WO2005063294A1

WO2005063294A1 - γ-セクレターゼ複合体形成阻害剤

Info

Publication number: WO2005063294A1
Application number: PCT/JP2004/019628
Authority: WO
Inventors: Yasuomi Urano; Takao Hamakubo; Tatsuhiko Kodama
Original assignee: Kowa Company, Ltd.; Nissan Chemical Industries, Ltd.
Priority date: 2003-12-30
Filing date: 2004-12-28
Publication date: 2005-07-14
Also published as: JPWO2005063294A1; ATE535614T1; WO2005063294A8; EP1702626A1; EP1702626B1; EP1702626A4

Abstract

　本発明は、コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤を有効成分とするγ−セクレターゼ複合体形成阻害剤、及びそれを製造するためのコレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤の使用を提供する。また、本発明は、コレステロールの合成阻害活性を測定すること、又は細胞の脂質ラフトにおけるコレステロールの蓄積量を測定することからなるγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有する物質をスクリーニングする方法に関する。また、本発明は、γ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を測定することからなるコレステロール合成阻害剤、蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤、又はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤をスクリーニングする方法に関する。さらに、本発明は、細胞内におけるγ−セクレターゼが、その活性複合体を形成するに必要とされるニカストリン（nicastrin）、ＡＰＨ−１、Ｐｅｎ−２などの構成成分の細胞内における分布を測定することにより、被検物質のγ−セクレターゼに対する作用をスクリーニングする方法に関する。

Description

7ーセクレターゼ複合体形成阻害剤

技術分野

[0001] 本発明は、コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラ-ルイ匕抑制剤を有効成分とする γ -セクレターゼ複合体形成阻害剤又は γ -セクレターゼの活性複合体の脂質ラフト分布低下剤、及びコレステロールの合成阻害活性を測定すること、又は細胞の脂質ラフトにおけるコレステロールの蓄積量を測定することからなる Ίーセクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有する物質をスクリーニングする方法又は γ—セクレターゼの脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を有する物質をスクリーニングする方法に関する。また、本発明は、 γ—セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を測定することからなるコレステロール合成阻害剤、蛋白ゲラ- ルゲラ-ルイ匕抑制剤、又は HMG— CoA還元酵素阻害剤をスクリーニングする方法に関する。さらに、本発明は、コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラ -ルゲラ- ルイ匕抑制剤を用いて、 yーセクレターゼの活性複合体の形成を阻害する方法又は γ ーセクレターゼの活性複合体の脂質ラフトにおける分布を低下させる方法に関する。また、本発明は、 γ—セクレターゼ複合体形成阻害剤又は γ—セクレターゼの活性複合体の脂質ラフト分布低下剤を製造するためのコレステロール合成阻害剤，又は蛋白ゲラ-ルゲラ二ルイ匕抑制剤の使用に関する。また、本発明は、細胞内における γ— セクレターゼ力その活性複合体を形成するに必要とされる-カストリン (nicastrin)、

APH— 1、 Pen— 2などの構成成分の細胞内における分布を測定することにより、被検物質の γ—セクレターゼに対する作用をスクリーニングする方法に関する。

背景技術

[0002] 老人性痴呆症の代表的疾患であるアルツハイマー病 (AD)は、脳の萎縮、老人斑の沈着および神経原線維の形成を特徴とする変性疾患で、神経細胞の脱落が痴呆症状を引き起こすと考えられている (N Engl J Med 2003;348:1356)_o ADでは、 1回膜貫通蛋白であるアミロイド前駆体タンパク質 (APP)が、細胞膜に存在する α—セクレターゼよりも脂質ラフト (lipid rafts：スフインゴ脂質とコレステロールが集積した細胞膜のミクロドメイン） (J Clin Invest. 2002;110:597-603)に存在する j8—セクレターゼで細胞外部分が切断され、更に Ίーセクレターゼによって膜貫通部が切断されて A β 40、 A |8 42ペプチドを生じ、これらのペプチドとりわけ凝集性の強い A |8 42が脳に沈着して神経細胞が脱落し脳の萎縮が生じる。 γ—セクレターゼは、単一の膜貫通蛋白である 13ーセクレターゼと異なり、活性サブユニットであるプレセ二リン (presenilin)が-力ストリン（nicastrin)、 APH- 1、 Pen-2と γ—セクレターゼ複合体を形成して作用し (生体の科学 2003;291-296)、脂質ラフトが、 A j8 40、 A j8 42産生の場になると考えられている。セクレターゼの活性はコレステロールレベルの影響を受け、コレステロールレベルの増加は OLーセクレターゼ活性を低下させ、 βーセクレターゼ活性を上昇させるが、 y—セクレターゼの活性には大きな影響を受けな、とされて、る (Biochem Soc Transact 2002 ;30:525- 529)。コレステロール包接剤（J Lipid Res. 1999;40:781-96) による脂質ラフトからのコレステロールの除去では γ—セクレターゼ活性が消失したという報告 (Neurobiol Dis. 2002;9:11-23)と影響がなかったという報告 (Biochemistry 2003;42:13977- 86)がある。

コレステロールの生合成過程は、 HMG— CoA合成酵素によりァセチルー CoAから生成された 3—ヒドロキシー 3—メチルーグルタリルー CoA (HMG— CoA)力 HMG— Co A還元酵素により還元されて、メバロン酸を生成する過程から始まる。生成されたメバロン酸は、活性イソプレン単位と呼ばれるイソペンテ-ルピロリン酸とされ、ゲラニルビ口リン酸を経て、フアルネシルピロリン酸合成酵素によりフアルネシルピロリン酸とされる。そして、スクアレン合成酵素によりスクアレンとされ、スクアレンエポキシダーゼにより 2, 3—エポキシスクアレンとされる。そして、ラノステロール合成酵素によりラノステロールとされてコレステロールの母体構造が形成された後、各種の修飾反応を経てコレステロールが生成される。

