明 細 書 キノン系肺疾患治療剤 技術分野
本発明は、 メナテトレノンを有効成分とする肺癌治療剤および肺癌予後改善剤 に関する。 背景技術
近年、 肺癌は、 最も死亡率の高い疾患として位置付けられている "。 肺癌患者 の 6 0 %以上は、 外科的除去のできない進行ステージ (advanced stage) と診断さ れる 2 )。 このような場合には化学療法剤による治療が行われるが、 その奏効率は 非常に低い3 _ 5 )。 また、 多くの化学療法剤は、 副作用が強く、 患者の生活の質を 著しく低下させることが問題となっている。 そのため、 肺癌患者に対して、 有効 性が高く、 安全性に優れた薬剤および治療方法が強く望まれている。
ビタミン Kは、 ビタミン K依存性タンパク質の N末端に存在するグルタミン酸 残基を、 生理活性を有する γ—カルボキシグルタミン酸に変換する酵素である γ 一ダルタミルカルボキシラ一ゼの補酵素である。 そして、 ビタミン Κは血液凝固 I I因子 (プロ ト口ンビン) 、 V I I、 I Xや X等のビタミン Κ依存性タンパク 質の生合成に不可欠なビタミンである。
ビタミン Κファミ リ一は天然体の Κ 1 (フィ トナジオン) 、 Κ 2 (メナキノン、 メナテトレノン) や合成体の Κ 3 (メナジオン) から構成される。 なかでも、 ビ タミン Κ 2、 特にメナテトレノンは骨粗鬆症の治療薬として販売されている。 メナテトレノンは、 肝癌細胞株 (Hep3B、 Hep40) の増殖を抑制することが報告 されている6— 8 )。 また、 メナテトレノンは、 白血病細胞 (Primary, HL-60など) において、アポトーシスや分化を誘導することが知られている9一 1 2 )。さらには、 メナテトレノンの側鎖であるゲラニルゲラ二オールが、腫瘍細胞株(HL-60、K562、 Molt3、 Colo320DM) において1 3 )、 あるいはメナテトレノン類似体であるメナキ
ノン一 3、 メナキノン一 4及びメナキノン一 5が、 初代培養白血病細胞において 1 4 )、 アポトーシスを誘導することが報告されている。
メナテトレノンは、 白血病細胞において、 分化誘導を引き起こし、 白血病のみ ならず固形腫瘍にも有効であるとされている 1 5 )。
しかし、これらの文献においては、 in vitroにおける効果しか記載されておらず、 臨床での肺癌に対する効果は明らかになっていない。
また近年、 メナテトレノンが肝癌治療後の患者における肝癌の再発を抑制し、 生存率を高めることが知られている 1 6 )。 しかしながら、 臨床において癌に対す る薬剤の効果は、癌種ごとに異なることが当業者における技術常識となっており、 したがって、 各癌種ごとに臨床試験を行う実態がある。
このような背景において、 肺癌患者にメナテトレノンなどのビタミン K 2を投 与することによって、 肺癌の進行を抑制できるかどうか及び肺癌腫瘍の増大を抑 制することにより予後を改善できるかどうかについては臨床データは未だ取られ たことがなく、 不明であった。
参考
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1 4 ) Yaguchi M, Miyazawa K, Katagiri T, Nishimaki J, Kizaki M, Tohyama K and
Toyama K. Leukemia, 1 1 : 779-787, 1997
1 5 ) 特開平 6— 3 0 5 9 5 5号公報
1 6 ) 国際公開第 0 3 1 0 5 8 1 9号パンフレッ ト 発明の開示
本発明は、 このような状況に鑑みてなされたものであり、 その解決しようとす る課題は、 肺癌患者に対して、 有効性が高く、 安全性に優れた薬剤および治療方 法を提供することにある。
