WO2005090588A1 - 微生物及び微生物由来酵素によるアニリン誘導体のアセチル化 - Google Patents

微生物及び微生物由来酵素によるアニリン誘導体のアセチル化 Download PDF

Info

Publication number
WO2005090588A1
WO2005090588A1 PCT/JP2005/005195 JP2005005195W WO2005090588A1 WO 2005090588 A1 WO2005090588 A1 WO 2005090588A1 JP 2005005195 W JP2005005195 W JP 2005005195W WO 2005090588 A1 WO2005090588 A1 WO 2005090588A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
phenylenediamine
strain
enzyme
pda
microorganism
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/005195
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kenji Aoki
Shinji Takenaka
Original Assignee
The New Industry Research Organization
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The New Industry Research Organization filed Critical The New Industry Research Organization
Priority to JP2006511293A priority Critical patent/JP4812619B2/ja
Publication of WO2005090588A1 publication Critical patent/WO2005090588A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism that metabolizes an aniline derivative, and a technique for acetylating an amino group of the aniline derivative using an enzyme produced by the microorganism.
  • aniline derivative is used in a broad sense to refer to an aromatic compound having an amino group (aromatic amine or arylamine) unless otherwise specified. This is meant to include not only monocyclic anilines but also polycyclic aromatic compounds such as aminonaphthalenes.
  • an acetylated derivative of an aniline derivative is used in various industrial fields.
  • aminoacetanilide in which one amino group of phenylenediamine having two amino groups is acetylated is an intermediate of an azo dye.
  • Hydroxyacetoanilide acetamidophenol [AAP]
  • AAP acetamidophenol
  • Chloroacetanilide and methylacetanilide are used as raw materials of a force herbicide, which is an acetiluidani of chloroaniline and toluidine, respectively.
  • Acetamide benzoic acid which is an acetyl amide of amino benzoic acid, is an intermediate such as a pigment, and is disclosed in Japanese Unexamined Patent Publication No. 2002-541139 (International Publication No. WO00 / 59875). It is disclosed that it is effective as a novel inhibitor of AGE) formation.
  • acetylated form such as aminoacetanilide
  • the conventional organic chemical synthesis method involves complicated production steps. , And was expensive.
  • 2_aminoacetanilide it is difficult to synthesize 2_aminoacetanilide directly from inexpensive 2-phenylenediamine by the conventional method, and both amino groups are acetylated.
  • acetoanilide-nitroaniline or the like is prepared as a starting substrate.
  • acetanilide When acetanilide is used as a starting substrate, 0- (2-) form and m- (3-) form are generated after nitration, and these must be separated. When nitroaline is used as a starting substrate, acetylation and reduction of nitro groups are required. In organic reactions, 2-methylbenzimidazole may be produced from 2_aminoacetanilide produced by reaction conditions due to intramolecular dehydration.
  • O-acetyltransferase O-acetyltransferase
  • their enzymatic activities and substrate specificities are unknown, and are currently difficult to use.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a novel method for acetylating an amino group of an aniline derivative using an enzyme derived from a microorganism or a microorganism, and to provide the novel method.
  • An object of the present invention is to provide a novel method for producing acetoanilides using the method.
  • the present inventor searched for microorganisms capable of metabolizing aniline derivatives from soil samples collected from various locations. As a result, one amino group of phenylenediamine was acetylated to form aminoacetoanilide. Two strains (PDa-1 strain and
  • the present invention includes the following inventions (1)-(13) as industrially useful inventions.
  • a Bacillus bacterium used in the method of (1) or (3).
  • Bacillus cereus PDa-1 strain (Accession number FERM ABP-10292)
  • Bacillus cereus 10_L_2 strain (Accession number FERM ABP-10291)
  • a method for producing a compound comprising a step of acetylating an amino group of an aniline derivative by any one of the methods (1) and (3).
  • the compound is 2_aminoacetanilide, 3_aminoacetanilide, 4_aminoacetanilide, 2-methylacetanilide, 3-methylacetanilide, 4-methylacetanilide, 2- Cloacetanilide, 3_chloroacetanilide, 4_chloroacetanilide, 2-hydroxyacetanilide, 3-hydroxyacetanilide, 4-hydroxyacetanilide, 2_acetamidobenzoic acid, 3_acetoamide Benzoic acid, 4_acetamidobenzoic acid, 2_nitroacetoanilide, 3_nitroacetanilide, 4_nitroacetoanilide, acetoanilide, 2-hydroxy_4-acetylaminobenzoic acid, 2-hydroxy-5- Acetylaminobenzoic acid
  • a conventional chemical synthesis requires a complicated manufacturing process, and a high-cost chemical substance such as aminoacetanilide can be easily and inexpensively manufactured by a one-step reaction.
  • Power S can.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the conversion of each of 19 aniline derivatives to an acetoanilide derivative according to the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating the conversion of each of the other five aniline derivatives to an acetoanilide derivative according to the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating acetylation of an aniline derivative by arylamine N-acetyltransferase derived from PDa_l strain and 10-L-2 strain.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating a reaction system combining a synthesis system for converting an aniline derivative into an acetoanilide derivative and a acetyl-CoA regeneration system.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of mass spectrometry of metabolites of 2-phenylenediamine by the PDa_l strain.
  • FIG. 6 shows the results of NMR analysis of metabolites of 2-phenylenediamine by the PDa_l strain. is there.
  • FIG. 7 is a graph showing acetylation of 2_phenylenediamine by the PDa_l strain over time. Closed circles indicate 2_aminoacetanilide (mM) produced, open circles indicate residual concentration of 2_phenylenediamine (mM), and open squares indicate residual 2-phenylenediamine of control (control). Concentration (mM), black triangles indicate turbidity at a wavelength of 660 nm, and indicate the amount of resting cells of the PDa-1 strain used in the reaction.
  • mM 2_aminoacetanilide
  • control control
  • black triangles indicate turbidity at a wavelength of 660 nm, and indicate the amount of resting cells of the PDa-1 strain used in the reaction.
  • FIG. 8 is a graph showing acetylation of 4_phenylenediamine by the 10-L_2 strain over time. Closed circles indicate 4-aminoacetanilide (mM) produced, open circles indicate residual concentration of 4-phenylenediamine (mM), and open squares indicate residual concentration of 4-phenylenediamine of control (control). (mM), black triangles indicate turbidity at a wavelength of 660 nm, and were used for the reaction.
  • mM 4-aminoacetanilide
  • control control
  • black triangles indicate turbidity at a wavelength of 660 nm, and were used for the reaction.
  • the figure shows the amount of the growing cells of the 10-L-2 strain.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of purifying an enzyme derived from the PDa-l strain by DE52 column chromatography.
  • the enzymatic activity (U / ml) and the protein amount (mg / ml) of each fraction (3 ml / tube) are indicated by black circles and white circles, respectively.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of purifying an enzyme derived from 10-L-2 strain by DE52 column chromatography.
  • the enzymatic activity (U / ml) and the amount of protein (mg / ml) of each fraction (4 ml / tube) are indicated by black circles and white circles, respectively.
  • FIG. 11 is a view illustrating a process for producing 2-aminoacetanilide by a conventional organic chemical synthesis method.
  • Bacillus cereus PDa-1 which metabolizes 2_phenylenediamine and Bacillus cereus 10_L_2 which metabolizes 4-phenylenediamine, from the collected soil samples.
  • these strains convert 2-phenylenediamine and 4-phenylenediamine to 2-aminoacetanilide and 4-aminoacetanilide, respectively, that is, only one amino group of phenylenediamine is acetylated by both strains. It was clarified that it could be ridden (Examples 1-2).
  • strains PDa-1 and 10-L-2 was received by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) and the Patent Organism Depositary Center (1-1, Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan 1-Central 6 (Zip code: 305-8566)), respectively.
  • ABP-10292 (receipt date: March 7, 2005)
  • FERM ABP-10291 (receipt date: March 7, 2005).
  • Both strains belong to Bacillus cereus and are common in that they produce arylamine N-acetyltransferase (FIG. 3) as an enzyme that metabolizes aniline derivatives.
  • FOG. 3 arylamine N-acetyltransferase
  • both strains were tested for the effects of various environmental factors on the conversion of phenylenediamine to aminoacetanilide, the results of a substrate specificity test using the cells, and Differences were found in the type of enzyme used and its stability in buffer. From the results of the enzyme purification in each cell, the arylamine N-acetyltransferase derived from the PDa-l strain was one type, whereas the 10-L-2 strain was two types of lysozyme (aryluamine N-acetyl). Transferases I and II) (Figs. 9 and 10).
  • FIG. 1 and FIG. 2 show the reaction mechanism of acetylation of each azirine derivative to an acetoanilide derivative by enzymes from both strains, predicted from the results of MS analysis.
  • Table 1 in the reaction system using the resting cells of the PDa_l strain, 1_naphthylamine, 1_ami It was confirmed that aminonaphthalenes such as no-2-naphthol were also included in the substrate (Fig. 2).
  • Enzymes derived from both strains show high activity against phenylenediamine, and both have characteristics unlike previously reported enzymes in which only one of the two amino groups of phenylenediamine is acetylated. Therefore, these enzymes can be referred to as “phenylenediamine monoacetyltransferases” as expressions expressing their characteristics.
  • both of the two strains obtained this time were Bacillus cereus, it is a preferable method to conduct screening by focusing on Bacillus spp., Especially Bacillus cereus.
  • the genetic information may be used to screen for closely related strains having high rRNA homology with the above two strains. (The homology (%) of the 16S rRNA between the PDa-1 strain and the 10-L-2 strain was 99.5%.)
  • resting cells When performing acetylation of an aniline derivative using a microorganism, resting cells generally have a higher enzyme activity and a higher degradation rate, and thus recover the desired reaction product after the conversion reaction. Since purification is considered easier, a method using resting cells is preferred, but the method is not limited to this, and growing cells may be used. In the tests shown in Table 1, the PDa_l strain used resting cells, and the 10-L-2 strain used growing cells.
  • the conditions for using microorganisms in the present invention are particularly limited. What is necessary is just to select the most suitable use conditions for acetilich according to the characteristics and characteristics of the microorganism used. For example, when inexpensive sugars such as gnorecose, fructose, and sucrose are added to the reaction solution as an energy source (acetyl CoA supply source)
  • the reaction can be continued and the initial concentration of the substrate (arylamines) can be increased. available.
  • the substrate concentration is high during the enzymatic reaction, substrate inhibition may occur.Therefore, a method of starting the reaction at a low concentration and confirming that the amount of substrate has been reduced while re-adding the substrate to the reaction system is the ultimate The yield can be improved, and it is considered to be a preferable method.
  • the purified enzymes were used without using microorganisms.
  • a reaction system using acetyl it is preferable to add acetyl CoA as the reaction proceeds.
  • a reaction system combining a synthesis system for converting arylamines to acetoanilides and a regeneration system for converting CoASH generated by this reaction back to acetyl CoA. Building a system is the preferred method. For example, as shown in FIG.
  • the conversion reaction of arylylamines to acetoanilides according to the present invention has the following advantages as compared with the conventional organic chemical synthesis method (FIG. 11).
  • the reaction does not require heavy metals or the like as a catalyst, and the reaction proceeds at room temperature.
  • the substrate specificity is wide, it is possible to produce useful chemical substances with various substrate forces.
  • a by-product is generated by the organic chemical method.
  • the reaction proceeds in one step, and the target compound is obtained.
  • conventional organic chemistry methods such as the conversion reaction of phenylenediamine to aminoacetanilide require several steps in a single step, so the cheap 2_ phenylenediamine can be replaced with the expensive one. It can be used for production of 2_aminoacetanilide.
  • Fraction 3 was applied to a column (1.5 x 17.5 cm) packed with DEAE-Cellulose (DE52) (Whatman International Ltd, Maidstone, England) equilibrated with buffer A. After washing the column with 90 ml of buffer A, the enzyme was eluted at a flow rate of 40 ml / h by a linear gradient method using 360 ml of buffer A containing 0-0.4 M NaCl. Each fraction ( 3.0 ml / tube) and the protein activity were measured. Highly active fractions were collected and the outer solution of dialysis was exchanged every 3 hours against 1 L of buffer A, and dialysis was performed for a total of 6 hours. (Fraction 4, 27 ml)
  • the active fraction was fractionated by a perfusion chromatography workstation using a BioCAD Workstation system (PerSeptove Biosystems, uambndge, MAJ and POROS 50HQ Kahum (PerSeptove Biosystems).
  • a POROS 50HQ column (0.46 x 10.0 cm) equilibrated with Fraction 4 with buffer A. After washing the column with buffer A, the enzyme was eluted at a flow rate of 15 ml / min by the linear gradient method using buffer A containing 0-0.5 M NaCl. Enzyme activity and protein content were measured (Fraction 5, ⁇ ml)
