WO2005051982A1 - 糖ペプチド及び温度応答性ミセル - Google Patents

糖ペプチド及び温度応答性ミセル Download PDF

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WO2005051982A1
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temperature
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peptide
pro
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Keiko Miura
Chieri Shibata
Kazukiyo Kobayashi
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Toagosei Co,. Ltd.
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure

Definitions

  • the present invention relates to a glycopeptide which is a temperature-responsive amphiphilic conjugate and a temperature-responsive micelle comprising the glycopeptide. More particularly, it relates to novel formulations for drug delivery systems (DDS) and glycopeptides and micelles useful in microreactors.
  • DDS drug delivery systems
  • conventional temperature-responsive high-molecular monomers are highly biotoxic, acrylamide, and the like, and it is desired to develop a temperature-responsive substance that does not require the use of a vinyl conjugate. .
  • Non-patent document l Macromolecules, 1998, 31, 2394
  • Non-Patent Document 2 J. Am Chem. Soc. 1996, 118, 6092
  • Non-Patent Document 3 Macromolecules, 1999, 32, 9067
  • Non-Patent Document 4 Biomacromolecules, 2000, 1, 552
  • Non-Patent Document 5 J. Phys. Chem. B, 1997, 101, 11007
  • the present invention aims to provide a temperature-responsive amphiphilic glycopeptide using an oligopeptide.
  • an object of the present invention is to provide a temperature-responsive Angstrom-level compound having high biocompatibility and to be a compound useful for medical materials, drug transport, agriculture, and the like.
  • the present invention provides an elastin model peptide whose hydrophilicity and hydrophobicity change in response to temperature (
  • the present invention relates to a synthesized glycopeptide which does not exist in nature, and is a glycopeptide represented by the following formula (1) and a temperature-responsive micelle comprising the glycopeptide.
  • the invention's effect [0009]
  • the glycopeptide of the present invention has a reversible and rapid temperature response, and the micelle of the present invention has a temperature response in which the particle size changes in a certain temperature range.
  • glycopeptide of the present invention is a temperature-responsive molecule at the angstrom level, and is used in drug delivery systems and other molecular devices that require precise response.
  • glycopeptide of the present invention is constituted by a molecular structure having high biocompatibility, and is a compound suitable for biomaterials and agricultural materials.
  • sugars are known to interact specifically with cells, pathogenic bacteria, toxins, and viruses, and the glycopeptides of the present invention can be used more advantageously for drugs that control pathogens in a temperature-responsive manner. It becomes.
  • FIG. 1 is a view showing a synthesis flow of a compound 1, a compound 4, and a compound 8.
  • FIG. 2 is a view showing a CD spectrum of Compound 1 (relationship between wavelength and molecular ellipticity).
  • FIG. 3 is a view showing a CD spectrum of Compound 1 (relationship between temperature and molecular ellipticity).
  • FIG. 4 is a view showing a CD spectrum of Compound 4 (relationship between wavelength and molecular ellipticity).
  • FIG. 5 is a view showing a CD spectrum of Compound 4 (relationship between temperature and molecular ellipticity).
  • FIG. 6 is a view showing a CD spectrum of Compound 8 (relationship between wavelength and molecular ellipticity).
  • FIG. 7 is a view showing a CD spectrum of Compound 8 (relationship between temperature and molecular ellipticity).
  • FIG. 8 is a diagram showing the CD vector of a control compound (NH2-Vatro Pro-Gly-Vatro Gly-Vatro Pro-Gly-Vavo Gly-OH) (relation diagram between wavelength and molecular ellipticity). .
  • FIG. 9 A diagram showing the CD vector of a control compound (NH2-Vat Pro-Gly-Vat Gly-Vat Pro-Gly-Vat Gly-OH) (relation diagram between temperature and molecular ellipticity). .
  • FIG. 10 is a view showing a DLS measurement result of Compounds 1, 4, and 8.
  • FIG. 11 is a graph showing the temperature responsiveness of micelles composed of Compound 1.
  • FIG. 12 is a diagram of a ⁇ -A curve (pressure-area curve) of a gas-liquid interface of compound 1.
  • Preferred sugar chains that can be used in the glycopeptide of the present invention are monosaccharide or oligosaccharide sugar chains, and more preferably are trisaccharide or less sugar chains.
  • Preferred examples of the monosaccharide include mannose, a, j8-glucose, galactose, fucose, sialic acid, dalcosamine, N-acetyldarcosamine, N-acetylgalatatosamine and the like.
  • oligosaccharide examples include maltose, cellobiose, ratatose, isomaltose, chitobiose, chitotriose, cellotriose, manoletotriose, cellotetraose, chitotetraose, cellopentaose, maltotetraose, maltopentaose, chitopentaose, and setoporose.
  • the sugar chain constitutes a hydrophilic group, and when the peptide is aggregated by a temperature response, the hydrophilicity and hydrophobicity of the elastin model peptide are considered in order to make the glycopeptide amphiphilic.
  • a sugar is appropriately selected.
  • the linker between the peptide and the sugar chain is not limited as long as it has an organic group for binding the peptide and the sugar chain.
  • Preferred linkers on the C-terminal side include paraamide phenoxide, alkylamine and
  • L is a linker for linking a sugar chain to the N-terminal side of the peptide chain, and is preferably obtained by incorporating an amino acid having a carboxyl group such as glutamic acid or aspartic acid into the peptide chain.
  • the sugar chains can be easily linked by further linking the two.
  • the peptide in the present invention is an elastin model peptide oligopeptide (Val-Pro-Gly-X-Gly) n or (Glu-VaPro-Gly-X-Gly) n (where X is any amino acid residue). And n is an integer from 1 to 10. ).
