WO2005071056A1 - バイオチップ及びそれを用いた試料溶液の機能性検査方法 - Google Patents

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WO2005071056A1
WO2005071056A1 PCT/JP2005/000741 JP2005000741W WO2005071056A1 WO 2005071056 A1 WO2005071056 A1 WO 2005071056A1 JP 2005000741 W JP2005000741 W JP 2005000741W WO 2005071056 A1 WO2005071056 A1 WO 2005071056A1
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enzyme
enzyme activity
substrate
chip substrate
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PCT/JP2005/000741
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Norikazu Nishino
Takaaki Baba
Tamaki Kato
Takashi Yasuda
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Kitakyushu Foundation For The Advancement Of Industry, Science And Technology
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Publication date
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing

Definitions

  • the present invention relates to a biochip capable of patterning and exhaustively detecting the activity and reaction behavior of a sample solution for an enzyme, and a method for detecting the functionality of a sample solution using the biochip.
  • a technique in which a large number of reactants obtained by hydrolyzing DNA or RNA are immobilized on a substrate to form a chip.
  • a DNA chip an array in which a number of oligonucleotides are immobilized on a substrate such as glass to form an array is called a DNA chip, and is a gene for genes related in fields such as pathology, medicine, drug discovery, food, and the environment. Frequently used for analysis.
  • proteases proteases
  • Patent Document 1 discloses that the both ends of a substrate peptide specifically cleaved by caspase, which is a kind of proteolytic enzyme, are modified with a fluorescent group, and the fluorescent wavelength of the fluorescent group generated by cleaving the substrate peptide by caspase. And a fluorescent probe which measures the enzyme activity of a solution containing caspase by measuring the fluorescence intensity.
  • Patent Document 1 JP-A-2000-316598
  • Patent Document 1 merely detects the enzymatic activity of a sample solution for a specific proteolytic enzyme, so that the enzyme can be used in a complex system such as blood containing various enzymes and proteins. Complicated procedures must be repeated to comprehensively measure the activity and immunological properties, etc., and to position the characteristics of the sample solution to be measured in a large amount of library data for pathological diagnosis. There was a problem that it was necessary and lacked the reliability and speed of measurement.
  • a peptide as an enzyme substrate is bound to a surface on a substrate such as glass via trimethoxyaminopropylsilane, etc., and the surface is immersed in an enzyme solution to emit fluorescence. Has been detected.
  • a substrate such as glass via trimethoxyaminopropylsilane, etc.
  • the binding amount of the fluorescent substrate peptide on the substrate is low, qualitative results with or without enzymatic activity can be obtained, but it is difficult to use for applications requiring quantitativeness. ⁇ ⁇ There was an issue.
  • the present invention has been made in order to solve the above conventional problems, and comprehensively measures the enzymatic activity and immunological properties of blood and the like, and performs data handling and reliability when performing pathological diagnosis.
  • An object of the present invention is to provide a Noochip which is excellent in quickness, is easy to perform chemical treatment, can increase the degree of integration of a detection section, and can acquire enzyme activity and its tendency even in a small amount of a sample solution.
  • the present invention does not require accumulation of basic data, is excellent in analyzing time-series data, and is excellent in operability and efficiency in which enzyme activity of a sample solution can be measured in a short time using a small amount of a sample solution. It is an object of the present invention to provide a method for testing the functionality of a sample solution.
  • the biochip according to claim 1 of the present invention is a biochip for detecting an enzyme in a sample solution introduced into a chip substrate, and has a spiral, tree, radial, or other flow path pattern as a whole.
  • the flow of the sample solution can be formed in the sample solution flow path only by supplying a small amount of the sample solution, and the enzymes in the sample solution can react with the enzyme activity detectors having different enzyme activities. In this way, by detecting optically or electrically the state change associated with the enzymatic reaction in each enzyme activity detector, the activity behavior unique to the sample solution is comprehensively represented as a two-dimensional image displayed on the chip substrate. Can be obtained.
  • the data of the two-dimensional image is identified and grouped by comparing and referring to known library data obtained in a similar manner, so that the enzyme activity and immunological properties of the sample solution can be comprehensively determined. It is possible to accurately and promptly perform a pathological diagnosis and the like by grasping.
  • Enzyme activity detectors with different activities are arranged in the sample solution flow path formed in a spiral, tree, radial, etc. flow path pattern. Pathological diagnosis based on the data can also be directly performed by visual observation without using the pattern recognition processing of the data by the computer. In addition, by forming the sample solution flow path in a specific geometric arrangement, it is possible to facilitate a scanning operation at the time of data acquisition and to omit data processing.
  • a sample solution detection cell can be constructed by binding a fluorescent group to the chip substrate using a DNA chip plotter, printing means, etc. Using such a sample solution, data such as the enzyme activity can be efficiently obtained.
  • the sample solution a body fluid or a culture solution containing blood or urine, which is a target for pathological diagnosis or the like, can be applied.
  • a biological sample blood or the like
  • a solution from which blood cell components and the like have been removed by a filter or centrifugation can be used.
  • the condition set (pH adjustment, introduction of activator, etc.) for the enzyme to exhibit the activity based on the biological sample was used.
  • a pH adjuster a buffer such as Tris-HCl or Hepes-KOH can be added as a reaction buffer. Further, salts and an activity protecting agent required for the expression of the enzyme activity can also be added.
  • Enzymes to be detected include serine proteases such as trypsin, chymotrypsin, thrombin, plasmin, kallikrein, perokinase, and elastase; aspartic proteases such as pepsin, cathepsin D, renin, and chymosin; Metabotropic proteases such as thermolysin, endopeptidases that cut internal peptide bonds such as cysteine proteases such as cathepsin B, H, L, and calpain; blood coagulation proteases; capture proteases; I do.
  • serine proteases such as trypsin, chymotrypsin, thrombin, plasmin, kallikrein, perokinase, and elastase
  • aspartic proteases such as pepsin, cathepsin D, renin, and chymosin
  • Metabotropic proteases such as thermolysin, endo
  • the enzyme to be detected When the enzyme to be detected has an inactive state, it can be activated by adding trypsin or the like or removing an endogenous inhibitor.
  • a substrate having no enzyme specificity is used./ ⁇
  • a substrate such as glassy or synthetic resinous material is used.
  • Solvents used in the condensation reaction to form peptide bonds chloroforms, halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, esters such as ethyl acetate, polar organic solvents such as N, N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide) , Dioxane, ethers such as tetrahydrofuran, alcohols such as methanol and ethanol, and pyrinidine), and are formed of synthetic resin (polystyrene, etc.) or glass, etc., which are insoluble in a curved surface such as a flat plate or a spherical surface. Things are used.
  • Commercially available carriers for solid phase organic synthesis such as the Lantern series (registered trademark) manufactured by Mimotobus Inc. can also be used.
  • the sample solution flow path is a portion in which the vertical cross section of the chip substrate is formed in a rectangular shape, a U shape, a groove shape, or the like.
  • the flow path pattern of the sample solution flow path may be continuous or branched so that the sample solution flows toward the downstream opening or a single or a plurality of upstream opening forces, and has a spiral or tree shape in plan view. , Radial, zigzag, etc. As a result, the degree of integration of the sample liquid flow path can be increased, and the size of the biochip can be reduced.
  • the sample solution flow path can be mechanically or chemically cut on the chip substrate to form a volume of about 100 L or less, a flow path width and a depth of about lmm or less. These This is because, as the value becomes larger than the upper limit, the degree of integration of the sample solution flow path on the chip substrate tends to decrease, and it tends to be difficult to identify the fluorescent pattern formed on the chip substrate.
  • a liquid supply unit having a concave shape or the like for supplying a sample solution and connected to one or more upstream openings can be formed. Once the sample solution has been supplied to the liquid supply section formed in a depression or the like, the sample solution is simply left unattended, and the sample solution is transferred to the sample liquid flow path from the liquid supply section by capillary action.
  • a filter such as a membrane film for removing red blood cells, white blood cells, lymphocytes, etc. in the supplied blood (sample solution) is provided in the liquid supply section as necessary, so that the sample solution adheres to the flow path wall. So that the flow is not obstructed.
  • a liquid storage portion for storing the sample solution can be formed connected to one or more downstream openings.
  • the liquid storage portion is a concave portion formed at the center or the periphery of the chip substrate.
  • the sample solution flows out to the capillary liquid storage section on the other end side of the sample solution flow path, so that the flow of the sample solution to the sample solution flow path capillary liquid storage section can be formed.
  • the enzyme activity in the sample solution prevents the sample solution from staying in the sample solution flow path.
  • the enzyme activity detection part can reliably release the cut oligopeptide into the sample solution and detect the enzyme activity. Sensitivity can be increased.
  • the enzyme activity detecting section is configured by arranging a sensitive substrate such as a peptide chain having a selective and specific reaction behavior with respect to a specific enzyme. With such an enzyme-specific reaction, the optical and electrical properties such as the fluorescence wavelength and the fluorescence intensity of the sensitive substrate change, which can be detected.
  • the enzyme activity detectors located adjacent to each other in the sample solution flow path do not need to be arranged in a cell-like manner via a partition or the like so as to be isolated from the surroundings. May be continuously arranged in a planar shape along the bottom of the.
  • the independent enzyme activity detectors consisting of peptides to which fluorescent groups are attached can be placed in the sample solution flow path, for example, by using a commercially available plotter for DNA chips or by using a syringe while looking at the microscope. Can be arranged.
  • each predetermined area in the spirally formed sample solution flow path is filled with spherical particles or plates such as polystyrene resin with enzyme specificity on the surface, and independent enzyme activity detection is performed. It is also possible to arrange the parts.
  • the biochip according to claim 2 is the invention according to claim 1, wherein the enzyme activity detection unit comprises (a) a peptide chain having a base end bound to the chip substrate and bound to the other end. (B) an enzyme-specific binding site provided by a peptide chain of a specific amino acid sequence, which is a combination of amino acids; And an oligopeptide bonded to the fluorescent group via
  • This configuration has the following operation in addition to the operation described in claim 1.
  • the enzyme can be obtained simply by filling the sample solution flow path with a very small amount of sample solution containing the enzyme in the sample solution flow path and measuring the fluorescence intensity of the chip substrate
  • the degree of integration of the enzyme activity detector that can detect enzyme activity can be dramatically increased, and the size of the biochip can be reduced.
  • Enzyme activity can be detected only by using a sample solution that fills the microvolume of the sample solution flow path.Therefore, a large amount of sample solution is not required for measurement, and even a small amount of sample solution can be used. Can be detected.
  • the contact between the enzyme in the sample solution flowing through the sample solution flow path and the specific binding site of the enzyme activity detection unit cuts the binding site between the oligopeptide corresponding to this enzyme and the fluorescent group.
  • the fluorescence emission frequency of the fluorescent group can be shifted or its fluorescence intensity can be changed with a change in the fluorescence resonance energy. This change can be observed under excitation light irradiation through a filter or the like to observe the change in the bright spot, or the fluorescence spectrum can be measured and converted into data.
  • a peptide chain having a certain amino acid sequence power can be sequentially arranged in the sample solution flow path, and a biochip having a predetermined enzyme activity for a known or unknown enzyme can be easily manufactured. Can be provided.
  • the oligopeptide is a peptide composed of a peptide chain consisting of several amino acids, and has a substantially linear shape unlike a protein having a large molecular weight and a large mass.
  • the amino acid sequence of the oligopeptide allows one to characterize the enzyme specificity at the site where the oligopeptide is attached to the fluorescent group.
  • the fluorescent group those whose fluorescence wavelength or fluorescence intensity changes before and after the peptide bond with the oligopeptide is cleaved by the enzyme are used.
  • the substance is a non-fluorescent substance in a specific wavelength region, and emits fluorescence in the specific wavelength region when the peptide bond is cleaved to release the peptide chain.
  • Emitting fluorescent groups such as 4-methylcoumaryl 7-amide (MCA), 7-amino-4 carboxy Cimethylcoumarin (ACC), p-thro-lide, ⁇ -naphthylamide, hynaphthylester and the like are preferably used.
  • the binding portion that has been bonded to the fluorescent group can be released to change the fluorescence intensity and the fluorescence frequency of the fluorescent group.
  • the oligopeptide is formed with a peptide chain of a predetermined length (for example, about 15 ⁇ ) or more, the substrate specificity for each amino acid is not high, and it is necessary for the cleavage action of a relatively long peptide chain. It is also possible to detect enzymes such as elastase as described above, and it is possible to increase the types of enzymes that can be detected.
  • the amino acid sequence is composed of, for example, a peptide chain composed of each amino acid of A (alanine), B (proline), C (lysine), and D (phenylalanine). If the sequence of the peptide chain elements is arranged in the channel in the order of the rule combination, analysis and evaluation of test data should be performed easily and quickly based on the basic data accumulated for basic amino acids. Can be.
  • biopeptides can be mechanically constructed using well-known peptide chain synthesis means so that oligopeptides that also have basic amino acid power are regularly arranged in descending or ascending order such as the character code order of their ADs. It has excellent production efficiency.
  • the biochip according to claim 3 is the biochip according to claim 1 or 2, wherein the fluorescent group is an aminomethylcoumarin-based fluorescent group and is modified with a silane coupling agent or the like. And bonded to the chip substrate.
  • the bonding can be more reliably strengthened, and the bonding of the fluorescent group to the chip substrate is caused by the enzyme in the sample solution.
  • the stability and durability of the Noo tip, which cannot be easily cut off by such actions, can be improved.
  • silane coupling agent for example, aminopropyltrimethoxysilane or the like is used. Applicable.
  • Aminomethylcoumarin-based fluorescent groups include 4-methylcoumalyl 7-amide (MCA), 7-amino-4 carboxymethylcoumarin (ACC) and the like.
  • the biochip according to claim 4 is the biochip according to any one of claims 1 to 3, wherein the chip substrate is translucent, and a CCD or CMOS element is provided on the back side thereof. It is configured by laminating image sensor substrates on which are arranged.
  • the enzyme activity detection units are arranged in a predetermined pattern.
  • the fluorescence of the force on the back side of the chip substrate is directly changed, and the force can be acquired as a two-dimensional image.
  • the enzyme component in the sample solution can be analyzed with the enzyme activity detector integrated on the chip substrate at a high density, so that a compact and highly reliable biochip can be provided.
  • a CC including a photosensitive portion in which photodiodes are two-dimensionally arranged on a silicon thin plate and a signal output portion thereof by a well-known semiconductor manufacturing technique is formed.
  • D and CMOS elements can be applied.
  • a protective layer is provided on a surface of the chip substrate on which the sample solution flow path is formed. It is configured with.
  • the opening of the sample solution flow path formed in a groove shape or the like on the chip substrate is covered with a light-transmitting or light-transmitting protective layer such as an oxide silicon film, it is introduced.
  • the sample solution is protected from contact with air in the sample solution flow path, and the measurement accuracy, reliability, and stability can be further improved.
  • the protective layer can be formed by, for example, attaching a ceramic coating formed of silicon oxide or aluminum oxide on a chip substrate on which a sample solution flow path is formed.
  • a filter that passes the excitation wavelength of the fluorescent group can be coated as a protective layer.
  • the enzyme activity is detected by irradiating the surface-side light in which the sample solution flow path is formed and arranging an image sensor such as a CCD at a position where the fluorescence of the enzyme activity detection unit can be detected. can do.
  • the method for testing the functionality of a sample solution according to claim 6 is characterized in that the sample solution is stored in the liquid storage section of the sample solution flow path of the biochip according to any one of claims 1 to 5 under a predetermined condition. And a two-dimensional image on the chip substrate formed by a change in state of each of the enzyme activity detectors arranged on the sample solution flow path with a filter for removing a specific wavelength range.
  • This configuration has the following operation.
  • proteases in blood and the like exist in and out of the body as a mixture, only the enzyme activity is comprehensively detected as a mixture, and this is compared with the data of a peptide library.
  • Biological information on homeostasis which is the process of secretion, production, and degradation, can be obtained, which can contribute to personal health care.
  • the flow of the sample solution can be formed in the sample solution flow path only by supplying a small amount of the sample solution, and the enzymes in the sample solution can react with the enzyme activity detectors having different enzyme activities. In this way, by detecting optically or electrically the state change associated with the enzymatic reaction in each enzyme activity detector, the activity behavior unique to the sample solution is comprehensively represented as a two-dimensional image displayed on the chip substrate. Can be obtained.
  • the data of the two-dimensional image is identified and grouped by comparing and referring to known library data obtained in a similar manner, so that the enzyme activity and immunological properties of the sample solution can be comprehensively determined. It is possible to accurately and promptly perform a pathological diagnosis and the like by grasping.