  • Fraction 5 was applied to a column (0.46 x 10.0 cm) packed with POROS 20PE (PerSeptove Biosystems) equilibrated with buffer A containing 2 M ammonium sulfate. After washing the column with buffer A containing 2 M ammonium sulfate, the enzyme is eluted at a flow rate of 15 ml / min by the linear gradient method using BioCAD Workstation system with buffer A containing 2.0-0 M ammonium sulfate. did. The enzymatic activity and protein mass of each fraction (2 ml / tube) were measured. (Fraction 6, 36 ml)
  • the sample was subjected to DE52 column chromatography, POROS 50HQ column chromatography, and POROS 20PE column chromatography, followed by gel filtration chromatography.
  • the enzyme was purified by subjecting it to one. Table 2 shows the enzyme activity and protein mass at each purification step.
  • the final prepared enzyme was purified 94 times with a yield of 4%, and the specific activity was 3 U / mg.
  • the purity of the prepared enzyme was examined by Native polyacrylamide electrophoresis and SDS-PAGE electrophoresis.
  • the molecular weight was determined by a gel filtration method. Using a marker (4 mg each), it was performed on TOYOPEARL HW-55F (2.0 ⁇ 97 cm) according to the method described in (7) above. As markers, cytochrome c (12,500), chymotrypsinogen (25,000), ovalbumin (45,000), pserum serum albumin (68,000), and aldolase (158,000) were used.
  • the molecular weight of the enzyme determined by gel filtration was 31,000.
  • Fraction 3 was applied to a column (2.2 x 11 cm) packed with DEAE-Cellulose (DE52) (Whatman International Ltd, Maidstone, England) equilibrated with buffer B. After washing the column with 200 ml of buffer B, the enzyme was eluted at a flow rate of 40 ml / h by linear gradient method using 600 ml of buffer B containing 0-0.3 M NaCl. The enzyme activity and protein of each fraction (4 ml / tube) were measured. Highly active fractions (NAT I and NAT II fractions) were collected, and the dialysis solution was exchanged every 3 hours against 1 L of buffer B, and dialysis was performed for a total of 6 hours.
  • DEAE-Cellulose DE52
  • Fraction 5 (NAT I fraction 19 ml and NAT II fraction 21 ml) was applied to a column (0.46 ⁇ 10.0 cm) packed with POROS 20PE (PerSeptove Biosystems) equilibrated with buffer B containing 2 M ammonium sulfate, respectively. After washing the column with buffer B containing 2 M ammonium sulfate, the enzyme is eluted at a flow rate of 15 ml / min by the linear gradient method using BioCAD Workstation system using buffer B containing 2.0-0 M ammonium sulfate. did. The enzyme activity and protein amount of each fraction (2 ml / tube) were measured. (Fraction 6, 3 ml)
  • Fraction 7) Fraction Apollo 20 ml high-performance centrifugal concentrators (Oroital Biosciences, MA, USA). The concentrate was applied to a column (2.0 x 97 cm) packed with TOYOPEARL HW-55F (Tosoichi, Tokyo) equilibrated with buffer B containing 0.2 M NaCl. Using the same buffer, the enzyme was eluted at a flow rate of 20 ml / h. The enzymatic activity and protein of each fraction (2 ml / tube) were measured, and the highly active fraction was collected. (Fraction 7)
  • the molecular weight was determined by a gel filtration method. Using a marker (4 mg each), it was performed on TOYOPEARL HW-55F (2.0 ⁇ 97 cm) according to the method described in (7) above. As markers, cytochrome c (12,500), chymotrypsinogen (25,000), ovalbumin (45,000), pserum serum albumin (68,000), and aldolase (158,000) were used.
  • the molecular weights of NAT I and NAT II by gel filtration were both 35,400.
  • the following table summarizes the characteristics of each enzyme of the allylamine N-acetyltransferase derived from the PDa_l strain and the 10-L-2 strain purified by the above method.
  • Enzymes derived from PDa-1 strain Enzymes derived from 10-L-2 strain Enzyme 1 type 2 types Auxiliary for enzyme production 1% (w / v) sucrose and 1% (w / v) polypeptone as a substrate / v) Ammonium nitrate When added to the medium, the amount of enzyme synthesis increases when the enzyme is added to the medium.
  • the amount of synthesized elements is improved.
  • enzymes derived from the 10-L-2 strain are derivatives having a substituent at the 3-position (3-toluidine, 3-chloroaniline, 3-aminophenol, 3-aminobenzoic acid). , 3-nitroaniline).
  • the enzyme can be purified from the strain by the same method.
  • Example 1 Isolation and identification of microorganisms that metabolize phenylenediamine
  • Soil samples 350 from various locations were used as separation sources.
  • the amount of 12H0 added was adjusted.
  • the medium contains sucrose as a carbon source and ammonium nitrate as a nitrogen source separately from phenylenediamine.
  • the solution A and the solution B were separately sterilized with an autoclave, and the solution C containing phenylenediamine 'dihydrochloride was sterilized using a filtration sterilizer. After cooling, they were mixed.
  • the solid medium was prepared by adding 1.5% (w / v) agar.
  • a diazo coupling method which is a method for determining aromatic amines, was used.
  • Phenylenediamine is unstable in aqueous solution for all of the 2_, 3_, and 4-body, and the culture medium turns brown-black in 7 days of enrichment culture in the control medium that does not ingest the bacteria.
  • an integrated culture sample in which the growth of bacteria was good and the color of the culture solution did not change was selected.
  • a pure strain was isolated from 44 strains that metabolize 4-phenylenediamine, and a strain with good growth was identified.
  • the 10-L-2 strain was used.
  • the isolates were identified by morphological characteristics, biochemical tests and analysis of the 16S rRNA gene.
  • Table 6 shows the bacteriological properties of the PDa-1 and 10-L-2 strains used in the identification test. Dalam was positive, had periflagellate, oxidase was negative, and catalase activity was positive. In addition, acid production was observed anaerobically by fermentation from the sugars (D-arabinose, D-fructose, sucrose, D-glucose) used in the test. In addition, sporulation ability was also observed. Above result Showed characteristics of the genus Bacillus. Therefore, analysis of the 16S rRNA gene was performed. The nucleotide sequences of the 16S rRNA genes of the PDa-1 strain (1544 bp) and the 10-L-2 strain (1540 bp) were determined respectively.
  • Preculture was performed for 12 hours in a 0.1% (w / v) phenylenediamine medium (1 ml / tube) containing 1% (w / v) polypeptone.
  • Main culture of PDa-1 strain 1 ml of preculture contains 1% (w / v) sucrose and 0.15% (w / v) NHNO
  • Preculture was performed under the conditions described in 1.a. above, and sucrose (0.1% (w / v) Polypeptone, D-glucose, or polypeptone as a carbon source to be added to the medium in place of rangenamine medium, strain PDa-1) or polypeptone (0.07% (w / v) 4-phenylenediamine medium, strain 10-L-2) Sucrose, disodium succinate, sodium acetate, and glycerol were prepared to a final concentration of 1% (w / v).
  • the preculture medium was under the conditions described in 1.a. above, and the amounts of KHPO and NaHPO-12H0 were adjusted so that the pH of the medium was 3.58.5 in the main culture.
  • the concentration of phenylenediamine in this medium was 0.1% (w / v) 2-phenylenediamine 'dihydrochloride and 0.07% (w / v) 4-phenylenediamine' dihydrochloride.
  • the PDa-1 strain grew poorly and had a residual substrate mass (%) of 40% in a medium with 0.15% (w / v) concentration, S, which decomposed the substrate by 100% together with good growth.
  • B. cereus 10_L_2 strain Degraded 100% of the substrate with growth up to 0.035% -0.105% (w / v). However, as the substrate concentration increased compared to the 0.035% (w / v) phenylenediamine medium, the growth became poor, and the residual substrate mass (%) in the 0.14% (w / v) medium was 50%.
  • B. cereus PDa_l strain In the test, it showed good growth in 2-phenylenediamine medium containing 1.0% (w / v) sucrose, and the substrate was completely degraded. However, in the same medium containing 1.0% (w / v) disodium succinate, growth was poor and no decrease in substrate was observed.
  • B. cereus 10-L-2 strain In the test, it showed very good growth on 4-phenylenediamine medium containing 1.0% (w / v) polypeptone, and the substrate was completely degraded.
  • 1.0% (w / v) sucrose-supplemented medium in which the PDa-1 strain showed good growth the growth was poor and the residual substrate mass (%) was 50%.
  • B. cereus PDa_l strain In the test, 80% of the substrate was degraded with good growth in 2-phenylenediamine medium at pH 7.5.
  • B. cereus 10-L-2 strain In the test, it showed good growth in 4-phenylenediamine medium at pH 4.5 and 5.5 and the substrate was almost completely degraded.
  • reaction solution was sampled every hour, and the growth of the PDa-1 strain and the decrease in 2-phenylenediamine were quantified by HPLC.
  • the culture of PDa-1 and the reaction of the bacterium with the quiescent cells followed the method described in the above [2-1].
  • the turbidity (OD) derived from this bacterium in the reaction solution and the amounts of 2-phenylenediamine (initial concentration: 5.5 mM) and the metabolite 2-aminoacetanilide in the reaction solution were quantified by HPLC.
  • the effect of the substrate concentration on the metabolism of phenylenediamine was examined. As the concentration of the substrate in the reaction solution or medium increased, the degradation rate and degradation rate of the substrate decreased. Phenylenediamines have been reported to be mutagenic, and their toxicity may have inhibited bacterial growth and the biosynthetic system of metabolic enzymes. Examination of the effects of pH on the growth of PDa-1 and 10-L-2 strains and the degradation of phenylenediamine revealed that the PDa-1 strain showed good growth and substrate degradation near neutrality. . On the other hand, the 10-L-2 strain showed good growth and substrate degradation on the weakly acidic side. This result is similar to the pH range at the time of screening. The effect of the carbon source on the degradation of phenylenediamine and the effect of pH showed differences between the two bacteria.
  • a metabolite from phenylenediamine was isolated and identified as aminoacetanilide.
  • PDa-1 strain is 71% (2-phenylenediamine ⁇ 2_aminoacetanilide), and 10-L-2 strain is 90% (4-phenylenediamine ⁇ 4-aminoacetanilide).
  • the method for preparing the resting cells of the PDa-1 strain and the reaction were as described in [2-1] of Example 2.
  • the method for culturing the 10-L-2 strain was as described in [2-2] of Example 2.
  • the substrates used were aniline and its derivatives 2-, 3-, 4_phenylenediamine, 2-, 3-, 4-toluidine, 2-, 3-, 4-chloroaniline, , 3-, 4-aminophenol, 2-, 3_, 4-aminobenzoic acid, 2-, 3-, 4-nitroaniline, 4-, 5-aminosalicylic acid, 2-aminofluorene, Sulfamethazine, 1-naphthylamine and 1-amino-2-naphthol.
  • a reaction solution containing a 5 mM substrate having the composition shown in Table 7 above was prepared (however, the four types of 2-aminofluorene, sulfamethazine, tonaphthylamine, and 1-amino-2-naphthol were poorly soluble in water and were terminated. The concentration was 1 mM).
  • Sampling was performed at each time, and the amount of reduction of the substrate was quantified by spectrophotometry or HPLC. Quantification of aniline derivatives other than phenylenediamine was based on diazo coupling reaction. In addition, the identification of accumulated metabolites (acetoanilide derivatives) was by HPLC and D-MS analysis.
  • Acetyltransferases from PDa_l and 10-L-2 strains showed activity on a wide range of substrates. It can be said that the enzyme derived from the PDa_l strain exhibits activity on a wider range of substrates than the enzyme derived from the 10-L-2 strain.
  • the enzyme derived from strain 10-L-2 did not act on chloroanilines at all, but had a higher rate of degrading tonoleidine and nitroanilinaminobenzoic acid than the enzyme derived from PDa-1 strain.
  • the PDa-1 strain and the 10-L-2 strain were each cultured, and cell-free extracts were prepared from the obtained cells.
  • An enzymatic reaction (30 ° C., 1 hour) was performed using the reaction composition shown in Table 8, and aminoacetanilide generated from phenylenediamine was analyzed by HPLC.
  • a cell-free extract was prepared, and after removing nucleic acids with streptomycin sulfate, the active fraction was fractionated by ammonium sulfate fractionation. The active fraction was dialyzed against 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing various organic acids, saccharides and the like, and the enzyme activity was measured over time.
  • nucleic acid removal and ammonium sulfate fractionation were performed, and fractionation was performed by various types of chromatography.
  • the enzyme activity and protein amount at each purification step are as shown in Table 2 (arylamine N-acetyltransferase derived from PDa_l strain) and Table 3 (arylamine N-acetyltransferase derived from 10-L-2 strain). is there.
  • the purified enzyme was not single.
  • the crude enzyme solution derived from the PDa_l strain contains one type of the same enzyme, whereas the crude enzyme solution derived from the 10-L-2 strain contains two types of the same enzyme with different electrochemical properties. It was found that it contained enzymes (Figs. 9 and 10).
  • the molecular weight was determined by a gel filtration method. Using a marker (4 mg each), a column (2.0 x 97 cm) packed with Toyopearl HW-55F (Tosoichi, Tokyo) and a 20 mM Tris_HCl buffer (pH 8.0) containing 0.2 M NaCl were used. The protein was eluted using the same buffer at a flow rate of 20 ml / h. A standard curve for molecular weight calculation was used, using cytochrome c (12,500), chymotrypsinogen (25,000), ovalbumin (45,000), pserum albumin (68,000), and aldolase (158,000) as markers. It was created. The molecular weight of the enzyme derived from the PDa-II strain was 31,000. In addition, the two types of the same enzyme derived from the 10-L-2 strain both had a molecular weight of 35,400.
  • the present invention relates to a method for acetylating an amino group of an aniline derivative (aromatic amine) using a microorganism and an enzyme produced by the microorganism, and using a large number of aniline derivatives as substrates. Since these amino groups can be easily acetylated by a one-step reaction, they can be used for production of various useful acetoanilides such as aminoacetanilide.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