フアルネシルピロリン酸合成酵素により生成されたフアルネシルピロリン酸の一部は、イソペンテニルピロリン酸と反応してゲラニルゲラニルピロリン酸となり、ゲラニルゲラ -ル転移酵素により Rhoや Racなどのタンパク質のゲラニルゲラ-ルイ匕が行われる。また、 AMPKは HMG— CoA還元酵素をリン酸化して失活させるので AMPK活性ィ匕剤は HMG— CoA還元酵素阻害剤と類似の作用を有している。さら〖こ、 AMPKはァセチル CoAカルボキシラーゼをリン酸ィ匕して失活させる作用も持ち脂肪酸合成も抑制する。また、フイブラートは AMPK活性ィ匕作用を介して HMG— CoA還元酵素抑制作用をもつことが知られている。

[0004] HMG- CoA還元酵素阻害剤は、コレステロール生合成の律速段階、 HMG-CoAのメバロン酸への転換を触媒する酵素である HMG-CoA還元酵素を拮抗阻害する薬剤であり、高コレステロール血症治療剤として知られている。 HMG- CoA還元酵素阻害剤を服用して、る患者は AD罹患率が低、と、うレトロスぺクティブな疫学結果が報告され (Arch Neurol 2000;57: 1439-1433)、又、 HMG- CoA還元酵素阻害剤は in vitro, in vivoにおける A j8ペプチドの生成を低下させたとの結果から、 HMG-CoA還元酵素阻害剤が AD治療に有用とする特許が出願されている (WO 02/062824号、 WO 01/096311号、 WO 01/32161号、 WO 00/28981号、 WO 99/48488号、 USP 6,472,421号、 USP 6,440,387号、 USP 6,080,778号）。これらの特許明細書では、 HMG-CoA還元酵素阻害剤が APPのプロセシング即ちセクレターゼ活性の調節を介して A βペプチドの産生を低下させた可能性が述べられて!/、るが、 γ—セクレターゼ活性の低下を論じたものは無、。

[0005] y -セクレターゼ阻害剤は、本酵素が A β 42を産生する酵素であること、活性サブュニットであるプレセ二リンの遺伝子変異が AD病の原因となることなど力 (Arch Neurol. 2003;60: 1541-4), AD病治療薬として、現在、盛んに検討が行われている (Adv Drug Deliv Rev. 2002;54: 1579-88)。しかし、 γ -セクレターゼは APPの他、 Notch, ErbB4、 CD44、 LRPなどを切断し、活性の強いものは副作用を発現する為（ FASEB J 2003; 17:79-81)、 γ -セクレターゼ阻害剤の開発は必ずしもうまく進んでいない。既存の薬物では、 γ -セクレターゼ阻害作用を持つ、一部の非ステロイド性抗炎症剤が Α |8 42の産生を特異的に阻害し、 Notchの切断を阻害しないことが報告されている 0 Biol Chem 2003;278:30748-30754, 18664-18670)。その機序については Rho抑制の関与が示唆されて!、る (Science 2003； 302： 1215-1217)。

発明の開示

[0006] 本発明者らは、 Α β ΑΟ, Α β 42産生の場と考えられて、る神経細胞の脂質ラフトにおける γ—セクレターゼ複合体の存在量を蔗糖密度勾配法により検討した結果，コレステロールを除去し脂質ラフトの構造を破壊してしまうメチル βシクロデキストリンのようなコレステロール包接剤だけでなぐ驚くべきことに、脂質ラフトのコレステロールを低下させるコレステロール合成阻害剤力脂質ラフトのコレステロール残量に依存して脂質ラフトの _Ίーセクレターゼ複合体の存在量を低下させ、その活性を低下させることを見出し、本発明を完成した。従って、本発明は脂質ラフトへの γ—セクレターゼ複合体の分布量を低下させる新し、タイプの γ—セクレターゼ活性抑制剤及びそのスクリーニング方法を提供するものである。

また、本発明者らは、培養細胞に被検物質を添加して、細胞内における γ—セクレターゼが、その活性複合体を形成するに必要とされる-カストリン (nicastrin)、 APH-1 、 Pen-2などの成分の細胞内における分布を測定することにより、被検物質の γ—セクレターゼに対する作用をスクリーニングできることを見出した。

本発明は、第一に、コレステロールの合成阻害活性を測定することからなる、 γ -セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有する物質をスクリーニングする方法、より詳細には、脂質ラフトに蓄積され得るコレステロールの合成阻害活性を測定することからなる、 yーセクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供するものである。

本発明は、第二に、コレステロールの合成阻害活性を測定することからなる、 γ -セクレターゼの活性複合体の脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を有する物質をスクリーニングする方法、より詳細には、脂質ラフトに蓄積され得るコレステロールの合成阻害活性を測定することからなる、 y -セクレターゼのの脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供するものである。本発明は、第三に、被検物質の存在下に、細胞を培養し、細胞の脂質ラフトにおけるコレステロールの蓄積量を測定することからなる _Ίーセクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供するものである。本発明は、第四に、被検物質の存在下に、細胞を培養し、細胞の脂質ラフトにおけるコレステロールの蓄積量を測定することからなる、 _Ύ -セクレターゼの脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供するものである。 [0008] 本発明は、第五に、 γ—セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を測定することからなるコレステロール合成阻害剤、蛋白ゲラ-ルゲラ二ルイ匕抑制剤、又は HMG— CoA還元酵素阻害剤をスクリーニングする方法、より詳細には脂質ラフトにおける γ—セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を測定することからなるコレステロール合成阻害剤、蛋白ゲラ-ルゲラ二ルイ匕抑制剤、又は HMG— CoA還元酵素阻害剤をスクリーニングする方法を提供するものである。

本発明は、第六に、 γ—セクレターゼの脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を測定することからなるコレステロール合成阻害剤、蛋白ゲラ-ルゲラ二ルイ匕抑制剤、又は HMG— CoA還元酵素阻害剤をスクリーニングする方法、より詳細には脂質ラフトにおける γ—セクレターゼの分布を低下させる作用を測定することからなるコレステロール合成阻害剤、蛋白ゲラニルゲラ-ルイ匕抑制剤、又は HMG— CoA還元酵素阻害剤をスクリーニングする方法を提供するものである。

