Hybridenzyme mit kationischer Bindedomäne
Die vorliegende Erfindung betrifft Hybridenzyme, umfassend eine hydrolytisch aktive Einheit und eine kationische Bindungseinheit sowie Zubereitungen, die diese Hybridenzyme enthalten.
Als Biofilm bezeichnet man den Bewuchs von Oberflächen durch Mikroben und vor allem die von ihnen kollektiv abgegebene und sie umhüllende gallertartige Schutzschicht, die auch EPS-Matrix genannt wird, wobei EPS für „extrazelluläre polymere Substanzen" steht. Diese Schutzschicht setzt sich hierbei unter anderem zusammen aus Proteinen und Polysacchariden, in die verschiedenste Schmutzpartikel wie etwa abgestorbene Zellen, Hautpartikel und Kalk eingelagert sind. Dieser Schleim ist gleichzeitig der Grund dafür, daß unter realen Bedingungen lebende Bakterien, wie auch andere Biofilme produzierende Mikroorganismen, wesentlich widerstandsfähiger gegenüber - auch biozidhaltigen - Reinigungs- und Desinfektionsmitteln sind als Laborkulturen, die normalerweise aus einzelnen frei schwimmenden Bakterien, sog. planktonischen Zellen, bestehen. Biofilme führen in technischen Systemen zu massiven Beeinträchtigungen und können in der Medizin hartnäckige Infektionen hervorrufen, die gegenüber herkömmlichen Antibiotika weitgehend resistent sind. Im Haushalt sind die durch Biofilme hervorgerufenen Beeinträchtigungen sowohl hygienischer als auch ästhetischer Natur.
Die Bekämpfung von Biofilmen durch Biozide ist nur bedingt möglich, da die größtenteils aus Polysacchariden bestehende Schleimmatrix die Zellen vor der Einwirkung der Biozide schützt (sog. Pseudoresistenz). Um überhaupt eine Wirkung zu erzielen, müssten die Biozide daher wesentlich höher dosiert eingesetzt werden, als es für eine vergleichbare Menge unassoziiert vorliegender Bakterien vonnöten wäre. Der Einsatz von Bioziden im Haushalt ist jedoch unter ökologischen Gesichtspunkten ungünstig, so dass die Bestrebungen eher dahin gehen, Reinigungsmittel mit nur geringen Konzentrationen oder völlig ohne Biozide bereitzustellen. Dies ließ sich jedoch
bislang nicht mit dem Wunsch nach einer möglichst vollständigen Entfernung bakterieller Biofilme - und damit optimaler Hygiene - in Einklang bringen.
Die europäische Patentschrift EP 946 207 B1 (entspr. WO 98/26807) lehrt die enzyma- tische Behandlung von Biofilmen mit Kombinationen aus Hydrolasen, die zur Ablösung und Entfernung der Biofilme von der Oberfläche dienen, und Oxidoreductasen, die die enthaltenen Bakterien abtöten. Mit diesen Systemen werden harte Oberflächen aus den unterschiedlichsten Materialien in verschiedenen industriellen Bereichen, beispielsweise Kühltürmen, Molkereibetrieben oder Chemieanlagen, gereinigt und desinfiziert, aber auch weiche Oberflächen wie Haut, Haare oder Textilien.
EP 388 115 befaßt sich mit der Zerstörung und Entfernung von Schleim auf industriellen, wasserumspülten Oberflächen. Hierzu werden Glucanasen, Cellulasen, Amylasen und/oder Proteasen eingesetzt, die gezielt die Polysaccharide der Schleimmatrix zersetzen; anschließend sollen die nunmehr zugänglichen Mikroorganismen der Wirkung von Bioziden ausgesetzt werden.
In der WO 01/09295 werden Enzyme mit einer ß-(1 ,6)-Endoglucanaseaktivität sowie entsprechende DNA-Sequenzen beansprucht, weiterhin eine Enzymzubereitung zum Abbau ß-1 ,6-glucanhaltiger Materialien und ihre Verwendung. Die ß-(1 ,6)- Endoglucanasen dienen auch zur Entfernung von Biofilmen von verschiedenen Oberflächen. Hauptsächlich befaßt sich diese spanische Schrift jedoch mit dem Abbau der ß-1 ,6-glucanreichen Zellwand bestimmter Pilze.
Auch die WO-Schrift 96/36569 beschreibt eine enzymatische Methode zur Entfernung von Biofilmen. Hierbei wird eine Mannanase, gegebenenfalls in Kombination mit mindestens einem weiteren Enzym, eingesetzt, um in industriellen wasserführenden Systemen die Schleimbildung zu vermeiden und bestehenden Schleim zu entfernen. Gemäß WO 96/17632 kann diese Aufgabe auch mit Kombinationen kurzkettiger Glykolkomponenten mit mindestens einem Enzym aus der Gruppe Polysaccharidasen, Proteasen, Lipasen und Glycoproteasen gelöst werden.
Die internationale Anmeldung WO 01/53010 lehrt ebenfalls einen enzymatischen Prozeß zur Entfernung von "Biofilmen von verschiedenen mit Wasser oder wäßrigen
Lösungen umspülten Oberflächen in industriellen Systemen sowie im medizinischen Bereich, wobei sich die Biofilme sowohl oberhalb der Wasseroberfläche, also an fest/flüssig/Luft-Grenzflächen, als auch unter Wasser, an fest/flüssig- Grenzflächen, befinden. Bei den eingesetzten Enzymen handelt es sich um Carbohydrasen oder Proteasen, Kombinationen aus diesen beiden Enzymen sind ebenfalls möglich. Gegebenenfalls kann die Reinigungslösung neben den genannten Enzymen weitere Aktivstoffe wie Korrosionsinhibitoren, Tenside, Biozide etc. enthalten.
Wie kürzlich beschrieben wurde (Whitchurch et al. (2000) Science 295, 1487ff), bestehen bakterielle Biofilme auch aus Nukleinsäuren und sind insbesondere in frühen Stadien auch durch Nukleinsäure-abbauende Enzyme, z.B. durch DNAsen hydrolisierbar.
Die enzymatische Hydrolyse des Biofilms durch einen Hydrolasen enthaltenden Reiniger verläuft jedoch vielfach sehr ineffizient, weil die Einwirkzeit durch den Reinigungsvorgang nur sehr kurz ist, die Enzyme schnell ausgewaschen werden und somit nicht ausreichend lang mit den Polymeren in Kontakt stehen . Hierdurch wird nur eine geringe bzw. unvollständige Hydrolyseleistung erzielt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zur effektiven Entfernung des Biofilms bereitzustellen, insbesondere ein solches, das effektiver ist als die bisher im Stand der Technik beschriebenen Verfahren.
Es wurden hierbei Überlegungen angestellt, dass hydrolytische Enzyme ein effizientes Mittel zur Entfernung des Biofilms sein könnten, falls ihre Verweilzeit erhöht werden könnte.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher insbesondere, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem die Verweilzeit von zur Entfernung des Biofilms geeigneten Hydrolasen auf der Oberfläche erhöht wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es des weiteren insbesondere, Reinigungsmittel bereitzustellen, die ohne den Einsatz von Bioziden in der Lage sind,
Biofilme auf harten Oberflächen im Haushalt aufzulösen und die filmbildenden Mikroorganismen zu entfernen.
Die Hauptaufgabe wird gelöst durch Enzyme, die dazu in der Lage sind länger an der Oberfläche zu verweilen und daher zu einem effektiveren Biofilm-Abbau in der Lage sind.
Gelöst wird diese Aufgabe hierbei insbesondere durch solche Enzyme, die eine Modifikation in Form einer kationischen Bindedomäne aufweisen.
Aufgrund der negativen Ladung des Biofilms können die auf diese Weise modifizierten Enzyme länger am Biofilm bzw. an Oberflächen, die einen Biofilm aufweisen, haften und dadurch effektiver den Biofilm abbauen.
Diese Hybridenzyme sind dazu in der Lage, die bakterielle Schleimmatrix in Biofilmen auf WCs und anderen Oberflächen zu zerstören, so dass die Bakterien aus ihrem Verband herausgelöst und in die planktonische Form überführt werden, wodurch ein einfaches Fortspülen ausreicht, um die Mikroben zu entfernen, ohne dass zusätzlich der Einsatz von Bioziden vonnöten wären. Es ist daher eine umweltschonende Methode zur Reinigung und Desinfektion vor allem feuchter, wasserumspülter Oberflächen zugänglich geworden
Hybrid proteine, die Bindedomänen enthalten, sind im Stand der Technik bereits beschrieben.
So beschreibt WO 95/31556 Hybridproteine aus Glucanbindedomänen, an die antimikrobielle Substanzen gebunden sind, für die Verwendung als Mundpflegeprodukte. WO 98/18437 beschreibt Mutanbindedomänen, an die antimikrobielle Substanzen gebunden sind, ebenfalls für die Verwendung als Mundpflegeprodukte. In WO 98/16190 sind Hybrid proteine aus an Stärke bindenden Domänen mit antimikrobiellen Substanzen beschrieben, die ebenfalls als Mundpflegeprodukte Verwendung finden. In WO 99/33957 sind modifizierte Enzyme beschrieben, die eine polyanionische Domäne umfassen, die ebenfalls in Mundpflegeprodukten Verwendung finden.
WO 99/18999 beschreibt ebenfalls Zusammensetzungen, die in Mundpflegeprodukte Verwendung finden, wobei die Zusammensetzung ein Enzym umfasst sowie ein Ankermolekül, das an das Enzym gebunden ist und dazu in der Lage ist, an ein Substrat zu binden, das sich in der Nähe einer bakteriellen Kolonie befindet. In den Ausführungsbeispielen werden als Ankermoleküle kurzkettige basische und saure Moleküle angeführt.
WO 01/93875 beschreibt Zusammensetzungen zur Behandlung von Biofilmstrukturen, wobei die Zusammensetzung ein Enzym umfasst, das dazu in der Lage ist Biofilmstrukturen abzubauen, und einen Anker umfasst, der dazu in der Lage ist an die zelluläre Kolonie oder an andere bioadhäsive Moleküle zu binden. Als Beispiele für das Ankermolekül werden die Bindungsdomäne von Elastase, Domänen, die an Carbohydrate und Polysaccharide binden, Lectine, Selectine, die Bindungsdomäne von Heparin, die Bindungsdomäne von Fibronectin und das CD44 Protein genannt.
US 2002022005 beschreibt eine Zusammensetzung zum Abbau von Biofilmstrukturen, die mit cystischer Fibröse verbunden sind, wobei die Zusammensetzung ein Enzym umfasst, das dazu in der Lage ist, Biofilme abzubauen, und einen Anker umfasst, der dazu in der Lage ist an die Oberfläche auf oder in der Nähe der Biofilmstruktur zu binden. Als Anker-Moleküle werden beispielsweise Concanavalin, Lectine, Elastase, Heparin- und Amylose-bindende Domänen genannt.
WO 00/47174 und WO 00/47175 beschreiben Mundpflegeprodukte, die Fusionsproteine enthalten, die ein Enzym und ein Ankermolekül umfassen. Bei den Enzymen handelt es sich hierbei um solche, die Polysaccharide abbauen können, bei dem Ankermolekül handelt es sich um ein Molekül, das dazu in der Lage ist, „in der Nähe einer bakteriellen Kolonie" zu binden. Als Beispiele für das Ankermolekül werden Glutathion-S- Transferase, Glutathion, Avidin, Streptavidin, Biotin und Antikörper genannt. Des weiteren wird in diesen Offenlegungsschriften als mögliches kationisches Ankermolekül auch das Oligopeptid KKEKK genannt. Dieses kurzkettige Peptid ist jedoch nicht dazu in der Lage, bei Kopplung an eine höhermolekulare hydrolytisch aktive Einheit den pl- Wert des resultierenden Proteins ausreichend zu erhöhen, um eine effektive Bindung an einen Biofilm zu ermöglichen.
Erfindungsgemäße Hybridproteine sowie die erfindungsgemäße Verwendung der Hybridproteine wurde im Stand der Technik bisher noch nicht beschrieben.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Hybrid proteine, umfassend eine hydrolytisch aktive Einheit und eine kationische Bindungseinheit.
Bei der hydrolytisch aktiven Einheit des erfindungsgemäßen Hybridenzyms handelt es sich vorzugsweise um ein hydrolytisches Enzym, vor allem aus der Gruppe der Polysaccharidasen, insbesondere der ß-Glucanasen, Cellulasen, Xylanasen, Amylasen, Dextranasen, Glucosidasen, Galactosidasen, Pectinasen, Chitinasen oder Alginat- Lyasen oder um Lysozym, und/oder aus der Gruppe der Proteasen und Peptidasen, insbesondere Subtilisin, Thermolysin, Pepsin, Carboxypeptidase oder Saure Protease, und/oder aus der Gruppe der Nukleasen, insbesondere der DNAsen oder RNAsen und/oder es handelt sich um ein funktionelles Fragment davon.