　本発明は、微生物及びその微生物が産生する酵素を利用してアニリン誘導体（芳香族アミン）のアミノ基をアセチル化する方法である。多数のアニリン誘導体を基質とし、２つのアミノ基を有する基質に対しては一方のアミノ基のみアセチル化する。本発明によれば、従来の化学合成では複雑な製造工程を要し、高コストとなっていたアミノアセトアニリドなどの化学物質を１段階の反応で簡易かつ低コストで製造することができる。

Description

明 細 書
微生物及び微生物由来酵素によるァニリン誘導体のァセチル化 技術分野
[0001] 本発明は、ァニリン誘導体を代謝する微生物、及びその微生物が産生する酵素を 利用してァニリン誘導体のアミノ基をァセチルイ匕する技術に関するものである。なお、 本明細書において「ァニリン誘導体」の語は、特に断りのない限り、アミノ基を有する 芳香族化合物（芳香族ァミン、又はァリルアミン (arylamine) )とレ、う広義の意味で使用 しており、単環式のァニリン類のみならずァミノナフタレン類などの多環式芳香族化 合物も含む意味である。
背景技術
[0002] ァニリン誘導体 (芳香族ァミン)のァセチル化体は、様々な産業分野で利用されて いる。例えば、アミノ基を 2つ有するフエ二レンジァミンの一方のァミノ基がァセチル化 されたアミノアセトァニリドは、ァゾ染料の中間体である。ァミノフエノールのァセチノレ 化体であるヒドロキシァセトァニリド（ァセトアミドフエノール [AAP] )は、医薬品名をァ セトァミノフェンと称し鎮痛剤として広く利用されている。クロロアセトァ二リド、メチルァ セトァニリドは、それぞれクロロア二リン、トルイジンのァセチルイ匕体である力 除草剤 の原料等として使用されている。ァミノ安息香酸のァセチルイ匕体であるァセトアミド安 息香酸は、顔料等の中間体であり、また、特表 2002-541139号公報（国際公開番号 WO00/59875)には、後期糖化最終生成物 (AGE)形成の新規阻害剤として有効で ある旨開示されている。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 上述のように、アミノアセトァニリドなどの上記ァセチル化体（ァセトァニリド類）は産 業上非常に有用であるが、その製造において、従来の有機化学的な合成法は複雑 な製造工程を要し、高コストなものとなっていた。例えば、 2_アミノアセトァ二リドを製 造する場合、従来法では安価な 2—フエ二レンジァミンから直接 2_アミノアセトァニリド を合成することは困難であり、アミノ基両方がァセチル化されてしまうため、図 11に示 すようにまず、出発基質としてァセトァニリドゃニトロア二リン等を調製する。ァセトァニ リドを出発基質とした場合、ニトロ化の後 0- (2-)体と m- (3-)体が生じ、これらを分別 する必要がある。また、二トロア二リンを出発基質とした場合、ァセチル化とニトロ基の 還元ステップが必要となる。し力も、有機反応では反応条件により生成した 2_アミノア セトァニリドから分子内脱水により 2-メチルベンズイミダゾールが生じることがある。
[0004] このような従来の有機化学的な合成法の問題を解決するため、ァニリン誘導体を代 謝する微生物、及びその代謝に関わる酵素を利用した、まったく新しいァセトァニリド 類の製造方法の開発が期待される。即ち、微生物やその酵素を用いて、ァニリン誘 導体のアミノ基をァセチル化することによって、 1段階の反応で簡便にし力、も低コスト で目的とするァセトァニリド類を製造する新たな製造方法の開発が強く望まれる。
[0005] 現在、微生物由来の酵素としていくつかのァセチルトランスフェラーゼが同定、報告 されている（例えば、 DDBJ I GenBank / EMBLデータベースにァクセッション番号： AE017004、 locus_tag : BC2140として登録されている N-hydroxyarylamine
O-acetyltransferaseなど）。し力し、これらの酵素活性および基質特異性は不明であ り、現状では利用困難である。また、フエ二レンジァミンのようなアミノ基を 2つ有する 芳香族化合物に作用し、その一方のァミノ基のみァセチル化するという特徴をもった 酵素は従来まったく知られてレ、なかった。
[0006] 本発明は、このような状況に鑑みなされたものであり、その目的は、微生物及び微 生物由来酵素を用いてァニリン誘導体のアミノ基をァセチル化する新規方法を提供 すること、並びに当該方法を用いてァセトァニリド類の新規製造方法を提供すること にある。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者は、各地から採取した土壌試料の中から、ァニリン誘導体の代謝能を有 する微生物を探索した結果、フエ二レンジァミンの一方のアミノ基をァセチル化してァ ミノァセトァニリドを生成する性質をもった 2種類の菌株（後述の PDa-1株および
10-L-2株）を分離.同定すると共に、これらの菌株が産生する酵素がフエ二レンジアミ ンのみならず多数のァニリン誘導体を基質とする広い基質特異性を有すること、さら に単環式のァニリン類のみならず多環式のアミノナフタレン類にも作用し、そのアミノ 基をァセチル化すること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、産業上有用な発明として、以下の（1)一（13)の発明を包含する ものである。
(1) ァニリン誘導体 (芳香族ァミン)の代謝活性を有する微生物または同微生物由 来の酵素を使用して、ァニリン誘導体のアミノ基をァセチル化する方法。
(2) 上記（1)の方法であって、 2_フエ二レンジァミン、 3_フエ二レンジァミン、 4—フ ヱ二レンジァミン、 2—トルイジン、 3—トルイジン、 4—トルイジン、 2_クロロア二リン、 3_ クロロア二リン、 4—クロロア二リン、 2—ァミノフエノール、 3—ァミノフエノール、 4—ァミノ フエノーノレ、 2_アミノ安息香酸、 3_アミノ安息香酸、 4_ァミノ安息香酸、 2_ニトロァニ リン、 3_ニトロァニリン、 4_二トロア二リン、ァニリン、 4—ァミノサリチノレ酸、 5_アミノサリ チル酸、 2—ァミノフルオレン、 1_ナフチルァミン、及び 1—ァミノ— 2_ナフトールからな る群から選ばれる、 1又は複数のァニリン誘導体のアミノ基をァセチルイ匕する方法。
(3) 休止菌体を使用することを特徴とする上記（1)又は（2)の方法。
(4) 上記（1)一 (3)のレ、ずれかの方法に使用される微生物。
(5) 上記（1)一 (3)のレ、ずれかの方法に使用されるバチルス属菌。
(6) バチルス ·セレウス菌（Bacillus cereus) PDa-1株（受領番号 FERM ABP-10292)
(7) バチルス ·セレウス菌（Bacillus cereus) 10_L_2株（受領番号 FERM ABP-10291)
(8) 上記（1)又は（2)の方法に使用される微生物由来の酵素。
(9) 上記（1)又は（2)の方法に使用される微生物由来アミノアセチルトランスフェラ
(10) 上記（1)又は（2)の方法に使用される微生物由来ァセチル CoA依存型ァミノ ァセチルトランスフェラーゼ。
(11) 上記（1)又は（2)の方法に使用される微生物由来の酵素であって、ァミノナフ タレン類のアミノ基をァセチル化する酵素活性を有する酵素。
(12) 上記（1)一（3)のいずれかの方法によって、ァニリン誘導体のアミノ基をァセ チル化する工程を含む、化合物の製造方法。 (13) 化合物が、 2_アミノアセトァ二リド、 3_アミノアセトァ二リド、 4_アミノアセトァ二 リド、 2-メチルァセトァニリド、 3—メチルァセトァニリド、 4ーメチルァセトァニリド、 2-ク 口ロアセトァ二リド、 3_クロロアセトァ二リド、 4_クロロアセトァ二リド、 2—ヒドロキシァセ トァニリド、 3—ヒドロキシァセトァ二リド、 4—ヒドロキシァセトァ二リド、 2_ァセトアミド安 息香酸、 3_ァセトアミド安息香酸、 4_ァセトアミド安息香酸、 2_ニトロァセトァニリド、 3_二トロアセトァ二リド、 4_ニトロァセトァニリド、ァセトァニリド、 2—ヒドロキシ _4—ァセ チルァミノ安息香酸、 2—ヒドロキシー 5—ァセチルァミノ安息香酸、 2—ァセトアミドフル オレン、 1_ナフチルァセトアミド、及び N— (2—ヒドロキシ _1_ナフチル）ァセトアミドの いずれかである、上記（12)の製造方法。
発明の効果
[0009] 本発明によれば、従来の化学合成では複雑な製造工程を要し、高コストとなってい たアミノアセトァニリドなどの化学物質を 1段階の反応で簡易かつ低コストで製造する こと力 Sできる。
本発明の更なる特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるで あろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で一層明白になるであ ろう。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]本発明による、 19種の各ァニリン誘導体からァセトァニリド誘導体への変換を説 明する図である。
[図 2]本発明による、更に他の 5種の各ァニリン誘導体からァセトァニリド誘導体への 変換を説明する図である。
[図 3]PDa_l株および 10-L-2株由来のァリルアミン N-ァセチルトランスフェラーゼによ る、ァニリン誘導体のァセチル化を説明する図である。
[図 4]ァニリン誘導体をァセトァニリド誘導体へ変換する合成系と、ァセチル CoAの再 生系とを組み合わせた反応システムを説明する図である。
[図 5]PDa_l株による 2—フエ二レンジァミンの代謝産物の質量分析結果を示すグラフ である。
[図 6]PDa_l株による 2—フエ二レンジァミンの代謝産物の NMR解析結果を示す図で ある。
[図 7]PDa_l株による 2_フエ二レンジァミンのァセチル化を経時的に示すグラフである 。黒丸印は生成された 2_アミノアセトァニリド（mM)、白丸印は 2_フエ二レンジァミン の残存濃度 (mM)、白四角印はコントロール (対照）の 2—フヱニレンジァミンの残存 濃度 (mM)、黒三角印は波長 660nmにおける濁度であり、反応に使用した PDa-1 株の休止菌体の量を示す。
[図 8]10-L_2株による 4_フエ二レンジァミンのァセチル化を経時的に示すグラフであ る。黒丸印は生成された 4—アミノアセトァニリド (mM)、白丸印は 4一フエ二レンジアミ ンの残存濃度（mM)、白四角印はコントロール（対照）の 4一フエ二レンジァミンの残 存濃度 (mM)、黒三角印は波長 660nmにおける濁度であり、反応に使用した
10-L-2株の成長期菌体の量を示す。
[図 9]DE52カラムクロマトグラフィーによる PDa-l株由来の酵素精製結果を示すグラフ である。各フラクション（3 ml/tube)の酵素活性（U/ml)およびタンパク質量（mg/ml)を それぞれ、黒丸印、白丸印で示す。
[図 10]DE52カラムクロマトグラフィーによる 10-L-2株由来の酵素精製結果を示すダラ フである。各フラクション（4 ml/tube)の酵素活性（U/ml)およびタンパク質量 (mg/ml) をそれぞれ、黒丸印、白丸印で示す。
[図 11]従来の有機化学的な合成法による、 2-アミノアセトァ二リドの製造工程を説明 する図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の一形態について説明する。
[ 1 ]ァニリン誘導体を代謝する微生物の分離 ·同定
本発明者は後述するように、採取した土壌試料の中から、 2_フヱニレンジアミンを 代謝する菌株 Bacillus cereus PDa-1および 4—フエ二レンジアミンを代謝する菌株 Bacillus cereus 10_L_2を分離すると共に、これらの菌株によって 2_フエ二レンジアミ ンおよび 4 フエ二レンジアミンはそれぞれ 2—アミノアセトァニリドおよび 4 アミノアセト ァニリドへと変換されること、即ち両菌株によってフエ二レンジァミンの一方のアミノ基 のみァセチルイ匕できることを明らかにした（実施例 1 · 2)。なお、両菌株 PDa-1および 10-L-2は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター (日本国茨 城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵便番号 305-8566) )にそれぞれ受領番号 FERM ABP-10292 (受領日： 2005年 3月 7日）、 FERM ABP- 10291 (受領日： 2005年 3 月 7日）として寄託されている。