[0009] 本発明は、第七に、コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラ-ルゲラ二ルイ匕抑制剤を有効成分とする γ -セクレターゼ複合体形成阻害剤を提供するものである。本発明は、第八に、コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラ-ルゲラ二ルイ匕抑制剤を有効成分とする γ—セクレターゼの活性複合体の脂質ラフト分布低下剤を提供するものである。

本発明は、第九に、コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラ-ルゲラ二ルイ匕抑制剤を用いて、 yーセクレターゼの活性複合体の形成を阻害する方法を提供するものである。

本発明は、第十に、コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラ-ルゲラ二ルイ匕抑制剤を用いて、 yーセクレターゼの活性複合体の脂質ラフトにおける分布を低下させる方法を提供するものである。

本発明は、第十一に、 γ—セクレターゼ複合体形成阻害剤を製造するためのコレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラ-ルゲラ二ルイ匕抑制剤の使用を提供するものである。

本発明は、第十二に、 γ—セクレターゼの活性複合体の脂質ラフト分布低下剤を製造するためのコレステロール合成阻害剤，又は蛋白ゲラニルゲラ-ルイ匕抑制剤の使用を提供するものである。

さらに、本発明は、培養細胞に被検物質を添加して、細胞内における γ—セクレターゼが、その活性複合体を形成するに必要とされる-カストリン (nicastrin)、 ΑΡΗ-1、 Pen-2などの構成成分の細胞内における分布を測定することにより、被検物質の γ— セクレターゼに対する作用をスクリーニングする方法に関する。

図面の簡単な説明

[0010] [図 1]メチル βシクロデキストリン処理後の細胞膜分画のィムノブ口ティングを示す。図 1の Αは二カストリンについてのものであり、 Bは PS1CTFについてのものであり、 Cは PS2CTFについてのものであり、 Dは PEN— 2についてのものであり、 Eはフロチリン —1についてのものである。各々のブロッテイングの図は、上からメチル j8シクロデキストリンの濃度が OmM、 lmM、及び 2mMのものである。図中の 1一 10は、蔗糖密度勾配遠心法によるフラクションの番号を示す。

[0011] [図 2]メチル βシクロデキストリンによる細胞膜分画のコレステロール及びタンパク質含量の変化を示したグラフである。四角印（口及び國）はメチル βシクロデキストリンの濃度が OmMの場合を示し、三角印（△及び▲)は ImMの場合を示し、丸印（〇及び參）は 2mMの場合をそれぞれ示す。白抜きの印はコレステロールの量を示し、黒抜きの印はタンパク質の量を示す。グラフの横軸はフラクションの番号を示し、左側の縦軸はコレステロールの量（ μ g/mL)を示し、右側の縦軸はタンパク質の量（mgZmL )を示す。

[0012] [図 3]HMG-CoA還元酵素阻害剤処理後の細胞膜分画のィムノブ口ティングを示す。

図 3の Aは二カストリンについてのものであり、 Bは PS1CTFについてのものであり、 C は PS2CTFについてのものであり、 Dはフロチリンー1についてのものである。各々のブロッテイングの図は、上からコントロール、コンパクチン 50 M添カ卩の場合、ピタバスタチン 5 μ Μ添加の場合をそれぞれ示す。

[0013] [図 4]HMG-CoA還元酵素阻害剤による細胞膜分画のコレステロール及びタンパク質含量の変化を示したグラフである。四角印（口及び國）はコントロールとしてのメバロン酸 250 μ Μの場合を示し、丸印（〇及び參）はコンパクチン (メバロン酸 250 μ Μ及びコンパクチン 50 μ Μ)の場合を示し、三角印（△及び▲)はピタパスタチン (メバロン酸 250 μ Μ及びピタパスタチン 5 μ Μ)の場合をそれぞれ示す。白抜きの印はコレステロールの量を示し、黒抜きの印はタンパク質の量を示す。グラフの横軸はフラクションの番号を示し、左側の縦軸はコレステロールの量 g/mL)を示し、右側の縦軸はタンパク質の量 (mgZmL)を示す。

発明の詳細な説明

[0014] 本発明者らは、後述する実施例において示されるように、細胞に HMG-CoA還元酵素阻害剤を添加することにより、脂質ラフトにおけるコレステロール含有量の顕著な減少が見られるだけでなく（図 3参照）、メチル βシクロデキストリンを添加した場合と同様な γ—セクレターゼ活性複合体の構成成分である-カストリン、プレセ-リン 1及びプレセ-リン 2が脂質ラフト分画 (フラクション 3)から消失する（図 3Α、 Β及び C参照）ことを見出した。 HMG— CoA還元酵素阻害剤の場合には、フロティリンは脂質ラフト分画に未だ残っており脂質ラフト構造は保たれてヽた。

このことは、脂質ラフトのコレステロールを低下させるコレステロール合成阻害剤力脂質ラフトのコレステロール残量に依存して脂質ラフトの Ίーセクレターゼ活性複合体の存在量を低下させ、その活性を低下させることを明らかにしたものである。また、 A j8の産生を抑制する NSAIDsが Rho抑制を介して働くと報じられていること（Science 2003 ;302 : 1215-1217)、この実験で使用した HMG— CoA還元酵素阻害剤がコレステロールの合成阻害だけでなくタンパク質のゲラニルゲラ-ルイ匕をも阻害する活性を有して、ることから、 HMG-CoA還元酵素阻害剤が Rhoのゲラ-ルゲラ二ルイ匕抑制剤として機能して、ることを包含するものである。

また、本発明者らは、蔗糖密度勾配法などにより細胞の構成要素をフラクションィ匕することにより、 γ—セクレターゼ活性複合体の構成成分である-カストリン、プレセ- リン 1 (PS1)及びプレセ二リン 2 (PS2)などの細胞内での分布を解析できることを確立し、このような構成成分の分布を測定することにより、 γ—セクレターゼの活性に対して影響を与える物質をスクリーニングできることを明らかにした。

