明 細 書
微生物及び微生物由来酵素によるァニリン誘導体のァセチル化 技術分野
[0001] 本発明は、ァニリン誘導体を代謝する微生物、及びその微生物が産生する酵素を 利用してァニリン誘導体のアミノ基をァセチルイ匕する技術に関するものである。なお、 本明細書において「ァニリン誘導体」の語は、特に断りのない限り、アミノ基を有する 芳香族化合物(芳香族ァミン、又はァリルアミン (arylamine) )とレ、う広義の意味で使用 しており、単環式のァニリン類のみならずァミノナフタレン類などの多環式芳香族化 合物も含む意味である。
背景技術
[0002] ァニリン誘導体 (芳香族ァミン)のァセチル化体は、様々な産業分野で利用されて いる。例えば、アミノ基を 2つ有するフエ二レンジァミンの一方のァミノ基がァセチル化 されたアミノアセトァニリドは、ァゾ染料の中間体である。ァミノフエノールのァセチノレ 化体であるヒドロキシァセトァニリド(ァセトアミドフエノール [AAP] )は、医薬品名をァ セトァミノフェンと称し鎮痛剤として広く利用されている。クロロアセトァ二リド、メチルァ セトァニリドは、それぞれクロロア二リン、トルイジンのァセチルイ匕体である力 除草剤 の原料等として使用されている。ァミノ安息香酸のァセチルイ匕体であるァセトアミド安 息香酸は、顔料等の中間体であり、また、特表 2002-541139号公報(国際公開番号 WO00/59875)には、後期糖化最終生成物 (AGE)形成の新規阻害剤として有効で ある旨開示されている。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 上述のように、アミノアセトァニリドなどの上記ァセチル化体(ァセトァニリド類)は産 業上非常に有用であるが、その製造において、従来の有機化学的な合成法は複雑 な製造工程を要し、高コストなものとなっていた。例えば、 2_アミノアセトァ二リドを製 造する場合、従来法では安価な 2—フエ二レンジァミンから直接 2_アミノアセトァニリド を合成することは困難であり、アミノ基両方がァセチル化されてしまうため、図 11に示
すようにまず、出発基質としてァセトァニリドゃニトロア二リン等を調製する。ァセトァニ リドを出発基質とした場合、ニトロ化の後 0- (2-)体と m- (3-)体が生じ、これらを分別 する必要がある。また、二トロア二リンを出発基質とした場合、ァセチル化とニトロ基の 還元ステップが必要となる。し力も、有機反応では反応条件により生成した 2_アミノア セトァニリドから分子内脱水により 2-メチルベンズイミダゾールが生じることがある。
[0004] このような従来の有機化学的な合成法の問題を解決するため、ァニリン誘導体を代 謝する微生物、及びその代謝に関わる酵素を利用した、まったく新しいァセトァニリド 類の製造方法の開発が期待される。即ち、微生物やその酵素を用いて、ァニリン誘 導体のアミノ基をァセチル化することによって、 1段階の反応で簡便にし力、も低コスト で目的とするァセトァニリド類を製造する新たな製造方法の開発が強く望まれる。
[0005] 現在、微生物由来の酵素としていくつかのァセチルトランスフェラーゼが同定、報告 されている(例えば、 DDBJ I GenBank / EMBLデータベースにァクセッション番号: AE017004、 locus_tag : BC2140として登録されている N-hydroxyarylamine
O-acetyltransferaseなど)。し力し、これらの酵素活性および基質特異性は不明であ り、現状では利用困難である。また、フエ二レンジァミンのようなアミノ基を 2つ有する 芳香族化合物に作用し、その一方のァミノ基のみァセチル化するという特徴をもった 酵素は従来まったく知られてレ、なかった。
[0006] 本発明は、このような状況に鑑みなされたものであり、その目的は、微生物及び微 生物由来酵素を用いてァニリン誘導体のアミノ基をァセチル化する新規方法を提供 すること、並びに当該方法を用いてァセトァニリド類の新規製造方法を提供すること にある。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者は、各地から採取した土壌試料の中から、ァニリン誘導体の代謝能を有 する微生物を探索した結果、フエ二レンジァミンの一方のアミノ基をァセチル化してァ ミノァセトァニリドを生成する性質をもった 2種類の菌株(後述の PDa-1株および
10-L-2株)を分離.同定すると共に、これらの菌株が産生する酵素がフエ二レンジアミ ンのみならず多数のァニリン誘導体を基質とする広い基質特異性を有すること、さら に単環式のァニリン類のみならず多環式のアミノナフタレン類にも作用し、そのアミノ
基をァセチル化すること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、産業上有用な発明として、以下の(1)一(13)の発明を包含する ものである。
(1) ァニリン誘導体 (芳香族ァミン)の代謝活性を有する微生物または同微生物由 来の酵素を使用して、ァニリン誘導体のアミノ基をァセチル化する方法。
(2) 上記(1)の方法であって、 2_フエ二レンジァミン、 3_フエ二レンジァミン、 4—フ ヱ二レンジァミン、 2—トルイジン、 3—トルイジン、 4—トルイジン、 2_クロロア二リン、 3_ クロロア二リン、 4—クロロア二リン、 2—ァミノフエノール、 3—ァミノフエノール、 4—ァミノ フエノーノレ、 2_アミノ安息香酸、 3_アミノ安息香酸、 4_ァミノ安息香酸、 2_ニトロァニ リン、 3_ニトロァニリン、 4_二トロア二リン、ァニリン、 4—ァミノサリチノレ酸、 5_アミノサリ チル酸、 2—ァミノフルオレン、 1_ナフチルァミン、及び 1—ァミノ— 2_ナフトールからな る群から選ばれる、 1又は複数のァニリン誘導体のアミノ基をァセチルイ匕する方法。
(3) 休止菌体を使用することを特徴とする上記(1)又は(2)の方法。
(4) 上記(1)一 (3)のレ、ずれかの方法に使用される微生物。
(5) 上記(1)一 (3)のレ、ずれかの方法に使用されるバチルス属菌。
(6) バチルス ·セレウス菌(Bacillus cereus) PDa-1株(受領番号 FERM ABP-10292)
(7) バチルス ·セレウス菌(Bacillus cereus) 10_L_2株(受領番号 FERM ABP-10291)
(8) 上記(1)又は(2)の方法に使用される微生物由来の酵素。
(9) 上記(1)又は(2)の方法に使用される微生物由来アミノアセチルトランスフェラ
(10) 上記(1)又は(2)の方法に使用される微生物由来ァセチル CoA依存型ァミノ ァセチルトランスフェラーゼ。
(11) 上記(1)又は(2)の方法に使用される微生物由来の酵素であって、ァミノナフ タレン類のアミノ基をァセチル化する酵素活性を有する酵素。
(12) 上記(1)一(3)のいずれかの方法によって、ァニリン誘導体のアミノ基をァセ チル化する工程を含む、化合物の製造方法。
(13) 化合物が、 2_アミノアセトァ二リド、 3_アミノアセトァ二リド、 4_アミノアセトァ二 リド、 2-メチルァセトァニリド、 3—メチルァセトァニリド、 4ーメチルァセトァニリド、 2-ク 口ロアセトァ二リド、 3_クロロアセトァ二リド、 4_クロロアセトァ二リド、 2—ヒドロキシァセ トァニリド、 3—ヒドロキシァセトァ二リド、 4—ヒドロキシァセトァ二リド、 2_ァセトアミド安 息香酸、 3_ァセトアミド安息香酸、 4_ァセトアミド安息香酸、 2_ニトロァセトァニリド、 3_二トロアセトァ二リド、 4_ニトロァセトァニリド、ァセトァニリド、 2—ヒドロキシ _4—ァセ チルァミノ安息香酸、 2—ヒドロキシー 5—ァセチルァミノ安息香酸、 2—ァセトアミドフル オレン、 1_ナフチルァセトアミド、及び N— (2—ヒドロキシ _1_ナフチル)ァセトアミドの いずれかである、上記(12)の製造方法。
発明の効果
[0009] 本発明によれば、従来の化学合成では複雑な製造工程を要し、高コストとなってい たアミノアセトァニリドなどの化学物質を 1段階の反応で簡易かつ低コストで製造する こと力 Sできる。
本発明の更なる特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるで あろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で一層明白になるであ ろう。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]本発明による、 19種の各ァニリン誘導体からァセトァニリド誘導体への変換を説 明する図である。
[図 2]本発明による、更に他の 5種の各ァニリン誘導体からァセトァニリド誘導体への 変換を説明する図である。
[図 3]PDa_l株および 10-L-2株由来のァリルアミン N-ァセチルトランスフェラーゼによ る、ァニリン誘導体のァセチル化を説明する図である。
[図 4]ァニリン誘導体をァセトァニリド誘導体へ変換する合成系と、ァセチル CoAの再 生系とを組み合わせた反応システムを説明する図である。
[図 5]PDa_l株による 2—フエ二レンジァミンの代謝産物の質量分析結果を示すグラフ である。
[図 6]PDa_l株による 2—フエ二レンジァミンの代謝産物の NMR解析結果を示す図で
ある。
[図 7]PDa_l株による 2_フエ二レンジァミンのァセチル化を経時的に示すグラフである 。黒丸印は生成された 2_アミノアセトァニリド(mM)、白丸印は 2_フエ二レンジァミン の残存濃度 (mM)、白四角印はコントロール (対照)の 2—フヱニレンジァミンの残存 濃度 (mM)、黒三角印は波長 660nmにおける濁度であり、反応に使用した PDa-1 株の休止菌体の量を示す。
[図 8]10-L_2株による 4_フエ二レンジァミンのァセチル化を経時的に示すグラフであ る。黒丸印は生成された 4—アミノアセトァニリド (mM)、白丸印は 4一フエ二レンジアミ ンの残存濃度(mM)、白四角印はコントロール(対照)の 4一フエ二レンジァミンの残 存濃度 (mM)、黒三角印は波長 660nmにおける濁度であり、反応に使用した
10-L-2株の成長期菌体の量を示す。
[図 9]DE52カラムクロマトグラフィーによる PDa-l株由来の酵素精製結果を示すグラフ である。各フラクション(3 ml/tube)の酵素活性(U/ml)およびタンパク質量(mg/ml)を それぞれ、黒丸印、白丸印で示す。
[図 10]DE52カラムクロマトグラフィーによる 10-L-2株由来の酵素精製結果を示すダラ フである。各フラクション(4 ml/tube)の酵素活性(U/ml)およびタンパク質量 (mg/ml) をそれぞれ、黒丸印、白丸印で示す。
[図 11]従来の有機化学的な合成法による、 2-アミノアセトァ二リドの製造工程を説明 する図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の一形態について説明する。
[ 1 ]ァニリン誘導体を代謝する微生物の分離 ·同定
本発明者は後述するように、採取した土壌試料の中から、 2_フヱニレンジアミンを 代謝する菌株 Bacillus cereus PDa-1および 4—フエ二レンジアミンを代謝する菌株 Bacillus cereus 10_L_2を分離すると共に、これらの菌株によって 2_フエ二レンジアミ ンおよび 4 フエ二レンジアミンはそれぞれ 2—アミノアセトァニリドおよび 4 アミノアセト ァニリドへと変換されること、即ち両菌株によってフエ二レンジァミンの一方のアミノ基 のみァセチルイ匕できることを明らかにした(実施例 1 · 2)。なお、両菌株 PDa-1および
10-L-2は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター (日本国茨 城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵便番号 305-8566) )にそれぞれ受領番号 FERM ABP-10292 (受領日: 2005年 3月 7日)、 FERM ABP- 10291 (受領日: 2005年 3 月 7日)として寄託されている。
[0012] 両菌株はバチルス.セレウス菌(Bacillus cereus)に属し、ァニリン誘導体を代謝する 酵素としてァリルアミン N -ァセチルトランスフェラーゼ(図 3)を生産する点において共 通している。他方、両菌株は、フエ二レンジァミンからアミノアセトァニリドへの変換に 対する各種環境因子の影響試験の結果や、各菌体を用いた基質特異性試験の結 果、さらに各菌体中に含まれる酵素の種類やその緩衝液中での安定性において相 違がみられた。各菌体における酵素精製の結果から、 PDa-l株由来のァリルアミン N-ァセチルトランスフェラーゼは 1種類であるのに対して、 10-L-2株は 2種類のァイソ ザィム(ァリルァミン N -ァセチルトランスフェラーゼ Iおよび II)を生産することがわかつ た(図 9および図 10)。
[0013] 両菌株由来の酵素の基質特性を休止菌体 (resting cell)および成長期菌体( growing cell)を用いて試験したところ、以下の表 1に示すように、いずれもその基質特 異性は大変広いものであった。なお、表 1中、 decreasing (%)」は各菌株培養液に おける基質の減少率、「DI_MS analysis」は各基質より生成した代謝産物の DI-MS分 析結果を示す。
[0014] [表 1]
Decreasing (%)
Substrate DI-MS analysis (m/z)
Strain PDa-1 Strain 10-レ 2
2-フエ二レンジァミン 84.3 83 150(M+), 132, 108, 92
3-フエ二レンジァミン 6.3 5.7 ND°
4-フエ二レンジァミン 100 150(M+), 108, 91
2-トルイジン 16.1 9 NDC
3-トルイジン 26.0 42 149(M+), 107, 91
4-トルイジン 19.0 29 149(M+), 107, 91
2-ク口ロアユリン 9.6 12 NDC
3-クロロァニリン 12.2 72 NDd
4-ク口ロア-リン 40.5 32 169 and 171 (M+), 127, 129, 91
2-アミノフエノール 30.1 92 151 (M+), 130, 109, 93
3-アミノブエノール 28.5 77 ND"
4-アミノフエノール 48.0 Ϊ 5Ϊ (Μ+), 109
2-ァミノ安息香酸 100s 100*
3-ァミノ安息香酸 28.4 100 179(M+), 137, 120
4-ァミノ安息香酸 10.6 18 NDC
2-ニトロァニリン 0 0 NDC
3-ュトロアュリン 16.9 40 180(M+), 138, 108
4-ニトロァニリン 0 0 NDC
ァニリン 13.6 10 135(M+), 93, 77
4-アミノサリチル酸 100 195(M+), 177, 152, 135
5-アミノサリチル酸 100 ― β 195(M+), 177, 152, 135
2-ァミノフノレオレン 100 223(M+), 181 , 165, 149, 133 ス1レファメタジン 0 NDC
1 -ナフチルァミン 100 ― θ
185(M+), 143
1 -アミノ -2-ナフトール 100 ― θ 201 (M+), 183, 159
[注]
a) PDa-1の休止菌体を用いた反応系は pH力 .8のため、反応中に基質が重合及び 変性してしまい、定量できなかった。
b) 基質は 100%分解されたが、代謝中間体を分離'同定できなかった。
c) ND :変換量が微量であったため、 DI-MS分析の際に明瞭なイオンピークを検出で きなかった。
d) ND: PDa-1株の休止菌体を用いた変換反応では基質の分解量が微量であった ため生成物も少なぐ DI-MS分析の際に明瞭なイオンピークを検出できなかった。一 方、 10-L-2株の growing cellを用いた変換反応では基質の分解は良好であった。 e) 10-L-2株では未決定。
図 1および図 2には、 MS分析の結果から予測される両菌株由来の酵素による各ァ 二リン誘導体からァセトァニリド誘導体へのァセチル化の反応機構が示される。表 1 に示すように、 PDa_l株の休止菌体を用いた反応系では、 1_ナフチルァミン、 1_アミ
ノー 2—ナフトールなどのアミノナフタレン類も基質に含まれることが確認された(図 2)。
[0016] 両菌株由来の酵素はフエ二レンジァミンに対して高い活性を示し、いずれもフエ二 レンジァミンの 2つのアミノ基のうち一方のみをァセチル化するという既報の酵素には なレ、特徴を有することから、その特徴を表す表現としてこれらの酵素を「フヱ二レンジ ァミン モノァセチルトランスフェラーゼ」と呼ぶことができる。
[0017] このように、上記菌株 PDa-1および 10_L_2、あるいはこれらの菌株が産生する酵素 を利用して各ァニリン誘導体のアミノ基をァセチルイ匕することが可能であり、この方法 によってアミノアセトァニリドなどの有用化合物を従来法に比し 1段階の反応で簡易か つ低コストで生産することが可能である。また、本発明は上記 2種の菌株を用いた方 法に限定されるものではなぐ後述の実施例に示すような方法で土壌中、水中などか ら微生物のスクリーニングを行レ、、上記 2種の菌株以外にァニリン誘導体を代謝する 微生物を分離'同定し、得られた微生物又はその酵素を利用してァニリン誘導体のァ セチル化を行ってもよレ、。今回得られた 2種の菌株はいずれもバチルス'セレウス菌 であったため、バチルス属菌とりわけバチルス'セレウス菌に着目してスクリーニング を行うことは好ましい方法である。また、遺伝情報を利用して上記 2種の菌株と rRNA の相同性が高い近縁株をスクリーニングすることとしてもよレ、。 (PDa-1株と 10-L-2株 の 16S rRNAの相同性(%)は、 99.5%であった。 )
[0018] 微生物を用いてァニリン誘導体のァセチル化を行う場合、休止菌体(resting cell) の方が一般に酵素活性が高ぐ分解率も良ぐ変換反応後の目的とする反応生産物 の回収 ·精製もより容易と考えられることから、休止菌体を用いる方法が好ましいが、 これに限定されず、成長期菌体 (growing cell)を使用してもよい。表 1に示す試験で は PDa_l株は休止菌体を使用し、 10-L-2株は成長期菌体を使用した。
[0019] 本発明において微生物を使用する際の使用条件 (基質濃度、炭素源、 pH、温度、 培地組成、培養方法 (振盪あるいは攪拌による培養等)、その他の培養条件など)は 特に限定されるものではなぐ使用する微生物の性質 ·特徴に応じてァセチルイヒに最 適な使用条件を選択すればよい。例えば、エネルギー源(ァセチル CoA供給源)とし てグノレコース、フルクトース、スクロースなどの安価な糖類を反応溶液中に添カ卩すると
、反応を継続して行うことができ、基質 (ァリルアミン類)の初発濃度を高くできると考
えられる。また、酵素反応時に基質濃度が高いと基質阻害が生じることがあるので、 低濃度で反応を開始して基質が減ったことを確認しながら、反応系に基質を再添カロ する方法は最終的な収率を向上することができ、好ましレ、方法と考えられる。
[0020] PDa_l株および 10-L-2株由来の酵素は、いずれもァセチル CoA依存型ァリルアミ ン N -ァセチルトランスフェラーゼであったため(実施例 4、図 3)、微生物を用いずに その精製酵素を用いた反応系では反応の進行に伴いァセチル CoAを追加すること が好ましい。あるいは、ァセチル CoAを追加することなしに変換反応を継続する方法 として、ァリルアミン類をァセトァニリド類へ変換する合成系と、この反応により生じた CoASHを再びァセチル CoAへ変換する再生系とを組み合わせた反応システムを構 築することは好ましい方法である。例えば、図 4に示すように、 CoASH,ァセチルリン 酸およびホスホトランスァセチラーゼによる再生系と組み合わせて、ァセチル CoAをリ ユースする方法が挙げられる。その他に、(l) CoASH、 NAD+およびァセトアルデヒド デヒドロゲナーゼ(E.C. 1.2.1.10)による再生系と組み合わせてァセチル CoAをリュー スする方法、(2) CoASH、 ATPおよびァセチル CoAシンテターゼ(E.C. 6.2.1.1)による 再生系と組み合わせてァセチル CoAをリユースする方法、が考えられる。
[0021] 本発明によるァリルアミン類からァセトァニリド類への変換反応は、従来の有機化学 的合成法(図 11)と比較して次のような利点が挙げられる。 (1)反応に触媒として重 金属等を必要とせず、し力も常温で反応が進行する。 (2)基質特異性が広いため、 種々の基質力も有用な化学物質を製造できる。 (3)アミノ基以外にァセチル化される 置換基 (ァミノ基および水酸基など)や反応性の高レ、置換基 (アルデヒド基など)を有 する化合物の場合、有機化学的手法では副産物が生じる。一方、本発明による合成 法では 1段階で反応が進行し、 目的とする化合物が得られる。例えば、フエ二レンジ ァミンからアミノアセトァニリドへの変換反応のように従来の有機化学的手法では数ス テツプ必要な反応経路を 1段階で済ませることができるので、安価な 2_フヱニレンジ ァミンから高価な 2_アミノアセトァニリドへの生産等に利用できる。
[0022] [2]酵素の精製方法
以下では、 PDa-1株および 10-L-2株からの酵素の精製方法の一例について説明 する力 勿論これとは異なる方法で酵素の精製を行ってもょレ、。
[0023] [a] PDa- l株由来酵素の精製と特性解析
[a-1 ]酵素の精製
<方法 >
酵素精製におけるすべての操作は 4°C以下で行った。遠心分離は全て、 20, 000 X g , 10分間の条件で行った。精製には 1 mM DTTおよび 1 m EDTAを含む 20 mM Tris_HCl緩衝液(pH 8.0) (以下 buffer A)を用いた。本酵素 1 unitは 30°Cで 1時間に 1 μ molの 2_アミノアセトァ二リドを生成する酵素量と定義した。タンパク質の定量は Lowry法によった。また、比活性はタンパク質 1 mgあたりの unit数で示した。
[0024] (1) 無細胞抽出液の調製
培養液4.4しから?0&- 1株の菌体を23.8 g (湿菌体)得た。湿菌体 1 gあたり 10 mlの buffer Aをカロえ、菌体懸濁液(240 ml)を調製した。懸濁液 25 mlずつ KUBOTA model 201 M Isonatorを用いて 180 W, 15分間超音波処理することで破砕した。破砕液を 遠心分離して上清(無細胞抽出液)を回収した。 (Fraction 1 , 218 ml)
[0025] (2) 除核酸操作
無細胞抽出液に、 20% (w/v)硫酸ストレプトマイシン溶液を終濃度力 1 % (w/v)とな るように攪拌しながら添加した。 30分間攪拌した後、遠心分離により沈殿した核酸類 を除いた。 (Fraction 2, 220 ml)
[0026] (3) 硫安分画
Fraction 2に、粉末状に砕いた硫安を 50%飽和になるように攪拌しながら加えた。
30分間攪拌後、遠心分離により沈殿を除去した。得られた上清に硫安を 80%飽和と なるように加え、 30分間攪拌後、遠心分離により沈殿を回収した。沈殿を buffer A 11 mlに溶解した後、 1Lの buffer Aに対して透析した。 3時間おきに透析外液を交換し、 合計 9時間透析した。 (Fraction 3 , 20 ml)
[0027] (4) DE-52カラムクロマトグラフィー
Fraction 3を、 buffer Aで平衡化した DEAE-Cellulose (DE52) (Whatman International Ltd, Maidstone, England)を充填したカラム(1.5 X 17.5 cm)にアプライ した。 90 mlの buffer Aでカラムを洗浄した後、 0—0.4 M NaClを含む 360 mlの buffer A を用いてリニアグラジェント法により、流速 40 ml/hで酵素を溶出した。各フラクション(
3.0 ml/tube)の酵素活性およびタンパク質を測定した。高活性画分を集め buffer A 1 Lに対して 3時間おきに透析外液を交換し、合計 6時間透析を行った。 (Fraction 4, 27 ml)
[0028] (5) POROS 50HQカラムクロマトグラフィー
BioCAD Workstation system (PerSeptove Biosystems, uambndge, MAJおよび POROS 50HQカフム (PerSeptove Biosystems)による perfusion chromatography workstationにより活性画分を分画した。 Fraction 4を buffer Aで平衡化した POROS 50HQカラム(0.46 X 10.0 cm)にアプライした。 buffer Aでカラムを洗浄した後、 0—0.5 M NaClを含む buffer Aを用いてリニアグラジェント法により、流速 15 ml/minで酵素を 溶出した。各フラクション(6 ml/tube)の酵素活性およびタンパク質量を測定した。 ( Fraction 5 , όθ ml)
[0029] (6) POROS 20PEカラムクロマトグラフィー
Fraction 5を 2 M硫酸アンモニゥムを含む buffer Aで平衡化した POROS 20PE ( PerSeptove Biosystems)を充填したカラム(0·46 X 10.0 cm)にアプライした。 2 M硫酸 アンモニゥムを含む buffer Aでカラムを洗浄した後、 2.0—0 M硫酸アンモニゥムを含 む buffer Aを用いて BioCAD Workstation systemを用いてリニアグラジェント法により 、流速 15 ml/minで酵素を溶出した。各フラクション (2 ml/tube)の酵素活性およびタ ンパク質量を測定した。 (Fraction 6, 36 ml)
[0030] (7) ゲル濾過クロマトグラフィー
Fractionり Apollo 20 ml high-performance centrifugal concentrators (Oroital Biosciences, MA, USA)により 1 mほで濃縮した。濃縮液を 0.2 M NaClを含む buffer Aで平衡化した TOYOPEARL HW-55F (東ソ一,東京)を充填したカラム(2.0 X 97 cm)にアプライした。同 bufferを用いて流速 20 ml/hで酵素を溶出した。各フラクション (2 ml/tube)の酵素活性およびタンパク質を測定し、高活性画分を集めた。 (Fraction 7 , 8 ml)
[0031] ぐ結果 >
硫安分画に続いて、 DE52カラムクロマトグラフィー、 POROS 50HQカラムクロマトグ ラフィー、 POROS 20PEカラムクロマトグラフィーに供した後、ゲル濾過クロマトグラフィ
一に供することによって本酵素を精製した。各精製段階における酵素活性およびタ ンパク質量を表 2に示す。最終調製酵素は 4%の収率で 94倍に精製され、比活性は 3 U/mgであった。同調製酵素について Nativeなポリアクリルアミド電気泳動および SDS-PAGE電気泳動による純度の検討を行った力 単一ではなかった。
[表 2]
Total Total Specific
activity Recovery
Fraction activity protein
(units) (mg) (units/mg) (%)
1 :Cell extract 42 1,300 0.032 100
2:Streptomycin sulfate 48 1,800 0.027 110
3:Ammonium sulfate 20 250 0.08 48
4:DE52 8.9 9.9 0.9 21
5:P0R0S 50HQ 8.7 4.5 1.9 21
6:POROS 20PE 5.0 3.4 1.5 12
7:Toyopearl HW-55F 1.7 0.56 3.0 4.0
[0033] [a_2]酵素の特性解析:ゲル濾過法による分子量の測定
ぐ方法 >
分子量は、ゲル濾過法により決定した。マーカー(各 4 mg)を用いて、上記 (7)で述 ベた方法に従レ、 TOYOPEARL HW-55F (2.0 X 97 cm)上で行った。マーカーとして、 チトクローム c (12, 500)、キモトリプシノゲン(25,000)、オルアルブミン(45,000)、ゥシ 血清アルブミン(68,000)、アルドラーゼ(158,000)を使用した。
[0034] ぐ結果 >
ゲル濾過法による本酵素の分子量は 31,000であった。
[0035] [b] 10-L-2株由来酵素の精製と特性解析
[b-1]酵素の精製
<方法 >
酵素精製におけるすべての操作は 4°C以下で行った。遠心分離は全て、 20,000 X g , 10分間の条件で行った。精製には 20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0) (以下 buffer B)
を用いた。本酵素 1 unitは 30°Cで 1時間に Ι μ πιοΐの 4-アミノアセトァ二リドを生成する 酵素量と定義した。タンパク質の定量は Lowry法によった。また、比活性はタンパク質 1 mgあたりの unit数で示した。
[0036] (1) 無細胞抽出液の調製
培養液 2. 4Lから 10-L-2株の菌体を 19 g (湿菌体)得た。湿菌体 1 gあたり 10 mlの buffer Bをカロえ、菌体懸濁液(190 ml)を調製した。懸濁液 25 mlずつ KUBOTA model 201 M Isonatorを用いて 180 W, 15分間超音波処理することで破砕した。破砕液を遠 心分離して上清(無細胞抽出液)を回収した。 (Fraction 1 , 190 ml)
[0037] (2) 除核酸操作
無細胞抽出液に、 20% (w/v)硫酸ストレプトマイシン溶液を終濃度力 Sl % (w/v)とな るように攪拌しながら添加した。 30分間攪拌した後、遠心分離により沈殿した核酸類 を除いた。 (Fraction 2, 190 ml)
[0038] (3) 硫安分画
Fraction 2に、粉末状に砕いた硫安を 50%飽和になるように攪拌しながら加えた。 30分間攪拌後、遠心分離により沈殿を除去した。得られた上清に硫安を 85%飽和と なるように加え、ー晚攪拌後、遠心分離により沈殿を回収した。沈殿を buffer B 20 ml に溶解した後、 1Lの buffer Bに対して透析した。 3時間おきに透析外液を交換し、合 計 9時間透析した。 (Fraction 3, 33 ml)
[0039] (4) DE-52カラムクロマトグラフィー
Fraction 3を、 buffer Bで平衡化した DEAE-Cellulose (DE52) (Whatman International Ltd, Maidstone, England)を充填したカラム(2.2 X 11 cm)にアプライし た。 200 mlの buffer Bでカラムを洗浄した後、 0—0.3 M NaClを含む 600 mlの buffer B を用いてリニアグラジェント法により、流速 40 ml/hで酵素を溶出した。各フラクション( 4 ml/tube)の酵素活性およびタンパク質を測定した。高活性画分(NAT Iおよび NAT Π画分)を集め buffer B 1Lに対して 3時間おきに透析外液を交換し、合計 6時間透析 を行った。 (Fraction 4, NAT I fraction 32 mlおよび NAT II fraction 36 ml0ここで、「 NAT I」「NAT II」は、 10-L-2株由来の 2種類のァリルアミン N-ァセチルトランスフェラ ーゼを意味する。 )
[0040] (5) DEAE-Toyopearlカラムクロマトグラフィー
Fraction 4 (NAT I fractionおよび NAT II fraction)をそれぞれ、 buffer Bで平衡化し た DEAE-Toyopearl (東ソ一、東京)を充填したカラム(2.2 X 11 cm)にアプライした。
200 mlの buffer Bでカラムを洗浄した後、 0 0.3 M NaClを含む 120 mlの buffer Bを用 いてリニアグラジェント法により、流速 40 ml/hで酵素を溶出した。各フラクション(3 ml/tube)の酵素活性およびタンパク質を測定した。高活性画分を集め buffer B 1Lに 対して 3時間おきに透析外液を交換し、合計 6時間透析を行った。 (Fraction 5, NAT I fraction 19 mlおよび NAT II fraction 21 ml)
[0041] (6) POROS 20PEカラムクロマトグラフィー
Fraction 5 (NAT I fraction 19 mlおよび NAT II fraction 21 ml)をそれぞれ 2 M硫酸 アンモニゥムを含む buffer Bで平衡化した POROS 20PE (PerSeptove Biosystems)を 充填したカラム(0.46 X 10.0 cm)にアプライした。 2 M硫酸アンモニゥムを含む buffer B でカラムを洗浄した後、 2.0— 0 M硫酸アンモニゥムを含む buffer Bを用いて BioCAD Workstation systemを用いてリニアグラジェント法により、流速 15 ml/minで酵素を溶 出した。各フラクション (2 ml/tube)の酵素活性およびタンパク質量を測定した。 ( Fraction 6, 3り ml)
[0042] (7) ゲル濾過クロマトグラフィー
Fractionり Apollo 20 ml high-performance centrifugal concentrators (Oroital Biosciences, MA, USA)により 1 mほで濃縮した。濃縮液を 0.2 M NaClを含む buffer B で平衡化した TOYOPEARL HW-55F (東ソ一,東京)を充填したカラム(2.0 X 97 cm) にアプライした。同 bufferを用いて流速 20 ml/hで酵素を溶出した。各フラクション (2 ml/tube)の酵素活性およびタンパク質を測定し、高活性画分を集めた。 (Fraction 7)
[0043] ぐ結果 >
硫安分画に続いて、 DE52カラムクロマトグラフィーに供したところ、ァリルァミン N -ァ セチルトランスフェラーゼ活性のピークが 2ピーク見られた(図 10)。そこで、各ピーク を NAT Iおよび NAT IIとし、精製を進めた。各精製段階における酵素活性およびタン パク質量を表 3に示す。最終調製酵素は 4%の収率で 94倍に精製され、比活性は 3 U/mgであった。同調製酵素について Nativeなポリアクリルアミド電気泳動および
SDS-PAGE電気泳動による純度の検討を行った力 単一ではなかった
[0044] [表 3]
Total Total Specific
Fraction Activity Protein Activity Recovery
(%) (U) (mg) (U.mg 1)
1: Cell extract 22.7 1400 0.016 100
2: Streptomycin sulfate 19 1300 0.014 83
3: Ammonium sulfate 5 450 0.011 22
I II I II I II I II
4: DE52 4.7 8.5 8.7 18.7 0.54 0.45 21 37
5: DEAE-Toyopearl 650S 2.1 5 0.81 3.17 2.6 1.6 9 22
6: POROS 20PE 0.5 1.8 0.41 0.62 1.2 2.9 2 8
[0045] [b-2]酵素の特性解析:ゲル濾過法による分子量の測定
ぐ方法 >
分子量は、ゲル濾過法により決定した。マーカー(各 4 mg)を用いて、上記 (7)で述 ベた方法に従レ、 TOYOPEARL HW-55F (2.0 X 97 cm)上で行った。マーカーとして、 チトクローム c (12, 500)、キモトリプシノゲン(25,000)、オルアルブミン(45,000)、ゥシ 血清アルブミン(68,000)、アルドラーゼ(158,000)を使用した。
[0046] ぐ結果 >
ゲル濾過法による NAT Iおよび NAT IIの分子量はともに 35, 400であった。 以上の方法により精製した PDa_l株および 10-L-2株由来のァリルアミン N-ァセチ ノレトランスフェラーゼについて、各酵素の特徴を比較してまとめた表を以下に示す。
[0047] [表 4]
PDa-1株由来酵素 10-L-2株由来酵素 酵素 1種類 2種類 酵素生産に与える補助 1% (w/v) ショ糖および 1% (w/v) ポリペプトンを 基質の結果 0.15% (w/v) 硝酸アンモニ 培地に添加すると酵素の ゥムを培地に添加すると酵 合成量が増加する。
素の合成量が向上する。
酵素精製時の安定性 1 mM EDTAおよび 1 mM 20 mM Tris-HCl緩衝液
DTTを添加した 20 mM (pH 8.0) のみで安定。 Tris-HCl緩衝液 (pH 8.0)
で安定。
Nativeな状態での分子 31,000 NAT Iおよび NAT IIとも 里 に 35,400
基質特異性 特になし 3位に置換基を有する誘 導体に対して高い活性を 示す。
[0048] 上記のように、 10-L-2株由来の酵素は、 3位に置換基を有する誘導体(3-トルイジ ン、 3-クロロア二リン、 3-ァミノフエノール、 3-ァミノ安息香酸、 3-二トロア二リン)に対し て比較的高い活性を示した。
PDa-1株および 10-L-2株以外の菌株を使用する場合も、同様の方法により菌株か らの酵素精製が可能である。 実施例
[0049] 以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明する力 本発明はこれら 実施例によって何ら限定されるものではない。
[0050] [実施例 1 :フエ二レンジアミンを代謝する微生物の分離 ·同定]
[1-1]フエ二レンジアミンを代謝する微生物の分離
<方法 >
1.分離源
各地から採取した土壌試料 350を分離源として用いた。
[0051] 2.分離培地の調製
o-、 m -、 P-体のフエ二レンジァミン.二塩酸塩を基質として用いた。下記の表 5に分
離用培地組成を示す。培地の pHが 5.5および 6.8になるように KH POおよび Na HPO