Bei der kationischen Bindungseinheit kann es sich um eine natürlicherweise vorkommende oder um eine künstlich hergestellte, natürlicherweise nicht vorkommende Bindedomäne handeln. Vorzugsweise handelt es sich bei der Bindedomäne um ein Protein oder um ein Polypeptid, so dass es sich bei dem Hybridenzym um ein Fusionsprotein handelt. Alternativ können jedoch auch andere Einheiten als kationische Bindungseinheit bzw. kationische Bindedomäne verwendet werden, die eine positive Ladung aufweisen, beispielsweise organische Moleküle, die Aminogruppen tragen. Im Falle von Proteinen bzw. Polypeptiden ist die kationische Bindungseinheit vorzugsweise nicht mehr als 200, insbesondere nicht mehr als 150 Aminosäuren lang, besonders bevorzugt besitzt sie eine Länge zwischen 10 und 200, insbesondere zwischen 10 und 140, vor allem zwischen 10 und 20 oder zwischen 30 und 140 Aminosäuren. Die durchschnittliche Anzahl an Ladungen liegt vorzugsweise zwischen 0,01 und 0,8, besonders bevorzugt zwischen 0,1 und 0,4 positiven Ladungen pro Aminosäure-Rest bei neutralem pH. Die kationische Bindungseinheit ist vorzugsweise hinsichtlich Länge bzw. Größe und Ladung so gestaltet, dass durch Anfügen der kationischen Bindungseinheit an eine hydrolytische Einheit mit einem neutralen oder leicht sauren pl- Wert (pl < 8) ein Hybridenzym entsteht, das einen pl-Wert größer gleich 8,5, besonders bevorzugt größer gleich 9,0 besitzt. Durch den erhöhten pl-Wert wird die Bindung an
den negativ geladenen Biofilm erleichtert. Die Auswahl der passenden kationischen Bindungseinheit kann hierbei auf einfache Weise durch Berechnung des resultierenden pl-Wertes für das Hybridenzym in silico beispielsweise mit dem Programm ExPASy Compute pl/Mw erfolgen (Bjellqvist, B., Hughes, G.J., Pasquali, Ch., Paquet, N., Ravier, F., Sanchez, J.-Ch., Frutiger, S. & Hochstrasser, D.F. The focusing positions of polypeptides in immobilized pH gradients can be predicted from their amino acid sequences. Electrophoresis 1993, 14, 1023-1031 , Bjellqvist, B., Basse, B., Olsen, E. and Celis, J.E. Reference points for comparisons of two-dimensional maps of proteins from different human cell types defined in a pH scale where isoelectric points correlate with polypeptide compositions. Electrophoresis 1994, 15, 529-539).
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die kationische Bindungseinheit eine Bindedomäne eines natürlicherweise vorkommenden Oberflächenproteins, insbesondere eines sogenannten Cell Envelope-Proteins, eines Zellmembranassoziierten Proteins und/oder eines sogenannten Surface Layer-Proteins (S-Layer- Proteins) und/oder jeweils ein Fragment und/oder Derivat davon, wobei die Länge der kationischen Bindungseinheit vorzugsweise zwischen 10 und 200, insbesondere zwischen 10 und 140 beträgt, vor allem zwischen 10 und 20 oder zwischen 30 und 140 Aminosäuren beträgt, und wobei für die Ladungen die zuvor angegebenen Werte bevorzugt sind. Beispielsweise kann es sich hierbei um die Bindedomäne eines sbs- Proteins handeln, insbesondere eines sbs-Proteins aus Geobacillus, vor allem aus Geobacillus stearothermophilus, oder ein Fragment und/oder Derivat davon. Die Bindedomäne kann hierbei insbesondere ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 19 oder gemäß SEQ ID NO: 20 oder Derivate der genannten Polypeptide umfassen. Unter Derivaten sind hierbei insbesondere zu verstehen: a) natürlicherweise vorkommende oder künstlich synthetisierte Mutanten der genannten Polypeptide, insbesondere solche, die bis zu zehn, bevorzugt bis zu fünf, vor allem genau ein, zwei oder drei Punktmutationen in Bezug auf die genannten Polypeptide besitzen, b) Polypeptide, die eine Sequenzhomologie oder -identität von mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 60 % oder 70 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 80 oder 90 %, insbesondere mindestens 95 % oder 98 % in Bezug auf die genannten Polypeptide besitzen,
c) Polypeptide bestehend aus mindestens 10 oder 15, besonders bevorzugt mindestens 20 oder 30, aufeinanderfolgenden Aminosäuren der genannten Polypeptide oder eines Polypeptids gemäss (a) oder (b), d) Polypeptide mit Insertionen und/oder Deletionen von bis zu 10, 5 oder 3 Aminosäuren in Bezug auf die genannten Polypeptide oder in Bezug auf ein Polypeptid gemäss (a), (b) oder (c), e) Polypeptide, die mindestens eines der Polypeptide gemäss (a), b), (c) oder (d) umfassen.
Hinsichtlich weiterer erfindungsgemäß verwendbarer Surface Layer-Proteine wird vor allem auf Sara und Sleytr (2000, Journal of Bacteriology 182(4), 859-868) verwiesen, insbesondere auf Tabelle 1. Bei den erfindungsgemäß verwendbaren Derivaten dieser Proteine handelt es sich insbesondere um Mutanten, Homologe und Fragmente gemäß der zuvor angegebenen Definition.
Hinsichtlich weiterer erfindungsgemäß verwendbarer Oberflächenproteine außer Surface Layer-Proteinen seien allgemein Oberflächenproteine genannt, die zur Bindung an negativ geladene Polysaccharide, wie sie häufig in Zellwänden vorkommen, befähigt sind, wie z.B zellwandständige Proteine aus Pflanzen, die dazu in der Lage sind an Pektine zu binden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der kationischen Bindungseinheit um ein künstlich hergestelltes, natürlicherweise nicht vorkommendes Polypeptid, insbesondere um ein solches mit einer Länge zwischen 10 und 100, vorzugsweise zwischen 20 und 50, besonders bevorzugt zwischen 25 und 40 Aminosäuren, das vorzugsweise zwischen 0,3 und 0,4 positiven Ladungen bei neutralem pH-Wert trägt, wobei es sich bei den positiv geladenen Gruppen vorzugsweise um Lysin- oder Arginin-Reste, besonders bevorzugt um Lysin-Reste handelt. Die kationische Bindungsdomäne umfasst hierbei vorzugsweise ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäss SEQ ID NO. 21 oder ein Derivat davon, wobei unter einem Derivat insbesondere zu verstehen ist a) natürlicherweise vorkommende oder künstlich synthetisierte Mutanten eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz gemäss SEQ ID NO: 21 , insbesondere solche, die bis zu zehn, bevorzugt bis zu fünf, vor allem genau ein,
zwei oder drei Punktmutationen in Bezug auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäss SEQ ID NO: 21 besitzen, b) Polypeptide, die eine Sequenzhomologie oder -identität von mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 60 % oder 70 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 80 oder 90 %, insbesondere mindestens 95 % oder 98 % in Bezug auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäss SEQ ID NO: 21 besitzen, c) Polypeptide bestehend aus mindestens 10 oder 15, besonders bevorzugt mindestens 20 oder 30, aufeinanderfolgenden Aminosäuren eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 21 oder eines Polypeptids gemäss (a) oder (b), d) Polypeptide mit Insertionen und/oder Deletionen von bis zu 10, 5 oder 3 Aminosäuren in Bezug auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 21 oder in Bezug auf ein Polypeptid gemäss (a), (b) oder (c), e) Polypeptide, die mindestens eines der Polypeptide gemäss (a), (b), (c) oder (d) umfassen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 21 oder ein Derivat davon in dem zuvor angegebenen Sinne.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Nukleinsäuren, die für eines der zuvor genannten Polypeptide kodieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind des weiteren wässrige Zubereitungen (Enzymzubereitungen), die die erfindungsgemäßen Hybridproteine in gelöster Form enthalten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren die Verwendung der erfindungsgemäßen Hybridenzmye und/oder von Hybridenzymen enthaltenden Enzymzubereitungen, insbesondere in Sterilisations-, Desinfektions-, Wasch- und Reinigungsmitteln, vor allem in Reinigern zur Entfernung von Biofilmen von harten Oberflächen, wobei bei dieser Verwendung die Applikation vorzugsweise auf abiotischen Oberflächen, insbesondere nicht an Lebewesen, erfolgt. Der Einsatz der Mittel kann insbesondere im Haushalt oder auf dem Gebiet der Arzneimittel-, Lebensmittel-, Brauerei-, Medizintechnik-, Farben-, Holz-, Textil-, Kosmetik-, Leder-,
Tabak-, Pelz-, Seil-, Papier-, Zellstoff-, Kunststoff-, Treibstoff-, Öl-, Kautschuk- oder Maschinenindustrie oder in Molkereibetrieben erfolgen. Die erfindungsgemäßen Hybridenzyme können hierbei insbesondere zur Entfernung von Biofilmen von Haushalts- und/oder Sanitärgegenständen sowie in Zellstoff- und Papiermühlen, in Umlaufkühltürmen sowie in anderen Systemen, die fließendes und/oder umlaufendes Wasser führen, eingesetzt werden. Neben der Entfernung von Biofilmen sind die erfindungsgemäßen Hybridenzyme beispielsweise auch geeignet zum Einsatz in Waschmitteln zur Reinigung von Textilien, insbesondere zur Fleckentfernung. Durch die positiv geladene Bindungseinheit wird das Anhaften an negativ geladene Textiloberflächen erleichtert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind des weiteren Sterilisations-, Desinfektions- , Wasch- und Reinigungsmittel, die erfindungsgemäße Hybridenzyme und/oder Hybridenzyme enthaltende Enzymzubereitungen enthalten. Bei dem Mittel kann es sich grundsätzlich um ein Mittel für jede beliebige Art von Oberfläche handeln. Es kann sich also bei der Oberfläche um eine biotische oder abiotische, künstlich synthetisierte oder natürliche, weiche oder harte Oberfläche handeln. Vorzugsweise erfolgt jedoch die Applikation bei dieser Verwendung auf einer abiotischen Oberfläche, insbesondere nicht an Lebewesen. Bei der Oberfläche kann es sich etwa um eine Textil-, Keramik-, Metall- und/oder Kunststoffoberfläche handeln. Bei dem Gegenstand kann es sich beispielsweise um Wäsche, Sanitäreinrichtungen, Bodenbeläge, Schuhe, Leder, aus Gummi hergestellte Gebrauchsgegenstände, Schiffsrümpfe, Prothesen, Zähne, Zahnersatz oder Katheter handeln.
Bei dem Reinigungsmittel kann es sich insbesondere um einen Haushaltsreiniger oder einen Reiniger für industrielle Anlagen, insbesondere der zuvor genannten, handeln. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Reiniger um einen solchen zum Säubern harter Oberflächen, wie zum Beispiel von Böden, Kacheln, Fliesen, Kunststoffen sowie anderen harten Oberflächen im Haushalt, in industriellen Anlagen, in öffentlichen sanitären Anlagen, in Schwimmbädern, Saunen, Sportanlagen oder in Arztoder Massagepraxen.
Medizinisch relevante Biofilme, die mit erfindungsgemäßen Hybridenzymen entfernt werden können, sind beispielsweise Biofilme durch chronische Lungeninfektionen, die
z.B. bei Mukoviszidose-Patienten auftreten können. Des weiteren kann es sich um Zahnbelag handeln oder um Biofilme, die von Kontaktlinsen, Implantaten oder von medizinischen Geräten, Instrumenten oder Apparaturen, wie Kathetern oder Endoskopen, entfernt werden müssen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Hybridenzyme und/oder Hybridenzyme enthaltender Enzymzubereitungen in kosmetischen und/oder pharmazeutischen Produkten sowie kosmetische und/oder pharmazeutische Produkte, die die erfindungsgemäßen Hybridenzyme und/oder Enzymzubereitungen enthalten sowie des weiteren die Verwendung der erfindungsgemäßen Hybridenzyme und/oder Enzymzubereitungen zur Herstellung von kosmetischen und/oder pharmazeutischen Produkten. Bei dem Produkt kann es sich beispielsweise um ein Produkt zur Entfernung von Zahnbelag von Zahnoberlächen oder um ein Produkt zur Entfernung von Biofilmen, die durch chronische Lungeninfektionen verursacht bzw. mit diesen verbunden sind, wie z.B. im Falle der Mukoviszidose, handeln. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher vor allem auch Mund-, Zahn-, oder Zahnprothesenpflegemittel, die die erfindungsgemäßen Hybridenzyme enthalten.
Die Sterilisations-, Desinfektions-, Wasch- und Reinigungsmittel können weitere Komponenten enthalten, wie sie dem Fachmann bekannt sind, insbesondere ein oder mehrere Komponenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tensiden, Buildern, Säuren, alkalischen Substanzen, Hydrotropen, Lösungsmitteln, Verdickungsmitteln, Farbstoffen, Parfüms, Korrosionsinhibitoren und Hautschutzmitteln. Soll das Reinigungsmittel versprüht werden, kann gegebenenfalls auch ein Treibmittel enthalten sein. Das Reinigungsmittel ist vorzugsweise ein flüssiges wässriges Mittel, es kann sich jedoch beispielsweise auch um ein Gel, eine Paste oder um ein Pulver handeln.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Erzeugnis, enthaltend eine erfindungsgemäße Enzymzubereitung oder ein erfindungsgemäßes Reinigungsmittel und einen Sprühspender.