  • Enzyme activity detectors with different activities are arranged in the sample solution flow path formed in a spiral, tree, radial, etc. flow path pattern. Pathological diagnosis based on the data can also be directly performed by visual observation without using the pattern recognition processing of the data by the computer. In addition, by forming the sample solution flow path in a specific geometric arrangement, it is possible to facilitate a scanning operation at the time of data acquisition and to omit data processing.
  • a sample solution detection cell can be constructed by binding a fluorescent group to the chip substrate using a DNA chip plotter, printing means, etc. Using such a sample solution, data such as the enzyme activity can be efficiently obtained.
  • the following effects are obtained in addition to the effects of claim 1.
  • a fluorescent group bonded to the chip substrate and an oligopeptide bonded to the fluorescent group by a peptide bond that is cleaved by an enzyme are provided, when the peptide bond is cleaved by reacting with the enzyme, the oligopeptide Is released. Since the fluorescence wavelength of the fluorescent group released from the oligopeptide or the fluorescence intensity at a predetermined wavelength is different from that before the release, the enzyme activity can be detected using the change in the fluorescence intensity or the like as an index.
  • the enzyme can be obtained simply by filling the sample solution flow path with a very small amount of sample solution containing the enzyme in the sample solution flow path and measuring the fluorescence intensity of the chip substrate The activity can be detected, and the degree of integration of the enzyme activity detection unit capable of detecting the enzyme activity can be dramatically increased.
  • Enzyme activity can be detected simply by using a sample solution that fills the sample solution flow path, so that a large amount of sample solution is not required for measurement, and enzyme activity can be detected with a small amount of sample solution. It can be carried out.
  • the bonding can be more reliably strengthened, and the bonding of the fluorescent group to the chip substrate is caused by the enzyme in the sample solution.
  • the stability and durability of the Noo tip, which cannot be easily cut off by such actions, can be improved.
  • the enzyme activity detection units are arranged in a predetermined pattern.
  • the fluorescence of the force on the back side of the chip substrate is directly changed, and the force can be acquired as a two-dimensional image.
  • the enzyme component in the sample solution can be analyzed with the enzyme activity detector integrated on the chip substrate at a high density, so that a compact and highly reliable biochip can be provided.
  • a data judgment step is performed to compare the time-series data or result data obtained in this way with library data and calculate the degree of pattern matching with each library data, so that a small amount of data that does not require accumulation of basic data
  • the enzyme activity of the sample solution can be measured in a short time using the sample solution of ⁇ , and the operability and efficiency are excellent.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the principle of detecting the enzyme activity of the enzyme activity detector.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of an enzyme activity detector having different arrangement configurations.
  • FIG. 3 is a schematic perspective view of a biochip according to Embodiment 1.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a state of an enzyme activity detection unit arranged in a sample solution flow path.
  • FIG. 5 is a graph showing the enzyme activity of a sample solution introduced into a biochip according to Embodiment 1. Configuration diagram when measuring using a di-sensor
  • FIG. 6 is a schematic diagram of a biochip according to a second embodiment.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing a modification of the biochip in the second embodiment.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a principle of detecting an enzyme activity of an enzyme activity detection unit in a biochip according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is a mechanically flat plate made of silicon dioxide, glass, or the like! Is a chip substrate having a chemically grooved portion (sample solution flow path), and 2 is a peptide on the chip substrate 1
  • Fluorescent groups such as 4-methylcoumaryl 7 amide (MCA) directly bonded by bonding, etc.
  • 3 is an oligopeptide such as amino acid or peptide bonded to fluorescent group 2 by peptide bond
  • 4 is a bond between fluorescent group 2 and oligopeptide 3
  • 3 5 is an enzyme having a substrate specificity such as a serine protease that selectively cleaves 5) 7-amino-methylcoumarin (AMC) whose fluorescence wavelength and the like are changed by the selective release of oligopeptide 3 by enzyme 4.
  • the enzyme activity detector configured as described above is synthesized using a known peptide synthesis technique, and is bonded onto the chip substrate 1.
  • the fluorescent group 2 such as 4-methylcoumalyl 7 amide (MCA) shown in FIG. 1 (a) is a non-fluorescent substance and does not show fluorescence in a specific wavelength region.
  • MCA 4-methylcoumalyl 7 amide
  • the fluorescent group 5 from which the oligopeptide 3 is released becomes a fluorescent substance in the specific wavelength region such as 7-amino-methyl coumarin (AMC). Since it is different from group 2, enzyme activity can be detected using changes in fluorescence intensity and the like as indexes (see Fig. 1 (c)).
  • the fluorescent group 2 is directly bonded to the chip substrate 1 .
  • the fluorescent group 2 is bonded to the chip substrate 1 via an amino acid, a peptide, or the like.
  • amino acids and peptides between the fluorescent group 2 and the chip substrate 1 are synthesized with molecules or compounds having no enzyme specificity. This is to prevent the fluorescent group 2 from being released from the chip substrate 1 by the action of the enzyme.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of an enzyme activity detector having an arrangement different from that of FIG.
  • reference numeral 6 denotes a first oligopeptide whose one end is fixed to the chip substrate 1
  • 7 denotes a first fluorescent group introduced into a side chain of the oligopeptide 6
  • 8 denotes a first peptide bond.
  • the second oligopeptide bound to oligopeptide 6, 9 is the second fluorescent group that binds to the second oligopeptide and causes fluorescence resonance energy transfer with the first fluorescent group 7, and 7a is originally due to fluorescence resonance energy transfer.
  • This is the first fluorescent group in which the fluorescence of the second fluorescent group 9 to be observed has been attenuated, and the fluorescence has been observed instead.
  • the fluorescence resonance energy transfer means that when a certain two fluorescent compounds are present at close distances, the fluorescence spectrum of one (donor and! /) Of the two fluorescent compounds and the other (acceptor) When the excitation spectra of (c) and (c) overlap, the energy of the donor excitation wavelength is attenuated, and the fluorescence of the donor that should be observed is attenuated, and instead the fluorescence of the receptor is observed.
  • the second oligopeptide is released by the enzyme 4 and the two fluorescent compounds are located far away from each other.
  • the fluorescence is attenuated, and instead the fluorescence of the first fluorescent group 7 is observed (7a), and the enzyme activity can be detected.
  • the first fluorescent group 7 and the second fluorescent group 9 a combination of a donor and an acceptor that cause fluorescence resonance energy transfer can be used.
  • the second fluorescent group 9 which is an atomic group having an absorption band in a wavelength range overlapping with the fluorescent wavelength of the first fluorescent group 7 (or the second fluorescent group 9) is used.
  • Dnp dinitrophenyl
  • Dabsyl And EDANS (5— (2'-aminoethyl) amino Combination of naphthalene 1-sulfonic acid), combination of tryptophan (Trp) and 5-dimethylamino-1-naphthalenesulfonic acid (Dns), combination of carboxydichlorofluorescein (CDCF) and carboxymethyl rhodamine (CTMR), carboxy A combination of diclomouth fluorescein (CDCF) and carboxy X rhodamine (CXR), a combination of lucifer yellow (LY) and carboxymethyl rhodamine (CTMR) and the like are used.
  • Any of these donor receptors can be the first fluorescent group 7 or the second fluorescent group 9. This is because any change in the spectrum of the first fluorescent group 7 can be used as an indicator for measuring enzyme activity.
  • first fluorescent group 7 and the second fluorescent group 9 which are respectively bonded to the first fluorescent group 7 and the second oligonucleotide 8 introduced into the side chain of the first oligopeptide 6 are connected to each other. It is desirable that the length between them is 100 A or less. As this distance increases, the fluorescence resonance energy transfer tends to decrease and the change in fluorescence intensity and the like tends to decrease.If the distance is longer than 100 A, this tendency is remarkably reduced, and the change in fluorescence intensity is significantly reduced and the sensitivity is reduced. .
  • the enzyme activity detection unit By configuring the enzyme activity detection unit in this way, it is possible to easily detect enzymes such as elastase that require a relatively long peptide chain for the cleavage action without increasing the substrate specificity for each amino acid. Sensitivity can be increased.
  • FIG. 3 is a schematic perspective view of a biochip according to Embodiment 1 of the present invention to which the above-described principle of enzyme activity detection is applied
  • FIG. 4 is a schematic view showing a state of an enzyme activity detection unit arranged in a sample solution flow path.
  • reference numeral 10 denotes a biochip according to the first embodiment of the present invention
  • 11 denotes a chip substrate which constitutes the biochip 10 and is entirely formed in a substantially rectangular plate shape
  • 12 denotes a spiral shape as a whole.
  • an enzyme activity 13 is formed in the sample solution flow path 12 in a cell shape and a spot shape, each having a predetermined enzyme activity and arranged in a predetermined order.
  • a detection unit, 14 is a substantially rectangular liquid supply unit provided on the outer end side of the sample solution flow path 12 to supply the sample solution
  • 15 is a substantially circular center on a spiral center side serving as a discharge side of the sample solution flow path 12. It is a liquid reservoir provided in a shape.
  • the Noo chip 10 has a substantially rectangular plate shape (side length of about 20 to 30 mm, thickness of about 2 to 30 mm). (mm) vitreous or polystyrene-lipid, etc., and flow into each other with a flow path cross section of about 0.5 mm and a depth of about 0.1 mm and an effective flow path length of about 90 mm.
  • a sample solution flow path 12 formed in a spiral shape with a path interval of 0.5 mm is provided.
  • the liquid supply section 14 is formed in a substantially square shape with a side of about 2.5 mm, and the effective volume of such a sample solution flow channel 12 is about 4.5 ⁇ L.
  • a sample solution such as a collected blood sample is supplied to a liquid supply section 14 on the chip substrate 11 and sequentially moves through a sample solution flow path 12 by capillary action or the like, and comes into contact with the enzyme activity detection section 13 to contact the sample solution. Characteristics such as the activity of each enzyme contained therein and antibody reactivity are detected.
  • the enzyme activity detecting section 13 is formed as a cell-shaped, concave-shaped or flat spot-shaped site at the bottom of the sample solution flow path 12 spirally formed on the chip substrate 11, and has different enzyme activities. Are arranged so as to be sequentially arranged at a predetermined interval from each other.
  • the enzyme activity detecting section 13 includes a fluorescent group having one end coupled to the bottom surface of the sample solution flow path 12 formed in a substantially groove shape as shown in FIGS. 3 and 4, and a fluorescent group having the other end thereof.
  • a fluorescent group having the other end thereof is composed of an oligopeptide having an amino acid sequence that is bound to the four sites of ⁇ -D.
  • the fluorescent group K is, for example, an aminomethylcoumarin-based fluorescent group, and has different fluorescent characteristics depending on the binding state with each oligopeptide. If necessary, the chip substrate 11 is chemically modified with a silane coupling agent or the like so that the fluorescent group K is bonded in the sample solution flow channel 12 of the chip substrate 11 so that the chip substrate 11 is bonded. Stability and durability can be improved.
  • Each of the A to D sites of the oligopeptide conjugated to the fluorescent group K has, for example, a peptide chain composed of any combination of ala: alanine, pro: proline, lys: lysine, and phe: hue-alanin So that is set.
  • Oligopeptides include, for example, (l) ala-pro-lys-phe, (2) pro-lys-phe-ala, (3) lys phe-ala-pro, (4) phe-ala-pro-lys
  • the amino acid sequence is set, and the enzyme-specific part of the fluorescent group binding part to which the oligopeptide is bound corresponding to each such amino acid sequence
  • the gender is defined.
  • Each amino acid sequence can be synthesized by an ordinary peptide synthesis method such as a solid phase method by extending the peptide at the C-terminal.
  • the C-terminal force of the target amino acid sequence is also sequentially extended to the N-terminal side! / ⁇ Successive extension method, or multiple short! ⁇ peptide fragments are synthesized and extended by coupling between peptide fragments
  • a fragment condensation method or the like can be used.
  • it can be synthesized using a known peptide synthesizer by introducing 9-fluoromethylcarboxyl (Fmoc) amino acid, t-butyloxycarbol (Boc) amino acid, or the like.
  • a peptide bond can be generated using a protease, or can be synthesized using a genetic engineering technique.
  • examples of the condensation method for forming a peptide bond include azide method, acid chloride method, acid anhydride method, mixed acid anhydride method, DCC method, DCC-additive method, active ester method, and carbonyl method.
  • Diimidazole method, redox method, method using Woodward reagent K, and the like are used.
  • carboxyl groups and amino groups that are not involved in the reaction in amino acids and peptides are protected by known means, and carboxyl and amino groups that are involved in the reaction are activated. You can also keep.
  • the S1-Sn enzyme activity detectors 13 each having a possible combination of amino acid sequences are arranged at the bottom of the sample solution flow channel 12 as follows, for example.
  • the enzymes and proteins in the sample solution have different enzyme specificities. Acts on the bond between the oligopeptide provided with and the fluorescent group to cleave this bond. Optically detect changes in the fluorescent properties of the fluorescent groups associated with this cleavage
  • the spirally formed sample solution channel 12 can be represented as a fluorescent pattern unique to the sample solution.
  • the amino acid sequence of the oligopeptide in S1-Sn may be a unique sequence specific to the biochip 10 without having to know the properties and behavior of each amino acid sequence, such as its enzymatic activity. For this reason, S1-Sn includes, for example, a regular array or a random array that includes a periodic pattern.
  • the sample solution flow path 12 is formed by etching or the like when the chip substrate 11 is made of silicon dioxide or glass.
  • the chip substrate 11 is formed by embossing, laser beam processing, grinding using a machine Jung center, or the like. It can be manufactured by injection molding or press molding as a raw material.
  • the depth of the sample solution flow channel 12 formed in the groove shape be in the range of about 10 to 200 m and the width be in the range of 10 to 1000 m. This is because if the depth or width of the flow path becomes smaller than the lower limit, the viscosity of the sample solution tends to block the flow path or the measurement sensitivity becomes insufficient. Conversely, the depth or width becomes the upper limit. If the value is larger than the above value, the degree of integration of the enzyme activity detector on the chip substrate becomes insufficient, and it becomes difficult to identify a fluorescent pattern to be formed on the chip substrate.
  • the liquid supply unit 14 may be provided with a filter disposed on the side of the chip substrate 11 for removing red blood cells and the like in blood, such as a nonwoven fabric filter and a membrane film.
  • a filter disposed on the side of the chip substrate 11 for removing red blood cells and the like in blood, such as a nonwoven fabric filter and a membrane film.
  • a biochip 10 is prepared in which enzyme activity detectors 13 each having a unique enzyme activity are arranged in a predetermined pattern at each site S1-Sn of a sample solution flow path 12 spirally formed on a chip substrate 11.
  • a sample solution such as blood is supplied to the liquid supply section 14 of the top 10 at a predetermined flow rate and temperature.
  • blood components and the like supplied to the liquid supply unit 14 are supplied to the sample solution flow channel 12 and sequentially contact the enzyme activity detection units 13 at the respective S 1 -Sn sites using capillary action or the like. It can be done.
  • the bond between the oligopeptide that is sensitive to a specific enzyme in the blood component and the fluorescent group is cleaved, and the fluorescence characteristics of the fluorescent group are in the state before cleavage (here, OC and ) To the state after cutting (here, ⁇ ).
  • the state of the fluorescent group at the S1-Sn site along the sample solution flow path 12 changes from the initial state X (h, ⁇ , ⁇ , ⁇ , a) to the detection state Y ( ⁇ , j8, ⁇ , ⁇ , ⁇ ).
  • a two-dimensional fluorescence image on the chip substrate 11 formed by a change in fluorescence at each of the enzyme activity detectors 13 on the sample solution flow path 12 is acquired by an image sensor or the like.
  • the time series data or the result data after a predetermined time can be obtained.
  • the time-series data or the result data after a predetermined time is compared with library data measured and accumulated in advance for various samples under the same measurement conditions, and the pattern recognition means and the statistical data are compared.
  • a sample solution containing blood, urine, or the like is to be tested, and the sample solution arrayed with an oligopeptide imparting enzyme specificity is used. Guide the reaction to the flow path.
  • the results of this enzymatic reaction are acquired by an image sensor that detects the fluorescence intensity, and the acquired data can be compared with library data to comprehensively detect the activity of the protease mixture contained in the sample solution. .
  • the sample solution flow path 12 is formed in a spiral shape, the speed of the sample solution moving in the sample solution flow path 12 due to a capillary phenomenon or the like can be kept substantially constant, and the reproducibility of the obtained time-series data can be improved.
  • the method for testing the functionality of a sample solution using a Noochip is applied to medical fields such as pathological diagnosis and research fields such as proteome analysis, and the activities of multiple enzymes can be performed at high speed and in small samples. Can be measured.