本発明者らは、 上記課題を解決するため、 鋭意検討を重ねた結果、 臨床におい て、 肺癌患者に対するメナテトレノンの投与により、 肺癌の進行を抑制したこと 及び肺癌腫瘍の増大を抑制することにより予後を改善できること、 さらには長期 間投与しても副作用を生じないことを見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、 以下に関する。
( 1 ) ビタミン K 2またはその水和物を有効成分として含む肺癌用医薬組成物。
( 2 ) 肺癌治療または肺癌予後改善のための請求項 1記載の医薬組成物。
( 3 ) ビタミン K 2またはその水和物を有効成分として含む医薬組成物を患者 に有効量投与することを特徴とする肺癌の治療方法。
( 4 ) ビタミン K 2またはその水和物を有効成分として含む医薬組成物を患者 に有効量投与することを特徴とする肺癌の予後改善方法。
( 5 ) 肺癌治療剤を製造するためのビタミン K 2またはその水和物の使用。
( 6 ) 肺癌予後改善剤を製造するためのビタミン K 2またはその水和物の使用。 上記 ( 1 ) 〜 ( 6 ) において、 ビタミン K 2はメナテトレノンであってもよい。 本発明により、 肺癌の治療剤および予後改善剤としてのビタミン K 2、 好まし くはメナテトレノンの有効性が確認された。 本発明の治療剤および予後改善剤を 用いて、 肺癌患者の治療および予後の改善が可能となった。
また、 本発明により、 肺癌患者に対するビタミン K 2、 好ましくはメナテトレ ノンの治療剤および予後改善剤としての有効性に加え、 ビタミン K 2、 好ましく はメナテトレノンが長期間投与しても極めて高い安全性が期待できることから、 長期間治療を続けることにより、 肺癌患者の生活の質を大きく改善することが可 能となった。 図面の簡単な説明
図 1は、 メナテトレノン処理による細胞増殖抑制を示したグラフである。 図 1 に示すように、メナテトレノン処理により、用量依存的に細胞増殖が抑制された。 図 2は、 メナテトレノン処理による形態学的変化を示したものである。 図 2に 示すように、 メナテトレノン処理により、 アポトーシスが起こっている細胞に典 型的な形態学的変化が観察された。
図 3は、 メナテトレノン処理によるアポトーシス誘導を示したものである。 図 3に示すように、 メナテトレノン処理により、 AP02.7陽性細胞およびカスパーゼ 3 (カスペース- 3 ) 活性が増加した。
図 4は、 メナテトレノン処理による G0/G1 arrestを示したグラフである。 図 4
に示すように、 メナテトレノン処理により、 G0/G1期の細胞集団が増加した。 図 5は、 メナテトレノンおよび CDDP処理による細胞増殖抑制における併用効 果を示したグラフである。 図 5に示すように、 メナテトレノンおよび CDDP処理 により、 細胞増殖抑制における併用効果が観察された。
図 6は、 メナテトレノン投与後の cytokeratin 19 fragment (CYFRA21 -1) の推移 を示したグラフである。 図 6に示すよ うに、 メナテ ト レノ ン投与によ り、 CYFRA21-1 が 36.6 ng/mLから 16.1 ng/mLに低下した。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施の形態について説明する。 以下の実施の形態は、 本発明を 説明するための例示であり、 本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではな レ、。 本発明は、 その要旨を逸脱しない限り、 さまざまな形態で実施をすることが できる。
なお、 本明細書において引用した文献、 および公開公報、 特許公報その他の特 許文献は、 参照として本明細書に組み込むものとする。
1 . 本発明の概要