Bevorzugt ist der Sprühspender ein manuell aktivierter Sprühspender, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend Aerosolsprühspender (Druckgasbehälter; auch u.a. als Spraydose bezeichnet), selbst Druck aufbauende Sprühspender,
Pumpsprühspender und Triggersprühspender, insbesondere Pumpsprühspender und Triggersprühspender mit einem Behälter aus transparentem Polyethylen oder Polyethylenterephthalat. Sprühspender werden ausführlicher in der WO 96/04940 (Procter & Gamble) und den darin zu Sprühspendern zitierten US-Patenten, auf die in dieser Hinsicht sämtlich Bezug genommen und deren Inhalt hiermit in diese Anmeldung aufgenommen wird, beschrieben. Triggersprühspender und Pumpzerstäuber besitzen gegenüber Druckgasbehältern den Vorteil, daß kein Treibmittel eingesetzt werden muß.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das die Enzymzubereitung enthaltende Mittel jedoch nicht als Aerosol zerstäubt, da hierbei gegebenenfalls geringe Mengen der Enzymzubereitung in die Atemwege geraten können und unter Umständen dort allergische Reaktionen auslösen könnten. Durch geeignete, partikelgängige Aufsätze, Düsen etc. (sog. "nozzle-Ventile") auf dem Sprühspender kann das Enzym in auf Partikeln immobilisierter Form dem Mittel beigefügt werden und als Reinigungsschaum dosiert werden. Bei der Erzeugung dieser kompakten Schäume entstehen keine lungengängigen Teilchen, so daß die Gefahr der Inhalation von Allergenen im wesentlichen gebannt wird.
Noch ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Hydrolyse von Biofilmen auf harten Oberflächen, bei dem die Vitalität der mikrobiellen Zellen nicht geschädigt wird. Hierzu wird die erfindungsgemäße Enzymzubereitung oder das erfindungsgemäße Reinigungsmittel, gegebenenfalls unter Benutzung eines erfindungsgemäßen Erzeugnisses, auf die mit Biofilm überzogene Fläche aufgebracht und gegebenenfalls nach einer Einwirkzeit von 1 bis 30 Minuten, bei stärkerem Befall auch einige Stunden oder über Nacht, mit klarem Wasser abgespült. Die Zubereitung oder das Mittel kann auch vor dem Abspülen mit einem Tuch, einem Schwamm, einer Bürste oder einem sonstigen zur Reinigung geeigneten Utensil auf der von Biofilm befallenen Oberfläche verwischt oder verrieben werden, was z.B. bei Anwesenheit von Abrasivstoffen im Reinigungsmittel die Reinigungsleistung verbessert. Schließlich wird die Oberfläche mit einem trockenen Tuch abgetrocknet. Bei sehr starkem Befall der Oberfläche mit Biofilm kann der Reinigungsvorgang anschließend wiederholt werden.
Stoffe, die auch als Inhaltsstoffe von kosmetischen Mitteln dienen, werden nachfolgend ggf. gemäß der International Nomenclature Cosmetic Ingredient (INCI)-Nomenklatur be-
zeichnet. Chemische Verbindungen tragen eine INCI-Bezeichnung in englischer Sprache, pflanzliche Inhaltsstoffe werden ausschließlich nach Linne in lateinischer Sprache aufgeführt, sogenannte Trivialnamen wie "Wasser", "Honig" oder "Meersalz" werden ebenfalls in lateinischer Sprache angegeben. Die INCI-Bezeichnungen sind dem International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook - Seventh Edition (1997) zu entnehmen, das von The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association (CTFA), 1101 17th Street, NW, Suite 300, Washington, DC 20036, USA, herausgegeben wird und mehr als 9.000 INCI-Bezeichnungen sowie Verweise auf mehr als 37.000 Handelsnamen und technische Bezeichnungen einschließlich der zugehörigen Distributoren aus über 31 Ländern enthält. Das International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook ordnet den Inhaltsstoffen eine oder mehrere chemische Klassen (Chemical Classes), beispielsweise Polymeric Ethers, und eine oder mehrere Funktionen (Functions), beispielsweise Surfactants - Cleansing Agents, zu, die es wiederum näher erläutert und auf die nachfolgend ggf. ebenfalls bezug genommen wird.
Die Angabe CAS bedeutet, daß es sich bei der nachfolgenden Zahlenfolge um eine Bezeichnung des Chemical Abstracts Service handelt.
Enzymzubereitung
Die erfindungsgemäße Enzymzubereitung ist ein System enthaltend eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Hybridenzyme. Gegebenenfalls können auch weitere, nicht-modifizierte Enzyme, insbesondere ausgewählt aus Polysaccharidasen, Proteasen und Nukleasen in der Enzymzubereitung enthalten sein. Die folgenden Erläuterungen beziehen sich, soweit nicht explizit unterschieden wird, sowohl auf die freien Enzyme als auch auf die hydrolytische Einheit, die Teil der Hybridenzyme ist.
Als Polysaccharidasen bezeichnet man solche Enzyme, die die hydrolytische Spaltung von Polysacchariden katalysieren. So wird durch die Cellulase beispielsweise Cellulose abgebaut, während die Glucosidase aus dem Oligo- oder Polysaccharidmolekül vom Ende her einzelne Glucoseeinheiten abspaltet. Die extrazelluläre Polysaccharidmatrix des Biofilms besteht aus Homo- und Heteropolysacchariden, die vor allem aus Glucose, Fucose, Mannose, Galactose, Fructose, Pyruvat, Mannuronsäure und Glucuronsäure aufgebaut sind. Dementsprechend handelt es sich bei den Polysacchariden
beispielsweise um Levane, Polymannane, Dextrane, Cellulose, Amylopektin, Glykogen oder um Alginat.
Im Sinne dieser Erfindung sind sämtliche Polysaccharidasen zur Hydrolyse von Biofilmen einsetzbar. Bevorzugt enthält die Enzymzubereitung jedoch mindestens ein Enzym entweder als freies Enzym oder als hydrolytische Einheit des Hybridenzyms aus der Gruppe ß-Glucanase, Cellulase, Xylanase, Amylase, Dextranase, Glucosidase, Ga- lactosidase, Pectinase, Chitinase, Lysozym, Hemicellulase und Alginat-Lyase. Diese Enzyme können jeweils mehrere Familienmitglieder umfassen. So kennt man beispielsweise sowohl eine α-1 ,4-Glucosidase, die früher auch als Maltase bezeichnet wurde, als auch eine ß-1 ,4-Glucosidase. Im Sinne dieser Erfindung sind alle diese Untergruppen umfaßt. Es können auch bereits im Handel erhältliche Gemische aus Polysaccharidasen eingesetzt werden. So eignet sich beispielsweise Viscozyme, eine flüssige Enzymzubereitung aus Aspergillus sp., die aus verschiedenen Polysaccharidasen zusammengesetzt ist, u.a. aus Arabanase, Cellulase, ß-Glucanase, Hemicellulase und Xylanase, zum Einsatz im Sinne dieser Erfindung.
Proteasen sind Enzyme, welche die hydrolytische Spaltung der Peptidbindung von Proteinen und Peptiden katalysieren. Sie können daher ebenfalls zum Abbau von Biofilmen genutzt werden, da diese neben Polysacchariden auch von den filmbildenden Organismen sekretierte Eiweißstoffe enthalten können. Proteasen können systematisch zum einen nach dem pH-Optimum ihrer Wirkung in saure, neutrale und alkalische Proteasen eingeteilt werden, zum anderen klassifiziert man sie aber nach der katalytisch wirksamen Gruppe im aktiven Zentrum. Dabei unterscheidet man Serin-, Cystein-, Aspartat- und Metallproteasen.
Sämtliche bekannte Proteasen können im Sinne dieser Erfindung zum Abbau von Biofilmen eingesetzt werden, vorzugsweise wird jedoch mindestens eine Protease ausgewählt aus der Gruppe Subtilisin, Thermolysin, Pepsin, Carboxypeptidase, Saure Protease eingesetzt.
Bei den Nucleasen handelt es sich um Nukleinsäuren abbauende Enzyme. Je nach Hydrolysestelle unterscheidet man Endonucleasen, die innerhalb des Nucleinsäurestranges spalten (z.B. DNAse I aus Pankreas) und Exonucleasen, die
Nucleotide vom Ende her freisetzen (z.B. Exonuclease III aus E. col i). Dabei können DNA-Einzelstränge (S1-Nuclease aus Aspergillus oryzae) oder -Doppelstränge (Exonuclease III) als Substrat dienen und recht unspezifisch zu kürzeren Strängen oder einzelnen Nucleotiden abgebaut werden. Auch gemischte Spezifitäten sind möglich und treten in Abhängigkeit z.B. von Enzymkonzentration und Gegenwart bestimmter Ionen auf. Analog ist auch die Spaltung von RNA-Molekülen möglich. Hochspezifische Endonucleasen erfordern bestimmte Nucleotidsequenzen (typischerweise 4-8 Basenpaare) und werden teilweise auch als Restriktionsenzyme oder Restriktionsendonucleasen bezeichnet. Da Biofilme auch aus Nukleinsäuren bestehen können, sind auch sämtliche Nucleasen zum erfindungsgemäßen Einsatz in biofilmabbauenden Mitteln geeignet. Vorzugsweise werden jedoch unspezifische DNAsen oder RNAsen eingesetzt.
Die im Sinne dieser Erfindung einsetzbaren freien Enzyme können durch übliche biochemische Methoden aus den entsprechenden Organismen gewonnen werden. Sie sind aber auch kommerziell erhältlich, beispielsweise von den Firmen Novozymes, Genencor International, Sigma, AB Enzymes oder ASA Enzyme. Dabei können die Enzympräparationen auch von technischer Qualität sein und aus mehreren verschiedenen Enzymaktivitäten bestehen. Die Gegenwart von teilweise nicht näher charakterisierten Nebenaktivitäten kann auf die Hydrolyse der komplex zusammengesetzten Biofilm-Polymere ebenfalls einen günstigen Einflu ß haben.
Sollen Proteasen mit anderen Enzymen, beispielsweise Polysaccharidasen, kombiniert werden, so ist zu beachten, unabhängig davon, ob es sich um erfindungsgemäße Hybridenzyme oder um freie Enzyme handelt, dass diese in flüssigen Mitteln durch im Reiniger enthaltene Komponenten wie Tenside oder organische Säuren oder aber auch durch die recht unspezifisch agierenden Proteasen angegriffen werden könnten, wodurch sich die Wirksamkeit der Mittel gegenüber nicht-Protein-Biofilmbestandteilen verringern würde. Um die Aktivität und Stabilität solcher Reinigungsmittel über einen längeren Zeitraum zu gewährleisten, ist es daher sinnvoll, empfindliche Enzyme von denaturierenden Komponenten und insbesondere auch Proteasen von anderen Enzymen getrennt zu halten, so daß diese Komponenten erst unmittelbar vor oder während des Reinigungsvorgangs aufeinander treffen.
Diese Trennung der verschiedenen Enzyme kann auf verschiedenen Wegen erfolgen. Eine Möglichkeit ist es, die Enzyme in Mikrokapseln einzubringen, die erst unmittelbar vor oder während des Reinigungsvorgangs, beispielsweise durch mechanische Einwirkung beim Putzvorgang, durch plötzliche Veränderung der osmotischen Verhältnisse z.B. beim Verdünnen mit Wasser oder durch ein Zerschneiden der Kapseln beim Dosieren aus der Vorratsflasche, geöffnet werden und ihren Inhalt freisetzen. Hierbei ist jedoch zu beachten, dass die Kapselwand ihrerseits nicht durch die Enzyme angegriffen werden darf. Kapselmaterialien auf der Basis von Proteinen oder Polysacchariden sind daher auszuschließen. Alternativ können die Enzyme auch jeweils auf einem festen Träger immobilisiert werden, der im Reinigungsmittel suspendiert wird und bei der Anwendung des Mittels zusätzlich als Abrasivstoff dienen kann. Die Immobilisierung erfolgt auf dem Fachmann bekanntem Wege; als Trägermaterialien können neben anorganischen Stoffen, beispielsweise Silicaten oder porösem Glas, auch Polymere eingesetzt werden.
Eine weitere denkbare Möglichkeit könnte auch das Einarbeiten in ein mehrphasiges Mittel sein, so dass die Protease vorwiegend in einer Phase angesiedelt wäre und die übrigen Enzyme vorwiegend in einer weiteren Phase vorlägen. Ein solches Mittel würde kurz vor der Verwendung aufgeschüttelt und die entstehende Emulsion auf die zu reinigende Fläche aufgetragen; das in der Vorratsflasche verbleibende Mittel würde anschließend eine rasche Phasentrennung erfahren, so dass die Enzyme nur für kurze Zeit sowie ggf. an der Phasengrenzfläche in Kontakt kämen. Ähnlich wäre der Fall gelagert, wenn ein Enzym in eine Phase eingearbeitet würde, die in Form von Tröpfchen in der zweiten, das andere Enzym enthaltenden Phase stabil dispergiert wäre; hierbei würde das Mittel nicht geschüttelt, sondern direkt aus der Vorratsflasche dosiert, gegebenenfalls auch versprüht. Ein solches mehrphasiges Mittel wäre jedoch eine technisch aufwendige und schwierig zu realisierende Lösung. Zudem wäre die Verbraucherakzeptanz voraussichtlich gering.