  • X in the above sequence is Val.
  • a peptide having 5 amino acid residues or 10 amino acid residues is suitably used as a peptide forming a micelle having rapid temperature response.
  • the ability to use longer peptide chains It is then desirable to attach longer oligosaccharide chains to maintain a balance of amphipathicity.
  • a temperature-responsive amphipathic glycopeptide can be produced by binding an oligosaccharide chain to a peptide having 10 amino acids and 40 amino acids.
  • the N-terminal of the peptide may be a group protected with acetinol, Boc B (t-butyloxycarbonyl) or Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl), in addition to the unprotected amino group.
  • a first preferred embodiment of the present invention is a glycopeptide in which a monosaccharide mannose is bound to a peptide having an oligopeptide sequence of an elastin model peptide, using paraamide phenoxide as a linker.
  • Specific examples include the following glycopeptides.
  • a second preferred embodiment of the present invention is a glycopeptide obtained by partially changing the sequence of an elastin model peptide. It has been reported that a peptide in which the fourth residue of the elastin model sequence was changed also showed a temperature response (J. Phys. Chem. B, 1997, 101, 11007). The modified dangling product also shows temperature responsiveness. Specific examples include the following glycopeptides. [0018] [Formula 3]
  • X is any amino acid residue.
  • a third preferred embodiment of the present invention is a glycopeptide in which the sugar moiety to be bound to the elastin model peptide is changed to various sugar chains.
  • X is any amino acid residue.
  • a paraamide phenoxide is used as a linker and mannose is bound to the C-terminus of the elastin model peptide, and a side chain of glutamic acid and paraamide phenoxide are linked to the N-terminus.
  • a glycopeptide to which mannose is bound as a linker is linked to the C-terminus of the elastin model peptide, and a side chain of glutamic acid and paraamide phenoxide are linked to the N-terminus.
  • a part of the elastin model peptide is modified, paranose phenoxide is used as a linker, mannose is bound to the C-terminus, and the side chain of glutamic acid and para It is a glycopeptide having mannose bound to the N-terminus using amide phenoxide as a linker.
  • X is any amino acid residue.
  • X is any amino acid residue.
  • a seventh preferred embodiment of the present invention is the following peptide in which the N-terminal of the elastin model peptide is protected and a sugar is bound.
  • An eighth preferred embodiment of the present invention is the following peptide in which the N-terminus of the elastin model peptide is protected and a sugar is bound.
  • Fmoc- (Va Pro-Gly-X-Gly) n-OH was synthesized by solid-phase synthesis by the Fmoc method, and then a linker was covalently bonded to the anomeric position of the sugar chain by a known method.
  • the linker-linked sugar chain is covalently linked to the C-terminal of the previously synthesized oligopeptide by glycosylation to obtain a sugar chain-linked oligopeptide.
  • the Fomc group at the N-terminal of the peptide is deprotected, purified by reversed-phase silica gel chromatography, and lyophilized to obtain the desired glycopeptide. (If you have LI)
  • Fmoc-Glu (Va-Pro-Gly-X-Gly) n-OH is synthesized by solid-phase synthesis by the Fmoc method.
  • the linker-linked sugar chain in which a linker is covalently bonded to the anomeric position of the sugar chain by a known method, is shared with the C-terminal of the oligopeptide previously synthesized and the glutamic acid side chain by glycosylation.
  • the oligopeptides are linked to obtain oligopeptides having sugar chains linked to both ends.
  • the target glycopeptide is obtained by the same method as described above.
  • the sugar chain acts as a temperature-responsive hydrophobic group and the sugar chain acts as a hydrophilic group. Therefore, the glycopeptide easily forms a temperature-responsive micelle in water. I do.
  • the peptide Normally, at higher temperatures, the peptide becomes more hydrophobic and tends to saturate at a certain level, with which the size of the micelles tends to increase with temperature and reach a certain maximum size.
  • the maximum size of micelles can be controlled in the range of 100-100 nm.
  • Compounds 4 and 8 were synthesized using mannose and each Fmocidai amino acid (Peptide Research Laboratories) as starting materials.
  • Acetic anhydride (88 ml) and pyridine (78 ml) were placed in an eggplant flask, cooled to 0 ° C. in an ice bath, and D-mannose (100 g, 5.4 mmol) was added thereto and stirred magnetically.
  • Pyridine was concentrated under reduced pressure by azeotropic boiling with toluene. Dissolve the concentrated target substance in ethyl acetate, add 1N hydrochloric acid, saturated aqueous NaHCO,
  • the reaction mixture was diluted with a magnetic chromatographic form, washed three times with IN NaOH and three times with water, stirred with magnesium sulfate, and terminated after 28 hours.
  • the molecular sieve was filtered through celite and the solution was dried. After filtering off magnesium sulfate, toluene was added thereto, and an azeotropic yellow solid was recrystallized from ethyl acetate and hexane to obtain white crystals.
  • ⁇ -Nitrophenyl and D-mannoside were dissolved in methanol, and palladium hydroxide (6 mg) was added.
  • a three-way cock was attached to the flask, a hydrogen balloon was attached, and the inside of the flask was replaced with hydrogen.
  • Peptide 1 (140 mg, 0.13 mmol) was dissolved in dehydrated DMF and cooled to 0 ° C.
  • 2- (1 ⁇ -7-azabenzotriazole-1-yl) -1, 1, 3,3-tetramethylhexafluorohexaphosphate (HATU) (59.3 mg, 1.2 eq) and diisopropylethyl (DIEA) (54 ⁇ l, 2.4 eq) was stirred with kamen.