本発明者は、 臨床において、 代表的なビタミン K 2であるメナテトレノンの投 与により肺癌の進行を抑制するという知見、 及び肺癌腫瘍の増大を抑制すること により予後を改善できるという知見、 さらには長期間投与しても副作用を生じな いという知見を見出し、 本発明を完成するに至った。 したがって、 本発明は、 ビ タミン K 2、 好ましくはメナテトレノンを有効成分として含む医薬組成物、 特に 肺癌治療剤および肺癌予後改善剤に関するものである。 また、 ビタミン Κ 2、 好 ましくはメナテトレノンを有効成分として含む医薬組成物を患者に有効量投与す ることを特徴とする、 肺癌の治療方法および肺癌予後改善方法、 ならびに肺癌治 療剤および肺癌予後改善剤を製造するためのビタミン Κ 2、 好ましくはメナテト レノンの使用も本発明の範囲である。 ビタミン Κ 2、 好ましくはメナテトレノン の水和物も本発明の範囲である。
2. ビタミン K 2
ビタミン Κ 2 (メナキノン、 menaquinone) は、 生体中において腸内細菌によ り合成されるため、構造の類似する種々の同属体が存在することが知られている。 メナキノンの構造式を以下の式 (I)に示す。
式 (I)中、 nは 1〜7の整数を示す。 本発明で使用するビタミン K 2のうち、 好 ましくは代表的なビタミン K 2である、 n = 4 (メナキノン一 4) のオールトラ ンス体、 メナテトレノンである。
本発明で使用するメナテトレノンとは、 化学名 2—メチル一 3—テトラプレニ ノレ一 1, 4—ナフ トキノン (2-methl-3-tetraprenyl-l,4-naphthoquinone) であり、 そ の構造式を以下に示す。
メナテトレノンは黄色の結晶または油状の物質であり、 におい及び味はなく、 光により分解しやすい。 また、 水にはほとんど溶けない。 メナテトレノンは、 ビ タミン K— I I、 ビタミン K 2 (VK2) 、 VK— I I、 とも称され、 本明細書 中において 「VK2」 と称する場合がある。
メナテトレノンなどのビタミン K 2の薬理作用は、 血液凝固因子 (プロ トロン ビン、 VII、 IX、 X) の生合成過程において、 グルタミン酸残基を、 生理活性を有 する γ—カルボキシグルタミン酸に変換する際のカルボキシル化反応に関与する ものである。 すなわち、 メナテトレノンなどのビタミン Κ 2の薬理作用は、 疋常 プロ トロンビン等の肝合成を促進し、 生体の止血機構を賦活して生理的に止血作 用を発現するものである。
本発明の医薬組成物の有効成分であるビタミン Κ 2、 好ましくはメナテトレノ ンは、 無水物であってもよいし、 水和物を形成していてもよい。 また、 メナテト レノンには結晶多形が存在することもあるが特定の結晶形に限定されず、 いずれ かの結晶形が単一であってもよいし、 結晶形混合物であってもよい。 さらに、 本 発明で使用するビタミン Κ 2、 好ましくはメナテトレノン、 またはその水和物が 生体内で分解されて生じる代謝物も本発明に包含される。
本発明に使用するビタミン Κ 2またはその水和物は、 公知の方法で製造するこ とができ、 代表的な例としては、 特開昭 4 9 - 5 5 6 5 0号公報に開示される方 法によって、 容易に製造することができる。 また、 合成メーカーから市販品とし て入手することもできる。
また、 本発明に使用するメナテトレノン、 またはその水和物も、 公知の方法で 製造することができ、 代表的な例として、 特開昭 4 9一 5 5 6 5 0号公報に開示 される方法によれば容易に製造することができるほか、 合成メーカーから容易に 入手することもできる。 また、 メナテトレノンはカプセル剤 (例えば、 「ケイツ —カプセル」 、 「ダラケーカプセル」 (以上、 エーザィ株式会社製) ) 、 注射剤 (例えば、 「ケイツー Ν 注」 (エーザィ株式会社製) ) 、 シロップ剤 (例えば、 「ケイツーシロップ」 (エーザィ株式会社製) ) 等の製剤としても入手できる。 さらに、本発明に使用するビタミン Κ 2には、体内で代謝されてビタミン Κ 2、 好ましくはメナテトレノンとなる物質を投与することもできる。 体内で代謝され てメナテトレノンとなる物質は特に限定されず、 例えば、 ビタミン K l、 フイ ト ナジオン等が挙げられる。 フィ トナジオンはケーワンカプセル (商品名) (エー ザィ株式会社製) 、 ケーワン錠 (商品名) (エーザィ株式会社製) またはケーヮ
ン散 (商品名) (エーザィ株式会社製) として入手することができる。
3 . 肺癌用医薬組成物
本発明は、 ビタミン K 2、 好ましくはメナテトレノン、 またはその水和物を有 効成分として含む肺癌用医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、例えば、 肺癌治療剤および肺癌予後改善剤として使用できる。
本発明において 「肺癌」 には、 腺癌 (adenocarcinoma) 、 扁平上皮癌 (squamous cell carcinoma) 、 月¾扁平上皮癌 (adenosquamous carcinoma) 、 大糸田月包;) (large cell carcinoma) 、小細胞癌 (small cell carcinoma) 等が含まれる (日本肺癌学会 (編) . 臨床 ·病理、 肺癌取扱い規約、 改訂第 5版. 東京:金原出版、 1999、 下里幸雄. WHO 肺ならびに胸膜腫瘍組織型分類第三版の解説:肺上皮性腫瘍について. 肺 癌 2000; 40: 1 -10. ) 。 本発明において、 肺癌の病期は特に限定されるものでは ない。 例えば TNM分類により分類される各ステージ (s ge IA, IB, ΠΑ, ΠΒ, ΠΙΑ, 1IIB, IV) のものが含まれる。
本発明において 「肺癌治療剤」 とは、 上記の肺癌に罹患した患者の肺癌進行を 抑制する作用、 肺癌腫瘍を消失させる作用、 または腫瘍の増大を抑制する作用を 有する肺癌用医薬組成物をいう。
本発明において 「予後」 とは、 病気の経過や結末を意味する。 本発明において 「肺癌予後改善剤」 は、 肺癌の進行を抑制する作用または肺癌腫瘍の増大を抑制 する作用を有する肺癌用医薬組成物を意味する。
本発明の治療剤および予後改善剤は、 長期間にわたり投与しても重篤な副作用 を生じないため、 良好な生活の質を維持することができる点においても有用であ る。
本発明の医薬組成物の効果は、 胸部レントゲン写真、 胸部 CT等の所見や生検 の病理組織診断により、あるいは腫瘍マーカーの値により判断することができる。 前記の腫瘍マーカ一は、 例えば、 非小細胞肺癌では CYFRA21 -1 を挙げることが できる。
本発明の医薬組成物は、 ビタミン K 2、 好ましくはメナテトレノン、 またはそ
の水和物をそのまま用いてもよいし、 または、 公知の薬学的に許容できる担体等 (例:賦形剤、 結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 着色剤、 矯味矯臭剤、 安定化剤、 乳化 剤、 吸収促進剤、 界面活性剤、 p H調整剤、 防腐剤、 抗酸化剤等) 、 一般に医薬 品製剤の原料として用いられる成分を配合して慣用される方法により製剤化して もよレ、。 また、必要に応じて、 ビタミン類、 ァミノ酸等の成分を配合してもよい。 製剤化の剤形としては、 錠剤、 散剤、 細粒剤、 顆粒剤、 カプセル剤、 シロップ剤、 坐剤、 注射剤、 軟膏剤、 パップ剤等があげられるが、 これらに限定されるもので はない。
また、 本発明においては、 ビタミン K 2、 好ましくはメナテトレノン、 または その水和物を有効成分として含む医薬組成物の投与形態は特に限定されないが、 経口的に投与することが好ましい。 メナテトレノンのカプセル剤は商品名ケイツ 一カプセル (エーザィ株式会社製) 、 グラケ一カプセル (エーザィ株式会社製) として、 またシロップ剤は商品名ケイツ一シロップ (エーザィ株式会社製) とし て、 注射剤は商品名ケイツ一 Ν注 (エーザィ株式会社製) として入手することが できる。