[0012] 両菌株はバチルス.セレウス菌（Bacillus cereus)に属し、ァニリン誘導体を代謝する 酵素としてァリルアミン N -ァセチルトランスフェラーゼ（図 3)を生産する点において共 通している。他方、両菌株は、フエ二レンジァミンからアミノアセトァニリドへの変換に 対する各種環境因子の影響試験の結果や、各菌体を用いた基質特異性試験の結 果、さらに各菌体中に含まれる酵素の種類やその緩衝液中での安定性において相 違がみられた。各菌体における酵素精製の結果から、 PDa-l株由来のァリルアミン N-ァセチルトランスフェラーゼは 1種類であるのに対して、 10-L-2株は 2種類のァイソ ザィム（ァリルァミン N -ァセチルトランスフェラーゼ Iおよび II)を生産することがわかつ た（図 9および図 10)。
[0013] 両菌株由来の酵素の基質特性を休止菌体 (resting cell)および成長期菌体（ growing cell)を用いて試験したところ、以下の表 1に示すように、いずれもその基質特 異性は大変広いものであった。なお、表 1中、 decreasing (%)」は各菌株培養液に おける基質の減少率、「DI_MS analysis」は各基質より生成した代謝産物の DI-MS分 析結果を示す。
[0014] [表 1]
Decreasing (%)
Substrate DI-MS analysis (m/z)
Strain PDa-1 Strain 10-レ 2
2-フエ二レンジァミン 84.3 83 150(M+), 132, 108, 92
3-フエ二レンジァミン 6.3 5.7 ND°
4-フエ二レンジァミン 100 150(M+), 108, 91
2-トルイジン 16.1 9 NDC
3-トルイジン 26.0 42 149(M+), 107, 91
4-トルイジン 19.0 29 149(M+), 107, 91
2-ク口ロアユリン 9.6 12 NDC
3-クロロァニリン 12.2 72 NDd
4-ク口ロア-リン 40.5 32 169 and 171 (M+), 127, 129, 91
2-アミノフエノール 30.1 92 151 (M+), 130， 109, 93
3-アミノブエノール 28.5 77 ND"
4-アミノフエノール 48.0 Ϊ 5Ϊ (Μ+), 109
2-ァミノ安息香酸 100s 100*
3-ァミノ安息香酸 28.4 100 179(M+), 137, 120
4-ァミノ安息香酸 10.6 18 NDC
2-ニトロァニリン 0 0 NDC
3-ュトロアュリン 16.9 40 180(M+), 138, 108
4-ニトロァニリン 0 0 NDC
ァニリン 13.6 10 135(M+), 93, 77
4-アミノサリチル酸 100 195(M+), 177, 152, 135
5-アミノサリチル酸 100 ― β 195(M+), 177, 152， 135
2-ァミノフノレオレン 100 223(M+), 181 , 165, 149, 133 ス1レファメタジン 0 NDC
1 -ナフチルァミン 100 ― θ
185(M+), 143
1 -アミノ -2-ナフトール 100 ― θ 201 (M+), 183, 159
[注]
a) PDa-1の休止菌体を用いた反応系は pH力 .8のため、反応中に基質が重合及び 変性してしまい、定量できなかった。
b) 基質は 100%分解されたが、代謝中間体を分離'同定できなかった。
c) ND :変換量が微量であったため、 DI-MS分析の際に明瞭なイオンピークを検出で きなかった。
d) ND： PDa-1株の休止菌体を用いた変換反応では基質の分解量が微量であった ため生成物も少なぐ DI-MS分析の際に明瞭なイオンピークを検出できなかった。一 方、 10-L-2株の growing cellを用いた変換反応では基質の分解は良好であった。 e) 10-L-2株では未決定。
図 1および図 2には、 MS分析の結果から予測される両菌株由来の酵素による各ァ 二リン誘導体からァセトァニリド誘導体へのァセチル化の反応機構が示される。表 1 に示すように、 PDa_l株の休止菌体を用いた反応系では、 1_ナフチルァミン、 1_アミ ノー 2—ナフトールなどのアミノナフタレン類も基質に含まれることが確認された（図 2)。
[0016] 両菌株由来の酵素はフエ二レンジァミンに対して高い活性を示し、いずれもフエ二 レンジァミンの 2つのアミノ基のうち一方のみをァセチル化するという既報の酵素には なレ、特徴を有することから、その特徴を表す表現としてこれらの酵素を「フヱ二レンジ ァミン モノァセチルトランスフェラーゼ」と呼ぶことができる。
[0017] このように、上記菌株 PDa-1および 10_L_2、あるいはこれらの菌株が産生する酵素 を利用して各ァニリン誘導体のアミノ基をァセチルイ匕することが可能であり、この方法 によってアミノアセトァニリドなどの有用化合物を従来法に比し 1段階の反応で簡易か つ低コストで生産することが可能である。また、本発明は上記 2種の菌株を用いた方 法に限定されるものではなぐ後述の実施例に示すような方法で土壌中、水中などか ら微生物のスクリーニングを行レ、、上記 2種の菌株以外にァニリン誘導体を代謝する 微生物を分離'同定し、得られた微生物又はその酵素を利用してァニリン誘導体のァ セチル化を行ってもよレ、。今回得られた 2種の菌株はいずれもバチルス'セレウス菌 であったため、バチルス属菌とりわけバチルス'セレウス菌に着目してスクリーニング を行うことは好ましい方法である。また、遺伝情報を利用して上記 2種の菌株と rRNA の相同性が高い近縁株をスクリーニングすることとしてもよレ、。 （PDa-1株と 10-L-2株 の 16S rRNAの相同性（％)は、 99.5%であった。 )
[0018] 微生物を用いてァニリン誘導体のァセチル化を行う場合、休止菌体（resting cell) の方が一般に酵素活性が高ぐ分解率も良ぐ変換反応後の目的とする反応生産物 の回収 ·精製もより容易と考えられることから、休止菌体を用いる方法が好ましいが、 これに限定されず、成長期菌体 (growing cell)を使用してもよい。表 1に示す試験で は PDa_l株は休止菌体を使用し、 10-L-2株は成長期菌体を使用した。
[0019] 本発明において微生物を使用する際の使用条件 (基質濃度、炭素源、 pH、温度、 培地組成、培養方法 (振盪あるいは攪拌による培養等）、その他の培養条件など）は 特に限定されるものではなぐ使用する微生物の性質 ·特徴に応じてァセチルイヒに最 適な使用条件を選択すればよい。例えば、エネルギー源（ァセチル CoA供給源）とし てグノレコース、フルクトース、スクロースなどの安価な糖類を反応溶液中に添カ卩すると
、反応を継続して行うことができ、基質 (ァリルアミン類)の初発濃度を高くできると考 えられる。また、酵素反応時に基質濃度が高いと基質阻害が生じることがあるので、 低濃度で反応を開始して基質が減ったことを確認しながら、反応系に基質を再添カロ する方法は最終的な収率を向上することができ、好ましレ、方法と考えられる。
[0020] PDa_l株および 10-L-2株由来の酵素は、いずれもァセチル CoA依存型ァリルアミ ン N -ァセチルトランスフェラーゼであったため（実施例 4、図 3)、微生物を用いずに その精製酵素を用いた反応系では反応の進行に伴いァセチル CoAを追加すること が好ましい。あるいは、ァセチル CoAを追加することなしに変換反応を継続する方法 として、ァリルアミン類をァセトァニリド類へ変換する合成系と、この反応により生じた CoASHを再びァセチル CoAへ変換する再生系とを組み合わせた反応システムを構 築することは好ましい方法である。例えば、図 4に示すように、 CoASH,ァセチルリン 酸およびホスホトランスァセチラーゼによる再生系と組み合わせて、ァセチル CoAをリ ユースする方法が挙げられる。その他に、（l) CoASH、 NAD+およびァセトアルデヒド デヒドロゲナーゼ（E.C. 1.2.1.10)による再生系と組み合わせてァセチル CoAをリュー スする方法、（2) CoASH、 ATPおよびァセチル CoAシンテターゼ（E.C. 6.2.1.1)による 再生系と組み合わせてァセチル CoAをリユースする方法、が考えられる。
[0021] 本発明によるァリルアミン類からァセトァニリド類への変換反応は、従来の有機化学 的合成法（図 11)と比較して次のような利点が挙げられる。 （1)反応に触媒として重 金属等を必要とせず、し力も常温で反応が進行する。 （2)基質特異性が広いため、 種々の基質力も有用な化学物質を製造できる。 (3)アミノ基以外にァセチル化される 置換基 (ァミノ基および水酸基など)や反応性の高レ、置換基 (アルデヒド基など）を有 する化合物の場合、有機化学的手法では副産物が生じる。一方、本発明による合成 法では 1段階で反応が進行し、 目的とする化合物が得られる。例えば、フエ二レンジ ァミンからアミノアセトァニリドへの変換反応のように従来の有機化学的手法では数ス テツプ必要な反応経路を 1段階で済ませることができるので、安価な 2_フヱニレンジ ァミンから高価な 2_アミノアセトァニリドへの生産等に利用できる。
[0022] [2]酵素の精製方法
以下では、 PDa-1株および 10-L-2株からの酵素の精製方法の一例について説明 する力 勿論これとは異なる方法で酵素の精製を行ってもょレ、。 [0023] [a] PDa- l株由来酵素の精製と特性解析
[a-1 ]酵素の精製
<方法 >
酵素精製におけるすべての操作は 4°C以下で行った。遠心分離は全て、 20, 000 X g , 10分間の条件で行った。精製には 1 mM DTTおよび 1 m EDTAを含む 20 mM Tris_HCl緩衝液（pH 8.0) (以下 buffer A)を用いた。本酵素 1 unitは 30°Cで 1時間に 1 μ molの 2_アミノアセトァ二リドを生成する酵素量と定義した。タンパク質の定量は Lowry法によった。また、比活性はタンパク質 1 mgあたりの unit数で示した。
[0024] (1) 無細胞抽出液の調製
培養液4.4しから？0&- 1株の菌体を23.8 g (湿菌体）得た。湿菌体 1 gあたり 10 mlの buffer Aをカロえ、菌体懸濁液（240 ml)を調製した。懸濁液 25 mlずつ KUBOTA model 201 M Isonatorを用いて 180 W, 15分間超音波処理することで破砕した。破砕液を 遠心分離して上清（無細胞抽出液）を回収した。 (Fraction 1 , 218 ml)
[0025] (2) 除核酸操作
無細胞抽出液に、 20% (w/v)硫酸ストレプトマイシン溶液を終濃度力 1 % (w/v)とな るように攪拌しながら添加した。 30分間攪拌した後、遠心分離により沈殿した核酸類 を除いた。 （Fraction 2, 220 ml)
[0026] (3) 硫安分画
Fraction 2に、粉末状に砕いた硫安を 50%飽和になるように攪拌しながら加えた。
30分間攪拌後、遠心分離により沈殿を除去した。得られた上清に硫安を 80%飽和と なるように加え、 30分間攪拌後、遠心分離により沈殿を回収した。沈殿を buffer A 11 mlに溶解した後、 1Lの buffer Aに対して透析した。 3時間おきに透析外液を交換し、 合計 9時間透析した。 （Fraction 3 , 20 ml)
[0027] (4) DE-52カラムクロマトグラフィー
Fraction 3を、 buffer Aで平衡化した DEAE-Cellulose (DE52) (Whatman International Ltd, Maidstone, England)を充填したカラム（1.5 X 17.5 cm)にアプライ した。 90 mlの buffer Aでカラムを洗浄した後、 0—0.4 M NaClを含む 360 mlの buffer A を用いてリニアグラジェント法により、流速 40 ml/hで酵素を溶出した。各フラクション（ 3.0 ml/tube)の酵素活性およびタンパク質を測定した。高活性画分を集め buffer A 1 Lに対して 3時間おきに透析外液を交換し、合計 6時間透析を行った。 (Fraction 4, 27 ml)