•12H 0の添加量を調整した。同培地はフエ二レンジァミンとは別に炭素源としてショ 糖、窒素源として硝酸アンモニゥムを含む。 A液および B液はオートクレープにて別 々に殺菌し、フヱニレンジァミン'二塩酸塩を含む C液は濾過除菌装置を用いて除菌 した。冷却後これらを混合した。また、固体培地は 1.5% (w/v)寒天をカ卩えて調製した
[表 5] pH 5.5 pH 6.8
A) Buffer solution (100 ml)
KH2P04 2.00 g 0.45 g
Na2HP04- 12H20 0.25 g 1.80 g
NaCI 0.10 g 0.10 g
Yeast extract 0.04 g 0.04 g
Sucrose 2.00 g 2.00 g
Agar 3.00 g 3.00 g
B) Metal solution (30 ml)
MgS04- 7H20 0.10 g 0.10 g
CaCI2'2H2〇 0.10 mg 0.10 mg
CuS04- 5H20 0.10 mg 0.10 mg
ZnCI2 0.10 mg 0.10 mg
FeS04-7H20 0.10 mg 0.10 mg
C) Substrate solution (70 ml)
Phenylenediamine■ 2HCI 0.24 g 0.24 g
(2-, 3-, or 4-)
KH2P04 0.60 g
Na2HP04- 12H20 ― 0.60 g
3.分離方法
lgの土壌を 0.8% (w/v) NaCl溶液 9 mlに懸濁後 2— 3分間静置し、上清 1 mlを表 5 に示した 0.12% (w/v)フエ二レンジァミン培地 6.7 mlに添カロした。これを 30°Cで 1一 2週 間振盪培養した後、生育の見られた培養液をフエ二レンジァミン固体培地上に塗抹
した。さらに、単一コロニーをフエ二レンジァミン固体培地に移し、同培地にて良好な 生育を示した菌株をフエ二レンジァミン分解菌として保存した。
[0054] 4.培地中のフエ二レンジァミンの定量
芳香族ァミン類の定量法であるジァゾカップリング法によった。
[0055] ぐ結果 >
1.フヱニレンジアミンを代謝する菌株の分離
フエ二レンジアミンは、 2_、 3_、 4-体 3種類とも水溶液中では不安定で、菌が摂取し ないコントロール培地では集積培養 7日間のうちに培養液は褐色一黒色に変わる。ま ず、菌の生育が良好かつ培養液の色が変色しない集積培養サンプルを選抜した。
350の土壌試料から目的にかなう菌株を 2-フヱニレンジァミン分離培地(pH 6.8)およ び 4-フエ二レンジァミン分離培地(pH 5.5)よりそれぞれ 17株、 44株分離した。
[0056] 2.フエ二レンジアミンを代謝する菌株の選択
2-フエ二レンジアミンを代謝する菌株 17株について肉汁平板培地および 2-フエニレ ンジァミン平板培地上にて純粋分離を行い、生育の良好な株を 4株 (PDa_l、 PDa_2、 PDa_3、 PDa-4)選択した。さらに、液体培地にて基質の分解を確認し、以後の実験 にはこれら 4株のうち最も生育の良好な PDa-1株を用いることにした。
[0057] 4-フエ二レンジアミンを代謝する菌株 44株から純粋分離を行い、生育の良好な株を
3株(10-L-1、 10-L-2、 10-L-3)選択した。以後の実験には生育の最も良好な
10-L-2株を用いることにした。
[0058] [1-2]分離菌 PDa-1および 10-L-2株の同定
<方法 >
分離菌の同定は形態的性質、生化学的試験および 16S rRNA遺伝子の解析によつ た。
[0059] ぐ結果 >
同定試験に用いた PDa-1および 10-L-2株の菌学的性質を下記の表 6に示す。ダラ ム陽性で周鞭毛を有し、ォキシダーゼは陰性、カタラーゼ活性は陽性であった。また 、試験に用いた糖 (D-ァラビノース、 D-フルクトース、ショ糖、 D-グルコース)から発酵 により嫌気的にも酸の生成が見られた。さらに、胞子形成能も見られた。以上の結果
は、 Bacillus属の特徴を示すものであった。そこで、 16S rRNA遺伝子の解析を行った 。 PDa-1株(1544 bp)および 10-L-2株(1540 bp)の 16S rRNA遺伝子の塩基配列をそ れぞれ決定した。 DDBJデータバンクのデータベースを用いてシークェンス解析したと ころ、既報の Bacillus cereusと高い類似性を示した。以上より、両株を Bacillus cereus と同定した。また、 PDa_l株と 10-L-2株由来の 16S rRNA遺伝子の相同性を調べたと ころ、 99.5。/0であった。
[表 6]
Test or characteristic Strain PDa-1 Strain 10-L-2
Morphology rod rod
Size (μηι) 1.0x2.4-3.4 1.5x3.1
Aerobic growth + +
Gram stain positive positive
Flagella peritrichous peritrichous
Spore formation + +
Catalase + +
Oxidase
O-F test fermentative fermentative
16S rRNA analysis B. cereus B16 (99.7%) B. cereus ZK (99.8%)
B. cereus PR-1 (99.7%)
[1-3]本実施例の結果と考察
フエ二レンジアミンを含む三種類(2_、 3-、 4-)の分離培地(pH 6.8:fe pH 5.5)を 用いてスクリーニングを行った結果、 2-フエ二レンジアミンを代謝する Bacillus cereus PDa-1および 4-フエ二レンジアミンを代謝する Bacillus cereus 10_L_2を分離すること ができた。ァミノフエノール (水酸基置換体)やフエ二レンジァミン (ァミノ基置換体)等 のァニリン誘導体は、水溶液中での安定性は pHに依存する。 2-フエ二レンジアミンは 中性付近で安定であるのに対して、 4-フエ二レンジアミンは弱酸性において安定で、 基質が安定な pH条件において基質を代謝する菌株を分離できる傾向がみられた。
PDa-1株と 10-L-2株由来の 16S rRNA遺伝子の相同性は、 99.5%であった力 実施 例 3で述べる基質特異性の相違 (前記表 1)から、同種に属するが異なる菌であると
結論した。 ほた、 10-L-2株は 2種類のァリルアミン N-ァセチルトランスフェラーゼを 生産する(前記表 4)。)
[0062] [実施例 2 : Bacillus cereus PDa-1および Bacillus cereus 10_L_2株の生育とフエニレ ンジァミンの代 ί]
[2-l] B. cereus PDa- 1および B. cereus 10- L_2株の生育とフエ二レンジァミンの代謝 に与える各種環境因子の影響
ぐ方法 >
1. B. cereus PDa- 1および B. cereus 10-L-2株の生育とフエ二レンジァミンの代謝に 与える基質濃度の影響
a.目 ij培養
1 % (w/v)ポリペプトンを含む 0.1 % (w/v)フエ二レンジアミン培地 (7 ml/tube)にて 12 時間前培養した。
[0063] b.本培養
PDa-1株の本培養:前培養液 1 mlを 1 % (w/v)ショ糖、 0.15% (w/v) NH NOを含む
4 3 培地(pH 6.8、 70 ml/500 mlコルベン)に 2_フエ二レンジァミン'二塩酸塩(0.10%—
0.20% (w/v) )を添加し培養した。
[0064] 10-L-2株の本培養:前培養液 1 mlを 1 % (w/v)ポリペプトンを含む 0.07%フエ二レン ジァミン培地(pH 5.5, 70 ml/500 mlコルベン)に 4_フエ二レンジァミン'二塩酸塩(