  • a DMF solution 1.5 eq
  • p-aminophenol a-D-mannoside was added, and the mixture was stirred at room temperature.
  • the conformational change with temperature of the glycopeptides (compounds 1 and 4) obtained as described above was measured using a CD spectrum (JASCO, J-720).
  • Sugar Bae flop tide PBS buffer solution 5 X 10- 4 (M) by using a quartz cell having an optical path length of lmm was subjected to measurement of CD spectra.
  • Figures 2 and 3 (A) CD spectrum of compound 1 (B) [ ⁇ ] at each temperature of 220 nm (where, ⁇ represents molecular ellipticity; the same applies hereinafter)
  • Glycopeptide particle size was measured by dynamic light scattering (DLS, Otsuka Electronics HK-6600) to observe micelle formation.
  • Temperature-responsive polymers such as poly-N-isopropylacrylamide, and multimers of elastin model peptides, which are temperature-responsive polymers, are macromolecules. Usually, several hours to 24 hours) are observed. On the other hand, the glycopeptide of the present invention has a small molecular force at the angstrom level, and therefore has a quick response, and the force is maintained even if the response is repeated.
  • Compound 1 also has a sugar as a control molecule!
  • the temperature-responsive glycopeptide of the present invention has reversible and rapid temperature response, and forms micelles. Since it is an Angstrom-level temperature-responsive molecule, it is used for drug delivery systems (DDS) and other molecular devices that require precise response.
  • DDS drug delivery systems
  • the glycopeptide when used in a drug delivery system that delivers a necessary amount of a drug administered to a living body to a necessary fibrous tissue when needed and performs an effective drug treatment, Because of its rapid temperature response, it rapidly responds to the body temperature and skin temperature of a living body or a temperature stimulus from the outside of a living body to release micelle-encapsulated drugs. In the field of materials, it has high applied value.
  • micelle-forming glycopeptides can deliver drugs specific to organs or pathogens or toxins. it is conceivable that. Therefore, this glycopeptide can be said to be very industrially useful because it can be used for DDS which has both controlled release and target-directed properties.
  • the present glycopeptide can be used as a modified sugar chain.
  • glycosylation which is one of post-translational modifications of a protein
  • the present glycopeptide is capable of controlling the inactivation or enhancement of the activity of proteins, including enzymes, in a temperature-responsive manner, and is of great pharmaceutical interest.

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Abstract