[0028] (5) POROS 50HQカラムクロマトグラフィー
BioCAD Workstation system (PerSeptove Biosystems, uambndge, MAJおよび POROS 50HQカフム (PerSeptove Biosystems)による perfusion chromatography workstationにより活性画分を分画した。 Fraction 4を buffer Aで平衡化した POROS 50HQカラム（0.46 X 10.0 cm)にアプライした。 buffer Aでカラムを洗浄した後、 0—0.5 M NaClを含む buffer Aを用いてリニアグラジェント法により、流速 15 ml/minで酵素を 溶出した。各フラクション（6 ml/tube)の酵素活性およびタンパク質量を測定した。 （ Fraction 5 , όθ ml)
[0029] (6) POROS 20PEカラムクロマトグラフィー
Fraction 5を 2 M硫酸アンモニゥムを含む buffer Aで平衡化した POROS 20PE ( PerSeptove Biosystems)を充填したカラム（0·46 X 10.0 cm)にアプライした。 2 M硫酸 アンモニゥムを含む buffer Aでカラムを洗浄した後、 2.0—0 M硫酸アンモニゥムを含 む buffer Aを用いて BioCAD Workstation systemを用いてリニアグラジェント法により 、流速 15 ml/minで酵素を溶出した。各フラクション (2 ml/tube)の酵素活性およびタ ンパク質量を測定した。 （Fraction 6, 36 ml)
[0030] (7) ゲル濾過クロマトグラフィー
Fractionり Apollo 20 ml high-performance centrifugal concentrators (Oroital Biosciences, MA, USA)により 1 mほで濃縮した。濃縮液を 0.2 M NaClを含む buffer Aで平衡化した TOYOPEARL HW-55F (東ソ一，東京）を充填したカラム（2.0 X 97 cm)にアプライした。同 bufferを用いて流速 20 ml/hで酵素を溶出した。各フラクション (2 ml/tube)の酵素活性およびタンパク質を測定し、高活性画分を集めた。 (Fraction 7 , 8 ml)
[0031] ぐ結果 >
硫安分画に続いて、 DE52カラムクロマトグラフィー、 POROS 50HQカラムクロマトグ ラフィー、 POROS 20PEカラムクロマトグラフィーに供した後、ゲル濾過クロマトグラフィ 一に供することによって本酵素を精製した。各精製段階における酵素活性およびタ ンパク質量を表 2に示す。最終調製酵素は 4%の収率で 94倍に精製され、比活性は 3 U/mgであった。同調製酵素について Nativeなポリアクリルアミド電気泳動および SDS-PAGE電気泳動による純度の検討を行った力 単一ではなかった。
[表 2]
Total Total Specific
activity Recovery
Fraction activity protein
(units) (mg) (units/mg) (%)
1 :Cell extract 42 1,300 0.032 100
2:Streptomycin sulfate 48 1,800 0.027 110
3:Ammonium sulfate 20 250 0.08 48
4:DE52 8.9 9.9 0.9 21
5:P0R0S 50HQ 8.7 4.5 1.9 21
6:POROS 20PE 5.0 3.4 1.5 12
7:Toyopearl HW-55F 1.7 0.56 3.0 4.0
[0033] [a_2]酵素の特性解析:ゲル濾過法による分子量の測定
ぐ方法 >
分子量は、ゲル濾過法により決定した。マーカー（各 4 mg)を用いて、上記 (7)で述 ベた方法に従レ、 TOYOPEARL HW-55F (2.0 X 97 cm)上で行った。マーカーとして、 チトクローム c (12, 500)、キモトリプシノゲン（25,000)、オルアルブミン（45,000)、ゥシ 血清アルブミン（68,000)、アルドラーゼ（158,000)を使用した。
[0034] ぐ結果 >
ゲル濾過法による本酵素の分子量は 31,000であった。
[0035] [b] 10-L-2株由来酵素の精製と特性解析
[b-1]酵素の精製
<方法 >
酵素精製におけるすべての操作は 4°C以下で行った。遠心分離は全て、 20,000 X g , 10分間の条件で行った。精製には 20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0) (以下 buffer B) を用いた。本酵素 1 unitは 30°Cで 1時間に Ι μ πιοΐの 4-アミノアセトァ二リドを生成する 酵素量と定義した。タンパク質の定量は Lowry法によった。また、比活性はタンパク質 1 mgあたりの unit数で示した。
[0036] (1) 無細胞抽出液の調製
培養液 2. 4Lから 10-L-2株の菌体を 19 g (湿菌体）得た。湿菌体 1 gあたり 10 mlの buffer Bをカロえ、菌体懸濁液（190 ml)を調製した。懸濁液 25 mlずつ KUBOTA model 201 M Isonatorを用いて 180 W, 15分間超音波処理することで破砕した。破砕液を遠 心分離して上清（無細胞抽出液）を回収した。 （Fraction 1 , 190 ml)
[0037] (2) 除核酸操作
無細胞抽出液に、 20% (w/v)硫酸ストレプトマイシン溶液を終濃度力 Sl % (w/v)とな るように攪拌しながら添加した。 30分間攪拌した後、遠心分離により沈殿した核酸類 を除いた。 （Fraction 2， 190 ml)
[0038] (3) 硫安分画
Fraction 2に、粉末状に砕いた硫安を 50%飽和になるように攪拌しながら加えた。 30分間攪拌後、遠心分離により沈殿を除去した。得られた上清に硫安を 85%飽和と なるように加え、ー晚攪拌後、遠心分離により沈殿を回収した。沈殿を buffer B 20 ml に溶解した後、 1Lの buffer Bに対して透析した。 3時間おきに透析外液を交換し、合 計 9時間透析した。 （Fraction 3, 33 ml)
[0039] (4) DE-52カラムクロマトグラフィー
Fraction 3を、 buffer Bで平衡化した DEAE-Cellulose (DE52) (Whatman International Ltd, Maidstone, England)を充填したカラム（2.2 X 11 cm)にアプライし た。 200 mlの buffer Bでカラムを洗浄した後、 0—0.3 M NaClを含む 600 mlの buffer B を用いてリニアグラジェント法により、流速 40 ml/hで酵素を溶出した。各フラクション（ 4 ml/tube)の酵素活性およびタンパク質を測定した。高活性画分（NAT Iおよび NAT Π画分）を集め buffer B 1Lに対して 3時間おきに透析外液を交換し、合計 6時間透析 を行った。 （Fraction 4, NAT I fraction 32 mlおよび NAT II fraction 36 ml0ここで、「 NAT I」「NAT II」は、 10-L-2株由来の 2種類のァリルアミン N-ァセチルトランスフェラ ーゼを意味する。 ) [0040] (5) DEAE-Toyopearlカラムクロマトグラフィー
Fraction 4 (NAT I fractionおよび NAT II fraction)をそれぞれ、 buffer Bで平衡化し た DEAE-Toyopearl (東ソ一、東京）を充填したカラム（2.2 X 11 cm)にアプライした。
200 mlの buffer Bでカラムを洗浄した後、 0 0.3 M NaClを含む 120 mlの buffer Bを用 いてリニアグラジェント法により、流速 40 ml/hで酵素を溶出した。各フラクション（3 ml/tube)の酵素活性およびタンパク質を測定した。高活性画分を集め buffer B 1Lに 対して 3時間おきに透析外液を交換し、合計 6時間透析を行った。 (Fraction 5， NAT I fraction 19 mlおよび NAT II fraction 21 ml)
[0041] (6) POROS 20PEカラムクロマトグラフィー
Fraction 5 (NAT I fraction 19 mlおよび NAT II fraction 21 ml)をそれぞれ 2 M硫酸 アンモニゥムを含む buffer Bで平衡化した POROS 20PE (PerSeptove Biosystems)を 充填したカラム（0.46 X 10.0 cm)にアプライした。 2 M硫酸アンモニゥムを含む buffer B でカラムを洗浄した後、 2.0— 0 M硫酸アンモニゥムを含む buffer Bを用いて BioCAD Workstation systemを用いてリニアグラジェント法により、流速 15 ml/minで酵素を溶 出した。各フラクション (2 ml/tube)の酵素活性およびタンパク質量を測定した。 ( Fraction 6, 3り ml)
[0042] (7) ゲル濾過クロマトグラフィー
Fractionり Apollo 20 ml high-performance centrifugal concentrators (Oroital Biosciences, MA, USA)により 1 mほで濃縮した。濃縮液を 0.2 M NaClを含む buffer B で平衡化した TOYOPEARL HW-55F (東ソ一，東京）を充填したカラム（2.0 X 97 cm) にアプライした。同 bufferを用いて流速 20 ml/hで酵素を溶出した。各フラクション (2 ml/tube)の酵素活性およびタンパク質を測定し、高活性画分を集めた。 (Fraction 7)
[0043] ぐ結果 >
硫安分画に続いて、 DE52カラムクロマトグラフィーに供したところ、ァリルァミン N -ァ セチルトランスフェラーゼ活性のピークが 2ピーク見られた（図 10)。そこで、各ピーク を NAT Iおよび NAT IIとし、精製を進めた。各精製段階における酵素活性およびタン パク質量を表 3に示す。最終調製酵素は 4%の収率で 94倍に精製され、比活性は 3 U/mgであった。同調製酵素について Nativeなポリアクリルアミド電気泳動および SDS-PAGE電気泳動による純度の検討を行った力 単一ではなかった
[0044] [表 3]
Total Total Specific
Fraction Activity Protein Activity Recovery
(%) (U) (mg) (U.mg 1)
1： Cell extract 22.7 1400 0.016 100
2: Streptomycin sulfate 19 1300 0.014 83
3: Ammonium sulfate 5 450 0.011 22
I II I II I II I II
4: DE52 4.7 8.5 8.7 18.7 0.54 0.45 21 37
5: DEAE-Toyopearl 650S 2.1 5 0.81 3.17 2.6 1.6 9 22
6: POROS 20PE 0.5 1.8 0.41 0.62 1.2 2.9 2 8
[0045] [b-2]酵素の特性解析:ゲル濾過法による分子量の測定
ぐ方法 >
分子量は、ゲル濾過法により決定した。マーカー（各 4 mg)を用いて、上記 (7)で述 ベた方法に従レ、 TOYOPEARL HW-55F (2.0 X 97 cm)上で行った。マーカーとして、 チトクローム c (12, 500)、キモトリプシノゲン（25,000)、オルアルブミン（45,000)、ゥシ 血清アルブミン（68,000)、アルドラーゼ（158,000)を使用した。
[0046] ぐ結果 >
ゲル濾過法による NAT Iおよび NAT IIの分子量はともに 35, 400であった。 以上の方法により精製した PDa_l株および 10-L-2株由来のァリルアミン N-ァセチ ノレトランスフェラーゼについて、各酵素の特徴を比較してまとめた表を以下に示す。
[0047] [表 4]