[0015] 本発明において、コレステロール合成阻害剤とは、生体内のコレステロールの合成を阻害することができる薬剤であり、生体内におけるコレステロールの生合成経路のいずれか 1つの段階又は 2以上の段階を阻害することができるものであればよい。本発明のコレステロール合成阻害剤としては、例えば、 HMG-CoA合成酵素阻害剤 (Proc Natl Acad Sci USA.1987;84:7488-92), HMG- CoA還元酵素阻害剤、スクァレンシンターゼ阻害剤、スクアレンエポキシダーゼ阻害剤、ラノステロール合成酵素阻害剤、フイブラート等の AMPK活性化剤 (Biochemical Society

Transactions.l997;25:S676),及びビスホスホネート等のフアルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤（Biochem Biophys Res Commun 1999;264:108-111)などが挙げられる。好まし、コレステロール合成阻害剤としては、 HMG-CoA還元酵素阻害剤が挙げられる。

また、本発明の蛋白ゲラニルゲラ-ルイ匕抑制剤としては、生体内のゲラ -ルゲラ- ルイ匕タンパク質の生成を阻害又は抑制することができる薬剤であればよぐ生体内におけるゲラニルゲラ-ルイ匕タンパク質の生合成経路のいずれか 1の段階又は 2以上の段階を阻害又は抑制することができるものであればよい。本発明の蛋白ゲラニルゲラニルイ匕抑制剤としては、例えば、 HMG-CoA合成酵素阻害剤、 HMG-CoA還元酵素阻害剤、フイブラート等の AMPK活性化剤、ビスホスホネート等のフアルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤、ゲラ -ルゲラニル転移酵素阻害剤などが挙げられる。本発明の好ましい蛋白ゲラニルゲラ-ルイ匕抑制剤としては、 HMG-CoA還元酵素阻害剤、ゲラ -ルゲラニル転移酵素阻害剤などが挙げられる。

したがって、本発明のコレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラ-ルゲラ二ルイ匕抑制剤としては、 HMG-CoA合成酵素阻害剤、 HMG-CoA還元酵素阻害剤、スクアレン合成酵素阻害剤、スクアレンエポキシダーゼ阻害剤、ラノステロール合成酵素阻害剤、 AMPK活性化剤、、フアルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤及びゲラニルゲラ-ル転移酵素阻害剤からなる群力選ばれた 1種又は 2種以上の薬剤を使用することができる。生体内におけるコレステロールの生合成経路とゲラ -ルゲラニルピロリン酸の生合成経路は、フアルネシルピロリン酸の合成経路までは同じであることから、フアルネシァピロリン酸の生合成までの経路における酵素活性阻害剤の使用が好ましい。例えば、本発明の好ましいコレステロール合成阻害剤又は蛋白ゲラニルゲラ-ルイ匕抑制剤としては、 HMG-CoA還元酵素阻害剤が挙げられる。より好ましい薬剤としてはスタチン類が挙げられる。これらの薬剤は、製剤学的に必要であれば、塩や溶媒和物として使用することもできる。

本発明における好ま、HMG-CoA還元酵素阻害剤としては、例えば、

ロノスタチン（ィ匕学名：（ + ) (IS, 3R, 7S, 8S, 8aR)-l, 2, 3, 7, 8, 8a—へキサヒドロ一 3, 7—ジメチルー 8— [2— [ (2R, 4R)—テトラヒドロー 4—ヒドロキシ一 6 ォキソ 2H—ピラン 2—ィル]ェチル ]ー1 ナフチル (S) 2—メチルプチレート（米国特許第 4, 231, 938号参照））；

シンパスタチン（ィ匕学名：（ + ) (IS, 3R, 7S, 8S, 8aR)-l, 2, 3, 7, 8, 8a—へキサヒドロ一 3, 7 ジメチルー 8— [2— [ (2R, 4R)—テトラヒドロー 4ーヒドロキシー 6 ォキソ 2H—ピラン 2—ィル]ェチル ]ー1 ナフチル 2, 2—ジメチルブタノエート（米国特許第 4, 444, 784号参照））；

プラバスタチン（ィ匕学名：（ + ) (3R, 5R)-3, 5—ジヒドロキシー 7— [ (IS, 2S, 6S, 8S, 8aR)— 6—ヒドロキシー 2—メチルー 8— [ (S)— 2—メチルブチリルォキシ ]—1, 2, 6, 7, 8, 8a—へキサヒドロー 1 ナフチル]ヘプタン酸（米国特許第 4, 346, 227号参照） ) ;

フルパスタチン（ィ匕学名：（3RS, 5SR, 6E)— 7— [3— (4 フルオロフェ-ル）— 1— (1 ーメチルェチル)—1H インドールー 2 ィル]—3, 5—ジヒドロキシー 6 ヘプテン酸（米国特許第 5, 354, 772号参照)）；

アトルバスタチン（ィ匕学名： (3R, 5R)— 7— [2— (4 フルオロフェ-ル )—5 イソプロピル 3—フエ-ルー 4 フエ-ルカルバモイルー 1H—ピロルー 1 ィル]—3 , 5—ジヒドロキシヘプタン酸 (米国特許第 5, 273, 995号参照)）；

セリバスタチン（ィ匕学名： (3R, 5S)—エリスロー (E)—7—[4—(4—フルオロフヱ-ル) 2, 6—ジイソプロピル 5—メトキシメチルーピリジン— 3 ィル]—3, 5—ジヒドロキシー 6— ヘプテン酸 (米国特許第 5, 177, 080号参照)）；

メパスタチン（ィ匕学名：（ + ) (IS, 3R, 7S, 8S, 8aR)-l, 2, 3, 7, 8, 8a—へキサヒドロ一 7—メチルー 8— [2— [ (2R, 4R)—テトラヒドロー 4ーヒドロキシー 6 ォキソ 2H— ピラン 2 ィル]ェチル] 1 ナフチル（S)— 2 メチルプチレート (米国特許第 3, 9 83, 140号参照）)；

ロスパスタチン（ィ匕学名： 7— [4— (4—フルオロフェ-ル）一6 イソプロピル 2— (N—メチルー N メタンスルホ -ルァミノピリミジン)一 5—ィル]一（3R, 5S)ージヒドロキシー (E) - 6 ヘプテン酸 (米国特許第 5, 260, 440号、日本国特許第 2, 648, 897号参照））ピタパスタチン（（3R, 5S, 6E)— 7— [2—シクロプロピル 4— (4—フルオロフェ -ル） —3 キノリル]— 3, 5—ジヒドロキシー 6 ヘプテン酸（米国特許第 5, 856, 336号、日本国特許第 2, 569, 746号参照)）；

又はそれらの塩などが挙げられる。より好ましくは、ピタパスタチン、口パスタチン、シンノスタチンなどが挙げられ、さらに好ましくは、ピタパスタチンが挙げられる。

[0017] 本発明における好ましいコレステロール合成阻害剤としては、 HMG- CoA還元酵素阻害剤が挙げられ、当該 HMG-CoA還元酵素阻害剤としては、口パスタチン、ブラバスタチン、シンパスタチン、フノレパスタチン、セリバスタチン、アトルバスタチン、ピタノくスタチン又はロスパスタチン、及びそれぞれの場合においてその薬学的に許容される塩力もなる群力選ばれる化合物が挙げられる。さらに好ましい HMG-CoA還元酵素阻害剤としては、ピタノスタチン又はその塩若しくはその溶媒和物が挙げられる。

[0018] 本発明は、 γ—セクレターゼの活性を抑制すること、より詳細には脂質ラフトにおける活性を抑制することを、その目的のひとつとするものである。したがって、本発明の γーセクレターゼの活性抑制剤としては、 γ—セクレターゼの複合体の形成を阻害することからなる γ—セクレターゼ複合体形成阻害剤、又は γ—セクレターゼ又はその活性複合体の脂質ラフトにおける分布を低下させるための Ίーセクレターゼの活性複合体の脂質ラフト分布低下剤の、ずれのものであってもよ、。

本発明の γ—セクレターゼ複合体形成阻害剤、又は γ—セクレターゼの活性複合体の脂質ラフト分布低下剤は、有効成分としてのコレステロール合成阻害剤及び Ζ 又は蛋白ゲラニルゲラ二ルイ匕抑制剤、並びに製薬上許容される担体を含有することができ、これらの成分を含有してなる医薬組成物として使用することもできる。

また、本発明は、 γ—セクレターゼの活性を抑制することが必要とされる患者に、本発明のコレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラ-ルゲラ二ルイ匕抑制剤の有効量を投与することからなる γ—セクレターゼの活性ィ匕に伴う疾患を治療又は予防する方法を提供するものである。本発明の γ—セクレターゼの活性を抑制することが必要とされる患者としては、 γ—セクレターゼの活性複合体の形成による Α β 40、Α β 42ペプチド、特に A |8 42の産生を抑制し、これらのペプチドの沈着に起因する各種の疾患、例えば、アルツハイマー病（AD)などが挙げられる。

[0019] 本発明のコレステロール合成阻害剤及び Z又は蛋白ゲラ-ルゲラ二ルイ匕抑制剤、又はこれらを含有してなる本発明の医薬組成物の投与経路としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は静脈内注射剤、筋肉内注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等による非経口投与が挙げられる。

[0020] またこのような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、この有効成分を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を 1種又はそれ以上と適宜組み合わせて用いることができる。

[0021] 特に、 HMG-CoA還元酵素阻害剤は、これらの投与経路のうち、経口投与が好ましい。経口投与用製剤の調製にあたっては、有効成分の安定性を考慮して pHを調整（特開平 2— 6406号、日本国特許第 2, 774, 037号、 WO97Z23200号等参照）するのが好ましい。

[0022] これらの医薬の投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状等によって異なるが、通常成人の場合、有効成分を一般式（1)で表される化合物として、一日 0. 01— 1000 mg、特に 0. 1— lOOmgを、 1回又は数回に分けて経口投与又は非経口投与するのが好ましい。

[0023] 本発明の γ—セクレターゼ複合体形成阻害剤又は γ—セクレターゼの活性複合体の脂質ラフト分布低下剤は、脂質ラフトにおける γ—セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する又は Ίーセクレターゼ若しくはその活性複合体の脂質ラフトにおける分布を低下させることにより、 γ—セクレターゼの実質的な活性を抑制し、 Α |8 40、 Α |8 42 ペプチド、特に A |8 42の産生を抑制し、これらのペプチドの沈着に起因する各種の疾患、例えば、アルツハイマー病 (AD)などの予防や治療に有用である。

[0024] 本発明の γ—セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する方法又は γ—セクレターゼ若しくはその活性複合体の細胞内における分布を変化させる方法としては、培養細胞や生体系などの被処理系に本発明のコレステロール合成阻害剤，及び Z又は蛋白ゲラニルゲラ-ルイ匕抑制剤を添加することによることにより行うことができる。本発明のこの方法は、特に脂質ラフト上における γ—セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する方法又は Ίーセクレターゼ若しくはその活性複合体の脂質ラフトにおける分布を低下させる方法を提供するものである。

[0025] 本発明のコレステロールの合成阻害活性を測定する方法としては、コレステロールの合成量を測定できる方法であればよぐ特に細胞中の脂質ラフトにおけるコレステロールの蓄積量を測定できる方法が好ましい。より具体的には、標識化又は非標識化されたコレステロール合成源を含有する培地中で、スクリーニング物質の存在下又は非存在下で細胞を培養し、所定時間後における細胞中、特に脂質ラフト中におけるコレステロールの含有量を測定することにより行うことができる。標識化としては、生合成に影響を与えず、測定可能なものであれば特に制限はないが、通常は同位体による標識ィ匕が好ましい。このようにして、コントロールとの比較により、スクリーニング物質がコレステロール合成阻害活性を有するカゝ否かを決定することができる。そして、本発明によれば、このようにしてスクリーニング物質のコレステロール合成阻害活性を測定することにより、当該スクリーニング物質が γ—セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有するか否かをスクリーニングすることができる。

[0026] また、本発明は、被検物質の存在下に、細胞を培養し、細胞の脂質ラフトにおけるコレステロールの蓄積量を測定することからなる _Ίーセクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有する物質、又は Ίーセクレターゼの脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供するものである。この方法におけるコレステロールの蓄積量の測定法としては、標識ィ匕又は非標識ィ匕されたコレステロール合成源を含有する培地中で、スクリーニング物質 (被検物質)の存在下又は非存在下で細胞を培養し、細胞中、特に脂質ラフト中におけるコレステロ一ルの含有量を測定することにより行うことができる。このようにして、コントロールとの比較により、スクリーニング物質が γ—セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有する物質である力、又は γ—セクレターゼの脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を有する物質であるかを判定することができる。 [0027] また、本発明の γ—セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を測定する方法、又は γ—セクレターゼの脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を測定する方法としては、例えば、スクリーニング物質の存在下、及び非存在下に細胞を培養し、培養された細胞の脂質ラフトを分離し、その中に含まれる γ—セクレターゼの構成成分を測定する方法が挙げられる。脂質ラフトを分離する具体的方法としては、細胞膜分画を界面活性剤で処理する方法、蔗糖密度勾配法により分画する方法及びそれらの組み合わせが挙げられる。 γ—セクレターゼの構成成分を測定する具体的方法としてはプレセ-リン、二カストリン、 APH-1又は Pen-2を免疫学的に測定する方法が挙げられる。

この方法により、スクリーニング物質力コレステロール合成阻害剤、蛋白ゲラニルゲラ-ルイ匕抑制剤、又は HMG— CoA還元酵素阻害剤としての作用を有して、るか否かを判定することができる。

本発明のこれらにスクリーニング方法において使用される細胞としては、脂質ラフトが存在し、培養が容易なものであれば特に制限はないが、例えば、 SH- SY5Y細胞（ Invitrogen)などが好まし！/、。

[0028] 本発明の細胞の成分をフラクションィ匕する方法としては、細胞をプロテアーゼなどを用いて消化して可溶ィ匕し、これを蔗糖 (スクロース）、塩ィ匕セシウム、トリフルォロ酢酸セシウムなどを用いた密度勾配法などによりフラクションィ匕することができる。このようなマクロドメインの生化学的分画法として，細胞を界面活性剤中でホモジネートとし，蔗糖密度勾配遠心法で界面活性剤不溶性画分を得る方法が知られてヽるが、これに限定されるものではない。

脂質ラフトはプロテアーゼなどの消化によっては破壊されないので、脂質ラフトを特定のフラクションとして同定することが可能となり、脂質ラフトのフラクションと他のフラクシヨンにおける γ—セクレターゼ活性複合体の構成成分の検出、定量ィ匕をィムノブロッテイング法などにより行うことができる。この場合に、脂質ラフトを同定するためのマーカーとして、フロチリン (flotillin)を用いることができる力これに限定されるものではない。

本発明のこの方法により γ—セクレターゼ活性複合体の各構成成分の細胞内での、より正確には細胞膜における分布を測定することが可能となる。この分布により γ— セクレターゼ活性複合体の形成を検出、定量化することも可能となり、当該細胞における γ—セクレターゼの活性を測定することができる。

したがって、培養細胞に被検物質を添加して、被検物質を添加しない場合をコントロールとして、当該培養細胞における γ—セクレターゼ活性複合体の構成成分の分布を前記した本発明の方法で測定することにより、被検物質の γ—セクレターゼに対する作用、例えば、活性促進作用や活性阻害作用をスクリーニングすることができ、本発明は γ—セクレターゼの活性をスクリーニングする新規な方法を提供する。

Ύーセクレターゼ活性複合体を形成するに必要とされる構成成分としては、二カストリン（nicastrin)、 ΑΡΗ— 1、 Pen— 2、及び γ—セクレターゼの活性サブユニットであるプレセ-リン（presenilin)からなる群、好ましくは -カストリン（nicastrin)、 APH— 1、及び Pen-2からなる群力も選ばれる 1種又は 2種以上を採用することができる。

[0029] 実施例

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではな、。

[0030] 参考例 1 :細胞の培養

SH-SY5Y細胞（Invitrogen)は、完全培地（10%ゥシ胎児血清（Sigma)、 100 units/mL ペニシリンおよび 100 mg/mLストレプトマイシンを含む DMEM (Sigma) )で 37°Cで 15 cm径ディッシュに継代培養した。

[0031] 参考例 2：界面活性剤不溶性膜ドメイン（detergent insoluble membrane domain (raft) )の調製

SH-SY5Y細胞を 15 cm径のディッシュに培養し、コンフレントになったものについて PBSで洗浄した。さらにセルスクレイパーを用いて PBS中に細胞を回収し、 9807 m/s2 で、 5分間遠心した。沈殿した細胞を 200 Lの 2% CHAPSOとプロテアーゼ混合物（ Complete protease mixture ) (Roche)を含むノッファー R (buffer R) (20 mM Tris-HCl pH 7.6、 150 mM NaCl、 ImM EDTA)に懸濁した。氷上に 20分間静置することで可溶ィ匕を行った。可溶化後、 800 Lの 56.25%蔗糖を含むバッファー R (buffer R) を加え、終濃度が 45%蔗糖、 0.4% CHAPSOとなるように希釈し、遠心用チューブの底に添加した。さらにその上に 3mLの 35%蔗糖を含むバッファー R (buffer R)を重ね、続けて 1 mLの 5%蔗糖を含むバッファー R (buffer R)を重ねた。ベックマン超遠心器により SW55ローターで 980700 m/s2 (32.000 rpm)で、 4°Cで 16時間遠心後、上部より 500 μ Lずつ分取した。

[0032] 参考例 3： SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動とィムノブ口ティング

前記の参考例 2で分取した各画分について SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ィムノブ口ティングを行った。二カストリンを認識する抗体として-カストリン（N-19) (santa cruz)、プレセ-リン 1の C端側を認識する抗体として抗 G1L3 (anti-GlL3)、プレセ-リン 2の C端側を認識する抗体として抗 G2L (antト G2L)、 PEN-2を認識する抗体として抗 PNT(anti-PNT3)、フロティリン- 1を認識する抗体としてフロテリン 1 ( Flotillin-1) (BD sciences),カルネキシンを認識する抗体としてカルネキシン（BD biosciences) 用ヽ 7こ。

室温で 1時間、または 4°Cで終夜反応させた後、 TBS-tween (20 mM Tris-buffered saline, pH7.4, 0.05% Tween 20)で 2回洗浄を行った。つぎに HRP結合型抗マウス IgG 抗体、または抗ャギ IgG抗体、または抗ゥサギ IgG抗体で 1時間反応させ、 TBS-tween で洗净した。さらにスーパーシグナルウェストドラ（Supersignal west dura) (pierce)で化学発光させ、 X線フィルムに感光させた。

実施例 1

[0033] メチル j8シクロデキストリンによる処理（図 1、図 2参照）

SH-SY5Y細胞を 15 cm径のディッシュに培養し、コンフレントになったものについて PBSで洗浄後、メチル j8シクロデキストリン (sigma)を最終濃度が 0— 2mMとなるように溶かした DMEMをカ卩え、 37°Cでさらに 30分間培養を行った。これらの細胞について前記した参考例 2に記載の方法に準じて分画を行、、ィムノブ口ティングを行った。結果を図 1に示す。また、コレステロール量及びタンパク質量を定量ィ匕した結果を図 2にグラフィ匕して示す。図 1及び図 2における 1 10の番号は細胞のフラクションを示し、脂質ラフトはフラクション 3である。

図 1は、メチル βシクロデキストリン（Μ β CD)処理後の細胞膜分画のィムノブロティングを示す。図 1中の 1—10のフラクションは、蔗糖密度勾配遠心法による細胞ホモジネートの分画の番号で、低比重のものが浮上し先の分画に出てきている。脂質ラフトのマーカーとしてゥロチリン—l (flotillin-l)が使用されている（図 1E参照）。図 1の Aは二カストリンについてのものであり、 Bは γ—セクレターゼの活性サブユニットのプレセ二リンー1 (PS1)についてのものであり、 Cはプレセ-リン 2 (PS2)についてのものであり、 Dは PEN— 2についてのものであり、 Eは脂質ラフトのマーカーとしてのフロチリン— 1についてのものである。図 1中の PS1及び PS2における「CTF」は Carboxy Terminal Fragment の意味で、 PS 1及び PS 2のそれぞれの C末端部分を認識する抗体でィムノブロッテイングを行ったことを示す。

各々のブロッテイングの図は、上からメチル j8シクロデキストリンの濃度が OmM、 lm M、及び 2mMのものである。

図 2は、メチル βシクロデキストリンによる細胞膜分画のコレステロール及びタンパク質含量の変化を示したグラフである。

この結果、メチル j8シクロデキストリンによりコレステロールが脂質ラフト (フラクション 3)より除去され（図 2の白抜き部分参照）、脂質ラフトのマーカータンパクであるフロティリンが本来の脂質ラフト分画であるフラクション 3からフラクション 9及び 10に移行した（図 1E参照)。同様に γ—セクレターゼの構成成分である-カストリン、プレセ-リン 1、プレセ-リン 2及び Pen-2が脂質ラフト分画 (フラクション 3)力も消失した（図 1Α、 Β 、 C及び D参照)。これによつて、メチル j8シクロデキストリンは脂質ラフトからコレステロールを引き抜くことによりラフト構造を破壊し、脂質ラフトにおける γ—セクレターゼの活性複合体の形成を阻害することが確認された。

実施例 2

HMG-CoA還元酵素阻害剤処理による処理（図 3、図 4参照）

SH-SY5Y細胞を 15 cm径のディッシュに培養し、コンフレントになる前の細胞について、 PBSで洗浄した。 DMEMに 5% LPDS、 250 Mのメバロン酸を加え、さらにコレステロールの生合成の阻害剤として 50 μ Μのコンパクチンまたは 5 μ Μのピタパスタチンをカロえた培地を調製し、 48時間培養した。これらの細胞について前記した参考例 2に記載の方法に準じて分画を行、、ィムノブ口ティングを行った。

結果を図 3に示す。また、コレステロール量及びタンパク質量を定量ィ匕した結果をグラフ化して図 4に示す。図 3及び図 4における 1 10の番号は細胞のフラクションを示し、脂質ラフトはフラクション 3である。図 3は、 HMG-CoA還元酵素阻害剤処理後の細胞膜分画のィムノブ口ティングを示す。図 3の Aは-カストリンにつ!、てのものであり、 Bは PS 1CTFについてのものであり、 Cは PS2CTFについてのものであり、 Dはフロチリン— 1についてのものである。各々のブロッテイングの図は、上からコントロール、即ち、 HMG-CoA還元酵素阻害剤を添カ卩していない場合、中段はコンパクチンを 50 M添加した場合、下段はピタパスタチンを 5 M添加した場合をそれぞれ示す。図 4は、 HMG-CoA還元酵素阻害剤による細胞膜分画のコレステロール及びタンパク質含量の変化を示したグラフである。四角印（口及び國）はコントロールとしてのメバロン酸 250 μ Μの場合を示し、丸印（〇及び參）はコンパクチン (メバロン酸 250 μ Μ及びコンパクチン 50 μ Μ)の場合を示し、三角印（△及び▲)はピタパスタチン (メバロン酸 250 μ Μ及びピタパスタチン 5 μ Μ)の場合をそれぞれ示す。白抜きの印はコレステロールの量を示し、黒抜きの印はタンパク質の量を示す。

この結果、 HMG-CoA還元酵素阻害剤であるコンパクチン及びピタノスタチンにより脂質ラフト (フラクション 3)のコレステロールが減少し（図 3参照）、実施例 1と同様に γ —セクレターゼの構成成分である-カストリン、プレセ-リン 1及びプレセ二リン 2が脂質ラフト分画 (フラクション 3)から消失した（図 3Α、 Β及び C参照)。フロティリンは脂質ラフト分画に未だ残っておりラフト構造は保たれているが、コンパクチン及びピタバスタチンは脂質ラフトにおける γ—セクレターゼの活性複合体の形成を阻害することが確認された。