Sinnvoller ist es daher, die beiden Enzyme bzw. Enzymgruppen in räumlich getrennten Lösungen aufzubewahren. Dabei ist die Lagerung in zwei völlig getrennten Flaschen die weniger bevorzugte Lösung, da dies für den Verbraucher einen größeren Aufwand bedeutet. Besonders bevorzugt ist daher die Bereitstellung in einer Zweikammerflasche, aus der dann gleichzeitig beide Reinigungslösungen dosiert werden können. Solche
Zweikammerflaschen sind bereits aus dem Stand der Technik bekannt. Neben der Möglichkeit der getrennten Lagerung miteinander nicht kompatibler Enzyme bietet eine Zwei- oder Mehrkammerflasche weitere Vorteile. So ist es möglich, in einer Kammer unter anderem ein Enzym in einer Lösung mit optimalem pH bezüglich der Lagerstabilität aufzubewahren und in einer weiteren Kammer eine Lösung zu bevorraten, deren pH-Wert dazu führt, daß beim Mischen dieser mit der Enzymaufbewahrungslösung eine Reinigungslösung entsteht, deren pH-Wert ein Optimum an Enzymaktivität bewirkt. Beispielsweise sind viele Polysaccharidasen bei neutralem pH-Wert besonders stabil, entfalten ihre höchste Aktivität aber bei pH 4 bis 5.
Reinigungsmittel
Das Hybridenzym und/oder die Enzymzubereitung können im Sinne dieser Erfindung auch in einem Reinigungsmittel für harte Oberflächen eingesetzt werden. Das Reinigungsmittel kann die Enzymzubereitung insbesondere in Mengen von 0,1 bis 10,0 Gew.-% enthalten, vorzugsweise 0,5 bis 3 Gew.-%. Das Reinigungsmittel ist hierbei vorzugsweise biozidfrei, kann jedoch gegebenenfalls auch Biozid, vorzugsweise in geringen Mengen, enthalten.
Neben der Enzymzubereitung kann ein flüssiges, gelförmiges oder pastöses wäßriges Reinigungsmittel für harte Oberflächen erfindungsgemäß auch übliche Reinigungsmittelbestandteile enthalten. Zu diesen Inhaltsstoffen zählen beispielsweise Tenside, aber auch Builder, Säuren, Alkalien, Hydrotrope, Lösungsmittel, Verdickungsmittel, Abrasivstoffe sowie weitere Hilfs- und Zusatzstoffe wie Farbstoffe, Parfüms, Korrosionsinhibitoren oder auch Hautpflegemittel.
Die gegebenenfalls eingesetzten Tenside werden vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe anionische Tenside, nichtionische Tenside und/oder amphotere Tenside. Bevorzugt werden dabei anionische und/oder nichtionische Tenside eingesetzt. Sofern sie eingesetzt werden, kommen anionische Tenside vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 15 Gew.-%, nichtionische Tenside vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 10 Gew.-% und amphotere Tenside vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 4 Gew.-% zur Anwendung, jeweils bezogen auf die Gesamtzusammensetzung. In einer weniger bevorzugten Ausführungsform können daneben auch noch kationische Tenside in Mengen von bis zu 2 Gew.-% eingesetzt werden, bezogen auf die
Gesamtzusammensetzung. Ebenso können auch kationische Tenside eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Reinigungsmittel aufgrund der von kationischen Tensiden ausgehenden bioziden Wirkung jedoch frei von diesen.
Zu den erfindungsgemäß einsetzbaren anionischen Tensiden zählen aliphatische Sulfate wie Fettalkoholsulfate, Fettalkoholethersulfate, Dialkylethersulfate, Monoglyceridsulfate und aliphatische Sulfonate wie Alkansulfonate, α-Olefinsulfonate, Ethersulfonate, n-Alkylethersulfonate, sulfonierte Fettsäuren, Estersulfonate und Ligninsulfonate. Ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind Alkylbenzolsulfonate, Fettsäuresalze (Seifen), Fettsäurecyanamide, Sulfosuccinate (Sulfobernsteinsäuremono- und -dialkylester), Sulfosuccinamate, Sulfosuccinamide, Carbonsäureamidethersulfate, Alkylpolyglykolethercarboxylate, Fettsäureisethionate, Acylaminoalkansulfonate (Fettsäuretau ride, N-Acyltauride), Fettsäuresarcosinate, Ethercarbonsäuren und Alkyl(ether)phosphate sowie α-Sulfofettsäuresalze, Acylglutamate, Monoglyceriddisulfate und Alkylether des Glycerindisulfats, und schließlich deren Mischungen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung stehen Fettsäuren bzw. Fettalkohole bzw. deren Derivate - soweit nicht anders angegeben - stellvertretend für verzweigte oder unverzweigte Carbonsäuren bzw. Alkohole bzw. deren Derivate mit vorzugsweise 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, insbesondere 8 bis 20 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt 10 bis 18 Kohlenstoffatomen, äußerst bevorzugt 12 bis 16 Kohlenstoffatomen, beispielsweise 12 bis 14 Kohlenstoffatomen. Die Fettsäuren/-alkohole bzw. ihre Derivate mit gerader Anzahl Kohlenstoffatome sind insbesondere wegen ihrer pflanzlicher Basis als auf nachwachsenden Rohstoffen basierend aus ökologischen Gründen bevorzugt, ohne jedoch die erfindungsgemäße Lehre auf sie zu beschränken. Insbesondere sind auch die beispielsweise nach der RoELENschen Oxo-Synthese erhältlichen Oxo-Alkohole bzw. deren Derivate mit vorzugsweise 7 bis 19 Kohlenstoffatomen, insbesondere 9 bis 19 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt 9 bis 17 Kohlenstoffatomen, äußerst bevorzugt 11 bis 15 Kohlenstoffatomen, beispielsweise 9 bis 11 , 12 bis 15 oder 13 bis 15 Kohlenstoffatomen, entsprechend einsetzbar.
Sie werden in Form ihrer Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze, insbesondere Natrium-, Kalium- und Magnesiumsalze, wie auch Ammonium- und Mono-, Di-, Tri- bzw.
Tetraalkylammoniumsalze sowie im Falle der Sulfonate auch in Form ihrer korrespondierenden Säure, z.B. Dodecylbenzolsulfonsäure, eingesetzt. Die Alkylethersulfate enthalten herstellungsbedingt vor allem bei niederen Ethoxylierungsgraden immer auch Restgehalte nichtalkoxylierter Fettalkoholsulfate. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Mittel auch Seifen, d.h. Alkali- oder Ammoniumsalze gesättigter oder ungesättigter C6-C22-Fettsäuren, enthalten.
Bevorzugt werden die anionischen Tenside ausgewählt aus der Gruppe umfassend Fettalkoholsulfate in Mengen von bis zu 5 Gew.-%, Alkylbenzolsulfonate in Mengen von bis zu 7,5 Gew.-% und Seifen in Mengen von bis zu 2 Gew.-%, jeweils bezogen auf die Gesamtzusammensetzung, sowie Gemische derselben.
Geeignete nichtionische Tenside sind beispielsweise Cβ-C-iβ-
Alkylalkoholpolyglykolether, Alkylpolyglykoside sowie stickstoffhaltige Tenside bzw. Mischungen davon, insbesondere der ersten beiden.
Cβ-Ciβ-Alkylalkoholpolypropylenglykol/polyethylenglykolether können durch die Formel R10-(CH2CH(CH3)0)p(CH2CH20)e-H
beschrieben werden, in der R1 für einen linearen oder verzweigten, aliphatischen Alkyl- und/oder Alkenylrest mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, p für 0 oder Zahlen von 1 bis 3 und e für Zahlen von 1 bis 20 steht. Sie werden durch Anlagerung von Propylenoxid und/oder Ethylenoxid an Alkylalkohole, vorzugsweise an Fettalkohole, erhalten. Weiterhin können auch endgruppenverschlossene C8-Ci8-Alkylalkoholpolyglykolether eingesetzt werden, d.h. Alkylalkoholpolyalkylenglykolether gemäß obiger Formel, in denen die freie OH-Gruppe verethert ist.
Erfindungsgemäße Reiniger können Alkylalkoholpolyglykolether in Mengen von 0,1 bis 4 Gew.-% enthalten, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung.
Bevorzugte nichtionische Tenside sind weiterhin Alkylpolyglykoside (APG) der Formel
R20[G]x, in der R2 für einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten Alkylrest mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen, [G] für einen glykosidisch verknüpften Zuckerrest und x für eine Zahl von 1 bis 10 stehen. Die Indexzahl x gibt den Oligomerisierungsgrad (DP-
Grad) an, d.h. die Verteilung von Mono- und Oligoglykosiden. Während x in einer gegebenen Verbindung stets ganzzahlig sein muß und hier vor allem d ie Werte x = 1 bis 6 annehmen kann, ist der Wert x für ein bestimmtes Alkylglykosid eine analytisch ermittelte rechnerische Größe, die meistens eine gebrochene Zahl darstellt. Vorzugsweise werden Alkylglykoside mit einem mittleren Oligomerisierungsgrad x von
1.1 bis 3,0 eingesetzt. Aus anwendungstechnischer Sicht sind solche Alkylglykoside bevorzugt, deren Oligomerisierungsgrad kleiner als 1 ,7 ist und insbesondere zwischen
1.2 und 1 ,6 liegt. Als glykosidischer Zucker wird vorzugsweise Xylose, insbesondere aber Glucose verwendet. Der Alkyl- bzw. Alkenylrest R2 kann sich von primären Alkoholen mit 8 bis 18, vorzugsweise 8 bis 14 Kohlenstoffatomen ableiten. Typische Beispiele sind Capronalkohol, Caprylalkohol, Caprinalkohol und Undecylalkohol sowie deren technische Gemische, wie sie beispielsweise im Verlauf der Hydrierung von technischen Fettsäuremethylestern oder im Verlauf der Hydrierung von Aldehyden aus der RoELENschen Oxosynthese anfallen. Vorzugsweise leitet sich der Alkyl- bzw. Alkenylrest R2 aber von Laurylalkohol, Myristylalkohol, Cetylalkohol, Palmoleylalkohol, Stearylalkohol, Isostearylalkohol oder Oleylalkohol ab. Weiterhin sind Elaidylalkohol, Petroselinylalkohol, Arachidylalkohol, Gadoleylalkohol, Behenylalkohol, Erucylalkohol sowie deren technische Gemische zu nennen.
Alkylpolyglykoside können in erfindungsgemäßen Reinigern in Mengen von 0,1 bis 6 Gew.-% enthalten sein, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung.
Als weitere nichtionische Tenside können stickstoffenthaltende Tenside enthalten sein, z.B. Fettsäurepolyhydroxyamide, beispielsweise Glucamide, und Ethoxylate von Alkyl- aminen, vicinalen Diolen und/oder Carbonsäureamiden, die Alkylgruppen mit 10 bis 22 C-Atomen, vorzugsweise 12 bis 18 C-Atomen, besitzen. Der Ethoxylieru ngsgrad dieser Verbindungen liegt dabei in der Regel zwischen 1 und 20, vorzugsweise zwischen 3 und 10. Bevorzugt sind Ethanolamid-Derivate von Alkansäuren mit 8 bis 22 C-Atomen, vorzugsweise 12 bis 16 C-Atomen. Zu den besonders geeigneten Verbindungen gehören die Laurinsäure-, Myristinsäure- und Palmitinsäuremonoethanolamide.
Zu den Amphotensiden (amphoteren Tensiden, zwitterionischen Tensiden), die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, zählen u.a. Betaine, Aminoxide, Alkylamido-
alkylamine, alkylsubstituierte Aminosäuren sowie acylierte Aminosäuren. Bevorzugte Amphotenside sind dabei beispielsweise Betaine der Formel
(R3)(R4)(R5)N+CH2COO-,
in der R3 einen gegebenenfalls durch Heteroatome oder Heteroatomgruppen unterbrochenen Alkylrest mit 8 bis 25, vorzugsweise 10 bis 21 Kohlenstoffatomen und R4 sowie R5 gleichartige oder verschiedene Alkylreste mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeuten, insbesondere Cio-Cis-Alkyl-dimethylcarboxymethylbetain und Cn-Cι7- Alkyamidopropyl-dimethylcarboxymethylbetain.
Sollten Kationtenside in der Zusammensetzung enthalten sein, so sind dies bevorzugt die quartären Ammoniumverbindungen der Formel
(R6)(R7)(R8)(R9)N+ X",
in der R6 bis R9 für vier gleich- oder verschiedenartige, insbesondere zwei lang- und zwei kurzkettige, Alkylreste und X" für ein Anion, insbesondere ein Halogenidion, stehen, beispielsweise Didecyl-dimethyl-ammoniumchlorid, Alkyl-benzyl-didecyl- ammoniumchlorid und deren Mischungen. Vorzugsweise ist die Reinigungsmittelzusammensetzung jedoch frei von kationischen Tensiden.
Bei der Wahl der geeigneten Tenside ist darauf zu achten, daß sie mit den eingesetzten Enzymen kompatibel sind. Bevorzugt wird die Enzymaktivität während einer typischen mittleren Einwirkzeit von 15 Minuten um nicht mehr als 50% gesenkt, insbesondere um nicht mehr als 30%. So haben Versuche ergeben, daß das als denaturierend bekannte Natriumdodecylsulfat (SDS) die Aktivität der Corolase bereits in einer Konzentration von 1% innerhalb von 15 Minuten auf unter 30% absenkt, während die Aktivität der Xylanase schon mit nur 0,1% SDS auf weniger als 40% sinkt, so daß dieses Tensid für den Einsatz in erfindungsgemäßen Reinigungsmittel nicht bevorzugt ist. Soll dieses oder ein ähnlich wirkendes Tensid dennoch eingesetzt werden, so ist vorzugsweise auf eine räumliche Trennung während der Lagerung zu achten, beispielsweise durch Verkapselung der Enzyme oder durch den Einsatz einer Mehrkammerflasche, so daß Enzyme und Tenside erst unmittelbar vor bzw. während der Anwendung miteinander in
Kontakt kommen. Alkylpolyglykoside sind dagegen gut für den Einsatz in enzymhaltigen Mitteln gemäß dieser Erfindung geeignet. So bleibt die Aktivität der Corolase auch mit 3% APG 600 noch deutlich über 50%, die Xylanase erfährt durch den Zusatz von APG 600 sogar zunächst eine Aktivitätssteigerung (über 150% Aktivität mit 0,1% Tensid) und weist mit 3% APG immer noch über 80% Aktivität auf.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Mittel Builder enthalten. Geeignete Builder sind beispielsweise Alkalimetallgluconate, -citrate, -nitrilotriacetate, -carbonate und - bicarbonate, insbesondere Natriumgluconat, -citrat und -nitrilotriacetat sowie Matrium- und Kaliumcarbonat und -bicarbonat, sowie Alkalimetall- und Erdalkalimetallhydroxide, insbesondere Natrium- und Kaliumhydroxid, Ammoniak und Amine, insbesondere Mono- und Triethanolamin, bzw. deren Mischungen. Hierzu zählen auch die Salze der Glutarsäure, Bernsteinsäure, Adipinsäure, Weinsäure und Benzolhexacarbonsäure sowie Phosphonate und Phosphate. Die Mittel können Builder in Mengen, bezogen auf die Zusammensetzung, von 0,1 bis 5 Gew.-% enthalten.
Des weiteren können die erfindungsgemäßen Mittel Säuren und/ oder Alkalien enthalten. Diese dienen einerseits als pH-Regulatoren, andererseits können die Säuren aber auch zur Entfernung von Kalkflecken von den zu reinigenden Oberflächen beitragen. Bei den erfindungsgemäß einsetzbaren Säuren kann es sich um anorganische Mineralsäuren, beispielsweise Salzsäure, und/oder um C1.-6- Mono-, Di-, Tri- oder Polycarbonsäuren oder -hydroxycarbonsäuren wie beispielsweise Ameisensäure, Essigsäure, Milchsäure, Citronensäure, Gluconsäure, Glutarsäure, Bernsteinsäure, Adipinsäure, Weinsäure oder auch Äpfelsäure sowie um weitere organische Säuren wie etwa Salicylsäure oder Amidosulfonsäure handeln. Besonders bevorzugt wird jedoch die Citronensäure eingesetzt; auch Mischungen aus mehreren Säuren können verwendet werden. Säuren können im erfindungsgemäßen Reinigungsmittel in Mengen von bis zu 6 Gew.-% enthalten sein, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung.
Zu den gegebenenfalls einsetzbaren Basen zählen Alkanolamine, beispielsweise Mono- oder Diethanolamin, sowie Ammonium- oder Alkalimetallhydroxide, vor allem Natriumhydroxid. Das erfindungsgemäße Reinigungsmittel kann Basen in Mengen von bis zu 2,5 Gew.-% enthalten, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung.
Das erfindungsgemäße Mittel kann weiterhin zur Viskositätsregulierung einen oder mehrere Verdicker enthalten. Als Verdickungsmittel geeignet sind dabei natürliche und synthetische Polymere sowie anorganische Verdickungsmittel. Zu den einsetzbaren Polymeren zählen Polysaccharide bzw. Heteropolysaccharide und andere organische natürliche Verdickungsmittel, darunter die Polysaccharidgummen wie Gummi arabicum, Agar, Alginate, Carrageene und ihre Salze, Guar, Guaran, Tragant, Gellan, Ramsan, Dextran oder Xanthan und ihre Derivate, z.B. propoxyliertes Guar, sowie ihre Mischungen, weiterhin auch Pektine, Polyosen, Johannisbrotbaumkernmehl, Stärke, Dextrine, Gelatine, Casein. Weiterhin können organische abgewandelte Naturstoffe wie Carboxymethylcellulose und -Celluloseether, Hydroxyethyl- und -propylcellulose und dgl. oder Celluloseacetat sowie Kemmehlether eingesetzt werden. Als organische vollsynthetische Verdickungsmittel können homo- und copolymere Polycarboxylate, vor allem Polyacryl- und Polymethacryl-Verbindungen sowie Vinylpolymere, Polycarbonsäuren, Polyether, Polyimine oder auch Polyamide dienen. Zu den einsetzbaren anorganischen Verdickungsmitteln zählen Polykieselsäuren, Tonmineralien wie Montmorillonite, Zeolithe, Kieselsäure sowie verschiedene nanopartikuläre anorganische Verbindungen wie nanopartikuläre Metalloxide, - oxidhydrate, -hydroxide, -carbonate und -phosphate sowie Silicate mit einer mittleren Teilchengröße von 1 bis 200 nm, bezogen auf den Teilchendurchmesser in der Längsrichtung, d.h. in der Richtung der größten Ausdehnung der Teilchen. Diese nano- partikulären Stoffen können optional in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung mit einem oder mehreren Oberflächenmodifikationsmitteln behandelt sein. Die Oberflächenmodifikation erfolgt in dem Fachmann bekannter Weise mit ein- und mehrbasischen C2.8-Carbonsäuren oder -Hydroxycarbonsäuren, funktionellen Silanen des Typs (OR)4-nSiRn (R = org. Reste mit funktioneilen Gruppen wie Hydroxy, Carboxy, Ester, Amin, Epoxy, etc.), quartären Ammoniumverbindungen oder Aminosäuren sowie weiteren hierzu einsetzbaren Stoffen.
Neben den bisher genannten Verdickungsmitteln kann das erfindungsgemäße Reinigungsmittel Elektrolytsalze enthalten. Diese können ebenfalls zu einer Viskositätserhöhung beitragen. Elektrolytsalze im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Salze, die in dem erfindungsgemäßen wäßrigen Mittel in ihre ionischen Bestandteile zerfallen. Bevorzugt sind die Salze, insbesondere Alkalimetall- und/oder Erdalkalimetallsalze,
einer anorganischen Säure, vorzugsweise einer anorganischen Säure aus der Gruppe, umfassend die Halogenwasserstoffsäuren, Salpetersäure und Schwefelsäure, insbesondere die Chloride und Sulfate. Im Rahmen der erfindungsgemäßen Lehre kann ein Elektrolytsalz auch in Form seines korrespondierenden Säure/Base-Paares eingesetzt werden, beispielsweise Salzsäure und Natriumhydroxid anstatt Natriumchlorid.
Im erfindungsgemäßen Mittel können organische und/oder anorganische Verdicker in Mengen von insgesamt bis zu 2 Gew.-%, eingesetzt werden, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung.
Das erfindungsgemäße Mittel kann vorteilhafterweise zusätzlich ein oder mehrere wasserlösliche organische Lösungsmittel enthalten, üblicherweise in einer Menge von bis zu 6 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung. Das Lösungsmittel wird im Rahmen der erfindungsgemäßen Lehre nach Bedarf insbesondere als Hydrotropikum, Viskositätsregulator und/oder Kältestabilisator eingesetzt. Es wirkt lösungsvermittelnd insbesondere für Tenside und Elektrolyt sowie Parfüm und Farbstoff und trägt so zu deren Einarbeitung bei, verhindert die Ausbildung flüssigkristalliner Phasen und hat Anteil an der Bildung klarer Produkte. Die Viskosität des erfindungsgemäßen Mittels verringert sich mit zunehmender Lösungsmittelmenge. Zuviel Lösungsmittel kann jedoch einen zu starken Viskositätsabfall bewirken. Schließlich sinkt mit zunehmender Lösungsmittelmenge der Kältetrübungs- und Klarpunkt des erfindungsgemäßen Mittels.
Geeignete Lösungsmittel sind beispielsweise gesättigte oder ungesättigte, vorzugsweise gesättigte, verzweigte oder unverzweigte C1-2o-Kohlenwasserstoffe, bevorzugt C2-i5-Kohlenwasserstoffe, mit mindestens einer Hydroxygruppe und gegebenenfalls einer oder mehreren Etherfunktionen C-O-C, d.h. die Kohlenstoffatomkette unterbrechenden Sauerstoffatomen. Bevorzugte Lösungsmittel sind jedoch die - gegebenenfalls einseitig mit einem Cι-6-Alkanol veretherten - C2.6- Alkylenglykole und Poly-C2.3-alkylenglykolether mit durchschnittlich 1 bis 9 gleichen oder verschiedenen, vorzugsweise gleichen, Alkylenglykolgruppen pro Molekül, z.B. Ethylenglykol, Propylenglykol, Butylenglycol, Diethylenglycol, Dimethoxydiglycol, Dipropylenglycol, Propylengiycolbutylether, Propylenglycolpropylether,
Dipropylenglykolmonomethylether sowie PEG. Weitere bevorzugte Lösungsmittel sind die Cι-6-Alkohole, wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, t-Butanol usw., besonders bevorzugt wird Ethanol und/oder Isopropanol eingesetzt.
Als Lösungsvermittler können außer den zuvor beschriebenen Lösungsmitteln beispielsweise auch Alkanolamine sowie Alkylbenzolsulfonate mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen im Alkylrest, z.B. Xylol- oder Cumolsulfonat eingesetzt werden. Weitere einsetzbare Hydrotrope sind z.B. Octylsulfat oder Butylglucosid. Das erfindungsgemäße Mittel kann diese Hydrotrope in Mengen von, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung, bis zu 4 Gew.-% enthalten.
In einer Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Mittel Abrasivstoffe enthalten. Als Abrasivkomponente können hierbei feste wasserlösliche und wasserunlösliche, vorzugsweise anorganische Verbindungen und Gemische derselben dienen. Hierzu gehören beispielsweise Alkalicarbonate, Alkalibicarbonate und Alkalisulfate, Alkaliborate, Alkaliphosphate, Siliciumdioxid, kristalline oder amorphe Alkalisilikate und Schichtsilikate, feinkristalline Natriumaluminiumsilikate und Caiciumcarbonat. Der Vorteil wasserlöslicher Abrasivkomponenten besteht in einer praktisch rückstandsfreien Abspülbarkeit des Mittels. Neben diesen anorganischen Stoffen können auch aus der belebten Natur gewonnene Abrasiva, beispielsweise zerkleinerte Nußschalen oder Hölzer, sowie abriebfeste Kunststoffe, beispielsweise Polyethylenperlen, oder auch Keramik- oder Glaskügelchen Verwendung finden. Das erfindungsgemäße Reinigungsmittel kann Abrasivstoffe in Mengen von bis zu 2 Gew.-% enthalten, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung.
Neben den genannten Komponenten können die erfindungsgemäßen Mittel einen oder mehrere weitere Hilfs- und Zusatzstoffe enthalten, wie sie vor allem in Reinigungsmitteln für harte Oberflächen üblich sind. Hierzu zählen insbesondere UV- Stabilisatoren, Korrosionsinhibitoren, Reinigungsverstärker, Antistatika, Konservierungsmittel (z.B. 2-Brom-2-nitropropan-1 ,3-diol oder eine Isothiazolinon- Bromnitropropandiol-Zubereitung), Parfüm, Farbstoffe, Perlglanzmittel (beispielsweise Glykoldistearat) sowie Trübungsmittel oder auch Hautschutzmittel, wie sie beispielsweise in EP 522 506 beschrieben sind. Die Menge an derartigen Zusätzen liegt üblicherweise nicht über 12 Gew.-% im Reinigungsmittel. Die Untergrenze des
Einsatzes hängt von der Art des Zusatzstoffes ab und kann beispielsweise bei Farbstoffen bis zu 0,001 Gew.-% und darunter betragen. Vorzugsweise liegt die Menge an Hilfsstoffen zwischen 0,01 und 7 Gew.-%, insbesondere 0,1 und 4 Gew.-%.
Als Farbstoffe können sämtliche in Haushaltsreinigungsmitteln üblicherweise eingesetzten Farbstoffe verwendet werden. Auch bei den Duftstoffen können sämtliche übliche Parfüms zum Einsatz kommen. Bevorzugt sind dabei fruchtige Düfte, beispielsweise Citrus, ferner Pine (Fichte) und Minze sowie blumige Düfte. Konservierungsmittel besitzen eine biozide Wirkung, so daß es wünschenswert ist, in erfindungsgemäßen Reinigungsmitteln nur geringe Konzentrationen, vorzugsweise aber gar keine Konservierungsmittel einzusetzen.
Es ist von Vorteil, wenn das Mittel keine Komplexbildner enthält; der Zusatz eines Bleichmittels zum erfindungsgemäßen Reinigungsmittel ist nicht erforderlich.
Der pH-Wert der erfindungsgemäßen Mittel liegt vorzugsweise zwischen 1 und 7,5, besonders bevorzugt zwischen 2 und 5, insbesondere zwischen 2,5 und 4,5. Dabei ist bei mehrphasigen Mitteln unter dem pH-Wert des Mittels der pH-Wert der nach dem Aufschütteln entstandenen temporären Emulsion zu verstehen, bei Mitteln, die in Mehrkammerflaschen angeboten werden, ist der pH-Wert des Mittels der pH-Wert der aus der gemeinsamen bestimmungsgemäßen Dosierung der in den verschiedenen Kammern gelagerten Komponenten erhaltenen Lösung. Es ist also jeweils der pH-Wert der gebrauchsfertigen Reinigungslösung gemeint.
Sofern es sich um ein flüssiges Mittel handelt, besitzt dieses vorzugsweise eine Viskosität von bis zu 1000 mPas. Gelförmige oder pastöse Reinigungsmittel können demgegenüber Viskositäten von bis zu 150000 mPas haben. Die Viskositätsmessungen erfolgen bei 20°C im Brookfield-Viskosimeter LVDV II mit einer Rotorfrequenz von 20 U/min (Spindel Nr. 31 , Konz. 100%).
Das Reinigungsmittel kann ein oder mehrere Treibmittel (INCI Propellants), üblicherweise in einer Menge von 1 bis 80 Gew.-%, vorzugsweise 1,5 bis 30 Gew.-%, insbesondere 2 bis 10 Gew.-%, besonders bevorzugt 2,5 bis 8 Gew.-%, äußerst bevorzugt 3 bis 6 Gew.-%, enthalten.
Treibmittel sind erfindungsgemäß üblicherweise Treibgase, insbesondere verflüssigte oder komprimierte Gase. Die Wahl richtet sich nach dem zu versprühenden Produkt und dem Einsatzgebiet. Bei der Verwendung von komprimierten Gasen wie Stickstoff, Kohlendioxid oder Distickstoffoxid, die im allgemeinen in dem flüssigen Reinigungsmittel unlöslich sind, sinkt der Betriebsdruck mit jeder Ventilbetätigung. Im Reinigungsmittel lösliche oder selbst als Lösungsmittel wirkende verflüssigte Gase (Flüssiggase) als Treibmittel bieten den Vorteil gleichbleibenden Betriebsdrucks und gleichmäßiger Verteilung, denn an der Luft verdampft das Treibmittel und nimmt dabei ein mehrhundertfaches Volumen ein.
Geeignet sind demgemäß folgende gemäß INCI bezeichnete Treibmittel: Butane, Carbon Dioxide, Dimethyl Carbonate, Dimethyl Ether, Ethane, Hydrochlorofluorocarbon 22, Hydrochlorofluorocarbon 142b, Hydrofluorocarbon 152a, Hydrofluorocarbon 134a, Hydrofluorocarbon 227ea, Isobutane, Isopentane, Nitrogen, Nitrous Oxide, Pentane, Propane.
Auf Chlorfluorkohlenstoffe (Fluorchlorkohlenwasserstoffe, FCKW) als Treibmittel wird jedoch wegen ihrer schädlichen Wirkung auf den - vor harter UV-Strahlung schützenden - Ozon-Schild der Atmosphäre, die sogenannte Ozon-Schicht, vorzugsweise weitgehend und insbesondere vollständig verzichtet.
Bevorzugte Treibmittel sind Flüssiggase. Flüssiggase sind Gase, die bei meist schon geringen Drücken und 20°C vom gasförmigen in den flüssigen Zustand übergeführt werden können. Insbesondere werden unter Flüssiggasen jedoch die - in Ölraffinerien als Nebenprodukte bei Destillation und Kracken von Erdöl sowie in der Erdgas- Aufbereitung bei der Benzinabscheidung anfallenden - Kohlenwasserstoffe Propan, Propen, Butan, Buten, Isobutan (2-Methylpropan), Isobuten (2-Methylpropen, Isobutylen) und deren Gemische verstanden.
Besonders bevorzugt enthält das Reinigungsmittel als ein oder mehrere Treibmittel Propan, Butan und/oder Isobutan, insbesondere Propan und Butan, äußerst bevorzugt Propan, Butan und Isobutan.
Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflegemittel
Die erfindungsgemäßen Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflegemittel können beispielsweise als Mundwasser, Gel, flüssige Zahnputzlotion, steife Zahnpaste, Kaugummi, Gebissreiniger oder Prothesenhaftcreme vorliegen.
Hierzu ist es erforderlich, die erfindungsgemäßen Hybridenzyme in einen geeigneten Träger einzuarbeiten.
Als Träger können z.B. auch pulverförmige Zubereitungen oder wässrig-alkoholische Lösungen dienen, die als Mundwässer 0 bis 15 Gew.-% Ethanol, 1 bis 1 ,5 Gew.-% Aromaöle und 0,01 bis 0,5 Gew.-% Süßstoffe oder als Mundwasser-Konzentrate 15 bis 60 Gew.-% Ethanol, 0,05 bis 5 Gew.-% Aromaöle, 0,1 bis 3 Gew.-% Süßstoffe sowie ggf. weitere Hilfsstoffe enthalten können und vor Gebrauch mit Wasser verdünnt werden. Die Konzentration der Komponenten muss dabei so hoch gewählt werden, dass nach Verdünnung die genannten Konzentrationsuntergrenzen bei der Anwendung nicht unterschritten werden.
Als Träger können aber auch Gele sowie mehr oder weniger fließfähige Pasten dienen, die aus flexiblen Kunststoffbehältern oder Tuben ausgedrückt und mit Hilfe einer Zahnbürste auf die Zähne aufgetragen werden. Solche Produkte enthalten höhere Mengen an Feuchthaltemitteln und Bindemitteln oder Konsistenzreglern und Polierkomponenten. Darüber hinaus sind auch in diesen Zubereitungen Aromaöle, Süßstoffe und Wasser enthalten.
Als Feuchthaltemittel können dabei z.B. Glycerin, Sorbit, Xylit, Propylenglykole, Polyethenylenglycole oder Gemische dieser Polyole, insbesondere solche Polyethenylenglycole mit Molekulargewichten von 200 bis 800 (von 400 - 2000 ) verwendet werden enthalten sein. Bevorzugt ist als Feuchthaltemittel Sorbit in einer Menge von 25 - 40 Gew.-% enthalten.
Als Antizahnstein-Wirkstoffe und als Demineralisierungs-Inhibitoren können kondensierten Phosphate in Form ihrer Alkalisalze, bevorzugt in Form ihrer Natriumoder Kaliumsalze enthalten sein. Die wäßrigen Lösungen dieser Phosphate reagieren aufgrund hydrolytischer Effekte alkalisch. Durch Säurezusatz wird der pH-Wert der
erfindungsgemäßen Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflegemittel auf die bevorzugten Werte von 7,5 - 9 eingestellt.
Es können auch Gemische verschiedener kondensierter Phosphate oder auch hydratisierte Salze der kondensierten Phosphate eingesetzt werden. Die spezifizierten Mengen von 2 - 12 Gew.-% beziehen sich jedoch auf die wasserfreien Salze. Bevorzugt ist als kondensiertes Phosphat ein Natrium- oder Kalium-tripolyphosphat in einer Menge von 5 - 10 Gew.-% der Zusammensetzung enthalten.
Ein bevorzugt enthaltener Wirkstoff ist eine karieshemmende Fluorverbindung, bevorzugt aus der Gruppe der Fluoride oder Monofluorophosphate in einer Menge von 0,1 - 0,5 Gew.-% Fluor. Geeignete Fluorverbindungen sind z.B. Natriummonofluorophosphat (Na2P03F), Kaliummonofluorophosphat, Natrium- oder Kaliumfluorid, Zinnfluorid oder das Fluorid einer organischen Aminoverbindung.
Als Bindemittel und Konsistenzregler dienen z.B. natürliche und synthetische wasserlösliche Polymere wie Carragheen, Traganth, Guar, Stärke und deren nichtionogene Derivate wie z.B. Hydroxypropylguar, Hydroxyethylstärke, Celluloseether wie z.B. Hydroxyethylcellulose oder Methylhydroxypropylcellulose. Auch Agar-Agar, Xanthan-Gum, Pektine, wasserlösliche Carboxyvinylpolymere (z.B. Carbopol®-Typen), Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, höhermolekulare Polyethylenglykole (Molekulargewicht 103 bis 106 D). Weitere Stoffe, die sich zur Viskositätskontrolle eignen, sind Schichtsilikare wie z.B. Montmorillonit-Tone, kolloidale Verdickungskieselsäuren, z.B. Aerogel-Kieselsäure oder pyrogene Kieselsäuren.
Als Polierkomponenten können alle hierfür bekannten Poliermittel, bevorzugt aber Fällungs- und Gelkieselsäuren, Aluminiumhydroxid, Aluminiumsilicat, Aluminiumoxid, Aluminiumoxidtrihydrat, unlösliches Natriummetaphosphat, Calciumpyrophosphat, Calciumhydrogenphosphat, Dicalciumphosphat, Kreide, Hydroxylapatit, Hydrotalcite, Talkum, Magnesiumaluminiumsilicat (Veegum®), Calciumsuifat, Magnesiumcarbonat, Magnesiumoxid, Natriumaluminiumsilikate, z.B. Zeolith A oder organische Polymere, z.B. Polymethacrylat, eingesetzt werden. Die Poliermittel werden vorzugsweise in kleineren Mengen von z.B. 1 - 10 Gew.-% verwendet.
Die erfindungsgemäßen Zahn- und/oder Mundpflegeprodukte können durch Zugabe von Aromaölen und Süßungsmitteln in ihren organoleptischen Eigenschaften verbessert werden. Als Aromaöle kommen alle für Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflegemittel gebräuchlichen natürlichen und synthetischen Aromen in Frage. Natürliche Aromen können sowohl in Form der aus den Drogen isolierten etherischen Öle als auch der aus diesen isolierten Einzelkomponenten verwendet werden. Bevorzugt sollte wenigstens ein Aromaöl aus der Gruppe Pfefferminzöl, Krauseminzöl, Anisöl, Kümmelöl, Eukalyptusöl, Fenchelöl, Zimtöl, Geraniumöl, Salbeiöl, Thymianöl, Majoranöl, Basilikumöl, Citrusöl, Gaultheriaöl oder eine oder mehrere daraus isolierte synthetisch erzeugten Komponenten dieser Öle enthalten sein. Die wichtigsten Komponenten der genannten Öle sind z.B. Menthol, Carvon, Anethol, Cineol, Eugenol, Zimtaldehyd, Geraniol, Citronellol, Linalool, Salven, Thymol, Terpinen, Terpinol, Methylchavicol und Methylsalicylat. Weitere geeignete Aromen sind z.B. Menthylacetat, Vanillin, Jonone, Linalylacetat, Rhodinol und Piperiton. Als Süßungsmittel eignen sich entweder natürliche Zucker wie Sucrose, Maltose, Lactose und Fructose oder synthetische Süßstoffe wie z.B. Saccharin-Natriumsalz, Na- triumcyclamat oder Aspartam.
Als Tenside sind dabei insbesondere Alkyl- und/oder Alkenyl-(oligo)-glycoside einsetzbar. Ihre Herstellung und Verwendung als oberflächenaktive Stoffe sind beispielsweise aus US-A-3 839 318, US-A-3 707 535, US-A-3 547 828 DE-A- 19 43 689, DE-A-20 36 472 und DE-A-30 01 064 sowie EP-A-77 167 bekannt. Bezüglich des Glycosidrestes gilt, daß sowohl Monoglycoside (x = 1), bei denen ein Pentose- oder Hexoserest glycosidisch an einen primären Alkohol mit 4 bis 16 C- Atomen gebunden ist, als auch oligomere Glycoside mit einem Oligomerisationsgrad x bis 10 geeignet sind. Der Oligomerisationsgrad ist dabei ein statistischer Mittelwert, dem eine für solche technischen Produkte übliche Homologenverteilung zugrunde liegt.
Bevorzugt eignet sich als Alkyl- und/oder Alkenyl-(oligo)-glycosid ein Alkyl- und/oder Alkenyl-(oligo)-glucosid der Formel RO(C6HιoO)x-H, in der R eine Alkyl- und/oder Alkenyl-gruppe mit 8 bis 14 C-Atomen ist und x einen Mittelwert von 1 bis 4 hat. Besonders bevorzugt sind Alkyloligoglucoside auf Basis von gehärtetem Cι2/i4-Kokosal- kohol mit einem DP von 1 bis 3. Das Alkyl- und/oder Alkenyl-glycosid-Tensid kann sehr
sparsam verwendet werden, wobei bereits Mengen von 0,005 bis 1 Gew.-% ausreichend sind.
Außer den genannten Alkylglucosid-Tensiden können auch andere nichtionische, ampholytische und kationische Tenside enthalten sein, als da beispielsweise sind: Fettalkoholpolyglycolethersulfate, Monoglyceridsulfate, Monoglyceridethersulfate, Mono- und/oder Dialkylsulfosuccinate, Fettsäureisethionate, Fettsäuresarcosinate, Fettsäuretauride, Fettsäureglutamate, Ethercarbonsäuren, Fettsäureglucamide, Al- kylamido-betaine und/oder Proteinfettsäurekondensate, letztere vorzugsweise auf Basis von Weizenproteinen. Insbesondere zur Solubilisierung der meist wasserunlöslichen Aromaöle kann ein nichtionogener Lösungsvermittler aus der Gruppe der oberflächenaktiven Verbindungen erforderlich sein. Besonders geeignet für diesen Zweck sind z.B. oxethylierte Fettsäureglyceride, oxethylierte
Fettsäuresorbitanpartialester oder Fettsäurepartialester von Glycerin- oder Sorbitan- Oxethylaten. Lösungsvermittler aus der Gruppe der oxethylierten Fettsäureglyceride umfassen vor allem Anlagerungsprodukte von 20 bis 60 Mol Ethylenoxid an Mono- und Diglyceride von linearen Fettsäuren mit 12 bis 18 C-Atomen oder an Triglyceride von Hydroxyfettsäuren wie Oxystearinsäure oder Ricinolsäure. Weitere geeignete Lösungsvermittler sind oxethylierte Fettsäuresorbitanpartialester; das sind bevorzugt Anlagerungsprodukte von 20 bis 60 Mol Ethylenoxid an Sorbitanmonoester und Sorbitandiester von Fettsäuren mit 12 bis 18 C-Atomen. Ebenfalls geeignete Lösungsvermittler sind Fettsäurepartialester von Glycerin- oder Sorbitan-Oxethylaten; das sind bevorzugt Mono- und Diester von Cι2-Cι8-Fettsäuren und Anlagerungsprodukten von 20 bis 60 Mol Ethylenoxid an 1 Mol Glycerin oder an 1 Mol Sorbit.
Die erfindungsgemäßen Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflegemittel enthalten bevorzugt als Lösungsvermittler für gegebenenfalls enthaltene Aromaöle Anlagerungsprodukte von 20 bis 60 Mol Ethylenoxid an gehärtetes oder ungehärtetes Rizinusöl (d.h. an Oxystearinsäure- oder Ricinolsäure-triglycerid), an Glyzerin-mono- und/oder -distearat oder an Sorbitanmono- und/oder -distearat.
Weitere übliche Zusätze für die Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflege mittel sind z.B.
Pigmente, z.B. Titandioxid, und/oder Farbstoffe pH-Stellmittel und Puffersubstanzen wie z.B. Natriumbicarbonat, Natriumeitrat, Natriumbenzoat, Zitronensäure, Phosphorsäure oder saure Salze, z.B. NaH2P04 wundheilende und entzündungshemmende Stoffe wie z.B. Allantoin, Harnstoff, Panthenol, Azulen bzw. Kamillenextrakt weitere gegen Zahnstein wirksame Stoffe wie z.B. Organophosphonate, z.B. Hydroxyethandiphosphonate oder Azacycloheptandiphosphonat Konservierungsstoffe wie z.B. Sorbinsäure-Salze, p-Hydroxybenzoesäure-Ester. Plaque-Inhibitoren wie z.B. Hexachlorophen, Chlorhexidin, Hexetidin, Triclosan, Bromchlorophen, Phenylsalicylsäureester.
In einer besonderen Ausführungsform ist die Zusammensetzung eine Mundspülung, ein Mundwasser, ein Prothesenreiniger oder ein Prothesenhaftmittel.
Für erfindungsgemäß bevorzugten Prothesenreiniger, insbesondere
Prothesenreinigungstabletten und -pulver, eignen sich neben den schon genannten Inhaltsstoffen für die Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflege zusätzlich noch PerVerbindungen wie beispielsweise Peroxoborat, Peroxomonosulfat oder Percarbonat. Sie haben den Vorteil, dass sie neben der Bleichwirkung gleichzeitig auch desodorierend und/oder desinfizierend wirken. Der Einsatz solcher Per-Verbindungen in Prothesenreinigern beträgt zwischen 0,01 und 10 Gew.-%, insbesondere zwischen 0,5 und 5 Gew.-%.
Als weitere Inhaltsstoffe sind auch Enzyme, wie z.B. Proteasen und Carbohydrase, zum Abbau von Proteinen und Kohlenhydraten geeignet. Der pH-Wert kann zwischen pH 4 und pH 12, insbesondere zwischen pH 5 und pH 11 liegen.
Für die Prothesenreinigungstabletten sind zusätzlich noch weitere Hilfsstoffe notwendig, wie beispielsweise Mittel, die einen sprudelnden Effekt hervorrufen, wie z.B. C02 freisetzende Stoffe wie Natriumhydrogencarbonat, Füllstoffe, z.B. Natriumsulfat oder Dextrose, Gleitmittel, z.B. Magnesiumstearat, Fließregulierungsmittel, wie beispielsweise kolloidales Siliziumdioxid und Granuliermittel, wie die bereits erwähnten hochmolekularen Polyethylenglykole oder Polyvinylpyrrolidon.
Prothesenhaftmittel können als Pulver, Cremes, Folien oder Flüssigkeiten angeboten werden und unterstützen die Haftung der Prothesen.
Als Wirkstoffe sind natürliche und synthetische Quellstoffe geeignet. Als natürliche Quellstoffe sind neben Alginaten auch Pflanzengummen, wie z.B. Gummi arabicum, Traganth und Karaya-Gummi sowie natürlicher Kautschuk aufzufassen. Insbesondere haben sich Alginate und synthetische Quellstoffe, wie z.B. Natriumcarboxymethylcellulose, hochmolekulare Ethylenoxid-Copolymere, Salze der Poly(vinyl-ether-co-maleinsäure) und Polyacrylamide.
Als Hilfsstoffe für pastöse und flüssige Produkte eignen sich besonders hydrophobe Grundlagen, insbesondere Kohlenwasserstoffe, wie beispielsweise Weißes Vaselin (DAB) oder Paraffinöl.
Abbildungen
Fig. 1 zeigt schematisch das DNA-Fragment der Glucanase (Glu), Fig. 5 zeigt die dazugehörigen DNA- und Protein-Sequenzen (SEQ ID NO: 3 und 4) (s. Beispiel 1 ).
Fig. 2 zeigt schematisch das DNA-Fragment des Hybridenzyms aus Glucanase und kleiner Bindedomäne (KBD), Fig. 6 zeigt die dazugehörigen DNA- und Protein- Sequenzen (SEQ ID NO: 7 und 8) (s. Beispiel 2).
Fig. 3 zeigt schematisch das DNA-Fragment des Hybridenzyms aus Glucanase und großer Bindedomäne (GBD), Fig. 7 zeigt die dazugehörigen DNA- und Protein- Sequenzen (SEQ ID NO: 12 und 13) (s. Beispiel 3).
Fig. 4 zeigt schematisch das DNA-Fragment des Hybridenzyms aus Glucanase und mittlerer Bindedomäne (MBD), Fig. 8 zeigt die dazugehörigen DNA- und Protein- Sequenzen (SEQ ID NO: 17 und 18) (s. Beispiel 4).
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1 :
Isolierung des ß-Glucanase-Gens (EC 3.2.1.6, X00754) aus B. subtilis
DNA wurde nach Standardmethoden mit dem DNeasy Kit (Qiagen) aus B. subtilis isoliert. Das Gen wurde in einer PCR-Reaktion (1x PCR-Puffer, Gibco; 0,2 mM je dNTP, Gibco; 1 ,5 mM MgCI2, Gibco; 2,5 U Taq-Polymerase, Gibco) mit den Primern GluBcl (5TGATCATGCCTTATCTGAAACGAG3') (SEQ ID NO: 1) und GluSac (5OAGCTCTTATTTTTTTGTATAGCGC3') (SEQ ID NO: 2) (beide jeweils 0,6 μM) in einem Thermocycler (Eppendorf) unter folgenden Bedingungen amplifiziert:
94 °C 5 Minuten
30 Zyklen:
94 °C 30 Sekunden
55 °C 30 Sekunden
72 °C 1 Minute 30 Sekunden abschließende Elongation:
72 °C 7 Minuten
Das Amplifikat wurde in den TA-Cloning Vektor (pGEM-Teasy, Promega) kloniert und in XLIBIue MRF' E. coli Zellen (Stratagene) transformiert (nach jeweiligen Herstellerangaben).
Für die Expression musste das isolierte Gen in ein Bacillus-Expressionssystem überführt werden. Das Plasmid wurde mittels des QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) aus einer Übernachtkultur der transformierten E. coli Zellen isoliert. Anschließend wurde das Gen mit den Restriktionsenzymen Bell und Sacl aus dem pGEM-Teasy Vektor geschnitten und in die entsprechenden Schnittstellen des Henkel-Bacillus- Expressionsvektor pAWA31 integriert. Die transformierten Bacillus subtilis Zellen waren vor der Transformation Glucanase defizient (Stamm MW10, Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, USA).
Beispiel 2:
Isolierung der ß-Glucanase (EC 3.2.1.6, X00754) aus B. subtilis unter Einbau der kleinen positiven Bindedomäne (KBD):
Die kleine Bindedomäne entspricht dem DNA-Bereich 238-276 Basenpaare aus dem sbsA Gen (X71092) aus Geobacillus stearothermophilus. Das Gen kodiert für ein
Oberflächenprotein. Die Sequenz wurde durch Verlängerung des Primers der Glucanase (ohne Stopp-Codon) hinzugefügt. Das Stopp-Codon wurde hinter den Bereich des sbsA Gens gesetzt.
DNA wurde nach Standardmethoden mit dem DNeasy Kit (Qiagen) aus B. subtilis isoliert. Das Gen wurde in einer PCR-Reaktion (1x PCR-Puffer, Gibco; 0,2 mM je dNTP, Gibco; 1 ,5 mM MgCI2, Gibco; 2,5 U Taq-Polymerase, Gibco) mit den Primern GluBcl (5TGATCATGCCTTATCTGAAACGAG3') (SEQ ID NO: 5) und GluKyrSac (5'GAGCTCCTAACGGTATCGTTTTTTCGCTTTGTTGTATTCAGCATATACTTTTTTTG TAT AGCGC3") (SEQ ID NO: 6) (beide jeweils 0,6 μM) in einem Thermocycler (Eppendorf) unter folgenden Bedingungen amplifiziert:
94 °C 5 Minuten
30 Zyklen:
94 °C 30 Sekunden
55 °C 30 Sekunden
72 °C 50 Sekunden abschließende Elongation:
72 °C 7 Minuten
Das Amplifikat wurde in den TA-Cloning Vektor (pGEM-Teasy, Promega) kloniert und in XLI BIue MRF' E. coli Zellen (Stratagene) transformiert (nach jeweiligen Herstellerangaben).
Für die Expression musste das isolierte Gen in ein Bacillus-Expressionssystem überführt werden. Das Plasmid wurde mittels des QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) aus einer Übernachtkultur der transformierten E. coli Zellen isoliert. Anschließend wurde das Gen mit den Restriktionsenzymen Bell und Sacl aus dem pGEM-Teasy Vektor geschnitten und in die entsprechenden Schnittstellen des Henkel-Bacillus- Expressionsvektor pAWA31 integriert. Die transformierten Bacillus subtilis Zellen waren vor der Transformation Glucanase defizient (Stamm MW10, Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, USA).
Beispiel 3:
Isolierung der ß-Glucanase (EC 3.2.1.6, X00754) aus B. subtilis unter Einbau der großen positiven Bindedomäne (GBD):
Die große positive Bindedomäne entspricht dem DNA-Bereich 276-686 Basenpaare aus dem sbsC Gen (AF055578) aus Geobacilus stearothermophilus (DSM22). Das Gen kodiert für ein Oberflächenprotein. Die Sequenz wurde durch PCR isoliert und molekularbiologisch an den C-Terminus der Glucanase ligiert. Die Ligation erfolgte durch eine Kas-Schnittstelle, die als Linker zwischen den beiden Domänen funktioniert.
DNA wurde nach Standardmethoden mit dem DNeasy Kit (Qiagen) aus B. subtilis und G. stearothermophilus isoliert.
Das Glucanse-Gen ohne Stopp-Codon wurde in einer PCR-Reaktion aus B. subtilis DNA (1x PCR-Puffer, Gibco; 0,2 mM je dNTP, Gibco; 1 ,5 mM MgCI2) Gibco; 2,5 U Taq- Polymerase, Gibco) mit den Primern GluBcl (5TGATCATGCCTTATCTGAAACGAG3') und GluKas (5'GGCGCCTTTTTTTGTATAG CGCACCC3') (SEQ ID NO: 9) (beide jeweils 0,6 μM) in einem Thermocyeler (Eppendorf) unter folgenden Bedingungen amplifiziert:
94 °C 5 Minuten
30 Zyklen:
94 °C 30 Sekunden
60 °C 30 Sekunden
72 °C 50 Sekunden abschließende Elongation:
72 °C 7 Minuten
Der Genabschnitt aus dem sbsC Gen aus G. stearothermophilus DNA wurde in einer PCR-Reaktion (1x PCR-Puffer, Gibco; 0,2 mM je dNTP, Gibco; 1 ,5 mM MgCI2, Gibco; 2,5 U Taq-Polymerase, Gibco) mit den Primern KassbsC (5'GGCGCCGACAAAAAGAAAGCAGTCAAA3') (SEQ ID NO: 10) und SacsbsC (5OAGCTCTTAGCGCATTTTGTCTMTTTTG31) (SEQ ID NO: 11 ) (beide jeweils 0,1 μM) in einem Thermocyeler (Eppendorf) unter folgenden Bedingungen amplifiziert:
94 °C 10 Minuten 30 Zyklen:
94 °C 30 Sekunden 60 °C 30 Sekunden 72 °C 45 Sekunden abschließende Elongation: 72 °C 10 Minuten
Durch den Primer SacsbsC wurde ein Stopp-Codon am Ende des sbsC Abschnittes eingefügt.
Die Fragmente wurden nach Herstellerangaben in den pGEM-Teasy Vektor (Promega) Moniert und in JM110 Zellen (Stratagene) transformiert.
Plasmide wurden mit dem QiaPrep-Spin Kit (Qiagen) isoliert.
Fragment-Isolierung
Glucanase: Die Glucanase wurde in zwei Schritten aus dem Vektor isoliert. Plasmid-
DNA wurde mit Puffer A (Endkonz. 1x) und 50 Units Narl (beides Röche) für 6 h bei 37
°C gespalten. Die DNA wurde mit dem PCR-Purification Kit (Qiagen) aufkonzentriert und anschließend mit 1x Puffer M und 50 Units Bell (Röche) bei 37 °C für 3 h gespalten.
SbsC: Gen-Fragment: Das sbsC Gen-Fragment wurde in zwei Schritten aus dem Vektor isoliert. Plasmid-DNA wurde mit Puffer A (Endkkonz. 1x) und 50 Units Narl (beides
Röche) für 3 h bei 37 °C gespalten und anschließend mit zusätzlich 25 Units Sacl
(Röche) bei 37 °C für 3 h gespalten.
Beide Fragmente wurden auf einem präparativen, 2 % Agarosegel vom Vektor abgetrennt, unter UV-Licht ausgeschnitten und mit QIAquick Gel-Extraction Kit (Qiagen) aus dem Gel gereinigt.
Ca. 20 ng der Glucanase wurden mit ca. 60 ng GBD in Anwesenheit von 1x Ligationspuffer und 0,5 U T4-Ligase (Röche) über Nacht bei 4 °C ligiert.
Das Ligationsprodukt wurde mit den Primern GluBcl und SacsbsC (beide jeweils 0,6 μM) in Anwesenheit von (1x PCR-Puffer, Qiagen; 0,3 mM je dNTP, Gibco; 2,5 U ProofStart DNA-Polymerase, Qiagen) in einem Thermocyeler (Eppendorf) unter folgenden Bedingungen amplifiziert:
94 °C 5 Minuten
30 Zyklen:
94 °C 30 Sekunden
60 °C 30 Sekunden
72 °C 1 Minute 10 Sekunden abschließende Elongation:
72 °C 7 Minuten
Das Amplifikat wurde über die eingebauten Schnittstellen Bell und Sacl in den Henkel- Bacillus-Expressionsvektor pAWA31 integriert. Die transformierten Bacillus subtilis
Zellen waren vor der Transformation Glucanase defizient (Stamm MW10, Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, USA).
Beispiel 4:
Isolierung der ß-Glucanase (EC 3.2.1.6, X00754) aus B. subtilis unter Einbau der mittleren, positiven Bindedomäne (MBD):
Bei der mittleren positiven Bindedomäne handelt es sich um einen künstlich synthetisierten DNA-Abschnitt, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er Regionen mit positiven Ladungen enthält. Die Synthese der MBD erfolgte über zwei hintereinander stattfindende PCR-Reaktionen. Die Sequenz wird durch die Wahl der eingesetzten Primer bestimmt. Die Primer selber dienten als Template DNA.
DNA wurde nach Standardmethoden mit dem DNeasy Kit (Qiagen) aus B. subtilis isoliert.
Das Glucanse-Gen ohne Stopp-Codon wurde in einer PCR-Reaktion aus B. subtilis DNA (1x PCR-Puffer, Gibco; 0,2 mM je dNTP, Gibco; 1 ,5 mM MgCI2, Gibco; 2,5 U Taq- Polymerase, Gibco) mit den Primern GluBcl (5TGATCATGCCTTATCTGAAACGAG3') und GluKas (5'GGCGCCTTTTTTTGTATAG CGCACCC3') (beide jeweils 0,6 μM) in einem Thermocyeler (Eppendorf) unter folgenden Bedingungen amplifiziert:
94 °C 5 Minuten
30 Zyklen:
94 °C 30 Sekunden
60 °C 30 Sekunden
72 °C 50 Sekunden abschließende Elongation:
72 °C 7 Minuten
Die MBD wurde in zwei aufeinanderfolgenden PCR-Reaktionen synthetisiert. In der ersten Reaktion wurde ein 81 bp langes Fragment in einem Thermocyeler (Eppendorf) unter folgenden Bedingungen amplifiziert:
1x PCR-Puffer, Gibco; 0,2 mM je dNTP, Gibco; 1 ,5 mM MgCI2) Gibco; 2,5 U Taq- Polymerase, Gibco Primer: PBDvorne
(5'GGCGCCCAGCTGAAGAAGAAGCTGCAGGCACTCAAGAAGAAGAATGCGCAGCT A3') (SEQ ID NO: 14) PBDmitte (5OTTCTTAAGTGCCTGCAGCTTCCACTTTAGCTGCGCATTCTTCTTCTTGA3') (SEQ
ID NO: 15) (beide jeweils 0,1 μM)
PCR Schema: 94 °C 5 Minuten 10 Zyklen:
94 °C 30 Sekunden 60 °C 30 Sekunden 72 °C 10 Sekunden abschließende Elongation: 72 °C 7 Minuten
Das 81 bp große Fragment wurde in eine neue PCR Reaktion (1x PCR-Puffer, Gibco; 0,2 mM je dNTP, Gibco; 1 ,5 mM MgCI2, Gibco; 2,5 U Taq-Polymerase, Gibco) mit den Primern PBDvorne
(5'GGCGCCCAGCTGAAGAAGAAGCTGCAGGCACTCAAGAAGAAGAATGCGCAGCT A3') und PBDhinten
(5'GAGCTCTCAACAACCGCCCTGCGCCAGCTTCTTCTTAAGTGCCTGCAGCT3!) (SEQ ID NO: 16) (beide jeweils 0,1 μM) eingesetzt. Das Amplifikationsschema sah wie folgt aus:
94 °C 5 Minuten
10 Zyklen:
94 °C 30 Sekunden
60 °C 30 Sekunden
72 °C 10 Sekunden abschließende Elongation:
72 °C 7 Minuten
Durch den Primer PBDhinten wurde ein Stopp-Codon am Ende des PBD Abschnittes eingefügt.
Die Fragmente wurden nach Herstellerangaben in den pGEM-Teasy Vektor (Promega) kloniert und in XL1-Blue MRF' Zellen (Stratagene) transformiert.
Plasmide wurden mit dem QiaPrep-Spin Kit (Qiagen) isoliert.
Fragment-Isolierung Glucanase: Die Glucanase wurde in zwei Schritten aus dem Vektor isoliert. Plasmid- DNA wurde mit Puffer A (Endkonz. 1x) und 50 Units Narl (beides Röche) für 6 h bei 37 °C gespalten. Die DNA wurde mit dem PCR-Purification Kit (Qiagen) aufkonzentriert und anschließend mit 1x Puffer M und 50 Units Bell (Röche) bei 37 °C für 3 h gespalten.
MBD: Das MBD-Fragment wurde in zwei Schritten aus dem Vektor isoliert. Plasmid-DNA wurde mit Puffer A (Endkkonz. 1x) und 50 Units Narl (beides Röche) für 3 h bei 37 °C gespalten und anschließend mit zusätzlich 25 Units Sacl (Röche) bei 37 °C für 3 h gespalten.
Beide Fragmente wurden auf einem präparativen, 2 % Agarosegel vom Vektor abgetrennt, unter UV-Licht ausgeschnitten und mit QIAquick Gel-Extraction Kit (Qiagen) aus dem Gel gereinigt.
Ca. 20 ng der Glucanase wurden mit ca. 60 ng MBD in Anwesenheit von 1x Ligationspuffer und 0,5 U T4-Ligase (Röche) über Nacht bei 4 °C ligiert.
Das Ligationsprodukt wurde mit den Primern GluBcl und PBDhinten (beide jeweils 0,6 μM) in Anwesenheit von (1x PCR-Puffer, Qiagen; 0,3 mM je dNTP, Gibco; 2,5 U ProofStart DNA-Polymerase, Qiagen) in einem Thermocyeler (Eppendorf) unter folgenden Bedingungen amplifiziert:
94 °C 5 Minuten 30 Zyklen:
94 °C 30 Sekunden
60 °C 30 Sekunden
72 °C 1 Minute 10 Sekunden abschließende Elongation:
72 °C 7 Minuten
Das Amplifikat wurde über die eingebauten Schnittstellen Bell und Sacl in den Henkel- Bacillus-Expressionsvektor pAWA31 integriert. Die transformierten Bacillus subtilis Zellen waren vor der Transformation Glucanase defizient (Stamm MW10, Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, USA).
Beispiel 5:
Eine Glucanase aus B. subtilis wurde kloniert. Dieses Enzym wurde gentechnisch mit drei verschienenen, positiv geladenen Bindedomänen versehen:
GluMBD: Glucanase + Linker + künstliche Bindedomäne
GluKBD: Glucanase + kleinem positiv geladenem Bereich aus Oberflächenprotein aus G. stearothermophilus GluGBD: Glucanase + Linker + großem positiv geladenem Bereich aus Oberflächenprotein aus G. stearothermophilus Für die Überprüfung der Funktion der Monierten Enzyme wurden jeweils Überstände aus Übernachtkulturen verwendet und auf vergleichbare Enzymaktivitäten eingestellt (Fig. 1).
Die Bindung und Hydrolysefähigkeit dieser klonierten Enzyme wurde im Vergleich zur unmodifizierten Glucanase auf Pektin-Agar (negativ geladenes Polysaccharid) getestet. Dem Agar war unlösliches Glucan zugesetzt. Die klonierten Enzyme wurden aktivitätsgleich eingesetzt. Jedes klonierte Enzym wurde für 5 Minuten bei 4 °C auf den Agar pipettiert, abgenommen und zweimal mit Puffer gewaschen. Der Agar wurde dann mit Puffer überschichtet und bei 37 °C inkubiert. Es zeigte sich anhand einer Blaufärbung, dass nur dort, wo Hybridenzyme (GluMBD, GluKBD, GluGBD) auf den Agar pipettiert wurden, das unlösliche Glucan hydrolysiert wurde.
Beispiel 6:
Beispielrezepturen für Haushaltsreiniger
Beispiel 7: pl-Werte von ß-Glucanase mit unterschiedlichen kationischen Bindungseinheiten
Die pl-Werte wurden in silico mit dem Programm ExPASy Compute pl/Mw (Bjellqvist, B., Hughes, G.J., Pasquali, Ch., Paquet, N., Ravier, F., Sanchez, J.-Ch., Frutiger, S. & Hochstrasser, D.F. The focusing positions of polypeptides in immobilized pH gradients can be predicted from their amino acid sequences. Electrophoresis 1993, 14, 1023- 1031 , Bjellqvist, B., Basse, B., Olsen, E. and Celis, J.E. Reference points for
comparisons of two-dimensional maps of proteins from different human cell types defined in a pH scale where isoelectric points correlate with polypeptide compositions. Electrophoresis 1994, 15, 529-539) errechnet.
Tabelle 1 : ß-Glucanase mit kleiner (KBD, VYAEYNKAKKRYR), mittlerer (MBD, GAQL- KKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQGGC) und großer Bindedomäne (GBD, GA- sbsC2-i3δ) im Vergleich zu dem Enzym mit KKEKK-Bindedomäne