PDa-1株由来酵素 10-L-2株由来酵素 酵素 1種類 2種類 酵素生産に与える補助 1% (w/v) ショ糖および 1% (w/v) ポリペプトンを 基質の結果 0.15% (w/v) 硝酸アンモニ 培地に添加すると酵素の ゥムを培地に添加すると酵 合成量が増加する。
素の合成量が向上する。
酵素精製時の安定性 1 mM EDTAおよび 1 mM 20 mM Tris-HCl緩衝液
DTTを添加した 20 mM (pH 8.0) のみで安定。 Tris-HCl緩衝液 （pH 8.0)
で安定。
Nativeな状態での分子 31,000 NAT Iおよび NAT IIとも 里 に 35,400
基質特異性 特になし 3位に置換基を有する誘 導体に対して高い活性を 示す。
[0048] 上記のように、 10-L-2株由来の酵素は、 3位に置換基を有する誘導体（3-トルイジ ン、 3-クロロア二リン、 3-ァミノフエノール、 3-ァミノ安息香酸、 3-二トロア二リン）に対し て比較的高い活性を示した。
PDa-1株および 10-L-2株以外の菌株を使用する場合も、同様の方法により菌株か らの酵素精製が可能である。 実施例
[0049] 以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明する力 本発明はこれら 実施例によって何ら限定されるものではない。
[0050] [実施例 1 :フエ二レンジアミンを代謝する微生物の分離 ·同定]
[1-1]フエ二レンジアミンを代謝する微生物の分離
<方法 >
1.分離源
各地から採取した土壌試料 350を分離源として用いた。
[0051] 2.分離培地の調製
o-、 m -、 P-体のフエ二レンジァミン.二塩酸塩を基質として用いた。下記の表 5に分 離用培地組成を示す。培地の pHが 5.5および 6.8になるように KH POおよび Na HPO
•12H 0の添加量を調整した。同培地はフエ二レンジァミンとは別に炭素源としてショ 糖、窒素源として硝酸アンモニゥムを含む。 A液および B液はオートクレープにて別 々に殺菌し、フヱニレンジァミン'二塩酸塩を含む C液は濾過除菌装置を用いて除菌 した。冷却後これらを混合した。また、固体培地は 1.5% (w/v)寒天をカ卩えて調製した
[表 5] pH 5.5 pH 6.8
A) Buffer solution (100 ml)
KH2P04 2.00 g 0.45 g
Na2HP04- 12H20 0.25 g 1.80 g
NaCI 0.10 g 0.10 g
Yeast extract 0.04 g 0.04 g
Sucrose 2.00 g 2.00 g
Figure imgf000019_0001
Agar 3.00 g 3.00 g
B) Metal solution (30 ml)
MgS04- 7H20 0.10 g 0.10 g
CaCI2'2H2〇 0.10 mg 0.10 mg
CuS04- 5H20 0.10 mg 0.10 mg
ZnCI2 0.10 mg 0.10 mg
FeS04-7H20 0.10 mg 0.10 mg
C) Substrate solution (70 ml)
Phenylenediamine■ 2HCI 0.24 g 0.24 g
(2-, 3-, or 4-)
KH2P04 0.60 g
Na2HP04- 12H20 ― 0.60 g
3.分離方法
lgの土壌を 0.8% (w/v) NaCl溶液 9 mlに懸濁後 2— 3分間静置し、上清 1 mlを表 5 に示した 0.12% (w/v)フエ二レンジァミン培地 6.7 mlに添カロした。これを 30°Cで 1一 2週 間振盪培養した後、生育の見られた培養液をフエ二レンジァミン固体培地上に塗抹 した。さらに、単一コロニーをフエ二レンジァミン固体培地に移し、同培地にて良好な 生育を示した菌株をフエ二レンジァミン分解菌として保存した。
[0054] 4.培地中のフエ二レンジァミンの定量
芳香族ァミン類の定量法であるジァゾカップリング法によった。
[0055] ぐ結果 >
1.フヱニレンジアミンを代謝する菌株の分離
フエ二レンジアミンは、 2_、 3_、 4-体 3種類とも水溶液中では不安定で、菌が摂取し ないコントロール培地では集積培養 7日間のうちに培養液は褐色一黒色に変わる。ま ず、菌の生育が良好かつ培養液の色が変色しない集積培養サンプルを選抜した。
350の土壌試料から目的にかなう菌株を 2-フヱニレンジァミン分離培地（pH 6.8)およ び 4-フエ二レンジァミン分離培地（pH 5.5)よりそれぞれ 17株、 44株分離した。
[0056] 2.フエ二レンジアミンを代謝する菌株の選択
2-フエ二レンジアミンを代謝する菌株 17株について肉汁平板培地および 2-フエニレ ンジァミン平板培地上にて純粋分離を行い、生育の良好な株を 4株 (PDa_l、 PDa_2、 PDa_3、 PDa-4)選択した。さらに、液体培地にて基質の分解を確認し、以後の実験 にはこれら 4株のうち最も生育の良好な PDa-1株を用いることにした。
[0057] 4-フエ二レンジアミンを代謝する菌株 44株から純粋分離を行い、生育の良好な株を
3株（10-L-1、 10-L-2、 10-L-3)選択した。以後の実験には生育の最も良好な
10-L-2株を用いることにした。
[0058] [1-2]分離菌 PDa-1および 10-L-2株の同定
<方法 >
分離菌の同定は形態的性質、生化学的試験および 16S rRNA遺伝子の解析によつ た。
[0059] ぐ結果 >
同定試験に用いた PDa-1および 10-L-2株の菌学的性質を下記の表 6に示す。ダラ ム陽性で周鞭毛を有し、ォキシダーゼは陰性、カタラーゼ活性は陽性であった。また 、試験に用いた糖 (D-ァラビノース、 D-フルクトース、ショ糖、 D-グルコース）から発酵 により嫌気的にも酸の生成が見られた。さらに、胞子形成能も見られた。以上の結果 は、 Bacillus属の特徴を示すものであった。そこで、 16S rRNA遺伝子の解析を行った 。 PDa-1株（1544 bp)および 10-L-2株（1540 bp)の 16S rRNA遺伝子の塩基配列をそ れぞれ決定した。 DDBJデータバンクのデータベースを用いてシークェンス解析したと ころ、既報の Bacillus cereusと高い類似性を示した。以上より、両株を Bacillus cereus と同定した。また、 PDa_l株と 10-L-2株由来の 16S rRNA遺伝子の相同性を調べたと ころ、 99.5。/0であった。
[表 6]
Test or characteristic Strain PDa-1 Strain 10-L-2
Morphology rod rod
Size (μηι) 1.0x2.4-3.4 1.5x3.1
Aerobic growth + +
Gram stain positive positive
Flagella peritrichous peritrichous
Spore formation + +
Catalase + +
Oxidase
O-F test fermentative fermentative
16S rRNA analysis B. cereus B16 (99.7%) B. cereus ZK (99.8%)
B. cereus PR-1 (99.7%)
[1-3]本実施例の結果と考察
フエ二レンジアミンを含む三種類（2_、 3-、 4-)の分離培地（pH 6.8:fe pH 5.5)を 用いてスクリーニングを行った結果、 2-フエ二レンジアミンを代謝する Bacillus cereus PDa-1および 4-フエ二レンジアミンを代謝する Bacillus cereus 10_L_2を分離すること ができた。ァミノフエノール (水酸基置換体)やフエ二レンジァミン (ァミノ基置換体)等 のァニリン誘導体は、水溶液中での安定性は pHに依存する。 2-フエ二レンジアミンは 中性付近で安定であるのに対して、 4-フエ二レンジアミンは弱酸性において安定で、 基質が安定な pH条件において基質を代謝する菌株を分離できる傾向がみられた。
PDa-1株と 10-L-2株由来の 16S rRNA遺伝子の相同性は、 99.5%であった力 実施 例 3で述べる基質特異性の相違 (前記表 1)から、同種に属するが異なる菌であると 結論した。 ほた、 10-L-2株は 2種類のァリルアミン N-ァセチルトランスフェラーゼを 生産する（前記表 4)。）
[0062] [実施例 2 : Bacillus cereus PDa-1および Bacillus cereus 10_L_2株の生育とフエニレ ンジァミンの代 ί]
[2-l] B. cereus PDa- 1および B. cereus 10- L_2株の生育とフエ二レンジァミンの代謝 に与える各種環境因子の影響
ぐ方法 >
1. B. cereus PDa- 1および B. cereus 10-L-2株の生育とフエ二レンジァミンの代謝に 与える基質濃度の影響
a.目 ij培養
1 % (w/v)ポリペプトンを含む 0.1 % (w/v)フエ二レンジアミン培地 (7 ml/tube)にて 12 時間前培養した。
[0063] b.本培養
PDa-1株の本培養：前培養液 1 mlを 1 % (w/v)ショ糖、 0.15% (w/v) NH NOを含む
4 3 培地（pH 6.8、 70 ml/500 mlコルベン）に 2_フエ二レンジァミン'二塩酸塩（0.10%—
0.20% (w/v) )を添加し培養した。
[0064] 10-L-2株の本培養：前培養液 1 mlを 1 % (w/v)ポリペプトンを含む 0.07%フエ二レン ジァミン培地（pH 5.5, 70 ml/500 mlコルベン）に 4_フエ二レンジァミン'二塩酸塩（
0.035%— 0.21% (w/v) )を添加し培養した。
[0065] cフエ二レンジァミンおよび代謝産物の定量 HPLCによった。
分析条件
カラム： Inertsil ODS-2 (4.6 X 150 mm)
溶離液： 20 mM H PO -NaH PO緩衝液（pH 3.0) -MeOH (98： 2)
3 4 2 4
流速： 0.7 ml/min
検出波長： 274 nm
[0066] 2. B. cereus PDa- 1および B. cereus 10-L-2株の生育とフエ二レンジァミンの代謝に 与える炭素源の影響
前培養は上記 1. a.で述べた条件とし、本培養においてショ糖（0.1% (w/v) 2-フエ二 レンジァミン培地、 PDa-1株）またはポリペプトン（0.07% (w/v) 4-フエ二レンジアミン培 地、 10-L-2株）のかわりに培地に添加する炭素源としてポリペプトン、 D-グルコース、 ショ糖、コハク酸 2ナトリウム、酢酸ナトリウム、グリセロールを終濃度 1 % (w/v)となるよ うにカ卩えた。
[0067] 3. B. cereus PDa- 1および B. cereus 10-L-2株の生育とフエ二レンジァミンの代謝に 与える pHの影響
前培養培地は上記 1. a.で述べた条件とし、本培養において培地の pHが 3.5 8.5と なるように KH POおよび Na HPO - 12H 0の添加量を調整した。本培地でのフエユレ ンジァミン濃度は 0.1 % (w/v) 2 -フエ二レンジアミン'二塩酸塩および 0.07% (w/v) 4- フエ二レンジァミン'二塩酸塩とした。
[0068] ぐ結果 >
1. B. cereus PDa- 1および B. cereus 10-L-2株の生育とフエ二レンジァミンの代謝に 与える基質濃度の影響
B. cereus PDa_l株： 2_フエ二レンジアミン*二塩酸塩濃度が 0.125% (w/v)までは
PDa-1株は良好な生育とともに基質を 100%分解した力 S、 0.15% (w/v)濃度の培地で は、生育は不良で残存基質量（％)は 40%であった。
[0069] B. cereus 10_L_2株： 0.035%— 0.105% (w/v)までは生育とともに基質を 100%分解 した。しかし、 0.035% (w/v)フエ二レンジァミン培地と比較して基質濃度が増加する につれて生育も不良となり、 0.14% (w/v)培地での残存基質量（％)は 50%であった
。一方、 0.20% (w/v)培地においても本菌は生育を示した力 4-フエ二レンジァミンの 分解はまったく見られなかった。
[0070] 2. B. cereus PDa- 1および B. cereus 10-L-2株の生育とフエ二レンジァミンの代謝に 与える炭素源の影響