産業上の利用可能性

本発明は、 γ—セクレターゼの活性複合体の形成を阻害し、 γ—セクレターゼの活性複合体の形成による Α β 40、Α β 42ペプチド、特に Α β 42の産生を抑制し、これらのペプチドの沈着に起因する各種の疾患、例えば、アルッノ、イマ一病 (AD)などの治療や予防に有用な医薬組成物を提供するものであり、産業上の利用性を有する。また、本発明は、 γ—セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有する物質をスクリーニングする方法や、 yーセクレターゼの脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供するものであり、有用な医薬品としての活性成分を簡便な手法で探索可能な方法を提供するものであり、産業上の利用性を有する。

Claims

請求の範囲

[1] コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラ-ルイ匕抑制剤を有効成分とする yーセクレターゼ複合体形成阻害剤。

[2] コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラ-ルイ匕抑制剤が、 HMG-CoA 合成酵素阻害剤、 HMG— CoA還元酵素阻害剤、スクアレン合成酵素阻害剤、スクアレンエポキシダーゼ阻害剤、ラノステロール合成酵素阻害剤、 AMPK活性化剤、フアルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤及びゲラ -ルゲラニル転移酵素阻害剤からなる群力選ばれた 1種又は 2種以上の薬剤である請求項 1に記載の γ—セクレターゼ複合体形成阻害剤。

[3] コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラ-ルイ匕抑制剤が、 HMG-CoA 還元酵素阻害剤である請求項 1に記載の γ -セクレターゼ複合体形成阻害剤。

[4] コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラ-ルイ匕抑制剤が、ピタバスタチンである請求項 1に記載の γ—セクレターゼ複合体形成阻害剤。

[5] コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラ-ルイ匕抑制剤を用いて、 γーセクレターゼの活性複合体の形成を阻害する方法。

[6] 脂質ラフト上における γ—セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する方法である請求項 5に記載の方法。

[7] コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラ-ルイ匕抑制剤が、 HMG-CoA 合成酵素阻害剤、 HMG— CoA還元酵素阻害剤、スクアレン合成酵素阻害剤、スクアレンエポキシダーゼ阻害剤、ラノステロール合成酵素阻害剤、 AMPK活性化剤、フアルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤、及び、ゲラニルゲラ-ル転移酵素阻害剤からなる群力選ばれた 1種又は 2種以上の薬剤である請求項 5に記載の γ—セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する方法。

[8] コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラ-ルイ匕抑制剤力 HMG-CoA 還元酵素阻害剤である請求項 5に記載の γ—セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する方法。

[9] コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラ-ルイ匕抑制剤が、ピタバスタチンである請求項 5に記載の γ—セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する方法。

[10] yーセクレターゼ複合体形成阻害剤を製造するためのコレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラ二ルイ匕抑制剤の使用。

[11] yーセクレターゼ複合体形成阻害剤力脂質ラフト上における γ—セクレターゼの活性複合体の形成を阻害するものである請求項 10に記載の使用。

[12] コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラ-ルイ匕抑制剤力 HMG-CoA 合成酵素阻害剤、 HMG— CoA還元酵素阻害剤、スクアレン合成酵素阻害剤、スクアレンエポキシダーゼ阻害剤、ラノステロール合成酵素阻害剤、 AMPK活性化剤、フアルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤、ゲラニルゲラ-ル転移酵素阻害剤カゝらなる群力も選ばれた 1種又は 2種以上の薬剤である請求項 10に記載の使用。

[13] コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラ-ルイ匕抑制剤力 HMG-CoA 還元酵素阻害剤である請求項 10に記載の使用。

[14] コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラ-ルイ匕抑制剤が、ピタバスタチンである請求項 10に記載の使用。

[15] コレステロールの合成阻害活性を測定することからなる、 γ -セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有する物質をスクリーニングする方法。

[16] コレステロールの合成阻害活性が、脂質ラフトに蓄積され得るコレステロールの合成阻害活性である請求項 15に記載のスクリーニング方法。

[17] コレステロールの合成阻害活性力 HMG— CoA合成酵素の阻害活性、 HMG— C oA還元酵素の阻害活性、スクアレン合成酵素の阻害活性、スクアレンエポキシダーゼの阻害活性、ラノステロール合成酵素の阻害活性、 AMPKの活性化、及びフアルネシルピロリン酸合成酵素の阻害活性力もなる群力選ばれたコレステロールの合成阻活性である請求項 15に記載のスクリーニング方法。

[18] コレステロールの合成阻害活性力 HMG— CoA還元酵素の阻害活性である請求項 15に記載のスクリーニング方法。

[19] γーセクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を測定することからなるコレステロール合成阻害剤、蛋白ゲラ-ルゲラ二ルイ匕抑制剤又は HMG— CoA還元酵素阻害剤をスクリーニングする方法。

[20] γ -セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を測定することからなる、 Η MG— CoA合成酵素阻害剤、 HMG— CoA還元酵素阻害剤、スクアレン合成酵素阻害剤、スクアレンエポキシダーゼ阻害剤、ラノステロール合成酵素阻害剤、 AMPK活性化剤、フアルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤、ゲラニルゲラ-ル転移酵素阻害剤からなる群力も選ばれたコレステロール合成阻害剤をスクリーニングする方法。

[21] γ -セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を測定することからなる、 Η MG— CoA還元酵素阻害剤をスクリーニングする方法。

[22] 培養細胞に被検物質を添加して、細胞内における γ—セクレターゼカその活性複合体を形成するに必要とされる構成成分の細胞内における分布を測定することにより、被検物質の Ίーセクレターゼに対する作用をスクリーニングする方法

[23] γ—セクレターゼ活性複合体を形成するに必要とされる構成成分が、二カストリン、 ΑΡΗ—1、及び Pen— 2からなる群力も選ばれる 1種又は 2種以上である請求項 22に記載の方法。