遺伝子のような薬剤耐性遺伝 子が好適に用いられ得る力 これらに限定されない。
[0030] 「植物プロモーター」は、選抜マーカー遺伝子に作動可能に連結される、植物で発 現するプロモーターを意味する。このようなプロモーターの例としては、カリフラワーモ ザイクウィルス (CaMV)の 35Sプロモーター、およびノパリン合成酵素のプロモータ 一が挙げられる力 これらに限定されない。
[0031] 「ターミネータ一」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、 DNA が mRNAに転写される際の転写の終結、およびポリ A配列の付加に関与する配列 である。ターミネータ一の例としては、 CaMV35Sターミネータ一、およびノパリン合 成酵素遺伝子のターミネータ一 (Tnos)が挙げられるが、これらに限定されない。
[0032] 「ェンノヽンサ一」は、 目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。ェンノヽ ンサ一としては、 CaMV35Sプロモーター内の上流側の配列を含むェンハンサー領 域が好適である。ェンノヽンサ一は、 1つの植物発現用ベクターあたり複数個用いられ 得る。
(植物の形質転換）
単子葉植物の形質転換に用いられるァグロバタテリゥムは、任意のァグロバクテリウ ム属細菌であり得、好ましくは Agrobacterium tumefaciensである。ァグロバタテリ ゥムは、所望の組換え遺伝子を含む植物発現用ベクターで (例えば、エレクトロボレ ーシヨンによって)形質転換される。形質転換されたァグロパクテリゥムで種子を感染 することにより、所望の組換え遺伝子を植物に導入し得る。導入された組換え遺伝子 は、植物中のゲノムに組み込まれて存在する。なお、植物中のゲノムとは、核染色体 のみならず、植物細胞中の各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）に含 まれるゲノムを含んで 、う。
[0033] 形質転換が意図される植物の種子は、籾殻を除去した後、無傷の状態で前培養さ れる。種子に関して「無傷」とは、種子が、胚珠を除去すること、および胚盤を傷つけ ることなどの人為的な操作を受けて 、な 、状態であることを!、う。
[0034] 前培養にお!、て、種子は、適切な濃度のオーキシン (例えば、 2, 4 D)を含む培 地 (例えば、 N6D培地）に播種されて、代表的には 1日一 3日間、保温され得る。この ときの温度は、代表的には 25— 35°C、好ましくは 27— 32°Cである。前培養の完了 後、種子は殺菌され、次いで水で十分に洗浄される。次いで、種子は、無菌操作下 で、形質転換されたァグロパクテリゥムで感染され得る。
[0035] ァグロバタテリゥムでの感染（共存培養）の間、種子は、暗黒下で、代表的には 2日 間一 5日間、好ましくは 3日間、保温される。このときの温度は、代表的には 26— 28 °C、好ましくは 28°Cである。次いで、種子は、培地中のァグロバタテリゥムを除菌する ために、適切な除菌剤（例えば、カルべ-シリン、クラフォラン）による処理に供される 。形質転換された種子が、選抜マーカー (例えば、ハイグロマイシン耐性などの薬剤 耐性)を基準として選抜される。
[0036] 適切な除菌条件および選抜条件下での培養後、選抜された形質転換種子は、適 切な植物調節物質を含む再分化培地 (例えば、 MS培地）に移され、適切な期間、保 温され得る。植物体を再生するためには、再分化した形質転換体は、発根培地 (例 えば、植物調節物質を含まない MS培地）に移される。根の発育が確認された後、形 質転換体は、鉢上げされ得る。
[0037] 植物に導入された所望の組換え遺伝子は、植物において意図される目的（例えば 、目的とされる新たな形質の発現、またはある内因性の遺伝子の発現の制御）のため に作用し得る。
[0038] 所望の組換え遺伝子が植物に導入されたカゝ否かは、当業者に周知の手法を用い て、確認され得る。この確認は、例えば、ノーザンプロット解析を用いて行い得る。具 体的には、再生した植物の葉力ゝら全 RNAを抽出し、変性ァガロースでの電気泳動の 後、適切なメンブランにプロットする。このプロットに、導入遺伝子の一部分と相補的 な標識した RNAプローブをハイブリダィズさせることにより、目的の遺伝子の mRNA を検出し得る。あるいは、所望の組換え遺伝子の導入によって、植物における内因性 遺伝子の発現制御が所望される場合、標的となる内因性遺伝子の発現を、例えば、 上記のノーザンプロット解析を用いて、試験し得る。標的となる内因性遺伝子の発現 力 非形質転換のコントロール植物におけるその発現に比べて有意に抑制されてい る場合、所望の組換え遺伝子は植物に導入され、そして発現の制御に作用したこと が確認される。 [0039] 従来の方法は、ァグロバタテリゥムでの感染の前に、通常、 3— 4週間の脱分化誘 導期間を必要とする。対照的に、本発明の方法は、脱分化を誘導する工程を必要と しないので、形質転換単子葉植物を作出するために必要な日数を短縮することが可 能である。さらに、本発明の方法によれば、従来法における選抜に要する期間を短 縮することも可能となり、培養変異の影響を低減することが可能となる。