B. cereus PDa_l株：試験した中で、 1.0% (w/v)ショ糖を含む 2 -フエ二レンジァミン 培地において良好な生育を示し、基質も完全に分解された。しかし、 1.0% (w/v)コハ ク酸 2ナトリウムを含む同培地では生育は不良で、基質の減少も全く見られなかった。
[0071] B. cereus 10-L-2株：試験した中で、 1.0% (w/v)ポリペプトンを含む 4-フエ二レンジ ァミン培地において非常に良好な生育を示し、基質も完全に分解された。一方、 PDa-1株が良好な生育を示した 1.0% (w/v)ショ糖添加培地では、生育は不良で残存 基質量（％)は 50%であった。
[0072] 3. B. cereus PDa_lおよび B. cereus 10-L-2株の生育とフエ二レンジァミンの代謝に 与える pHの影響
B. cereus PDa_l株：試験した中で、 pH 7.5の 2-フエ二レンジァミン培地において良 好な生育とともに基質が 80%分解された。
[0073] B. cereus 10-L-2株：試験した中で、 pH 4.5および 5.5の 4-フエ二レンジァミン培地 において良好な生育を示すとともに基質がほぼ完全に分解された。
[0074] [2-2]代謝産物の分離'同定
1. B. cereus PDa- 1の培養と休止菌体の調製
1 % (w/v)ポリペプトンを含む 0.1 % (w/v) 2-フエ二レンジアミン培地 (7 ml/tube)にて PDa-1株を前培養後、 1 % (w/v)ショ糖、 0.15% (w/v) NH NOを含む培地（70 ml/500
4 3
mlコルベン）に前培養液 1 mlを添加し、 24時間培養した。集菌した菌体を反応溶液（ 組成を下記表 7に示す）に濁度（OD )が 30となるように懸濁し、 30°Cで振とうした。各
660
時間ごとに反応溶液をサンプリングし、 PDa-1株の生育と 2-フエ二レンジァミンの減少 を HPLCにて定量した。
[0075] [表 7]
KH2P0 0.45 g
Na2HP04- 12H20 2.4 g
NaCI 0.10 g
MgS04- 7H20 0.10 g
CaCI2-2H20 0.10 mg
CuS04- 5H20 0.10 mg
ZnCI2 0.10 mg
FeS04- 7H20 0.10 mg
H20 200 ml(pH 6.8)
[0076] 2. B. cereus 10-L- 2株の培養
1 % (w/v)ポリペプトンを含む 0·07%4-フエ二レンジァミン培地（7 ml/tube)にて 10-L-2株を前培養後、同じ組成の培地（70 ml/500 mlコルベン）に前培養液 1 mlを 添加し、 24時間培養した。各時間ごとに反応溶液をサンプリングし、 10-L-2株の生育 と 4-フエ二レンジァミンの減少を HPLCにて定量した。
[0077] 3.代謝産物の分離'同定
遠心分離し、菌体と上清を分別した。上清を濃縮後、 3N NaOHにて PH 11とし、酢 酸ェチルにて蓄積した代謝産物を反応溶液より抽出した。抽出後のサンプルを
DI-MS分析および NMR分析した。
[0078] ぐ結果 >
DI-MS分析および1 H-NMRおよび13 C-NMR分析より得られたスペクトルを解析し、 代謝産物はアミノアセトァニリドであると同定した。 2_フエ二レンジァミンおよび 4_フエ 二レンジアミンはそれぞれ 2-アミノアセトァニリドおよび 4_アミノアセトァ二リドに変換さ れたと結論した。図 5および図 6に 2_フヱニレンジァミンより生成した代謝産物の各ス ぺクトノレを示す。
[0079] [2- 3] B. cereus PDa- 1および Β· cereus 10- L- 2株によるフエ二レンジァミンからァミノ ァセトァニリドの生産
<方法 >
PDa-1の培養および本菌の休止菌体を用いた反応は前記 [2-1]に述べた方法に 従った。反応溶液中の本菌由来の濁度（OD )および反応溶液中の 2-フエ二レンジ ァミン (初濃度： 5.5 mM)と代謝産物 2-アミノアセトァ二リドの量を HPLCにて定量した
[0080] 10-L-2の growing cellを用いた反応は前記 [2-2]に述べた方法に従った。反応溶 液中の本菌由来の濁度（〇D )および反応溶液中の 4-フエ二レンジァミン (初濃度：
3.9 mM)と代謝産物 4_アミノアセトァ二リドの量を HPLCにて定量した。
[0081] ぐ結果 >
PDa_lの休止菌体を用いた反応において反応 30時間の時点で 2-フヱニレンジアミ ンの残存量は 0.14 mM、 2_アミノアセトァ二リドの生産量は 3.80 mMであり、モル変換 率は 71%であった（図 7)。
[0082] 10-L-2の growing cellを用いた反応において培養時間 30時間の時点で 4-フヱユレ ンジァミンの残存量は 0%であり、 4-アミノアセトァ二リドの生産量は 3.5 mMであり、モ ル変換率は 90%であった（図 8)。
[0083] [2-4]本実施例の結果と考察
フエ二レンジァミンの代謝に与える基質濃度の影響を調べたところ、反応溶液ほた は培地）中の基質濃度の増加に伴い、基質の分解率および分解速度は減少した。フ ェニレンジアミン類は変異原性を示すことが報告されており、その毒性から菌の増殖 および代謝酵素の生合成系が抑制されたと思われる。 PDa-1株および 10-L-2株の生 育とフエ二レンジァミンの分解に与える pHの影響を調べたところ、 PDa-1株は中性付 近で生育および基質の分解が良好であった。一方、 10-L-2株は弱酸性側で生育お よび基質の分解が良好であった。この結果は、スクリーニング時の pH領域と類似して いる。フヱニレンジァミンの分解に与える炭素源の影響および pHの影響試験結果は 両菌において相違が見られた。
[0084] フエ二レンジァミンからの代謝産物を分離し、アミノアセトァニリドであると同定した。
両菌はフエ二レンジァミンの有する 2つのアミノ基のうち、片方のみをァセチル化した。 し力も、そのモル変換効率は高ぐ PDa-1株は 71 % (2-フエ二レンジアミン→2_ァミノ ァセトァニリド）であり、 10-L-2株は 90% (4-フエ二レンジアミン→4-アミノアセトァニリド )であった。
[0085] [実施例 3：ァニリン誘導体に対する基質特性]
<方法 >
PDa-1株の休止菌体調製法および反応は、実施例 2の [2-1]で述べた方法によつ た。 10-L-2株の培養方法は、実施例 2の [2-2]で述べた方法によった。
[0086] 用いた基質は、ァニリンおよびその誘導体である 2-, 3-, 4_フエ二レンジァミン、 2-, 3-, 4-トルィジン、 2-, 3-, 4-クロロア二リン、 2-, 3-, 4-ァミノフエノール、 2-, 3_， 4-ァ ミノ安息香酸、 2-, 3-, 4-二トロア二リン、 4-， 5-ァミノサリチル酸、 2-ァミノフルオレン、 スルファメタジン、 1-ナフチルァミン、 1-ァミノ- 2-ナフトールである。前記表 7に組成を 示した 5 mM基質を含む反応溶液を調製した（ただし、 2-ァミノフルオレン、スルファメ タジン、トナフチルァミン、 1-ァミノ- 2-ナフトールの 4種類は水に難溶のため終濃度 1 mMとした）。 [0087] 各時間サンプリングを行い、基質の減少量を分光光学的または HPLCにて定量した 。フエ二レンジァミン以外のァニリン誘導体の定量はジァゾカップリング反応によった 。さらに、蓄積した代謝産物（ァセトァニリド誘導体）の同定は HPLCおよび Dト MS分 析によった。
[0088] ぐ結果 >
PDa-1株の resting cellおよび 10-L- 2株の growing cellを用いたァニリン誘導体に対 する基質特異性試験結果を前記表 1に示した。さらに MS分析の結果から推定した反 応機構を図 1に示した。
[0089] ぐ本実施例の結果と考察 >
PDa_l株および 10-L-2株由来のァセチルトランスフェラーゼは幅広い基質に対して 活性を示した。 PDa_l株由来の同酵素は 10-L-2株由来の同酵素と比較してより幅広 い基質に対して活性を示すと言える。 10-L-2株由来の同酵素はクロロア二リン類に はまったく作用しないが、 PDa-1株由来の同酵素よりもトノレイジン、二トロア二リンゃァ ミノ安息香酸分解率が高かった。
[0090] [実施例 4 :フエ二レンジァミン代謝に関与する酵素系の解析]
[4-1]フエ二レンジァミン代謝に関与する酵素系の検索
<方法 >
PDa-1株および 10-L-2株をそれぞれ培養し、得られた菌体から無細胞抽出液を調 製した。表 8に示す反応組成にて酵素反応（30°C、 1時間）を行レ、、 HPLCにてフエ二 レンジァミンから生成したアミノアセトァ二リドを分析した。
[0091] [表 8]
50 mM Sodium-potassium phosphate (pH 7.5) 2.50 ml
30 mM DTT 0.1 ml
30 mM EDTA 0.1 ml
5 mM Acety卜 CoA 0.1 ml
5 mM phenylenediamine · 2HCI 0.1 ml
Enzyme 0.10 ml
Total 3.0 ml
[0092] <結果 >
ァセチル CoA添加時のみフエ二レンジァミンからアミノアセトァニリドへの変換が見ら れた。ァセチル化を触媒する酵素はァリルアミン N-ァセチルトランスフェラーゼであ るといえる。酵素反応機構を図 3に示す。
[0093] [4-2]PDa-l株および 10-L-2株由来ァリルアミン N-ァセチルトランスフェラーゼの特 性解析
<方法 >
1.酵素の安定化
無細胞抽出液を調製し、硫酸ストレプトマイシンにより除核酸後、硫安分画により活 性画分を分画した。活性画分を種々の有機酸、糖類等を含む 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)にて透析し、経時的に酵素活性を測定した。
[0094] 2.酵素の精製
前述した方法により菌体破砕後、除核酸、硫安分画を行い、各種クロマトグラフィー により分画した。
[0095] ぐ結果 >
1.酵素の安定化
PDa_l株由来の同酵素は 20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0)では、菌体破砕後 2日 で活性を失ったが、 1.0 mM EDTAおよび 1.0 mM DTTを含む 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)緩衝液中では安定であることを見いだした。一方、 10-L-2株由来の同酵素は 20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0)において 1週間以上安定であった。 [0096] 2.酵素の精製
各精製段階における酵素活性およびタンパク質量は、前記の表 2 (PDa_l株由来ァ リルアミン N-ァセチルトランスフェラーゼ）および表 3 ( 10-L-2株由来ァリルアミン N- ァセチルトランスフェラーゼ）に示したとおりである。精製酵素は単一でなかった。
DE52クロトグラムより PDa_l株由来の粗酵素液には一種類の同酵素が含まれている のに対して、 10-L-2株由来の粗酵素液には電気化学的性質が異なる 2種類の同酵 素が含まれていることがわかった（図 9および図 10)。
[0097] 3.酵素の特性
分子量は、ゲル濾過法により決定した。マーカー（各 4 mg)を用いて、 Toyopearl HW-55F (東ソ一，東京）を充填したカラム（2.0 X 97 cm)および 0.2 M NaClを含む 20 mM Tris_HCl緩衝液（pH 8.0)を用いて行った.同緩衝液を用いて流速 20 ml/hでタ ンパク質を溶出した。マーカーとして、チトクローム c (12,500)、キモトリプシノゲン（ 25,000)、オルアルブミン（45, 000)、ゥシ血清アルブミン（68, 000)、アルドラーゼ（ 158,000)を使用し、分子量算出のための検量線を作成した。 PDa-Ι株由来の同酵素 の分子量は、 31 ,000であった。また、 10-L-2株由来の 2種類の同酵素はともに分子量 35,400であった。
産業上の利用可能性
[0098] 本発明は以上のように、微生物及びその微生物が産生する酵素を利用してァニリ ン誘導体 (芳香族ァミン）のアミノ基をァセチルイ匕する方法であり、多数のァニリン誘 導体を基質として、それらのアミノ基を 1段階の反応で簡易にァセチルイ匕することがで きるため、アミノアセトァ二リドをはじめとする種々の有用なァセトァニリド類の生産に 利用できる。