  • FIG. 5 is a configuration diagram when the enzyme activity of the sample solution introduced into the biochip according to the first embodiment is measured using an image sensor.
  • reference numeral 20 denotes an image sensor arranged on the biochip 10 for acquiring two-dimensional data in the enzyme activity detection unit 13 on the chip substrate 11 via the lens 21.
  • the image sensor 20 is placed away from the chip substrate 11, a change in the state of the fluorescent group of the enzyme activity detection unit 13 is imaged on the image sensor 20 via an optical system such as the lens 21. Read.
  • the biochip in the first embodiment is configured! Therefore, a very small amount of a sample solution containing an enzyme is introduced into the sample solution flow path 12 of the chip substrate 11, and the fluorescence of the chip substrate 11 is reduced. Enzyme activity can be detected only by measuring the strength and the like. Furthermore, since it is not necessary to form a cell for injecting a solution into the substrate for each individual sample, the enzyme activity detecting section 13 and the sample solution flow path 12 can be miniaturized, so that the enzyme can be detected on the chip substrate 11. The degree of integration of the department can be dramatically increased.
  • enzyme activity can be detected by using only a very small amount of sample solution containing enzyme, a large amount of sample solution is not required for measurement, and enzyme activity can be detected even with a small amount of sample solution. be able to.
  • FIG. 6 is a schematic diagram of a biochip according to the second embodiment of the present invention in a case where a chip substrate is directly arranged on an image sensor to measure an enzyme activity of a sample solution introduced into a nanochip.
  • reference numeral 22 denotes a filter serving as a light-transmitting protective layer disposed on the surface of the chip substrate 11 in which the enzyme activity detecting section 13 is arranged in the sample solution flow path 12, and the enzyme activity is detected.
  • the detection unit 13 has a selectivity that allows the excitation wavelength to pass but blocks the fluorescence wavelength.
  • Reference numeral 23 denotes a filter arranged on the back surface of the chip substrate 11, which has a selectivity such that the fluorescence wavelength of the enzyme activity detection unit 13 is transmitted but the excitation wavelength is blocked.
  • Reference numeral 24 denotes an image sensor such as a CCD disposed on the back surface of the chip substrate 11 via the filter 23.
  • the chip substrate 11 is formed of a light-transmitting glass or the like. Have been.
  • the biochip of the second embodiment can read the fluorescence of the enzyme activity detection unit 13 directly with the detection element of the image sensor 24 that is closely mounted, so that the biochip is compact without using an optical system such as a lens. I can do it.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing a modification of the biochip on which the image sensors according to the second embodiment are stacked.
  • reference numeral 30 denotes a biochip of a modification of the second embodiment
  • reference numeral 31 denotes a light-transmitting chip substrate capable of forming silicon oxide
  • reference numeral 32 denotes a sample formed on the chip substrate 31 by etching or the like in a groove shape.
  • the solution flow path, 32a is an enzyme activity detector arranged in the sample solution flow path 32, and 33 is made of glass or an organic substance which is disposed so as to cover the opening surface of the sample solution flow path 32 and transmits fluorescence of a predetermined wavelength.
  • the upper filter 34 is an image sensor substrate on which CMOS elements and the like are stacked on the back side of the chip substrate 31 via the lower filter 35, and 36 is an oxygen sensor for protecting the surface of the image sensor substrate 34.
  • This is a silicon layer, which is formed as an insulating layer (protective layer) by means of CVD or the like when a CMOS element or the like of the image sensor substrate 34 is formed.
  • the upper filter 33 has a selectivity such that the excitation wavelength of the enzyme activity detector 32a is passed but the fluorescence wavelength is cut off, and the lower filter 35 allows the fluorescence wavelength of the enzyme activity detector 32a to pass.
  • the excitation wavelength has a selectivity to cut off.
  • the chip substrate 31 is formed by CVD or the like as an insulating layer (protective layer) formed by means such as CVD as an insulating layer (protective layer) when forming a CMOS element or the like of the image sensor substrate 34. It is made.
  • the biochip 30 according to the present embodiment configured as described above is provided on the projection surface of the lower filter 35 directly disposed on the silicon dioxide layer 36 of the image sensor substrate 34 on the projection surface of the chip substrate 31.
  • 32a is located, and the chip substrate 31 is manufactured using the same semiconductor manufacturing technology as that for forming the CMOS elements and the like of the image sensor substrate 34. Therefore, the manufacturing process can be shortened. ⁇ action is obtained.
  • Example 1 As a preliminary experiment for forming an enzyme activity detection part, a peptidyl fluorescent group-bonded spherical substrate as a substrate for enzyme activity detection was synthesized to measure the activity for enzymes (trypsin and chymotrypsin). A measurement was made. Hereinafter, the method will be described.
  • a biochip can be formed by filling and arranging such a spherical substrate in each region of the sample solution flow path formed in a spiral shape or the like to be the enzyme activity detection sections S1-Sn. ⁇ Synthesis of spherical substrate bonded with peptidyl fluorescent group>
  • NH-PEGA-resin manufactured by Watanabe Chemical Industry
  • Solid phase Fix the growth vessel vertically, and add NH-PEGA-resin (0.05 mmol / g, 0.5 g).
  • DMF (10 ml) was poured while the cock of the cell was open to replace the solvent. Next, close the cock of the vessel and dissolve Fmoc-Aca-OH (0.13 mmol, 44 mg), HBTU (0.13 mmol, 48 mg) and DIEA (0.13 mmol, 0.022 ml) in DMF (2 ml), and add. ⁇ ⁇ Reacted. After the reaction, the cock was opened and washed with DMF (10 ml) and methanol (10 ml) to obtain Fmoc-Aca-PEGA resin.
  • Fmoc-Lys (Boc) -ACC-OH (36 mg, 54 mmol), DCC (11 mg, 54 mmol), HOBt-H20 (8.3 mg, 54 mmol) were reacted for 24 hours. After the reaction, wash twice with DMF (1 ml), twice with DCM (1 ml), twice with EtOH (1 ml), and twice with DCM (1 ml), and dried under reduced pressure to obtain a fluorescent group. Fmoc-Lys (Boc) -ACC-Aca-Aca-PEGA resin in which (ACC) was bound to the binding portion (Aca-Aca-) was obtained.
  • the Fmoc group was removed by stirring for 30 minutes using 20% piperidine ZDCM (1 ml). After washing with DCM (1 ml) three times and DMF (1 ml), Fmoc-Pro-OH (18 mg, 54 mmol), HATU (20 mg, 54 mmol), HOAt (7 mg, 54 mmol) ), DIEA (16 ml, 90 mmol) was dissolved in DMF (1 ml) and reacted for 1 hour. Then, 3 times with DMF (1 ml), DCM (1 ml) three times to obtain Fmoc-Pro-Lys (Boc) -ACC-Aca-Aca-PEGA resin.
  • Peptidyl fluorescent group-bonded spherical substrate as the substrate for enzyme activity detection of Example 1 was added to the wells A to D of the 96-well fluorescence measurement microplate.
  • the substrate for enzyme activity detection of Example 1 had about 315-fold chymotrypsin in Gael A in which trypsin was present. ⁇ It was confirmed that El B differs about 10 times. This indicates that the enzyme activity detection substrate of Example 1 can be used to detect the enzyme activity corresponding to the amount of the enzyme, the type of the enzyme, and the like. Comparing the fluorescence values of the wells A and B, the substrate for detecting the enzyme activity of Example 1 showed that the fluorescence value of trypsin was about 30 times larger than that of chymotrypsin. confirmed.
  • Example 1 the amino acid at the binding site that binds to the fluorescent group on the substrate for enzyme activity detection of Example 1 is lysine, and trypsin has the specificity of selectively cleaving the peptide bond mainly at the C-terminal side of lysine. It is presumed to have emerged from the fact that they had.
  • chymotrypsin mainly has the specificity of selectively cleaving the peptide bond on the C-terminal side of the aromatic amino acid residue, so it is presumed that the change in the fluorescence value before and after the reaction was small.
  • Example 1 This indicates that the enzyme activity detection substrate of Example 1 has specificity depending on the enzyme, and that qualitative analysis of the enzyme having activity is possible.
  • a sample solution containing the same type of enzyme was brought into contact with the same type of enzyme activity detection substrate and the fluorescence value was measured after a predetermined time, the change in the fluorescence value was modified by the action of the enzyme. It was speculated that quantitative analysis of the enzyme was possible because it corresponds to the number of molecules.
  • Example 2 an enzyme activity was measured by synthesizing a peptidyl fluorescent group-bonded flat substrate as a substrate for enzyme activity detection.
  • the method will be described.
  • an enzyme activity detecting section can be formed, and enzyme activity detecting sections having different enzyme specificities can be arranged in a predetermined pattern in each region of the sample solution flow path.
  • a synthetic resin carrier made into a planar shape by cutting out only one plate of a multi-plate synthetic resin carrier for peptide synthesis (Lantern Series (registered trademark) manufactured by Mimotobus) was used.
  • a synthetic resin carrier lantern (Mimotops D-series, introduction rate 18 mmol / unit) as a substrate is placed in a screw tube, and the mixture is stirred with 20% piperidine ZDCM (1 mL) for 30 minutes and the Fmoc-based Removal was performed. After washing with DCM (1 ml) three times and DMF (1 ml),
  • Fmoc-Aca-OH (19 mg 54 mmol), DCC (17 mg 81 mmol) and HOBt-H20 (8 mg 54 mmol) were dissolved in DMF (1 ml) and reacted for 24 hours. After the reaction is completed, wash twice with DMF (1 ml), twice with DCM (1 ml), twice with EtOH (1 ml), and twice with DCM (1 ml), and then dried under reduced pressure to remove Fmoc- Aca-lantern was obtained.
  • the Boc group of the Lys side chain was removed using 25% TFA / DCM (1 ml), and the target substrate for detecting the enzyme activity of Example 2 (Ac-Ala-Ala-Pro-Lys-ACC-Aca-Aca- lantern).
  • Example 2 using lantern as the substrate It was shown that the enzyme having activity can be detected also on the substrate for detecting enzyme activity.
  • Example 3 an enzyme activity was measured by synthesizing a peptidyl fluorescent group-bonded flat substrate as a substrate for enzyme activity detection. Hereinafter, the method will be described.
  • the substrate used was a synthetic resin carrier made of a multi-plate synthetic resin carrier for peptide synthesis (Lantern Series (registered trademark) manufactured by Mimotobus Co., Ltd.) that was cut into a single plate and used as a substrate.
  • One carrier lantern (Mimotops D-series, introduction rate: 18 mmol / unit) was added, and the mixture was stirred with 20% piperidine I DCM (1 mL) for 30 minutes to cut out the Fmoc group.
  • Fmoc-Phe-ACC-OH (33.4 mg 56.7 mmol), DCC 12.5 mg (60.6 mmol), HOBt-H20 8.9 mg (58.0 mmol) dissolved in DMF 1 ml were stirred for 22 hours.
  • DMF (1 mix 2), DCM (1 mix 2), DCM I EtOH 1: 1 (1 mix 2), EtOH (1 mix 2), DCM (1 ml XI), getyl ether (1 After washing with ml XI), it was dried to obtain Fmoc-Phe-ACC-Aca-Aca-Lantern in which a fluorescent group (ACC) was bound to the binding part (Aca-Aca).
  • the substrates for detecting the enzyme activity of Example 2 were used in the plates A and C, and the substrates for detecting the enzyme activity in Example 3 (introduction ratio 2 molZ substrate), 100 ⁇ l of 20 mM Tris HC1 buffer (pH 7.2, 100 mM NaCl, 50 mM CaC12), 100 ml of methanol 1001, and 50 g of the following enzyme. I let you.
  • the measurement was performed using a WALLAC ARVOTM SX 1420 multilabel counter (PerkinElmer) at an excitation wavelength of 370 nm and an emission wavelength of 460 nm, and measured the fluorescence value before adding the enzyme and the fluorescence value 30 minutes after adding the enzyme. And asked for the difference.
  • Peptides were cut out from each resin to obtain 361 types of unprotected C-terminal peptides.
  • a spiral with a channel width of 500 ⁇ m and a channel depth of 100 ⁇ m is etched on a silicon substrate (chip substrate) formed as a protective layer (insulating layer) on a glass substrate or image sensor by etching.
  • a sample solution flow path was formed.
  • a square concave portion having a depth of 100 m and a length and width of 2.5 mm as a sample supply portion was formed continuously at one end of the sample solution flow channel by etching.
  • the entire surface of the sample solution flow channel was coated with an amino group, and 361 kinds of peptides as the enzyme activity detection unit described above were introduced into the sample solution channel using a condensing agent (HATU).
  • HATU condensing agent
  • An automatic spotter (model: 222XL) manufactured by Gilson was used for introduction.
  • the peptides were introduced within a circle of about 200 ⁇ m at the center of 0 ⁇ m, and other peptides were introduced one after another at intervals of about 100 ⁇ m.
  • a filter (which blocks wavelengths longer than 350 ⁇ 10 nm) that transmits fluorescence excitation light was pressed onto the upper surface of the sample solution flow path into which the peptide had been introduced, also as a cover (protective layer).
  • a fluorescent chip (which blocks wavelengths shorter than 450 ⁇ 10 nm) was adhered to the image sensor substrate, and a chip substrate was further disposed thereon to manufacture a biochip similar to that described in the second embodiment.
  • the fluorescence intensity of each spot was calculated every 10 msec from the output of the image sensor, and the enzyme activity (fluorescence intensity) of each spot was calculated based on the calculated fluorescence intensity.
  • FIG. 8 is a graph in which the fluorescence intensity of each amino acid constituting each spot is plotted.
  • the X-axis and the y-axis show a combination sequence of each amino acid, and the z-axis shows each fluorescence intensity corresponding to this combination of amino acids.
  • the biochip of the present invention is applied to the analysis of a sample solution containing enzymes, proteins, and genes related to fields such as pathology, medicine, drug discovery, food, and the environment, and has properties such as enzyme activity.
  • the data can be comprehensively evaluated and specified, which can contribute to medical fields such as pathological diagnosis and research such as proteome analysis.