[0040] 本発明の方法の好ましい 1つの実施態様において、形質転換単子葉植物を作出 するために必要とされる日数は約 32日であり、従来のァグロパクテリゥム形質転換方 法 (例えば、下記実施例 2を参照）において必要とされる日数 (約 90日）の約 3分の 1 程度である。また、本発明の方法によれば、日本晴の種子の場合で、 10— 15%の形 質転換効率が得られる。どんとこい、キタァケなどの他のイネ品種でも同程度に高い 形質転換効率が達成可能である。従って、本発明の方法を使用することによって、従 来の形質転換法よりも効率良ぐおよび迅速に、形質転換植物を作出することが可能 である。
[0041] 以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるも のではない。
実施例
[0042] 以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。この実施例は、本発明を限 定するものではない。実施例で使用した、材料、試薬などは、他に特定のない限り、 商業的な供給源力 入手可能である。
(実施例 1：本発明の方法によるイネ植物の形質転換）
(材料）
ジャポニカ品種である日本晴を材料に以下の方法によって形質転換を行った。
[0043] (種子の滅菌）
70%エタノールで 30秒、続けて 2. 5%次亜塩素酸ナトリウム溶液で 20分間滅菌し た後、滅菌水で洗浄した。
[0044] (ベクター）
形質転換細胞を選抜するマーカー遺伝子であるハイグロマイシン耐性遺伝子と、形 質転換細胞のレポーターとなる GFP (Green Fluorescent Protein)遺伝子を T DNA上に有するバイナリーベクター pCAMBIA 1390— sGFP (図 1 )を Agrobacter ium tumefaciens EHA105菌に形質転換し実験に用いた。
[0045] (ァグロバタテリゥムを感染させるイネ種子の前培養）
滅菌したイネの種子を、 2, 4—Dを含む N6D培地（Toki、 Plant Molecular Biolo gy Report, 15 (1) (1997) )に置床し、 30°C明条件下で 1一 3日間前培養しァグロ バタテリゥムによる感染に供した。 N6D培地の組成は、以下のとおりである：
Figure imgf000011_0001
クロース、 0. 3gZlカザミノ酸、 2. 8gZlプロリン、 2mg/l 2, 4— D、 4gZlゲルライ卜 、 ρΗ5. 80
[0046] (ァグロバタテリゥムの感染）
上記の様に 1一 5日間前培養したイネ種子をそのままァグロバタテリゥム菌液に浸せ きした後、 2Ν6— AS培地（Hieiら、 The Plant Journal(1994) 6 (2)、 271— 282) に移植し、暗黒下 28°Cで共存培養を行った。 2N6— AS培地の組成は、以下のとお りである： N6の無機塩類及びビタミン類（Chu C. C. 1978 ;Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Science Press Peking, pp. 43—50)、 lgZlカザミノ酸、 2m g/1 2, 4— D、 30gZンョ糖、 2gZlゲルライト、ァセトシリンゴン 20mgZml)。なお 、ァセトシリンゴンは、 10— 40mgZmlの濃度を用いた場合でも、同様の結果が得ら れた。
[0047] (除菌及び形質転換カルスの選抜）
共存培養の完了後、 500 mgZlカルべ-シリンを含有する N6D液体培地を用いて ァグロパクテリゥムを前培養した種子力も洗 、流した。次 、で形質転換した細胞を選 抜するために形質転換処理種子を薬剤として 50 mgZレヽィグロマイシン及び 500 mgZlカルべ-シリンを含有する N6D培地 (選抜培地）に置床した。選抜培地上に おける形質転換細胞の出現は、置床後のカルスの出現および増殖、ならびにレポ一 ター遺伝子 GFPの発現を指標に評価した。