さらに、 上述のように本発明に使用するビタミン Κ 2には、 体内で代謝されて ビタミン Κ 2、 好ましくはメナテトレノンとなる物質 (例えば、 ビタミン K 1、 フイ トナジオン等) を用いることもできる。 フイ トナジオンのカプセル剤は商品 名ケ一ワンカプセル (ェ一ザィ株式会社製) として、 また、 錠剤は商品名ケーヮ ン錠 (エーザィ株式会社製) として、 散剤は商品名ケーワン散 (ェ一ザィ株式会 社製) として入手することができる。
また、 本発明には、 肺癌治療剤または肺癌予後改善剤を製造するための、 ビタ ミン Κ 2、 好ましくはメナテトレノン、 またはその水和物の使用も含まれる。 ビタミン Κ 2、 好ましくはメナテトレノン、 またはその水和物を有効成分とし て含有する本発明の医薬組成物は、 肺癌治療および肺癌予後改善に有用である。 すなわち、 本発明は、 ビタミン Κ 2、 好ましくはメナテトレノン、 またはその水 和物を有効成分として含む医薬組成物を、 肺癌の患者に有効量投与することを特 徴とする肺癌の治療方法および肺癌の予後改善方法を提供するものである。
本発明において、 ビタミン K 2、 好ましくはメナテトレノン、 またはその水和 物の有効な投与量 (有効量) としては、 成人 (体重 6 O k g) あたり、 通常、 1 0〜200mgZ日であり、 好ましくは 1 5〜: 1 35mgZ日であり、 さらに好 ましくは 30〜60mg/日 (例えば 45mg/日) である。 投与期間は、 特に 限定されるものではなく、 例えば、 1〜1 000日、 好ましくは 7〜300日で ある。 投与期間は、 肺癌の治療効果または予後改善効果と患者の状態 (例えば Performance status) とを勘案しながら、 適宜設定することができる。
これらの用法及び用量で本発明の医薬組成物を患者に投与すると、 副作用を生 じることなく (副作用が生じても患者に影響のない微弱な程度である) 、 肺癌の 治療効果または予後改善効果を得ることが可能である。 実施例
以下に、 具体的な例をもって本発明を示すが、 本発明はこれに限られるもので はない。 また、 実施例中、 メナテトレノンを 「VK 2」 と称する場合がある。 実施例 1 : メナテトレノンによる肺癌細胞株の増殖抑制
本実施例では、 6 種の肺癌細胞株において、 メナテトレノンの増殖阻害効果を 試験した。
[細胞株]
急性白血病細胞株 (Acute Leukemia Cell Line) (HL-60) 、小細胞肺癌細胞株 (Small Cell) (LU-139、 LU-130) 、 肺扁平上皮癌細胞株(Squamous) (LC-AI、 LC-l/sq) 、 肺腺癌細胞株 (Adenocarcinoma) (PC-14、 CCL185) および大細胞肺癌細胞株 (Large Cell) (IA-LM)は、 American Type Culture Collection (Rockville, MD) より購入した。 細胞は、 10 % FCS (Hyclone, Logan, UT)、 2 mM L-glutamine, penicillin (50 U/mL), streptomycin ( 100 /ig/mL) を添加した RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY) (以下、 培養メディウムと称する場合がある)を用レ、て継続培養することにより維持した。 指数関数的に増殖している細胞を以下の実験に用いた。
[試薬および抗体]
メナテトレノンは、 エーザィ株式会社 (Tokyo, Japan) より購入した。 シスプラ チン (Cisplatin、 以下、 CDDPと称する場合がある) は、 日本化薬株式会社(Tokyo, Japan)より購入した。 PC5-conjugated AP02.7モノクロ一ナル抗体(mAb: clone 2.7, 以下、 AP02.7と称する場合がある) は、 アポトーシスが起こっている細胞に特異 的に発現する 7A6抗原に反応するものであり、 Immunotech (Marseille, France) よ り購入した。
[生細胞数の評価]
肺癌細胞株をさまざまな濃度 (0.1〜500 μ Μ) のメナテトレノンに 96時間さら した後、 培養した細胞を回収し、 フローサイ トメ トリーにより生細胞数を確認し た。 生細胞数は、 EPICS XL II (Beckman-Coulter Japan, Tokyo, Japan) を用いてフロ 一サイ トメ トリ一により分析した。
より具体的には、 LC-AI、 LC-l/sq、 PC-14、 CCL-185および IA-LMにおいては、 さまざまな濃度 (0.1〜500 ;u M) のメナテトレノンに 96時間さらした細胞および メナテトレノンにさらしていない細胞を、それぞれ室温で 5分から 10分の間トリ プシン- EDTA溶液 (GIBCO, Grand Island, NY) でインキュベートした。 次に、 当 該細胞を回収し、 回収した細胞を培養メディウムで 1回洗浄し、 完全な細胞懸濁 液を得るために、 当該細胞をプラスティックシリンジを用いて 23G注射針に 3回 通した。
LU-139および LU-130 においては、 さまざまな濃度 (0.1〜500 μ Μ) のメナテ トレノンに 96時間さらした細胞およびメナテトレノンにさらしていない細胞を、 それぞれ遠心により回収し、 室温で 5分間トリプシン- EDTA溶液 (GIBCO, Grand Island, NY) でインキュベートした。 完全な細胞懸濁液を得るために、 当該細胞を プラスティックシリンジを用いて 23G注射針に 3回通し、 PBSにより再懸濁した。
HL-60においては、 さまざまな濃度 (0.1〜500 μ Μ) のメナテトレノンに 96時 間さらした細胞およびメナテトレノンにさらしていない細胞を、 それぞれ遠心に より回収した。 完全な細胞懸濁液を得るために、 当該細胞をブラスティ ックシリ ンジを用いて 23G注射針に 3回通し、 PBSにより再懸濁した。
次に、当該細胞を、 30分間、 4 °Cにて、 1 % propiodium iodide (PI) (Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO) を含む溶液で染色した。
初めに、 各々の細胞株の生細胞を検出するためのサイ トグラムのグーティリン グエリアを、 PI染色陰性エリア (生細胞を示す) 並びに前方および側方散乱光密 度にしたがって設定した。 次に、 細胞を、 均一な細胞懸濁液を得るために静かに ピペッティングし、 フローサイ トメ トリーに導入した。 生細胞のためのゲーティ リングエリァ内の細胞数を、 各々の細胞株において 60秒間測定した。
結果を図 1に示す。 各グラフの縦軸は生細胞の相対数 (Relative Cell Number) (%) を、 横軸はメナテトレノン (V K 2 ) の濃度を表す。 メナテトレノンは、 HL-60と同様に用量依存的にすべての肺癌細胞株の細胞増殖を抑制した(図 1 )。 すべての細胞株において有意な増殖抑制がメナテトレノン処理により観察され、 IC50は、 7·5〜75 // Μであった。 実施例 2 : メナテトレノンによる肺癌細胞株のアポト一シス誘導
本実施例では、 肺癌細胞株における増殖抑制がアポトーシス誘導によるものか どうかを試験した。
細胞培養および懸濁液の調製は、 実施例 1 と同様に行った。 形態学的変化を観 察するために、 Shandon Cytospin 2 (Shandon Inc., Pittsburgh, PA) を細胞懸濁液に使 用し、 定法によりプレパラー トの細胞 (prepared cells) を May-Giemsa 染色 (May-Giemsa s ining)した。 細胞は、 LU-139 (小細胞肺癌細胞株: Small Cell) 、 LC-AI (肺扁平上皮癌細胞株 : Squamous ) および PC-14 (肺腺癌細胞株 : Adenocarcinoma) を レヽた。
図 2上段のパネルは対照細胞株 (Control) を、 下段のパネルはメナテトレノン処 理細胞株 (VK2 (+))を示す。 メナテトレノンに 96時間さらした(96 hr exposure)各々 の細胞株 (LU-139および LC-AIは 10 μ M、 PC-14は 50 Mのメナテトレノン) は、 アポトーシスを誘発している細胞に典型的な形態学的変化 (例えばアポト一 シス小体の形成、 核の断片化等) を示した (図 2 ) 。
アポトーシスを誘発している細胞の百分率を評価するために、 AP02.7を用いて フローサイ トメ トリーにより解析した。
カスパーゼ 3活性 (Caspase-3 Activity) は、 PhiPhiLux-G6D2を含む基質試薬キ ッ ト (Oncolmmunin, College Park, MD) を用いてフローサイ トメ トリーによって 評価した。 メナテトレノン処理後、 細胞を、 PBSで洗浄し、 37°C、 60分間、 基質 試薬とインキュベートした。 カスパーゼ 3活性は、 蛍光を FL2チャンネル (励起 波長 488 nm) にてフローサイ トメ トリーを用いて分析することにより測定した。 細胞は、 LU-139 (小細胞肺癌細胞株: Small Cell) および LC-AI (肺扁平上皮癌細 胞株: Squamous Cell) を用いた。
図 3の上段の各グラフは対照細胞群 (Control) の結果を、 また下段の各グラフ はメナテトレノン処理細胞群 (V K 2 ) の結果を示す。 各グラフの縦軸は生細胞 の相対数 (Relative Cell Number) ( % ) を表す。 「afa」 は、 自家蛍光強度 (auto-fluorescence activity) を意味し、 図中の0 /oで表した数字は、 AP02.7または カスパーゼ 3 (カスペ一ス - 3 ) 活性陽性細胞の百分率を意味する。 Ι Ο μ Μのメナ テトレノンに 96時間さらした各々の細胞株 (LU-139および LC-AI) では、 有意 に ΑΡ02.7 に染色された細胞数およびカスパーゼ 3活性が増加した (図 3 ) 。 よ つて、 メナテトレノンは、 肺癌細胞株において、 アポトーシスを誘導することが 確認された。 実施例 3 : メナテトレノンによる肺癌細胞株の G0/G1 arrest (停止) 本実施例では、 LU-139および HL-60を、 メナテトレノン (V K 2 ) に 72時間 さらした後、 細胞周期を評価した。
細胞培養および懸濁液の調製は、 実施例 1 と同様に行った。 次に、 細胞を固定 し、 1 % PI、 100 μ g/mL digitonin, 0.01% NaN3、 200 mg/mL RNase (Sigma) および 2.5 % FCSを含む溶液にて室温、 10分間ィンキュベートすることにより染色した。 細胞は、 細胞周期分析プログラム MultiCycle AV (Phoenix Flow Systems Inc, San Diego, CA) を用いてフローサイ トメ トリーにより分析した。
その結果、 LU-139において、 HL-60と同様にメナテトレノンは、 有意に G0/G1 期における細胞集団を増加させた (図 4、 小ドッ ト) 。 よって、 メナテトレノン は、 肺癌細胞株において、 G0/G1 arrest (停止) を引き起こすことが確認された。
メナテトレノンによって処理された細胞の G0/G1期における LU-139の蓄積比 率が、 HL-60の蓄積比率よりも少ないのは、おそらく LU-139の倍加期間が HL-60 の倍加期間よりも長いことによると思われる (LU-139 は 96時間であり、 HL-60 は 24時間である) 。 実施例 4 : LU-139におけるメナテトレノンおよび CDDPの併用効果 本実施例では、 LU-139 におけるメナテトレノンおよび CDDPの併用効果を評 価した。