0.035%— 0.21% (w/v) )を添加し培養した。
[0065] cフエ二レンジァミンおよび代謝産物の定量 HPLCによった。
分析条件
カラム: Inertsil ODS-2 (4.6 X 150 mm)
溶離液: 20 mM H PO -NaH PO緩衝液(pH 3.0) -MeOH (98: 2)
3 4 2 4
流速: 0.7 ml/min
検出波長: 274 nm
[0066] 2. B. cereus PDa- 1および B. cereus 10-L-2株の生育とフエ二レンジァミンの代謝に 与える炭素源の影響
前培養は上記 1. a.で述べた条件とし、本培養においてショ糖(0.1% (w/v) 2-フエ二
レンジァミン培地、 PDa-1株)またはポリペプトン(0.07% (w/v) 4-フエ二レンジアミン培 地、 10-L-2株)のかわりに培地に添加する炭素源としてポリペプトン、 D-グルコース、 ショ糖、コハク酸 2ナトリウム、酢酸ナトリウム、グリセロールを終濃度 1 % (w/v)となるよ うにカ卩えた。
[0067] 3. B. cereus PDa- 1および B. cereus 10-L-2株の生育とフエ二レンジァミンの代謝に 与える pHの影響
前培養培地は上記 1. a.で述べた条件とし、本培養において培地の pHが 3.5 8.5と なるように KH POおよび Na HPO - 12H 0の添加量を調整した。本培地でのフエユレ ンジァミン濃度は 0.1 % (w/v) 2 -フエ二レンジアミン'二塩酸塩および 0.07% (w/v) 4- フエ二レンジァミン'二塩酸塩とした。
[0068] ぐ結果 >
1. B. cereus PDa- 1および B. cereus 10-L-2株の生育とフエ二レンジァミンの代謝に 与える基質濃度の影響
B. cereus PDa_l株: 2_フエ二レンジアミン*二塩酸塩濃度が 0.125% (w/v)までは
PDa-1株は良好な生育とともに基質を 100%分解した力 S、 0.15% (w/v)濃度の培地で は、生育は不良で残存基質量(%)は 40%であった。
[0069] B. cereus 10_L_2株: 0.035%— 0.105% (w/v)までは生育とともに基質を 100%分解 した。しかし、 0.035% (w/v)フエ二レンジァミン培地と比較して基質濃度が増加する につれて生育も不良となり、 0.14% (w/v)培地での残存基質量(%)は 50%であった
。一方、 0.20% (w/v)培地においても本菌は生育を示した力 4-フエ二レンジァミンの 分解はまったく見られなかった。
[0070] 2. B. cereus PDa- 1および B. cereus 10-L-2株の生育とフエ二レンジァミンの代謝に 与える炭素源の影響
B. cereus PDa_l株:試験した中で、 1.0% (w/v)ショ糖を含む 2 -フエ二レンジァミン 培地において良好な生育を示し、基質も完全に分解された。しかし、 1.0% (w/v)コハ ク酸 2ナトリウムを含む同培地では生育は不良で、基質の減少も全く見られなかった。
[0071] B. cereus 10-L-2株:試験した中で、 1.0% (w/v)ポリペプトンを含む 4-フエ二レンジ ァミン培地において非常に良好な生育を示し、基質も完全に分解された。一方、
PDa-1株が良好な生育を示した 1.0% (w/v)ショ糖添加培地では、生育は不良で残存 基質量(%)は 50%であった。
[0072] 3. B. cereus PDa_lおよび B. cereus 10-L-2株の生育とフエ二レンジァミンの代謝に 与える pHの影響
B. cereus PDa_l株:試験した中で、 pH 7.5の 2-フエ二レンジァミン培地において良 好な生育とともに基質が 80%分解された。
[0073] B. cereus 10-L-2株:試験した中で、 pH 4.5および 5.5の 4-フエ二レンジァミン培地 において良好な生育を示すとともに基質がほぼ完全に分解された。
[0074] [2-2]代謝産物の分離'同定
1. B. cereus PDa- 1の培養と休止菌体の調製
1 % (w/v)ポリペプトンを含む 0.1 % (w/v) 2-フエ二レンジアミン培地 (7 ml/tube)にて PDa-1株を前培養後、 1 % (w/v)ショ糖、 0.15% (w/v) NH NOを含む培地(70 ml/500
4 3
mlコルベン)に前培養液 1 mlを添加し、 24時間培養した。集菌した菌体を反応溶液( 組成を下記表 7に示す)に濁度(OD )が 30となるように懸濁し、 30°Cで振とうした。各
660
時間ごとに反応溶液をサンプリングし、 PDa-1株の生育と 2-フエ二レンジァミンの減少 を HPLCにて定量した。
[0075] [表 7]
KH2P0 0.45 g
Na2HP04- 12H20 2.4 g
NaCI 0.10 g
MgS04- 7H20 0.10 g
CaCI2-2H20 0.10 mg
CuS04- 5H20 0.10 mg
ZnCI2 0.10 mg
FeS04- 7H20 0.10 mg
H20 200 ml(pH 6.8)
[0076] 2. B. cereus 10-L- 2株の培養
1 % (w/v)ポリペプトンを含む 0·07%4-フエ二レンジァミン培地(7 ml/tube)にて
10-L-2株を前培養後、同じ組成の培地(70 ml/500 mlコルベン)に前培養液 1 mlを 添加し、 24時間培養した。各時間ごとに反応溶液をサンプリングし、 10-L-2株の生育 と 4-フエ二レンジァミンの減少を HPLCにて定量した。
[0077] 3.代謝産物の分離'同定
遠心分離し、菌体と上清を分別した。上清を濃縮後、 3N NaOHにて PH 11とし、酢 酸ェチルにて蓄積した代謝産物を反応溶液より抽出した。抽出後のサンプルを
DI-MS分析および NMR分析した。
[0078] ぐ結果 >
DI-MS分析および1 H-NMRおよび13 C-NMR分析より得られたスペクトルを解析し、 代謝産物はアミノアセトァニリドであると同定した。 2_フエ二レンジァミンおよび 4_フエ 二レンジアミンはそれぞれ 2-アミノアセトァニリドおよび 4_アミノアセトァ二リドに変換さ れたと結論した。図 5および図 6に 2_フヱニレンジァミンより生成した代謝産物の各ス ぺクトノレを示す。
[0079] [2- 3] B. cereus PDa- 1および Β· cereus 10- L- 2株によるフエ二レンジァミンからァミノ ァセトァニリドの生産
<方法 >
PDa-1の培養および本菌の休止菌体を用いた反応は前記 [2-1]に述べた方法に 従った。反応溶液中の本菌由来の濁度(OD )および反応溶液中の 2-フエ二レンジ ァミン (初濃度: 5.5 mM)と代謝産物 2-アミノアセトァ二リドの量を HPLCにて定量した
[0080] 10-L-2の growing cellを用いた反応は前記 [2-2]に述べた方法に従った。反応溶 液中の本菌由来の濁度(〇D )および反応溶液中の 4-フエ二レンジァミン (初濃度:
3.9 mM)と代謝産物 4_アミノアセトァ二リドの量を HPLCにて定量した。
[0081] ぐ結果 >
PDa_lの休止菌体を用いた反応において反応 30時間の時点で 2-フヱニレンジアミ ンの残存量は 0.14 mM、 2_アミノアセトァ二リドの生産量は 3.80 mMであり、モル変換 率は 71%であった(図 7)。
[0082] 10-L-2の growing cellを用いた反応において培養時間 30時間の時点で 4-フヱユレ