(形質転換体の再分化）
選抜培地に置床後 2週間目に、選抜培地上で増殖の見られたカルスを再分ィ匕培地（ Toki 1997)に移植した。再分化培地の組成は、以下のとおりである：（カルべ-シリ ン（500mgZDおよびハイグロマイシン（50mgZDを補充した MS培地（30gZlスク ロース、 30gZlソルビトール、 2gZlカザミノ酸、 2mgZl力イネチン、 0. 02mg/l N AA、 4gZlゲルライト、 ρΗ5. 7) o
(鉢上げ）
再分化した形質転換体を、発根培地 (ハイグロマイシン（25mgZDを補充した、ホ ルモンを含まない MS培地）上に移して、根の発育を確認した後に、鉢上げした。 (再生植物体を用いたサザン分析）
得られた再生植物体及び非形質転換植物体の葉からゲノム DNAを抽出し、 EcoRI で消化した後、図 6に示される Xmnlプローブ（1.4kb)及び sGFPプローブ (1.4kb)を混 合して調製した標識プローブを用いて、サザンプロットを行った。サザンプロットは、 '吊'法 (MolecularCloning, A Laboratory Manual,弟 2版, Maniatisら, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)に従って行った。その結果、染色体にプラスミド DNA が挿入されたことが、示された。
(結果）
播種後、 1日間、 2日間、および 3日間前培養し、薬剤 (ハイグロマイシン)選抜の 7 日目、および 14日目、ならびに再分ィ匕培地へ移してから 14日目の組織を観察した。 その結果を、図 2— 4に示す。各図の左側のパネルは、 GFPの蛍光を観察した結果 を示す。また、各図の右側のパネルは、自然光下で観察した組織を示す。これらの結 果から明らかなように、播種後、 1日間、 2日間、および 3日間前培養した無傷の種子 のいずれを用いた場合であっても、 GFPを発現し、かつ薬剤に耐性な組織が得られ た (上段および中段)。さらに、再分化培地での培養の結果、再分化植物体が得られ た（下段)。この結果は、 1一 3日間の前培養をした無傷の種子がァグロバタテリゥムに よって感染され、外来遺伝子がその種子の細胞内に導入されたことを示す。
[0048] 実施例 1の結果を、前培養日数と GFP発現組織出現率との関係、および前培養日 数と薬剤存在下で増殖可能な組織の出現率との関係をまとめた結果を図 5Aおよび Bに示す。図 5の結果から、 1日間の前培養においても、 GFPを発現する組織、およ び薬剤存在下で増殖し得る組織は出現するが、その出現する割合は、前培養日数 の増加とともに増加することが示された。
[0049] 形質転換し、ハイグロマイシン耐性となった組織を、再分化させたところ、 1日間の 前培養の場合は 2クローン (再分化率 1. 7%)、 2日間の前培養の場合は 11クローン (再分化率 10. 5%)、 3日間の前培養の場合は 44クローン (再分ィ匕率 38. 6%)が再 分化した。この結果は、 1一 3日間前培養した無傷の種子を用いることによって、植物 体に再分化する形質転換体が得られたことを示す。
[0050] 前培養日数と再分化植物体が得られる割合との関係をまとめた結果を図 5Cに示す 。図 5の結果から、 1日間の前培養においても、再分化植物体が得られるが、その出 現する割合は、前培養日数の増加とともに増加することが示された。
[0051] さらに、再分化植物体の葉を用いてサザンプロットを行ったところ、外来遺伝子が植 物細胞の染色体に挿入されていることが確認された。
[0052] 従って、本発明の方法を用いることによって、植物の迅速な形質転換が可能になつ

Claims

請求の範囲
[1] 単子葉植物の形質転換方法であって、所望の組換え遺伝子を含むァグロバクテリウ ムで、単子葉植物の種子を感染する工程を包含し、ここで、該種子は植物成長因子 を含む培地に播種後 1一 3日間前培養して発芽させた発芽種子である、方法。
[2] 前記種子が無傷の種子である、請求項 1に記載の方法。
[3] 前記植物成長因子がオーキシンである、請求項 1に記載の方法。
[4] 前記植物成長因子が 2, 4 - Dである、請求項 1に記載の方法。
[5] 前記単子葉植物が、イネ科植物である、請求項 1に記載の方法。
[6] 前記イネ科植物が、イネである、請求項 5に記載の方法。
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