Abstract

　血液などの酵素活性や免疫学的特性を網羅的に測定して病理学的診断を行う際のデータの取り扱い性や信頼性に優れ、化学処理が容易でしかも検出部の集積度を高められ微量の検体溶液でも酵素活性及びその傾向を取得できるバイオチップを提供する。 　チップ基板１１に導入される試料溶液中の酵素を検出するバイオチップであって、全体が渦巻き状やツリー状、放射状などの流路パターンで前記チップ基板上に形成された試料溶液流路１２と、試料溶液流路１２に所定順で複数配置され所定の酵素に対してそれぞれ異なる活性を有する酵素活性検知部１３と、を備える。  

Description

明 細 書
バイオチップ及びそれを用いた試料溶液の機能性検査方法
技術分野
[0001] 本発明は、酵素に対する試料溶液の活性や反応挙動をパターン化して網羅的に 検出することができるバイオチップ、及びバイオチップを用いた試料溶液の機能性検 查方法に関する。
背景技術
[0002] 従来、単一の蛍光性酵素基質ペプチドを用い、溶液中の蛍光変化によって酵素活 性を測定する技術が多くの酵素 蛍光性基質ペアに対して確立されている。
また、このような酵素活性の多種測定を同時並行して行うために、基板上に DNA や RNAを加水分解した反応物を多数固定してチップ化する手法が開発されている。 例えば多数のオリゴヌクレオチドをガラス等の基板上に固定ィ匕して、アレイとしたも のは DNAチップと呼ばれ、病理、医療、創薬、食品、および環境等の分野で関連す る遺伝子の解析に多用されている。
また、 DNAチップと同様にプロテインチップ（サイファージェン社の登録商標）を用 V、て遺伝子産物であるタンパク質を網羅的に検索する技術の開発が進められて!/、る 。生命現象がみられるところに DNAが存在するのと同様に、タンパク質分解酵素（プ 口テアーゼ)も存在する。従って、プロテアーゼを網羅的に検出することができれば、 ペプチド性ホルモンの分泌、生成、分解の過程カゝらなるホメォスターシスに関する生 体情報が得られる等、個人のへルスケアに必要な技術となる。プロテアーゼを網羅的 に検出するには、タンパク質としての一分子の存在を科学的に定性定量する方法が ある。
し力しながら、タンパク質の断片化はタンパク質機能の喪失をもたらすため、生体高 分子の立体構造を保持したまま基板上に固定ィ匕することはその形態的な問題力 容 易ではなぐ技術上のネックになっている。
[0003] 近年、病理学的診断などの医学的分野やプロテオーム解析等の研究的分野の発 展に伴って、タンパク質のような断片化による欠点がなく化学的な取り扱いやデータ のライブラリ化が容易な酵素を用いた方法が注目され、複数の酵素に対する活性を 検出する必要性が生じており、酵素に対して活性を有する感応物質を用いてその変 化に伴う吸収光や蛍光等を溶液中で測定する技術が種々研究されている。
例えば、特許文献 1には、タンパク質分解酵素の一種であるカスパーゼにより特異 的に切断される基質ペプチドの両端を蛍光基で修飾し、カスパーゼにより基質ぺプ チドが切断されて生じる蛍光基の蛍光波長や蛍光強度を測定してカスパーゼを含む 溶液の酵素活性を検出するようにした蛍光プローブが記載されている。
また、このような酵素活性の測定方法としては、蛍光測定用マイクロプレートに形成 されたセルに検体溶液を注入し、プレートリーダを用いてセルの蛍光を測定する方法 がある。
特許文献 1：特開 2000-316598号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
し力しながら前記従来の技術では以下のような課題を有して 、た。
(1)特許文献 1に記載の技術では、特定のタンパク質分解酵素に対する試料溶液の 酵素活性が検出されるだけなので、多種多様の酵素やタンパク質を含む血液などの 複雑系に対応させて、その酵素活性や免疫学的特性などを網羅的に測定して、測 定対象となる試料溶液の特徴を多くのライブラリデータなどの中で位置付けて病理学 的診断などを行うには複雑な手順の繰り返しが必要で測定の信頼性や迅速性に欠 けるという課題があった。
(2)また、酵素センサとして特定の酵素に対する特異性が予め知られている基質べ プチドを用いる必要があるので、この基質ペプチドを多数特定配置してこれをセンサ として複雑な免疫系等を解析するには、基礎データの膨大な蓄積を要するという課 題があった。
(3)ミリメートルサイズのセルを有するマイクロプレートに検体溶液を注入して蛍光プ ローブの蛍光変化を測定する従来の方法では、多数の酵素活性を調べるためには 大量の溶液を必要とし、かつハンドリングも煩雑となる。そのため、蛍光測定を行う際 にはマイクロプレートの交換に時間を要し、測定効率を高めることができず測定に時 間を要すると 、う課題を有して ヽた。
(4)さらにセンサ物質と酵素とが結合又は反応しあう際の時系列データなどの取得が 困難で動的解析性に欠けるという課題があった。
(5)基板上でアレイ状に酵素基質を結合させることから、同時並行測定を行うために は基板表面を酵素を含む試料溶液に浸す必要があり、試料溶液をミリリットル単位で 必要として試料溶液を多量に要するという課題があった。
(6)蛍光性酵素基質ペプチドを用い、溶液中の蛍光変化によって酵素活性を測定 する技術では単一の酵素測定の為に溶液用の蛍光測定ゥ ルをひとつ必要とし、多 数の蛍光測定装置を用いたとしても蛍光測定にはゥエル 100個当たり数分を必要と し、精密な定量性を確保するための各ゥエル毎に時間変化測定を行う場合には数時 間以上の時間を必要とし効率性に欠けるという課題があった。
(7)酵素活性検出バイオチップの研究レベルにおいては、トリメトキシァミノプロピル シラン等を介して酵素基質のペプチドをガラス等の基板上表面に結合し、この表面を 酵素溶液に浸すことによって蛍光発光を検出している。しかしながら、基板上の蛍光 性基質ペプチドの結合量が低 、ことから、酵素活性あるなしの定性的な結果を得るこ とはできても、定量性を要求される用途には使用し難 、 t ヽぅ課題があつた。
(8)また、基板上への蛍光性基質ペプチドの結合量が安定せずかつ結合量の定量 が困難であることから、複数の酵素基質ペプチド間の結果の比較を行うことができず 、単一チップ上で同時に酵素活性を定量することは困難である。
本発明は上記従来の課題を解決するためになされたもので、血液などの酵素活性 や免疫学的特性を網羅的に測定して病理学的診断を行う際のデータの取り扱い性 や信頼性、迅速性に優れ、化学処理が容易でしかも検出部の集積度を高められ微 量の検体溶液でも酵素活性及びその傾向を取得できるノィォチップを提供すること を目的とする。
また本発明は、基礎データの蓄積を要せず、しかも時系列データの解析性に優れ 、少量の試料溶液を用いて試料溶液の酵素活性を短時間で測定できる操作性と効 率性に優れた試料溶液の機能性検査方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段 [0006] 本発明の請求項 1に記載のバイオチップは、チップ基板に導入される試料溶液中 の酵素を検出するバイオチップであって、全体が渦巻き状やツリー状、放射状などの 流路パターンで前記チップ基板上に形成された試料溶液流路と、前記試料溶液流 路に所定順で複数配置され所定の酵素に対してそれぞれ異なる活性を有する酵素 活性検知部と、を有して構成される。
この構成により、以下のような作用が得られる。
(1)少量の試料溶液を供給するだけで試料溶液の流れを試料溶液流路に形成させ 、試料溶液中の酵素をそれぞれ異なる酵素活性を備えた酵素活性検知部と反応さ せることができる。こうして、この各酵素活性検知部における酵素反応に伴う状態変 化を光学的または電気的に検出することにより、試料溶液に固有の活性挙動をチッ プ基板上に表示された二次元イメージとして網羅的に取得することができる。
(2)この二次元イメージのデータを同様に取得された既知のライブラリデータなどと比 較参照することにより特定したりグループィ匕したりして、試料溶液の酵素活性や免疫 特性を網羅的に把握して病理学的診断などを的確かつ迅速に行うことができる。
(3)渦巻き状やツリー状、放射状などの流路パターンで形成された試料溶液流路に 、それぞれ異なる活性を備えた酵素活性検知部が配列されているので、取得された 二次元イメージデータに基づく病理診断などをコンピュータによるデータのパターン 認識処理を介せず目視により直接行うこともできる。また、試料溶液流路を特定の幾 何学的配列にして形成することによりデータ取得時におけるスキャン操作の容易化 や、データ処理の省略ィ匕なども図ることができる。
(4)チップ基板に蛍光基を DNAチップ用プロッタや印刷手段などを用いて結合させ て試料溶液検知セルを構成することができ、検出部の集積度を飛躍的に高めること ができ、極微量の試料溶液を用いてその酵素活性などのデータを効率的に得ること ができる。
[0007] ここで、試料溶液としては、病理診断などの対象となる血液や尿を含む体液や培養 液などを適用できる。試料溶液は生体試料 (血液等）をそのまま、あるいはフィルタや 遠心分離等で血球成分等を除去したものを用いることができる。また、生体試料を基 に酵素が活性を発現するような条件設定 (pH調整、活性剤導入など)を行ったものを 使用することもできる。 pH調整剤としては、 Tris-HCl, Hepes-KOH等の緩衝剤を 反応バッファ一として添加することができる。また、酵素活性の発現に必要な塩類や 活性保護剤を添加することもできる。
検知対象となる酵素としては、トリプシン，キモトリブシン，トロンビン，プラスミン，カリ クレイン，ゥロキナーゼ，エラスターゼ等のセリンプロテアーゼ、ペプシン，カテブシン D,レニン，キモシン等のァスパラギン酸プロテアーゼ、カルボキシぺプチダーゼ A, B,コラゲナーゼ，サーモリシン等のメタ口プロテアーゼ、カテブシン B, H, L,カルパ イン等のシスティンプロテアーゼ等の内部のペプチド結合を切断するエンドべプチダ ーゼ、血液凝固系プロテアーゼ、捕体系プロテアーゼ、ホルモンプロセシング酵素等 が該当する。
検知対象となる酵素が不活性状態を持つ場合、トリプシン等の添加または内在阻 害剤の除去により、それらを活性化させることもできる。
[0008] チップ基板としては、酵素特異性を有しな!/ヽガラス質や合成樹脂質などの基質のも のが用いられる。また、ペプチド結合を形成するための縮合反応に用いられる溶媒（ クロ口ホルム，ジクロロメタン等のハロゲン化炭化水素類、酢酸ェチル等のエステル類 、 N, N—ジメチルホルムアミド，ジメチルスルホキシド等の極性有機溶媒、ジォキサン ,テトラヒドロフラン等のエーテル類、メタノール，エタノール等のアルコール類、ピリジ ン等）に不溶性の合成樹脂 (ポリスチレン等)製やガラス製等で平板状や球面等の湾 曲面状等に形成されたものが用いられる。ミモートブス社製ランタンシリーズ (登録商 標)等の市販の固相有機合成用担体も用いることができる。
[0009] 試料溶液流路は、チップ基板の垂直断面が矩形状、 U字状、溝状などに形成され た部分である。試料溶液流路の流路パターンは、単数もしくは複数の上流側開口部 力も下流側開口部に向けて試料溶液が流れるように連続して若しくは分岐して、平 面視で渦巻き状や、ツリー状、放射状、ジグザグ状などに形成することができる。これ により、試料液体流路の集積度を高め、バイオチップを小型化 'コンパクトィ匕すること ができる。
試料溶液流路は、チップ基板上に機械的あるいは化学的に刻んで、 100 L以下 程度の容積、流路幅および深さが lmm以下程度に形成することができる。これらの 上限値より大きくなるにつれ、チップ基板上の試料溶液流路の集積度が低下し、チッ プ基板上に形成させる蛍光パターンの特定が困難になる傾向がみられるからである 試料溶液流路の一端側には、単数若しくは複数の上流側開口部に連設して試料 溶液を供給するための窪み状等の液供給部を形成することができる。窪み状等に形 成された液供給部に試料溶液を一旦供給しておけば、後は放置しておくだけで、試 料溶液を液供給部カゝら試料液体流路に毛管現象等で順次移動させることができるか らである。液供給部には供給される血液 (試料溶液）中の赤血球や白血球、リンパ球 などを除くためのメンブレンフィルムなどのフィルタを必要に応じて設け、これよつて、 試料溶液が流路壁に付着してその流れが妨げられないようにすることができる。 試料溶液流路の他端側には、単数若しくは複数の下流側開口部に連設して試料 溶液を貯めるための液貯留部を形成することができる。この液貯留部は、チップ基板 の中央または周縁部に形成された凹部状の部分である。これによつて、試料溶液流 路の他端側カゝら液貯留部へ試料溶液が流出するため、試料溶液流路カゝら液貯留部 への試料溶液の流れを形成することができるので、試料溶液流路内で試料溶液が滞 留することなぐ試料溶液内の酵素の作用によって酵素活性検知部力 切断された オリゴペプチドを試料溶液内に確実に遊離させることができ、酵素活性の検出感度を 高めることができる。
酵素活性検知部は、特定の酵素に対して選択的特異的な反応挙動を有するぺプ チド鎖などの感応基質などが配置されて構成される。このような酵素特異的反応など に伴って感応基質の蛍光波長や蛍光強度などの光学的特性や電気的特性が変化 し、これを検出することができる。
酵素活性検知部を試料溶液流路内に複数配し、この酵素活性検知部の光を受け ることができる位置等に CCDや CMOS素子の集積体等力 なるイメージセンサを配 置した場合は、チップ基板上の二次元蛍光イメージを取得して、酵素活性検知部の 時系列蛍光データ又は所定時間経過後の蛍光データを得ることができる。
試料溶液流路内に互いに隣接して配置される酵素活性検知部は、隔壁などを介し てセル状に周囲と隔絶するように配置する必要はなぐチップ基板の試料溶液流路 の底部に沿って平面状に連続配列するようにしてもよい。
なお、蛍光基が結合したペプチドからなるそれぞれ独立した酵素活性検知部の試 料溶液流路内への配置は、例えば市販の DNAチップ用プロッタ等を用いたり、顕微 鏡を見ながらシリンジを使ったりして配置することができる。また、渦巻き状などに形成 された試料溶液流路内の所定領域毎にその表面に酵素特異性を付与させたポリス チレン榭脂などの球状粒子や平板等を充填し、それぞれ独立した酵素活性検知部 を配列することも可能である。
請求項 2に記載のバイオチップは、請求項 1に記載の発明において、前記酵素活 性検知部が、（a)その基端側が前記チップ基板に結合されその他端側に結合される ペプチド鎖との化学結合状態によってその蛍光周波数や蛍光強度などの蛍光特性 が変動される蛍光基と、 (b)アミノ酸の組み合わせ力 なる特定アミノ酸配列のぺプ チド鎖により付与される酵素特異性の結合部を介して前記蛍光基に結合されるオリゴ ペプチドと、を備えて構成される。
この構成によって、請求項 1に記載の作用に加えて以下の作用を有する。
(1)チップ基板に結合した蛍光基と、蛍光基に酵素によって切断されるペプチド結合 で結合したオリゴペプチドとを備えて 、るので、酵素と反応させてペプチド結合の切 断が起こるとオリゴペプチドが遊離される。オリゴペプチドが遊離した蛍光基の蛍光 波長又は所定の波長における蛍光強度はその遊離前とは異なるので、蛍光強度等 の変化を指標として酵素活性を検出することができる。
(2)チップ基板上の試料溶液流路内に蛍光基が結合しているので、酵素を含む極微 量の試料溶液を試料溶液流路中に満たしチップ基板の蛍光強度等を測定するだけ で酵素活性を検出することができるとともに、酵素活性を検出できる酵素活性検知部 の集積度を飛躍的に高めバイオチップを小型化できる。
(3)微小容量の試料溶液流路を満たすだけの試料溶液を用いるだけで酵素活性を 検出することができるので、測定の際に多量の試料溶液を必要とせず、微量の試料 溶液でも酵素活性の検出を行うことができる。
(4)試料溶液流路を流れる試料溶液中の酵素と酵素活性検知部の特異的な結合部 位とが接触することで、この酵素に対応したオリゴペプチドと蛍光基との結合部が切 断され、蛍光共鳴エネルギーなどの変化に伴って蛍光基の蛍光発光周波数をシフト させたり、その蛍光強度を変動させたりすることができる。この変化を励起光照射下で フィルタなどを通してその輝点変化を観察したり、または蛍光スペクトルを計測してデ ータ化したりすることができる。
(5)特定酵素などに対する酵素特異性はオリゴペプチドを構成するそれぞれのァミノ 酸配列により決まるので、このアミノ酸配列の可能な組み合わせを一定の順序でチッ プ基板上の試料溶液流路に二次元配列した場合は、同じ試料溶液であれば常に同 一の蛍光パターン配列のイメージが得られる。従って、このイメージデータを既知成 分のデータを含むライブリーデータと比較することにより、その酵素特異性の傾向な ど力 病理学的特性を網羅的に判定することができる。
(6)アミノ酸配列を構成するアミノ酸としては、タンパク質に含まれる 20種以上のもの が設定可能である。アミノ酸配列を 4種のアミノ酸で構成した場合は、 204= 160000 種以上もの順列組み合わせ力もなるペプチド鎖の一部または全部を試料溶液流路 の各酵素活性検知部に配列することができる。