Claims

請求の範囲
[I] ァニリン誘導体 (芳香族ァミン)の代謝活性を有する微生物または同微生物由来の 酵素を使用して、ァニリン誘導体のアミノ基をァセチルイ匕する方法。
[2] 請求項 1記載の方法であって、 2—フエ二レンジァミン、 3—フエ二レンジァミン、 4—フ ヱ二レンジァミン、 2—トルイジン、 3—トルイジン、 4—トルイジン、 2_クロロア二リン、 3_ クロロア二リン、 4—クロロア二リン、 2—ァミノフエノール、 3—ァミノフエノール、 4—ァミノ フエノーノレ、 2—ァミノ安息香酸、 3—ァミノ安息香酸、 4ーァミノ安息香酸、 2—二トロア二 リン、 3—二トロア二リン、 4一二トロア二リン、ァニリン、 4一アミノサリチノレ酸、 5—アミノサリ チル酸、 2—ァミノフルオレン、 1一ナフチルァミン、及び 1一アミノー 2—ナフトールからな る群から選ばれる、 1又は複数のァニリン誘導体のアミノ基をァセチルイ匕する方法。
[3] 休止菌体を使用することを特徴とする請求項 1又は 2記載の方法。
[4] 請求項 1一 3のいずれか 1項に記載の方法に使用される微生物。
[5] 請求項 1一 3のいずれ力 1項に記載の方法に使用されるバチルス属菌。
[6] バチルス ·セレウス（Bacillus cereus) PDa-1株（受領番号 FERM ABP_10292)。
[7] バチルス ·セレウス（Bacillus cereus) 10-L-2株（受領番号 FERM ABP_10291)。
[8] 請求項 1又は 2記載の方法に使用される微生物由来の酵素。
[9] 請求項 1又は 2記載の方法に使用される微生物由来アミノアセチルトランスフェラー ゼ。
[10] 請求項 1又は 2記載の方法に使用される微生物由来ァセチル CoA依存型アミノアセ チルトランスフェラーゼ。
[II] 請求項 1又は 2記載の方法に使用される微生物由来の酵素であって、ァミノナフタ レン類のアミノ基をァセチル化する酵素活性を有する酵素。
[12] 請求項 1一 3のいずれか 1項に記載の方法によって、ァニリン誘導体のアミノ基をァ セチル化する工程を含む、化合物の製造方法。
[13] 化合物が、 2_アミノアセトァ二リド、 3_アミノアセトァ二リド、 4_アミノアセトァ二リド、 2 —メチルァセトァニリド、 3—メチルァセトァニリド、 4ーメチルァセトァニリド、 2_クロロア セトァ二リド、 3_クロロアセトァ二リド、 4_クロロアセトァ二リド、 2—ヒドロキシァセトァニリ ド、 3—ヒドロキシァセトァ二リド、 4—ヒドロキシァセトァ二リド、 2_ァセトアミド安息香酸、 3 -ァセトアミド安息香酸、 4一ァセトアミド安息香酸、 2 -二トロアセトァ二リド、 3 -二トロ ァセトァニリド、 4_二トロアセトァ二リド、ァセトァニリド、 2—ヒドロキシ _4—ァセチルアミ ノ安息香酸、 2—ヒドロキシー 5—ァセチルァミノ安息香酸、 2_ァセトアミドフルオレン、 1 —ナフチルァセトアミド、及び N— (2—ヒドロキシ— 1_ナフチル）ァセトアミドのいずれか である、請求項 12記載の化合物の製造方法。
PCT/JP2005/005195 2004-03-24 2005-03-23 微生物及び微生物由来酵素によるアニリン誘導体のアセチル化 WO2005090588A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006511293A JP4812619B2 (ja) 2004-03-24 2005-03-23 微生物及び微生物由来酵素によるアニリン誘導体のアセチル化

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US55568104P 2004-03-24 2004-03-24
US60/555,681 2004-03-24
US63057604P 2004-11-26 2004-11-26
US60/630,576 2004-11-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005090588A1 true WO2005090588A1 (ja) 2005-09-29

Family

ID=34993713

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/005195 WO2005090588A1 (ja) 2004-03-24 2005-03-23 微生物及び微生物由来酵素によるアニリン誘導体のアセチル化

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP4812619B2 (ja)
WO (1) WO2005090588A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010017176A (ja) * 2008-06-10 2010-01-28 Sumitomo Rubber Ind Ltd 微生物または植物を利用した老化防止剤、加硫促進剤または変性天然ゴムの製造方法
JP2011083288A (ja) * 2008-06-10 2011-04-28 Sumitomo Rubber Ind Ltd 微生物または植物を利用した老化防止剤、加硫促進剤または変性天然ゴムの製造方法
CN104058985A (zh) * 2014-05-29 2014-09-24 西安交通大学 一种1-乙酰基-4-氯-1h-吲唑的乙酰基转移至芳香族伯胺的方法
JP2018039001A (ja) * 2016-09-01 2018-03-15 積水アクアシステム株式会社 活性汚泥の処理方法、汚泥発生量の抑制方法、並びに、微生物

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05339222A (ja) * 1992-06-09 1993-12-21 Idemitsu Petrochem Co Ltd アミド化合物の製造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05339222A (ja) * 1992-06-09 1993-12-21 Idemitsu Petrochem Co Ltd アミド化合物の製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MOUNA A. ET AL: "Enantioselective acetylation of primary amines by Clindrocarpon radicicola", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 3, no. 4, 1993, pages 681 - 684, XP000655187 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010017176A (ja) * 2008-06-10 2010-01-28 Sumitomo Rubber Ind Ltd 微生物または植物を利用した老化防止剤、加硫促進剤または変性天然ゴムの製造方法
JP4662571B2 (ja) * 2008-06-10 2011-03-30 住友ゴム工業株式会社 微生物または植物を利用した老化防止剤、加硫促進剤または変性天然ゴムの製造方法
JP2011083288A (ja) * 2008-06-10 2011-04-28 Sumitomo Rubber Ind Ltd 微生物または植物を利用した老化防止剤、加硫促進剤または変性天然ゴムの製造方法
CN104058985A (zh) * 2014-05-29 2014-09-24 西安交通大学 一种1-乙酰基-4-氯-1h-吲唑的乙酰基转移至芳香族伯胺的方法
JP2018039001A (ja) * 2016-09-01 2018-03-15 積水アクアシステム株式会社 活性汚泥の処理方法、汚泥発生量の抑制方法、並びに、微生物

Also Published As

Publication number Publication date
JP4812619B2 (ja) 2011-11-09
JPWO2005090588A1 (ja) 2008-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2006093322A2 (en) Method for manufacturing 4-hydroxy-l-isoleucine or a salt thereof
EP1513946B1 (en) Polypeptides having alpha-h-alpha amino acid amide racemase activity and nucleic acids encoding the same
EP1624052B1 (en) Process for the production of beta-amino acids with the use of acylase
CN102203244A (zh) 制备光学活性胺衍生物的方法
CN118184576B (zh) 一种天然蓝色素及其生物合成方法
WO2005090588A1 (ja) 微生物及び微生物由来酵素によるアニリン誘導体のアセチル化
US4605615A (en) L-glutamic acid oxidase (H2 O2 -generating), its production and analytical method therefor
JP4941990B2 (ja) Ｎε−アシル−Ｌ−リジン特異的アミノアシラーゼ
CN111944794A (zh) 酰胺酶xam及其编码基因和应用
KR987001034A (ko) D-N-카르바모일-알파-아미노산의 제조법(Process for Producing D-N-Carbamoyl-Alpha-Amino Acid)
Hartley et al. Production of D-amino acids from D, L-5-substituted hydantoins by an Agrobacterium tumefaciens strain and isolation of a mutant with inducer-independent expression of hydantoin-hydrolysing activity
Takenaka et al. Microbial transformation of aniline derivatives: regioselective biotransformation and detoxification of 2-phenylenediamine by Bacillus cereus strain PDa-1
Wu et al. Enzymatic production of Dp-hydroxyphenylglycine from DL-5-p-hydroxyphenylhydantoin by Sinorhizobium morelens S-5
CA2494854C (en) Methods to produce theanine
Thomas Evans et al. A Novel, Efficient Biotransformation for the Production of l–Phenylalanine
CN109321492B (zh) 非脱羧勒克菌zjb-17008及其应用
EA009075B1 (ru) Штаммы микроорганизма rhodococcus, способные превращать нитрил в амид, и способ получения амидов
Moreau et al. The enzymatic production of adipic acid
US6902915B2 (en) Heat-stable D-aminoacylase
CA2245543A1 (en) Process for producing n-protected d-proline derivatives 8
US5212069A (en) Method of using N-acetyl-2,3-Didehydroleucine acylase for the preparation of D- or L-tryptophyl glycine, D- or L-tryptophyl-D-methionine or L-tryptophyl-D-cysteine
Fukatsu et al. Optimum culture conditions for the production of N-substituted formamide deformylase by Arthrobacter pascens F164
US7709235B2 (en) 5-Substituted hydantoin racemase, DNA encoding the same, recombinant DNA, transformed cell, and process for production of optically active N-carbamylamino acid or optically active amino acid
JP2005304498A (ja) α−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体およびα−アミノアジピン酸誘導体を製造するための新規微生物と酵素、およびα−アミノアジピン酸セミアルデヒド誘導体とα−アミノアジピン酸誘導体の製造方法
JP4627039B2 (ja) アミダーゼ活性を有するポリペプチド及びその遺伝子

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006511293

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase