WO2005073385A1 - 遺伝子導入効率を上昇させるための組成物および方法 - Google Patents

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WO2005073385A1
WO2005073385A1 PCT/JP2005/001148 JP2005001148W WO2005073385A1 WO 2005073385 A1 WO2005073385 A1 WO 2005073385A1 JP 2005001148 W JP2005001148 W JP 2005001148W WO 2005073385 A1 WO2005073385 A1 WO 2005073385A1
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cell adhesion
cells
cell
antibody
target substance
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PCT/JP2005/001148
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Masato Miyake
Tomohiro Yoshikawa
Eiichiro Uchimura
Jun Miyake
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National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Cytopathfinder, Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2842—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta1-subunit-containing molecules, e.g. CD29, CD49

Definitions

  • compositions and methods for increasing gene transfer efficiency are provided.
  • the present invention relates to the field of cell biology. More specifically, the present invention relates to compounds, compositions, devices, methods and systems that increase the efficiency of introducing substances into cells. Background art
  • Transfusion is a technique used to transiently express a gene in cells such as animal cells and observe the effects thereof. It is a technique that is frequently used to elucidate the functions of the genes that it encodes.
  • the present invention provides a target substance (for example, DNA, polypeptide, sugar, or a complex thereof) that is conventionally difficult to be introduced into cells by diffusion or hydrophobic interaction.
  • the task is to develop a method that can improve the efficiency of introduction (in particular, transfer excursion) in any situation.
  • the present invention provides the following inventions.
  • a composition containing a cell adhesion-related factor for increasing the efficiency of introducing a target substance into cells (1) A composition containing a cell adhesion-related factor for increasing the efficiency of introducing a target substance into cells.
  • composition for increasing the efficiency of introducing a target substance into a cell wherein the cell adhesion-related factor includes an interacting substance that interacts with a cell adhesion molecule.
  • composition according to item 2 wherein the cell adhesion molecule is an extracellular matrix.
  • composition according to item 2 wherein the cell adhesion molecule contains an integrin receptor.
  • composition according to item 2 wherein the cell adhesion molecule contains an integrin.
  • composition according to item 1 wherein the interacting substance reacts with the partner of the cell adhesion molecule through an antigen-antibody reaction.
  • composition according to item 1 wherein the interacting substance is an antibody or a derivative thereof.
  • composition according to item 1 wherein the interacting substance is a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • composition according to item 1, wherein the interacting substance comprises an antibody selected from the group consisting of an anti-CD49a antibody, an anti-CD49b antibody, an anti-CD49c antibody, an anti-CD49e antibody and an anti-CD49f antibody.
  • composition according to item 1 wherein the target substance includes a nucleic acid molecule.
  • composition according to item 4 wherein the integrin receptor is selected from the group consisting of CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, and CD29.
  • composition according to item 4 wherein the integrin receptor is selected from the group consisting of CD29, CD49a, CD49c, CD49d, CD49e and CD49f.
  • composition according to item 4 wherein the integrin receptor interacts with a molecule selected from the group consisting of collagen, fibronectin, vitronectin and laminin.
  • composition according to item 1 wherein the cells include at least one cell selected from the group consisting of a stem cell and a differentiated cell.
  • composition according to item 1 wherein the cell adhesion molecule is specifically expressed in the cell.
  • composition according to item 1 wherein the target substance is a genetic substance and further contains a gene introduction reagent.
  • composition according to item 18, wherein the gene introduction reagent is selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, and calcium phosphate.
  • composition according to item 1 further comprising particles.
  • composition according to item 20 wherein the particles include a gold colloid.
  • composition according to item 1 The composition according to item 1, further comprising a salt.
  • composition according to item 22 wherein the salt is selected from the group consisting of salts contained in a buffer and salts contained in a medium.
  • a kit comprising:
  • a composition comprising:
  • composition according to item 25 wherein the target substance includes a substance selected from the group consisting of DNA, RNA, polypeptide, sugar, and a complex thereof.
  • composition according to item 25 wherein the target substance contains DNA encoding a gene sequence to be transfused.
  • composition according to item 25 further comprising a gene introduction reagent.
  • composition according to item 25 wherein the cell adhesion-related factor includes an interacting substance that interacts with a cell adhesion molecule.
  • composition according to item 25 wherein the cell adhesion-related factor includes an antibody of a cell adhesion molecule.
  • composition according to item 25 which is present as a solid phase.
  • the cell adhesion-related factor is fixed to a support.
  • the target substance includes a substance selected from the group consisting of DNA, RNA, polypeptide, sugar, and a complex thereof.
  • the support is selected from the group consisting of a plate, a microwell plate, a chip, a slide glass, a film, a bead, and a metal.
  • the coating agent includes a substance selected from the group consisting of poly-L-lysine, silane, MAS, hydrophobic fluororesin, and metal.
  • the target substance includes a substance selected from the group consisting of DNA, RNA, polypeptide, sugar, and a complex thereof.
  • cell adhesion-related factor includes an interacting substance that interacts with a cell adhesion molecule.
  • cell adhesion-related factor includes a cell adhesion molecule antibody.
  • a method comprising:
  • transfusion efficiency increasing reagent is particularly useful for carrying out a transfusion in a solid phase.
  • FIG. 1 shows the relationship between integrin receptors and recognized extracellular matrices.
  • FIG. 2A shows various cell adhesion-related factors and 5 shows the results of transfection efficiency using fibronectin.
  • FIG. 2B shows the results of transfection efficiency using another cell adhesion-related factor in an experiment using HepG2 cells.
  • Figure 3A shows the relationship between various integrin receptors (CD49a, d, f) expressed on HepG2 cells and the extracellular matrix recognized in Example 3, and the transfection on the surface coated with each extracellular matrix. Shows the exciton efficiency.
  • Fig. 3B is a cell photograph showing a state of transfection in an experiment using HepG2. Uncoated is a control without coating,
  • FIG. 3C is a cell photograph showing a state of transfection in an experiment using HepG2. CD44, CD46 and CD54 are shown.
  • Fig. 3D is a cell photograph showing a state of transfection in an experiment using HepG2. CD49a, CD49c and CD49d are shown.
  • FIG. 3E is a cell photograph showing a state of transfection in an experiment using HepG2. CD49e, CD49f and HLA are shown.
  • Fig. 4 shows the relationship between various integrin receptors (CD49a, d, f) expressed on PC12 cells and the extracellular matrix recognized in Example 4, and the transfection on the surface coated with each extracellular matrix. Shows the exciton efficiency.
  • FIG. 5A and 5B show the state of cell adhesion of PC12 cells in Example 4.
  • 3 shows the inhibition of PC12 cell adhesion to the TypelV collagen-coated surface using cell adhesion-related factors (eg, CD antibody) and transfection.
  • TypelV collagen coated on poly-L-lysine coated slide glass Thereafter, PC12 cells that had been brought into contact with the antibody solution in advance were seeded, and transfection was performed using Lipofectamin2000 according to a normal (liquid phase) protocol.
  • Figure 5A shows that anti-CD49a markedly inhibited the adhesion of PC12 cells to the TypelV collagen-coated surface.
  • FIG. 5B also shows the difference in transfection efficiency in the presence of anti-CD49f. The displayed values indicate how many times the antibody stock solution was diluted and brought into contact with PC12 cells in advance.
  • FIG. 5B shows the state of cell adhesion of PC12 cells in Example 4.
  • 3 shows the inhibition of PC12 cell adhesion to the TypelV collagen-coated surface and the transfection using a cell adhesion-related factor (eg, a CD antibody).
  • a cell adhesion-related factor eg, a CD antibody
  • TypelV collagen coating on poly-L-lysine coated slide glass Thereafter, PC12 cells that had been brought into contact with the antibody solution in advance were seeded, and transfection was performed using Lipofectamin2000 according to a normal (liquid phase) protocol.
  • Figure 5A shows that anti-CD49a markedly inhibited the adhesion of PC12 cells to the TypelV collagen-coated surface. Anti-CD49d does not inhibit the adhesion of PC12 cells and shows the same transfection efficiency as Control without antibody.
  • FIG. 5B also shows the difference in transfection efficiency in the presence of anti-CD49f. The displayed values indicate how many times the antibody stock solution was diluted and brought into contact with PC12 cells in advance.
  • FIG. 6 shows the transfusion effect of the coating on the support of PC12 cells in Example 4. The test was performed using an anti-CD49a antibody, an anti-CD49c antibody, and an anti-CD49d antibody.
  • FIG. 7 shows the transfection effect of the coating on the support of PC12 cells in Example 4. The test was performed using an anti-CD49e antibody, an anti-CD49f antibody, and an anti-HLA antibody.
  • FIG. 8 shows an outline of a solid-phase transfection using a cell adhesion-related factor.
  • the lower right is the same as Fig. 1.
  • the upper right shows the results of fluorescence intensity distribution using three types of anti-CD antibodies.
  • On the left the relative transfer efficiency index is shown.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleic acid sequence of fibronectin (human)
  • SEQ ID NO: 2 Fibronectin amino acid sequence (human)
  • SEQ ID NO 3 Amino acid sequence of CD29 (preform of isoform 1A)
  • SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence of CD49a
  • SEQ ID NO: 5 Amino acid sequence of CD49b
  • SEQ ID NO: 6 Amino acid sequence of CD49c (isoform a precursor)
  • SEQ ID NO: 7 Amino acid sequence of CD49d (precursor)
  • SEQ ID NO: 8 Amino acid sequence of CD49e (precursor)
  • SEQ ID NO: 9 Amino acid sequence of CD49f
  • SEQ ID NO: 10 Amino acid sequence of CD29 (preform isoform 1B)
  • SEQ ID NO: 11 Amino acid sequence of CD29 (preform of isoform 1C-1)
  • SEQ ID NO: 12 Amino acid sequence of CD29 (preform of isoform 1C-2)
  • SEQ ID NO: 13 Amino acid sequence of CD29 (isoform 1D precursor)
  • SEQ ID NO: 14 Amino acid sequence of CD49c (isoform b precursor)
  • cell adhesion molecule or “adhesion molecule” is used interchangeably, and means that two or more cells approach each other (cell adhesion) or a substrate and a cell Refers to molecules that mediate adhesion between In general, a cell-cell adhesion (intercellular adhesion) on the molecular (ce ll_ ce ll adhesion molecule) , adhesion between a cell and an extracellular matrix - molecules involved in (cell substrate adhesion) (cell- substrate adhesion molecul e ). Cells usually contain such cell adhesion molecules. Therefore, in this specification, cell adhesion molecules include proteins on the substrate side during cell-substrate adhesion.
  • a cell-side protein for example, an integrin receptor
  • a cell-side protein for example, an integrin receptor
  • a molecule other than a protein mediates cell adhesion
  • the concept of the cell adhesion molecule or the adhesion molecule in the present specification is used. to go into.
  • cadherin many molecules belonging to the immunoglobulin superfamily (NCAM, Ll, ICAM, facyclin II, III, etc.), selectins and the like are known, and cell membranes are formed by unique molecular reactions. It is also known to combine
  • Whether a molecule is a cell adhesion molecule can be determined by biochemical quantification (SDS-PAG method, labeled collagen method), immunological quantification (enzyme antibody method, fluorescent antibody method, immunohistological examination), By determining that a positive result is obtained in an assay such as the PCR method or the hybridization method, the semi-IJ can be determined.
  • Such cell adhesion molecules include collagen, integrins, fibronectin, laminin, vitronectin, fibrinogen, the immunoglobulin parfamily (eg, CD2, CD4, CD8, ICM1, ICAM2, VCAM1), selectin, cadherin, CD29. , CD49 family and the like. Many of such cell adhesion molecules transmit an auxiliary signal for cell activation by cell-cell interaction into the cell simultaneously with cell adhesion.
  • cell adhesion molecules for example, cadherin is widely known as a cell adhesion molecule in tissue-fixing cell lines.
  • cell adhesion molecules include, for example, immunoglobulin superfamily molecules (CD2, LFA_3, ICAM_1, CD2, CD4, CD8, ICM1, ICAM2, VCAM1, etc.) Integrin family molecules (LFA-1, Mac-1, gpllbllla, pl50, 95, VLA1, VLA2, VLA3, VLA4, VLA5, VLA6, etc.); selectin family molecules (L-selectin, E-selectin, P-selectin, etc.) ); CD29, CD49 family (CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, etc.), and the like, but are not limited thereto. Therefore, such minutes Offspring can be particularly useful for treating tissues or organs of the blood-immune system.
  • Cell adhesion molecules are required for fixing non-fixed cells. In this case, it is thought that the adhesion between cells is gradually strengthened by the primary adhesion by a constantly expressed selectin molecule and the like, followed by the secondary adhesion of an activated intedarin molecule and the like.
  • cell adhesion molecules contemplated in the present invention may include such factors that mediate primary adhesion, factors that mediate secondary adhesion, or both, with secondary adhesion being preferred. It seems.
  • the cell adhesion molecule is a protein, its active site has been elucidated at the amino acid level, and RGD, YIGSR, etc. are known (these are also collectively referred to as the RGD sequence).
  • cell adhesion-related factor refers to a factor that suppresses the activity of a cell to adhere to another substance (eg, a support, another cell, or the like).
  • factors include, but are not limited to, interactors that interact with cell adhesion molecules.
  • Such an interacting substance is confirmed to have an adhesion inhibitory effect due to the coexistence of the interacting substance when cells are seeded on a surface coated with an ECM substrate such as fibronectin.
  • an increase in the adhesion of cells to the surface is confirmed.
  • the interacting substance examples include a substance that interacts with a competitor in an allosteric manner, a partner in an antigen-antibody reaction (an antibody in the case of an antigen, an antigen in the case of an antibody), and a partner having a receptor-one ligand relationship (such as a receptor)
  • a partner in an antigen-antibody reaction an antibody in the case of an antigen, an antigen in the case of an antibody
  • a partner having a receptor-one ligand relationship such as a receptor
  • RGD molecule refers to a protein molecule containing the amino acid sequence RGD (Arg-Gly-Asp) or a functionally identical sequence thereof.
  • the RGD molecule is characterized by containing RGD, which is an amino acid sequence useful as the amino acid sequence of the cell adhesion active site of the cell adhesion protein, or another functionally equivalent amino acid sequence.
  • RGD sequence was discovered as a cell adhesion site in fibular mouth nectin, and subsequently, many cell adhesion properties such as type I collagen, laminin, vitronectin, fibrinogen, von Willebrand factor, and entactin.
  • the biomolecule in the present invention may be a chemically synthesized RGD molecule.
  • RGD molecules include, but are not limited to, the GRGDSP peptide, for example, in addition to the naturally occurring molecules described above. Since the RGD sequence is recognized by integrin (eg, CD49 family, CD29, etc.), which is a cell attachment molecule (and also a receptor), a functionally equivalent molecule of RGD would recognize such an integrin. Can be identified by examining the interaction.
  • integrin or "integrin receptor” is used interchangeably and refers to a transmembrane glycoprotein that is a receptor involved in cell adhesion. Integrins are present on the cell surface and function when cells adhere to the extracellular matrix. It is known that blood cells and the like are also involved in adhesion between cells. Such integrins include, for example, receptors such as fibronectin, vitronectin, and collagen, lib / Ilia of platelets, Mac-1 of macrophages, LFA-1 of lymphocytes, VLA-16, PSA of Drosophila. And the like, but are not limited thereto.
  • Integrin usually takes the form of a heterodimer in which a ⁇ -chain with a molecular weight of 130 kDa-210 kDa and a chain with a molecular weight of 95 kDa-130 kDa are covalently and one-to-one associated with each other.
  • the ⁇ chain is not limited to a powerful force S such as ⁇ , ⁇ 2, ⁇ 3, ⁇ 4, ⁇ 5, ⁇ 6, ct L, ⁇ , ⁇ , allb, aV, ⁇ . .
  • Examples of the chain include, but are not limited to, 1, ⁇ 2, ⁇ 3, 4, ⁇ 5, ⁇ 6, 7, and the like.
  • heterodimers examples include, for example, VLA-1, VLA-2, VLA-3, VLA-4, VLA-5, VLA-6, CD51 / CD29, CD49 Family, LFA-1, Mac-1, pl 50, 90, vitronectin receptor, / 34 subfamily, j35 subfamily, ⁇ 6 subfamily, LPAM_1, HML-1, and the like.
  • the extracellular domain of the heavy chain has a divalent cation binding site
  • the extracellular domain of the / 3 chain has a cysteine-rich region
  • the intracellular domain of the ⁇ chain often has a tyrosine phosphorylation site.
  • the recognition site in the binding ligand is often an RGD sequence.
  • integrins may be RGD molecules.
  • extracellular matrix protein refers to a protein in the "extracellular matrix”. It refers to what is Parkaceous.
  • extracellular matrix ECM
  • ECM extracellular matrix
  • somatic cell somatic cell
  • the extracellular matrix is involved in the organization of the internal environment necessary for the survival of all somatic cells, not just for tissue support. Extracellular matrices are generally produced from connective tissue cells, but are also partially secreted by the cells themselves that carry the basement membrane, such as epithelial or endothelial cells.
  • the extracellular matrix is generally divided into a fibrous component and a matrix filling the fibrous component.
  • the fibrous component includes collagen fibers and elastic fibers.
  • the basic constituent of the substrate is glycosaminodalican (acid mucopolysaccharide), most of which binds to non-collagenous proteins to form macromolecules of proteodalican (acid mucopolysaccharide-protein complex).
  • substrates include laminin in the basal membrane, microfibril fibers around the elastic fibers, and fibronectin on the cell surface.
  • the basic structure is the same in specially differentiated tissues.
  • chondroblasts produce characteristically large amounts of cartilage matrix containing proteoglycan in hyaline cartilage
  • osteoblasts produce bone matrix in bone that causes calcification. Is done. Therefore, examples of the extracellular matrix used in the present invention include, but are not limited to, collagen, elastin, proteoglycan, glycosaminoglycan, fibronectin, vitronectin, laminin, elastic fiber, collagen fiber and the like.
  • examples of the extracellular matrix protein include, but are not limited to, fibronectin, vitronectin, laminin and the like.
  • any extracellular matrix protein may be considered as long as it is a factor related to cell adhesion.
  • CD49a is integrin heavy chain subunit 1 (amino acid sequence is SEQ ID NO: 4)
  • CD49b is integrin heavy chain subunit 2 (amino acid sequence is SEQ ID NO: 5)
  • CD49c is Is the integrin heavy chain subunit HI3 (amino acid sequence 1J is SEQ ID NO: 6 and 14)
  • CD49d is the integrin heavy chain subunit a4 (amino acid sequence is SEQ ID NO: 7).
  • CD49e is integrin heavy chain subunit 5 (amino acid sequence is SEQ ID NO: 8), and CD49f is integrin heavy chain subunit (Amino acid sequence is SEQ ID NO: 9), and CD29 is integrin ⁇ -subunit i31 (amino acid sequence is SEQ ID NO: 3, 10, 11, 12, and 13).
  • CD44 is a cell surface hyaluronan binding protein
  • CD46 is a cell adhesion factor called membrane cofactor protein (MCP)
  • CD54 is a cell-indirect adhesion molecule ICAM-1 that binds cells.
  • HLA refers to the product of the major histocompatibility complex (HLA gene) complex.
  • biomolecule refers to a molecule associated with a living body.
  • the term “living body” refers to a biological organism, including, but not limited to, animals, plants, fungi, and vinoles. Therefore, in the present specification, the biomolecule includes, but is not limited to, a molecule that can be extracted from a living body. Therefore, molecules synthesized by combinatorial chemistry and small molecules that can be used as pharmaceuticals (eg, small molecule ligands) also fall within the definition of biomolecules as long as their effects on living organisms can be intended.
  • biomolecules include proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (eg, including DNA such as cDNA, genomic DNA, and RNA such as mRNA), polypeptides, and the like. Includes saccharides, oligosaccharides, lipids, small molecules (eg, hormones, ligands, signal transducers, small organic molecules, etc.), and their complex molecules (glycolipids, glycoproteins, lipoproteins, etc.). Not limited to them. Biomolecules can also include the cells themselves, as well as parts of tissues, as long as introduction into the cells is contemplated.
  • the biomolecules include nucleic acids (DNA or RNA) or proteins.
  • the biomolecule is a nucleic acid (eg, genomic DNA or cDNA, or DNA synthesized by PCR or the like).
  • the biomolecule can be a protein.
  • "genetic material” refers to any material that carries genetic information. Examples of such a substance include, but are not limited to, nucleic acids such as DNA and RNA, PNA, proteins and the like.
  • the DNA can be in any form, such as cDNA, genomic DNA, artificial DNA, RNAi, and the like.
  • the RNA may be mRNA, tRNA, rRNA, RNAi, or the like.
  • protein As used herein, the terms "protein,” “polypeptide,” “oligopeptide,” and “peptide” are used interchangeably herein and refer to a polymer of amino acids of any length. .
  • This polymer may be linear or branched or cyclic.
  • the amino acid may be a natural or non-natural amino acid or a modified amino acid.
  • the term may also include those assembled into a complex of multiple polypeptide chains.
  • the term also includes natural or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, dalycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component).
  • This definition also includes, for example, polypeptides containing one or more analogs of an amino acid (eg, including unnatural amino acids, etc.), peptidomimetic compounds (eg, peptoids), and other modifications known in the art. Is included. Gene products of extracellular matrix proteins such as fibronectin usually take the form of polypeptides.
  • polynucleotide As used herein, the terms “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” are used interchangeably herein, and refer to a polymer of nucleotides of any length. The term also includes “derivative oligonucleotides” or “derivative polynucleotides.” The term “derivative oligonucleotide” or “derivative polynucleotide” refers to an oligonucleotide or polynucleotide containing a derivative of a nucleotide or having an unusual linkage between nucleotides, and is used interchangeably.
  • oligonucleotide examples include, for example, 2,1-O-methyl-ribonucleotide, a derivative in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and an oligonucleotide in a oligonucleotide.
  • oligonucleotide in which phosphodiester bond is converted to N3'_P5, phosphoramidate bond, ribose and oligonucleotide in oligonucleotide Derivative oligonucleotide in which diester bond is converted to peptide nucleic acid bond, Derivative in which peracyl in oligonucleotide is substituted with C_5 propierperacyl, Derivative in which peracyl in oligonucleotide is substituted with C_5 thiazole peracyl Oligonucleotides, derivatives in which cytosine in the oligonucleotide is replaced with C-5 propynylcytosine Oligonucleotides, derivatives in which cytosine in the oligonucleotide is replaced with phenoxazine-modified cytosine, DNA Derivative oligonucleotides in which the ribose in the amino acid is substitute
  • a particular nucleic acid sequence also includes conservatively modified variants (eg, degenerate codon substitutions) and complementary sequences thereof, as well as explicitly stated sequences. Is contemplated. Specifically, degenerate codon substitutions create a sequence in which the third position of one or more selected but not all codons has been replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue. (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91. —98 (1994)). Genes such as extracellular matrix proteins such as fibronectin usually take this polynucleotide form. The molecule to be subjected to transfection is also this polynucleotide.
  • nucleic acid molecule is also used interchangeably with nucleic acids, oligonucleotides, and polynucleotides, and includes cDNA, mRNA, genomic DNA, and the like.
  • nucleic acids and nucleic acid molecules may be included in the concept of the term “gene”.
  • a nucleic acid molecule encoding a gene sequence also includes "splice variants (variants).”
  • a particular protein encoded by a nucleic acid includes any protein encoded by a splice variant of the nucleic acid.
  • splice variants are the products of onoretanative splicing of a gene.
  • an initial nucleic acid transcript can be spliced such that different (alternate) nucleic acid splice products encode different polypeptides.
  • the mechanism of splice variant production involves alternative splicing of variable force exons.
  • Another polypeptide derived from the same nucleic acid by read-through transcription It is also included in this definition. Any product of a splicing reaction, including recombinant forms of the splice product, is included in this definition.
  • extracellular matrix proteins useful as cell adhesion-related factors may also include splice variants thereof.
  • gene refers to a factor that defines a genetic trait. Usually they are arranged in a certain order on the chromosome. Those that define the primary structure of a protein are called structural genes, and those that control its expression are called regulatory genes (eg, promoters). As used herein, a gene includes a structural gene and a regulatory gene unless otherwise specified. Therefore, a fibronectin gene usually includes both a fibronectin structural gene and a fibronectin promoter. In this specification,
  • Gene may refer to “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” and / or “protein”, “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide”
  • gene product also refers to “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” and / or “protein”, “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide” expressed by a gene. ". Those skilled in the art can understand what a gene product is, depending on the situation.
  • the term “homology” of a sequence refers to the degree of identity between two or more gene sequences. Therefore, the higher the homology between certain two genes, the higher the identity or similarity between their sequences. Whether the two genes have homology can be determined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, the hybridization method under stringent conditions.
  • the DNA sequences between the gene sequences are typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, more preferably at least 80%, 90% , 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical, the genes are homologous.
  • similarity refers to two or more gene sequences when conservative substitutions are regarded as positive (identical) in the homology described above. , The degree of identity to each other. Thus, if there are conservative substitutions, identity and similarity will vary depending on the presence of the conservative substitution. When there is no conservative substitution, identity and similarity show the same numerical value.
  • the comparison of the similarity, identity and homology between the amino acid sequence and the base sequence is calculated using FASTA, a sequence analysis tool, using default parameters.
  • amino acid may be natural or non-natural as long as the object of the present invention is satisfied.
  • “Derivative amino acids” or “amino acid analogs” are those that differ from naturally occurring amino acids but have the same function as the original amino acid. Such derived amino acids and amino acid analogs are well-known in the art.
  • the term "natural amino acid” refers to the L-isomer of a natural amino acid.
  • Natural amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, methionine, threonine, pheninolealanine, tyrosine, tryptophan, cysteine, proline, histidine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, ⁇ —carboxyglutamic acid, Arginine, ordinine, and lysine. Unless otherwise indicated, all amino acids referred to herein are L-forms, but forms using D-form amino acids are also within the scope of the present invention.
  • the term “unnatural amino acid” refers to an amino acid not normally found in nature in proteins.
  • Examples of unnatural amino acids include D- or L-forms of norleucine, para-nitrophenylalanine, homophenylalanine, para-fluorophenylalanine, 3-amino-2-benzylpropionic acid, homoarginine, and D-phenylalanine.
  • Amino acid analog refers to a molecule that is not an amino acid, but that is similar in physical properties and / or function to the amino acid.
  • Amino acid analogs include, for example, etyonin, canavanine, 2-methyldaltamine and the like.
  • Amino acid mimetics refers to compounds that have a structure that is different from the general chemical structure of an amino acid, but that functions in a manner similar to a naturally occurring amino acid.
  • amino acids may be referred to herein by either their commonly known three letter symbols or by the one-letter symbols recommended by the IUPAC- IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotides may also be referred to by the generally recognized one-letter code.
  • corresponding amino acid refers to a given amino acid in a protein or polypeptide as a reference for comparison in a certain protein molecule or polypeptide molecule. Refers to amino acids that have the same action as, or are predicted to have, the same effect as amino acids. Say. For example, if it is a binding site of the integrin used in the present invention, it may be a similar site (domain) in the onoresolog corresponding to the binding site of the molecule.
  • nucleotide may be natural or non-natural.
  • “Derivative nucleotides” or “nucleotide analogs” are those that are different from naturally occurring nucleotides, but that have the same function as the original nucleotides. Such derivative nucleotides and nucleotide analogs are well known in the art. Examples of such derivative nucleotides and nucleotide analogs include, but are not limited to, phosphorothioate, phosphonoreamidate, methylphosphonate, chiral methylphosphonate, 2-0-methylribonucleotide, peptide mononucleic acid (PNA). Not done.
  • fragment refers to a polypeptide or a polynucleotide having a sequence length of up to 11-1 relative to a full-length polypeptide or polynucleotide (length is n). Polynucleotide.
  • the length of the fragment can be appropriately changed depending on the purpose.For example, the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 for a polypeptide. , 15,20,25,30,40,50 and more amino acids, and the lengths represented by specifically listed non-integer integers (eg, 11 and the like) are also lower limits. As appropriate.
  • a length represented by a non-integer integer (eg, 11, etc.) may also be appropriate as a lower limit.
  • the lengths of the polypeptide and the polynucleotide can be represented by the number of amino acids or nucleic acids, respectively, as described above. However, the above-mentioned numbers are not absolute, as long as they have the same function. The above number as an upper limit or adjustment is intended to include a few above and below (or, for example, 10% above and below).
  • fragments have a certain size (for example, 5 kDa) or more. It is preferable. Without being bound by theory, it appears that some size is required to function as a cell adhesion-related factor.
  • polynucleotide that hybridizes under stringent conditions refers to well-known conditions commonly used in the art. Using a polynucleotide selected from the polynucleotides of the present invention as a probe, a colony'no, hybridization method, a plaque'hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like is used. Thus, such a polynucleotide can be obtained.
  • sequences containing only the A sequence or only the T sequence are preferably excluded from the sequences that hybridize under stringent conditions.
  • polynucleotide that can be hybridized refers to a polynucleotide that can hybridize to another polynucleotide under the above hybridization conditions.
  • the hybridizable polynucleotide is a polynucleotide having at least 60% or more homology with the nucleotide sequence of the DNA encoding the polypeptide having the amino acid sequence specifically shown in the present invention, preferably 80% Polynucleotides having the above homology, more preferably polynucleotides having a homology of 95% or more can be mentioned.
  • RNAi is an abbreviation for RNA interference.
  • Homologous mRNA is specifically expressed by introducing a factor that causes RNAi such as double-stranded RNA (also referred to as dsRNA) into cells.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • RNAi may also be used synonymously with factors that cause RNAi in some cases.
  • factor causing RNAi refers to any factor capable of causing RNAi.
  • RNAi RNAi related to the gene and achieves the effect of RNAi (for example, suppression of expression of the gene).
  • Means Factors that cause such RNAi include, for example, at least 10%, including sequences that have at least about 70% homology to a portion of the nucleic acid sequence of the target gene or that hybridize under stringent conditions. Examples include, but are not limited to, RNAs containing nucleotide-length double-stranded portions or variants thereof.
  • the factor preferably includes a 3′-protruding end, and more preferably, the 3′-protruding end may be a DNA having a length of 2 nucleotides or more (eg, a DNA having a length of 24 nucleotides).
  • RNAi when a molecule that causes RNAi, such as dsRNA, is introduced into a cell, it is relatively long (eg, 40 base pairs or more).
  • dsRNA an R Naselll-like nuclease called Dicer with a helicase domain cuts out the molecule from the 3 'end by about 20 base pairs in the presence of ATP, producing short dsRNA (also called siRNA). .
  • ⁇ siRN A '' is an abbreviation for short interfering RNA, which is artificially synthesized or biochemically synthesized, or synthesized in an organism, or Short-chain double-stranded RNA of 10 base pairs or more, which is formed by degrading double-stranded RNA of about 40 bases or more in the body, usually has the structure of 5'-phosphate and 3'-OH And the 3 'end protrudes about 2 bases.
  • a specific protein binds to the siRNA to form RISC (RNA-induced d-silencing-complex).
  • This complex recognizes and binds mRNA having the same sequence as the siRNA, and cleaves the mRNA at the center of the siRNA by RNaselll-like enzyme activity.
  • 100% is preferable.
  • Mutation of the base at a position outside the central force of the siRNA leaves partial activity that does not completely eliminate the RNAi cleavage activity.
  • mutation of the base in the center of the siRNA has a large effect, and the mRNA cleavage activity by RNAi is extremely reduced. Utilizing such properties, for mRNA having a mutation, an siRNA having the mutation in the center can be synthesized and introduced into cells.
  • siRNA itself can be used as a factor that causes RNAi, and a factor that generates siRNA (for example, dsRNA typically having about 40 bases or more) can be used as such a factor. Can be.
  • siRNA acts as a primer for RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) by binding the antisense strand of siRNA to mRNA. It is also contemplated that dsRNA is synthesized, and this dsRNA again becomes a substrate for Dicer, generating new siRNA and amplifying the action.
  • RdRP RNA-dependent RNA polymerase
  • the siRNA itself and the factor by which the siRNA occurs are also useful. In fact, in insects and the like, for example, 35 dsRNA molecules almost completely degrade mRNA in a cell having more than 1,000 copies, so it is reasonable to think that siRNA itself and factors that generate siRNA are useful. It is cornered.
  • RNA having a length of about 20 bases (eg, typically about 21 to 23 bases) or less which is called siRNA
  • siRNA can be used for the treatment, prevention, prognosis and the like of a disease because it suppresses gene expression by expressing it in a cell and suppresses expression of a pathogenic gene targeted by the siRNA.
  • siRNA used in the present invention may take any form as long as it can induce RNAi.
  • the factor that causes RNAi of the present invention may be a short hairpin structure (shRNA; short hairpin RNA) having an overhang at the 3 'end.
  • shRNA refers to a single-stranded RNA containing a partially palindromic base sequence, thereby taking on a double-stranded structure in the molecule to form a hairpin-like structure. Molecules with more than base pairs. Such shRNAs are artificially chemically synthesized.
  • such shRNAs can generate the DNA of a hairpin structure in which the DNA sequences of the sense strand and the antisense strand are ligated in opposite directions by synthesizing RNA in vitro with T7 RNA polymerase.
  • T7 RNA polymerase T7 RNA polymerase
  • shRNAs can be transfected into a cell and then transfected into the cell for about 20 bases (typically, for example, 21 bases, 22 bases, 23 salts). It should be understood that it is degraded to the length of the group, causing RNAi like siRNA, and has the therapeutic effect of the present invention. It is to be understood that such effects are exerted on a wide variety of organisms, such as insects, plants, animals (including mammals).
  • shRNA causes RNAi similarly to siRNA, and thus can be used as an active ingredient of the present invention.
  • the shRNA may also preferably have a 3 'overhang.
  • the length of the double-stranded portion is not particularly limited, but may be preferably about 10 nucleotides or more, more preferably about 20 nucleotides or more.
  • the 3 'protruding end may be preferably DNA, more preferably at least 2 nucleotides in length, and even more preferably 2 to 4 nucleotides in length.
  • RNAi-causing factor used in the present invention may be artificially synthesized (for example, chemically or biochemically) or naturally-occurring. There is no essential difference in the effect of. For those chemically synthesized, it is preferable to purify them by liquid chromatography or the like.
  • RNAi used in the present invention can also be synthesized in vitro.
  • antisense and sense RNAs are synthesized from type I DNA using T7 RNA polymerase and T7 promoter. When these are annealed in vitro and then introduced into cells, RNAi is induced through the above-described mechanism, and the effects of the present invention are achieved.
  • such RNA can be introduced into cells by the calcium phosphate method.
  • Factors that cause RNAi of the present invention also include factors such as single strands that can hybridize with mRNA, or all similar nucleic acid analogs thereof. Such factors are also useful in the treatment methods and compositions of the present invention.
  • salt is used in the same meaning as commonly used in the art, and includes both inorganic salts and organic salts.
  • a salt is usually formed by a neutralization reaction between an acid and a base. Salts include NaCl, KSO, etc. generated by the neutralization reaction.
  • a salt a normal salt (H of an acid or ⁇ H of a base is not contained in the salt Substances, for example, NaCl, NH Cl, CH C ⁇ ONa, Na CO), acidic salts (H
  • salts are those constituting the medium (e.g., calcium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium hydrogen carbonate, sodium pyruvate, HEPES, calcium chloride, sodium chloride, lithium chloride, magnesium sulfide, iron nitrate, amino acid, etc.).
  • Vitamins, and salts constituting buffer solutions eg, calcium chloride, magnesium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium chloride
  • buffer solutions eg, calcium chloride, magnesium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium chloride
  • These salts may be used alone or in a combination of two or more, preferably a plurality, since the affinity for cells tends to increase.
  • the salt contained in the medium eg, Shii-dani calcium, Shii-dani magnesium, sodium hydrogen phosphate, chloride
  • More preferably preferably be used a plurality of thorium) device, be used as they are all salts that is part of the culture medium may be advantageous In. Another preferred embodiment, it may be added glucose.
  • search refers to another nucleobase sequence having a specific function and / or property, utilizing a certain nucleobase sequence, electronically or biologically or by another method.
  • Means to find Electronic search includes BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)), FASTA (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2444). —2448 (1988)), Smith and Waterman method (Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147: 195—197 (1981)), and Needleman and Wunsch method (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol.
  • Biological searches include stringent hybridization, macroarrays in which genomic DNA is attached to a nylon membrane, or microarrays (microarray assays) attached to a glass plate, PCR and in situ hybridization. But not limited to them. In the present specification, it is intended that Fnl should also include a corresponding gene identified by such electronic search and biological search. [0058] In the present specification, "introduction" of a substance into a cell means that the substance enters the inside of a cell membrane.
  • Intracellular changes eg, gene expression, signal transduction, events due to binding to intracellular receptors, metabolic changes, etc.
  • Intracellular changes can be physically (eg, visually), chemically (measuring secretions), biochemical, Biological measurements can be used to determine semi-IJ. Therefore, such “introduction” includes not only the simple transfer of a substance such as a protein into a cell, but also operations such as transfection, transformation, and transduction, which are usually called gene manipulation.
  • target substance refers to a substance that is intended to be introduced into cells.
  • the target substances contemplated by the present invention are substances that are not introduced into cells under normal conditions. Thus, substances that can be introduced into cells under normal conditions by diffusion or hydrophobic interaction are not considered as important aspects of the present invention.
  • Target substances that are not introduced into cells under normal conditions include, for example, proteins (polypeptides), RNA, DNA, sugars (especially polysaccharides), and their complex molecules (eg, glycoproteins, PNAs, etc.), viruses Vectors, and other compounds, but are not limited thereto.
  • the term "antibody” is used in a meaning commonly used in the art, and in this specification, all of antibodies and fragments and derivatives thereof, humanized antibodies, chimeric antibodies, And anti-idiotypic antibodies, and fragments thereof, such as F (ab ') 2 and Fab fragments, and other recombinantly produced conjugates.
  • it is an antibody that recognizes the polypeptide used in the present invention, and more preferably, it is an antibody that specifically recognizes the polypeptide used in the present invention.
  • Such antibodies may be either polyclonal or monoclonal. In one embodiment of the present invention, such antibodies are also included within the scope of the present invention.
  • the term "antigen" refers to an antibody that binds to an antibody or binds to a specific receptor such as a B lymphocyte or T lymphocyte to induce an immune reaction such as antibody production and / or cytotoxicity.
  • a substance that causes an inflammation for example, but not limited to proteins, lipids, sugars, etc.
  • Binding to an antibody or lymphocyte receptor is called “antigenicity”.
  • binding to an antibody or lymphocyte receptor is called "antigenicity”.
  • Properties that induce an immune response, such as antibody production are called "immunogenicity”.
  • the substance used as an antigen includes, for example, at least one substance of interest (eg, a protein).
  • epitopes or “antigenic determinants” refer to sites in an antigen molecule to which an antibody or lymphocyte receptor binds. Methods for determining epitopes are well known in the art, and such epitopes can be determined by those skilled in the art using such well-known and conventional techniques given the primary sequence of a nucleic acid or amino acid.
  • the partner of the "cell adhesion molecule” refers to a molecule that specifically interacts with the cell adhesion molecule.
  • the term “specifically interacts" with a cell adhesion factor refers to an interaction with a higher affinity for a cell adhesion factor than for a substance other than the specific cell adhesion factor.
  • the term "device” refers to a part that can constitute a part or the whole of an apparatus, and includes a support (preferably a solid support) and a support. It consists of a target substance to be carried. Such devices include, but are not limited to, chips, arrays, microtiter plates, cell culture plates, petri dishes, finolems, beads, and the like.
  • support refers to a material to which a substance such as a biomolecule can be immobilized.
  • the material of the support may be either covalently or non-covalently bonded, having the ability to bind to a substance such as a biomolecule used in the present invention, or derivatized to have such property. Any solid material that can be used.
  • any material that can form a solid surface can be used, for example, glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal (also alloy). And natural and synthetic polymers (eg, polystyrene, cellulose, chitosan, dextran, and nylon), and the like.
  • the support may be formed from multiple layers of different materials. For example, glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon oxide, silicon carbide And an inorganic insulating material such as silicon nitride.
  • Polyethylene ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, acrylic resin, Polyacrylonitrile, polystyrene, acetal resin, polycarbonate, polyamide, phenolic resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene 'acrylonitrile copolymer, acrylonitrile butadiene styrene copolymer, silicone resin, polyphenylene oxide, polysulfone, etc.
  • Organic materials can be used.
  • a membrane used for blotting such as a nitrocellulose membrane, a nylon membrane, or a PVDF membrane
  • a membrane used for blotting such as a nitrocellulose membrane, a nylon membrane, or a PVDF membrane
  • the material constituting the support is a solid phase, it is particularly referred to herein as "solid support".
  • solid support In the present specification, it may take the form of a plate, a microwell plate, a chip, a slide glass, a finolem, a bead, a metal (surface), or the like.
  • the support may be coated or uncoated.
  • liquid phase is used in the same meaning as usually used in the art, and usually means a state in a solution.
  • solid phase is used in the same meaning as used in the art, and usually means a solid state.
  • a liquid and a solid may be collectively referred to as a fluid.
  • contact means that two substances (eg, a composition and a cell) are present at a close enough distance to interact with each other.
  • the term "interaction” means that when referring to two objects, the two objects exert a force on each other.
  • Examples of such interactions include, but are not limited to, covalent bonds, hydrogen bonds, van der Waals forces, ionic interactions, nonionic interactions, hydrophobic interactions, electrostatic interactions, etc. Not done.
  • the interaction can be a normal interaction that occurs in vivo, such as a hydrogen bond, a hydrophobic interaction.
  • interacting substance refers to a substance that interacts with a certain subject.
  • substances include, for example, antibodies to antigens, ligands to receptors Or vice versa, but is not limited thereto.
  • the cell adhesion molecule used in the present invention often takes the form of a gene product, it is understood that such a gene product may be a variant thereof, as described above. Therefore, the present invention can also use substances produced by the following genetic modification techniques.
  • certain amino acids included in the sequence may be present in the protein structure, such as, for example, a cationic region or a binding site of a substrate molecule, without any apparent loss or loss of interaction binding capacity. It can be replaced by another amino acid. It is the protein's ability to interact and its properties that define the biological function of a protein. Thus, certain amino acid substitutions may be made in the amino acid sequence, or at the level of its DNA coding sequence, resulting in a protein that retains its original properties after the substitution. Thus, various modifications may be made in the peptide disclosed herein or the corresponding DNA encoding the peptide without any apparent loss of biological utility.
  • the hydropathic index of amino acids can be considered.
  • the importance of the hydrophobic amino acid index in conferring interactive biological functions on proteins is generally recognized in the art (Kyte. J and Doolittle, RFJ Mol. Biol. 157 (1): 105-132, 1982).
  • the hydrophobic nature of amino acids contributes to the secondary structure of the resulting protein, which in turn defines the interaction of the protein with other molecules (eg, enzymes, substrates, receptors, DNA, antibodies, antigens, etc.).
  • Each amino acid is assigned a hydrophobicity index based on its hydrophobicity and charge properties.
  • an amino acid is replaced by another amino acid having a similar hydrophobicity index and It is well known in the art, however, that proteins having similar biological functions can be generated (eg, proteins that are equivalent in enzyme activity).
  • the hydrophobicity index is preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5. It is understood in the art that such substitution of amino acids based on hydrophobicity is efficient.
  • the hydrophilicity index may also be considered in modifying proteins. As described in US Pat. No. 4,554,101, the following hydrophilicity indices have been assigned to amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartic acid ( Glutamic acid (+ 3.0 ⁇ 1); Serine (+0.3); Asparagine (+0.2); Glutamine (+0.2); Glycine (0); Threonine (— 0.4); proline (-0.5 ⁇ 1); alanine (-0.5); histidine (-0.5); cystine (-1.0); methionine (-1.3); valine ( —1.5); Leucine (—1.8); Isoloicin ( ⁇ 1.8); Tyrosine (—2.3); Phenylalanine (—2.5); and Tryptophan (—3.4).
  • an amino acid can be substituted for another that has a similar hydrophilicity index and still provide a bioisostere.
  • the hydrophilicity index is preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
  • conservative substitution refers to a substitution in which the amino acid substitution and the amino acid to be substituted have similar hydrophilicity indexes and / or hydrophobicity indexes as described above.
  • conservative substitution include, for example, those having a hydrophilicity index or a hydrophobicity index of two or less within soil 2, preferably within ⁇ 1 and more preferably within ⁇ 0.5. But not limited to them.
  • conservative substitutions are well known to those skilled in the art and include, for example, substitutions within each of the following groups: arginine and lysine; daltamic and aspartic acid; serine and threonine; glutamine and asparagine; Leucine, isoleucine, and the like, but are not limited thereto.
  • the "variant" refers to a substance in which a substance such as an original polypeptide or polynucleotide is partially changed. Such variants include substitutional variants, addition variants, deletion variants, truncated variants, allelic variants, etc. And so on. Alleles refer to genetic variants that belong to the same locus and are distinct from each other. Therefore, “allelic variant” refers to a variant that has an allelic relationship to a certain gene. Such allelic variants usually have sequences that are identical or very similar to their corresponding alleles, and usually have nearly the same biological activity, but rarely different biological activities. It may also have.
  • “Species homolog or homolog” refers to homology (preferably 60% or more homology, more preferably, homology at the amino acid level or nucleotide level) of a certain gene within a certain species. 80./o above, 85./ 0 or more, 90% or more, instances that have a homology) of 95% or more. Methods for obtaining such species homologs will be apparent from the description herein.
  • the term "ortholog” refers to a gene derived from speciation from a common ancestor with two genes, both orthologous genes.
  • Moguro bottles genes into range of the human and mouse force s, non-hemoglobin gene and the ⁇ -hemoglobin gene of human ortholog occurred at paralogs (genes duplicated gene ).
  • Onoresologs are useful for estimating molecular phylogenetic trees.
  • Orthologs of the present invention may also be useful in the present invention, since orthologs can usually perform the same function in another species as the original species.
  • conservatively modified variants applies to both amino acid sequences and nucleic acid sequences.
  • a conservatively modified variant is essentially a nucleic acid that encodes the same or essentially the same amino acid sequence, and if the nucleic acid does not encode an amino acid sequence, To the same sequence. Due to the degeneracy of the genetic code, many functionally identical nucleic acids encode any given protein. For example, the codons GCA, GCC, GCG, and GCU all encode the amino acid alanine.
  • nucleic acid variation is a "silent modification (mutation)," which is one type of conservatively modified mutation.
  • Every nucleic acid sequence herein which encodes a polypeptide also describes every possible silent variation of the nucleic acid.
  • nuclear Each codon in the acid except AUG, which is usually the only codon for methionine, and TGG, which is usually the only codon for tryptophan, can be modified to produce functionally identical molecules It is understood that. Accordingly, each silent variation of a nucleic acid which encodes a polypeptide is implicit in each described sequence.
  • such modifications may be made to avoid substitution of the amino acid cysteine, which greatly affects the conformation of the polypeptide.
  • base sequence modification methods include cleavage with a restriction enzyme or the like, ligation treatment with a DNA polymerase, Klenow fragment, DNA ligase, or the like, site-specific base substitution using a synthetic oligonucleotide, or the like. (Directed site-directed mutagenesis; Mark Zoller and Michael Smith, Methods in Enzymology, 100, 468-500 (1983)). The power S, and other methods usually used in the field of molecular biology. Can also be modified.
  • amino acid addition, deletion, or modification can also be performed to produce a functionally equivalent polypeptide.
  • Amino acid substitution refers to substitution of the original peptide with one or more amino acids, for example, 11 amino acids, preferably 115 amino acids, and more preferably 113 amino acids.
  • the addition of amino acids refers to adding one or more, for example, 110, preferably 115, and more preferably 113 amino acids to the original peptide chain.
  • Amino acid deletion refers to the deletion of one or more, for example, 110, preferably 115, more preferably 113 amino acids from the original peptide.
  • Amino acid modifications include, but are not limited to, forces S including amidation, carboxylation, sulfation, halogenation, alkylation, glycosylation, phosphorylation, hydroxylation, acylation (eg, acetylation), etc. .
  • the amino acid to be substituted or added may be a natural amino acid or an unnatural amino acid or an amino acid analog. Natural amino acids are preferred.
  • peptide analog or "peptide derivative” is a compound that is different from a peptide, but is equivalent to the peptide in at least one chemical or biological function.
  • peptide analogs include those in which one or more amino acid analogs or amino acid derivatives have been added or replaced with the original peptide.
  • Peptide analogs have a function similar to that of the original peptide (e.g., similar pKa values, similar functional groups, binding to other molecules). Such attachments or substitutions are made to be substantially similar (eg, similarity in similarity, similarity in water solubility).
  • Such peptide analogs can be made using techniques well known in the field.
  • a peptide analog can be a polymer comprising an amino acid analog.
  • polynucleotide analog and “nucleic acid analog” are compounds that are different from polynucleotides or nucleic acids.
  • a polynucleotide or nucleic acid and at least one chemical function or organism Are those whose biological functions are equivalent.
  • a polynucleotide or nucleic acid analog includes one or more nucleotide analogs or nucleotide derivatives added to or substituted for the original peptide.
  • the nucleic acid molecule used in the present specification has a part of the nucleic acid sequence deleted as long as the expressed polypeptide has substantially the same activity as the naturally-occurring polypeptide. Alternatively, it may be replaced by another base or another nucleic acid sequence may be partially inserted. Alternatively, another nucleic acid may be bound to the 5 'end and / or the 3' end. Further, a nucleic acid molecule which hybridizes a gene encoding a polypeptide under stringent conditions and encodes a polypeptide having substantially the same function as the polypeptide may be used. Such genes are known in the art and can be used in the present invention.
  • Such a nucleic acid can be obtained by a well-known PCR method, and can also be chemically synthesized. These methods may be combined with, for example, a site-specific displacement induction method, a hybridization method, or the like.
  • substitution, addition or deletion of a polypeptide or polynucleotide refers to an amino acid or its substitute for the original polypeptide or polynucleotide, respectively. Or the substitution of nucleotides or their substitutes, additions or removals. Techniques for such substitution, addition or deletion are well known in the art, and examples of such techniques include site-directed mutagenesis techniques.
  • the number of substitutions, additions, or deletions may be any number as long as it is one or more. Such a number may be a function having a desired function (for example, hormone, cytotoxicity, etc.) in a variant having the substitution, addition, or deletion. As long as the information transfer function is maintained) . For example, such a number may be one or several, and preferably may be within 20%, 10%, or 100 or less, 50 or less, 25 or less of the total length.
  • an agent that specifically interacts with a polynucleotide or a polypeptide refers to an affinity for the polynucleotide or the polypeptide or other irrelevant (particularly, identity of 30./o). Typically less than or equal to the affinity for a polynucleotide or polypeptide (preferably significantly higher). Such an affinity can be measured by, for example, hybridization assay, binding assay, and the like.
  • the "factor” may be any substance or other element (for example, energy) as long as the intended purpose can be achieved.
  • substances include, for example, proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (eg, DNAs such as cDNA, genomic DNA, mRNA, siRNA, RNAi Such as RNA), polysaccharides, oligosaccharides, lipids, small organic molecules (eg, hormones, ligands, signal transducers, small organic molecules, molecules synthesized by combinatorial chemistry, small molecules that can be used as pharmaceuticals) (Eg, small molecule ligands) and the like, but are not limited thereto.
  • a polynucleotide typically, a polynucleotide having a certain degree of sequence homology (for example, 70% or more sequence identity) to the sequence of the polynucleotide, and And polypeptides such as transcription factors that bind to the promoter region, but are not limited thereto.
  • an antibody specifically directed against the polypeptide, a derivative thereof, or an analog thereof eg, a single-chain antibody
  • the polypeptide When is a receptor or a ligand, specific ligands or receptors, and when the polypeptide is an enzyme, include but are not limited to substrates.
  • an "isolated" biological agent eg, a nucleic acid or protein
  • a nucleic acid or protein is defined as another biological agent in a cell of an organism in which the biological agent naturally exists.
  • Factors for example, in the case of nucleic acids, factors other than nucleic acids and nucleic acid sequences other than the target nucleic acid
  • a nucleic acid containing stem IJ in the case of a protein, refers to a substance substantially separated or purified from a factor other than a protein and a protein containing an amino acid sequence other than a target protein.
  • isolated nucleic acids and proteins include nucleic acids and proteins that have been purified by standard purification methods. Thus, isolated nucleic acids and proteins include chemically synthesized nucleic acids and proteins.
  • a “purified" biological agent eg, nucleic acid or protein
  • a biological agent in which at least a part of a factor naturally associated with the biological agent has been removed. Say. Thus, typically, the purity of the biological agent in the purified biological agent is higher (ie, more concentrated) than in the state in which the biological agent is normally present.
  • purified and isolated as used herein preferably refer to at least 75% by weight, more preferably at least 85% by weight, even more preferably at least 95% by weight. %, And most preferably at least 98% by weight, of the same type of biological agent.
  • a "vector” or “recombinant vector” is a vector capable of transferring a target polynucleotide sequence into a target cell.
  • Such vectors are capable of autonomous replication in host cells such as prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, animal individuals and plant individuals, or capable of integration into chromosomes, and Those containing a promoter at a position suitable for polynucleotide transcription are exemplified. Therefore, the plasmid is also one f of the vector. Of the vectors, those suitable for cloning are referred to as “cloning vectors”.
  • Such cloning vectors usually contain a multiple cloning site that contains multiple restriction enzyme sites.
  • restriction enzyme sites and multiple cloning sites are well known in the art, and those skilled in the art can appropriately select and use them according to the purpose. Such techniques are described in the literature described herein (eg, Sambrook et al., Supra).
  • the term "expression vector” refers to a structural gene and a gene that regulates its expression.
  • the regulatory elements may preferably include a terminator, a selectable marker such as a drug resistance gene, and a heterogeneous gene. It is well known to those skilled in the art that the type of expression vector of an organism (eg, an animal) and the type of regulatory element used can vary depending on the host cell.
  • Examples of recombinant vectors for prokaryotic cells include pcDNA3 (+), pBluescript-SK (+/-), pGEM-T, pEF_B ⁇ S, pEGFP, pHAT, pUC18, pFT—DEST TM 42GA TEWAY (Invitrogen) and the like. Is exemplified.
  • Recombinant vectors for animal cells include pcDNAl / Amp, pcDNAI, pCDM8 (also sold by Funakoshi Co., Ltd.), ⁇ 80 107 [Japanese Unexamined Patent Publication No. 3_229 (11 ⁇ 10 ⁇ 6, 103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], pAMo, pAMoAU. Biol. Chem., 268, 22782--22787 (1993)], based on Murine Stem Cell Virus (MSCV). And retroviral expression vectors, pEF-BOS, pEGFP and the like.
  • Examples of a recombinant vector for a plant cell include, but are not limited to, pPCVICEn4HPT, pCGN1548, pCGN1549, pBI221, pBI121, and the like.
  • terminal 1 is usually located downstream of the protein-encoding region of a gene, and is involved in termination of transcription when DNA is transcribed into mRNA and addition of a poly-A sequence. Sequence. It is known that the terminator is involved in mRNA stability and affects the expression level of a gene.
  • promoter refers to a region on DNA that determines the transcription initiation site of a gene and that directly regulates the frequency of transcription.
  • the starting base sequence Therefore, in the present specification, a portion of a gene having a promoter function is referred to as a “promoter portion”. Since the promoter region is usually a region within about 2 kbp upstream of the first exon of the putative protein coding region, if the protein coding region in the genomic nucleotide sequence is predicted using DNA analysis software, the promoter region may be The area can be estimated. Putative promoter regions vary from structural gene to gene, but are usually upstream of, but limited to, structural genes. However, it may be downstream of the structural gene. Preferably, the putative promoter region is within about 2 kbp upstream of the first exon translation start site.
  • the term “enhancer” refers to a sequence used to enhance the expression efficiency of a target gene. Such enhancers are well known in the art. A plurality of forces that can be used may be used or one may not be used.
  • silencer refers to a sequence having a function of suppressing gene expression and arresting.
  • any type of silencer may be used as long as the silencer has the function.
  • operably linked refers to the expression (operation) of a desired sequence, a transcriptional / translational regulatory system (eg, a promoter, an enhancer, a silencer, etc.) or a translational regulatory system. It means to be placed under the control of the sequence.
  • a transcriptional / translational regulatory system eg, a promoter, an enhancer, a silencer, etc.
  • the promoter is usually, but not necessarily, positioned immediately upstream of the gene.
  • any technique for introducing a nucleic acid molecule into cells may be used. Examples include transformation, transduction, and transfection. Techniques for introducing such nucleic acid molecules are well known and commonly used in the art, and are described, for example, in Ausubel FA et al. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York; NY; Sambrook J et al. "987) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. And its two fragments, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Co., 1997. Gene transfer can be confirmed using the methods described herein, such as Northern blot, Western blot analysis, or other well-known techniques.
  • any of the above-described methods for introducing DNA into cells can be used, and examples thereof include transfection, transduction, and transformation (for example, calcium phosphate method, ribosome method, DEAE dextran method, elect port Pore Chillon method, a method using particle gun (gene gun)), Ribofuwekushiyon method, staple erotic plasto method [p ro Natl. Acad. Sci . USA, 84, 1929 (1978)] , Lithium acetate 153, 163 (1983)] and Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978).
  • transformation for example, calcium phosphate method, ribosome method, DEAE dextran method, elect port Pore Chillon method, a method using particle gun (gene gun)
  • Ribofuwekushiyon method for example, calcium phosphate method, ribosome method, DEAE dextran method, elect port Pore Chillon method, a method using particle gun (gene gun)
  • gene introduction reagent refers to a reagent used for promoting the introduction efficiency in a gene introduction method.
  • gene introduction reagents include, but are not limited to, cationic polymers, cationic lipids, polyamine-based reagents, polyimine-based reagents, calcium phosphate, and the like.
  • reagents used in transfection include reagents commercially available from various sources, such as Effectene Transfection Reagent, cat.no.301425, Qiagen, CA), TransFastTM Transfection Reagent (E2431, Promega, WI), TfxTM-20 Reagent (E2391, Promega, WI), SuperFect Transfection Reagent (3 01305, Qiagen, CA), PolyFect Transfection Reagent (301105, Qiagen, CA), LipofectAMINE 2000 Reagent (11668) -019, Invitrogen corporation, CA), JetPEI (X4) cone. "01-30, Polyplus-transfection, France) and ExGen 500 (R0511, Fermentas Inc., MD). Not done.
  • Effectene Transfection Reagent cat.no.301425, Qiagen, CA
  • TransFastTM Transfection Reagent E2431, Promega, WI
  • TfxTM-20 Reagent E2391,
  • the "instructions" in the present specification describe the target substance introduction method and the like of the present invention to users (researchers, experimental assistants, or doctors and patients who administer patients in treatment, etc.). It was done.
  • This instruction describes, for example, a word indicating a method of using the composition or the like of the present invention.
  • the instructions shall be prepared in accordance with the format prescribed by the competent authority of the country in which the invention is to be implemented and shall specify that they have been approved by that competent authority.
  • the instructions are usually in the form of a so-called package insert for pharmaceuticals or in the form of a manual for laboratory reagents and are usually provided in paper form, but are not limited thereto. For example, it may be provided in a form such as an electronic medium (eg, a home page provided on the Internet, an e-mail).
  • the term "transformant” refers to all or a part (tissue or the like) of an organism such as a cell produced by transformation.
  • the transformant include all or a part (tissue, etc.) of living organisms such as cells of prokaryotes, yeasts, animals, plants, insects and the like.
  • Transformants may be transformed cells, transformed tissues, transformed It is also called the Lord.
  • the cell used in the present invention may be a transformant
  • prokaryotic cell when a prokaryotic cell is used in genetic engineering or the like, examples of the prokaryotic italium include Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium Noyu, Microbacterium, Pseudomonas, and the like. Examples include Noyu "5 J eukaryotic cells, for example, Escherichia coli XLl_Blue, Escherichia coli XL2-Blue, and Escherichia coli DH1. Alternatively, in the present invention, cells isolated from natural products can also be used.
  • Animal cells that can be used in genetic manipulation and the like in the present specification include mouse myeloma cells, rat 'myeloma cells, mouse' nos, ibridoma cells, Chinese hamster cells CH ⁇ cells, and BHK cells. And African green monkey kidney cells, human leukemia cells, HBT5637 (JP-A-63-299), and human colon cancer cell lines.
  • mouse 'myeloma cells include ps20 and NS ⁇
  • rat myeloma cells include YB2 /
  • human fetal kidney cells include HEK293 (ATCC: CRL_1573)
  • human leukemia cells include BALL-1.
  • C ⁇ S_1 and COS-7 as Zanore kidney cells
  • HCT-15 as human colon cancer cell line
  • SK—N_SH SK—N-SH-5Y
  • human neuroblastoma Neuro2A etc. Is exemplified.
  • primary cultured cells can also be used.
  • the plant cells that can be used in genetic manipulation and the like in the present specification include callus or a part thereof and suspension cultured cells, Solanaceae, Grassicaceae, Brassicaceae, Rosaceae, Leguminosae, Laceae, Examples include, but are not limited to, cells of plants such as Labiatae, Lily, Acacia, Apiaceae and the like.
  • the "detection" or “quantification” of gene expression is achieved using an appropriate method including, for example, mRNA measurement and immunological measurement methods.
  • mRNA measurement and immunological measurement methods can be done.
  • the molecular biological measurement method include a Northern blot method, a dot plot method, and a PCR method.
  • the immunological measurement method include, for example, an ELISA method using a microtiter plate, an RIA method, a fluorescent antibody method, a Western blot method, and an immunohistochemical staining method.
  • the quantification method and For example, the ELISA method or the RIA method is exemplified.
  • DNA arrays are widely outlined in Shujunsha, edited by Cell Engineering, “DNA Microarrays and the Latest PCR Method”.
  • the protein array is described in detail in Nat Genet. 2002 Dec; 32 Suppl: 526-32.
  • Methods for analyzing gene expression include, but are not limited to, RT-PCR, RACE, SSCP, immunoprecipitation, two-hybrid systems, in vitro translation, and the like, in addition to those described above.
  • expression of a gene product such as a gene, polynucleotide, or polypeptide means that the gene or the like undergoes a certain action in vivo to take on another form.
  • it means that a gene, polynucleotide, etc. is transcribed and translated to form a polypeptide, but transcription and production of mRNA may also be a form of expression. More preferably, such forms of the polypeptide may have undergone post-translational processing.
  • the term "expression level” refers to the level of expression of a polypeptide or mRNA in a target cell or the like. Such expression levels can be evaluated using the antibody of the present invention by any appropriate method including immunological measurement methods such as the ELISA method, RIA method, fluorescent antibody method, Western blot method, and immunohistological staining method.
  • Expression level at the mRNA level “Change in expression level” refers to the expression level of the polypeptide of the present invention at the protein level or mRNA level, which is evaluated by any appropriate method including the above-described immunological measurement method or molecular biological measurement method. It means increasing or decreasing.
  • expression or “reduction of expression level” of a gene, a polynucleotide, a polypeptide, or the like is defined as when the factor of the present invention is acted on or not. Means that the amount of expression is significantly reduced.
  • the decrease in expression is a polypeptide Including a decrease in the expression level of
  • “increase” of “expression” or “expression level” of a gene, polynucleotide, polypeptide, or the like refers to a factor related to gene expression in a cell (for example, a gene to be expressed or a gene that regulates the gene.
  • the increase in expression includes an increase in the expression level of the polypeptide.
  • induction of “expression” of a gene refers to increasing the expression level of a gene by causing a certain factor to act on a certain cell. Therefore, the induction of expression is to cause the gene to be expressed when no expression of the gene is found, and to increase the expression of the gene when the expression of the gene has already been seen It is included.
  • the term "specifically expresses" a gene means that the gene is different (preferably higher) at a particular site or stage in a plant than at other sites or stages. It is expressed. To be specifically expressed may be expressed only at a certain site (specific site) or may be expressed at other sites. Preferably, specific expression means expression at a certain site only.
  • biological activity refers to an activity that a certain factor (for example, a polypeptide or a protein) may have in a living body, and has various functions (for example, promotion of transcription).
  • a cell adhesion-related factor interacts with a cell adhesion molecule
  • its biological activity depends on the coexistence of the interacting substance when cells are seeded on a surface coated with an ECM substrate such as fibronectin. This confirms the adhesion inhibitory effect.
  • a substrate having such an interaction activity is chemically or physically immobilized on the surface, an increase in the adhesion of cells to the surface is confirmed. Therefore, it can be measured by the technique based on such a principle.
  • such biological activity can be cell adhesion activity, heparin binding activity, collagen binding activity, and the like.
  • Cell adhesion activity can be measured by measuring the rate of cell adhesion to a solid phase after cell seeding and treating it as the adhesion activity.
  • Heparin-binding activity can be measured by affinity chromatography using a heparin-immobilized column or the like, and can be confirmed by binding to this.
  • Collagen binding activity is measured by affinity chromatography using a collagen-immobilized column. It can be measured by what can be identified as binding to it. For example, if a factor is an enzyme, its biological activity includes that enzymatic activity.
  • an agent is a ligand, the ligand involves binding to the corresponding receptor.
  • Such biological activity can be measured by techniques well known in the art (see, eg, Molecular Cloning, Current Protocols (cited herein) and the like).
  • particle refers to a substance having a certain hardness and a size equal to or more than a certain size. In the present invention, it refers to a substance made of metal or the like. Examples of the particles used in the present invention include, but are not limited to, gold colloid, silver colloid, and latex colloid.
  • kits refers to a unit which is usually divided into two or more sections and provided with a part to be provided (eg, a reagent, a particle, or the like). This kit form is preferred when it is intended to provide a composition such that it should preferably be mixed and used shortly before use, which should be provided as a mixture. Such kits will advantageously be provided with instructions that describe how to provide the provided components (eg, reagents, particles, etc.).
  • the polypeptide used in the present invention is obtained by culturing a transformant derived from a microorganism, animal cell, or the like having a recombinant vector into which a DNA encoding the polypeptide has been incorporated, according to a conventional culture method. It can be produced by producing and accumulating a peptide, and collecting the polypeptide of the present invention from the culture.
  • the method for culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • a medium for culturing a transformant obtained by using a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host
  • a carbon source for example, gnorecose, fructose, sucrose, or any of these containing assimilation
  • Molasses Molasses, carbohydrates such as starch or starch hydrolysates, organic acids such as acetic acid and propionic acid, alcohols such as ethanol, propanol, etc.
  • nitrogen sources eg, ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate
  • Ammonium acetate ammonium phosphate, etc.
  • inorganic salts for example,
  • Culture is preferably performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture, but is not limited thereto.
  • the culture temperature is 15-40 ° C, and the culture time is usually 5 hours and 7 days.
  • the culture maintain the pH between 3.0 and 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like. If necessary, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • a conventional polypeptide commonly used in the field is used.
  • Peptide (eg, enzyme) isolation or purification techniques can be used.
  • the culture is treated by a technique such as centrifugation to obtain a soluble fraction. Get minutes.
  • solvents such as solvent extraction, salting-out desalting with ammonium sulfate, etc., precipitation with organic solvents, resins such as getylaminoethyl (DEA E) -Sepharose (Pharmacia), DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical) Anion exchange chromatography method used, S_Sepharose FF (Pharmacia), etc. used resin Cation exchange chromatography method, Butyl-Sepharose, Phenyl-Sepharose, etc. used resin hydrophobic chromatography method, molecular sieve used Gel filtration, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing, etc.
  • a purified sample can be obtained using a technique such as electrophoresis.
  • the cells in the culture were collected by centrifuging the culture, and the cells were washed. Thereafter, the cells are crushed using an ultrasonic crusher, a French press, a Mantongaulin homogenizer, a Dynomill, or the like to obtain a cell-free extract.
  • a purified sample can be obtained by using a gel filtration method using a molecular sieve, an affinity chromatography method, a chromatofocusing method, or an electrophoresis method such as isoelectric focusing.
  • the polypeptide used in the present invention is expressed by forming an insoluble substance in the cells, the cells are similarly collected, crushed, and then separated from the precipitate fraction obtained by centrifugation. After recovering the polypeptide of the present invention by an ordinary method, the insoluble form of the polypeptide is solubilized with a polypeptide denaturing agent. The lysate is diluted or dialyzed into a solution containing no polypeptide denaturing agent or a solution in which the concentration of the polypeptide denaturing agent is so low that the polypeptide is not denatured. After having a three-dimensional structure, a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the protein can be purified according to a conventional protein purification method [for example, J. Evan. Sadler et al .: Methods in Enzymology, 83, 458].
  • affinity chromatography using a substance having affinity for the fused protein may be used.
  • Can also be purified [Akio Yamakawa, Experimental Medicine, 13, 469-474 (1995)].
  • One such method is based on the method described by Lowe et al. [Pro Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227-8231 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)].
  • polypeptide can be produced as a fusion protein with Protein II, and purified by affinity chromatography using immunoglobulin G.
  • the polypeptide used in the present invention can be produced as a fusion protein with a FLAG peptide and purified by affinity chromatography using an anti-FLAG antibody [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Development, 4, 1288 (1990)].
  • polypeptide of the present invention can be purified by affinity chromatography using an antibody against the polypeptide itself.
  • the polypeptide of the present invention can be prepared in vitro according to a known method, Biomolecular NMR, 6, 129-134, Science, 242, 1162-1164, J. Biochem., 110, 166-168 (1991)]. Can be produced using a transcription'translation system.
  • the polypeptide of the present invention can also be obtained by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or the tBoc method (t_butyloxycarbonyl method). Can be manufactured.
  • peptide synthesis machines such as Advanced ChemTech, Applied Biosystems, Pharmacia Biotech ⁇ Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, and Shimadzu Corporation can be used for peptide synthesis.
  • plate refers to a flat support to which molecules such as antibodies can be immobilized.
  • the plate is preferably made of a glass substrate having a metal thin film containing plastic, gold, silver or aluminum on one side as a base material.
  • substrate refers to a material (preferably solid) on which the chip or array of the present invention is constructed.
  • the substrate is included in the concept of a plate.
  • the material of the substrate may have the property of binding to the biomolecule used in the present invention or be derivatized to have such property, either covalently or non-covalently. Any solid material is included.
  • any material capable of forming a solid surface can be used.
  • examples thereof include glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastic, and metal. (Including, but not limited to, alloys), natural and synthetic polymers (eg, polystyrene, cellulose, chitosan, dextran, and nylon).
  • the substrate may be formed from multiple layers of different materials.
  • inorganic insulating materials such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon carbide, silicon oxide, and silicon nitride can be used.
  • Organic materials can be used.
  • a preferable material for the substrate varies depending on various meters such as a measuring instrument, and a person skilled in the art can appropriately select an appropriate material from the various materials described above.
  • a slide glass is preferred for the transfection array.
  • such a substrate can be coated.
  • coating when used with respect to a solid support or substrate, refers to forming a film of a substance on the surface of the solid support or substrate and to such a film. Coating may be performed for various purposes, for example, to improve the quality of the solid support and the substrate (for example, to improve the service life and environmental resistance such as acid resistance), the substance to be bound to the solid support or the substrate. In many cases, the purpose is to improve the affinity of the compound.
  • the substance for such a coating is called a “coating agent”. As such a coating agent, various substances can be used.
  • biological substances such as DNA, RNA, proteins, and lipids, and polymers (for example, -L-lysine, MAS (available from Matsunami Glass, Kishiwada, Japan), hydrophobic fluoroplastics), silanes (APS (eg, ⁇ -aminopropyl silane)), and metals (eg, gold) It can be used but is not limited to them.
  • -L-lysine available from Matsunami Glass, Kishiwada, Japan
  • hydrophobic fluoroplastics for example, silanes (APS (eg, ⁇ -aminopropyl silane)), and metals (eg, gold) It can be used but is not limited to them.
  • APS eg, ⁇ -aminopropyl silane
  • metals eg, gold
  • such a coating comprises poly-L-lysine, silane, (eg, epoxy silane or mercapto silane, APS (o / -aminopropyl silane)), MAS, hydrophobic fluoropolymer, It may be advantageous to use a metal such as gold.
  • silane eg, epoxy silane or mercapto silane, APS (o / -aminopropyl silane)
  • MAS hydrophobic fluoropolymer
  • a metal such as gold.
  • Such substances can be cells or objects containing cells (e.g., living organisms, It is preferable to use a substance that conforms to ()).
  • chip or “microchip” is used interchangeably, has various functions, and refers to a microminiature integrated circuit that becomes a part of a system.
  • the chip include, but are not limited to, a DNA chip and a protein chip.
  • the term "array” refers to a pattern or pattern in which a composition (eg, a mixture of DNA, protein, and transfat) containing one or more (eg, 1000 or more) target substances is arranged. (E.g., a chip) itself having.
  • Arrays that are patterned on a small substrate eg, 10 ⁇ 10 mm
  • the terms microarray and array are used interchangeably herein. Therefore, what is patterned on a substrate larger than the above-mentioned substrate may be called a microarray.
  • an array is composed of a set of desired transphosphate mixtures that are themselves immobilized on a solid surface or membrane.
  • Array preferably comprises at least 10 two identical or different antibodies, at least 10 3 and more preferably, and more preferably at least 10 4, even more preferably at least 10 5 a. These antibodies are preferably placed on a surface of 125 ⁇ 80 mm, more preferably 10 ⁇ 10 mm.
  • a microtiter plate such as a 96-well microtiter plate or a 384-well microtiter plate, or a size similar to a slide glass is contemplated.
  • the composition containing the target substance to be immobilized may be one kind or plural kinds. The number of such types can be any number up to the number of individual spots. For example, a composition containing about 10, about 100, about 500, about 1000 target substances can be immobilized.
  • the solid phase surface or film such as a substrate
  • any number of target substances as described above e.g., proteins such as antibodies
  • 10 8 to biomolecules child up to 10 7 biomolecules in other embodiments, 10 up to 6 biomolecules, 10 to 5 biological molecules, no more than 10 4 biomolecules, up to 10 3 biomolecules , or 10 although pieces of biological molecules up to two biological molecules can be arranged, 10 a composition containing target product quality more than eight biomolecules may be disposed.
  • the size of the substrate is preferably smaller.
  • the spot size of a composition containing a target substance can be as small as the size of a single biomolecule (this Can be of the order of 2 nm).
  • the minimum substrate area is in some cases determined by the number of biomolecules on the substrate.
  • a composition containing a target substance to be introduced into a cell is usually immobilized by covalent bond or physical interaction in the form of a 0.01 mm to 10 mm spot.
  • spots of biomolecules may be arranged.
  • spot refers to a certain set of compositions containing a target substance.
  • spotting refers to producing spots of a composition containing a certain target substance on a certain substrate or plate. Spotting can be performed in any manner, for example, by pitting or the like, or can be performed by an automated device, and such methods are well known in the art.
  • the term "address” refers to a unique location on a substrate, which may be distinguishable from other unique locations.
  • the address takes any shape appropriate for association with the spot with that address, and the entity at every each address can be distinguished from the entity at the other address (eg, optically). obtain.
  • the shape defining the address may be, for example, a circle, an ellipse, a square, a rectangle, or an irregular shape. Therefore, “address” indicates an abstract concept, and “spot” may be used to indicate a specific concept. However, when there is no need to distinguish between the two, “address” is used in this specification. And “spot” can be used interchangeably.
  • the size defining each address depends, inter alia, on the size of the substrate, the number of addresses on a particular substrate, the amount and / or available reagents of the composition containing the target substance, the size of the microparticles and their size. Depends on the degree of resolution required for any method in which the array is used. The magnitude can be, for example, in the range of l_2 nm to a few cm. Any size is possible, consistent with the application of the array.
  • the spatial arrangement and shape defining the address are designed to suit the particular application in which the microarray is used.
  • the addresses can be densely distributed and widely dispersed, or sub-gnoled into a desired pattern appropriate for a particular type of analyte.
  • microarrays refer to the Genome Function Research Protocol It has been extensively reviewed in experimental lectures in the medical era 1), genomic medical science and its powerful genomic medicine (Experimental Medical Research IJ).
  • the term “cell” is defined in the same broadest sense as used in the art, and is a constituent unit of a tissue of a multicellular organism and isolates the outside world. An organism that is wrapped in a membrane structure that has self-renewal capability and has genetic information and its expression mechanism.
  • the cell used in the present specification may be a naturally occurring cell or an artificially modified cell (for example, a fusion cell, a genetically modified cell).
  • the source of cells can be, for example, a single cell culture, or cells from a normally grown transgenic animal embryo, blood, or body tissue, or a normally grown cell line. Cell mixtures such as, but not limited to.
  • the cells used in the present invention include cells from any organism (eg, any kind of single cell organism (eg, bacteria, yeast) or multicellular organisms (eg, animals (eg, vertebrates, invertebrates) Animals), plants (eg, monocotyledonous plants, dicotyledonous plants, etc.))).
  • any organism eg, any kind of single cell organism (eg, bacteria, yeast) or multicellular organisms (eg, animals (eg, vertebrates, invertebrates) Animals), plants (eg, monocotyledonous plants, dicotyledonous plants, etc.)).
  • cells derived from vertebrates are used, and more specifically, mammals (eg, monopores) Species, marsupials, oligodonts, skin wings, winged fins, carnivores, insectivores, longnoses, equinoids, artiodactyls, tubulars, squamata, sponges, whales, Cells derived from primates, rodents, and egrets) are used.
  • mammals eg, monopores
  • mammals eg, marsupials, oligodonts, skin wings, winged fins, carnivores, insectivores, longnoses, equinoids, artiodactyls, tubulars, squamata, sponges, whales, Cells derived from primates, rodents, and egrets
  • a primate eg, a chimpanzee
  • Macaques, and humans in particular, but not limited to, human-derived cells.
  • stem cell has a self-renewal ability and a pluripotency (ie, pluripotency).
  • a stem cell can be, but is not limited to, an embryonic stem (ES) cell or a tissue stem cell (also referred to as a tissue stem cell, a tissue-specific stem cell, or a somatic stem cell).
  • ES embryonic stem
  • tissue stem cell also referred to as a tissue stem cell, a tissue-specific stem cell, or a somatic stem cell.
  • artificially generated cells eg, the fused cells, reprogrammed cells, etc. described herein
  • Embryonic stem cells are pluripotent stem cells derived from early embryos. Embryonic stem cells were first established in 1981 and have been applied to the production of knockout mice since 1989.
  • Tissue stem cells unlike embryonic stem cells, are cells in which the direction of differentiation is limited, exist at specific positions in tissues, and have an undifferentiated intracellular structure. Thus, tissue stem cells have a low level of pluripotency. Tissue stem cells have poor intracellular organelles with a high nuclear / cytoplasmic ratio. Tissue stem cells are generally pluripotent and maintain their proliferative potential for more than one lifetime in individuals whose cell cycle is slow.
  • a stem cell may be an embryonic stem cell or a tissue stem cell.
  • tissue stem cells When classified according to the site of origin, tissue stem cells are classified into, for example, skin system, digestive system, bone marrow system, nervous system and the like.
  • Skin tissue tissue stem cells include epidermal stem cells and hair follicle stem cells.
  • Gastrointestinal tissue stem cells include knee (common) stem cells and hepatic stem cells.
  • myeloid tissue stem cells include hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells.
  • Tissue stem cells of the nervous system include neural stem cells and retinal stem cells.
  • "somatic cells” are cells other than germ cells such as eggs and sperm, and refer to all cells that do not directly transfer their DNA to the next generation. Somatic cells usually have limited pluripotency or disappear.
  • the somatic cell used in the present specification may be a naturally occurring one or a genetically modified one.
  • Cells can be classified into ectoderm, mesoderm and endoderm-derived stem cells according to their origin.
  • the cells derived from the ectoderm mainly exist in the brain, and include neural stem cells and the like.
  • Mesodermal-derived cells mainly exist in the bone marrow, and include vascular stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and the like.
  • Endoderm-derived cells are mainly present in organs and include hepatic stem cells and ⁇ stem cells.
  • somatic cells can be from any germ layer.
  • lymphocytes, spleen cells or testis-derived cells can be used as body cells.
  • isolated refers to a substance that naturally accompanies at least a reduced amount in a normal environment, and preferably is substantially free of the substance.
  • an isolated cell refers to a cell that is substantially free from other attendant materials (eg, other cells, proteins, nucleic acids, etc.) in its natural environment.
  • isolated refers to, for example, when substantially free of cellular material or culture medium when produced by recombinant DNA technology, and when chemically synthesized.
  • the isolated nucleic acid is preferably a sequence that naturally flanks the nucleic acid in the organism from which it is derived (ie, the sequence IJ located at the 5 'and 3' ends of the nucleic acid). Not included.
  • an "established” or “established” cell is a cell that maintains a specific property (eg, pluripotency) and A state in which stable growth is maintained. Therefore, the established stem cells maintain pluripotency.
  • a specific property eg, pluripotency
  • the term "differentiated (cell)” refers to a cell having a specialized function and morphology (eg, a muscle cell, a nerve cell, and the like). No or almost no gender.
  • the differentiated cells include, for example, epidermal cells, parenchymal cells, duct cells, hepatocytes, blood cells, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, osteoblasts, skeletal myoblasts, nerve cells, vascular endothelial cells, and pigments Cells, smooth muscle cells, adipocytes, bone cells, chondrocytes, etc.
  • the present invention relates to a medicament for introducing an active ingredient into cells (for example, a medicament such as a vaccine, a health food, a medicament in which protein or lipid has reduced antigenicity), a cosmetic, a pesticide, a food, and the like.
  • a medicament for introducing an active ingredient into cells
  • a medicament for example, a medicament such as a vaccine, a health food, a medicament in which protein or lipid has reduced antigenicity
  • a cosmetic for introducing an active ingredient into cells
  • Such medicaments and cosmetics may further include pharmaceutically acceptable carriers and the like.
  • the pharmaceutically acceptable carrier contained in the medicament of the present invention includes any substance known in the art.
  • Such suitable formulation materials or pharmaceutically acceptable carriers include antioxidants, preservatives, colorants, flavors, and diluents, emulsifiers, suspending agents, solvents, fillers, Quantities, buffers, delivery vehicles, diluents, excipients and Z or pharmaceutical adjuvants include but are not limited to.
  • the medicament of the invention will be administered in the form of a composition comprising the compound, or a variant or derivative thereof, together with one or more physiologically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • suitable vehicles may be water for injection, physiological solutions, or artificial cerebrospinal fluid, which may be supplemented with other materials common in compositions for parenteral delivery. is there.
  • an acceptable carrier, excipient, or stabilizer is non-toxic to recipients, and is preferably inert at the dosages and concentrations employed.
  • Exemplary suitable carriers include neutral buffered saline, or saline mixed with serum albumin.
  • the product is a suitable excipient (eg, For example, sucrose is used as a lyophilization agent.
  • suitable excipient eg, sucrose is used as a lyophilization agent.
  • Other standard carriers, diluents and excipients may be included as desired.
  • Other exemplary compositions include Tris buffer at pH 7.0-8.5 or acetate buffer at ⁇ 4.0-5.5, which further includes sorbitol or a suitable alternative thereof. obtain.
  • the present invention when used as a medicament, such a medicament can be administered orally or parenterally. Alternatively, such a medicament may be administered intravenously or subcutaneously.
  • the medicament used in the present invention may be in the form of a pyrogen-free, pharmaceutically acceptable aqueous solution. Preparation of such a pharmaceutically acceptable composition can be easily performed by those skilled in the art by considering ⁇ , isotonicity, stability, and the like.
  • the administration method includes oral administration, parenteral administration (e.g., intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, mucosal administration, rectal administration, vaginal administration, local administration to the affected area). , Dermal administration, etc.). Formulations for such administration may be provided in any form. Such preparations include, for example, solutions, injections, and sustained-release preparations.
  • the medicament of the present invention may contain a physiologically acceptable carrier, excipient or stabilizing agent (Japanese Pharmacopoeia, 14th edition or its latest edition, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, AR Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990, etc.) and a composition having the desired degree of purity, prepared and stored in the form of a lyophilized cake or aqueous solution. Can be done.
  • a physiologically acceptable carrier Japanese Pharmacopoeia, 14th edition or its latest edition, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, AR Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990, etc.
  • a composition having the desired degree of purity prepared and stored in the form of a lyophilized cake or aqueous solution. Can be done.
  • the amount of the composition used in the treatment method of the present invention depends on the purpose of use, the target disease (type, severity, etc.), the age, weight, sex, medical history, cell morphology or type of the patient, etc. It can be easily determined by a person skilled in the art in consideration of the above.
  • the frequency of applying the treatment method of the present invention to a subject (or patient) also depends on the purpose of use, the target disease (type, severity, etc.), the age, weight, sex, medical history, and course of treatment of the patient. A person of ordinary skill in the art can easily make a decision in consideration of the above. Frequency may include, for example, administration once every few months (eg, once a week—once a month). It is preferable to administer once a week to once a month while observing the progress.
  • a composition for increasing the efficiency of introducing a target substance into cells including a cell adhesion-related factor.
  • substances that are rarely introduced into cells under normal conditions e.g., DNA, RNA, polypeptides, sugar chains, or a complex thereof
  • cell adhesion-related factors typically, integrin.
  • the above-mentioned object was achieved by unexpectedly finding that the introduction of an antibody against the antibody) promotes the introduction.
  • cell adhesion-related factors would have a remarkable effect on promoting the transduction efficiency during genetic manipulation using DNA such as transfection.
  • the present invention should be noted as providing a significant breakthrough, especially in genetic research.
  • the cell adhesion-related factor used in the present invention includes an interacting substance that interacts with a cell adhesion molecule (eg, extracellular matrix, integrin receptor, RGD molecule, etc.).
  • a cell adhesion molecule eg, extracellular matrix, integrin receptor, RGD molecule, etc.
  • the interacting substance used in the present invention reacts with an antigen-antibody reaction with a partner of a cell adhesion molecule. Therefore, the interacting substance of the present invention may be an antibody (for example, monoclonal antibody, polyclonal antibody, etc.) or a derivative thereof (chimeric antibody).
  • an antibody for example, monoclonal antibody, polyclonal antibody, etc.
  • a derivative thereof chimeric antibody
  • the interacting substance includes an antibody selected from the group consisting of an anti-CD49a antibody, an anti-CD49b antibody, an anti-CD49c antibody, an anti-CD49e antibody and an anti-CD49f antibody.
  • an antibody selected from the group consisting of an anti-CD49a antibody, an anti-CD49b antibody, an anti-CD49c antibody, an anti-CD49e antibody and an anti-CD49f antibody.
  • Such antibodies are preferred because they unexpectedly increase the efficiency of cell transfer of genetic material (DNA).
  • DNA genetic material
  • a substrate such as an extracellular matrix to adhesion via integrins including CD49a-i3 ⁇ 4r.
  • Adhesion through such cell adhesion-related factors has a favorable effect on cells, in this case, in particular, increases the efficiency of cell transfer of genetic material (DNA). Observed (prior patent or reference).
  • an anti-CD49 antibody as an adhesion substrate is presumed to indicate a function that mimics this effect. Therefore, an antibody against a molecule called anti-integrin containing CD49a-fr3 ⁇ 4 related to CD49 can also be mentioned as a preferred embodiment of the present invention.
  • the target substance targeted in the present invention includes genetic material (eg, a nucleic acid molecule such as DNA or RNA).
  • genetic material eg, a nucleic acid molecule such as DNA or RNA.
  • DNA include, but are not limited to, plasmid DNA, naked DNA, cDNA, and genomic DNA.
  • the integrin receptor contemplated in the present invention is selected from the group consisting of CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, and CD29 force (eg, CD29, CD49a , CD49c, CD49d, CD49e and CD49f).
  • CD29 force eg, CD29, CD49a , CD49c, CD49d, CD49e and CD49f.
  • CD29 is also preferred because, by nature, attaching cells using a substrate such as extracellular matrix results in integrin-mediated attachment.
  • CD29 is the beta subunit of the integrin receptor and a common unit of many integrin receptors.
  • Adhesion via such cell adhesion-related factors has a favorable effect on cells, in which case, in particular, an increase in the efficiency of cell transfer of genetic material (DNA) is observed (prior patents or references). Therefore, the use of an anti-CD29 antibody as an adhesion substrate can be presumed to indicate a function that mimics this effect.
  • the integrin receptor may interact with a molecule selected from the group consisting of collagen, fibronectin, vitronectin and laminin.
  • the cells targeted by the present invention may include at least one cell selected from the group consisting of stem cells and differentiated cells.
  • both stem cells and differentiated cells can be targeted.
  • the cell adhesion molecule is one that is specifically expressed in the cell.
  • Such cell-specific adhesion molecules can be those known in the art, or can be identified by those skilled in the art using any well-known techniques. The ability to do S.
  • the target substance used in the present invention is a genetic substance, and it is advantageous to further include a gene transfer reagent.
  • Genetic material is usually DNA, which can be genetic material suitable for a gene transfer reagent.
  • the composition of the present invention preferably further comprises a gene transfer reagent. This is because by including such a gene transfer reagent, the effect of increasing the transfer efficiency of the present invention is synergistically exhibited.
  • the gene introduction reagent used in the present invention can be selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, and calcium phosphate.
  • the gene transfer reagent include, but are not limited to, Effectene, TransFast, TfxTM-20, SuperFect, PolyFect, LipofectAMINE 2000, JetPEI, and ExGen500. Li pofectAMINE 2000 force S preferred ,. This is because gene transfer efficiency is high.
  • the composition of the present invention further comprises particles. This is because by including the particles, the substance can be efficiently introduced into the cell, particularly, the targeted introduction. Preferred examples of such particles include, but are not limited to, metal colloids such as gold colloid.
  • the composition of the present invention further comprises a salt. While not wishing to be bound by theory, the inclusion of such a salt may enhance the anchoring effect when a support is used, or may allow the three-dimensional structure of the target material to be more appropriately shaped. It is considered that the effect retained by
  • any salt can be used as long as it is an inorganic salt or an organic salt.
  • the cell adhesion-related factor contained in the composition of the present invention is an antibody of an integrin receptor or a variant or fragment thereof.
  • an antibody of the integrin receptor or a variant or a fragment thereof unexpectedly has a target substance-introducing effect.
  • the extracellular matrix protein has the effect of increasing the efficiency of introducing a substance into cells.
  • a polypeptide (for example, an integrin) considered in the present invention has a polypeptide having an amino acid sequence known in the art, or a modified sequence thereof, and has a biological activity. It may be a polypeptide.
  • the number of substitutions, additions and deletions in the modified sequence is limited, for example, 50 or less, 40 or less, 30 or less, 20 or less, 15 or less, 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, preferably 2 or less.
  • the number of such substitutions, additions and Zs or deletions may be one or several. Lesser numbers of substitutions, additions and deletions are preferred, but higher numbers so long as they retain the biological activity (preferably have similar or substantially the same activity as the cell adhesion-related factor). May be.
  • allelic variants of the polypeptide are used and may have at least 90% homology with the sequence on which the comparison is based. For example, in the same strain, it is preferable that such allelic variants have at least 99% homology.
  • the species homologue is present in the gene sequence database of the species, the homologue of the species or the extracellular matrix protein of the present invention, the entire integrin receptor (eg, CD49 family) gene sequence or It can be identified by searching a part as a query sequence.
  • the gene of the present invention can be identified by screening a gene library of the species using all or a part of the gene of the present invention as a probe or a primer. Such identification methods are well known in the art and have been described in the literature described herein.
  • the species homolog has, for example, at least about 30% homology with the original sequence. Species homology preferably has at least about 50% homology with the original sequence.
  • the species homolog preferably has at least about 30% homology with the original sequence.
  • the species homolog preferably has at least about 50% homology with the original sequence.
  • the concentration of the cell adhesion-related factor can be easily determined by those skilled in the art with reference to the description in the present specification.
  • an example of such a concentration is at least about 0.1 / ig // L, preferably about 0.2 / ig / L, and more preferably 0.5 / ig // L. It is.
  • OzgZxL may be a preferred concentration range, since concentrations above about 0.5 zg / zL reach a plateau.
  • the present invention provides a kit for increasing gene transfer efficiency.
  • a kit comprises (a) a composition comprising a cell adhesion-related factor; and (b) a gene transfer reagent.
  • the cell adhesion-related factor the form described in detail in the above-described composition for increasing the efficiency of introduction of a target substance into a cell of the present invention can be applied.
  • Such a form can be selected by a person skilled in the art based on the description in the present specification, and can be performed.
  • such a kit may further comprise instructions. This instruction may be, but is not limited to, written in accordance with the format prescribed by the regulatory agency of the country in which the invention is implemented and approved by that regulatory agency.
  • Cell adhesion-related factors those skilled in the art can arbitrarily select a form to be applied in a composition for increasing the efficiency of introducing a target substance into cells of the present invention, as described above.
  • the invention can be implemented.
  • the cell adhesion-related factor may be an antibody of the integrin receptor or a variant or fragment thereof.
  • an antibody selected from the group consisting of an anti-CD49a antibody, an anti-CD49b antibody, an anti-CD49c antibody, an anti-CD49e antibody and an anti-CD49f antibody, a fragment thereof, or a variant thereof can be used.
  • the present invention provides a composition for increasing the efficiency of introducing a target substance into cells.
  • a target substance for example, DNA, RNA, polypeptide, sugar chain, or a complex substance thereof
  • the present invention has been completed by unexpectedly finding that induction is promoted by the action of a cell adhesion-related factor (typically, an antibody of an integrin receptor). It is provided in the form of a composition containing a target substance and a cell adhesion-related factor.
  • the cell adhesion-related factor may be an antibody to an integrin receptor or a variant thereof. More preferably, an antibody selected from the group consisting of an anti-CD49a antibody, an anti-CD49b antibody, an anti-CD49c antibody, an anti-CD49e antibody and an anti-CD49f antibody, or a fragment thereof or a variant thereof can be used.
  • the target substance contained in the composition for introducing the target substance of the present invention into a cell preferably includes, for example, DNA, RNA, polypeptide, sugar, and a complex thereof. It is not limited to.
  • DNA is selected as the target. When such DNA is used for gene expression, it is preferable to encode the gene of interest. Therefore, in an embodiment intended for transfection, the target substance comprises a DNA encoding the gene sequence to be transfected.
  • RNA is selected as the target substance. When such RNA is intended for gene expression, it preferably encodes the gene of interest. In this case, it is preferable to use RNA encoding the gene sequence together with a gene transfer agent suitable for RNA.
  • the composition for introducing a target substance of the present invention into cells may further contain a gene introduction reagent. While not being bound by theory, in one embodiment, such a gene transfer reagent and the cell adhesion-related factor found in the present invention act in unison to achieve an unprecedented efficient gene. Is thought to be introduced into cells.
  • such a gene transfer reagent that can be contained in the composition of the present invention includes, for example, cationic polymers, cationic lipids, polyamine-based reagents, polyimine-based reagents, calcium phosphate, and the like.
  • the composition for introducing the target substance of the present invention into cells may exist as a liquid phase. When present as a liquid phase, the invention is useful, for example, as a liquid phase transfer system.
  • the composition for introducing the target substance of the present invention into cells may exist as a solid phase.
  • the invention is useful, for example, as a solid phase transfection system.
  • Preferred embodiments of the solid phase transfer extrusion include, but are not limited to, a transfer extrusion system using a microtiter plate, or a transfer extrusion system using an array (or chip). . These liquid and solid forms are also useful when introducing polypeptides.
  • the present invention also provides a device for increasing the efficiency of introducing a target substance into cells.
  • a composition comprising A) a target substance; and B) a cell adhesion-related factor is immobilized on a solid support.
  • the device of the present invention is characterized in that a target substance that is hardly introduced into cells under normal conditions (for example, DNA, RNA, polypeptide, sugar chain, or a complex substance thereof) is a cell adhesion-related factor (typically, It has been completed by unexpectedly finding that the introduction is promoted by the action of an integrin receptor antibody or a variant thereof).
  • the present invention provides a target substance and a cell adhesion-related factor.
  • the cell adhesion-related factor may be an antibody to an integrin receptor or a variant thereof. More preferably, an antibody selected from the group consisting of an anti-CD49a antibody, an anti-CD49b antibody, an anti-CD49c antibody, an anti-CD49e antibody and an anti-CD49f antibody, or a fragment thereof or a variant thereof can be used.
  • the target substance included in the device of the present invention preferably includes, but is not limited to, for example, DNA, RNA, polypeptide, sugar, and a complex thereof. What? In certain preferred embodiments, DNA is selected as the target substance. When such DNA is used for gene expression, it is preferable to encode the desired gene. Therefore, in an embodiment for transfection, the target substance includes DNA encoding a gene sequence to be transfused.
  • the device of the present invention may further include a gene transfer reagent.
  • a gene transfer reagent and the cell adhesion-related factor found in the present invention cooperate to produce an unprecedented efficient intracellular gene. It is thought that it will be introduced.
  • the composition is immobilized on the solid support, it is preferable to use a gene transfer reagent that is compatible with the solid support.
  • the solid support used in the device of the present invention is selected from the group consisting of a plate, a microplate, a chip, a slide glass, a finolem, a bead, and a metal. May be.
  • a device of the invention when a device of the invention uses a chip as a solid support, such a device may also be referred to as an array.
  • biomolecules to be introduced eg, DNA, protein, etc.
  • transfer execution arrays those intended for transfer execution are also referred to herein as transfer execution arrays.
  • the composition, device, and method using the cell adhesion-related factor of the present invention achieve an unprecedented effect of providing a transfection array that can be performed with any cell. Will be.
  • the solid support used in the device of the present invention is preferably coated.
  • the coating improves the quality of the solid support and the substrate (for example, increases the service life, improves the environmental resistance such as acid resistance), the affinity for the substance to be bound to the solid support or the substrate, and This is because the affinity for cells is increased.
  • poly-L-lysine, silane eg, APS (—aminopropyl silane)
  • MAS aminopropyl silane
  • hydrophobic fluoropolymer epoxy silane
  • a coating agent containing a silane such as mercaptosilane or a metal such as gold is used.
  • the coating is poly L lysine.
  • the present invention provides a method for increasing the efficiency of introducing a target substance into cells.
  • the present invention presents a target substance (for example, DNA, RNA, polypeptide, sugar chain, or a complex substance thereof) which is hardly introduced into a cell under normal conditions to a cell together with a cell adhesion-related factor (preferably, This is an invention that has been completed by first finding an effect that the target substance is efficiently introduced into cells by contact. Therefore, the method of the present invention comprises, in any order, A) a step of providing a target substance; B) a step of providing a cell adhesion-related factor; and C) contacting the target substance and the cell adhesion-related factor with the cell. The method further includes a step.
  • the target substance and the cell adhesion-related factor may be provided together or separately.
  • the forms described in detail in the above-described composition for increasing the efficiency of introduction of the target substance into cells of the present invention can be applied.
  • those skilled in the art can select and implement an appropriate form based on the description in this specification. Therefore, as such a cell adhesion-related factor, those skilled in the art can arbitrarily select a form to be applied in a composition for increasing the efficiency of introducing the target substance of the present invention into a cell, and determine the present invention.
  • the cell adhesion-related factor can be an integrin receptor antibody or a variant thereof.
  • an antibody selected from the group consisting of an anti-CD49a antibody, an anti-CD49b antibody, an anti-CD49c antibody, an anti-CD49e antibody and an anti-CD49f antibody, or a fragment thereof or a variant thereof can be used.
  • the target substance used in the method of the present invention preferably includes, but is not limited to, for example, DNA, RNA, polypeptide, sugar, and complexes thereof.
  • DNA is selected as the target substance.
  • the target substance comprises DNA encoding the gene sequence to be transfected.
  • the method of the present invention employs a gene transfer reagent. It may also be used. Without being bound by theory, in one embodiment, such a gene transfer reagent and the cell adhesion-related factor found in the present invention act in synergy to provide a cell with an unprecedented efficient gene. It is thought that it will be introduced inside.
  • the provision of the gene transfer reagent may be together with or separate from the target substance and / or the cell adhesion-related factor.
  • such a gene transfer reagent that can be used in the method of the present invention includes, for example, a cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine-based reagent, a polyimine-based reagent, and calcium phosphate. But not limited to them.
  • the target cells in the present invention may include any cells as long as the target substance is introduced, and examples include stem cells and somatic cells.
  • a remarkable effect of the present invention is that the introduction of a target substance such as transfection is almost uniformly achieved in any cells regardless of the type of cells such as stem cells and somatic cells. This is an unexpected effect that the law did not have.
  • the subject may include, but is not limited to, tissue stem cells, and embryonic stem cells may also be included as the subject. Without being bound by theory, among stem cells, tissue stem cells appear to have a higher transduction efficiency than embryonic stem cells.
  • the target substance cell introduction method of the present invention can be partially or entirely performed in a liquid phase. In another specific embodiment, the target substance cell introduction method of the present invention can be performed partially or entirely on a solid phase. Therefore, the target substance cell introduction method of the present invention can be performed in a combination of a liquid phase and a solid phase.
  • the present invention provides a method for increasing the efficiency of introducing a target substance into cells using a support.
  • the present invention provides a method for immobilizing a target substance (e.g., DNA, RNA, polypeptide, sugar chain, or a complex substance thereof) that is hardly introduced into cells under normal conditions on a support, Present to (good More preferably, the present invention has been completed by first finding an effect that the target substance is efficiently introduced into cells by contact.
  • the effect of increasing the introduction efficiency of the target substance (particularly DNA, preferably DNA containing the sequence encoding the gene to be transfected) on the support is not achievable with the prior art, and is not achieved.
  • the method using the solid support of the present invention comprises a step of immobilizing a composition comprising I) A) a target substance; and B) a cell adhesion-related factor on a support; Contacting the cells with the composition.
  • a cell adhesion-related factor the form described in detail in the composition for increasing the efficiency of introduction of the target substance of the present invention into cells can be applied.
  • those skilled in the art can select and implement an appropriate form based on the description in this specification. Therefore, as such a cell adhesion-related factor, those skilled in the art can arbitrarily select a form to be applied in a composition for increasing the efficiency of introducing the target substance of the present invention into cells, and carry out the present invention. That can be S.
  • the cell adhesion-related factor may be an integrin receptor antibody or a variant thereof. More preferably, an antibody selected from the group consisting of an anti-CD49a antibody, an anti-CD49b antibody, an anti-CD49c antibody, an anti-CD49e antibody and an anti-CD49f antibody, or a fragment thereof or a variant thereof can be used.
  • the DNA When used as a target substance, the DNA may be provided naked (Naked DNA), but is preferably provided using a vector (plasmid) together with control sequences (promoter and the like). possible. In such cases, it is preferred that the DNA be operably linked to the control sequence.
  • the method of the present invention also preferably further comprises the step of providing a gene transfer reagent, wherein the gene transfer reagent is provided to be contacted with a cell.
  • a gene transfer reagent is preferred in the method of the present invention, since the transfer efficiency is further improved.
  • the provision of a gene introduction reagent is well known in the art, and includes, but is not limited to, for example, adding a solution in which a gene introduction reagent is dissolved to an experimental system.
  • the gene transfer reagent forms a complex with the target substance DNA, and then provides a cell adhesion-related factor. Without being bound by theory, taking this order This is because it has been found that the efficiency of introducing a target substance into cells on a solid support is dramatically increased.
  • the gene transfer reagent (eg, cationic lipid) -target substance conjugate comprises a target substance (eg, DNA in an expression vector) and a gene transfer reagent, which may be water or deionized. Dissolved in a suitable solvent such as water. This solution is spotted on a surface such as a slide, thereby generating a surface to which the gene transfer reagent-target substance complex is attached at a specific position. Thereafter, a cell adhesion-related factor is appropriately added. The spotted transfection reagent-target substance conjugate is attached to the slide and dried sufficiently so that the spot remains in this attached position under the conditions used in subsequent steps of the method.
  • a target substance eg, DNA in an expression vector
  • a gene transfer reagent which may be water or deionized. Dissolved in a suitable solvent such as water. This solution is spotted on a surface such as a slide, thereby generating a surface to which the gene transfer reagent-target substance complex is attached at a
  • the transfection reagent-target substance conjugate is coated on a slide or chip, such as a glass slide coated with poly-L-lysine (available from Sigma, Inc., Inc.), eg, manually or on a microarray. Spot using a manufacturing machine. The DNA spots can then be attached to the slide by drying the slide or chip at or above room temperature or under reduced pressure. The length of time required for sufficient drying to occur depends on several factors, such as the amount of mixture placed on the surface and the temperature and humidity conditions used. In the present invention, the cell adhesion-related factor is preferably provided after the complex is attached.
  • the concentration of DNA present in the mixture is determined experimentally for each application, but generally ranges from about 0.01 / 1 ⁇ // 11 to about 0.2 ⁇ // ⁇ 1. In a particular embodiment, it is about 0.102 / 1 ⁇ // 11 to about 0.10 gZ / l.
  • the concentration of DNA present in the gene transfer reagent-target substance complex is about 0.01 / 1 ⁇ / 1 to about 0.5 / 1 ⁇ // 11, about 0.1 Olugu 1 to about 0.4. ⁇ g / ⁇ l, and the stirrer may be 0.3 Olgu u 1 force, 0.3 ugu.
  • the concentration of cell adhesion-related factors, or other carrier macromolecules, such as gene transfer reagents is determined empirically for each application, but typically ranges from 0.01% to 0.5%. In certain embodiments, about 0.05% force, about 0.5%, about 0.05% force, about 0.2%, or about 0.1% to about 0.2%.
  • the final concentration of DNA in the cell adhesion-related factor-target substance complex is generally about 0.02 ⁇ gZ ⁇ 1 force, about 0.1 ⁇ g / ⁇ 1
  • the DNA is It can be a final DNA concentration equal to about 0.05 / g // l.
  • the vector can be of any type, such as a plasmid or a virus-based vector, in which the DNA of interest (to be expressed in cells) DNA) can be introduced and then expressed in the cell.
  • a vector for example, a CMV-driven expression vector can be used.
  • plasmid-based or virus-based vectors such as pEGFP (Clontech) or pcDNA3 (Invitrogen) may be used.
  • the surface with the spot is coated with an appropriate amount of a lipid-based transfection reagent, and the resulting product Is maintained under conditions appropriate for complex formation between the DNA in the spot and the gene transfer reagent (eg, a transfection reagent such as a cationic lipid).
  • the gene transfer reagent eg, a transfection reagent such as a cationic lipid
  • the cell adhesion-related factor is provided thereafter, or at the same time the cell adhesion-related factor is provided.
  • the resulting product is incubated at 25 ° C for about 20 minutes.
  • the gene transfer reagent is removed, a surface with DNA (DNA in complex with the transfection reagent) is generated, and cells in a suitable culture are plated on the surface.
  • the resulting product (the surface with the DNA and the plated cells) is maintained under conditions that cause entry of the DNA into the plated cells.
  • transfection efficiency expression of the encoded product, effects on cells, and the like can be evaluated using known methods. For example, detection of immunofluorescence, or enzyme immunocytology, in situ hybridization, autoradiography, or other methods of detecting the expression of DNA or the effects of the encoded product or DNA itself on the introduced cells. By the means described above, the above parameter can be determined.
  • antibodies that bind to the protein and are fluorescently labeled e.g., The slide is digested under conditions appropriate for binding of the body to the protein), and the location containing the protein (spot or area on the surface) is identified by detecting fluorescence.
  • the presence of the fluorescent light indicates that transfection has occurred at defined locations that exhibit fluorescence and that the encoded protein has been expressed.
  • the presence of a signal on the slide, detected by the method used indicates that expression of the transfection and encoded product or DNA transfer in the cell has occurred at the particular location where the signal was detected.
  • the identity of the DNA present at each particular location may be known or unknown; thus, when expression occurs, the identity of the expressed protein may be known or unknown. Good. Preferably, such information is known. This is because it can be correlated with conventional information.
  • Various cell adhesion-related factors were prepared as candidates for cell adhesion-related factors.
  • the preparations in this example are as follows.
  • Antibodies were prepared by using commercially available antibodies or by raising antibodies against the integrin receptor.
  • As the polypeptide a commercially available product or a product produced by genetic manipulation was used.
  • the CD29 and CD49 families can also be prepared using the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 3 to 14 for raising antibodies.
  • Fibronectin SEQ ID NO: 1
  • CD49a antibody IMMUN ⁇ TECH (a coulter company), france, monoclonal antibody CD49a—VLA alfal Cat. No. 1599 // COSMOBIO, Japan, mouse—ANTIratCD49a).
  • CD49b antibody (IMMUNOTECH (a coulter company), france, monoclonal antibody CD49b Cat. No. 0717).
  • CD49c antibody IMMUN ⁇ TECH (a coulter company), france, monoclonal antibody CD49c Cat. No2000).
  • CD49d antibody IMMUNOTECH (a coulter company), france, monoclonal antibody CD49d Cat. No0764 // ENDOGEN, USA, mouse—ANTIratCD49d).
  • CD49e antibody (IMMUNOTECH (a coulter company), france, monoclonal antibody CD49e Cat. No. 0771).
  • CD49f antibody IMMUN ⁇ TECH (a coulter company), france, monoclonal antibody CD49f Cat. No. 0769 // AntigenixAmerica, USA, mouse—ANTIratCD49f, PRO. NO. MR49662C.
  • CD29 antibody (IMMUNOTECH (a coulter company), france, monoclonal antibody CD29 Cat. Nol 5: 0.
  • the solution obtained by reconstituting these antibodies and cell adhesion-related factors in the specified manner and dose was diluted 100 to 5000 times with PBS, and then seeded on a glass slide surface and dried. After drying, wash well with PBS and print the gene transfer reagent and gene complex on it. The target cells are seeded on these glass slides and the solid phase gene transfer method is performed.
  • An anti-rat monoclonal antibody was used for PC12 cells and the like.
  • FIG. 1 shows the relationship between the integrin receptor and the recognized extracellular matrix.
  • a plasmid for transfection was prepared as DNA.
  • plasmids pEGFP-Nl and pDsRed2-Nl (both BD Biosciences, Clontech, CA, USA) were used.
  • gene expression is under the control of cytomegalovirus (CMV).
  • Plasmid DNA was amplified and amplified in E. coli (XLl blue, Stratgene, TX, USA) and used as one of the complex partners. DNA was dissolved in distilled water containing neither DNase nor RNase.
  • the transfection reagents used are as follows: Effectene Transfection Reagent (cat. No. 301425, Qiagen, CA), TransFastTM Transfection Reagent (E2431, Promega, WI), TfxTM-20 Reagent (E2391, Promega, WI), SuperFect Transfection Reagent (301305, Qiagen, CA), PolyFect Transfection Reagent (301 105, Qiagen, CA), LipofectAMINE 2000 Reagent (1 1668-019, Invitrogen corporation, CA), JetPEI (X4) cone. (101 — 30, Polyplus—transfection, France) and ExGen 500 (R0511, Ferment as Inc., MD). The power that seems to be preferable to use LipofectAMINE 2000 is not limited to that.
  • the transfusion reagent was added to the above-mentioned DNA and the cell adhesion-related factor or used after forming a complex with DNA.
  • PC12 rat pheochromocytoma cells: ATCC CRL-1721
  • PC12 rat pheochromocytoma cells: ATCC CRL-1721
  • DMEM / l 0% calf serum GIBCO
  • Transfection reagents should be used according to the manufacturer's instructions.
  • Plasmid DNA Glycerol stock was grown in lOOmL L_amp and purified using Qia prep Miniprep or Qiagen Plasmid Purification Maxi according to the standard protocol provided by the manufacturer.
  • RIKEN Cell Bank JPN. These are DMEM containing L_glut and pen / strep
  • the transfection reagent and DNA are mixed to form a DNA-transfection reagent complex. Since some time is required for complex formation, the mixture
  • the cell adhesion-related factor may be used at the time of forming the complex, but in this example, it was physically coated on a solid support (for example, poly-L-lysine slide). Reconstitute these antibodies' Itoda cell adhesion-related factor with the specified dosage and administration in PBS at 100-5000. After dilution by a factor of 1, the cells were seeded on a glass slide surface and dried. After drying, wash well with PBS and print the gene transfer reagent and gene complex on it. The target cells were seeded on these glass slides and subjected to solid-phase gene transfer.
  • a solid support for example, poly-L-lysine slide.
  • Cells were distributed for transfatate. This distribution was usually performed by suctioning the reagent under reduced pressure in a hood. The slide was placed on the dish and the solution containing the cells was added for transfection.
  • the distribution of cells is as follows.
  • Proliferating cells were distributed such that the cell concentration was 10 7 cells in 25 mL. Cells were plated on slides in square 100 0 100 1 5111111 Petri dishes or 100111111 15 mm circular dishes. The transfection was allowed to proceed for about 40 hours. This is about two cell cycles. Slides were processed for immunofluorescence.
  • Evaluation of gene transfer was achieved, for example, by immunofluorescence, fluorescence microscopy, laser scanning, radiolabeling and detection using sensitive films or emulsions.
  • the expressed proteins to be visualized are fluorescent proteins, they can be viewed by fluorescence microscopy and photographed.
  • the slide can be scanned with a laser scanner for data storage. If a fluorescent antibody can detect the expressed protein, an immunofluorescence protocol can be followed. If the detection is based on radioactivity, the slides can be attached as indicated above, and the radioactivity detected by autoradiography using film or emulsion.
  • FIG. 2A shows the results of using various cell adhesion-related factors and fibronectin when using HepG2 cells as an example.
  • FIG. 2B shows, as another example, the results of the transfusion efficiency using different cell adhesion-related factors (HLA, CD46 and CD54) in an experiment using HepG2 cells.
  • FIG. 3A shows the relationship between various integrin receptors (CD49a, d, f) expressed on HepG2 cells and the recognized extracellular matrix, and the transfusion efficiency on each extracellular matrix-coated surface.
  • FIGS. 3B-3E show changes in cells after transfection when various cell adhesion-related factors are coated.
  • PC12 cells which are known as nerve-like cells
  • nerve-like cells it was observed whether or not the effect of the cell adhesion-related factor of the present invention can be observed in differentiated cells.
  • various reagents and cells were prepared. However, PC12 cells followed the following procedure.
  • PC12 rat pheochromocytoma cells: ATCC CRL-1721
  • DMEM / lO containing L_glut and pen / strep. / 0 calfserum GEBCO
  • Growing cells were distributed such that the cell concentration was 10 7 cells in 25 mL.
  • Cells were plated on slides in square 100 ⁇ 100 ⁇ 15 mm Petri dishes or circular dishes of radius 100 mm ⁇ 15 mm. The transfusion was allowed to proceed for about 48 hours. Slides were processed for immunofluorescence.
  • FIGS. FIG. 4 shows a result similar to FIG. 3A in Example 3. As can be seen, it was revealed that the cell adhesion-related factor of the present invention also increases transfusion efficiency even in PC12 cells, which are less effective with fibronectin.
  • Figs. 5A and 5B show the state of cell adhesion
  • Fig. 6 shows photographs comparing the state of transfection.
  • 5A and 5B show the state of cell adhesion of PC12 cells in Example 4. Inhibition of PC12 cell adhesion to TypelV collagen-coated surface using CD antibody and transfection. TypelV collagen coat on poly-L-lysine coated slide glass. Thereafter, PC12 cells which had been brought into contact with the antibody solution in advance were seeded, and transfection was performed using Lipofectamin2000 according to a normal (liquid phase system) protocol.
  • Figure 5A shows that anti-CD49a markedly inhibited the adhesion of PC12 cells to the TypelV collagen-coated surface.
  • the anti-CD49d does not inhibit the adhesion of PC12 cells and shows the same transfection efficiency as the control without antibody.
  • PC12 cells do not express CD49d as is apparent from FIG.
  • CD49d is a receptor for fibronectin, suggesting that the adhesion to the TypelV collagen-coated surface was not inhibited.
  • the presence of the antibody itself does not affect the transfusion efficiency.
  • FIG. 5B also shows the difference in transfusion efficiency in the presence of anti-CD49f. The number shown indicates the number of dilutions of the antibody stock solution and the force with which it was brought into contact with PC12 cells beforehand. As can be clearly seen from the figure, the transfusion efficiency decreases depending on the concentration of the antibody contacted.
  • CD49f is a receptor for laminin.
  • FIG. 7 shows the effect of coating the cell adhesion-related factor on the support. Coating with collagen type IV appears to increase transfer efficiency.
  • FIG. 8 shows an outline of a solid-phase transfection using a cell adhesion-related factor.
  • phase transfer array SPTA
  • the present inventors used differentiated cells (PC12 cells) that were inefficient with HepG2 and fibronectin, by using the method of the present inventors ( Both the solid-phase transfer and the conventional liquid-phase transfer were studied under a series of transfusion conditions.
  • Transfection efficiency The transfection efficiency was determined as the total fluorescence intensity per unit area. Optimum liquid phase results were obtained according to the cell line used. These efficient transfusion reagents were then used to optimize the solid phase protocol. Some trends were observed: easily transfatable cell lines (e.g., HEK293, For HeLa, NIH3T3), the transfer efficiency observed with the solid phase protocol was slightly better than the standard liquid phase protocol, but was achieved at essentially similar levels. I have.
  • the present inventors have successfully realized PC12 cells and an hMSC transfection array in a system using cell adhesion-related factors. This is because of the pluripotent stem cell It will enable high-throughput research in various studies using solid-phase transfer exci- sion, such as elucidation of the genetic mechanism that controls the conversion. The detailed mechanism of solid phase transfer and the methodology related to the use of this technology for high-throughput real-time gene expression monitoring has been shown to be applicable to a variety of purposes.
  • hMSCs human mesenchymal stem cells, PT_2501, Cambrex Bioscience Walkersville, Inc., MD
  • human MSC cells these cells are converted to a commercially available human mesenchymal cell basal medium (MSCGM BulletKit PT-3001, Cambrex Bioscience Walkersville, MD). Inc., MD).
  • Example 4 Similarly to the results of Example 4, the present inventors successfully implemented a transfusion array using human mesenchymal stem cells using a system using cell adhesion-related factors. This will enable high-throughput studies in various studies using solid-phase transfection, such as elucidation of the genetic mechanism that controls the differentiation of pluripotent stem cells. The detailed mechanism of solid-phase transfer and the methodology related to the use of this technique for high-throughput real-time gene expression monitoring has been shown to be applicable to a variety of purposes.
  • SHSY5Y humanneuroblastoma: ATCC CRL-2266
  • Example 4 Similarly to the results of Example 4, the present inventors successfully realized a transfection array for human neuroblastoma using a system using cell adhesion-related factors. This indicates that seeds using solid-phase transfection, such as elucidation of the genetic mechanism that controls the differentiation of cancer cells, have been developed. It will enable high-throughput research in various studies. The detailed mechanism of solid-phase transfer and the methodology related to the use of this technique for high-throughput real-time gene expression monitoring have been shown to be applicable to a variety of purposes.
  • transfusion efficiency increasing reagent is particularly useful for carrying out a transfusion in a solid phase. Therefore, it is useful in any field that uses genetic engineering.

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Abstract

　本発明は、細胞に導入されることが難しい標的物質（例えば、ＤＮＡ、ポリペプチド、糖、あるいはそれらの複合体など）を導入する（特に、トランスフェクション）際に、その導入効率をどのような状況にもとでも改善することができる方法を提供する。標的物質の細胞への導入効率を上昇させるための組成物であって、細胞接着関連因子を含む、標的物質の細胞への導入効率を上昇させるための組成物が提供される。本発明はまた、このような組成物を用いたデバイスおよび方法にも関する。

Description

明 細 書
遺伝子導入効率を上昇させるための組成物および方法
技術分野
[0001] 本発明は、細胞生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、細胞への物質 の導入効率を上げる化合物、組成物、デバイス、方法およびシステムに関する。 背景技術
[0002] タンパク質の細胞への導入、トランスフエクシヨン、形質転換、形質導入などの遺伝 子導入技術を含む標的物質の細胞への導入は、細胞生物学、遺伝子工学、分子生 物学など広レ、分野にぉレ、て広く使用されてレ、る。
[0003] トランスフエクシヨンは、動物細胞などの細胞において一過的に遺伝子を発現させ、 その影響を観察するためなどに利用される技術であり、ポストゲノム時代を迎えた現 在、そのゲノムがコードする遺伝子の機能を解明するために頻繁に利用される技術と なっている。
[0004] トランスフエクシヨンを達成するために種々の技術が開発されており、そのために利 用される薬剤が種々開発されている。そのような技術として、カチォオン性の物質で あるカチオン性ポリマー、カチオン性脂質などを利用する技術があり、広く使用されて いる。
[0005] しかし、従来の薬剤を使用するのみでは、トランスフヱクシヨン効率が十分ではない ことが頻繁に起こっており、固相、液相を問わずに使用することができるような薬剤は 未だに開発されていなレ、。従って、そのような薬剤に対する需要は多大に存在する。 また、マイクロタイタープレート、アレイなどの固相上での標的物質の導入（例えば、ト ランスフエクシヨン）を効率的に行うための技術の開発に対する需要はますます高まる ばかりである。
[0006] 哺乳動物においてドミナントネガティブスクリーニングを開発する際の進行を妨げる もののうちの 1つは、トランスフエタト細胞またはトランスジエニック生物の作製である。 この問題に取り組むための 1つの手段として高効率のレトロウイルストランスフエクショ ンが開発されている。このレトロウイルストランスフエクシヨンは、強力であるが、ウィル ス中間体にパッケージングされる DNAの作製を必要とし、適用性に限界がある。ある いは、高密度トランスフエクシヨンアレイも開発されつつある力 S、これもまた、すべての 細胞に適用可能というわけではなレ、。液相トランスフエクシヨンについても、種々の系 が開発されているものの、付着細胞では効率が悪いなど、すべての細胞に適用可能 というわけではない。
[0007] このように、当該分野において、すべての系および細胞において適用可能な、トラ ンスフヱクシヨン系の開発が望まれている。そのようなトランスフエクシヨン系の開発は 、例えば、マイクロタイタープレート、アレイなどを用いた大規模ハイスループットアツ セィにおいて、種々の細胞および実験系に適用することへの応用が期待されることか ら、その需要は年々高まるば力、りである。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 以上にかんがみて、本発明は、従来拡散あるいは疎水性相互作用によっては細胞 に導入されることが難しい標的物質 (例えば、 DNA、ポリペプチド、糖、あるいはそれ らの複合体など）を導入する（特に、トランスフエクシヨン）際に、その導入効率をどのよ うな状況にもとでも改善することができる方法を開発することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0009] 上記課題は、インテグリンに対する抗体のような細胞接着関連因子を用いた系によ つて標的物質を細胞に導入する効率が飛躍的に上昇することを予想外に見いだした ことによって解決された。上記課題の解決は一部、細胞の接着を阻害することによつ て、遺伝子などの標的物質の導入が予想外に向上し、さらに遺伝物質などでは細胞 内での発現が活性であったことを予想外に見いだしたことにも起因する。
[0010] 従って、本発明は、以下の発明を提供する。
(1)細胞接着関連因子を含む、標的物質の細胞への導入効率を上昇させるための 組成物。
(2)上記細胞接着関連因子は、細胞接着分子と相互作用する相互作用物質を含む 、標的物質の細胞への導入効率を上昇させるための組成物。
(3)上記細胞接着分子は、細胞外マトリクスである、項目 2に記載の組成物。 (4)上記細胞接着分子は、インテグリンレセプターを含む、項目 2に記載の組成物。
(5)上記細胞接着分子は、インテグリンを含む、項目 2に記載の組成物。
(6)上記相互作用物質は、上記細胞接着分子のパートナーと抗原抗体反応する、項 目 1に記載の組成物。
(7)上記相互作用物質は、抗体またはその誘導体である、項目 1に記載の組成物。
(8)上記相互作用物質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、項 目 1に記載の組成物。
(9)上記相互作用物質は、抗 CD49a抗体、抗 CD49b抗体、抗 CD49c抗体、抗 CD 49e抗体および抗 CD49f抗体からなる群より選択される抗体を含む、項目 1に記載 の組成物。
(10)上記標的物質は、遺伝物質を含む、項目 1に記載の組成物。
(11)上記標的物質は、核酸分子を含む、項目 1に記載の組成物。
(12)上記標的物質は、 DNAを含む、項目 1に記載の組成物。
(13)上記インテグリンレセプターは、 CD49a、 CD49b、 CD49c、 CD49d、 CD49e 、 CD49f、ならびに CD29からなる群より選択される、項目 4に記載の組成物。
(14)上記インテグリンレセプターは、 CD29、 CD49a、 CD49c、 CD49d、 CD49e および CD49fからなる群より選択される、項目 4に記載の組成物。
(15)上記インテグリンレセプターは、コラーゲン、フイブロネクチン、ビトロネクチンお よびラミニンからなる群より選択される分子と相互作用する、項目 4に記載の組成物。
(16)上記細胞は、幹細胞および分化細胞からなる群より選択される少なくとも 1つの 細胞を含む、項目 1に記載の組成物。
(17)上記細胞接着分子は、上記細胞に特異的に発現される、項目 1に記載の組成 物。
(18)上記標的物質は、遺伝物質であり、さらに遺伝子導入試薬を含む、項目 1に記 載の組成物。
(19)上記遺伝子導入試薬は、カチオン性高分子、カチオン性脂質およびリン酸カル シゥムからなる群より選択される、項目 18に記載の組成物。
(20)さらに、粒子を含む、項目 1に記載の組成物。 (21)上記粒子は、金コロイドを含む、項目 20に記載の組成物。
(22)さらに、塩を含む、項目 1に記載の組成物。
(23)上記塩は、緩衝剤に含まれる塩類および培地に含まれる塩類からなる群より選 択される、項目 22に記載の組成物。
(24)
遺伝子導入効率を上昇させるためのキットであって、
(a)細胞接着関連因子；および
(b)遺伝子導入試薬、
を備える、キット。
(25)標的物質を細胞内へ導入するための組成物であって、
A)標的物質、
B)細胞接着関連因子、
を含む、組成物。
(26)上記標的物質は、 DNA、 RNA、ポリペプチド、糖およびこれらの複合体からな る群より選択される物質を含む、項目 25に記載の組成物。
(27)上記標的物質は、トランスフエタトされるべき遺伝子配列をコードする DNAを含 む、項目 25に記載の組成物。
(28)さらに、遺伝子導入試薬を含む、項目 25に記載の組成物。
(29)上記細胞接着関連因子は、細胞接着分子と相互作用する相互作用物質を含 む、項目 25に記載の組成物。
(30)上記細胞接着関連因子は、細胞接着分子の抗体を含む、項目 25に記載の組 成物。
(31)液相として存在する、項目 25に記載の組成物。
(32)固相として存在する、項目 25に記載の組成物。
(33)標的物質の細胞への導入効率を上昇させるためのデバイスであって、
A)標的物質；および
B)細胞接着関連因子、
を含み、上記細胞接着関連因子が、支持体に固定された、デバイス。 (34)上記標的物質は、 DNA、 RNA、ポリペプチド、糖およびこれらの複合体からな る群より選択される物質を含む、項目 33に記載のデバイス。
(35)上記標的物質は、遺伝子発現することを目的とする遺伝子配列をコードする D NAを含む、項目 33に記載のデバイス。
(36)遺伝子導入試薬をさらに含む、項目 33に記載のデバイス。
(37)上記細胞接着関連因子は、細胞接着分子と相互作用する相互作用物質を含 む、項目 36に記載のデバイス。
(38)上記細胞接着関連因子は、細胞接着分子の抗体を含む、項目 36に記載のデ バイス。
(39)上記支持体は、プレート、マイクロウヱルプレート、チップ、スライドグラス、フィル ム、ビーズおよび金属からなる群より選択される、項目 36に記載のデバイス。
(40)上記支持体は、コーティング剤でコーティングされる、項目 36に記載のデバイス
(41)上記コーティング剤は、ポリ- L-リジン、シラン、 MAS、疎水性フッ素樹脂およ び金属からなる群より選択される物質を含む、項目 40に記載のデバイス。
(42)標的物質の細胞への導入効率を上昇させるための方法であって、
A)標的物質を提供する工程；
B)細胞接着関連因子を提供する工程；
C)上記標的物質および上記細胞接着関連因子を上記細胞に接触させる工程、 を包含する、方法。
(43)上記標的物質は、 DNA、 RNA、ポリペプチド、糖、およびこれらの複合体から なる群より選択される物質を含む、項目 42に記載の方法。
(44)上記標的物質は、トランスフヱタトされるべき遺伝子配列をコードする DNAを含 む、項目 43に記載の方法。
(45)遺伝子導入試薬を提供する工程をさらに包含し、上記遺伝子導入試薬は、上 記細胞に接触される、項目 42に記載の方法。
(46)上記細胞接着関連因子は、細胞接着分子と相互作用する相互作用物質を含 む、項目 42に記載の方法。 (47)上記細胞接着関連因子は、細胞接着分子の抗体を含む、項目 42に記載の方 法。
(48)上記細胞接着分子は、細胞外マトリクスである、項目 46に記載の方法。
(49)上記工程は、液相中で行われる、項目 42に記載の方法。
(50)上記工程は、固相上で行われる、項目 42に記載の方法。
(51)標的物質の細胞への導入効率を上昇させるための方法であって、
I) A)標的物質と
B)細胞接着分子と
を支持体に固定する工程；および
II)上記支持体上の上記組成物に細胞を接触させる工程、
を包含する、方法。
(52)遺伝子導入試薬を提供する工程をさらに包含し、上記遺伝子導入試薬は、上 記細胞に接触される、項目 51に記載の方法。
(53)上記遺伝子導入試薬の提供後に、上記標的物質と上記遺伝子導入との複合 体を形成する工程をさらに包含し、その後、上記細胞接着関連因子が提供されること を特徴とする、項目 52に記載の方法。
(54)上記細胞接着関連因子は、細胞接着分子と相互作用する相互作用物質を含 む、項目 51に記載の方法。
[0011] 以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該 分野における周知慣用技術力 その実施形態などを適宜実施することができ、本発 明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
発明の効果
[0012] 本発明により、固相でも液相でも実施することができる、トランスフエクシヨンの効率 上昇が達成された。このようなトランスフエクシヨン効率上昇試薬は、特に固相でのトラ ンスフエクシヨンを実施するために有用である。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]図 1は、インテグリンレセプターと、認識される細胞外マトリクスとの関係を示す。
[図 2A]図 2Aは、 HepG2細胞を用いた実験において、種々の細胞接着関連因子お よびフイブロネクチンを用いたトランスフエクシヨン効率の結果を示す。
[図 2B]図 2Bは、 HepG2細胞を用いた実験において、別の細胞接着関連因子を用 いたトランスフエクシヨン効率の結果を示す。
園 3A]図 3Aは、実施例 3における HepG2細胞上に発現する各種インテグリンレセプ ター（CD49a， d， f)と認識される細胞外マトリクスの関係、各細胞外マトリクスコーテ イングされた表面でのトランスフエクシヨン効率を示す。
[図 3B]図 3Bは、 HepG2を用いた実験における、トランスフエクシヨンの様子を示す細 胞写真である。コーティングなしは、コーティングを施していないコントロールであり、
Figure imgf000008_0001
[図 3C]図 3Cは、 HepG2を用いた実験における、トランスフエクシヨンの様子を示す細 胞写真である。 CD44、 CD46および CD54を示す。
[図 3D]図 3Dは、 HepG2を用いた実験における、トランスフエクシヨンの様子を示す細 胞写真である。 CD49a、 CD49cおよび CD49dを示す。
[図 3E]図 3Eは、 HepG2を用いた実験における、トランスフエクシヨンの様子を示す細 胞写真である。 CD49e、 CD49fおよび HLAを示す。
[図 4]図 4は、実施例 4における PC12細胞上に発現する各種インテグリンレセプター (CD49a, d, f)と認識される細胞外マトリクスの関係、各細胞外マトリクスコーティン グされた表面でのトランスフエクシヨン効率を示す。
[図 5A]図 5A— Bには、実施例 4における PC12細胞の細胞接着の様子を示す。細胞 接着関連因子 (例えば、 CD抗体）を用いた PC12細胞の TypelVコラーゲンコート表面 への接着阻害およびトランスフエクシヨンを示す。ポリ- L-リシンコートスライドガラス上 に TypelVコラーゲンコート。その後、あらかじめ抗体溶液を接触させておいた PC12細 胞を播種し通常（液相系）のプロトコールに従い Lipofectamin2000を用いてのトランス フエクシヨンを行った。図 5Aは抗 CD49aにおいては TypelVコラーゲンコート表面へ の PC12細胞の接着が顕著に阻害された。抗 CD49dにおいては PC12細胞の接着 は阻害されず抗体のない Controlと同等のトランスフヱクシヨン効率を示す。 PC12細 胞は図 4より明らかなように CD49dを発現していなレ、。また、 CD49dはフイブロネク チンに対するレセプターであり、このことより TypelVコラーゲンコート表面への接着が 阻害されなかったためと考えられる。つまり、抗体の存在自体はトランスフエクシヨン効 率に影響を与えない。図 5Bは同様に抗 CD49f共存下におけるトランスフエクシヨン 効率違いを示す。表示されている数値は抗体のストック溶液を何倍に希釈してあらか じめ PC12細胞に接触させたかを示している。
[図 5B]図 5A Bには、実施例 4における PC12細胞の細胞接着の様子を示す。細胞 接着ィ関連因子（例えば、 CD抗体）を用いた PC12細胞の TypelVコラーゲンコート表 面への接着阻害およびトランスフエクシヨンを示す。ポリ -L-リシンコートスライドガラス 上に TypelVコラーゲンコート。その後、あらかじめ抗体溶液を接触させておいた PC12 細胞を播種し通常（液相系）のプロトコールに従い Lipofectamin2000を用いてのトラン スフエクシヨンを行った。図 5Aは抗 CD49aにおいては TypelVコラーゲンコート表面 への PC12細胞の接着が顕著に阻害された。抗 CD49dにおいては PC12細胞の接 着は阻害されず抗体のない Controlと同等のトランスフヱクシヨン効率を示す。 PC12 細胞は図 4より明らかなように CD49dを発現していない。また、 CD49dはフイブロネ クチンに対するレセプターであり、このことより TypelVコラーゲンコート表面への接着 が阻害されな力 たためと考えられる。つまり、抗体の存在自体はトランスフエクシヨン 効率に影響を与えない。図 5Bは同様に抗 CD49f共存下におけるトランスフエクショ ン効率違いを示す。表示されている数値は抗体のストック溶液を何倍に希釈してあら かじめ PC12細胞に接触させたかを示している。
[図 6]図 6は、実施例 4における PC12細胞の支持体におけるコーティングのトランスフ ヱクシヨン効果を示す。抗 CD49a抗体、抗 CD49c抗体、抗 CD49d抗体を使用して 行った。
[図 7]図 7は、実施例 4における PC12細胞の支持体におけるコーティングのトランスフ ェクシヨン効果を示す。抗 CD49e抗体、抗 CD49f抗体、抗 HLA抗体を使用して行 つた。
園 8]図 8は、細胞接着関連因子を利用した固相系トランスフエクシヨンの概略を示す 。右下は図 1を同じである。右上は、 3種の抗 CD抗体を用いた蛍光強度分布の結果 である。左には、相対トランスフエクシヨン効率指数を示す。
配列の説明 [0014] 配列番号 1：フイブロネクチンの核酸配列（ヒト）
配列番号 2：フイブロネクチンのアミノ酸配列（ヒト）
配列番号 3： CD 29 (ァイソフォーム 1 A前駆体）のアミノ酸配列
配列番号 4： CD49aのアミノ酸配列
配列番号 5： CD49bのアミノ酸配列
配列番号 6： CD49c (ァイソフォーム a前駆体）のアミノ酸配列
配列番号 7： CD49d (前駆体）のアミノ酸配列
配列番号 8： CD49e (前駆体）のアミノ酸配列
配列番号 9： CD49fのアミノ酸配列
配列番号 10： CD29 (ァイソフォーム 1B前駆体）のアミノ酸配列
配列番号 11： CD29 (ァイソフォーム 1C—1前駆体）のアミノ酸配列
配列番号 12： CD29 (ァイソフォーム 1C—2前駆体）のアミノ酸配列
配列番号 13： CD29 (ァイソフォーム 1D前駆体）のアミノ酸配列
配列番号 14： CD49c (ァイソフォーム b前駆体）のアミノ酸配列
発明を実施するための最良の形態
[0015] 以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及 しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書 において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味 で用いられることが理解されるべきである。
[0016] (用語）
以下に本明細書において特に言及される用語を説明する。
[0017] 本明細書において「細胞接着分子」（Cell adhesion molecule)または「接着分 子」とは、互換可能に使用され、 2つ以上の細胞の互いの接近（細胞接着）または基 質と細胞との間の接着を媒介する分子をいう。一般には、細胞と細胞の接着 (細胞間 接着）に関する分子（cell_cell adhesion molecule)と，細胞と細胞外マトリックス との接着（細胞-基質接着）に関与する分子（cell— substrate adhesion molecul e)に分けられる。細胞は、通常、このような細胞接着分子を含む。従って、本明細書 におレ、て細胞接着分子は、細胞-基質接着の際の基質側のタンパク質を包含するが 、本明細書では、細胞側のタンパク質 (例えば、インテグリンレセプターなど)も包含さ れ、タンパク質以外の分子であっても、細胞接着を媒介する限り、本明細書における 細胞接着分子または接着分子の概念に入る。
[0018] 細胞間接着に関しては、カドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する多く の分子（NCAM、 Ll、 ICAM、ファシクリン II、 IIIなど）、セレクチンなどが知られてお り、それぞれ独特な分子反応により細胞膜を結合させることも知られている。
[0019] このように多種多様な分子が細胞接着に関与しており、それぞれの機能は異なって レ、ることから、当業者は、 目的に応じて、適宜本発明において考慮されるべき分子を 選択すること力 Sできる。細胞接着に関する技術は、上述のもののほかの知見も周知で あり、例えば、細胞外マトリックス —臨床への応用- メディカルレビュー社に記載さ れている。
[0020] ある分子が細胞接着分子であるかどうかは、生化学的定量（SDS - PAG法、標識 コラーゲン法)、免疫学的定量 (酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫組織学的検討)、 PC R法、ハイブリダィゼイシヨン法などのようなアツセィにおレ、て陽性となることを決定す ることにより半 IJ定すること力 Sできる。このような細胞接着分子としては、コラーゲン、イン テグリン、フイブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、フイブリノゲン、免疫グロブリンス 一パーファミリー（例えば、 CD2、 CD4、 CD8、 ICM1、 ICAM2、 VCAM1)、セレク チン、カドヘリン、 CD29、 CD49ファミリーなどが挙げられるがそれに限定されない。 このような細胞接着分子の多くは、細胞への接着と同時に細胞間相互作用による細 胞活性化の補助シグナルを細胞内に伝達する。
[0021] 細胞接着分子としては、例えば、組織固着性の細胞系に広く知られる細胞接着分 子としてカドヘリンがある。一方，非固着性の血液'免疫系の細胞では，細胞接着分 子としては、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー分子（CD 2、 LFA_3、 ICA M_l、 CD2、 CD4、 CD8、 ICM1、 ICAM2、 VCAM1など）；インテグリンファミリー 分子（LFA— 1、 Mac— 1、 gpllbllla、 pl 50、 95、 VLA1、 VLA2、 VLA3、 VLA4、 VLA5、 VLA6など）；セレクチンファミリー分子（Lーセレクチン， E—セレクチン， P—セ レクチンなど）； CD29、 CD49ファミリー（CD49a、 CD49b、 CD49c、 CD49d、 CD 49e、 CD49fなど）などが挙げられるがそれらに限定されなレ、。従って、そのような分 子は、血液 ·免疫系の組織または臓器を処置するための特に有用であり得る。
[0022] 細胞接着分子は、非固着性の細胞が固定するために必要となる。その場合，恒常 的に発現するセレクチン分子などによる一次接着、それに続いて活性化されるインテ ダリン分子などの二次接着によって細胞間の接着は段階的に強くなると考えられてい る。従って、本発明において考慮される細胞接着分子としては、そのような一次接着 を媒介する因子、二次接着を媒介する因子、またはその両方が一緒に考慮され得る が、二次接着の方が好ましいようである。細胞接着分子がタンパク質の場合、その活 性部位はアミノ酸レベルで解明されており、 RGD, YIGSRなどが知られている（これ らを、総合して RGD配列とも呼ぶ）。
[0023] 本明細書において「細胞接着関連因子」とは、細胞が他の物質 (例えば、支持体、 他の細胞など）へ接着する活性を抑制する因子をいう。そのような因子としては、細胞 接着分子と相互作用する相互作用物質が挙げられるがそれらに限定されない。その ような相互作用物質は、フイブロネクチンなどの ECM基質をコートした表面への細胞 を播種した際に相互作用物質が共存することによって接着阻害作用などが確認され る。また、そのような相互作用活性を有する基質を表面上に化学的、または物理的に 固定した際、細胞のその表面上への接着性の亢進が確認される。相互作用物質に は、例えば、競合相手とァロステリックに相互作用する物質、抗原抗体反応における パートナー（抗原であれば抗体、抗体であれば抗原）、レセプタ一一リガンドの関係に あるパートナー（レセプターであればリガンド、リガンドであればレセプター）などが挙 げられるがそれらに限定されない。本発明では、細胞接着が強化される限り、本発明 の目的（標的物質の導入）が達成されることから、特に限定されなレ、ことが理解される べきである。
[0024] 本明細書にぉレ、て「RGD分子」とは、アミノ酸配列 RGD (Arg-Gly-Asp)またはそ の機能的に同一な配列を含むタンパク質分子をいう。 RGD分子は、細胞接着性蛋 白質の細胞接着活性部位のアミノ酸配列として有用なアミノ酸配列である RGDまた は機能的に等価な別のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。 RGD配列は、フイブ口 ネクチンの細胞接着部位として発見され、その後， I型コラーゲン、ラミニン，ビトロネク チン，フイブリノゲン，フォンヴィルブランド因子，ェンタクチンなど多くの細胞接着性 の活性を示す分子に見出された。化学合成した RGDペプチドを固相化すると細胞 接着活性を示すことから、本発明における生体分子は、化学合成した RGD分子であ つてもよレ、。そのような RGD分子としては、上述の天然に存在する分子のほかに、例 えば、 GRGDSPペプチドが挙げられるがそれに限定されなレ、。 RGD配列は細胞接 着分子（かつ、レセプターでもある）であるインテグリン（例えば、 CD49ファミリー、 CD 29など）によって認識されることから、 RGDの機能的に等価な分子は、そのようなイン テグリンを用いて相互作用を調べることによって同定することができる。
[0025] 本明細書において、「インテグリン」または「インテグリンレセプター」とは、互換可能 にもちいられ、細胞接着に関与するレセプターである膜貫通糖タンパク質をいう。イン テグリンは、細胞表面に存在し、細胞が細胞外マトリックスに接着するときに機能する 。血球系などでは細胞どうしの接着にも関与することが知られている。そのようなイン テグリンとしては、例えば、フイブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンなどのレセプ ター、血小板の lib/Ilia,マクロファージの Mac— 1 ,リンパ球の LFA— 1 , VLA— 1一 6,ショウジヨウバエの PSAなどが挙げられるがそれに限定されない。通常、インテグリ ンは，分子量 130kDa— 210kDaの α鎖と分子量 95kDa— 130kDaの 鎖と力 共有結合で 1対 1に会合したヘテロ二量体の構造をとる。 α鎖としては、例えば、 α ΐ 、 α 2、 α 3、 α 4、 α 5、 α 6、 ct L、 α Μ、 α Χ、 a llb、 a V、 α Εなど力ある力 Sそれに 限定されない。 鎖としては、例えば 1、 β 2、 β 3、 4、 β 5、 β 6、 7などがある がそれに限定されない。
[0026] このようなヘテロ二量体としては、例えば、 GpIIblllaのほ力に、 VLA— 1、 VLA— 2 、 VLA— 3、 VLA— 4、 VLA— 5、 VLA— 6、 CD51/CD29、 CD49ファミリー、 LFA- 1、 Mac— 1、 pl 50， 90、ビトロネクチンレセプター、 /3 4サブファミリー、 j3 5サブフアミ リー、 β 6サブファミリー、 LPAM_1、 HML—1などがあるがそれに限定されなレ、。通 常、 ひ鎖の細胞外ドメインに二価カチオン結合部位があり、 /3鎖の細胞外ドメインに システィンリッチ領域があり、 β鎖の細胞内ドメインにチロシンリン酸化部位があること が多い。結合リガンド中の認識部位は RGD配列であることが多レ、。従って、インテグ リンは、 RGD分子であり得る。
[0027] 本明細書にぉレ、て「細胞外マトリクスタンパク質」とは「細胞外マトリクス」のうちタン パク質であるものをいう。本明細書において「細胞外マトリクス」（ECM)とは「細胞外 基質」とも呼ばれ、当該分野において通常用いられる意味と同様の意味で用いられ、 上皮細胞、非上皮細胞を問わず体細胞（somatic cell)の間に存在する物質をいう 。細胞外マトリクスは、組織の支持だけでなぐすべての体細胞の生存に必要な内部 環境の構成に関与する。細胞外マトリクスは一般に、結合組織細胞から産生されるが 、一部は上皮細胞または内皮細胞のような基底膜を保有する細胞自身からも分泌さ れる。細胞外マトリクスは一般に、線維成分とその間を満たす基質とに大別され、線 維成分としては膠原線維および弾性線維がある。基質の基本構成成分はグリコサミノ ダリカン (酸性ムコ多糖）であり、その大部分は非コラーゲン性タンパクと結合してプロ テオダリカン (酸性ムコ多糖一タンパク複合体）の高分子を形成する。このほかに、基 底膜のラミニン、弾性線維周囲のミクロフイブリル (microfibril)線維、細胞表面のフィ ブロネクチンなどの糖タンパクも基質に含まれる。特殊に分化した組織でも基本構造 は同一で、例えば硝子軟骨では軟骨芽細胞によって特徴的に大量のプロテオグリカ ンを含む軟骨基質が産生され、骨では骨芽細胞によって石灰沈着が起こる骨基質が 産生される。従って、本発明において用いられる細胞外マトリクスとしては、例えば、 コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フイブロネクチン、ビト ロネクチン、ラミニン、弾性繊維、膠原繊維などが挙げられるがそれに限定されない。 本発明において用いられる場合、細胞外マトリクスタンパク質としては、例えば、フィ ブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンなどが挙げられるがそれらに限定されない。
[0028] 本発明おいて細胞外マトリクスタンパク質としては、細胞接着に関連する因子であ れば、どのようなものであっても考慮され得る。
[0029] CD番号は元々は白血球の細胞表面抗原として分化マーカーとして同定された際 の命名法である。 CD49aはインテグリンひ鎖サブユニットであるひ 1であり（アミノ酸酉己 列は、配列番号 4)、 CD49bはインテグリンひ鎖サブユニットであるひ 2であり（ァミノ 酸配列は、配列番号 5)、 CD49cはインテグリンひ鎖サブユニットであるひ 3であり（ァ ミノ酸配歹 1Jは、配列番号 6および 14)、 CD49dはインテグリンひ鎖サブユニットである a 4であり（アミノ酸配列は、配列番号 7)、 CD49eはインテグリンひ鎖サブユニットで あるひ 5であり（アミノ酸配列は、配列番号 8)、 CD49fはインテグリンひ鎖サブユニット である α 6であり（アミノ酸配列は、配列番号 9)、 CD29はインテグリン β鎖サブュニッ トである i3 1である（アミノ酸配列は、配列番号 3、 10、 11、 12および 13)。 CD44は、 細胞表面のヒアルロン酸結合タンパク質であり、 CD46は、膜補因子タンパク質（ MCP)と呼ばれる細胞接着因子であり、 CD54は、細胞と細胞を結合させる細胞間接 着分子 ICAM-1である。 HLAは、主要組織適合抗原遺伝子複合体 (HLA遺伝子） 複合体の産物を示す。
(一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手 法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、 Sambrook J. e t al. (1989) . Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Cold Spring
Harborおよびその 3rd Ed. (2001)； Ausubei, F. M. (1987) . Current Pro tocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and A/iley— Inte rscience ; Ausubei, F. M. " 989) . Short Protocols in Molecular Biolog y : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecul ar Biology, Greene Pub. Associates and Wiley— Interscience ; Innis, M . A. (1990) . PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications , Academic Press ; Ausubei, F. M. (1992) . Short Protocols in Molecul ar Biology : A Compendium of Methods from Current Protocols in
Molecular Biology, Greene Pub. Associates ; Ausubei, F. M. (1995) . Short Protocols in Molecular Biology : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associa tes ; Innis, M. A. et al. (1995) . PCR Strategies, Academic Press ;Ausu bel, F. M. (1999) . Short Protocols in Molecular Biology : A Compen dium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wil ey, and annual updates ; Sninsky, J. J. et al. (1999) . PCR Applications ： Protocols for Functional Genomics, Academic Press、別冊夹験医'ギ「 遺伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 1997などに記載されており、これらは本明 細書において関連する部分 (全部であり得る）が参考として援用される。 [0031] 人工的に合成した遺伝子を作製するための DNA合成技術および核酸化学につい ては、例えば、 Gait, M. J. (1985) . Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach, IRLPress ; Gait, M. J. (1990) . Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach, IRL Press ; Eckstein, F. (1991) . Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approac, IRL Press ; Adams, R. L. et al. (1992) . The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman&Hall ; Sha barova, Z. et al. (1994) . Advanced Organic Chemistry of Nucleic A cids, Weinheim； Blackburn, G. M. et al. (1996) . Nucleic Acids in Che mistry and Biology, Oxford University Press； Hermanson, G. T. (1996 ) . Bioconjugate Techniques, Academic Pressなどに記載されており、これら は本明細書において関連する部分が参考として援用される。
[0032] 本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子をいう。
本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイ ノレスなどを含むがそれらに限定されなレ、。従って、本明細書では生体分子は、生体 力 抽出される分子を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子 であれば生体分子の定義に入る。したがって、コンビナトリアルケミストリで合成された 分子、医薬品として利用され得る低分子 (たとえば、低分子リガンドなど)もまた生体 への効果が意図され得るかぎり、生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、 タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオ チド、ヌクレオチド、核酸（例えば、 cDNA、ゲノム DNAのような DNA、 mRNAのよう な RNAを含む）、ポリサッカライド、オリゴサッカライド、脂質、低分子（例えば、ホルモ ン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子など）、これらの複合分子 (糖脂質、糖タン パク質、リポタンパク質など）などが包含されるがそれらに限定されない。生体分子に はまた、細胞への導入が企図される限り、細胞自体、組織の一部も包含され得る。好 ましくは、生体分子は、核酸（DNAまたは RNA)またはタンパク質を含む。別の好ま しい実施形態では、生体分子は、核酸（例えば、ゲノム DNAまたは cDNA、あるいは PCRなどによって合成された DNA)である。他の好ましい実施形態では、生体分子 はタンパク質であり得る。 [0033] 本明細書において「遺伝物質」とは、遺伝情報を担う任意の物質をいう。そのような 物質としては、例えば、 DNA、 RNAなどの核酸、 PNA、タンパク質などが挙げられ るがそれらに限定されない。 DNAは、 cDNA、ゲノム DNA,人工 DNA、 RNAiなど 任意の形態のものであり得る。 RNAは、 mRNA、 tRNA、 rRNA、 RNAiなどであつ てもよい。
[0034] 本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」 および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸 のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよぐ環状であって もよレ、。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよぐ改変されたァ ミノ酸であってもよレ、。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとァセンブ ルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたァミノ 酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフイド結合形成、ダリ コシル化、脂質化、ァセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例え ば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の 1または 2以上 のアナログを含むポリペプチド (例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様 化合物（例えば、ぺプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される 。フイブロネクチンのような細胞外マトリクスタンパク質の遺伝子産物は、通常ポリぺプ チド形態をとる。
[0035] 本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「 核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリ マーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオ チド」を含む。 「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌク レオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌク レオチドまたはポリヌクレオチドをレ、い、互換的に使用される。そのようなオリゴヌタレ ォチドとして具体的には、例えば、 2，一 O—メチルーリボヌクレオチド、オリゴヌクレオチ ド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチォエート結合に変換された誘導体オリゴヌ クレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N3 ' _P5，ホスホロアミデ ート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリ ン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C_5プロピエルゥラシルで置換された誘導体オリゴ ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C_5チアゾールゥラシルで置換され た誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンが C—5プロピニルシトシ ンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフエノキ サジン修飾シトシン（phenoxazine—modif ied cytosine)で置換された誘導体オリ ゴヌクレオチド、 DNA中のリボースが 2，_0_プロピルリボースで置換された誘導体ォ リゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが 2，_メトキシェトキシリボース で置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示され なければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に 改変された改変体 (例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企 図される。具体的には、縮重コドン置換体は、 1またはそれ以上の選択されたほたは 、すべての）コドンの 3番目の位置が混合塩基および/またはデォキシイノシン残基 で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzerら、 Nucleic Acid R es. 19 : 5081 (1991) ; Ohtsukaら、 J. Biol. Chem. 260 : 2605—2608 (1985) ; Rossoliniら、 Mol. Cell. Probes 8 : 91—98 (1994) )。フイブロネクチンのような細 胞外マトリクスタンパク質などの遺伝子は、通常、このポリヌクレオチド形態をとる。ま た、トランスフエクシヨンの対象となる分子もこのポリヌクレオチドである。
本明細書において、用語「核酸分子」もまた、核酸、オリゴヌクレオチド、およびポリ ヌクレオチドと互換可能に使用され、 cDNA、 mRNA、ゲノム DNAなどを含む。本明 細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。ある遺伝子 配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体（改変体）」を包含する。同様に 、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコ ードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」 は、遺伝子のオノレタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写 物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプ ライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化する力 ェキソンのオルタナティ ブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドも また、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物 (組換え形態のスプ ライス産物を含む）がこの定義に含まれる。したがって、本明細書では、たとえば、細 胞接着関連因子として有用な細胞外マトリクスタンパク質には、そのスプライス変異体 もまた包含され得る。
[0037] 本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体 上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝 子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本 明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含 する。したがって、フイブロネクチン遺伝子というときは、通常、フイブロネクチンの構 造遺伝子およびフイブロネクチンのプロモーターの両方を包含する。本明細書では、
「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに/また は「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある
。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌク レオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに/または「タンパク質」「ポリべ プチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子 産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
[0038] 本明細書にぉレ、て配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、 2 以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある 2つの遺伝子 の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。 2種類の遺伝子 が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェント な条件下でのハイブリダィゼーシヨン法によって調べられ得る。 2つの遺伝子配列を 直接比較する場合、その遺伝子配列間で DNA配列が、代表的には少なくとも 50% 同一である場合、好ましくは少なくとも 70%同一である場合、より好ましくは少なくとも 80%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%または 99%同一である場合、それらの遺伝 子は相同性を有する。本明細書において、配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列な ど）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなし た場合の、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存 的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。 また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。
[0039] 本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比 較は、配列分析用ツールである FASTAにおいてデフォルトパラメータを用いて算出 される。
[0040] 本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非 天然のものでもよレ、。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在す るアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをレ、う。そのような誘 導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。用語「天然の アミノ酸」とは、天然のアミノ酸の L一異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、 ァラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチォニン、トレオニン、フエニノレアラ ニン、チロシン、トリプトファン、システィン、プロリン、ヒスチジン、ァスパラギン酸、ァス パラギン、グルタミン酸、グルタミン、 Ί—カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オル二 チン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸は L 体であるが、 D体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。用語「非天 然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非 天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ—ニトロフエ二ルァラニン、ホモフエニルァ ラニン、パラ—フルオロフェニルァラニン、 3_アミノー 2_ベンジルプロピオン酸、ホモア ルギニンの D体または L体および D—フエ二ルァラニンが挙げられる。 「アミノ酸アナ口 グ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および/または機能に類似する分子を いう。アミノ酸アナログとしては、例えば、ェチォニン、カナバニン、 2—メチルダルタミ ンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構 造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
[0041] 本明細書において、アミノ酸は、その一般に公知の 3文字記号か、または IUPAC— IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨される 1文字記号の いずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知さ れた 1文字コードにより言及され得る。
[0042] 本明細書において、「対応する」アミノ酸とは、あるタンパク質分子またはポリぺプチ ド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドにおける所定のアミ ノ酸と同様の作用を有する力、または有することが予測されるアミノ酸をいい、特に酵 素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をす るアミノ酸をいう。例えば、本発明において使用されるインテグリンの結合部位であれ ば、その分子の結合部位に対応するオノレソログにおける同様の部位（ドメイン）であり 得る。
[0043] 本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよレ、。 「誘導 体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは 異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレ ォチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導 体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチォエート、ホスホ ノレアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、 2—0—メチルリボヌタレ ォチド、ペプチド一核酸 (PNA)が含まれるが、これらに限定されない。
[0044] 本明細書にぉレ、て、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（ 長さが n)に対して、 1一 n— 1までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオ チドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例え ば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15, 2 0、 25、 30、 40、 50およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙して レ、ない整数で表される長さ（例えば、 11など)もまた、下限として適切であり得る。また 、ポリヌクレオチドの場合、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15, 20、 25、 30、 40、 50、 75、 100 およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表 される長さ（例えば、 11など)もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、 ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核 酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなぐ同じ機能を有 する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例え ば上下 10%)のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本 明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「 約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本 発明では、フラグメントは、ある一定の大きさ（例えば、 5kDa)以上の大きさを有する ことが好ましい。理論に束縛されないが、細胞接着関連因子として機能するためには ある程度の大きさが必要であるようであるからである。
[0045] 本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド」と は、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択 されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー'ノ、イブリダィゼーシヨン法、プラー ク 'ハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法等を用 レ、ることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニー あるいはプラーク由来の DNAを固定化したフィルターを用いて、 0. 7—1. 0Mの Na C1存在下、 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1 2倍濃度の SSC (salin e-sodium citrate)溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM 塩化ナトリウム 、 15mM クェン酸ナトリウムである）を用レ、、 65°C条件下でフィルターを洗浄するこ とにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダィゼーシヨンは、 Molecula r し lonmg 2nd ea. , Current Protocols m Molecular Biology, supple ment 1一 38、 DNA Cloning 1： Core Techniques, A Practical Approac h, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載さ れている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジヱントな条件下でハイブリダ ィズする配列からは、好ましくは、 A配列のみまたは T配列のみを含む配列が除外さ れる。 「ハイブリダィズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダィズ条件下で別の ポリヌクレオチドにハイブリダィズすることができるポリヌクレオチドをレ、う。ハイブリダィ ズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列 を有するポリペプチドをコードする DNAの塩基配列と少なくとも 60%以上の相同性 を有するポリヌクレオチド、好ましくは 80%以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さ らに好ましくは 95%以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
[0046] 本明細書において「RNAi」とは、 RNA interferenceの略称で、二本鎖 RNA (ds RNAともいう）のような RNAiを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同な mRNAが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用 レ、られる技術をいう。本明細書において RNAiはまた、場合によっては、 RNAiを引き 起こす因子と同義に用いられ得る。 [0047] 本明細書において「RNAiを引き起こす因子」とは、 RNAiを引き起こすことができる ような任意の因子をレ、う。本明細書にぉレ、て「遺伝子」に対して「RNAiを弓 [き起こす 因子」とは、その遺伝子に関する RNAiを引き起こし、 RNAiがもたらす効果 (例えば 、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのような RNAiを引き起こ す因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約 70% の相同性を有する配列またはストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする配列を含 む、少なくとも 10ヌクレオチド長の二本鎖部分を含む RNAまたはその改変体が挙げ られるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、 3'突出末端を含み、 より好ましくは、 3'突出末端は、 2ヌクレオチド長以上の DNA (例えば、 2 4ヌクレオ チド長の DNAであり得る。
[0048] 理論に束縛されないが、 RNAiが働く機構として考えられるものの一つとして、 dsR NAのような RNAiを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、 4 0塩基対以上） RNAの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Dicer)と呼ばれる R Naselll様のヌクレアーゼが ATP存在下で、その分子を 3'末端から約 20塩基対ず つ切り出し、短鎖 dsRNA (siRNAとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「siRN A」とは、 short interfering RNAの略称であり、人工的に化学合成されるかまた は生化学的に合成されたもの力、あるいは生物体内で合成されたもの力、あるいは 約 40塩基以上の二本鎖 RNAが体内で分解されてできた 10塩基対以上の短鎖二本 鎖 RNAをレ、い、通常、 5 '—リン酸、 3'— OHの構造を有しており、 3'末端は約 2塩基 突出している。この siRNAに特異的なタンパク質が結合して、 RISC (RNA— induce d— silencing—complex)が形成される。この複合体は、 siRNAと同じ配列を有する mRNAを認識して結合し、 RNaselll様の酵素活性によって siRNAの中央部で mR NAを切断する。 siRNAの配列と標的として切断する mRNAの配列の関係について は、 100%—致することが好ましレ、。し力、し、 siRNAの中央力 外れた位置について の塩基の変異については、完全に RNAiによる切断活性がなくなるのではなぐ部分 的な活性が残存する。他方、 siRNAの中央部の塩基の変異は影響が大きぐ RNAi による mRNAの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつ mRNAについては、その変異を中央に配した siRNAを合成し、細胞内に導入するこ とで特異的に変異を含む mRNAだけを分解することができる。従って、本発明では、 siRNAそのものを RNAiを引き起こす因子として用いることができるし、 siRNAを生 成するような因子（例えば、代表的に約 40塩基以上の dsRNA)をそのような因子とし て用いることができる。
[0049] また、理論に束縛されることを希望しないが、 siRNAは、上記経路とは別に、 siRN Aのアンチセンス鎖が mRNAに結合して RNA依存性 RNAポリメラーゼ（RdRP)の プライマーとして作用し、 dsRNAが合成され、この dsRNAが再びダイサ一の基質と なり、新たな siRNAを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、 siRNA自体および siRNAが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫など では、例えば 35分子の dsRNA分子が、 1 , 000コピー以上ある細胞内の mRNAを ほぼ完全に分解することから、 siRNA自体および siRNAが生じるような因子が有用 であることが理角军される。
[0050] 本発明において siRNAと呼ばれる、約 20塩基前後（例えば、代表的には約 21— 2 3塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖 RNAを用いることができる。このような siR NAは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、その siRNAの標的となる 病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することが できる。
[0051] 本発明において用いられる siRNAは、 RNAiを引き起こすことができる限り、どのよ うな形態を採ってレ、てもよい。
[0052] 別の実施形態において、本発明の RNAiを引き起こす因子は、 3'末端に突出部を 有する短いヘアピン構造（shRNA; short hairpin RNA)であり得る。本明細書に おいて「shRNA」とは、一本鎖 RNAで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより 、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約 20塩基対以上の分子を レ、う。そのような shRNAは、人工的に化学合成される。あるレ、は、そのような shRNA は、センス鎖およびアンチセンス鎖の DNA配列を逆向きに連結したヘアピン構造の DNAを T7 RNAポリメラーゼによりインビトロで RNAを合成することによって生成す ること力 Sできる。理論に束縛されることは希望しなレ、が、そのような shRNAは、細胞内 に導入された後、細胞内で約 20塩基（代表的には例えば、 21塩基、 22塩基、 23塩 基）の長さに分解され、 siRNAと同様に RNAiを引き起こし、本発明の処置効果があ ることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含 む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、 sh RNAは、 siRNAと同様に RNAiを引き起こすことから、本発明の有効成分として用い ること力 Sできる。 shRNAはまた、好ましくは、 3 '突出末端を有し得る。二本鎖部分の 長さは特に限定されないが、好ましくは約 10ヌクレオチド長以上、より好ましくは約 20 ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、 3'突出末端は、好ましくは DNAであり得、よ り好ましくは少なくとも 2ヌクレオチド長以上の DNAであり得、さらに好ましくは 2— 4ヌ クレオチド長の DNAであり得る。
[0053] 本発明において用いられる RNAiを引き起こす因子は、人工的に合成した (例えば 、化学的または生化学的)ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この 両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、 液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。
[0054] 本発明において用いられる RNAiを引き起こす因子は、インビトロで合成することも できる。この合成系において、 T7 RNAポリメラーゼおよび T7プロモーターを用いて 、铸型 DNAからアンチセンスおよびセンスの RNAを合成する。これらをインビトロで アニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じて RNAiが引き起こ され、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法でそのよう な RNAを細胞内に導入することができる。
[0055] 本発明の RNAiを引き起こす因子としてはまた、 mRNAとハイブリダィズし得る一本 鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。その ような因子もまた、本発明の処置方法および組成物において有用である。
[0056] 本明細書において「塩」は、当該分野において通常用いられる意味と同じ意味で用 いられ、無機塩および有機塩の両方を含む。塩は、通常、酸と塩基との中和反応に よって生成する。塩には中和反応で生成する NaCl、 K SOなどといったもののほか
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に、金属と酸との反応で生成する PbSO、 ZnClなど種々の種類があり、これらは、
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直接中和反応によって生成したものでなくても、酸と塩基との中和反応から生成した とみなすことができる。塩としては、正塩（酸の Hや塩基の〇Hが塩に含まれていない もの、例えば、 NaCl、 NH Cl、 CH C〇ONa、 Na CO )、酸性塩（酸の Hが塩に残
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つているもの、例えば、 NaHCO、 KHSO 、 CaHPO )、塩基性塩（塩基の OHが塩
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の中に残っているもの、例えば、 MgCl (OH)、 CuCl (OH) )などに分類することがで きるがそれらの分類は、本発明においてはそれほど重要ではない。好ましい塩として は、培地を構成する塩 (例えば、塩化カルシウム、リン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナト リウム、ピルビン酸ナトリウム、 HEPES、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化力リウ ム、硫化マグネシウム、硝酸鉄、アミノ酸、ビタミン、緩衝液を構成する塩 (例えば、塩 化カルゥム、塩化マグネシウム、リン酸水素ナトリウム、塩ィ匕ナトリウム）などが好ましい 。細胞に対する親和性を保持または改善する効果がより高いからである。これらの塩 は、単独で用いてもよいし、複数用いてもよい。複数用いることが好ましい。細胞に対 する親和性が高くなる傾向があるからである。従って、 NaClなどを単独で用いるより も、培地中に含まれる塩 (例えば、塩ィ匕カルゥム、塩ィ匕マグネシウム、リン酸水素ナトリ ゥム、塩化ナトリウム）を複数を用いることが好ましぐより好ましくは、培地中に含まれ る塩全部をそのまま使用することが有利であり得る。別の好ましい実施形態では、グ ルコースを加えてもよい。
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法によ り、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および/または性質を有する他の核 酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、 BLAST (Altschul et al . , J. Mol. Biol. 215 : 403— 410 (1990) )、 FASTA (Pearson & Lipman, Pr oc. Natl. Acad. Sci. , USA 85 : 2444—2448 (1988) )、 Smith and Water man法（Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147 : 195—197 (1981) )、およ び Needleman and Wunsch法 (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48 : 443— 453 (1970) )などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索と しては、ストリンジェントハイブリダィゼーシヨン、ゲノム DNAをナイロンメンブレン等に 貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアツ セィ）、 PCRおよび in situハイブリダィゼーシヨンなどが挙げられるがそれらに限定 されなレ、。本明細書において、 Fnlには、このような電子的検索、生物学的検索によ つて同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。 [0058] 本明細書において物質の細胞への「導入」とは、その物質が、細胞膜の内部へ進 入することをいう。内部に導入されたかどうかは、例えば、その物質そのものを標識（ 例えば、蛍光標識、化学発光標識、燐光、放射能などを利用する)しその標識を検出 することによるカ あるいは、その物質に起因する細胞内の変化 (例えば、遺伝子発 現、シグナル伝達、細胞内レセプターへの結合による事象、代謝変化など）を物理学 的 (例えば、 目視）、化学的 (分泌物の測定)、生化学的、生物学的に測定することに よって半 IJ定すること力 Sできる。従って、そのような「導入」には、単なるタンパク質などの 物質の細胞内への移入の他、通常遺伝子操作とも呼ばれる、トランスフエクシヨン、形 質転換、形質導入などの操作も包含される。
[0059] 本明細書において「標的物質」とは、細胞内への導入が企図される物質をいう。本 発明が企図する標的物質は、通常の条件下では、細胞内に導入されない物質をレ、う 。従って、拡散または疎水性相互作用によって通常の条件下で細胞に導入されるこ とができるような物質は、本発明の重要な局面では対象外となる。通常の条件下で細 胞内に導入されない標的物質としては、例えば、タンパク質 (ポリペプチド）、 RNA、 DNA、糖 (特に多糖）、およびそれらの複合分子（例えば、糖タンパク質、 PNAなど） 、ウィルスベクター、他の化合物が挙げられるがそれらに限定されない。
[0060] 本明細書において「抗体」とは、当該分野で通常使用される意味で用いられ、本明 細書においては、抗体の全部およびそのフラグメント、誘導体、それらの、ヒト化抗体 、キメラ抗体、および抗ィディオタイブ抗体、ならびにそれらの断片、例えば F (ab' ) 2 および Fab断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体なども包含する。 好ましくは、本発明において使用されるポリペプチドを認識する抗体であり、より好ま しくは、本発明において使用されるポリペプチドを特異的に認識する抗体である。そ のような抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよレ、。本 発明の 1実施形態において、そのような抗体もまた、本発明の範囲内に包含される。
[0061] 本明細書において「抗原」とは、抗体と結合したり、 Bリンパ球、 Tリンパ球などの特 異的レセプターに結合して、抗体産生および/または細胞障害などの免疫反応をひ きおこす物質 (例えば、タンパク質、脂質、糖などが挙げられるがそれらに限定されな レ、）をいう。抗体またはリンパ球レセプターとの結合性を、「抗原性」（antigecity)とい う。抗体産生などの免疫応答を誘導する特性を「免疫原性」（immunogenicity)とい う。抗原として使用される物質は、例えば、その目的とする物質 (例えば、タンパク質） を少なくとも 1つ含む。含まれる物質は、全長が好ましいが、免疫を惹起し得るェピト ープを少なくとも一つ含んでいれば、部分配列でもよい。本明細書において「ェピト ープ」または「抗原決定基」とは、抗体またはリンパ球レセプターが結合する抗原分子 中の部位をいう。ェピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、その ようなェピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのよ うな周知慣用技術を用いて決定することができる。
[0062] 本明細書において「細胞接着分子」のパートナーとは、細胞接着分子と特異的に相 互作用する分子をいう。本明細書では、細胞接着因子と「特異的に相互作用する」と は、その特定の細胞接着因子以外の物質よりもその細胞接着因子に対して高い親 和性で相互作用することをいう。
[0063] 本明細書にぉレ、て「デバイス」とは、装置の一部または全部を構成することができる 部分をレ、い、支持体 (好ましくは固相支持体）およびその支持体に担持されるべき標 的物質などから構成される。そのようなデバイスとしては、チップ、アレイ、マイクロタイ タープレート、細胞培養プレート、シャーレ、フイノレム、ビーズなどが挙げられるがそれ らに限定されない。
[0064] 本明細書において使用される「支持体」は、生体分子のような物質を固定することが できる材料 (material)をいう。支持体の材料としては、共有結合かまたは非共有結 合のいずれかで、本発明において使用される生体分子のような物質に結合する特性 を有する力またはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料 が挙げられる。
[0065] 支持体として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意 の材料が使用され得る力 例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、 プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチ レン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）などが挙げられるがそれら に限定されない。支持体は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例え ば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、酸化珪素、炭化珪素 、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用することができる。ポリエチレン、エチレン、ポ リプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含 フッ素樹脂、ポリ塩ィ匕ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビエルアルコ ール、ポリビュルァセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ァセタ ール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フエノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、 メラミン樹脂、スチレン 'アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン 共重合体、シリコーン樹脂、ポリフヱニレンオキサイド、ポリスルホンなどの有機材料を 用いることができる。本発明においてはまた、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、 PVD F膜など、ブロッテイングに使用される膜を用いることもできる。支持体を構成する材 料が固相である場合、本明細書において特に「固相支持体」という。本明細書におい て、プレート、マイクロウヱルプレート、チップ、スライドグラス、フイノレム、ビーズ、金属（ 表面）などの形態をとり得る。支持体はコーティングされていてもよぐコーティングさ れていなくてもよい。
[0066] 本明細書において「液相」とは、当該分野において通常用いられる意味と同じ意味 で用いられ、通常、溶液中での状態をいう。
[0067] 本明細書において「固相」とは、当該分野において用いられる意味と同じ意味で用 いられ、通常、固体の状態をいう。本明細書において液体および固体を総合して流 体ということがある。
[0068] 本明細書において「接触」とは、 2つの物質（例えば、組成物および細胞）が互いに 相互作用するに十分に至近距離に存在することをいう。
[0069] 本明細書において「相互作用」とは、 2つの物体について言及するとき、その 2つの 物体が相互に力を及ぼしあうことをいう。そのような相互作用としては、例えば、共有 結合、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、 疎水性相互作用、静電的相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。好ま しくは、相互作用は、水素結合、疎水性相互作用などの生体内で生じる通常の相互 作用であり得る。
[0070] 本明細書において「相互作用物質」とは、ある対象に対して相互作用する物質を言 う。そのような物質としては、例えば、抗原に対する抗体、レセプターに対するリガンド 、あるいはその逆などが挙げられるがそれらに限定されない。
[0071] (遺伝子の改変）
本発明において使用される細胞接着分子は遺伝子産物の形態をとることが多いが 、そのような遺伝子産物は、上述のようにその改変体であってもよいことが理解される 。従って、本発明は、以下のような遺伝子改変の技術で生産された物質も使用するこ とができる。
[0072] あるタンパク質分子において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力 の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合 部位のようなタンパク質構造にぉレ、て他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の 生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従つ て、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはその DNAコード配列のレ ベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る 。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書におい て開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応する DNAにおいて行わ れ得る。
[0073] 上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク 質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性 は、一般に当該分野で認められている（Kyte. Jおよび Doolittle, R. F. J. Mol. Bi ol. 157 (1) : 105-132, 1982)。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の 二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプ ター、 DNA、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水 性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは:イソロイシン（ + 4. 5)；バリン（ + 4. 2)；ロイシン（ + 3. 8)；フヱ二ルァラニン（ + 2. 8)；システィン /シスチン（ + 2. 5)；メチォニン（+ 1. 9)；ァラニン（ + 1. 8)；グリシン（一0. 4)；スレ ォニン (—0. 7)；セリン（—0. 8)；トリプトファン（—0. 9)；チロシン (—1. 3)；プロリン（― 1. 6)；ヒスチジン (_3. 2)；グルタミン酸 (_3. 5)；グルタミン (_3. 5)；ァスパラギン酸 (-3. 5)；ァスパラギン（_3. 5) ;リジン (_3. 9)；およびアルギニン (_4. 5) )である。
[0074] あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依 然として同様の生物学的機能を有するタンパク質 (例えば、酵素活性にぉレ、て等価 なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換に おいて、疎水性指数が ± 2以内であることが好ましぐ ± 1以内であることがより好まし ぐおよび ± 0. 5以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなァミノ 酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
[0075] 親水性指数もまた、タンパク質の改変において考慮され得る。米国特許第 4， 554, 101号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている： アルギニン（ + 3. 0)；リジン（ + 3. 0)；ァスパラギン酸（ + 3. 0 ± 1 )；グルタミン酸（+ 3. 0 ± 1 )；セリン（ + 0. 3)；ァスパラギン（ + 0. 2)；グルタミン（ + 0. 2)；グリシン（0)； スレオニン（—0. 4)；プロリン（—0. 5 ± 1 )；ァラニン（—0. 5)；ヒスチジン（—0. 5)；シス ティン (—1. 0)；メチォニン (—1. 3)；バリン (—1. 5)；ロイシン (—1. 8)；ィソロイシン（ -1. 8)；チロシン（—2. 3)；フエ二ルァラニン（—2. 5)；およびトリプトファン（—3. 4)。 アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別の ものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数 が ± 2以内であることが好ましぐ ± 1以内であることがより好ましぐおよび ± 0. 5以 内であることがさらにより好ましい。
[0076] 本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換さ れるアミノ酸との親水性指数または/および疎水性指数が上記のように類似してレ、る 置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、土 2以内のもの同士、好ましくは ± 1以内のもの同士、より好ましくは ± 0. 5以内のもの 同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業 者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；ダル タミン酸およびァスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびァスパラギン ；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定され ない。
[0077] 本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの 物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改 変体、付加改変体、欠失改変体、短縮 (truncated)改変体、対立遺伝子変異体な どが挙げられる。対立遺伝子（allele)とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される 遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して 、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常そ の対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ 同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「 種相同体またはホモログ（homolog)」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レべ ルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、 60%以上の相同性、より好まし くは、 80。/o以上、 85。/0以上、 90%以上、 95%以上の相同性）を有するものをいう。 そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。 「オルソ ログ (ortholog)」とは、ォノレソロガス遺伝子 (orthologous gene)ともレヽレ、、二つの 遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子 構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのひへモグロ ビン遺伝子はオルソログである力 s,ヒトのひヘモグロビン遺伝子および βヘモグロビン 遺伝子はパラログ (遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オノレソログは、分子系統樹 の推定に有用である。オルソログは、通常別の種においてもとの種と同様の機能を果 たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用 であり得る。
本明細書にぉレ、て「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配 列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは 、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をレ、い、核酸がァミノ 酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のた め、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コ ドン GCA、 GCC、 GCG、および GCUはすべて、アミノ酸ァラニンをコードする。した がって、ァラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされた ポリペプチドを変更することなぐ記載された対応するコドンの任意のものに変更され 得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の 1つの種である「サイレン ト改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列は また、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核 酸中の各コドン（通常メチォニンのための唯一のコドンである AUG、および通常トリプ トフアンのための唯一のコドンである TGGを除く） 、機能的に同一な分子を産生す るために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸 の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そ のような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステ インの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限 酵素などによる切断、 DNAポリメラーゼ、 Klenowフラグメント、 DNAリガーゼなどに よる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩 基置換法（特定部位指向突然変異法； Mark Zoller and Michael Smith, Me thods in Enzymology, 100, 468—500 (1983) )カ挙げ、られる力 S、この他にも通 常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。
[0079] 本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の 置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の 置換とは、もとのペプチドを 1つ以上、例えば、 1一 10個、好ましくは 1一 5個、より好ま しくは 1一 3個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖 に 1つ以上、例えば、 1一 10個、好ましくは 1一 5個、より好ましくは 1一 3個のアミノ酸 を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから 1つ以上、例えば、 1一 10個、好ましくは 1一 5個、より好ましくは 1一 3個のアミノ酸を欠失させることをいう。ァ ミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシ ノレ化、リン酸化、水酸化、ァシル化（例えば、ァセチル化）などを含む力 S、これらに限 定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよぐ非天 然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよレ、。天然のアミノ酸が好ましい。
[0080] 本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」または「ペプチド誘導体」と は、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも 1つの化学的機能また は生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとの ペプチドに対して、 1つ以上のアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体が付カ卩または置 換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機 能 (例えば、 pKa値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結 合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるよ うに、このような付カ卩または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分 野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナ口 グは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。
[0081] 本明細書にぉレ、て、「ポリヌクレオチドアナログ」、「核酸アナログ」は、ポリヌクレオチ ドまたは核酸とは異なる化合物である力 ポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも 1つ の化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ポリヌクレオ チドアナログまたは核酸アナログには、もとのペプチドに対して、 1つ以上のヌクレオ チドアナログまたはヌクレオチド誘導体が付加または置換されているものが含まれる。
[0082] 本明細書において使用される核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリ ペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部 が欠失または他の塩基により置換されていてもよぐあるいは他の核酸配列が一部揷 入されていてもよい。あるいは、 5 '末端および/または 3 '末端に他の核酸が結合し ていてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハ イブリダィズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコー ドする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発 明において利用することができる。
[0083] このような核酸は、周知の PCR法により得ることができ、化学的に合成することもで きる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダィゼーシヨン法な どを組み合わせてもよい。
[0084] 本明細書にぉレ、て、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付カ卩または欠失」 とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはそ の代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物力 置き換わること、付け加わること または取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野 において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが 挙げられる。置換、付加または欠失は、 1つ以上であれば任意の数でよぐそのような 数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、 ホルモン、サイト力インの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる 。例えば、そのような数は、 1または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの 20 %以内、 10%以内、または 100個以下、 50個以下、 25個以下などであり得る。
[0085] (相互作用因子）
本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して「特異的に相互作用 する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドに対する親和性力 他 の無関連の（特に、同一性が 30。/o未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対 する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に高レ、ものをい う。そのような親和性は、例えば、ハイブリダィゼーシヨンアツセィ、結合アツセィなど によって測定することができる。
[0086] 本明細書において「因子」としては、意図する目的を達成することができる限りどの ような物質または他の要素（例えば、エネルギー）でもあってもよレ、。そのような物質と しては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチ ド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、 cDNA、ゲノム DNAのような DN A、 mRNA、 siRNA、 RNAiのような RNAを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、 脂質、有機低分子 (例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビ ナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子 (例えば、低 分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポ リヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの 配列に対して一定の配列相同性を（例えば、 70%以上の配列同一性)もって相補性 を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリべプチ ドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子とし ては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘 導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたは リガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素で ある場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
[0087] 本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質な ど）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因 子 (例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配 歹 IJを含む核酸;タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタン パク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製され たものをいう。 「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって 精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタ ンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
[0088] 本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質な ど）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたも のをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の 純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高レ、 (すなわち濃縮されてい る)。
[0089] 本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少な くとも 75重量％、より好ましくは少なくとも 85重量％、よりさらに好ましくは少なくとも 95 重量％、そして最も好ましくは少なくとも 98重量％の、同型の生物学的因子が存在 することを意味する。
[0090] (遺伝子操作）
本明細書にぉレ、て遺伝子操作にっレ、て言及する場合、「ベクター」または「組み換 えベクター」とは、 目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができ るベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細 胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能 、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位 置にプロモーターを含有しているものが例示される。従って、プラスミドもまた、ベクタ 一の一 f列である。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングべク ター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマル チプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクロー二 ング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、 目的に合わせて適宜選択し て使用すること力 Sできる。そのような技術は、本明細書に記載される文献 (例えば、 Sa mbrookら、前出）に記載されている。
[0091] 本明細書にぉレ、て「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプ 口モーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結 されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネータ一、薬剤耐性 遺伝子のような選択マーカーおよび、ェンノヽンサ一を含み得る。生物（例えば、動物 )の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じ て変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
[0092] 原核細胞に対する組換えベクターとしては、 pcDNA3 ( + ) , pBluescript-SK ( + /-)、 pGEM— T、 pEF_B〇S、 pEGFP、 pHAT、 pUC18、 pFT— DEST™42GA TEWAY (Invitrogen)などが例示される。
[0093] 動物細胞に対する組換えベクターとしては、 pcDNAl/Amp、 pcDNAI、 pCDM 8 (レヽずれもフナコシょり巿販）、 八0£107 [特開平3_229 (11^1 0§6 、 八0£1 03 [J. Biochem.， 101， 1307 (1987) ]、 pAMo、 pAMoAU. Biol. Chem.， 26 8, 22782—22787 (1993) ]、マウス幹細胞ウィルス（Murine Stem Cell Virus ) (MSCV)に基づいたレトロウイルス型発現ベクター、 pEF— BOS、 pEGFPなどが 例示される。
[0094] 植物細胞に対する組換えベクターとしては、 pPCVICEn4HPT、 pCGN1548、 p CGN1549、 pBI221、 pBI121などが挙げられるがそれらに限定されない。
[0095] 本明細書において「ターミネータ一」とは、通常遺伝子のタンパク質をコードする領 域の下流に位置し、 DNAが mRNAに転写される際の転写の終結、ポリ A配列の付 加に関与する配列をいう。ターミネータ一は、 mRNAの安定性に関与して遺伝子の 発現量に影響を及ぼすことが知られている。
[0096] 本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、また その頻度を直接的に調節する DNA上の領域をレ、い、通常 RNAポリメラーゼが結合 して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロ モーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、 通常、推定タンパク質コード領域の第 1ェキソンの上流約 2kbp以内の領域であること が多いので、 DNA解析用ソフトウェアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード 領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域 は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定さ れず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一 ェキソン翻訳開始点から上流約 2kbp以内に存在する。
[0097] 本明細書において「ェンハンサー」とは、 目的遺伝子の発現効率を高めるために用 レ、られる配列をいう。そのようなェンハンサ一は当該分野において周知である。ェン ハンサ一は複数個用いられ得る力 S1個用いられてもよいし、用いなくともよい。
[0098] 本明細書において「サイレンサー」とは、遺伝子発現を抑制し静止する機能を有す る配列をいう。本発明では、サイレンサーとしてはその機能を有する限り、どのようなも のを用いてもよぐサイレンサーを用いなくてもよい。
[0099] 本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現 (作動） 力 Sある転写翻訳調節配歹 IK例えば、プロモーター、ェンハンサー、サイレンサーなど） または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作 動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置 される力 必ずしも隣接して配置される必要はない。
[0100] 本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよぐ 例えば、形質転換、形質導入、トランスフエクシヨンなどが挙げられる。 そのような核 酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、 例えば、 Ausubel F. A.ら編 (1988)、 Current Protocols in Molecular Bi ology、 Wiley、 New York；、 NY ; Sambrook Jら " 987) Molecular Cloning： A Laboratory Manual, 2nd Ed.およびその 二片反, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY、別冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 1997などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブ ロット、ウェスタンプロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣 用技術を用いて確認することができる。
[0101] ベクターの導入方法としては、細胞に DNAを導入する上述のような方法であれば いずれも用いることができ、例えば、トランスフヱクシヨン、形質導入、形質転換など（ 例えば、リン酸カルシウム法、リボソーム法、 DEAEデキストラン法、エレクト口ポレー シヨン法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）、リボフヱクシヨン法、スフ エロプラスト法 [pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978) ]、酢酸リチウム 法 Bacteriol. , 153, 163 (1983) ]、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 192 9 (1978)記載の方法が挙げられる。
[0102] 本明細書において「遺伝子導入試薬」とは、遺伝子導入方法において、導入効率 を促進するために用いられる試薬をいう。そのような遺伝子導入試薬としては、例え ば、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リン酸 カルシウムなどが挙げられるがそれらに限定されなレ、。トランスフエクシヨンの際に利 用される試薬の具体例としては、種々なソースから市販されている試薬が挙げられ、 例 ば、 Effectene Transfection Reagent、cat. no. 301425, Qiagen, CA) , TransFastTM Transfection Reagent (E2431 , Promega, WI) , TfxTM-2 0 Reagent (E2391 , Promega, WI) , SuperFect Transfection Reagent (3 01305, Qiagen, CA) , PolyFect Transfection Reagent (301105, Qiagen , CA) , LipofectAMINE 2000 Reagent (11668-019, Invitrogen corpora tion, CA) , JetPEI ( X 4) cone. "01-30, Polyplus-transfection, France)お よび ExGen 500 (R051 1 , Fermentas Inc. , MD)などが挙げられるがそれらに 限定されない。
[0103] 本明細書「指示書」とは、本発明の標的物質導入方法などを、ユーザー (研究者、 実験補助者、または治療においては医師、患者など投与を行う人など）に対して記載 したものである。この指示書は、本発明の組成物などを例えば、使用する方法を指示 する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁が規 定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指 示書は、医薬の場合通常いわゆる添付文書（package insert)の形態をとり、また は実験用試薬の形態の場合マニュアルの形態をとり、通常は紙媒体で提供されるが 、それに限定されず、例えば、電子媒体 (例えば、インターネットで提供されるホーム ページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
[0104] 本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生 命体の全部または一部 (組織など）をいう。形質転換体としては、原核生物、酵母、動 物、植物、昆虫などの細胞などの生命体の全部または一部（組織など）が例示される 。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿 主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい
[0105] 本明細書において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原 核生物糸田胞としては、 Escherichia属、 Serratia属、 Bacillus属、 Brevibacterium 属、 Corynebacteriumノ禺、 Microbacterium属、 Pseudomonas属などにノ禺" 5 J 核生物細胞、例えば、 Escherichia coli XLl_Blue、 Escherichia coli XL2- Blue, Escherichia coli DH1が例示される。あるいは、本発明では、天然物から 分離した細胞も使用することができる。
[0106] 本明細書において遺伝子操作などにおいて使用され得る動物細胞としては、マウ ス.ミエローマ細胞、ラット 'ミエローマ細胞、マウス'ノ、イブリドーマ細胞、チャイニーズ •ハムスターの細胞である CH〇細胞、 BHK細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白 血病細胞、 HBT5637 (特開昭 63—299)、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができ る。マウス'ミエローマ細胞としては、 ps20、 NS〇など、ラット 'ミエローマ細胞としては YB2/0など、ヒト胎児腎臓細胞としては HEK293 (ATCC : CRL_1573)など、ヒト 白血病細胞としては BALL— 1など、アフリカミドリザノレ腎臓細胞としては C〇S_1、 C OS— 7、ヒト結腸癌細胞株としては HCT— 15、ヒト神経芽細胞腫 SK— N_SH、 SK— N-SH-5Y,マウス神経芽細胞腫 Neuro2Aなどが例示される。あるいは、本発明で は、初代培養細胞も使用することができる。
[0107] 本明細書において遺伝子操作などにおいて使用され得る植物細胞としては、カル スまたはその一部および懸濁培養細胞、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科 、ゥリ科、シソ科、ユリ科、ァカザ科、セリ科などの植物の細胞が挙げられるがそれらに 限定されない。
[0108] 本明細書において遺伝子発現 (たとえば、 mRNA発現、ポリペプチド発現）の「検 出」または「定量」は、例えば、 mRNAの測定および免疫学的測定方法を含む適切 な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブ ロット法、ドットプロット法または PCR法などが例示される。免疫学的測定方法としては 、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いる ELISA法、 RIA法、蛍光 抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法と しては、 ELISA法または RIA法などが例示される。アレイ（例えば、 DNAアレイ、プロ ティンアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。 DNAアレイについて は、（秀潤社編、細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新 PCR法」）に広く概説され ている。プロテインアレイについては、 Nat Genet. 2002 Dec ; 32 Suppl : 526- 32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、 RT— PCR、 R ACE法、 SSCP法、免疫沈降法、 two—hybridシステム、インビトロ翻訳などが挙げ られるがそれらに限定されなレ、。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析 実験法 ·中村祐輔ラボ 'マニュアル、編集 ·中村祐輔 羊土社 (2002)などに記載され ており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
[0109] 本明細書にぉレ、て遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど遺伝子産物の「発現 」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう 。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチド の形態になることをいうが、転写されて mRNAが作製されることもまた発現の一形態 であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを 受けたものであり得る。
[0110] 本明細書において「発現量」とは、 目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたは m RNAが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いて ELI SA法、 RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法などの免疫学的 測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク 質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、 PCR法などの分子 生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチド の mRNAレベルでの発現量が挙げられる。 「発現量の変化」とは、上記免疫学的測 定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本 発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたは mRNAレベルでの発現量が増加ある いは減少することを意味する。
[0111] 従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」ま たは「発現量」の「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよ りも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチド の発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド などの「発現」または「発現量」の「増加」とは、細胞内に遺伝子発現に関連する因子（ 例えば、発現されるべき遺伝子またはそれを調節する因子）を導入したときに、作用 させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は 、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において遺伝子の「発現」の「誘導」 とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。 したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその 遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場 合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。
[0112] 本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、植物の特 定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レべ ルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発 現してもよぐそれ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発 現するとは、ある部位にぉレ、てのみ発現することをレ、う。
[0113] 本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタ ンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写 促進活性)を発揮する活性が包含される。例えば、細胞接着関連因子が細胞接着分 子と相互作用する場合、その生物学的活性は、フイブロネクチンなどの ECM基質をコ ートした表面への細胞を播種した際に相互作用物質が共存することによって接着阻 害作用などが確認される。また、そのような相互作用活性を有する基質を表面上に化 学的、または物理的に固定した際、細胞のその表面上への接着性の亢進が確認さ れる。従って、このような原理をもとにしたアツセィによって測定することができる。別 の好ましい実施形態では、そのような生物学的活性は、細胞接着活性、へパリン結 合活性、コラーゲン結合活性などであり得る。細胞接着活性は、細胞播種後に細胞 の固相への接着速度を測定し、接着活性として取り扱うことによって測定することがで きる。へパリン結合活性は、へパリン固定化カラム等のァフィ二ティーク口マトグラフィ 一を行い、これに結合するものとして確認できるものによって測定することができる。コ ラーゲン結合活性は、コラーゲン固定化カラム等のァフィ二ティークロマトグラフィーを 行レ、、これに結合するものとして確認できるものによって測定することができる。例え ば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。 別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの 結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によつ て測定することができる（Molecular Cloning, Current Protocols (本明細書に おいて引用）などを参照）。
[0114] 本明細書において「粒子」とは、一定の硬度を有し、一定の大きさ以上の大きさを有 する物質をいい、本発明では、金属などによって構成されるものをいう。本発明にお いて使用される粒子としては、例えば、金コロイド、銀コロイド、ラテックスコロイドなど が挙げられるがそれらに限定されない。
[0115] 本明細書において「キット」とは、通常 2つ以上の区画に分けて、提供されるべき部 分 (例えば、試薬、粒子など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべき でなぐ使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とす るときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部 分 (例えば、試薬、粒子など）をどのように処理すべきかを記載する説明書を備えて レ、ることが有利である。
[0116] (ポリペプチドの製造方法）
本発明において使用されるポリペプチドは、そのポリペプチドをコードする DNAを 組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞などに由来する形質転 換体を、通常の培養方法に従って培養し、このポリペプチドを生成蓄積させ、その培 養物よりその本発明のポリペプチドを採取することにより、製造することができる。
[0117] 形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従 つて行うことができる。大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として 得られた形質転換体を培養する培地としては、本発明の生物が資化し得る炭素源（ 例えば、グノレコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンある いはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノー ノレ、プロパノール等のアルコール類など）、窒素源（例えば、アンモニア、塩化アンモ 二ゥム、硫酸アンモニゥム、酢酸アンモニゥム、リン酸アンモニゥム等の各種無機酸ま たは有機酸のアンモニゥム塩、その他含窒素物質、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵 母エキス、コーンスチープリカー、カゼインカ卩水分解物、大豆粕および大豆粕加水分 解物、各種発酵菌体およびその消化物等など）、無機塩類 (例えば、リン酸第一カリ ゥム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫 酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等など)等を含有し、形質転換体 の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地（例えば、 RPMI1640 ； tせ地 [The Journal oi the American Medical Association, 199, 519 (1 967) ]、 Eagleの MEM培地 [Science, 122, 501 (1952) ]、 DMEM培地 [Virolo gy, 8, 396 (1959) ]、 199培地 [Proceedings of the Society for the Biol ogical Medicine, 73, 1 (1950) ]またはこれら培地にゥシ胎児血清等を添加した 培地等）のいずれを用いてもよい。培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の 好気的条件下で行うことが好ましいがそれに限定されない。培養温度は 15— 40°C 力 ぐ培養時間は、通常 5時間一 7日間である。培養中 pHは、 3. 0— 9. 0に保持 する。 pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、 アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンまたはテトラサイク リン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明において使用されるポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された形 質転換体の培養物から、そのポリペプチドを単離または精製するためには、当該分 野で周知慣用の通常のポリペプチド (例えば、酵素）の単離または精製法を用いるこ とができる。例えば、本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換 体の細胞外に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、その培養物を遠心分離 等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。その可溶性画分から、溶媒抽出法 、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジェチルアミノエチル (DEA E) -Sepharose (Pharmacia) , DIAION HPA—75 (三菱化学）等樹脂を用いた 陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S_Sepharose FF (Pharmacia)等の樹脂を用 レヽた陽イオン交換クロマトグラフィー法、 Butyl-Sepharose, Phenyl-Sepharose 等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、ァフィ 二ティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気 泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
[0119] 本発明において使用されるポリペプチドが形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積 する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、その細胞 を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、 ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。その無細胞抽出液を遠心分 離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機 溶媒による沈澱法、ジェチルアミノエチル（DEAE)— Sepharose、 DIAION HPA —75等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S— Sepharose FF等の樹 脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、 Butyl_Sepharose、 Phenyl-Sepha rase等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、ァ フィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電 気泳動法等の手法を用いることによって、精製標品を得ることができる。
[0120] 本発明において使用されるポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場 合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈澱画分より、 通常の方法により本発明のポリペプチドを回収後、そのポリペプチドの不溶体をポリ ペプチド変性剤で可溶化する。この可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まなレ、ある いはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希 釈、あるいは透析し、本発明のポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記 と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
[0121] また、通常のタンパク質の精製方法 [例えば、 J. Evan. Sadlerら： Methods in E nzymology, 83, 458]に準じて精製できる。また、本発明において使用されるポリ ペプチドが他のタンパク質との融合タンパク質として生産しても使用され得る場合、融 合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたァフィ二ティークロマトグラフィーを利 用して精製することもできる [山川彰夫，実験医学 (Experimental Medicine) , 13 , 469—474 (1995) ]。あるレヽ fま、： Loweらの方法 [Pro Natl. Acad. Sci. ， USA , 86, 8227-8231 (1989) , GenesDevelop. , 4, 1288 (1990) ]に記載の方法 に準じて、そのようなポリペプチドをプロテイン Αとの融合タンパク質として生産し、ィ ムノグロブリン Gを用いるァフィ二ティークロマトグラフィーにより精製することができる。 また、本発明において使用されるポリペプチドを FLAGペプチドとの融合タンパク質 として生産し、抗 FLAG抗体を用いるァフィ二ティークロマトグラフィーにより精製する こと力 Sできる [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Devel op.， 4， 1288 (1990) ]。
[0122] さらに、本発明のポリペプチド自身に対する抗体を用いたァフィ二ティーク口マトダラ フィ一で精製することもできる。本発明のポリペプチドは、公知の方法 Biomolecu lar NMR, 6, 129—134、 Science, 242, 1162— 1 164、 J. Biochem. , 110， 16 6—168 (1991) ]に準じて、 in vitro転写'翻訳系を用いてを生産することができる。
[0123] 上記で取得されたポリペプチドのアミノ酸情報を基に、 Fmoc法（フルォレニルメチ ルォキシカルボニル法）、 tBoc法（t_ブチルォキシカルボニル法）等の化学合成法 によっても本発明のポリペプチドを製造することができる。また、 Advanced ChemT ech、 Applied Biosystems、 Pharmacia Biotech^ Protein echnology Ins trument, Synthecell— Vega、 PerSeptive,島津製作所等のペプチド合成機を利 用しィ匕学合成することもできる。
[0124] (基板/プレート/チップ/アレイ）
本明細書において使用される「プレート」とは、抗体のような分子が固定され得る平 面状の支持体をいう。本発明では、プレートは、プラスチック、金、銀またはアルミニゥ ムを含む金属薄膜を片面にもつガラス基板を基材とすることが好ましい。
[0125] 本明細書において使用される「基板」とは、本発明のチップまたはアレイが構築され る材料 (好ましくは固体）をいう。したがって、基板はプレートの概念に包含される。基 板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使 用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘 導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。
[0126] プレートおよび基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成 し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二 酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば 、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）が挙げられるが それらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。 例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化 珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポ リプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含 フッ素樹脂、ポリ塩化ビュル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビュル、ポリビュルアルコ ール、ポリビュルァセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ァセタ ール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フエノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、 メラミン樹脂、スチレン 'アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン 共重合体、シリコーン樹脂、ポリフヱニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を 用いることができる。基板として好ましい材質は、測定機器などの種々のノ メータに よって変動し、当業者は、上述のような種々の材料から適切なものを適宜選択するこ とができる。トランスフエクシヨンアレイのためには、スライドグラスが好ましい。好ましく は、そのような基材は、コーティングされ得る。
本明細書において「コーティング」とは、固相支持体または基板について用いられる とき、その固相支持体または基板の表面上にある物質の膜を形成させることおよびそ のような膜をいう。コーティングは種々の目的で行われ、例えば、固相支持体および 基板の品質向上 (例えば、寿命の向上、耐酸性などの耐環境性の向上）、固相支持 体または基板に結合されるべき物質の親和性の向上などを目的とすることが多い。 本明細書において、そのようなコーティングのための物質は、「コーティング剤」と呼ば れる。そのようなコーティング剤としては、種々の物質が用いられ得、上述の固相支持 体および基板自体に使用される物質のほか、 DNA、 RNA、タンパク質、脂質などの 生体物質、ポリマー（例えば、ポリ- L-リジン、 MAS (松浪硝子、岸和田、 日本から入 手可能）、疎水性フッ素樹脂）、シラン (APS (例えば、 Ί—ァミノプロビルシラン) )、金 属（例えば、金など）が使用され得るがそれらに限定されない。そのような物質の選択 は当業者の技術範囲内にあり、当該分野において周知の技術を用いて場合ごとに 選択すること力 Sできる。一つの好ましい実施形態では、そのようなコーティングは、ポリ —L—リジン、シラン、 （例えば、エポキシシランまたはメルカプトシラン、 APS ( o/—アミ ノプロビルシラン））、 MAS、疎水性フッ素樹脂、金のような金属を用いることが有利 であり得る。このような物質は、細胞または細胞を含む物体 (例えば、生体、 S蔵器など )に適合する物質を用いることが好ましい。
[0128] 本明細書において「チップ」または「マイクロチップ」は、互換可能に用いられ、多様 の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。チップとしては、例えば 、 DNAチップ、プロテインチップなどが挙げられるがそれらに限定されない。
[0129] 本明細書において「アレイ」とは、 1以上（例えば、 1000以上）の標的物質を含む組 成物（例えば、 DNA、タンパク質、トランスフヱタト混合物）が整列されて配置されたパ ターンまたはパターンを有する基板（例えば、チップ）そのものをいう。アレイの中で、 小さな基板（例えば、 10 X 10mm上など）上にパターン化されているものはマイクロア レイというが、本明細書では、マイクロアレイとアレイとは互換可能に使用される。従つ て、上述の基板より大きなものにパターンィ匕されたものでもマイクロアレイと呼ぶことが ある。例えば、アレイはそれ自身固相表面または膜に固定されている所望のトランス フエタト混合物のセットで構成される。アレイは好ましくは同一のまたは異なる抗体を 少なくとも 102個、より好ましくは少なくとも 103個、およびさらに好ましくは少なくとも 10 4個、さらにより好ましくは少なくとも 105個を含む。これらの抗体は、好ましくは表面が 125 X 80mm,より好ましくは 10 X 10mm上に配置される。形式としては、 96ゥエル マイクロタイタープレート、 384ウエノレマイクロタイタープレートなどのマイクロタイター プレートの大きさのものから、スライドグラス程度の大きさのものが企図される。固定さ れる標的物質を含む組成物は、 1種類であっても複数種類であってもよい。そのよう な種類の数は、 1個一スポット数までの任意の数であり得る。例えば、約 10種類、約 1 00種類、約 500種類、約 1000種類の標的物質を含む組成物が固定され得る。
[0130] 基板のような固相表面または膜には、上述のように任意の数の標的物質 (例えば、 抗体のようなタンパク質）が配置され得るが、通常、基板 1つあたり、 108個の生体分 子まで、他の実施形態において 107個の生体分子まで、 106個の生体分子まで、 105 個の生体分子まで、 104個の生体分子まで、 103個の生体分子まで、または 102個の 生体分子までの個の生体分子が配置され得るが、 108個の生体分子を超える標的物 質を含む組成物が配置されていてもよい。これらの場合において、基板の大きさはよ り小さいことが好ましい。特に、標的物質を含む組成物（例えば、抗体のようなタンパ ク質）のスポットの大きさは、単一の生体分子のサイズと同じ小さくあり得る（これは、 1 一 2nmの桁であり得る）。最小限の基板の面積は、いくつかの場合において基板上の 生体分子の数によって決定される。本発明では、細胞への導入が企図される標的物 質を含む組成物は、通常、 0. 01mm— 10mmのスポット状に共有結合あるいは物 理的相互作用によって配列固定されている。
[0131] アレイ上には、生体分子の「スポット」が配置され得る。本明細書において「スポット」 とは、標的物質を含む組成物の一定の集合をいう。本明細書において「スポッティン グ」とは、ある標的物質を含む組成物のスポットをある基板またはプレートに作製する ことをいう。スポッティングはどのような方法でも行うことができ、例えば、ピぺッティン グなどによって達成され得、あるいは自動装置で行うこともでき、そのような方法は当 該分野において周知である。
[0132] 本明細書において使用される用語「アドレス」とは、基板上のユニークな位置をいい 、他のユニークな位置から弁別可能であり得るものをいう。アドレスは、そのアドレスを 伴うスポットとの関連づけに適切であり、そしてすベての各々のアドレスにおける存在 物が他のアドレスにおける存在物から識別され得る（例えば、光学的）、任意の形状 を採り得る。アドレスを定める形は、例えば、円状、楕円状、正方形、長方形であり得 るカ または不規則な形であり得る。したがって、「アドレス」は、抽象的な概念を示し 、 「スポット」は具体的な概念を示すために使用され得るが、両者を区別する必要がな い場合、本明細書においては、「アドレス」と「スポット」とは互換的に使用され得る。
[0133] 各々のアドレスを定めるサイズは、とりわけ、その基板の大きさ、特定の基板上のァ ドレスの数、標的物質を含む組成物の量および/または利用可能な試薬、微粒子の サイズおよびそのアレイが使用される任意の方法のために必要な解像度の程度に依 存する。大きさは、例えば、 l_2nmから数 cmの範囲であり得る力 そのアレイの適用 に一致した任意の大きさが可能である。
[0134] アドレスを定める空間配置および形状は、そのマイクロアレイが使用される特定の 適用に適合するように設計される。アドレスは、密に配置され得、広汎に分散され得 る力 \または特定の型の分析物に適切な所望のパターンへとサブグノレープ化され得 る。
[0135] マイクロアレイについては、ゲノム機能研究プロトコール (実験医学別冊 ポストゲノ ム時代の実験講座 1)、ゲノム医科学とこれ力ものゲノム医療（実験医学増干 IJ)などに 広く概説されている。
[0136] マイクロアレイから得られるデータは膨大であることから、クローンとスポットとの対応 の管理、データ解析などを行うためのデータ解析ソフトウェアが重要である。そのよう なソフトウェアとしては、各種検出システムに付属のソフトウェアが利用可能である（Er molaeva 〇ら（1998) Nat. Genet. 20 : 19—23)。また、データベースのフォーマ ットとしては、例えば、 Affymetrixが提唱している GATC (genetic analysis tech nology consortium)と呼ばれる开式が挙げられる。
[0137] 微細カロェにつレヽては、例えば、 Campbell, S. A. (1996) . The Science and Engineering of Microelectronic f abrication, Oxiord University Press ； Zaut, P. V. (1996) . Micromicroarray Fabrication : a Practical Guide t o Semiconductor Processing, Semiconductor Services ; Madou, M. J. ( 1997) . Fundamentals of Microfabrication, CRC1 5 Press； Rai— Choud hury, P. (1997) . Handbook of Microlithography, Microma chining , & Microfabrication： Microlithographyなどに記載されており、これらは本明細書に おいて関連する部分が参考として援用される。
[0138] (細胞）
本明細書にぉレ、て使用される「細胞」は、当該分野にぉレ、て用いられる最も広義の 意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜 構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する 生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であって も、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい 。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成 長したトランスジヱニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞 株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
[0139] 本発明で用いられる細胞は、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の単細 胞生物（例えば、細菌、酵母）または多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物 、無脊椎動物）、植物 (たとえば、単子葉植物、双子葉植物など)など））でもよい。例 えば、脊椎動物（たとえば、メタラウナギ類、ャッメゥナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両 生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞が用いられ、より詳細には、哺乳動 物 (例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、 奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ゥサギ目な ど）由来の細胞が用いられる。 1つの実施形態では、霊長類（たとえば、チンパンジー
、二ホンザル、ヒト）由来の細胞、特にヒト由来の細胞が用いられるがそれに限定され ない。
[0140] 本明細書にぉレ、て「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）
(「pluripotency」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときに その組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹 (ES)細胞または 組織幹細胞 (組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得 るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した 細胞（たとえば、本明細書において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞 など)もまた、幹細胞であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞を いう。胚性幹細胞は、 1981年に初めて樹立され、 1989年以降ノックアウトマウス作 製にも応用されている。 1998年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学に も利用されつつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定さ れている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしてい る。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核/細胞質比が 高ぐ細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が 遅ぐ個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される場合は、 幹細胞は胚性幹細胞であっても、組織幹細胞であってもよレ、。
[0141] 由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄 系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹 細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膝 (共通）幹細胞、肝幹細 胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞な どが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙 げられる。 [0142] 本明細書において「体細胞」とは、卵子、精子などの生殖細胞以外の細胞であり、 その DNAを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性 が限定されてレ、るかまたは消失してレ、る。本明細書にぉレ、て使用される体細胞は、 天然に存在するものであってもよぐ遺伝子改変されたものであってもよい。
[0143] 細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する幹細胞に分類され 得る。外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞などが含まれる。中胚葉 由来の細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞 などが含まれる。内胚葉由来の細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、陴幹細胞など が含まれる。本明細書では、体細胞はどのような胚葉由来でもよい。好ましくは、体細 胞は、リンパ球、脾臓細胞または精巣由来の細胞が使用され得る。
[0144] 本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が 少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないをいう。従って、単離され た細胞とは、天然の環境において付随する他の物質 (たとえば、他の細胞、タンパク 質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。核酸またはポリペプチドについていう 場合、「単離された」とは、たとえば、組換え DNA技術により作製された場合には細 胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物 質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。 単離された核酸は、好ましくは、その核酸が由来する生物において天然に該核酸に 隣接している（flanking)配列（即ち、該核酸の 5 '末端および 3'末端に位置する配 歹 IJ)を含まない。
[0145] 本明細書にぉレ、て、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質 (例え ば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになつ た状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。
[0146] 本明細書にぉレ、て「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例 えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほ とんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、陴実質細胞、陴管細胞、肝 細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血 管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられ る。
[0147] (医薬'ィ匕粧品など、およびそれを用いる治療、予防など）
別の局面において、本発明は、細胞へ有効成分を導入するための医薬 (例えば、 ワクチン等の医薬品、健康食品、タンパク質または脂質は抗原性を低減した医薬品） 、化粧品、農薬、食品などに関する。このような医薬および化粧品は、薬学的に受容 可能なキヤリァなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能な キャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。
[0148] そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤 、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増 量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および Zまたは薬学的アジュバント挙 げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、化合物、またはそ の改変体もしくは誘導体を、 1つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または 希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用 水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための 組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
[0149] 本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエン トに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不 活性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クェン酸塩、または他の有機酸；ァス コルビン酸、 α -トコフエロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清ァ ノレブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリ ドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、ァスパラギン、アルギニンまたはリジン） ；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデ キストリンを含む）；キレート剤（例えば、 EDTA)；糖アルコール（例えば、マンニトー ルまたはソルビトール）；塩形成対イオン (例えば、ナトリウム）；ならびに/あるいは非 イオン性表面活性化剤（例えば、 Tween、プル口ニック（pluronic)またはポリエチレ ングリコール（PEG) )。
[0150] 例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと 混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例 えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希 釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、 pH7. 0-8 . 5の Tris緩衝剤または ρΗ4· 0-5. 5の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソル ビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
[0151] 本発明が医薬として使用される場合、そのような医薬は経口的または非経口的に 投与され得る。あるいは、そのような医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全 身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的 に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調 製は、 ρΗ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことがで きる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与 (例えば、静脈内投 与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部へ の局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の 製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐 放剤が挙げられる。
[0152] 本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安 定化剤（日本薬局方第 14版またはその最新版、 Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed. , Mack Publishing Compan y, 1990などを参照）と、所望の程度の純度を有する組成物とを混合することによつ て、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
[0153] 本発明の処置方法において使用される組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類 、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考 慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被検体 (または 患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患 (種類、重篤度など）、患者の 年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定 すること力 Sできる。頻度としては、例えば、毎日一数ケ月に 1回（例えば、 1週間に 1回— 1ヶ月に 1回）の投与が挙げられる。 1週間- 1ヶ月に 1回の投与を、経過を見ながら施 すことが好ましい。
[0154] 本発明が化粧品、食品、農薬など別の用途で使用されるときもまた、当局の規定す る規制を遵守しながら化粧品などを調製することができる。
[0155] (好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であ り、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべ きである。
[0156] 1つの局面において、細胞接着関連因子を含む、標的物質の細胞への導入効率 を上昇させるための組成物を提供する。本発明は、通常の条件下では、ほとんど細 胞に導入されない物質 (例えば、 DNA、 RNA、ポリペプチド、糖鎖またはそれらの複 合物質など)が、細胞接着関連因子 (代表的には、インテグリンに対する抗体)の作 用により、導入が促進されることを予想外に見いだしたことによって、上記目的を達成 した。特に、トランスフエクシヨンなどの DNAを用いた遺伝子操作の際に、このような 細胞接着関連因子がその導入効率促進に顕著な効果があることは、従来全く知られ ておらず予想もされていなかったことから、本発明は、特に遺伝子研究において顕著 なブレークスルーをもたらすものとして注目されるべきである。
[0157] 1つの好ましい実施形態において、本発明において用いられる細胞接着関連因子 は、細胞接着分子（例えば、細胞外マトリクス、インテグリンレセプター、 RGD分子な ど）と相互作用する相互作用物質を含む。
[0158] 好ましい実施形態において、本発明において使用される相互作用物質は、細胞接 着分子のパートナーと抗原抗体反応する。従って、本発明の相互作用物質は、抗体 (例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体など）またはその誘導体 (キメラ抗
[0159] 好ましくは、相互作用物質は、抗 CD49a抗体、抗 CD49b抗体、抗 CD49c抗体、 抗 CD49e抗体および抗 CD49f抗体からなる群より選択される抗体を含む。このよう な抗体が好ましいのは、予想外に遺伝物質 (DNA)の細胞導入効率が上昇したから である。理論に束縛されることを望まなレ、が、このような効果が好ましいのは、本来、 細胞外マトリックスなどの基質を用いて細胞を接着させることは CD49a-i¾r含むイン テグリンを介した接着となる。このような細胞接着関連因子を介した接着は細胞に対 して好ましい影響、つまりこの場合特に遺伝物質 (DNA)の細胞導入効率が上昇が 観察される（前の特許またはリファレンス）。したがって抗 CD49抗体を接着基質とし て用いるいることは、この作用を模倣した機能示していると推測できるからである。従 つて、 CD49に関連する CD49a-f¾r含む抗インテグリンという分子に対する抗体もま た、本発明の好ましい実施形態としてあげることができる。
[0160] 1つの実施形態において、本発明において標的とされる標的物質は、遺伝物質 (例 えば、 DNA、 RNAのような核酸分子）を含む。そのような DNAとしては、例えば、プ ラスミド DNA、 Naked DNA、 cDNA、ゲノム DNAなどが挙げられるがそれらに限 定されない。
[0161] 1つの実施形態において、本発明において考慮されるインテグリンレセプターは、 C D49a、 CD49b、 CD49c、 CD49d、 CD49e、 CD49f、ならびに CD29力、らなる群よ り選択される（例えば、 CD29、 CD49a、 CD49c、 CD49d、 CD49eおよび CD49f) 。理論に束縛されることは望まなレ、が、 CD29もまた好ましいのは、本来、細胞外マト リックスなどの基質を用いて細胞を接着させることはインテグリンを介した接着となるか らである。 CD29はインテグリンレセプターの βサブユニットであり多くのインテグリン レセプターの共通のユニットである。このような細胞接着関連因子を介した接着は細 胞に対して好ましい影響、つまりこの場合特に遺伝物質 (DNA)の細胞導入効率が 上昇が観察される（前の特許またはリファレンス)。したがって抗 CD29抗体を接着基 質として用いるいることは、この作用を模倣した機能示していると推測できるからであ る。
[0162] あるいは、インテグリンレセプターは、コラーゲン、フイブロネクチン、ビトロネクチン およびラミニンからなる群より選択される分子と相互作用するものであってもよい。
[0163] 1つの実施形態において、本発明が対象とする細胞は、幹細胞および分化細胞か らなる群より選択される少なくとも 1つの細胞を含み得る。本発明では、幹細胞であつ ても、分化細胞であっても、いずれでも対象とすることができる。ただし、細胞に応じ て、細胞接着に関連する因子が異なり得ることから、そのような細胞に応じて、細胞接 着関連因子を選択することが好ましい。好ましくは、細胞接着分子は、細胞に特異的 に発現されるものである。このような細胞特異的な接着分子は、当該分野において公 知のものを使用することができ、あるいは、当業者が任意の周知の技術を用いて同定 すること力 Sできる。
[0164] 好ましい実施形態において、本発明において使用される標的物質は、遺伝物質で あり、さらに遺伝子導入試薬を含むことが有利である。遺伝物質は、遺伝子導入試薬 に適した遺伝物質であり得る力 通常、 DNAである。
[0165] 従って、遺伝子導入が企図される実施形態において、本発明の組成物は、遺伝子 導入試薬をさらに含むことが好ましい。そのような遺伝子導入試薬を含むことによって 、本発明の導入効率上昇効果が相乗的に発揮されるからである。
[0166] 本発明において使用される遺伝子導入試薬は、カチオン性高分子、カチオン性脂 質およびリン酸カルシウムからなる群より選択され得る。遺伝子導入試薬としては、 Ef fectene, TransFast 、 TfxTM— 20、 SuperFect, PolyFect, LipofectAMINE 2000、 JetPEIおよび ExGen 500などが挙げられるがそれらに限定されなレ、。 Li pofectAMINE 2000力 S好ましレ、。遺伝子導入効率が高いからである。
[0167] 別の実施形態において、本発明の組成物は、粒子をさらに含む。粒子を含むことに より、物質の細胞内への導入、特に、標的化した導入が効率よく行うことができるから である。そのような粒子の好ましい例としては、例えば、金コロイドのような金属コロイド などが挙げられるがそれらに限定されない。
[0168] 別の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、塩をさらに含む。理論に束縛さ れることは望まなレ、が、そのような塩を含むことにより、支持体が用いられる場合には 、固定効果が増強され、あるいは、標的物質の三次元構造がより適切な形で保持さ れる効果が奏されると考えられる。
[0169] このような塩としては、無機塩または有機塩であればどのような塩でも使用すること ができるが、単塩よりも、複数の塩の混合物を使用することが好ましい。そのような複 数の塩の混合物としては、例えば、緩衝剤に含まれる塩類および培地に含まれる塩 類などが挙げられるがそれらに限定されない。
[0170] 1つの好ましい実施形態において、本発明の組成物において含有される細胞接着 関連因子は、インテグリンレセプターの抗体またはその改変体もしくはそのフラグメン トである。本発明において、インテグリンレセプターの抗体またはその改変体もしくは そのフラグメントが予想外に標的物質導入効果を有することが見いだされたことから、 本発明では、細胞外マトリクスタンパク質による、物質の細胞への導入効率上昇とい う効果にも注目すべきである。
[0171] 本発明において考慮されるポリペプチド (例えば、インテグリンなど）は、当該分野に おいて公知のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその改変配列を有し、かつ、 生物学的活性を有する、ポリペプチドであってもよい。
[0172] あるいは、 1つの好ましい実施形態において、上記改変配列における置換、付加お よび欠失の数は、限定され、例えば、 50以下、 40以下、 30以下、 20以下、 15以下、 10以下、 9以下、 8以下、 7以下、 6以下、 5以下、 4以下、 3以下、 2以下であることが 好ましレ、。ある特定の実施形態では、そのような置換、付加および Zまたは欠失の数 は 1または数個であり得る。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生 物学的活性を保持する (好ましくは、細胞接着関連因子と類似するかまたは実質的 に同一の活性を有する）限り、多い数であってもよい。
[0173] 別の好ましい実施形態において、ポリペプチドの対立遺伝子変異体が使用され、 比較の基礎となる配列と少なくとも 90%の相同性を有し得る。同一系統内のものなど では、例えば、そのような対立遺伝子変異体は少なくとも 99%の相同性を有すること が好ましい。
[0174] 上記種相同体は、その種の遺伝子配列データベースが存在する場合、そのデータ ベースに対して、本発明の細胞外マトリクスタンパク質、インテグリンレセプター（例え ば、 CD49ファミリー）の遺伝子配列の全部または一部をクエリ配列として検索するこ とによって同定することができる。あるいは、本発明の遺伝子の全部または一部をプ ローブまたはプライマーとして、その種の遺伝子ライブラリーをスクリーニングすること によって同定することができる。そのような同定方法は、当該分野において周知であり 、本明細書において記載される文献にも記載されている。種相同体は、例えば、もと の配列と少なくとも約 30%の相同性を有することが好ましい。種相同性は、好ましく は、もとの配列と少なくとも約 50%の相同性を有する。あるいは、別の好ましい実施 形態において、上記種相同体は、もとの配列と少なくとも約 30%の相同性を有するこ とが好ましい。種相同体は、好ましくは、もとの配列と少なくとも約 50%の相同性を有 する。 [0175] 細胞接着関連因子の濃度は、当業者であれば、本明細書の記載を参照すれば、 容易に決定することができる。例えば、そのような濃度の例としては、少なくとも約 0· 1 /i g/ /i Lであり、好ましくは約 0. 2 /i g/ Lであり、より好ましくは 0. 5 /i g/ /i Lで ある。 1つの実施形態では、約 0. 5 z g/ z Lを超える濃度ではプラトーに達すること から、約 0. 5 z g/ z L 2. O z gZ x Lの濃度が好ましい濃度範囲であり得る。
[0176] (キット）
別の局面において、本発明は、遺伝子導入効率を上昇させるためのキットを提供 する。そのようなキットは、（a)細胞接着関連因子を含む組成物；および (b)遺伝子導 入試薬、を備える。細胞接着関連因子としては、上述の本発明の標的物質の細胞内 への導入の効率を上昇させるための組成物において詳述した形態が適用され得る。 そのような形態は、当業者は、本明細書の記載に基づけば、適切な形態を選択し実 施すること力 Sできる。このようなキットの形態で本発明が提供されるとき、そのようなキッ トは、さらに指示書を備えていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監 督官庁が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明 記されていてもよいがそれに限定されない。指示書は、通常、マニュアルの形態をと り、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体 (例えば、 インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得 る。このような細胞接着関連因子としては、上述したように、本発明の標的物質の細 胞への導入効率を上昇させるための組成物において適用される形態を当業者が任 意に選択して本発明を実施することができる。したがって、好ましくは、細胞接着関連 因子は、インテグリンレセプターの抗体またはその改変体もしくはそのフラグメントで あり得る。より好ましくは、抗 CD49a抗体、抗 CD49b抗体、抗 CD49c抗体、抗 CD4 9e抗体および抗 CD49f抗体からなる群より選択される抗体またはそのフラグメントも しくはその改変体が使用され得る。
[0177] (組成物）
別の局面において、本発明は、標的物質の細胞への導入効率を上昇させるための 組成物を提供する。本発明は、通常の条件下では、ほとんど細胞に導入されない標 的物質 (例えば、 DNA、 RNA、ポリペプチド、糖鎖またはそれらの複合物質など）が 、細胞接着関連因子 (代表的には、インテグリンレセプターの抗体)の作用により、導 入が促進されることを予想外に見いだしたことによって完成されたものであり、この場 合、本発明は、標的物質と細胞接着関連因子とが含有された組成物の形式で提供さ れる。このような細胞接着関連因子としては、上述したように、本発明の標的物質の 細胞への導入効率を上昇させるための組成物において適用される形態を当業者が 任意に選択して本発明を実施することができる。したがって、好ましくは、細胞接着関 連因子は、インテグリンレセプターの抗体またはその改変体であり得る。より好ましく は、抗 CD49a抗体、抗 CD49b抗体、抗 CD49c抗体、抗 CD49e抗体および抗 CD 49f抗体からなる群より選択される抗体またはそのフラグメントもしくはその改変体が 使用され得る。
[0178] 本発明の標的物質を細胞内へ導入するための組成物において含まれる標的物質 としては、好ましくは例えば、 DNA、 RNA、ポリペプチド、糖およびこれらの複合体な どが挙げられるがそれらに限定されない。特定の好ましい実施形態では、標的物質と して DNAが選択される。このような DNAは、遺伝子発現を目的とする場合、 目的と する遺伝子をコードすることが好ましい。したがって、トランスフエクシヨンを目的とする 実施形態では、標的物質は、トランスフエタトされるべき遺伝子配列をコードする DN Aを含む。別の好ましい実施形態では、標的物質として RNAが選択される。このよう な RNAは、遺伝子発現を目的とする場合、 目的とする遺伝子をコードすることが好ま しい。この場合、 RNAに適した遺伝子導入剤とともに遺伝子配列をコードする RNA を用いることが好ましい。
[0179] 遺伝子の導入を目的とする実施形態では、本発明の標的物質を細胞内へ導入す るための組成物は、遺伝子導入試薬をさらに含んでいてもよい。理論に束縛されな レ、が、 1つの実施形態では、そのような遺伝子導入試薬と本発明において見出され た細胞接着関連因子とが共同で作用することによって、従来にはない効率よい遺伝 子の細胞内への導入がされると考えられる。
[0180] 好ましい実施形態において、本発明の組成物に含有され得る、そのような遺伝子導 入試薬としては、例えば、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポ リイミン系試薬、リン酸カルシウムなどが挙げられるがそれらに限定されない 1つの好ましい実施形態において、本発明の標的物質を細胞内へ導入するための 組成物は、液相として存在し得る。液相として存在する場合は、本発明は、例えば、 液相トランスフエクシヨン系として有用である。
[0181] 別の好ましい実施形態において、本発明の標的物質を細胞内へ導入するための 組成物は、固相として存在し得る。固相として存在する場合は、本発明は、例えば、 固相トランスフエクシヨン系として有用である。固相トランスフエクシヨンの好ましい実施 形態としては、例えば、マイクロタイタープレートを用いたトランスフエクシヨン系、また はアレイ (もしくはチップ)を用いたトランスフエクシヨン系が挙げられるがそれらに限定 されなレ、。ポリペプチドを導入する際にも、これらの液相および固相の形態は有用で ある。
[0182] (デバイス）
別の局面において、本発明はまた、標的物質の細胞への導入効率を上昇させるた めのデバイスを提供する。このデバイスでは、 A)標的物質;および B)細胞接着関連 因子、を含む、組成物が、固相支持体に固定されている。本発明のデバイスは、通常 の条件下では、ほとんど細胞に導入されない標的物質（例えば、 DNA、 RNA、ポリ ペプチド、糖鎖またはそれらの複合物質など)が、細胞接着関連因子 (代表的には、 インテグリンレセプターの抗体またはその改変体）の作用により、導入が促進されるこ とを予想外に見いだしたことによって完成されたものであり、この場合、本発明は、標 的物質と細胞接着関連因子とが含有された組成物が固相支持体に固定された形式 で提供される。このような細胞接着関連因子としては、上述したように、本発明の標的 物質の細胞への導入効率を上昇させるための組成物において適用される形態を当 業者が任意に選択して本発明を実施することができる。したがって、好ましくは、細胞 接着関連因子は、インテグリンレセプターの抗体またはその改変体であり得る。より好 ましくは、抗 CD49a抗体、抗 CD49b抗体、抗 CD49c抗体、抗 CD49e抗体および 抗 CD49f抗体からなる群より選択される抗体またはそのフラグメントもしくはその改変 体が使用され得る。
[0183] 本発明のデバイスにおいて含まれる標的物質としては、好ましくは例えば、 DNA、 RNA、ポリペプチド、糖およびこれらの複合体などが挙げられるがそれらに限定され なレ、。特定の好ましい実施形態では、標的物質として DNAが選択される。このような DNAは、遺伝子発現を目的とする場合、 目的とする遺伝子をコードすることが好まし レ、。したがって、トランスフエクシヨンを目的とする実施形態では、標的物質は、トラン スフヱタトされるべき遺伝子配列をコードする DNAを含む。
[0184] 遺伝子の導入を目的とする実施形態では、本発明のデバイスは、遺伝子導入試薬 をさらに含んでいてもよい。理論に束縛されないが、 1つの実施形態では、そのような 遺伝子導入試薬と本発明において見出された細胞接着関連因子とが共同で作用す ることによって、従来にはない効率よい遺伝子の細胞内への導入がされると考えられ る。デバイスでは固相支持体に組成物が固定されることから、遺伝子導入試薬として は、固相支持体への適合性があるものを使用することが好ましい。
[0185] 好ましい実施形態において、本発明のデバイスにおいて用いられる固相支持体は 、プレート、マイクロウヱノレプレート、チップ、スライドグラス、フイノレム、ビーズおよび金 属からなる群より選択されるものであってもよい。
[0186] 特定の実施形態において、本発明のデバイスが固相支持体としてチップが用いら れる場合、そのようなデバイスは、アレイとも称され得る。アレイには、通常、導入が意 図される生体分子（例えば、 DNA、タンパク質など）が基板上に整列またはパターン 化されて配置されている。そのようなアレイのうち、トランスフエクシヨンを目的とするも のは、本明細書においてトランスフエクシヨンアレイとも呼ばれる。本発明では、従来 のシステムでは達成不可能であった、幹細胞などでもトランスフエクシヨンが生じること が判明した。従って、本発明の細胞接着関連因子を使用した組成物、デバイスおよ び方法は、どのような細胞でも実施可能なトランスフエクシヨンアレイを提供するという 、従来にはなかった予想外の効果を達成することになる。
[0187] ここで、本発明のデバイスにおいて使用される固相支持体はコーティングされること が好ましい。コーティングすることによって、固相支持体および基板の品質向上 (例え ば、寿命の向上、耐酸性などの耐環境性の向上）、固相支持体または基板に結合さ れるべき物質への親和性および細胞への親和性が高くなるからである。好ましい実 施形態において、そのようなコーティングにおいて、ポリ _L_リジン、シラン（たとえば 、 APS ( —ァミノプロビルシラン））、 MAS、疎水性フッ素樹脂、エポキシシランまた はメルカプトシランのようなシラン、金のような金属を含むコーティング剤が使用される 。好ましくは、コーティング剤は、ポリ L リジンである。
[0188] (細胞導入効率上昇方法）
別の局面において、本発明は、標的物質の細胞への導入効率を上昇させるための 方法を提供する。本発明は、通常の条件下では、ほとんど細胞に導入されない標的 物質 (例えば、 DNA、 RNA、ポリペプチド、糖鎖またはそれらの複合物質など）を、 細胞接着関連因子とともに細胞に提示する（好ましくは、接触させる）ことによって、そ の標的物質が効率よく細胞に導入されるという作用をはじめて見出したことによって 完成された発明である。従って、本発明の方法は、 A)標的物質を提供する工程; B) 細胞接着関連因子を提供する工程を順不同に包含し、 C)該標的物質および該細胞 接着関連因子を該細胞に接触させる工程をさらに包含する。ここで、標的物質およ び細胞接着関連因子は、一緒に提供されてもよぐ別々に提供されてもよい。細胞接 着関連因子としては、上述の本発明の標的物質の細胞内への導入の効率を上昇さ せるための組成物において詳述した形態が適用され得る。そのような形態は、当業 者は、本明細書の記載に基づけば、適切な形態を選択し実施することができる。した がって、このような細胞接着関連因子としては、本発明の標的物質の細胞への導入 効率を上昇させるための組成物において適用される形態を当業者が任意に選択し て本発明を実施することができる。好ましくは、細胞接着関連因子は、インテグリンレ セプターの抗体またはその改変体であり得る。より好ましくは、抗 CD49a抗体、抗 C D49b抗体、抗 CD49c抗体、抗 CD49e抗体および抗 CD49f抗体からなる群より選 択される抗体またはそのフラグメントもしくはその改変体が使用され得る。
[0189] 本発明の方法において使用される標的物質としては、好ましくは例えば、 DNA、 R NA、ポリペプチド、糖およびこれらの複合体などが挙げられるがそれらに限定されな レ、。特定の好ましい実施形態では、標的物質として DNAが選択される。このような D NAは、遺伝子発現を目的とする場合、 目的とする遺伝子をコードすることが好ましい 。したがって、トランスフエクシヨンを目的とする実施形態では、標的物質は、トランスフ ヱタトされるべき遺伝子配列をコードする DNAを含む。
[0190] 遺伝子の導入を目的とする実施形態では、本発明の方法では、遺伝子導入試薬を さらに使用してもよい。理論に束縛されないが、 1つの実施形態では、そのような遺伝 子導入試薬と本発明において見出された細胞接着関連因子とが共同で作用するこ とによって、従来にはない効率よい遺伝子の細胞内への導入がされると考えられる。 遺伝子導入試薬の提供は、標的物質および/または細胞接着関連因子と一緒でも よぐ別々であってもよい。好ましくは、標的物質と遺伝子導入試薬との間で複合体を 形成させてから細胞接着関連因子が提供されることが有利であり得る。理論に束縛さ れないが、そのような順番で行うことが導入効率を上げるようであるからである。
[0191] 好ましい実施形態において、本発明の方法において使用され得る、そのような遺伝 子導入試薬としては、例えば、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試 薬、ポリイミン系試薬、リン酸カルシウムなどが挙げられるがそれらに限定されない。
[0192] 本発明において対象となる細胞は、標的物質の導入が意図される限り、どのような 細胞を包含してもよぐ例えば、幹細胞、体細胞などが挙げられる。本発明の顕著な 効果は、幹細胞、体細胞など細胞の種類を問わず、どのような細胞でもほぼ満遍なく トランスフエクシヨンのような標的物質の導入が達成されることにあり、これは従来の方 法にはなかった予想外の効果といえる。好ましくは、幹細胞のうち、対象には組織幹 細胞が包含され得るがそれに限定されず、胚性幹細胞もまた対象として包含され得 る。理論に束縛されないが、幹細胞のうちでは、組織幹細胞が胚性幹細胞よりも導入 効率がょレ、ようであるからである。
[0193] 1つの特定の実施形態において、本発明の標的物質細胞導入方法は、その一部ま たは全部が液相中で行われ得る。別の特定の実施形態において、本発明の標的物 質細胞導入方法は、その一部または全部が固相上で行われ得る。従って、本発明の 標的物質細胞導入方法は、液相中と固相上との組み合わせで行うことも可能である
[0194] (支持体上での細胞導入効率上昇方法）
別の局面において、本発明は、支持体を利用した標的物質の細胞への導入効率 を上昇させるための方法を提供する。本発明は、通常の条件下では、ほとんど細胞 に導入されない標的物質 (例えば、 DNA、 RNA、ポリペプチド、糖鎖またはそれらの 複合物質など)を支持体上に固定し、細胞接着関連因子とともに細胞に提示する (好 ましくは、接触させる）ことによって、その標的物質が効率よく細胞に導入されるという 作用をはじめて見出したことによって完成された発明である。支持体で標的物質 (特 に DNA、好ましくは、トランスフエタトされるべき遺伝子をコードする配列を含む DNA )の導入効率が上昇したという効果は、従来技術では達成不可能であり、その達成す ら予測されていなかったことから、当該分野において顕著なブレークスルーをもたら すということができる。従って、本発明の固相支持体を利用した方法は、 I)A)標的物 質；および B)細胞接着関連因子、を含む組成物、を支持体に固定する工程; II)該 支持体上の該組成物に細胞を接触させる工程、を包含する。細胞接着関連因子とし ては、上述の本発明の標的物質の細胞内への導入の効率を上昇させるための組成 物において詳述した形態が適用され得る。そのような形態は、当業者は、本明細書 の記載に基づけば、適切な形態を選択し実施することができる。したがって、このよう な細胞接着関連因子としては、本発明の標的物質の細胞への導入効率を上昇させ るための組成物において適用される形態を当業者が任意に選択して本発明を実施 すること力 Sできる。好ましくは、細胞接着関連因子は、インテグリンレセプターの抗体 またはその改変体であり得る。より好ましくは、抗 CD49a抗体、抗 CD49b抗体、抗 C D49c抗体、抗 CD49e抗体および抗 CD49f抗体からなる群より選択される抗体また はそのフラグメントもしくはその改変体が使用され得る。
[0195] 標的物質として使用される場合、 DNAは裸 (Naked DNA)で提供されてもよいが 、好ましくは、制御配列（プロモーターなど）とともにベクター（プラスミド）を用いて提供 されることが有利であり得る。そのような場合、 DNAは作動可能に制御配列に連結さ れることが好ましい。
[0196] 本発明の方法はまた、好ましくは、遺伝子導入試薬を提供する工程をさらに包含し 、ここで、遺伝子導入試薬は、細胞に接触されるように提供される。遺伝子導入試薬 の使用は、本発明の方法において導入効率をさらに向上させることから好ましい。遺 伝子導入試薬の提供は、当該分野において周知であり、例えば、遺伝子導入試薬 が溶解した溶液を実験系に添加することなどが挙げられるがそれに限定されない。好 ましくは、遺伝子導入試薬は、標的物質である DNAと複合体を形成させた後、細胞 接着関連因子が提供される。理論に束縛されないが、このような順序をとることによつ て、固相支持体上での標的物質の細胞への導入効率が飛躍的に上昇することが判 明しているからである。
[0197] 1つの実施形態では、遺伝子導入試薬 (例えば、カチオン性脂質) -標的物質複合 体は、標的物質 (例えば、発現ベクター中の DNA)および遺伝子導入試薬を含み、 これは水または脱イオン水のような適切な溶媒中に溶解される。この溶液をスライドの ような表面にスポットし、それにより特定の位置に遺伝子導入試薬-標的物質複合体 が付着された表面を生成する。その後、適宜細胞接着関連因子が添加される。スポ ットした遺伝子導入試薬 -標的物質複合体がスライドに付着され、そしてこの方法の その後の工程で使用される条件下で、そのスポットがこの付着された位置に留まるよ うに十分乾燥させる。例えば、遺伝子導入試薬一標的物質複合体を、ポリ _L_リジン ( Sigma, Inc.など力、ら入手可能）でコーティングしたガラススライドのようなスライドま たはチップ上に、例えば手動で、またはマイクロアレイ製造機を用いてスポットする。 その後、このスライドまたはチップを室温もしくは室温より高い温度で、または減圧乾 燥させることによって、 DNAスポットをスライドに付着することができる。十分な乾燥が 起こるのに必要な時間の長さは、表面に配置された混合物の量および使用された温 度および湿度条件のようないくつかの因子による。本発明では、細胞接着関連因子 は、複合体が付着された後に提供されることが好ましい。
[0198] 混合物中に存在する DNAの濃度は、各用途のために実験的に決定されるが、一 般的には約 0.01/1 §//11カら約0.2μ§//ι1の範囲であり、特定の実施形態では 約 0· 02/1 §//11カら約0.10 gZ/ lである。あるいは、遺伝子導入試薬一標的物 質複合体中に存在する DNAの濃度は、約 0· 01/1 §/ 1カら約0.5/1 §//11、約0 . Olug u 1力ら約 0.4 μ g/ μ 1、および糸勺 0. Olug u 1力、ら糸勺 0.3ug u 1で あり得る。同様に、細胞接着関連因子、または遺伝子導入試薬のような別のキャリア 高分子の濃度は、各用途のために実験的に決定されるが、一般的には 0.01%から 0.5%の範囲であり、特定の実施形態では約 0.05%力、ら約 0.5%、約 0.05%力ら 約 0.2%、または約 0.1%から約 0.2%である。細胞接着関連因子一標的物質複合 体中の DNAの最終的な濃度 (例えば、細胞接着関連因子中の DNA)は、一般的に は約 0.02μ gZ x 1力、ら約 0.1 μ g/μ 1であり、そして別の実施形態では、 DNAは 約 0. 05 / g/ / lに等しい最終 DNA濃度とされ得る。
[0199] 使用される DNAがベクターに担持されて提供される場合、ベクターはプラスミドま たはウィルスに基づくベクターのような任意の型であり得、そこに目的の DNA (細胞 で発現されるべき DNA)が導入され得、そしてその後その細胞において発現され得 る。そのようなベクターとしては、例えば、 CMV駆動発現ベクターを使用し得る。市販 で入手可能な、 pEGFP (Clontech)または pcDNA3 (Invitrogen)のようなプラスミ ドに基づくベクターまたはウィルスに基づくベクターを使用し得る。この実施形態にお いて、遺伝子導入試薬一標的物質複合体を含むスポットを乾燥させた後、スポットを 有する表面を適切な量の脂質に基づいたトランスフエクシヨン試薬で被覆し、そして 生じた生成物をスポット中の DNAおよび遺伝子導入試薬 (たとえば、カチオン性脂質 などのトランスフエクシヨン試薬）との間の複合体形成に適切な条件下で維持 (インキ ュペート）する。その後に細胞接着関連因子が提供されるか、または同時に細胞接着 関連因子が提供されることが好ましい。 1つの実施形態では、生じた生成物を 25°C で約 20分間インキュベートする。続いて、遺伝子導入試薬を除去し、 DNA (トランス フエクシヨン試薬との複合体中の DNA)を有する表面を生成し、そして適切な培養液 中の細胞を表面上にプレーティングする。生じた生成物（DNAおよびプレーティング した細胞を有する表面）を、プレーティングした細胞への DNAの侵入を引き起こす条 件下で維持する。
[0200] 本発明において使用される場合は、約 1一 2細胞周期が、トランスフエクシヨンが起 こるのに十分であるが、これは使用される細胞の型および条件によって変動し、そし て特定の組み合わせのために適切な時間の長さは、当業者が用意に実験的に決定 され得る。十分な時間が経過した後、トランスフヱクシヨン効率、コードされた産物の発 現、細胞への影響などに関して、公知の方法を用いて評価することができる。例えば 、免疫蛍光の検出、または酵素免疫細胞学、インサイチュハイブリダィゼーシヨン、ォ 一トラジオグラフィー、あるいは DNAの発現またはコードされた産物もしくは DNA自 体による導入された細胞に対する影響を検出する他の手段によって、上記パラメータ を判定することができる。コードされたタンパク質の発現を検出するために免疫蛍光 を使用する場合、タンパク質に結合しかつ蛍光標識された抗体を使用し (例えば、抗 体のタンパク質への結合に適切な条件下でスライドにカ卩える）、そしてタンパク質を含 む位置 (表面上のスポットまたは領域）を、蛍光を検出することによって同定する。蛍 光の存在は、蛍光を示す規定位置においてトランスフエクシヨンが起こり、そしてコー ドされたタンパク質が発現したことを示す。使用された方法によって検出された、スラ イド上のシグナルの存在は、シグナルが検出された特定の位置において、トランスフ ヱクシヨンおよびコードされた産物の発現または細胞における DNA導入が起こったこ とを示す。各特定の位置に存在する DNAの正体は既知であってもよく未知であって もよい；従って、発現が起こった場合、発現したタンパク質の正体も既知であってもよ ぐ未知であってもよい。そのような情報は既知であることが好ましい。従来の情報と 相関付けすることができるからである。
[0201] 本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、そ の全体力 S、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援 用される。
[0202] 以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以 下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は 、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従つ て、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限 定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
実施例
[0203] 以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限 定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬、支持体などは、例外 を除き、 Sigma (St. Louis, USA,和光純薬（大阪、 日本）、松浪硝子 (岸和田、 日 本)などから市販されるものを用いた。
[0204] (実施例 1：細胞接着関連因子混合物の調製）
細胞接着関連因子の候補として、種々の細胞接着関連因子を準備した。この実施 例において調製したものは以下のとおりである。抗体は、市販のものを用いた力、あ るいは、インテグリンレセプターに対して抗体を惹起することによって調製した。ポリべ プチドは、市販のものを使用した力 \または遺伝子操作し発現させたものを用いた。 CD29、 CD49ファミリーについては、抗体惹起には、配列番号 3— 14に記載のアミ ノ酸配列を用いて作製することもできる。
1)フイブロネクチン（配列番号 1)；
2) CD49a抗体（IMMUN〇TECH (a coulter company) , france, monocl onal antibody CD49a— VLA alfal Cat. No. 1599//COSMOBIO, J apan, mouse— ANTIratCD49a)。
3) CD49b抗体（IMMUNOTECH (a coulter company) , france, monocl onal antibody CD49b Cat. No. 0717)。
4) CD49c抗体（IMMUN〇TECH (a coulter company) , france, monocl onal antibody CD49c Cat. No2000)。
5) CD49d抗体（IMMUNOTECH (a coulter company) , france, monocl onal antibody CD49d Cat. No0764// ENDOGEN, USA, mouse— ANTIratCD49d)。
6) CD49e抗体（IMMUNOTECH (a coulter company) , france, monocl onal antibody CD49e Cat. No. 0771)。
7) CD49f抗体（IMMUN〇TECH (a coulter company) , france, monocl onal antibody CD49f Cat. No. 0769// AntigenixAmerica, USA, mouse— ANTIratCD49f, PRO. NO. MR49662C 。
8) CD29抗体（IMMUNOTECH (a coulter company) , france, monoclo nal antibody CD29 Cat. Nol l 5:0。
[0205] これらの抗体 ·細胞接着関連因子を指定の用法 ·用量にて reconstitutionした溶 液を PBSにて 100 5000倍に希釈した後、ガラススライド表面上に播種し乾燥させ た。乾燥した後 PBSにてよく洗浄し、その上に遺伝子導入試薬、遺伝子の複合体を プリントする。それらのガラススライドに目的の細胞を播種し固相系遺伝子導入法を 行う。 PC12細胞などについては抗ラットモノクローナル抗体を用いた。
[0206] このインテグリンレセプターと、認識される細胞外マトリクスとの関係を図 1に示す。
[0207] DNAとしてトランスフエクシヨンのためのプラスミドを調製した。プラスミドとして、 pE GFP— Nlおよび pDsRed2— Nl (ともに BD Biosciences, Clontech, CA、 USA) を用いた。これらのプラスミドでは、遺伝子発現はサイトメガロウィルス（CMV)の制御 下にある。プラスミド DNAを、 Ε· coli (XLl blue, Stratgene, TX, USA)中で増 幅し増幅したプラスミド DNAを複合体パートナーの一方として用いた。 DNAは、 DN aseも RNaseも含まなレ、蒸留水中に溶解した。
[0208] 使用したトランスフエクシヨン試薬は以下の通りである： Effectene Transfection Reagent (cat. no. 301425, Qiagen, CA) , TransFastTM Transfection Re agent (E2431 , Promega, WI) , TfxTM— 20 Reagent (E2391 , Promega, WI ) , SuperFect Transfection Reagent (301305, Qiagen, CA) , PolyFect T ransfection Reagent (301 105, Qiagen, CA) , LipofectAMINE 2000 Rea gent ( 1 1668-019, Invitrogen corporation, CA) , JetPEI ( X 4) cone. ( 101 —30, Polyplus— transfection, France)および ExGen 500 (R051 1 , Ferment as Inc.， MD)。 LipofectAMINE 2000を用いるのが好ましいようである力 それ に限定されない。トランスフエクシヨン試薬は、上記 DNAおよび細胞接着関連因子に あら力じめ加えるかあるいは DNAと複合体を先に生成してから使用した。
[0209] このようにして調製した溶液を以下のトランスフエクシヨン効率の改善試験に用いた
[0210] (実施例 2 :液相におけるトランスフエクシヨン効率の改善）
本実施例では、液相におけるトランスフエクシヨン効率の改善を観察した。液相トラ ンスフエクシヨンのプロトコルは、 LipofectAMINE 2000、提供する指示書に従つ た。
[0211] 本実施例では、上述のように調製した細胞接着関連因子の有り無しにより、 PC12 細胞を用いて液相トランスフエクシヨンにおけるこれらの物質の効果を調べた。 PC12 (rat pheochromocytoma cells : ATCC CRL-1721 ) これらは、 L— glutお よび penZstrepを含む DMEM/l 0%calf serum (GIBCO)中で培養した。
[0212] 細胞接着関連因子は、 PBS中で 200 μ gZmlのストックとして保存した。全ての希 釈を PBS、 ddH〇またはダルベッコ MEM培地を用いて行った。希釈系列として、例
2
えは、、 0. 2 μ g/ml, 0. 067 z g/ml, 0. 04 μ g/ml, 1. 0 μ g/ml, 5. 0 μ g m 1、 10. 0 μ g/ml, 50. 0 z gZmlなどを調製した。 [0213] その結果、これらの細胞接着関連因子は、液相トランスフエクシヨンにおいて効率を 上げることが明らかになった。特にコラーゲン IVがその効率の上昇に顕著な効果を 有することが明らかになった。
[0214] (実施例 3 :固相におけるトランスフエクシヨン効率の改善）
本実施例では、固相におけるトランスフヱクシヨン効率の改善を観察した。そのプロ トコルを以下に示す。
[0215] (プロトコル）
DNAの最終濃度は、 l x gZ x Lに調整した。細胞接着関連因子は、 ddH O中で
2
200 z g/mlのストックとして保存した。全ての希釈を PBS ddH〇またはダルベッコ
2
MEM培地を用いて行った。希釈系列として、例えば、 0. 2 μ g m 0. 067 z g/ ml 0. 04 μ g/ml, 1. 0 μ gZmlなどを調製した。
[0216] トランスフエクシヨン試薬は、それぞれの製造業者が提供する指示書に従って、使 用し 7
[0217] プラスミド DNA:グリセロールストックから lOOmLの L_amp中でー晚増殖させ、 Qia prep Miniprepまた ίま Qiagen Plasmid Purification Maxiを用レヽて製造 者 が提供する標準プロトコールによって精製した。
[0218] 本実施例では、以下の細胞を利用して、効果を確認した： HepG2 (RCB1648
RIKEN Cell Bank, JPN)。これらは、 L_glutおよび pen/strepを含む DMEM
/ 10 %IFS中で培養した。
[0219] (希釈および DNAのスポット）
トランスフエクシヨン試薬と DNAとを混合して DNA—トランスフエクシヨン試薬複合体 を形成させる。複合体形成にはある程度の時間が必要であることから、上記混合物を
、ピペットを用いて固相支持体 (例えば、ポリ _L_リジンスライド）にスポットした。
[0220] 複合体形成およびスポット固定のために、真空乾燥機中で一晩スライドを乾燥させ た。
[0221] 細胞接着関連因子は、上記複合体形成時に使用してもよいが、本実施例では、固 相支持体 (例えば、ポリ _L_リジンスライド）へ物理的にコートした。これらの抗体'糸田 胞接着関連因子を指定の用法 ·用量にて再構成した溶液を PBSにて 100— 5000 倍に希釈した後、ガラススライド表面上に播種し乾燥させた。乾燥した後 PBSにてよ く洗浄し、その上に遺伝子導入試薬、遺伝子の複合体をプリントする。それらのガラ ススライドに目的の細胞を播種し固相系遺伝子導入法を行った。
[0222] (混合液の調製および固相支持体への適用）
(細胞の分配）
次に、細胞を添カ卩するプロトコルを示す。トランスフエタトのために細胞を分配した。 この分配は、通常、フード内で試薬を減圧吸引して行った。スライドを皿に置き、そし てトランスフエクシヨンのために細胞を含む溶液を加えた。細胞の分配は、以下のとお りである。
[0223] 細胞の濃度が 25mL中 107細胞になるように、増殖中の細胞を分配した。四角の 10 0 100 1 5111111のぺトリ皿または半径100111111 15mmの円开ディッシュ中で、ス ライド上に細胞をプレーティングした。約 40時間、トランスフエクシヨンを進行させた。 これは、約 2細胞周期にあたる。免疫蛍光のためにスライドを処理した。
[0224] (遺伝子導入の評価）
遺伝子導入の評価は、例えば、免疫蛍光、蛍光顕微鏡検査、レーザー走査、放射 性標識および感受性フィルムまたはェマルジヨンを用いた検出によって達成した。
[0225] 可視化されるべき発現されたタンパク質が蛍光タンパク質であるなら、それらを蛍光 顕微鏡検査で見てそして写真を撮ることができる。大きな発現アレイに関しては、スラ イドをデータ保存のためにレーザースキャナーで走査し得る。発現されたタンパク質 を蛍光抗体が検出し得るなら、免疫蛍光のプロトコールが引き続いて行うことができる 。検出が放射能に基づくなら、スライドを上記で示したように付着し得、そしてフィルム またはェマルジヨンを用いたオートラジオグラフィ一によつて放射能を検出することが できる。
[0226] (レーザー走查および蛍光強度定量）
トランスフエクシヨン効率を定量するために、本発明者らは、共焦点レーザー顕微鏡
(LSM510、 Carl Zeiss Co. , Lrd)を使用した。総蛍光強度（任意の単位）を測 定した後、表面積あたりの蛍光強度を計算した。
[0227] (結果） 図 2Aに一例として HepG2細胞を用いた場合の種々の細胞接着関連因子および フイブロネクチンを用いた結果を示す。図 2Bは別の例として、 HepG2細胞を用いた 実験において、別の細胞接着関連因子（HLA、 CD46および CD54)を用いたトラン スフヱクシヨン効率の結果を示す。
[0228] 結果から明ら力、なように、 CD49ファミリー抗体は、フイブロネクチンと同様に、顕著 にトランスフエクシヨンが起こっていた。従って、細胞接着関連因子は、トランスフエク シヨン効率を顕著に上昇させることが実証された。
[0229] 図 3Aには、 HepG2細胞上に発現する各種インテグリンレセプター（CD49a, d, f) と認識される細胞外マトリクスの関係、各細胞外マトリクスコーティングされた表面での トランスフヱクシヨン効率を示す。図 3B— 3Eには、各種細胞接着関連因子をコーティ ングした場合のトランスフヱクシヨン後の細胞の変化を示す。
[0230] 細胞接着関連因子の効果はトランスフエクシヨンの効率を上げていた。従って、トラ ンスフエクシヨン可能とされていた HEK293、 HeLa, 3T3はもちろん、トランスフエク シヨンが困難とされていた HepG2でも、 HeLaおよび 3T3に匹敵するトランスフエクシ ヨン効率が達成された。このような効果は、従来のトランスフエクシヨン系では決して達 成されなかったことであり、事実上すベての細胞についてトランスフエクシヨン効率を さらに上昇させることができ、実用に耐え得るトランスフエクシヨンをすベての細胞に提 供する系が史上初めて提供されたことになる。また、固相条件を採用したことによって 、相互夾雑も顕著に減少した。従って、固相支持体を使用する場合本発明は、集積 ィ匕バイオアレイを製造するために適切な方法であることが実証された。
[0231] また、種々のプレートを用いた場合、コーティングをしたときには、コーティングをし ていない場合よりも夾雑が少なくなつており、トランスフヱクシヨン効率も上昇している ようであることが明らかになった。
[0232] さらに、トランスフヱクシヨン効率は、抗体の濃度の上昇に伴って上昇することが明ら かになつた。ただし、一定濃度で効率がプラトーに達していることがわかる。
[0233] (実施例 4 : PC12細胞での実証）
神経様細胞として知られる、 PC12細胞を用いて、分化細胞でも本発明の細胞接着 関連因子の効果が見られるかどうかを観察した。 [0234] 実施例 3に従って、各種試薬および細胞を調製した。ただし、 PC12細胞は以下の 手順に従った。
[0235] PC12(rat pheochromocytoma cells:ATCC CRL-1721)これらは、 L_glutおよび pen /strepを含む DMEM/lO。/0calfserum (GIBCO)中で培養した。細胞の濃度が 25 mL中 107細胞になるように、増殖中の細胞を分配した。四角の 100 X 100 X 15mm のペトリ皿または半径 lOOmm X 15mmの円形ディッシュ中で、スライド上に細胞をプ レーティングした。約 48時間、トランスフエクシヨンを進行させた。免疫蛍光のためにス ライドを処理した。
[0236] (結果）
結果を図 4一 7に示す。図 4は、実施例 3における図 3Aと同様の結果を示す。見ら れるように、フイブロネクチンで効果が薄い PC12細胞でも、本発明の細胞接着関連 因子は、トランスフエクシヨン効率を上昇させることが明らかになった。
[0237] 図 5A— Bには、細胞接着の様子を示す、図 6にはトランスフエクシヨンの様子を対 比した写真を示す。図 5A— Bには、実施例 4における PC12細胞の細胞接着の様子 を示す。 CD抗体を用いた PC12細胞の TypelVコラーゲンコート表面への接着阻害お よびトランスフエクシヨン。ポリ- L-リシンコートスライドガラス上に TypelVコラーゲンコー ト。その後、あらかじめ抗体溶液を接触させておいた PC12細胞を播種し通常 (液相系 )のプロトコールに従い Lipofectamin2000を用いてのトランスフエクシヨンを行った。図 5Aは抗 CD49aにおいては TypelVコラーゲンコート表面への PC12細胞の接着が顕 著に阻害された。抗 CD49dにおいては PC12細胞の接着は阻害されず抗体のない Controlと同等のトランスフエクシヨン効率を示す。 PC12細胞は図 4より明らかなように CD49dを発現していない。また、 CD49dはフイブロネクチンに対するレセプターであ り、このことより TypelVコラーゲンコート表面への接着が阻害されなかったためと考え られる。抗体の存在自体はトランスフヱクシヨン効率に影響を与えなレ、。図 5Bは同様 に抗 CD49f共存下におけるトランスフヱクシヨン効率違いを示す。表示されている数 値は抗体のストック溶液を何倍に希釈してあらかじめ PC12細胞に接触させた力、を示 してレ、る。図より明ら力、なようにトランスフヱクシヨン効率は接触させた抗体の濃度依存 的に減少している。 CD49fはラミニンに対するレセプターである力 このことより TypelVコラーゲンコート表面への接着が阻害されいないと考えられる。 PC12細胞は 図 4より明らかなように CD49fを発現しており、ラミニンによりトランスフエクシヨン効率 は上昇することから抗 CD49fはトランスフエクシヨン効率を上昇することができる（図 6 , 7参照）。
[0238] 図 5より明らかなようにトランスフエクシヨン効率は接触させた抗体の濃度依存的に 減少している。 CD49fはラミニンに対するレセプターである力 このことより TypelVコ ラーゲンコート表面への接着が阻害されいないと考えられる。 PC12細胞は図 4より明 らかなように CD49fを発現しており、ラミニンによりトランスフエクシヨン効率は上昇す ることから抗 CD49fはトランスフエクシヨン効率を上昇することができる（図 6， 7参照） と考えられる。その結果図 7に示すように抗 CD49fを用いることによってトランスフエク シヨン効率を上昇させることができることが実証された。
[0239] このように、細胞接着の阻害と、トランスフヱクシヨンの効率の上昇が逆相関であるこ と力 S示された。このようなことは、従来知られておらず、本発明は、細胞接着の促進を 行うことによって、トランスフエクシヨン効率を上昇させることを見出したことから、任意 の細胞において細胞接着を促進することによって、トランスフエクシヨン効率を上げる ことを示す。
[0240] 図 7には、支持体における細胞接着関連因子のコーティングの効果を示す。コラー ゲン IV型をコーティングすると、トランスフエクシヨン効率は上がるようである。
本発明者らが開発した複合体一塩という系を用いることにより、種々の細胞株 (HepG 2)に対して高いトランスフエクシヨン効率ならびに密集したアレイ中での空間的な局 在の獲得を可能にする固相系トランスフエクシヨンが達成された。細胞接着関連因子 を利用した固相系トランスフエクシヨンの概略を、図 8に示す。
[0241] 固相系トランスフエクシヨンにより、インビボ遺伝子送達のために使用され得る「トラン スフヱクシヨンパッチ」の技術的な達成ならびに HepG2、 PC12における高スループ ットの遺伝子機能研究のための固相系トランスフエクシヨンアレイ（SPTA)が可能に なることが判明した。
[0242] 哺乳動物細胞をトランスフエタトするための多数の標準的な方法が存在するが、遺 伝物質の HepG2、 PC12などの細胞株への導入については、 HEK293、 HeLaな どの細胞株を比較して不便かつ困難であることが知られている。従来使用されるウイ ルスベクター送達またはエレクト口ポレーシヨンのいずれも重要である力 潜在的な毒 性（ウィルス方法）、ゲノムスケールでの高スループット分析を受けにくいこと、および インビボ研究に対して制限された適用性 (エレクト口ポレーシヨンに関して）のような不 便さが存在する。
[0243] 固相支持体に簡便に固定することができ、かつ徐放性および細胞親和性を保持し た固相支持体固定系が開発されたことにより、これらの欠点のほとんど克服すること ができた。
[0244] マイクロプリンティング技術を使用する本発明者らの技術を用いて、選択された遺 伝物質、トランスフエクシヨン試薬および適切な細胞接着分子、ならびに塩を含む混 合物を、固体支持体上に固定化し得た。混合物を固定化した支持体の上での細胞 培養は、その培養細胞に対する、混合物中の遺伝子の取り込みを可能にした。その 結果、支持体一接着細胞における、空間的に分離した DNAの取り込みを可能にした
[0245] 本実施例の結果、いくつかの重要な効果が達成された：高レ、トランスフエクシヨン効 率（その結果、統計学的に有意な細胞集団が研究され得る）、異なる DNA分子を支 持する領域間の低い相互夾雑 (その結果、個々の遺伝子の効果が、別々に研究され 得る）、トランスフエタト細胞の長期生存、高スループットの互換性のある形式および 簡便な検出方法。 SPTAは、これらの基準を全て満たすことは、さらなる研究のため の適切な基盤となることになる。
[0246] これらの目的の達成を明確に確立するために、上述のように本発明者らは、 HepG 2およびフイブロネクチンでは効率が悪い分化細胞（PC12細胞）を、本発明者らの方 法論（固相系でのトランスフエクシヨン）および従来の液相系トランスフエクシヨンの両 方を用いて一連のトランスフヱクシヨン条件下で研究した。
[0247] トランスフエクシヨン効率：トランスフエクシヨン効率を、単位面積あたりの総蛍光強度 として決定した。使用した細胞株に従って、最適な液相の結果を得た。次いで、これ らの効率的なトランスフヱクシヨン試薬を、固相系プロトコルの最適化に使用した。レ、く つかの傾向が観察された:容易にトランスフヱタト可能な細胞株 (例えば、 HEK293、 HeLa、 NIH3T3)の場合、固相系プロトコルで観察されたトランスフエクシヨン効率は 、標準的な液相系プロトコルと比較してわずかに優れていたが、本質的に類似したレ ベルで達成されている。
[0248] しかし、細胞をトランスフエタトするのが困難な場合（例えば、 PC12細胞、および He pG2)において SPTA方法論に最適化した条件を用いることによって、本発明者らは 、特に PC12細胞の場合、細胞の特徴を維持しながら、トランスフエクシヨン効率が 10 0倍まで増加したことを観察した。予備的実験の結果では HeLa細胞では上記のよう に本質的に高レ、トランスフエクシヨン効率を示した。
[0249] チップ上での高レ、トランスフエクシヨン効率の達成のための重要な点は、使用される ガラスコーティングである。 PLL力 トランスフエクシヨン効率および相互夾雑の両方 に関して、最良の結果を提供することを発見した。細胞接着関連因子を使用しない 場合、少数のトランスフエタト体を観察した (他のすべての実験条件は一定に保った） 。完全に確立したわけではないが、細胞接着関連因子の役割はおそらぐ DNAの導 入が可能になる時間を制限するということである。
[0250] 低い相互夾雑： SPTAプロトコルで観察されたより高レ、トランスフエクシヨン効率は別 として、本技術の重要な利点は、別個に分離された細胞アレイの実現であり、その各 位置では、選択した遺伝子が発現する。本発明者らは、細胞接着関連因子でコーテ イングしたガラス表面上に、 JetPEIおよびフイブロネクチンと混合した 2つの異なるレ ポーター遺伝子をプリントした。得られたトランスフエクシヨンチップを適切な細胞培養 に提供した。最良であると見出された実験条件下において、発現された GFPおよび RFPは、それぞれの cDNAがスポットされた領域に局在した。相互夾雑はほとんど観 察されなかった。
[0251] この確立された技術は、経済的な高スループットの遺伝子機能スクリーニングの状 況において特に重要である。実際に、必要とされるトランスフエクシヨン試薬および D NAの量が少量であること、ならびに全プロセス（プラスミドの単離から検出まで）を自 動化が可能であることは、上記の方法の有用性を増大する。
[0252] 結論として、本発明者らは、細胞接着関連因子を用いた系で、 PC12細胞および h MSCトランスフヱクシヨンアレイを好首尾に実現した。このことは、多能性幹細胞の分 化を制御する遺伝子機構の解明など、固相系トランスフエクシヨンを利用した種々の 研究における高スループット研究を可能にすることになる。固相系トランスフエクシヨン の詳細な機構ならびに高スループットのリアルタイム遺伝子発現モニタリングに対す るこの技術の使用に関する方法論は種々の目的に応用可能であることが明らかにな つた。
[0253] (実施例 5：ヒト間葉系幹細胞での実証）
トランスフエクシヨンについては、実施例 3に記載されるように固相トランスフエクショ ン法を用いて行った。
[0254] 細胞の調製は以下のとおりであった。 hMSCs (ヒト間葉系幹細胞、 PT_2501、 Ca mbrex Bioscience Walkersville, Inc.， MD)、ヒト MSC細胞の場合、この細胞 を、市販のヒト間葉細胞基底培地（MSCGM BulletKit PT—3001 , Cambrex Bioscience Walkersville, Inc. , MD)中で維持した。
[0255] 実施例 4の結果と同様に、本発明者らは、細胞接着関連因子を用いた系で、ヒト間 葉系幹細胞でのトランスフエクシヨンアレイを好首尾に実現した。このことは、多能性 幹細胞の分化を制御する遺伝子機構の解明など、固相系トランスフエクシヨンを利用 した種々の研究における高スループット研究を可能にすることになる。固相系トランス フエクシヨンの詳細な機構ならびに高スループットのリアルタイム遺伝子発現モニタリ ングに対するこの技術の使用に関する方法論は種々の目的に応用可能であることが 明らかになった。
[0256] (実施例 6：ヒト神経芽細胞腫での実証）
SHSY5Y (humanneuroblastoma： ATCC CRL—2266)を用レ、て、神経芽細胞月重 でのトランスフヱクシヨン効率の上昇を実証した。
[0257] トランスフエクシヨンは実施例 3に記載されるように行った。細胞の調製は、 L-グノレタ ミンおよび pen/strepを含む DMEMZlO%FBS中で培養することによって行った
[0258] 実施例 4の結果と同様に、本発明者らは、細胞接着関連因子を用いた系で、ヒト神 経芽細胞腫でのトランスフヱクシヨンアレイを好首尾に実現した。このことは、癌細胞 の分化を制御する遺伝子機構の解明など、固相系トランスフエクシヨンを利用した種 々の研究における高スループット研究を可能にすることになる。固相系トランスフエク シヨンの詳細な機構ならびに高スループットのリアルタイム遺伝子発現モニタリングに 対するこの技術の使用に関する方法論は種々の目的に応用可能であることが明らか になった。
[0259] 以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発 明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解され る。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体 的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として 援用されるべきであることが理角军される。
産業上の利用可能性
[0260] 本発明により、固相でも液相でも実施することができる、トランスフエクシヨンの効率 上昇が達成された。このようなトランスフエクシヨン効率上昇試薬は、特に固相でのトラ ンスフエクシヨンを実施するために有用である。従って、遺伝子操作を使用する任意 の分野において有用である。

Claims

請求の範囲
[I] 細胞接着関連因子を含む、標的物質の細胞への導入効率を上昇させるための組成 物。
[2] 前記細胞接着関連因子は、細胞接着分子と相互作用する相互作用物質を含む、標 的物質の細胞への導入効率を上昇させるための組成物。
[3] 前記細胞接着分子は、細胞外マトリクスである、請求項 2に記載の組成物。
[4] 前記細胞接着分子は、インテグリンレセプターを含む、請求項 2に記載の組成物。
[5] 前記細胞接着分子は、 RGD分子を含む、請求項 2に記載の組成物。
[6] 前記相互作用物質は、前記細胞接着分子のパートナーと抗原抗体反応する、請求 項 1に記載の組成物。
[7] 前記相互作用物質は、抗体またはその誘導体である、請求項 1に記載の組成物。
[8] 前記相互作用物質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項 1に記載の組成物。
[9] 前記相互作用物質は、抗 CD49a抗体、抗 CD49b抗体、抗 CD49c抗体、抗 CD49 e抗体および抗 CD49f抗体からなる群より選択される抗体を含む、請求項 1に記載の 組成物。
[10] 前記標的物質は、遺伝物質を含む、請求項 1に記載の組成物。
[II] 前記標的物質は、核酸分子を含む、請求項 1に記載の組成物。
[12] 前記標的物質は、 DNAを含む、請求項 1に記載の組成物。
[13] 前記インテグリンレセプターは、 CD49a、 CD49b、 CD49c、 CD49d、 CD49e、 CD
49f、ならびに CD29からなる群より選択される、請求項 4に記載の組成物。
[14] 前記インテグリンレセプターは、 CD29、 CD49a、 CD49c、 CD49d、 CD49eおよび
CD49fからなる群より選択される、請求項 4に記載の組成物。
[15] 前記インテグリンレセプターは、コラーゲン、フイブロネクチン、ビトロネクチンおよびラ ミニンからなる群より選択される分子と相互作用する、請求項 4に記載の組成物。
[16] 前記細胞は、幹細胞および分化細胞からなる群より選択される少なくとも 1つの細胞 を含む、請求項 1に記載の組成物。
[17] 前記細胞接着分子は、前記細胞に特異的に発現される、請求項 1に記載の組成物。
[18] 前記標的物質は、遺伝物質であり、さらに遺伝子導入試薬を含む、請求項 1に記載 の組成物。
[19] 前記遺伝子導入試薬は、カチオン性高分子、カチオン性脂質およびリン酸カルシゥ ムからなる群より選択される、請求項 18に記載の組成物。
[20] さらに、粒子を含む、請求項 1に記載の組成物。
[21] 前記粒子は、金コロイドを含む、請求項 20に記載の組成物。
[22] さらに、塩を含む、請求項 1に記載の組成物。
[23] 前記塩は、緩衝剤に含まれる塩類および培地に含まれる塩類からなる群より選択さ れる、請求項 22に記載の組成物。
[24] 遺伝子導入効率を上昇させるためのキットであって、
(a)細胞接着関連因子；および
(b)遺伝子導入試薬、
を備える、キット。
[25] 標的物質を細胞内へ導入するための糸且成物であって、
A)標的物質、
B)細胞接着関連因子、
を含む、組成物。
[26] 前記標的物質は、 DNA、 RNA、ポリペプチド、糖およびこれらの複合体からなる群 より選択される物質を含む、請求項 25に記載の組成物。
[27] 前記標的物質は、トランスフエタトされるべき遺伝子配列をコードする DNAを含む、 請求項 25に記載の組成物。
[28] さらに、遺伝子導入試薬を含む、請求項 25に記載の組成物。
[29] 前記細胞接着関連因子は、細胞接着分子と相互作用する相互作用物質を含む、請 求項 25に記載の組成物。
[30] 前記細胞接着関連因子は、細胞接着分子の抗体を含む、請求項 25に記載の組成 物。
[31] 液相として存在する、請求項 25に記載の組成物。
[32] 固相として存在する、請求項 25に記載の組成物。
[33] 標的物質の細胞への導入効率を上昇させるためのデバイスであって、
A)標的物質;および
B)細胞接着関連因子、
を含み、該細胞接着関連因子が、支持体に固定された、デバイス。
[34] 前記標的物質は、 DNA、 RNA、ポリペプチド、糖およびこれらの複合体からなる群 より選択される物質を含む、請求項 33に記載のデバイス。
[35] 前記標的物質は、遺伝子発現することを目的とする遺伝子配列をコードする DNAを 含む、請求項 33に記載のデバイス。
[36] 遺伝子導入試薬をさらに含む、請求項 33に記載のデバイス。
[37] 前記細胞接着関連因子は、細胞接着分子と相互作用する相互作用物質を含む、請 求項 36に記載のデバイス。
[38] 前記細胞接着関連因子は、細胞接着分子の抗体を含む、請求項 36に記載のデバ イス。
[39] 前記支持体は、プレート、マイクロウェルプレート、チップ、スライドグラス、フィルム、ビ ーズおよび金属からなる群より選択される、請求項 36に記載のデバイス。
[40] 前記支持体は、コーティング剤でコーティングされる、請求項 36に記載のデバイス。
[41] 前記コーティング剤は、ポリ- L-リジン、シラン、 MAS,疎水性フッ素樹脂および金 属からなる群より選択される物質を含む、請求項 40に記載のデバイス。
[42] 標的物質の細胞への導入効率を上昇させるための方法であって、
A)標的物質を提供する工程；
B)細胞接着関連因子を提供する工程；
C)該標的物質および該細胞接着関連因子を該細胞に接触させる工程、 を包含する、方法。
[43] 前記標的物質は、 DNA、 RNA、ポリペプチド、糖、およびこれらの複合体からなる群 より選択される物質を含む、請求項 42に記載の方法。
[44] 前記標的物質は、トランスフエタトされるべき遺伝子配列をコードする DNAを含む、 請求項 43に記載の方法。
[45] 遺伝子導入試薬を提供する工程をさらに包含し、該遺伝子導入試薬は、前記細胞 に接触される、請求項 42に記載の方法。
[46] 前記細胞接着関連因子は、細胞接着分子と相互作用する相互作用物質を含む、請 求項 42に記載の方法。
[47] 前記細胞接着関連因子は、細胞接着分子の抗体を含む、請求項 42に記載の方法。
[48] 前記細胞接着分子は、細胞外マトリクスである、請求項 46に記載の方法。
[49] 前記工程は、液相中で行われる、請求項 42に記載の方法。
[50] 前記工程は、固相上で行われる、請求項 42に記載の方法。
[51] 標的物質の細胞への導入効率を上昇させるための方法であって、
I) A)標的物質と
B)細胞接着分子と
を支持体に固定する工程；および
II)該支持体上の該組成物に細胞を接触させる工程、
を包含する、方法。
[52] 遺伝子導入試薬を提供する工程をさらに包含し、該遺伝子導入試薬は、前記細胞 に接触される、請求項 51に記載の方法。
[53] 前記遺伝子導入試薬の提供後に、前記標的物質と該遺伝子導入との複合体を形成 する工程をさらに包含し、その後、前記細胞接着関連因子が提供されることを特徴と する、請求項 52に記載の方法。
[54] 前記細胞接着関連因子は、細胞接着分子と相互作用する相互作用物質を含む、請 求項 51に記載の方法。
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