(7)このようなアミノ酸配列の全てにつ!、て特定の酵素やタンパク質に対する酵素活 性などの知見を予め必要としないので、コンピュータによる制御手段を適用してその 規則配列を機械的に形成させることができ、一定のアミノ酸配列力もなるペプチド鎖 を順次試料溶液流路に配置させることができ、既知または未知の酵素に対する所定 の酵素活性を備えて規格構成されたバイオチップを容易に製造して提供できる。
[0012] ここで、オリゴペプチドは、アミノ酸数個からなるペプチド鎖で構成されたペプチドで あって、分子量が大きく塊状などのタンパク質とは異なって略線状の形態を有して 、 る。このオリゴペプチドのアミノ酸配列によって、このオリゴペプチドが結合される蛍光 基との結合部分における酵素特異性を特徴付けることができる。
[0013] 蛍光基としては、オリゴペプチドとのペプチド結合が酵素によって切断される前後に おいて、蛍光波長や蛍光強度に変化が生じるものが用いられる。特に、ペプチド鎖と の結合部とペプチド結合したときは特定波長領域にお!、て非蛍光物質であり、ぺプ チド結合が切断されてペプチド鎖が遊離したときに該特定波長領域において蛍光を 発する蛍光基、例えば、 4 メチルクマリル 7—アミド (MCA)、 7—アミノー 4 カルボキ シメチルクマリン (ACC)、 p— -トロア-リド、 α ナフチルアミド、 ひ ナフチルエステ ル等が好適に用いられる。
結合部に位置するアミノ酸残基は、酵素によって C末端側のペプチド結合が選択 的に切断されるものが用いられる。これにより、蛍光基と結合していた結合部を遊離さ せて蛍光基の蛍光強度や蛍光周波数を変化させることができるからである。
また、オリゴペプチドを所定の長さ（例えば 15 Α程度)以上のペプチド鎖で形成し た場合には、個々のアミノ酸に対する基質特異性が高くなぐむしろ比較的長いぺプ チド鎖の切断作用に必要とするエラスターゼ等の酵素の検出もできるようにすること ができ、検出できる酵素の種類を増やすことができる。
[0014] アミノ酸配列は、例えば A (ァラニン）、 B (プロリン）、 C (リジン）、 D (フエ-ルァラニン )の各アミノ酸を要素とするペプチド鎖で構成して、酵素活性検知部が試料溶液流路 内にペプチド鎖の各要素の規則組み合わせ順に配列した場合は、基本的なアミノ酸 につ 、て蓄積された基礎データに基づ 、て、検査データの解析や評価を容易かつ 迅速に行うことができる。また、基礎的アミノ酸力もなるオリゴペプチドをその A— Dの 文字コード順などの降順や昇順に規則配列するように公知のペプチド鎖の合成手段 を用いて機械的に構成することができ、バイオチップ生産の効率性にも優れている。
[0015] 請求項 3に記載のバイオチップは、請求項 1又は 2に記載の発明において、前記蛍 光基がアミノメチルクマリン系蛍光基であって、シランカップリング剤などでィ匕学修飾 された前記チップ基板上に結合されて構成される。
この構成によって、請求項 1又は 2に記載の作用に加えて以下の作用を有する。
(1)蛍光基をシランカップリング剤でィ匕学修飾されたチップ基板に結合させるので、 結合をより確実に強化することができ、しかも蛍光基のチップ基板に対する結合が試 料溶液中の酵素などの作用で容易に切断されることがなぐノィォチップの安定性と 耐久性を高めることができる。
(2)アミノメチルクマリン系蛍光基を用いるので、各オリゴペプチドとの結合状態によ つて異なるその優れた蛍光特性を有効に利用して、選択性に優れた酵素活性検知 部を構成することができる。
[0016] ここで、シランカップリング剤としては例えば、ァミノプロピルトリメトキシシランなどが 適用できる。
アミノメチルクマリン系蛍光基としては、 4 メチルクマリル 7—アミド（MCA)、 7—ァ ミノー 4 カルボキシメチルクマリン (ACC)などが含まれる。
[0017] 請求項 4記載のバイオチップは、請求項 1乃至 3の内いずれか 1項に記載の発明に おいて、前記チップ基板が透光性であって、その背面側に CCDや CMOS素子など を配列したイメージセンサ基板が積層されて構成されている。
この構成によって、請求項 1乃至 3の内いずれか 1項に記載の作用に加えて以下の 作用を有する。
(1)酸ィ匕珪素や酸ィ匕アルミニウムなどの透光性材カもなるチップ基板の背面側にィメ ージセンサ基板が積層されているので、酵素活性検知部が所定のパターンで配列さ れたチップ基板背面側力 の蛍光変化を直接的にし力も二次元画像として取得でき る。
(2)酵素活性検知部をそのチップ基板上に高密度で集積させた状態で試料溶液中 の酵素成分の解析を行えるので、コンパクトで信頼性に優れたバイオチップを提供で きる。
[0018] イメージセンサ基板としては、周知の半導体製作技術によりシリコン薄板上にフォト ダイオードが二次元配置された感光部及びその信号出力部を備えて形成される CC
Dや CMOS素子などを適用することができる。
[0019] 請求項 5記載のバイオチップは、請求項 1乃至 4の内いずれか 1項に記載の発明に おいて、前記チップ基板の前記試料溶液流路が形成された面側に保護層を備えて 構成されている。
この構成によって、請求項 1乃至 4の内いずれか 1項に記載の作用に加えて以下の 作用を有する。
(1)チップ基板上に溝状などに形成された試料溶液流路の開口部が酸ィ匕珪素膜な どの透光性又は不透光性の保護層で被覆されて 、るので、導入される試料溶液が 試料溶液流路中で空気と接触することなく保護され、測定精度や信頼性、安定性を さらに高めることができる。
(2)透光性の保護層で試料溶液流路を被覆した場合には、その保護層側から励起 光を照射したり、蛍光基の蛍光変化をその外部から測定したりすることができる上に、 試料溶液を試料溶液流路に導入後のバイオチップのハンドリング性や保存性にも優 れている。
[0020] 保護層は例えば、酸ィ匕珪素や酸ィ匕アルミニウムなどで形成されたセラミック被膜を 試料溶液流路が形成されたチップ基板上に添着して構成させることができる。
また、蛍光基の励起波長を通過するフィルタを保護層として被覆することもできる。 これにより、前記試料溶液流路が形成された面側力 光を照射し、酵素活性検知部 の蛍光を検出することができる位置等に CCD等のイメージセンサを配置することで酵 素活性を検出することができる。
[0021] 請求項 6に記載の試料溶液の機能性検査方法は、請求項 1乃至 5の内いずれか 1 項に記載のバイオチップの前記試料溶液流路の液貯留部に試料溶液を所定条件で 供給する試料溶液供給工程と、前記試料溶液流路上に配列された前記酵素活性検 知部毎の状態変化により形成される前記チップ基板上の二次元イメージをその特定 波長域を除去するフィルタで処理してその時系列データ又は所定時間後の結果デ ータを取得するデータ取得工程と、前記時系列データ又は結果データを予め同一測 定条件で蓄積されたライブラリデータと比較してパターン認識手段や統計的データ 処理手段により各ライブラリデータとのパターン適合度を判定するデータ判定工程と 、を有して構成されている。
この構成によって、以下の作用を有する。
(1)全体が渦巻き状やツリー状、放射状などに形成された試料溶液流路に試料溶液 を供給する試料溶液供給工程を有するので、試料溶液流路の酵素活性検知部と試 料溶液中の酵素とを接触させ、この酵素に対して特異的に作用して切断するオリゴ ペプチドと蛍光基との結合を切断させることができる。
(2)次にこの酵素活性検知部毎の酵素切断による蛍光基の蛍光特性などの変化に より二次元イメージを取得するデータ取得工程を有するので、複雑な計算処理を行う ことなく多種類のオリゴペプチドに対応する蛍光挙動を二次元イメージとして網羅的 に取り込むことができる。
(3)このように取得される時系列データ又は結果データをライブラリデータと比較して 各ライブラリデータとのパターン適合度を算出するデータ判定工程を有するので、基 礎データの蓄積を要することなぐ少量の試料溶液を用いて試料溶液の酵素活性を 短時間で測定でき、操作性と効率性に優れて!、る。
(4)血液中などのプロテアーゼは混合物として生体内外に存在するので、混合物の まま酵素活性のみを網羅的に検出して、これをペプチドライブラリのデータと比較、参 照して、ペプチド性ホルモンの分泌、生成、分解の過程カゝらなるホメォスターシスなど に関する生体情報が得られ、個人のへルスケアに資することができる。
発明の効果
[0022] 請求項 1記載の発明によれば、以下のような効果が得られる。
(1)少量の試料溶液を供給するだけで試料溶液の流れを試料溶液流路に形成させ 、試料溶液中の酵素をそれぞれ異なる酵素活性を備えた酵素活性検知部と反応さ せることができる。こうして、この各酵素活性検知部における酵素反応に伴う状態変 化を光学的または電気的に検出することにより、試料溶液に固有の活性挙動をチッ プ基板上に表示された二次元イメージとして網羅的に取得することができる。
(2)この二次元イメージのデータを同様に取得された既知のライブラリデータなどと比 較参照することにより特定したりグループィ匕したりして、試料溶液の酵素活性や免疫 特性を網羅的に把握して病理学的診断などを的確かつ迅速に行うことができる。
(3)渦巻き状やツリー状、放射状などの流路パターンで形成された試料溶液流路に 、それぞれ異なる活性を備えた酵素活性検知部が配置されているので、取得された 二次元イメージデータに基づく病理診断などをコンピュータによるデータのパターン 認識処理を介せず目視により直接行うこともできる。また、試料溶液流路を特定の幾 何学的配列にして形成することによりデータ取得時におけるスキャン操作の容易化 や、データ処理の省略ィ匕なども図ることができる。
(4)チップ基板に蛍光基を DNAチップ用プロッタや印刷手段などを用いて結合させ て試料溶液検知セルを構成することができ、検出部の集積度を飛躍的に高めること ができ、極微量の試料溶液を用いてその酵素活性などのデータを効率的に得ること ができる。
[0023] 請求項 2記載の発明によれば、請求項 1の効果にカ卩えて、以下の効果を有する。 (1)チップ基板に結合した蛍光基と、蛍光基に酵素によって切断されるペプチド結合 で結合したオリゴペプチドとを備えて 、るので、酵素と反応させてペプチド結合の切 断が起こるとオリゴペプチドが遊離される。オリゴペプチドが遊離した蛍光基の蛍光 波長又は所定の波長における蛍光強度はその遊離前とは異なるので、蛍光強度等 の変化を指標として酵素活性を検出することができる。
(2)チップ基板上の試料溶液流路内に蛍光基が結合しているので、酵素を含む極微 量の試料溶液を試料溶液流路中に満たしチップ基板の蛍光強度等を測定するだけ で酵素活性を検出することができ、酵素活性を検出できる酵素活性検知部の集積度 を飛躍的に高めることができる。
(3)試料溶液流路を満たすだけの試料溶液を用いるだけで酵素活性を検出すること ができるので、測定の際に多量の試料溶液を必要とせず、微量の試料溶液でも酵素 活性の検出を行うことができる。
(4)試料溶液流路を流れる試料溶液中の酵素と酵素活性検知部の特異的な結合部 位とが接触することで、この酵素に対応したオリゴペプチドと蛍光基との結合部が切 断され、蛍光共鳴エネルギーなどの変化に伴って蛍光基の蛍光発光周波数をシフト させたり、その蛍光強度を変動させたりすることができる。この変化を励起光照射下で フィルタなどを通してその輝点変化を観察したり、または蛍光スペクトルを計測してデ ータ化したりすることができる。
(5)特定酵素などに対する酵素特異性はオリゴペプチドを構成するそれぞれのァミノ 酸配列により決まるので、このアミノ酸配列の可能な組み合わせを一定の順序でチッ プ基板上の試料溶液流路に二次元配列しておくことにより、同じ試料溶液であれば 常に同一の蛍光パターン配列のイメージが得られる。従って、このイメージデータを 既知成分のデータを含むライブリーデータと比較することにより、その酵素特異性の 傾向など力 病理学的特性を網羅的に判定することができる。
(6)アミノ酸配列を構成するアミノ酸としては、タンパク質に含まれる 20種以上のもの が設定可能である。アミノ酸配列を 4種のアミノ酸で構成した場合は、 204= 160000 種以上もの順列組み合わせ力もなるペプチド鎖の一部または全部を試料溶液流路 の各酵素活性検知部に配列することができる。 (7)このようなアミノ酸配列の全てにつ!、て特定の酵素やタンパク質に対する酵素活 性などの知見を予め必要としないので、コンピュータによる制御手段を適用してその 規則配列を機械的に形成させることができ、一定のアミノ酸配列力もなるペプチド鎖 を順次試料溶液流路に配置させることができ、既知または未知の酵素に対する所定 の酵素活性を備えて規格構成されたバイオチップを容易に製造して提供できる。
[0024] 請求項 3記載の発明によれば、請求項 1又は 2の効果に加えて以下の効果を有す る。
(1)蛍光基をシランカップリング剤でィ匕学修飾されたチップ基板に結合させるので、 結合をより確実に強化することができ、しかも蛍光基のチップ基板に対する結合が試 料溶液中の酵素などの作用で容易に切断されることがなぐノィォチップの安定性と 耐久性を高めることができる。
(2)アミノメチルクマリン系蛍光基を用いるので、各オリゴペプチドとの結合状態によ つて異なるその優れた蛍光特性を有効に利用して、選択性に優れた酵素活性検知 部を構成することができる。
[0025] 請求項 4記載の発明によれば、請求項 1乃至 3の内いずれか 1の効果にカ卩えて以 下の効果を有する。
(1)酸ィ匕珪素や酸ィ匕アルミニウムなどの透光性材カもなるチップ基板の背面側にィメ ージセンサ基板が積層されているので、酵素活性検知部が所定のパターンで配列さ れたチップ基板背面側力 の蛍光変化を直接的にし力も二次元画像として取得でき る。
(2)酵素活性検知部をそのチップ基板上に高密度で集積させた状態で試料溶液中 の酵素成分の解析を行えるので、コンパクトで信頼性に優れたバイオチップを提供で きる。
[0026] 請求項 5記載の発明によれば、請求項 1乃至 4の内いずれか 1に記載の効果にカロ えて、以下の効果を有する。
(1)チップ基板上に溝状などに形成された試料溶液流路の開口部が酸ィ匕珪素膜な どの透光性又は不透光性の保護層で被覆されて 、るので、導入される試料溶液が 試料溶液流路中で空気と接触することなく保護され、測定精度や信頼性、安定性を さらに高めることができる。
(2)透光性の保護層で試料溶液流路を被覆した場合には、その保護層側から励起 光を照射したり、蛍光基の蛍光変化をその外部から測定したりすることができる上に、 試料溶液を試料溶液流路に導入後のバイオチップのハンドリング性や保存性にも優 れている。
[0027] 請求項 6記載の発明によれば、以下の効果を有する。
(1)全体が渦巻き状やツリー状、放射状などに形成された試料溶液流路に試料溶液 を供給する試料溶液供給工程を有するので、試料溶液流路の酵素活性検知部と試 料溶液中の酵素とを接触させ、この酵素に対して特異的に作用して切断するオリゴ ペプチドと蛍光基との結合を切断させることができる。
(2)次にこの酵素活性検知部毎の酵素切断による蛍光基の蛍光特性などの変化に より二次元イメージを取得するデータ取得工程を有するので、複雑な計算処理を行う ことなく多種類のオリゴペプチドに対応する蛍光挙動を二次元イメージとして網羅的 に取り込むことができる。
(3)このように取得される時系列データ又は結果データをライブラリデータと比較して 各ライブラリデータとのパターン適合度を算出するデータ判定工程を有するので、基 礎データの蓄積を要することなぐ少量の試料溶液を用いて試料溶液の酵素活性を 短時間で測定でき、操作性と効率性に優れて!/、る。
(4)血液中などのプロテアーゼは混合物として生体内外に存在するので、混合物の まま酵素活性のみを網羅的に検出して、これをペプチドライブラリのデータと比較、参 照して、ペプチド性ホルモンの分泌、生成、分解の過程カゝらなるホメォスターシスなど に関する生体情報が得られ、個人のへルスケアに資することができる。
図面の簡単な説明
[0028] [図 1]酵素活性検知部の酵素活性検出原理を示す模式図
[図 2]異なる配置構成を有した酵素活性検知部の模式図
[図 3]実施の形態 1におけるバイオチップの模式斜視図
[図 4]試料溶液流路に配列された酵素活性検知部の状態を示す模式図
[図 5]実施の形態 1におけるバイオチップに導入された試料溶液の酵素活性をィメー ジセンサを用いて測定する場合の構成図
[図 6]実施の形態 2におけるバイオチップの模式図
[図 7]実施の形態 2におけるバイオチップの変形例を示す模式図
[図 8]アミノ酸の組み合わせごとに蛍光強度をプロットしたグラフ 符号の説明
1 チップ基板
2 蛍光基
3 オリゴペプチド
4 酵素
5 蛍光波長が変化した蛍光基
6 オリゴペプチド
7 第 1の蛍光基
7a 蛍光が観察されるようになった第 1の蛍光基
8 第 2のオリゴペプチド
9 第 2の蛍光基
10 バイオチップ
11 チップ基板
12 試料溶液流路
13 酵素活性検知部
14 液供給部
15 液貯留部
20 イメージセンサ
21 レンズ
22, 23 フイノレタ
24 イメージセンサ
30 バイオチップ
31 チップ基板
32 試料溶液流路 32a 酵素活性検知部
33 上部フィルタ
34 イメージセンサ基板
35 下部フィルタ
36 酸化珪素層
発明を実施するための最良の形態
[0030] 以下、本発明の一実施の形態を、図面を参照しながら説明する。
図 1は本発明の実施の形態に係るバイオチップにおける酵素活性検知部の酵素活 性検出原理を示す模式図である。
図中、 1は酸ィ匕珪素やガラス等で平板状に機械的ある!、は化学的に製溝された部 分 (試料溶液流路)を備えたチップ基板、 2はチップ基板 1にペプチド結合等で直接 結合した 4 メチルクマリル 7 アミド (MCA)等の蛍光基、 3は蛍光基 2とペプチド結 合で結合されたアミノ酸，ペプチド等のオリゴペプチド、 4は蛍光基 2とオリゴペプチド 3の結合を選択的に切断するセリンプロテアーゼ等の基質特異性を有する酵素、 5は 酵素 4によって選択的にオリゴペプチド 3が遊離されたことにより蛍光波長等が変化し た 7—アミノーメチルクマリン (AMC)等の蛍光基である。以上のように構成される酵素 活性検出部は、公知のペプチド合成の手法を用いて合成され、チップ基板 1上に結 合される。
[0031] 以下、図 1を参照して酵素活性の検出原理について説明する。
図 1 (a)に示す 4 メチルクマリル 7 アミド (MCA)等の蛍光基 2は特定波長領域 にお ヽて非蛍光物質であり蛍光を示さな ヽ。このチップ基板 1に酵素 4を含む試料溶 液を接触させ反応させると、基質特異性を有する酵素 4は、蛍光基 2とオリゴペプチド 3との間のペプチド結合を切断する（図 1 (b)参照)。
オリゴペプチド 3が遊離した蛍光基 5は 7—アミノーメチルクマリン (AMC)等の該特 定波長領域における蛍光物質となり、蛍光波長又は所定の波長における蛍光強度 は、オリゴペプチド 3とペプチド結合した蛍光基 2とは異なるので、蛍光強度等の変化 を指標として酵素活性を検出することができる（図 1 (c)参照)。
[0032] なお、ここでは蛍光基 2がチップ基板 1に直接結合された場合にっ 、て説明したが 、蛍光基 2をアミノ酸，ペプチド等を介してチップ基板 1に結合させる場合もある。これ により、チップ基板 1と酵素作用点との距離を適正化することができ、チップ基板 1の 影響を受けずに酵素活性をより正確に検出することができるという作用が得られる。 なお、この場合、蛍光基 2とチップ基板 1との間のアミノ酸，ペプチド等は酵素特異性 を有しない分子又は化合物で合成する。酵素が作用して蛍光基 2がチップ基板 1か ら遊離するのを防止するためである。
[0033] 図 2は、図 1とは異なる配置構成を有した酵素活性検知部の模式図である。
図 2において、 6はチップ基板 1にその一端が固定ィ匕された第 1のオリゴペプチド、 7 はオリゴペプチド 6の側鎖に導入された第 1の蛍光基、 8はペプチド結合で第 1のオリ ゴペプチド 6と結合した第 2のオリゴペプチド、 9は第 2のオリゴペプチドに結合し第 1 の蛍光基 7と蛍光共鳴エネルギー移動を起こす第 2の蛍光基、 7aは蛍光共鳴エネル ギー移動によって本来観察されるはずの第 2の蛍光基 9の蛍光が減衰し、代わりに蛍 光が観察されるようになった第 1の蛍光基である。
ここで、蛍光共鳴エネルギー移動とは、ある 2つの蛍光化合物が距離的に近い位置 に存在するとき、その 2つの蛍光化合物のうちの一方（ドナーと!/、う）の蛍光スペクトル と他方 (ァクセプターと 、う）の励起スペクトルとが重なりをもつ場合、ドナーの励起波 長のエネルギーを当てると本来観察されるはずのドナーの蛍光が減衰し、代わりにァ クセプターの蛍光が観察される現象を 、う。
この酵素活性検知部では、酵素 4によって第 2のオリゴペプチドが遊離されて 2つの 蛍光化合物が距離的に遠い位置に存在することになつたため、本来観察されるはず の第 2の蛍光基 9の蛍光が減衰し、代わりに第 1の蛍光基 7の蛍光が観察され (7a)、 酵素活性を検出することができる。
[0034] ここで、第 1の蛍光基 7、第 2の蛍光基 9としては、蛍光共鳴エネルギー移動が起こ るドナーとァクセプターの組合せを用いることができる。例えば、第 1の蛍光基 7 (又は 第 2の蛍光基 9)の蛍光波長と重なる波長域に吸収帯をもつ原子団である第 2の蛍光 基 9 (又は第 1の蛍光基 7)が用いられる。具体的には、（7—メトキシクマリンー 4 ィル） ァセチル（MOAc) ,アントラ-ロイルペンジル（ABz) , N—メチルアントラ-ル酸（Nm a)等とジニトロフエ-ル（Dnp)の組合せ、 Dabsylと EDANS (5— (2'-アミノエチル）ァミノ ナフタレン 1ースルホン酸）の組合せ、トリプトファン（Trp)と 5—ジメチルァミノ— 1—ナ フタレンスルホン酸 (Dns)の組合せ、カルボキシジクロ口フルォレセイン（CDCF)と力 ルボキシメチルローダミン（CTMR)の組合せ、カルボキシジクロ口フルォレセイン（C DCF)とカルボキシ X ローダミン（CXR)の組合せ、ルシファーイエロー（LY)とカル ボキシメチルローダミン（CTMR)の組合せ等が用いられる。
これらのドナーゃァクセプターのいずれが第 1の蛍光基 7になっても第 2の蛍光基 9 になっても構わない。第 1の蛍光基 7にスペクトル変化が生じれば酵素活性の測定指 標にすることができるからである。
なお、第 1のオリゴペプチド 6の側鎖に導入された第 1の蛍光基 7と第 2のオリゴぺプ チド 8に各々結合した第 1の蛍光基 7と第 2の蛍光基 9の結合部間の長さは、 100 A 以下であることが望ましい。この距離が長くなるにつれ蛍光共鳴エネルギー移動が小 さくなり蛍光強度等の変化が小さくなる傾向がみられ、 100Aより長くなるとこの傾向 が著しく蛍光強度の変化が著しく小さくなり感度が低下する力 である。
このように酵素活性検知部を構成することにより、個々のアミノ酸に対する基質特異 性が高くなぐむしろ比較的長いペプチド鎖を切断作用に必要とするエラスターゼ等 の酵素の検出を容易に行うことができ検出感度を高めることができる。
(実施の形態 1)
図 3は以上の酵素活性検出原理が適用される本発明の実施の形態 1におけるバイ ォチップの模式斜視図であり、図 4は試料溶液流路に配列された酵素活性検知部の 状態を示す模式図である。
図 3において、 10は本発明の実施の形態 1におけるバイオチップ、 11はバイオチッ プ 10を構成して全体が略矩形板状に形成されたチップ基板、 12はその全体が渦巻 き状となってチップ基板 11上に溝状に形成された試料溶液流路、 13は試料溶液流 路 12内にセル状、スポット状に形成されそれぞれ所定の酵素活性を有して所定順で 配置された酵素活性検知部、 14は試料溶液流路 12の外端側に設けられ試料溶液 が供給される略矩形状の液供給部、 15は試料溶液流路 12の排出側となる渦巻き中 心側に略円形状に設けられた液貯留部である。
ノィォチップ 10は、その全体が略矩形板状（一辺の長さ約 20— 30mm、厚み約 2 mm)のガラス質やポリスチレン榭脂質など力もなるチップ基板 11に、流路幅約 0. 5 mm、深さ約 0. 1mmの流路断面と有効流路長さ約 90mmを有して互いに流路間隔 0. 5mmで渦巻き状に形成された試料溶液流路 12を備えている。なお、液供給部 1 4は一辺が約 2. 5mmの略正方形状に形成され、このような試料溶液流路 12の有効 容積は約 4. 5 μ Lである。
このチップ基板 11上の液供給部 14に採取された血液サンプルなどの試料溶液が 供給されて試料溶液流路 12を毛管現象等によって順次移動して酵素活性検知部 1 3に接触して試料溶液中に含まれる各酵素の活性や抗体反応性などの特性が検出 されるようにしている。
[0036] 酵素活性検知部 13は、チップ基板 11上に渦巻き状に形成された試料溶液流路 1 2の底部にセル状、窪み状又は平坦なスポット状サイトとして形成され、それぞれ異な る酵素活性を備えたものが互いに所定間隔をお ヽて順次配列されるように構成され ている。
酵素活性検知部 13は、図 3及び図 4に示すように略溝状に形成された試料溶液流 路 12の底面にその一端側が結合される蛍光基 Κと、蛍光基 Κの他端側に結合され 例えば Α— Dの 4サイトに配置されるアミノ酸配列力 なるオリゴペプチドとで構成され る。
蛍光基 Kは例えばアミノメチルクマリン系蛍光基であって、各オリゴペプチドとの結 合状態によって異なる蛍光特性を有する。なお、必要に応じてチップ基板 11をシラン カップリング剤などで化学修飾処理して、蛍光基 Kがチップ基板 11の試料溶液流路 12内に結合されるようにして、チップ基板 11との結合の安定性と耐久性を高めること ができる。
[0037] 蛍光基 Kに接合するオリゴペプチドの A— Dの各サイトには例えば、 ala :ァラニン、 pro :プロリン、 lys :リジン、 phe :フエ-ルァラニンの内のいずれかの組み合わせから なるペプチド鎖が設定されるようにして 、る。
オリゴペプチドは例えば、（l) ala— pro— lys— phe、（2) pro—lys—phe—ala、 (3) lys phe—ala— pro、（4) phe— ala— pro— lysのようなアミノ酸配列に設定され、このような 各アミノ酸配列に対応して、オリゴペプチドが結合される蛍光基の結合部の酵素特異 性が規定されるようにして 、る。
[0038] 各アミノ酸配列は、ペプチドを C末端力 伸長して 、く固相法等の通常のペプチド 合成法により合成することができる。また、 目的とするアミノ酸配列の C末端側力も N 末端側へ逐次伸長して!/ヽく逐次伸長法や、複数の短!ヽペプチド断片を合成しぺプ チド断片間のカップリングにより伸長させる断片縮合法等を用いることができる。また 、公知のペプチド合成機を用いて 9 フルォレ -ルメチルォキシカルボ-ル（Fmoc) アミノ酸や t ブチルォキシカルボ-ル (Boc)アミノ酸等を導入して合成することもでき る。さらに、プロテアーゼを用いてペプチド結合を生成したり、遺伝子工学的手法を 用いて合成することもできる。
さらに、ペプチド結合を形成するための縮合方法としては、例えば、アジド法、酸ク 口ライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、 DCC法、 DCC -アディティブ法、活性ヱ ステル法、カルボニルジイミダゾール法、酸化還元法、ウッドワード試薬 Kを用いる方 法等が用いられる。また、縮合反応を行う前に、公知の手段によりアミノ酸やペプチド 中の反応に関与しないカルボキシル基、アミノ基等を保護したり、また反応に関与す るカルボキシル基，アミノ基を活性ィ匕させたりしておくこともできる。
[0039] こうして、図 4に示すようにアミノ酸配列の可能な組合せをそれぞれ有した S1— Sn の酵素活性検知部 13を試料溶液流路 12の底部に、例えば以下のように配列する。
S 1：蛍光基 オリゴペプチド（1) (ala-pro-lys-phe)
52：蛍光基 オリゴペプチド（2) (pro-lys-phe-ala)
53：蛍光基 オリゴペプチド（3) (lys-phe-ala-pro)
54：蛍光基 オリゴペプチド（4) (phe-ala-pro-lys)
Sn：蛍光基 オリゴペプチド (n)
このように S I— Snの酵素活性検知部が配列された試料溶液流路 12に試料溶液を 流して酵素活性検知部 13と接触させることにより、試料溶液中の酵素やタンパク質が それぞれ異なる酵素特異性が付与されたオリゴペプチドと蛍光基間の結合に作用し てこの結合を切断する。この切断に伴う蛍光基の蛍光特性変化を光学的に検出する ことにより、渦巻き状に形成された試料溶液流路 12を、試料溶液に固有の蛍光バタ ーンとして表すことができる。
なお、 S1— Snにおけるオリゴペプチドのアミノ酸配列は、各アミノ酸配列について その酵素活性などの特性や挙動が既知である必要はなぐバイオチップ 10として特 定のユニークな配列のものであればよい。このため、 S1— Snには、例えば周期的パ ターンを含むような規則配列やランダム配列のものなどが含まれる。
[0040] 試料溶液流路 12は、チップ基板 11が酸ィ匕珪素やガラス質である場合にはエツチン グ加工などにより形成される。また、チップ基板 11が合成樹脂などである場合にはェ ンボス加工、レーザビーム加工、マシンユングセンタを用いた研削加工などにより形 成されるが、所定形状の金型を用いて合成樹脂を出発原料として射出成形やプレス 成形などにより製造することもできる。
溝状に形成される試料溶液流路 12の深さは約 10— 200 m、幅は 10— 1000 mの範囲とすることが好ましい。これは流路の深さや幅がそれぞれの下限値より小さく なると、試料溶液の粘性で流路が閉塞されたり、測定感度が不足するような傾向が現 れ、逆に深さや幅がそれぞれの上限値より大きくなると、チップ基板上の酵素活性検 知部の集積度が不足してチップ基板上に形成させる蛍光パターンの特定が困難に なる傾向が生じる力 である。
[0041] 液供給部 14はチップ基板 11の辺側に配置されて不織布フィルタやメンブレンフィ ルムなどの血液中の赤血球などを除去するフィルタを設けることもできる。これによつ て、供給される試料溶液中の赤血球や白血球などを濾過して試料溶液の粘性等を 調整することができるので、試料溶液流路 12の壁部に付着して流路が閉塞されるの を効果的に防止できる。
[0042] 続いて、以上のように構成されたバイオチップ 10に適用される試料溶液の機能性 検査方法について、図 4に示す酵素活性検知部の特定酵素に対する動作模式図を 参照しながら説明する。
まず、それぞれ固有の酵素活性を有する酵素活性検知部 13をチップ基板 11上に 渦巻き状に形成された試料溶液流路 12の各サイト S1— Snにそれぞれ所定パターン で配置したバイオチップ 10を用意して、試料溶液供給工程において、このバイオチ ップ 10の液供給部 14に血液などの試料溶液を所定流量や温度の条件で供給する。 これによつて、液供給部 14に供給された血液成分等が試料溶液流路 12に供給され て、各 S 1— Snのサイトの酵素活性検知部 13に毛管現象等を利用して順次接触させ ることがでさる。
こうして、図示するように血液成分中の特定の酵素に対して感応性を有したオリゴ ペプチドと蛍光基との結合部分が切断され、蛍光基の蛍光特性が切断前の状態 (こ こでは OCとする）から切断後の状態 (ここでは βとする）に変化する。この結果、試料 溶液流路 12に沿う S 1— Snのサイトにおける蛍光基の状態は、その初期状態 X (ひ、 α、 α、 α、 a )から、例えば検知状態 Y ( α、 j8、 α、 α、 β )のよう に表される。
[0043] 次のデータ取得工程においては、試料溶液流路 12上の酵素活性検知部 13毎に おける蛍光変化により形成されるチップ基板 11上の二次元蛍光イメージをイメージセ ンサなどで取得して、その特定波長域を除去するフィルタで処理することにより、その 時系列データ又は所定時間後の結果データを得ることができる。
[0044] データ判定工程においては、前記時系列データ又は所定時間後の結果データを、 予め同一測定条件で各種のサンプルにつ 、て測定蓄積されたライブラリデータと比 較してパターン認識手段や統計的判定手段などにより各ライブラリデータとのパター ン適合度を判定して、各種の病理学的知見などを迅速かつ的確に得ることができる。
[0045] 以上説明したように、ノィォチップ 10を用いる試料溶液の機能性検査方法では、 血液や尿等を含む試料溶液を検査対象とし、酵素特異性を付与するオリゴペプチド でアレイ化された試料溶液流路に導 ヽて反応させる。この酵素反応の結果を蛍光強 度を検出するイメージセンサで取得して、この取得されたデータをライブラリデータと 比較して、試料溶液に含まれるプロテアーゼ混合物の活性を網羅的に検出すること ができる。また、試料溶液流路 12が渦巻状に形成されているので、毛管現象等で試 料溶液流路 12内を移動する試料溶液の速度を略一定にでき、取得した時系列デー タの再現性に優れ、さらに分岐せずひと続きなので、試料液体流路 12における液供 給部 14からの道のりの長さと蛍光強度等とを 1対 1の関係で表すことができ、ライブラ リデータとの比較を容易に行うことができる。 このようにプロテアーゼを網羅的に検出して、ペプチド性ホルモンの分泌、生成、分 解過程力 なるホメォスターシスなどに関する生体情報が得られるので、これを個人 のへルスケアに効率的に活用することができる。
こうして、ノィォチップを用いた試料溶液の機能性検査方法を、病理学的診断など の医学的分野やプロテオーム解析等の研究的分野に適用して、複数の酵素の活性 を高速で、かつ少量のサンプルで測定することができる。