 オリゴペプチドを用いて、温度応答性を有する両親媒性の糖ペプチド及び温度応答性ミセルを提供する。  天然には存在しない合成された糖ペプチドであって、下式（１）で表される糖ペプチド及び該糖ペプチドからなる温度応答性ミセル。 【化１】 （上式においてＸは任意のアミノ酸残基であり、Ｌ１及びＬ２はリンカーであり、ＳＵＧは糖鎖であり、ｍは０又は１であり、ｎは１～１０の整数であり、Ｌ１及びＬ２は互いに同じであっても異なっていてもよく、複数のＳＵＧは互いに同じであっても異なっていても良い。） 　 　 　

Description

明 細 書
糖ペプチド及び温度応答性ミセル
技術分野
[0001] 本発明は温度応答型の両親媒性ィ匕合物である糖ペプチド及びこの糖ペプチドから なる温度応答性ミセルに関するものである。さらに詳しくは、薬物送達システム (DDS) のための新しい製剤やマイクロリアクターにおいて有用な糖ペプチド及びミセルに関 する。
背景技術
[0002] これまでの温度応答型の両親媒性ィ匕合物は主にポリ N-イソプロピルアクリルアミド、 ポリ Ν,Ν-ジェチルアクリルアミドを利用したポリマーが殆どであった（例えば、
Macromolecules, 1998, 31, 2394. J. Am Chem. Soc. 1996, 118, 6092.) 0これらのィ匕 合物と水溶性高分子のブロック共重合体は温度応答性の界面活性剤として機能する ことが知られている。しかし、これらの化合物のブロック重合体を得ることは容易では ない。また、これらの高分子化合物においては、オングストロームレベルでの重合度 の制御は容易ではない。
[0003] また、従来の温度応答型の高分子のモノマーは生体毒性の高!、、アクリルアミドな どであり、ビニルイ匕合物を用いることなぐ温度応答性物質を開発することが望まれて いる。
[0004] 生体安全性の高!、、温度応答物質として、細胞外マトリックスであるエラスチンのモ デルシーケンスを利用した高分子物質の合成が考えられて ヽる。これまでに
Va卜 Pro- Gly- Va卜 Glyや Gly- Va卜 Pro- Gly- Va卜 Glyなどの繰り返しシーケンスを有す るアミノ酸の多量体が温度応答性の高分子として機能することが示されている (例え ば Macromolecules, 1999, 32, 9067. Biomacromolecules, 2000, 1, 552.)。また、エラス チンモデルシーケンスの第 4残基を変更したペプチドも温度応答性を示すことがこれ までに報告されている（J.Phys. Chem. B, 1997, 101, 11007)。
し力し、この高分子物質ではポリ N-イソプロピルアクリルアミドなどのビュル系の温 度応答性高分子と同様に、オングストロームレベルでの制御されたィ匕合物は実現し ていなかった。
非特許文献 l : Macromolecules, 1998, 31, 2394
非特許文献 2 : J. Am Chem. Soc. 1996, 118, 6092
非特許文献 3 : Macromolecules, 1999, 32, 9067
非特許文献 4 : Biomacromolecules, 2000, 1, 552
非特許文献 5 :J.Phys. Chem. B, 1997, 101, 11007
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は上記事情に鑑み、オリゴペプチドを用いて、温度応答性を有する両親媒 性の糖ペプチドを提供しょうとするものである。特に、本発明は、生体親和性の高い 温度応答性のオングストロームレベルの化合物を提供し、医療材料、薬物輸送、農 業などに役に立つ化合物にすることを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明は、温度応答的に親水性と疎水性が変化するエラスチンモデルペプチド（
-(Val-Pro-Gly-Val-Gly) -)と親水性の糖鎖を組み合わせた糖ペプチドが特異な温 度応答性を有することを見出し、完成されたものである。
即ち、本発明は、天然には存在しない合成された糖ペプチドであって、下式（1)で 表される糖ペプチド及び該糖ペプチドからなる温度応答性ミセルである。
[0007] [化 1]
NH2- Li -(Va l -Pro-G l y-X-G l y )n-L2-SUG (1)
SUG
[0008] (上式において Xは任意のアミノ酸残基であり、 L及び Lはリンカ一であり、 SUGは
1 2
糖鎖であり、 mは 0又は 1であり、 nは 1一 10の整数であり、 L及び Lは互いに同じで
1 2
あっても異なっていてもよぐ複数の SUGは互いに同じであっても異なっていても良 い。）
発明の効果 [0009] 本発明の糖ペプチドは可逆的かつ、迅速な温度応答性を有し、本発明の糖ペプチド 力 なるミセルはある温度領域で粒径が変化するという温度応答性を有する。
本発明の糖ペプチドはオングストロームレベルの温度応答性分子であり、精密な応 答性を要する薬物送達システムやそのほかの分子デバイスに用いられる。
更に、本発明の糖ペプチドは生体親和性の高い分子構造によって構成されており 、生体材料や農業用材料に適した化合物である。
更に、糖は細胞、病原菌、毒素、ウィルスと特異的な相互作用することが知られて おり、本発明の糖ペプチドは温度応答的に病原体を抑制する薬剤へとより有利に用 V、られることとなるのである。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]化合物 1、化合物 4及びィ匕合物 8の合成フローを示す図である。
[図 2]化合物 1の CDスペクトルを示す図（波長と Molecular ellipticityとの関係図）であ る。
[図 3]化合物 1の CDスペクトルを示す図（温度と Molecular ellipticityとの関係図）であ る。
[図 4]化合物 4の CDスペクトルを示す図（波長と Molecular ellipticityとの関係図）であ る。
[図 5]化合物 4の CDスペクトルを示す図（温度と Molecular ellipticityとの関係図）であ る。
[図 6]化合物 8の CDスペクトルを示す図（波長と Molecular ellipticityとの関係図）であ る。
[図 7]化合物 8の CDスペクトルを示す図（温度と Molecular ellipticityとの関係図）であ る。
[図 8]対照化合物 (NH2- Va卜 Pro- Gly- Va卜 Gly- Va卜 Pro- Gly- Va卜 Gly- OH)の CDス ベクトルを示す図（波長と Molecular ellipticityとの関係図）である。
[図 9]対照化合物 (NH2- Va卜 Pro- Gly- Va卜 Gly- Va卜 Pro- Gly- Va卜 Gly- OH)の CDス ベクトルを示す図（温度と Molecular ellipticityとの関係図）である。
[図 10]化合物 1、 4、 8の DLS測定結果を示す図である。 [図 11]化合物 1からなるミセルの温度応答性を示す図である。
[図 12]化合物 1の気液界面の π— A曲線 (圧力-面積曲線)の図である。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 〇糖鎖
本発明の糖ペプチドに用いることができる好ましい糖鎖は、単糖又はオリゴ糖の糖 鎖であり、より好ましくは 3糖以下の糖鎖である。
単糖の好ましい例として、マンノース、 a、 j8—グルコース、ガラクトース、フコース、 シアル酸、ダルコサミン、 N—ァセチルダルコサミン及び N—ァセチルガラタトサミン等 がある。
オリゴ糖の好ましい例として、マルトース、セロビオース、ラタトース、イソマルトース、 キトビオース、キトトリオース、セロトリオース、マノレトトリオース、セロテトラオース、キト テトラオース、セロペンタオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、キトペンタ オース、セ口へキサオース、キトへキサオース等がある。
本発明の糖ペプチドにおいて糖鎖は親水性基を構成するものであり、ペプチドが 温度応答により凝集した際、糖ペプチドを両親媒性とするために、エラスチンモデル ペプチドの親 ·疎水性を考慮して、糖が適宜選択される。
[0012] 〇リンカ一
本発明にあたっては、ペプチドと糖鎖のリンカ一は、ペプチドと糖鎖を結合する有 機基を有するものであれば、制限はない。
C末端側の好ましいリンカ一 Lとして、パラアミドフエノキシド、アルキルアミン及びェ
2
チレングリコールァミンなどがある。
上式（1)において Lは、ペプチド鎖の N末端側に糖鎖を結合させるためのリンカ一 であり、好ましくはグルタミン酸、ァスパラギン酸等のカルボキシル基を有するアミノ酸 をペプチド鎖に組み込むことにより、 C末端側のリンカ一 Lと同様のリンカ
2 一を更に結 合させることにより糖鎖を容易に結合することができる。
[0013] 〇ペプチド
本発明におけるペプチドは、エラスチンモデルペプチドのオリゴペプチドである（ Val-Pro-Gly-X-Gly) n又は（Glu- Va Pro- Gly- X- Gly) n (但し、 Xは任意のアミノ酸残 基であり、 nは 1一 10の整数である。）のシーケンスを有するものである。 好まし 、ペプチドにお!/、て、前記シーケンスにおける Xは Valである。
糖に単糖を用いる場合にっ 、ては、迅速な温度応答性を有するミセルを形成する ペプチドはアミノ酸 5残基またはアミノ酸 10残基のペプチドが適して 、る。より長 ヽぺ プチド鎖も用いることができる力 そのときには両親媒性の均衡を保っために、より長 いオリゴ糖鎖を結合させることが望ましい。例えば、アミノ酸 10残基一アミノ酸 40残基 のペプチドにはオリゴ糖鎖を結合させ、温度応答的両親媒性糖ペプチドを製造する ことが可能である。
さらに、本発明にあたっては、ペプチドの N末端は、無保護のアミノ基以外に、ァセ チノレ 、 Boc¾(t— Butyloxycarbonyl)又は Fmoc (9— Fluorenylmethoxycarbonyl)で保 護した基であっても良い。
[0014] 本発明にあたって用いられる、エラスチンオリゴペプチド（（Va卜 Pro- Gly- Va卜 Gly)、
(Vaト Pro- Gly- X- Gly)； Xは任意）はペプチド合成によって簡便に提供される。ぺプ チド合成は公知である液相合成、固相合成によって簡便に得ることが可能である。
[0015] 本発明の第一の好ましい実施様態は、エラスチンモデルペプチドのオリゴペプチド のシーケンスを有するペプチドに、パラアミドフエノキシドをリンカ一として、単糖である マンノースを結合した糖ペプチドである。具体的には下記糖ペプチドを挙げることが できる。
[0016] [化 2]
Figure imgf000006_0001
[0017] 本発明の第二の好ましい実施様態は、エラスチンモデルペプチドのシーケンスを一 部変更した糖ペプチドである。エラスチンモデルシーケンスの第 4残基を変更したぺ プチドも温度応答性を示すことがこれまでに報告されているため (J.Phys. Chem. B, 1997, 101, 11007)、一部のシーケンスを変更したィ匕合物についても、温度応答性を 示す。具体的には以下の糖ペプチドを挙げることができる。 [0018] [化 3]
Figure imgf000007_0001
(上式において Xは任意のアミノ酸残基である。 )
[0019] 本発明の第三の好ましい実施様態はエラスチンモデルペプチドに結合させる糖部 分を種々の糖鎖に変更した糖ペプチドである。
[0020] [化 4]
。 jj
(上式において Xは任意のアミノ酸残基である。 )
[0021] 本発明の第四の好ましい実施様態は、エラスチンモデルペプチドの C末端に、パラ アミドフエノキシドをリンカ一として、マンノースを結合させ、 N末端にグルタミン酸の側 鎖とパラアミドフエノキシドをリンカ一としてマンノースを結合させた糖ペプチドである。
[0022] [化 5]
，
Figure imgf000007_0002
[0023] 本発明の第五の好まし 、実施様態は、エラスチンモデルペプチドの一部を改変し、 パラアミドフエノキシドをリンカ一として、 C末端にマンノースを結合させ、グルタミン酸 の側鎖とパラアミドフエノキシドをリンカ一として、 N末端にマンノースを結合させた糖 ペプチドである。
[0024] [化 6]
Figure imgf000007_0003
(上式において Xは任意のアミノ酸残基である。 ) [0025] 本発明の第六の好ましい実施様態は、エラスチンモデルペプチドの一部を改変し、
C、 N両末端に任意の糖鎖を結合させたペプチドである。
[0026] [化 7]
Figure imgf000008_0001
(上式において Xは任意のアミノ酸残基である。 )
本発明の第七の好まし ヽ実施様態は、エラスチンモデルペプチドの N末端を保護し て、糖を結合させた以下のペプチドである。
[化 8]
Figure imgf000008_0002
[0028] 本発明の第八の好ましい実施様態は、エラスチンモデルペプチドの N末端を保護し て、糖を結合させた以下のペプチドである。
[化 9]
Figure imgf000008_0003
[0029] 〇糖ペプチドの合成方法
(L1がない場合）
先ず、 Fmoc法による固相合成により Fmoc-(Va卜 Pro-Gly-X- Gly)n-OHを合成し、次 に、公知の方法により糖鎖のァノマー位にリンカ一を共有結合させた、リンカ一結合 型糖鎖を、グリコシルイ匕により、先に合成したオリゴペプチド C末端に共有結合させ、 糖鎖結合型オリゴペプチドを得る。その後、ペプチド N末端の Fomc基を脱保護し、逆 相シリカゲルクロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥することにより目的の糖ペプチドを 得る。 (LIがある場合）
グルタミン酸を用いた場合を以下に説明する。
先ず、 Fmoc法による固相合成により Fmoc- Glu(Va卜 Pro- Gly- X- Gly)n- OHを合成す る。
次に、公知の方法により糖鎖のァノマー位にリンカ一を共有結合させた、リンカ一結 合型糖鎖を、グリコシルイ匕により、先に合成したオリゴペプチド C末端及びグルタミン 酸側鎖に共有結合させ、両末端に糖鎖を結合したオリゴペプチドを得る。以降上記と 同様の手法により目的の糖ペプチドを得る。
[0030] 〇温度応答性ミセル
本発明の糖ペプチドにおいて、ペプチドは、温度応答的に凝集した際、温度応答 性疎水基として、糖鎖は親水基として各々作用するため、糖ペプチドは、水中で温度 応答性ミセルを容易に形成する。
通常、高温になると、ペプチドの疎水性が強くなり、ある水準で飽和する傾向があり 、それに伴い、ミセルの粒径は温度とともに大きくなり、ある最大粒径に達する傾向が ある。
ペプチドと糖鎖を適宜選択することにより、ミセルの最大粒径を 100— lOOOOnmの 範囲で制御することができる。
実施例
[0031] 以下に説明する実施例によって、本発明を更に詳細に説明するが、本発明をかか る実施例に限定することを意図したものではない。
[0032] まず、マンノースと各 Fmocィ匕アミノ酸 (株式会社ペプチド研究所)を出発原料として 、化合物 化合物 4及び化合物 8を合成した。
次いで、これらの化合物について、 CDスペクトルの測定及び動的光散乱によるミセ ル形成の測定を行った。化合物 1からなるミセルについて、温度応答性を確認する試 験を行った。また、気液界面単分子膜を用いた集合性の確認について検討を行った 。また、糖認識レクチンである、コンカナノ リン Aとの結合を蛍光消光実験によって求 めた。
以下、合成と測定の方法及びそれらの結果について具体的に説明する。 [0033] A) ペンタ— O—ァセチル D-マンノースの合成
ナスフラスコに無水酢酸（88ml)とピリジン（78ml)をとり、氷浴で 0°Cに冷却し、そこへ D-マンノース（lO.OOg, 5.4 mmol)をカ卩え、磁気攪拌した。反応は TLC (展開溶媒、酢 酸ェチル：へキサン = 2 : 1)で追跡した。ピリジンをトルエンとともに共沸騰により、減 圧濃縮した。濃縮された目的物を酢酸ェチルに溶解し、 1N塩酸、飽和 NaHCO水、
3 水の順に洗浄した。溶液を無水マグネシウムで乾燥した後、減圧濃縮した。（収率 > 99%)
[0034] B) p--トロフエ-ルーテトラ- 0-ァセチル a - D-マンノシド
二つ口フラスコにモレキュラーシーブ 4Α (オングストローム）を入れ乾燥させて窒素雰 囲気下にした。ペンタ- 0-ァセチル a - D-マンノシド （10.0 g, 25.6 mmol)と トロ フエノール（10.7 g, 76.86 mmol, 3 eq)をジクロロメタンに溶かしてフラスコ内に注入し 、およそ一時間攪拌した。三フッ化ホウ素エーテル錯体（12.8 ml, 4 eq)を加えて終夜 攪拌した。反応の進行を TLC (へキサン：酢酸ェチル = 1： 1)で追跡した。磁気クロ口 ホルムに希釈し、 IN NaOHで 3回、水で 3回洗浄し、硫酸マグネシウムを入れて攪拌 して、 28時間後反応を終了した。セライトでモレキュラーシーブをろ過し、溶液を乾燥 した。硫酸マグネシウムをろ過した後、トルエンを加えて共沸した黄色固体を酢酸ェ チルとへキサンで再結晶して白色結晶を得た。
収量 9.1 g
収率 74.8 %
[0035] C) p—-トロフエ-ル a— D—マンノシド
ρ—-トロフエ-ルーテトラ— 0—ァセチル a— D—マンノシド（93.9 mg, 0.2 mmol)とナトリ ゥムメトキシド（4.7 eq)をメタノール 7.1 mlに溶かし、撹拌した。反応の進行を TLC (クロ 口ホルム:メタノール = 3 : 1)で追跡し、一時間後反応を停止した。アンバーリストで中 和し、減圧濃縮した。
[0036] D) p—ァミノフエ-ル a— D—マンノシド
ρ-ニトロフエ-ル ひ D マンノシドをメタノールに溶かし、水酸化パラジウム (6 mg) を加えた。フラスコに三方コックをつけ水素風船を取り付けフラスコ内を水素置換した 。そのまま撹拌し反応の進行を TLC (クロ口ホルム:メタノール =3 : 1)で追跡した。 16 時間後反応の終了を確認してパラジウムをろ過した。ろ液を減圧濃縮し、次の反応に そのまま用いた。
[0037] [ペプチド固相合成]
E) 公知のペプチド合成法によって、以下のペプチドを合成した。
ペプチド 1 Fmoc- Va卜 Pro- Gly- Va卜 Gly- Va卜 Pro- Gly- Va卜 Gly
ペプチド 2 Fmoc-Val-Pro-Gly-Val-Gly
ペプチド 3 Fmoc-Glu- Va卜 Pro— Gly— Va卜 Gly— Va卜 Pro— Gly— Va卜 Gly
ペプチド 4 Fmoc-Glu- Va卜 Pro- Gly- Va卜 Gly
ペプチド 5 Ac-Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly
ペプチド 6 Ac-Glu- Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly
精製は逆相 HPLCカラムによって行!、、 MALDI- MSスペクトル（アプライドバイオシス テム社製、 Voyager )によって、合成の確認を行った。
[0038] F) 化合物 1 (NH— Vaト Pro— Gly— Vaト Gly— Vaト Pro— Gly— Vaト Gly— pAP— Man)の合
2
成
ペプチド 1 (140 mg, 0.13 mmol)を脱水 DMFに溶かし、 0°Cに冷却した。 2-(1Η-7-ァザ ベンゾトリァゾールー 1 ィル)—1 , 1 , 3, 3—テトラメチルゥ口-ゥム へキサフルオロフォス フェート（HATU) (59.3 mg, 1.2 eq)とジイソプロピルェチルァミン（DIEA) (54 μ 1, 2.4 eq)をカ卩ぇ撹拌した。 p-アミノフヱ-ル a - D-マンノシドの DMF溶液（1.5 eq)を加え、 室温で撹拌した。反応の進行を TLC (クロ口ホルム:メタノール = 1 : 2)で追跡し、 3時 間後、 HATU 0.5 eqと DIEA 1.0 eqを加えた。一時間後反応を停止し溶媒を減圧濃縮 して除いた。 LH20ゲルカラム (フアルマシア社製、溶媒メタノール)で精製を行い、 Fmoc- Vaト Pro- Gly- Vaト Gly- Vaト Pro- Gly- Vaト Gly— pAP- Manを得た。
Fmoc— Vaト Pro— Gly— Vaト Gly— Vaト Pro— Gly— Vaト Gly— pAP— Manにピペリジン DMF溶 液 (20%)を加え、 2時間撹拌した。 Fmoc保護基が外れたのを確認してから溶媒を減圧 濃縮した。メタノールとァセトニトリル力 再結晶し遠心分離により固体を収集した。一 部を HPLC (0.1 %TFA水：メタノール = 1： 1 )でさらに精製し、白色固体 (化合物 1 )を 得た。
収量 6.3 mg 収率 4.4 %
純度 98.3 % (HPLC 0.1 %TFA水：メタノール = 1： 1で分析）
分子量 1113. 6[M+Na]+
[0039] G)化合物 4 (NH— Glu(pAP— Man)— Vaト Pro— Gly— Vaト Gly— Vaト Pro— Glv— Vaト Gl— p
2
AP-Man)の合成
ペプチド 3(140mg, 0.118 mmol)を脱水 DMFに溶かし、 0°Cに冷却した。 HATU(107 mg, 1.2 eq)と DIEA (90 μ 1, 2.4 eq)を加え撹拌した。 p-ァミノフエ-ル a - D-マンノシ ドの DMF溶液（1.5 eq)を加え、室温で撹拌した。反応の進行を TLC (クロ口ホルム:メ タノール = 1： 1)で追跡し、 24時間後反応を終了した。減圧濃縮して DMFを除き、 LH20ゲルカラム (溶媒メタノール)で精製を行った。得られた化合物 Fmoc- NH
2
-Glu(pAP-Man)-Val-Pro-Gly-Val-Gly- Va卜 Pro— Gly— Va卜 Gly— pAP— Manにピベリジ ン DMF溶液 (20%)をカ卩え、 30分ほど撹拌した。 Fmoc保護基が外れたのを確認してか ら溶媒を減圧濃縮した。逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（水:メタノール = 1： 1 )で精製し、凍結乾燥して白色固体を得た。
収量 37 mg
収率 21.3 %
純度 95.1 % (HPLC 0.1 %TFA水：メタノール = 1 : 1で分析）
分子量 1495. 7[M+Na]+
[0040] H)ィ匕合物 8 (Ac-Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly-pAP-Man)の合成 ペプチド 5(40mg, 0.091 mmol)を脱水ジメチルァセトアミドに溶かし、 0°Cに冷却した 。 HATU(26mg, 1.2eq)と DIEA(24 ;z 1, 2.4eq)を加え攪拌した。 pAP—マンノシドの DMA 溶液（1.5eq)をカ卩え、室温で攪拌した。反応の進行を TLC (クロ口ホルム:メタノール =2:3)で追跡し、 24時間後反応を停止し、溶媒を減圧濃縮して除いた。シリカゲルカラ ムクロマトグラフィー (溶媒:クロ口ホルム:メタノール = 2 : 3)、で精製し、残留シリカゲ ルを LH20カラム (溶媒:メタノール）にて取り除いた。凍結乾燥により、白色固体 (化合 物 8)を得た。
収量 38mg,
収率 73% 純度 97.2% (HPLC 0.1% TFA水：メタノール = 1:1で分析）
分子量 1155.3 [M+Na]+
[0041] I) CDスペクトル測定
以上のようにして得られた糖ペプチド (化合物 1と 4)の温度に伴うコンフオメーシヨン の変化を CDスペクトル (日本分光、 J-720)を用いて測定した。 5 X 10— 4 (M)の糖ぺプ チド PBSバッファー溶液を光路長 lmmの石英セルを用いて、 CDスペクトルの測定を 行った。
[0042] 化合物 1、化合物 4及び化合物 8の CDスペクトルを 5°Cから 50°Cまで温度を変化させ て、 CDスペクトルを測定した。 CDスペクトルは温度とともに変化して、構造の変化が 2 5°Cから 30°C付近で起こることが示された。この構造変化は対象ペプチドと同様の温 度変化をとり、特に化合物 1と 8についてはその挙動が類似していることから、ぺプチ ドのコンフオメーシヨン変化はエラスチンモデルペプチドとほぼ同じであることが示さ れた。化合物 1 (図 2、図 3)、化合物 4 (図 4、図 5)、化合物 8 (図 6、図 7)、対照化合 物（図 8、図 9)。
図 2、図 3 : (A)化合物 1の CDスペクトル（B) 220nmの各温度での [Θ] (但し、 Θは Molecular ellipticityを表す。以下同じ。）
図 4、図 5 : (A)化合物 4の CDスペクトル (B) 206nmの各温度での [Θ]
図 6、図 7 : (AM匕合物 8の CDスペクトル（B) 220nmの各温度での [Θ]
図 8、図 9 : (A)対照化合物の CDスペクトル（B) 220nmの各温度での [Θ]
[0043] J) 動的光散乱によるミセノレ形成の測定
動的光散乱（DLS、大塚電子 HK— 6600)によって、糖ペプチドの粒径の測定より、 ミセル形成につ!、て観察を行った。
[0044] 化合物 4 8また、対照分子として糖を有していないペプチド (NH
2
- Va卜 Pro- Gly- Va卜 Gly- Va卜 Pro- Gly- Va卜 Gly- OH)を温度を変化させて、溶液中で の粒径の測定を行った。化合物 1は 25°C以上で直径 のミセルを、化合物 4は直 径 400 のミセルを形成した。それに対して、対照ペプチド分子は非常に粒径の大き な凝集体を形成することがゎカゝつた。すなわち、エラスチンモデルペプチド (NH
2
-Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly-OH)に対して糖を付カ卩させると、高温 で両親媒性となり、一定の粒径のミセルを形成することが示される。（図 10)
[0045] N末端に保護基を付加させた、化合物 8では集合体を形成する温度が 35°C以上 へと変化し、 N末端の保護によって、集合体の形成温度をコントロールできることが示 された。
[0046] ポリ N-イソプロピルアクリルアミドなどの温度応答性高分子、エラスチンモデルぺプ チドの多量体力 なる温度応答性の高分子は巨大分子であるため、温度応答性に 対する時間的なレスポンスの遅れ (通常、数時間一 24時間）が観測される。それに対 して、本発明の糖ペプチドはオングストロームレベルの小分子力 なるため、早い応 答性を有しており、し力もその応答性は繰り返しても保たれる。
[0047] 化合物 1の溶液について、 15°Cと 35°Cの間の温度領域を 15分間で温度変化させ 、その温度変化を繰り返し、 15°Cと 35°Cにおける粒径測定を行った。化合物 1からな るミセルは、昇温により粒径が増大し、降温により粒径が減少するというサイクルを繰 り返し、少なくとも 5回のほぼ完全なミセル形成が観測されることがわ力つた。（図 5)
[0048] K)気液界面単分子膜形成による、分子集合性の測定
LB膜作成装置（日本レーザー電子株式会社）によって、糖ペプチドの気液界面で の集合性につ!、て解析を行った。
[0049] 化合物 1、また、対照分子として糖を有して!/、な 、ペプチド (NH
2
-Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly-OH)を用いた。これらペプチドを蒸留 したクロ口ホルムに溶解させ、溶液濃度 20 1とした。この化合物をノヽミルトンガスタイ トシリンジによって、気液界面に播種した。 10分静置したのち、 π -Α曲線の測定を行 つた。分子の温度応答的な疎水性部分の変化によって、気液界面の単分子膜の挙 動が変化した。温度が、 5, 10から 25°C程度に上昇させるにつれ、ペプチド部分が 疎水性に変化するため、分子間の相互作用が変化して、膜は膨張した。さらに、温度 を上昇させると、膜は凝集して、小さな分子占有面積をとるようになった。（図 12) [0050] 化合物 1について、温度が上昇した、 45度の π— A曲線は、分子占有面積が小さく なり、分子の π— A曲線のカーブも急峻に変化した。高温でのペプチドが両親媒性へ と変化するため、糖ペプチド分子の配向が界面に垂直に近い状態へと変化している ことが示された。（図 12) 産業上の利用可能性
本発明の温度応答性糖ペプチドは可逆的かつ、迅速な温度応答性を有し、ミセル を形成する。また、オングストロームレベルの温度応答性分子であるため、精密な応 答性を要するドラックデリバリーシステム (DDS)やそのほかの分子デバイスに用いら れる。
具体的には、生体に投与された薬物を必要な糸且織に必要な時に必要な量だけ送 達し、有効な薬物治療を行うドラックデリバリーシステムに本糖ペプチドを利用した場 合、本糖ペプチドはその迅速な温度応答性のため、生体の体温や皮膚温、もしくは 生体外部からの温度刺激に対して迅速に反応してミセル内包薬物を放出させるなど 、医学的 ·薬学的にも、或いは化粧料の分野においても、応用価値の高いものである 。また、糖鎖は細胞、病原菌、毒素、ウィルスと特異的な相互作用をするため、ミセル を形成させた本糖ペプチドは臓器特異的、あるいは病原菌や毒素特異的にも薬剤を 送達することができると考えられる。従って、本糖ペプチドは、放出制御型かつ標的 指向型と両者性質を兼ね備えた DDSに利用できるため、産業上非常に有用であると いえる。また、本糖ペプチドを修飾糖鎖として利用することもできる。例えば、タンパク 質の翻訳後修飾の一つである糖鎖修飾の過程にぉ ヽて、本糖ペプチドの糖鎖を利 用し目的のタンパク質に本糖ペプチドを結合させた場合、該タンパク質の構造を温 度応答的に変化させることが可能である。従って、本糖ペプチドは温度応答的に酵 素を含めタンパク質の失活あるいは活性の向上を制御することも可能であり、医薬的 にも非常に興味深いものである。

Claims

請求の範囲 天然には存在しな 、合成された糖ペプチドであって、下式（1)で表される糖ペプチド
[化 1]
L!- ptVal-Pro-Gly-X-Gly Lg-SUG (1)
(上式において Xは任意のアミノ酸残基であり、 L及び Lはリンカ一であり、 SUGは
1 2
糖鎖であり、 mは 0又は 1であり、 nは 1一 10の整数であり、 L及び Lは互いに同じで
1 2
あっても異なって 、てもよく、複数の SUGは互いに同じであっても異なって!/ヽても良 い。）
[2] 上式（1)における SUGが単糖又はオリゴ糖の糖鎖である請求項 1記載の糖ペプチド
[3] 上式（1)における X力 Valである請求項 1又は請求項 2記載の糖ペプチド。
[4] 上式（1)における mが 0である請求項 1一請求項 3の何れかに記載の糖ペプチド。
[5] 請求項 1一請求項 4の何れかに記載の糖ペプチドからなる温度応答性ミセル。
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