LU-139を初めに 0、 5または ΙΟ μ Μの CDDPに 2時間さらし、 次に、 当該細胞 をさらに 0、 5または 10 Mのメナテトレノン(V K 2 )に 96時間さらした(96hr treatment) 。 細胞培養、 懸濁液の調製および生細胞数の測定は、 実施例 1 と同様 に行った。
結果を図 5に示す。 図 5のグラフの縦軸は生細胞の相対数 (Relative Cell Number) %を示す。
初めに CDDPにさらしていない細胞では、 5 μ Mのメナテトレノン処理は、 処 理していない細胞と比べいかなる効果も示さなかった(図 5中、 CDDP O M群)。 しかしながら、一度 CDDPにさらした細胞では、 のメナテトレノン処理は、 CDDP単独処理と比べ、有意な増殖阻害を示した(図 5中、 CDDP 5、 Ι Ο μ Μ群)。 図 5中、 「a」 は、 p<0.05, 無処理 (対象) vs VK2単独を、 「b」 は、 p<0.05, CDDP 単独 vs VK2 + CDDPを、 「c」 は、 p<0.05, VK2単独 vs VK2 + CDDPをそれぞれ 意味する。 実施例 5
本実施例では、 以下の肺癌患者に対してメナテトレノンの投与試験を行った。
[症例] 8 4歳 男性
[診断] 原発性肺癌 (低分化型腺癌、 ステージ I I b、 T 3 N 0 N 0 ) 、 慢性肺 気腫を合併
[現病歴] 2 0 0 0年 1 1月 2 4 日 血痰を主訴に呼吸器内科にて受診した。 胸
部レントゲン写真上、 左中下肺野に 5 X 4 c m大の腫瘤性病変を認め、 胸部 C T でも右 S 8に 6 X 5 c m大の腫瘤性病変が観察された。経気管支肺生検を施行し、 病理組織診断により低分化型腺癌と診断された。
2 0 0 2年 9月より、 メナテトレノン (商品名ダラケ一:エーザィ株式会社製) 4 5 m g Z日の経口投与を開始した。 開始当初は、 メナテトレノンによる明らか な効果は観察されなかったが、 2 0 0 2年 1 1月には気管支の腫瘤による閉塞に より生じていた右下葉無気肺の改善を認めた。 また、 非小細胞肺癌の腫瘍マーカ 一である C Y F R A 2 1— 1 (正常値 3.5 ng/mL以下) が 36.6 ng/mLまで上昇し ていたが、 2 0 0 3年 8月には 16.1 ng/mLまで低下していた (図 6 ) 。 その間、 胸部レントゲン写真上、 腫瘤陰影の増大傾向も認めず、 メナテトレノン投与開始 後 1 4力月を経過した時点でも極めて良好な performance statusを維持していた。 また、 メナテトレノン投与による副作用は観察されなかった。
胸部レントゲン写真上、 腫瘤陰影の増大抑制が認められるとともに、 腫瘍マー カーの一つである C Y F R A 2 1— 1の低下が認められ、 かつ、 肺癌診断後 3年 以上を経過した後においても極めて良好な生活の質を維持している。 また、 通常 の抗癌剤投与時に出現する嘔吐、 骨髄抑制等の副作用も観察されなかった。 以上 を総合的に判断すると、 メナテトレノンは、 肺癌治療において極めて有効である ことが示された。 産業上の利用の可能性
本発明により、 肺癌患者に対するビタミン K 2、 好ましくはメナテトレノン、 またはその水和物の治療剤および予後改善剤としての有効性が確認され、 肺癌患 者の治療が可能となった。
また、 本発明により、 肺癌患者に対するビタミン K 2、 好ましくはメナテトレ ノン、 またはその水和物の治療剤および予後改善剤としての有効性に加え、 メナ テトレノンが長期間投与しても極めて高い安全性が期待できることから、 長期間 治療を続けることにより、 肺癌患者の生活の質を大きく改善することが可能とな つた。 .