ンジァミンの残存量は 0%であり、 4-アミノアセトァ二リドの生産量は 3.5 mMであり、モ ル変換率は 90%であった(図 8)。
[0083] [2-4]本実施例の結果と考察
フエ二レンジァミンの代謝に与える基質濃度の影響を調べたところ、反応溶液ほた は培地)中の基質濃度の増加に伴い、基質の分解率および分解速度は減少した。フ ェニレンジアミン類は変異原性を示すことが報告されており、その毒性から菌の増殖 および代謝酵素の生合成系が抑制されたと思われる。 PDa-1株および 10-L-2株の生 育とフエ二レンジァミンの分解に与える pHの影響を調べたところ、 PDa-1株は中性付 近で生育および基質の分解が良好であった。一方、 10-L-2株は弱酸性側で生育お よび基質の分解が良好であった。この結果は、スクリーニング時の pH領域と類似して いる。フヱニレンジァミンの分解に与える炭素源の影響および pHの影響試験結果は 両菌において相違が見られた。
[0084] フエ二レンジァミンからの代謝産物を分離し、アミノアセトァニリドであると同定した。
両菌はフエ二レンジァミンの有する 2つのアミノ基のうち、片方のみをァセチル化した。 し力も、そのモル変換効率は高ぐ PDa-1株は 71 % (2-フエ二レンジアミン→2_ァミノ ァセトァニリド)であり、 10-L-2株は 90% (4-フエ二レンジアミン→4-アミノアセトァニリド )であった。
[0085] [実施例 3:ァニリン誘導体に対する基質特性]
<方法 >
PDa-1株の休止菌体調製法および反応は、実施例 2の [2-1]で述べた方法によつ た。 10-L-2株の培養方法は、実施例 2の [2-2]で述べた方法によった。
[0086] 用いた基質は、ァニリンおよびその誘導体である 2-, 3-, 4_フエ二レンジァミン、 2-, 3-, 4-トルィジン、 2-, 3-, 4-クロロア二リン、 2-, 3-, 4-ァミノフエノール、 2-, 3_, 4-ァ ミノ安息香酸、 2-, 3-, 4-二トロア二リン、 4-, 5-ァミノサリチル酸、 2-ァミノフルオレン、 スルファメタジン、 1-ナフチルァミン、 1-ァミノ- 2-ナフトールである。前記表 7に組成を 示した 5 mM基質を含む反応溶液を調製した(ただし、 2-ァミノフルオレン、スルファメ タジン、トナフチルァミン、 1-ァミノ- 2-ナフトールの 4種類は水に難溶のため終濃度 1 mMとした)。
[0087] 各時間サンプリングを行い、基質の減少量を分光光学的または HPLCにて定量した 。フエ二レンジァミン以外のァニリン誘導体の定量はジァゾカップリング反応によった 。さらに、蓄積した代謝産物(ァセトァニリド誘導体)の同定は HPLCおよび Dト MS分 析によった。
[0088] ぐ結果 >
PDa-1株の resting cellおよび 10-L- 2株の growing cellを用いたァニリン誘導体に対 する基質特異性試験結果を前記表 1に示した。さらに MS分析の結果から推定した反 応機構を図 1に示した。
[0089] ぐ本実施例の結果と考察 >
PDa_l株および 10-L-2株由来のァセチルトランスフェラーゼは幅広い基質に対して 活性を示した。 PDa_l株由来の同酵素は 10-L-2株由来の同酵素と比較してより幅広 い基質に対して活性を示すと言える。 10-L-2株由来の同酵素はクロロア二リン類に はまったく作用しないが、 PDa-1株由来の同酵素よりもトノレイジン、二トロア二リンゃァ ミノ安息香酸分解率が高かった。
[0090] [実施例 4 :フエ二レンジァミン代謝に関与する酵素系の解析]
[4-1]フエ二レンジァミン代謝に関与する酵素系の検索
<方法 >
PDa-1株および 10-L-2株をそれぞれ培養し、得られた菌体から無細胞抽出液を調 製した。表 8に示す反応組成にて酵素反応(30°C、 1時間)を行レ、、 HPLCにてフエ二 レンジァミンから生成したアミノアセトァ二リドを分析した。
[0091] [表 8]
50 mM Sodium-potassium phosphate (pH 7.5) 2.50 ml
30 mM DTT 0.1 ml
30 mM EDTA 0.1 ml
5 mM Acety卜 CoA 0.1 ml
5 mM phenylenediamine · 2HCI 0.1 ml
Enzyme 0.10 ml
Total 3.0 ml
[0092] <結果 >
ァセチル CoA添加時のみフエ二レンジァミンからアミノアセトァニリドへの変換が見ら れた。ァセチル化を触媒する酵素はァリルアミン N-ァセチルトランスフェラーゼであ るといえる。酵素反応機構を図 3に示す。
[0093] [4-2]PDa-l株および 10-L-2株由来ァリルアミン N-ァセチルトランスフェラーゼの特 性解析
<方法 >
1.酵素の安定化
無細胞抽出液を調製し、硫酸ストレプトマイシンにより除核酸後、硫安分画により活 性画分を分画した。活性画分を種々の有機酸、糖類等を含む 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)にて透析し、経時的に酵素活性を測定した。
[0094] 2.酵素の精製
前述した方法により菌体破砕後、除核酸、硫安分画を行い、各種クロマトグラフィー により分画した。
[0095] ぐ結果 >
1.酵素の安定化
PDa_l株由来の同酵素は 20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)では、菌体破砕後 2日 で活性を失ったが、 1.0 mM EDTAおよび 1.0 mM DTTを含む 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)緩衝液中では安定であることを見いだした。一方、 10-L-2株由来の同酵素は 20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)において 1週間以上安定であった。
[0096] 2.酵素の精製
各精製段階における酵素活性およびタンパク質量は、前記の表 2 (PDa_l株由来ァ リルアミン N-ァセチルトランスフェラーゼ)および表 3 ( 10-L-2株由来ァリルアミン N- ァセチルトランスフェラーゼ)に示したとおりである。精製酵素は単一でなかった。
DE52クロトグラムより PDa_l株由来の粗酵素液には一種類の同酵素が含まれている のに対して、 10-L-2株由来の粗酵素液には電気化学的性質が異なる 2種類の同酵 素が含まれていることがわかった(図 9および図 10)。
[0097] 3.酵素の特性
分子量は、ゲル濾過法により決定した。マーカー(各 4 mg)を用いて、 Toyopearl HW-55F (東ソ一,東京)を充填したカラム(2.0 X 97 cm)および 0.2 M NaClを含む 20 mM Tris_HCl緩衝液(pH 8.0)を用いて行った.同緩衝液を用いて流速 20 ml/hでタ ンパク質を溶出した。マーカーとして、チトクローム c (12,500)、キモトリプシノゲン( 25,000)、オルアルブミン(45, 000)、ゥシ血清アルブミン(68, 000)、アルドラーゼ( 158,000)を使用し、分子量算出のための検量線を作成した。 PDa-Ι株由来の同酵素 の分子量は、 31 ,000であった。また、 10-L-2株由来の 2種類の同酵素はともに分子量 35,400であった。
産業上の利用可能性
[0098] 本発明は以上のように、微生物及びその微生物が産生する酵素を利用してァニリ ン誘導体 (芳香族ァミン)のアミノ基をァセチルイ匕する方法であり、多数のァニリン誘 導体を基質として、それらのアミノ基を 1段階の反応で簡易にァセチルイ匕することがで きるため、アミノアセトァ二リドをはじめとする種々の有用なァセトァニリド類の生産に 利用できる。