[0046] 次に、イメージセンサを用いてバイオチップに導入された試料溶液の酵素活性を測 定する具体的な構成について説明する。
図 5は実施の形態 1におけるバイオチップに導入された試料溶液の酵素活性をィメ ージセンサを用いて測定する場合の構成図である。
図 5において、 20はバイオチップ 10の上部に配置されレンズ 21を介してチップ基 板 11上の酵素活性検知部 13における二次元データを取得するためのイメージセン サである。このように、イメージセンサ 20をチップ基板 11から離して置く形態のもので は、酵素活性検知部 13の蛍光基の状態変化がレンズ 21などの光学系を介してィメ ージセンサ 20上に結像して読み取られる。
[0047] 以上のように実施の形態 1におけるバイオチップは構成されて!、るので、チップ基 板 11の試料溶液流路 12に酵素を含む極微量の試料溶液を導入させチップ基板 11 の蛍光強度等を測定するだけで酵素活性を検出することができる。さらに、個別の試 料ごとに基板に溶液を注入するセル等を形成する必要がなく酵素活性検知部 13及 び試料溶液流路 12を微小化できるので、チップ基板 11にお 、て酵素の検出部の集 積度を飛躍的に高めることができる。
また、酵素を含む極微量の試料溶液を使用するだけで酵素活性を検出することが できるので、測定の際に多量の試料溶液を必要とせず、微量の試料溶液でも酵素活 性の検出を行うことができる。
[0048] (実施の形態 2)
図 6はチップ基板をイメージセンサ上に直接配置してノィォチップに導入される試 料溶液の酵素活性を測定する場合の本発明の実施の形態 2におけるバイオチップ の模式図である。 図 6にお ヽて、 22は酵素活性検知部 13が試料溶液流路 12内に配列されたチップ 基板 11の表面に配置された透光性を有する保護層としてのフィルタであり、酵素活 性検知部 13の励起波長は通過させるが蛍光波長は遮断するような選択性を有して いる。 23はチップ基板 11の背面に配置されたフィルタであり、酵素活性検知部 13の 蛍光波長は通過させるが励起波長は遮断するような選択性を有して 、る。 24はチッ プ基板 11の裏面側にフィルタ 23を介して配設された CCD等のイメージセンサである なお、本実施の形態においては、チップ基板 11は透光性を有するガラス製等で形 成されている。
これにより、実施の形態 2におけるバイオチップは、酵素活性検知部 13の蛍光を密 着配置されたイメージセンサ 24の検出素子でそのまま読み取ることができるので、レ ンズ等の光学系を要さずコンパクトィ匕することができる。
図 7は実施の形態 2におけるイメージセンサを積層させたバイオチップの変形例を 示す模式図である。
図 7において、 30は実施の形態 2における変形例のバイオチップ、 31は酸ィ匕珪素 力もなる透光性を有するチップ基板、 32はチップ基板 31に溝状にエッチング等で形 成された試料溶液流路、 32aは試料溶液流路 32内に配列された酵素活性検知部、 33は試料溶液流路 32の開口面を覆うように配置され所定波長の蛍光を透過させる ためのガラスまたは有機物からなる上部フィルタ、 34はチップ基板 31の裏面側に下 部フィルタ 35を介して積層配置された CMOS素子等が集積ィ匕されたイメージセンサ 基板、 36はイメージセンサ基板 34の表面を保護する酸ィ匕珪素層であり、イメージセ ンサ基板 34の CMOS素子等を形成する際に絶縁層（保護層）として CVD等の手段 で形成されたものである。
なお、上部フィルタ 33は酵素活性検知部 32aの励起波長は通過させるが蛍光波長 は遮断するような選択性を有しており、下部フィルタ 35は酵素活性検知部 32aの蛍 光波長は通過させるが励起波長は遮断するような選択性を有している。
また、チップ基板 31はイメージセンサ基板 34の CMOS素子等を形成する際に絶 縁層 (保護層）として CVD等の手段で形成された酸ィ匕珪素層と同様に、 CVD等で形 成されている。
以上のように構成された本実施の形態におけるバイオチップ 30は、イメージセンサ 基板 34の酸ィ匕珪素層 36上に直接配置された下部フィルタ 35の投影面上にチップ 基板 31の酵素活性検知部 32aが位置するように構成されており、チップ基板 31をィ メージセンサ基板 34の CMOS素子等を形成するのと同様の半導体製造技術を用い て製造されて ヽるので、製造工程が短縮できると ヽぅ作用が得られる。
実施例 1
[0050] 以下、本発明を実施例を参照してさらに具体的に説明する。なお、本発明はこれら の実施例に限定されるものではない。
本実施例で説明するアミノ酸、ペプチド、保護基、溶媒等は、当該技術分野で慣用 されている略号又は IUPAC-IUBの命名委員会で採用された略号を使用する。
例えば、以下の略号を使用している。 Ala:ァラニン、 Pro :プロリン、 Lys :リジン、 Phe : フエ-ルァラニン、 Aca:アミノカプロン酸、 A ァセチル、 ACC : 7—アミノー 4 カルボキ シメチルクマリン、 Boc :t ブチルォキシカルボ-ル、 Lys(Boc) :側鎖 t-ブチルォキシ カルボ-ル保護リジン、 DCC :ジシクロへキシルカルボジイミド、 DCM :ジクロロメタン、 DIEA:N,N—ジイソプロピルェチルァミン、 DMF:N,N—ジメチルホルムアミド、 EtOH :ェ タノール、 Fmo 9 フルォレ -ルメチルォキシカルボ-ル、 HATU : o—(7—ァザベン ゾトリアゾール—1 ィル）—1, 1, 3, 3—テトラメチルゥ口-ゥムへキサフルォロホスフエ ート、 HBTU: o— (ベンゾトリアゾール 1—ィル） 1, 1, 3, 3—テトラメチルゥ口-ゥムへ キサフルォロホスフェート、 HOAt: 1—ヒドロキシー 7—ァゾベンゾトリァゾール、 HOBt: 1 ーヒドロキシベンゾトリァゾール、 TFA:トリフルォロ酢酸。
[0051] 実施例 1では、酵素活性検知部を形成させるための予備実験として、酵素活性検 出用基板としてのぺプチジル蛍光基結合球状基板を合成して酵素（トリプシンとキモ トリプシン）に対する活性の測定を行った。以下、その方法について説明する。
なお、このような球状基板を、渦巻き状などに形成された試料溶液流路の酵素活性 検知部 S1— Snとなる各領域に充填配置してバイオチップを構成することができる。 <ぺプチジル蛍光基結合球状基板の合成 >
基板としては球状の市販の NH -PEGA-resin (渡辺化学工業製)を用いた。固相合 成用ベッセルを垂直に固定し、 NH - PEGA- resin(0.05 mmol/g, 0.5 g)を入れてべッ
2
セルのコックを開いた状態で DMF(10 ml)を流し溶媒を置換した。次いで、ベッセルの コックを閉じ、 Fmoc— Aca— OH (0.13 mmol, 44 mg), HBTU(0.13 mmol, 48 mg), DIEA(0.13 mmol, 0.022ml)を DMF(2 ml)に溶解させて加え、ー晚反応させた。反応後 、コックを開き DMF(10 ml)およびメタノール (10 ml)で洗浄し、 Fmoc- Aca- PEGA resin を得た。
[0052] 次に、ベッセル中の Fmoc- Aca- PEGA resin(0.05 mmol/g, 0.5 g)に、コックを開いた 状態で DMF(10 ml)を流し、溶媒置換および洗浄を行った。コックを閉じて 20%ピベリジ ン ZDMFを入れ、 30分反応させ、脱 Fmocを行った。その後、コックを開いて 20%ピぺ リジン ZDMFを除去し、次いで DMF(10 ml)を用いて洗浄した。次に、コックを閉じた 状態で Fmoc— Aca— OH(3 eq), HATU(3 eq), HOAt(3eq), DIEA(5eq)を DMF(2 ml)に溶 解させて加え、 3時間反応させた。その後コックを開け、 DMF(10 ml),メタノール (10 ml)を用いて洗浄し、基板 (PEGA resin)に結合部 (Aca- Aca- )が結合した
Fmoc-Aca-Aca-PEuA resinをネ守に。
次に、 20%ピぺリジン ZDCM (1 mL)を用いて 30分撹拌して Fmoc基の除去を行った 。 DCM(1 ml)で 3回、 DMF (1 ml)で 1回洗浄した後、 DMF 1 mlに溶解させた
Fmoc— Lys(Boc)— ACC— OH (36 mg, 54 mmol), DCC (11 mg, 54 mmol), HOBt-H20 (8.3 mg, 54 mmol)をカ卩ぇ 24時間反応させた。反応終了後、 DMF (1 ml)で 2回、 DCM (1 ml)で 2回、 EtOH (1 ml)で 2回、 DCM (1 ml)で 2回洗浄した後、減圧下乾燥させて 蛍光基（ACC)が結合部（Aca-Aca-)に結合した Fmoc-Lys(Boc)-ACC-Aca-Aca- PEGA resinを得た。
その後、 DMF (1 ml)で 1回洗浄し、 DIEA (32 ml, 183 mmol)および無水酢酸 (8.5 ml, 90 mmol)を DMF (1 ml)に希釈して加え 1時間撹拌させた。その後、 DMF (1 ml)で 3回、 DCM (1 ml)で 3回洗浄を行い、未反応物のァセチル化を行った。
[0053] 次!、で、 20%ピぺリジン ZDCM (1 ml)を用いて 30分撹拌して Fmoc基の除去を行つ た。その後、 DCM(1 ml)で 3回、 DMF (1 ml)洗浄を行った後、 Fmoc- Pro- OH (18 mg, 54mmol), HATU (20 mg, 54 mmol), HOAt (7 mg, 54 mmol), DIEA (16 ml, 90 mmol) を DMF (1 ml)に溶解させて加え 1時間反応させた。その後、 DMF (1 ml)で 3回、 DCM (1 ml)で 3回洗浄し Fmoc- Pro- Lys(Boc)- ACC- Aca- Aca- PEGA resinを得た。
以下、 Fmoc— Pro— Lys(Boc)— ACC— Aca— Aca— PEGA resinに Fmoc— Ala— OHを用いて 同様の操作を繰り返しペプチドを伸長し、蛍光基 (ACC)に結合部 (Ala-Ala-Pro- Lys )が結合した Ala- Ala- Pro- Lys(Boc)- ACC- Aca- Aca- PEGA resinを得た。その後、コ ックを閉じて DIEA (2.5 mmol, 0.435 ml),無水酢酸 (1.25 mmol, 0.117 ml)を DMF(2 ml) に希釈してカ卩ぇ 1時間反応させて結合部の末端基がァセチルイ匕された
Ac— Ala— Ala— Pro— Lys(Boc)— ACC— Aca— Aca— PEGA resinを得た。
ベッセルに Ac— Ala— Ala— Pro— Lys(Boc)— ACC— Aca— Aca— PEGA resin(0.05 mmol, 0.5 mg)を入れ、コックを開いた状態で DCM(10 ml)を流し溶媒を置換した後、コックを閉 じて 25%TFAZDCM(2 ml)を入れ、 30分反応させ、脱 Bocを行った後、 DCM(10 ml),H20 (10 ml)を用いて洗浄し、目的とする実施例 1のぺプチジル蛍光基結合球状 基板 (Ac- Ala- Ala- Pro- Lys- ACC- Aca- Aca- PEGA resin)を得た。
<酵素活性の測定 >
96ゥエルの蛍光測定用マイクロプレートのゥエル A— Dに、実施例 1の酵素活性検 出用基板としてのぺプチジル蛍光基結合球状基板
Ac- Ala- Ala- Pro- Lys- ACC- Aca- Aca- PEGA resinと以下の溶液を入れ、実験開始 時の蛍光値と 30分後の蛍光値との差を測定した。蛍光値は、 WALLAC ARVOTM SX 1420マルチラベルカウンタ（パーキンエルマ一製）を用いて励起波長 370nm、 蛍光波長 460nmで測定した。
A:Ac— Ala— Ala— Pro— Lys— ACC— Aca— Aca— PEGA resin (wet) 5 mgゝ 20 mM Tris HC1 buffer(pH 7.2, 100 mM NaCl, 50 mM CaC12 )240 μ 1、トリプシン (1 mg/1 ml)から 10 μ
B :Ac— Ala— Ala— Pro— Lys— ACC— Aca— Aca— PEGA resin (wet) 5 mgゝ 20 mM Tris HC1 buffer(pH 7.2, 100 mM NaCl, 50 mM CaC12 )240 μ 1、キモトリブシン (1 mg/1 ml)から 10 μ ΐ
C :Ac— Ala— Ala— Pro— Lys— ACC— Aca— Aca— PEGA resin (wet) 5 mgゝ 20 mM Tris HC1 buffer(pH 7.2, 100 mM NaCl, 50 mM CaC12 )250 μ 1
D : 20 mM Tris HC1 buffer (pH 7.2, 100 mM NaCl, 50 mM CaC12 )250 μ 1, なお、ゥ ル Aとゥ ル Bとの異なる点は酵素の種類であり、ゥ ル A (又はゥ ル B) とゥエル Cとの異なる点は酵素の有無であり、ゥヱル A (又はゥヱル B, C)とゥヱル Dと の異なる点は酵素活性検出用基板の有無である。
各ゥエルについて実験開始時の蛍光値と 30分後の蛍光値との差を (表 1)に示す。
[表 1]
Figure imgf000031_0001
[0056] (表 1)のゥエル A, Bとゥエル Cの蛍光値を比較して、実施例 1の酵素活性検出用基 板は、トリプシンが存在するゥエル Aでは約 315倍、キモトリブシンが存在するゥエル B では約 10倍異なることが確認された。これにより、実施例 1の酵素活性検出用基板を 適用して酵素の量や酵素の種類等に対応した酵素活性の検出が可能であることが 示された。また、ゥエル Aとゥエル Bの蛍光値を比較して、実施例 1の酵素活性検出用 基板は、トリプシンの場合の蛍光値がキモトリブシンの場合の蛍光値と比較して約 30 倍以上大きいことが確認された。これは、実施例 1の酵素活性検出用基板の蛍光基 と結合する結合部のアミノ酸がリジンであり、トリプシンは主にリジンの C末端側のぺプ チド結合を選択的に切断する特異性を有していることから発現したものであると推察 される。一方、キモトリブシンは主に芳香族アミノ酸残基の C末端側のペプチド結合を 選択的に切断する特異性を有しているため、反応前後の蛍光値の変化が小さかった と推察される。
これにより、実施例 1の酵素活性検出用基板は酵素によって特異性を有するため、 活性を有する酵素の定性分析が可能であることが示された。また、同一の種類の酵 素活性検出用基板に同一種類の酵素を含有する検体溶液を接触させ所定時間後 における蛍光値を測定すれば、蛍光値の変化は酵素の作用を受けて修飾された分 子の数に対応するので、酵素の定量分析が可能であると推察された。
実施例 2
[0057] 実施例 2では、酵素活性検出用基板としてのぺプチジル蛍光基結合平面基板を合 成して酵素の活性測定を行った。以下、その方法について説明する。なお、以下に 述べる合成方法を適用して酵素活性検知部を形成でき、試料溶液流路の各領域に それぞれ異なる酵素特異性を有した酵素活性検知部を所定パターンで配列すること ができる。
[0058] <ぺプチジル蛍光基結合平面基板の合成 >
基板としては、ペプチド合成用多板状合成樹脂製担体 (ミモートブス社製ランタンシ リーズ (登録商標))を 1プレートだけ切り離し平面状とした合成樹脂製担体を用いた。 スクリュー管に基板としての合成樹脂製担体 lantern 1個（ミモートプス社 D-series, 導入率 18 mmol /個）を入れ、 20%ピぺリジン ZDCM (1 mL)を用いて 30分撹拌し Fmoc基の除去を行った。 DCM (1 ml)で 3回、 DMF (1 ml)で洗浄した後、
Fmoc-Aca-OH (19 mg 54 mmol) , DCC (17 mg 81 mmol), HOBt-H20 (8 mg 54 mmol)を DMF (1 ml)に溶解させてカ卩ぇ 24時間反応させた。反応終了後、 DMF (1 ml) で 2回、 DCM (1 ml)で 2回、 EtOH (1 ml)で 2回、 DCM (1 ml)で 2回洗浄した後、減圧 下乾燥させて Fmoc-Aca-lanternを得た。
次に、 20%ピぺリジン ZDCM (1 ml)を用いて 30分撹拌して Fmoc基の除去を行った 。その後、 DCM(1 ml)で 3回、 DMF (1 ml)洗浄を行った後、 Fmoc- Aca- OH (19 mg, 54mmol), HATU (20 mg, 54 mmol), HOAt (7 mg, 54 mmol), DIEA (16 ml, 90 mmol) を DMF (1 ml)に溶解させて加え 1時間反応させた。その後、 DMF (1 ml)で 3回、 DCM (1 ml)で 3回洗浄し、基板 (lantern)に結合部 (Aca-Aca)の一端が固定ィ匕された Fmoc- Aca- Aca- lanternをネ守た。
[0059] 次いで、 20%ピぺリジン ZDCM (1 mL)を用いて 30分撹拌して Fmoc基の除去を行つ た。 DCM(1 ml)で 3回、 DMF (1 ml)で 1回洗浄して lanternを膨潤させ、 DMF 1 mlに溶 解させた Fmoc- Lys(Boc)- ACC- OH (36 mg, 54 mmol), DCC (11 mg, 54 mmol), HOBt-H20 (8.3 mg, 54 mmol)をカ卩ぇ 24時間反応させた。反応終了後、 DMF (1 ml) で 2回、 DCM (1 ml)で 2回、 EtOH (1 ml)で 2回、 DCM (1 ml)で 2回洗浄した後、減圧 下乾燥させて結合部 (Aca-Aca)に蛍光基 (ACC)が結合した
Fmoc— Lys(Boc)— ACし— Aca— Aca— lanternをネ守に。
その後、 DMF (1 ml)で 1回洗浄し、 DIEA (32 ml, 183 mmol)および無水酢酸 (8.5 ml, 90 mmol)を DMF (1 ml)に希釈して加え 1時間撹拌させた。その後、 DMF (1 ml)で 3回、 DCM (1 ml)で 3回洗浄を行い、未反応物のァセチル化を行った。 次に、 20%ピぺリジン ZDCM (1 ml)を用いて 30分撹拌して Fmoc基の除去を行った 。その後、 DCM(1 ml)で 3回、 DMF (1 ml)洗浄を行った後、 Fmoc- Pro- OH (18 mg, 54mmol), HATU (20 mg, 54 mmol), HOAt (7 mg, 54 mmol), DIEA (16 ml, 90 mmol) を DMF (1 ml)に溶解させて加え 1時間反応させた。その後、 DMF (1 ml)で 3回、 DCM (1 ml)で 3回洗浄し Fmoc- Pro- Lys(Boc)- ACC- Aca- Aca- lanternを得た。
[0060] 以下、 Fmoc- Pro- Lys(Boc)- ACC- Aca- Aca- lanternに Fmoc- Ala- OHを用いて同様 の操作を 2回繰り返してペプチドを伸長させ、蛍光基 (ACC)に結合部（
Ala— Ala— Pro— Lys)が結合した Fmoc— Ala— Ala— Pro— Lys(Boc)—ACC— Aca— Aca— lantern を得た。
その後、 20%ピぺリジン ZDCM (1 ml)を用いて 30分撹拌して Fmoc基の除去を行つ た。その後、 DCM(1 ml)で 3回、 DMF (1 ml)洗浄を行った後、 DMF (1 mL)、 DIEA 32 ml (183 mmol)および無水酢酸 8.5 ml(90 mmol)を DMF (1 mL)に希釈して加え、 1時 間撹拌させた。その後、 DMF (1 ml)で 3回、 DCM (1 ml)で 3回 lanternを洗浄し、 25% TFAZDCMを用いて 30分反応させて Boc基の除去を行った。その後、 DCM(1 ml)で 3回、 H20 (1 ml)で 5回、 DCM(1 ml)で 3回洗浄し、減圧乾燥を行い、結合部（ Ala-Ala-Pro-Lys)の末端基がァセチル化された
Ac— Ala— Ala— Pro— Lys(Boc)— ACC— Aca— Aca— lanternを得た。
25%TFA/DCM(lml)を用いて Lys側鎖の Boc基を除去し、 目的とする実施例 2の酵素 活性検出用基板 (Ac-Ala-Ala-Pro-Lys-ACC-Aca-Aca-lantern)を得た。
[0061] <酵素活性の測定 >
実施例 2の酵素活性検出用基板に、 20 mM Tris HC1 buffer (pH 7.2, 100 mM NaCl, 50 mM CaC12)を 100 μ 1,メタノール 100 μ 1,トリプシン（1 mg/1 ml)を 50 μ 1 加え、反応前と反応後の蛍光値を測定した。蛍光値は、 WALLAC ARVOTM SX 1420マルチラベルカウンタ（パーキンエルマ一製）を用いて励起波長 370nm、蛍光 波長 460nmで測定した。
その結果、初期蛍光値は 39000、 18時間反応後の蛍光値は 145000であり、蛍光値 が約 4倍変化することが確認された。これにより、基板として lanternを用いた実施例 2 の酵素活性検出用基板においても、活性を有する酵素の検出が可能であることが示 された。
実施例 3
[0062] 実施例 3では、酵素活性検出用基板としてのぺプチジル蛍光基結合平面基板を合 成して酵素の活性測定を行った。以下、その方法について説明する。
<ぺプチジル蛍光基結合平面基板の合成 >
基板としては、ペプチド合成用多板状合成樹脂製担体 (ミモートブス社製ランタンシ リーズ (登録商標))を 1プレートだけ切り離して平面状とした合成樹脂製担体を用いた スクリュー管に基板としての合成樹脂製担体 lantern 1個（ミモートプス社 D-series, 導入率 18 mmol /個）を入れ、 20%ピぺリジン I DCM (1 mL)を用いて 30分撹拌し Fmoc基を切り出した。 DCM洗浄 (1 ml X 3)後、 DMF (1 ml X I)で lanternを膨潤させ DMF 1 mlに溶解させた Fmoc— Aca— OH 20.0 mg (56.6 mmol), DCC 17.5 mg (84.5 mmol), HOBt-H20 8.8 mg (57.5 mmol)をカ卩え 23時間撹拌した。 DMF (1 mi x 2), DCM (1 mi x 2), DCM I EtOH = 1:1 (1 mi x 2), EtOH (1 mi x 2), DCM (1 ml X I),ジ ェチルエーテル (1 ml X I)で榭脂を洗浄した後乾燥させ、 Fmoc- Aca- lanternを得た。
[0063] 次に、 20%ピぺリジン ZDCM (1 mL)を用いて 30分撹拌して Fmoc基を切り出し DCM 洗浄（1 mi x 3)した後、 DMF 1 mlに溶解させた Fmoc- Aca- OH 23.0mg (65.1mmol), HATU 21.6 mg (56.8 mmol), HOAt 8.1 mg (59.5 mmol), DIEA 15.7 ml (90.2 mmol) を加え 1時間撹拌させた。 DMF (1 mi x 3), DCM (1 mi x 3)で洗浄し基板 (lantern)に 結合部（Aca-Aca)の一端が固定化された Fmoc-Aca-Aca-lanternを得た。次!、で、 20%ピぺリジン ZDCM (1 mL)を用いて 30分撹拌して Fmoc基を除去し、 DCM洗浄 (1 ml X 3)を行って H- Aca- Aca- lanternを得た。
次いで、 DMF 1 mlに溶解させた Fmoc- Phe- ACC- OH (33.4 mg 56.7 mmol)、 DCC 12.5 mg (60.6 mmol), HOBt-H20 8.9 mg (58.0 mmol)をカ卩え 22時間撹拌した。 DMF (1 mi x 2), DCM (1 mi x 2), DCM I EtOH = 1:1 (1 mi x 2), EtOH (1 mi x 2), DCM (1 ml X I),ジェチルエーテル (1 ml X I)で洗浄後、乾燥させ結合部 (Aca-Aca)に蛍光 基（ACC)が結合した Fmoc- Phe- ACC- Aca- Aca- Lanternを得た。 [0064] 次に、 20%ピぺリジン ZDCM (1 mL)を用いて 30分撹拌して Fmoc基を除去し、 DCM 洗浄（1 mi x 3)した。次いで、 DMF 1 mlに溶解させた Fmoc- Pro- OH 24.7mg (73.2 mmol), HATU 21.4 mg (56.2 mmol), HOAt 8.2 mg (60.2 mmol), DIEA 15.7 ml (90.2 mmol)を加え 1時間撹拌させた後、 DMF (1 mi x 3), DCM (1 mi x 3)で洗浄し
Fmoc- Pro- Phe- ACし- Aca-Aca- lantern 得 7こ。
以下、これと同様の操作を行って Fmoc-Ala-OHを 2回導入し、蛍光基 (ACC)に結 合部（Ala- Ala- Pro- Phe)が結合した Fmoc- Ala- Ala- Pro- Phe- ACC- Aca-Aca- lantern を得た。
その後、 20%ピぺリジン ZDCM (1 mL)を用いて 30分撹拌して Fmoc基を除去し、 DCM洗浄 (1 mi x 3)後、 DMF (1 mL)、 DIEA 32 ml (183 mmol)および無水酢酸 8.5 ml(90 mmol)を加え、 1時間撹拌させた。その後、 DMF (1 mi x 3), DCM (1 mi x 3)で 洗浄を行 ヽ、結合部 (Ala-Ala-Pro- Phe)の末端基をァセチル化して、 目的とする実 施例 3の酵素活性検出用基板としてのぺプチジル蛍光基結合平面基板
Ac— Ala— Ala— Pro— Phe— ACC— Aca— Aca— lanternを得た。
[0065] <酵素活性の測定 >
蛍光測定用マイクロプレートのゥヱル A, Cに実施例 2の酵素活性検出用基板 (導 入率 2 /z molZ基板)を、ゥヱル B, Dに実施例 3の酵素活性検出用基板 (導入率 2 molZ基板）を入れ、各々に 20 mM Tris HC1 buffer (pH 7.2, 100 mM NaCl, 50 mM CaC12)を 100 μ \,メタノール 100 1をカ卩え、さらに以下の酵素 50 gをカ卩えて反応さ せた。
A：キモトリブシン
B :キモトリブシン
C :トリプシン
D :トリプシン
測定は、 WALLAC ARVOTM SX 1420マルチラベルカウンタ（パーキンエルマ一製 )を用いて励起波長 370nm、蛍光波長 460nmで、酵素を加える前の蛍光値と酵素 を加えてから 30分後の蛍光値とを測定し、その差を求めた。
各ゥ ルにおける算出された蛍光値の差を (表 2)に示す。 [0066] [表 2]
Figure imgf000036_0001
[0067] 表 2によれば、キモトリブシンに対しては、蛍光基と結合する結合部のアミノ酸が芳 香族アミノ酸の 1種のフエ二ルァラニンである実施例 3の酵素活性検出用基板で大き な蛍光値の変化が確認された。また、トリプシンに対しては、蛍光基と結合する結合 部のアミノ酸がリジンである実施例 2の酵素活性検出用基板で大きな蛍光値の変化 が確認された。これらの変化の差は、キモトリブシンは主に芳香族アミノ酸残基の C末 端側のペプチド結合を選択的に切断する特異性を有しており、トリプシンは主にリジ ンの C末端側のペプチド結合を選択的に切断する特異性を有していることから発現し たものであると推察される。これにより、蛍光基と結合する結合部のアミノ酸の種類を 変えることにより、酵素の種類に対する活性検出能を変えられることが明らかになった 実施例 4
[0068] 通常のペプチド合成用レジン lgに Aca 0.3 mmolを実施例 1のようにして導入し、こ れを 361個のグループに分けた。このそれぞれのレジンにペプチド合成装置を用い て ACCを導入し、ついでシスティンを除く 19種類のアミノ酸残基を 2回導入し、最後 に脱保護後ァセチル基でキヤッビングを行った。これにより 361種類のペプチドを榭 脂上で合成した。
各榭脂からペプチドを切り出し、 361種類の C端無保護ペプチドを得た。 ガラス基板上、あるいはイメージセンサ上の保護層（絶縁層）として構築された酸ィ匕 珪素層の（チップ基板）上にエッチングで流路幅 500 μ m、流路深さ 100 μ mの渦巻 き状の試料溶液流路を形成した。なお、試料供給部として深さ 100 m、縦横の長さ が 2. 5mm正方の凹部をエッチングで試料溶液流路の一端部に連設形成した。 この試料溶液流路内の全面をァミノ基でコ一ティングし、ここに上記の酵素活性検 知部としての 361種類のペプチドを縮合剤 (HATU)を用いて導入した。導入にはギ ルソン社製の自動スポッター（型式： 222XL)を用い、 1種類のペプチドは流路幅 50 0 μ mの中心の約 200 μ mの円内に導入し、約 100 μ mの間隔をあけて他の種類の ペプチドを次々に導入した。
このペプチドを導入した試料溶液流路の上面に、蓋 (保護層）をかねて蛍光励起光 を透過するフィルタ（350± 10nmより長い波長を遮断するもの）を圧着した。イメージ センサ基板に蛍光発光フィルタ (450 ± 10nmより短い波長を遮断するもの）を接着し 、さらにその上にチップ基板を配置して実施の形態 2で説明したものと同様のバイオ チップを製造した。
[0069] テスト用の試料として、トリプシンを中心とした酵素群 1と、キモトリブシンを中心とし た酵素群 2の溶液（20nM、 5mM HEPES pH7. 4)を準備した。これを上記のバ ィォチップ 2つにマイクロシリンジを用いてそれぞれ導入し、導入開始時点からのィメ ージセンサの出力を記録した。
イメージセンサの出力から各スポット (酵素活性検知部）の蛍光強度をそれぞれ 10 msec毎に算出し、それを元に各スポット毎の酵素活性 (蛍光強度)を計算した。
[0070] 図 8は各スポットを構成するアミノ酸ごとにその蛍光強度をプロットしたグラフである。
図 8にお 、て X軸及び y軸はそれぞれのアミノ酸の組み合わせ配列を示し、 z軸はこの アミノ酸の組み合わせに対応したそれぞれの蛍光強度を示している。
図 8から同一の酵素活性検知部の配列を有するバイオチップで出力された蛍光強 度のパターンが酵素群 1と酵素群 2では異なることが確認された。これにより、例えば 、人の体液を試料溶液として用い、その酵素活性を本発明のノィォチップを用いて 定期的にイメージデータとして検出することにより、体液中の酵素活性が変化して ヽ る力否かを網羅的にモニタリングすることができ、病理学的診断等を的確かつ迅速に 行うことができることが確認された。
産業上の利用可能性
[0071] 本発明のバイオチップは、病理、医療、創薬、食品、および環境等の分野で関連す る酵素やタンパク質、遺伝子を含む試料溶液の解析に適用して、その酵素活性など の特性データを網羅的に評価特定することができ、病理学的診断などの医学的分野 やプロテオーム解析等の研究に資することができる。

Claims

請求の範囲
[1] チップ基板に導入される試料溶液中の酵素を検出するバイオチップであって、全 体が渦巻き状やツリー状、放射状などの流路パターンで前記チップ基板上に形成さ れた試料溶液流路と、前記試料溶液流路に所定順で複数配置され所定の酵素に対 してそれぞれ異なる活性を有する酵素活性検知部と、を有することを特徴とするバイ ォチップ。
[2] 前記酵素活性検知部が、 (a)その基端側が前記チップ基板に結合されその他端側 に結合されるペプチド鎖との化学結合状態によってその蛍光周波数や蛍光強度など の蛍光特性が変動される蛍光基質と、 (b)アミノ酸の組み合わせ力 なる特定アミノ 酸配列のペプチド鎖により付与される酵素特異性の結合部を介して前記蛍光基質に 結合されるオリゴペプチドと、を備えたことを特徴とする請求項 1に記載のバイオチッ プ。
[3] 前記蛍光基質がアミノメチルクマリン系蛍光基質であって、シランカップリング剤な どでィ匕学修飾された前記チップ基板上に結合されていることを特徴とする請求項 1又 は 2に記載のバイオチップ。
[4] 前記チップ基板が透光性であって、その背面側に CCDや CMOS素子などを配列 したイメージセンサ基板が積層されていることを特徴とする請求項 1乃至 3の内いず れカ 1項に記載のバイオチップ。
[5] 前記チップ基板の前記試料溶液流路が形成された面側に透光性又は不透光性の 保護層を備えていることを特徴とする請求項 1乃至 4の内いずれか 1項に記載のバイ ォチップ。
[6] 請求項 1乃至 5の内いずれか 1項に記載のバイオチップの前記試料溶液流路に試 料溶液を所定条件で供給する試料溶液供給工程と、
前記試料溶液流路上に配列された前記酵素活性検知部毎の状態変化により形成 される前記チップ基板上の二次元イメージをその特定波長域を除去するフィルタで 処理してその時系列データ又は所定時間後の結果データを取得するデータ取得ェ 程と、
前記時系列データ又は結果データを予め同一測定条件で蓄積されたライブラリデ ータと比較してパターン認識手段や統計的データ処理手段により各ライブラリデータ とのパターン適合度を判定するデータ判定工程と、
を有することを特徴とする試料溶液の機能性検査方法。
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