WO2005038023A1 - 発芽バキュロウィルスを用いた活性型膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の発現方法 - Google Patents

発芽バキュロウィルスを用いた活性型膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の発現方法 Download PDF

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WO2005038023A1
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membrane
protease protein
type protease
baculovirus
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PCT/JP2004/015668
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Yasuomi Urano
Takeshi Iwatsubo
Tatsuhiko Kodama
Takao Hamakubo
Taisuke Tomita
Ikuo Hayashi
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Toudai Tlo, Ltd.
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    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
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    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore

Definitions

  • the present invention relates to a method for expressing a membrane-type protease protein complex using a budding paculovirus. More specifically, the present invention relates to a method for expressing a membrane-type protease protein complex having protease activity, which comprises expressing a membrane-type protein complex in a germinated baculovirus released from a host. : Background technology
  • the baculovirus expression system utilizes a baculovirus highly expressed protein, particularly a polyhedrin gene promoter, and recombines the target gene in insect cells (such as Sf9 cells) to produce a large amount.
  • insect cells such as Sf9 cells
  • This is a system for expression.
  • Baculovirus expression systems that purify the expressed protein by introducing a gene encoding a recombinant protein into a polyhedron gene have more hydrophobic regions such as membrane proteins than expression systems that use Escherichia coli or Yeast bacteria. Proteins that have proteins have many advantages, such as the difficulty of aggregation of expressed proteins, and post-translational modifications required for protein functions such as addition of sugar chains and coordination of metal ions.
  • Baculoviruses have another life cycle in addition to being present in the nucleus as a polyhedral virus that has suffered from polyhedral proteins. That is, the virus proliferates and infects other cells / individuals, resulting in a budding virus (Budded virus).
  • This budding virus covers the cell membrane of Sf9 cells and exits the cell. At this time, seven transmembrane receptors that had been recombined into the polyhedrin protein were expressed on the Sf9 cell membrane. And recovered on the budding baculovirus envelope (Loisel TP! Ansanay H, St-Onge S, Gay B, Boulanger P, Strosberg AD, Marullo S, Bouvier II, Nat Biotechnol.
  • endoplasmic reticulum (ER) membranes such as SREBP (sterol regulatory element binding protein) 2, HMG'CoA (hydroxymethylcleylylcoenzyme A) reductase, SCAP (SREBP cleavage activating protein), SIP (site 1 protease), etc.
  • SREBP sterol regulatory element binding protein
  • HMG'CoA hydroxymethylcleylylcoenzyme A reductase
  • SCAP SREBP cleavage activating protein
  • SIP site 1 protease
  • GPCR G-protein coupled receptor
  • a high-affinity receptor can be obtained by creating a virus that expresses a subunit and reconstituting it on a budding virus (Masuda K, Itoh H, Sakihama T, Akiyama C, Takahas i K, Fukuda R, Yokomizo T, Shimiz T, Kodama T, Hamakubo T "J Biol Chem. 2003 278 (27) ⁇ 24552-24562, A combinatorial G protein-coupled receptor reconstitution system on budded baculovirus.Evidence for Galpha and Galp ao coupling to a human leukotriene B4 receptor.).
  • AD Alzheimer's disease
  • AD brain Is characterized by accumulation of an abnormal protein called / 3 amyloid in a two-sided relationship with neuronal loss (Selkoe DJ, Physiol Rev 2001, 81 (2): 741-766.
  • Alzheimer's disease genes, proteins, and therapy.).
  • 3 ⁇ ⁇ loid accumulates in AD3 ⁇ 4 in the form of senile plaques and pathological forms of vascular amyloid, and is biochemically composed of 40-42 amino acids.
  • ⁇ is produced by a two-step cleavage from precursor ⁇ and secreted extracellularly.
  • the C-terminal fragment of ⁇ is cleaved at the intramembrane part by the proteolytic activity of an enzyme called ⁇ -secretase, ⁇ / 3 is formed and released outside the cell.
  • the cleavage site is diverse, with 90% of the C-terminus of ⁇ / 3 occurring at position 40 and 10% at position 42 (Suzuki N et alScience 264: 1336, 1994), but its aggregation as j8 amyloid does not.
  • a / 34 is higher and accumulates preferentially in the AD brain from the beginning (Iwatsubo T, Odaka A, Suzuki N, Mizusawa H, Nukina N, Ihara Y. Neuron. 1994, 13 (l): 45-53 , Visualization of A beta 42 (43) and.
  • a beta 40 in senile plaques with end-specific A beta monoclonals evidence that an initially deposited species is A beta 42 (43).
  • the presenilin protein Presenilin; PS
  • PS the product of the major etiological gene of familial AD, has been shown to be consistent with the catalytic subunit of a-secretase, a membrane-bound aspartic protease (Wolfe MS).
  • ⁇ -secretase forms a giant intramembrane complex having a molecular weight of 250 to 500 kDa or more, including fragment-type presenilin, and binds to a complex component (cofactor) that is a membrane protein to form a protein. It has been shown that it exerts zease activity.
  • the present inventors in addition to presenilin, dicastrin (NCT), APH-1 and And PEN-2 together form the basic skeleton of the T-secretase complex (Takasugi ⁇ , Tomita T, Hayashi I, Tsuruoka M, Niimura M, Takahashi Y, Thinakaran G, Iwatsubo T Nature 2003, 422: 438-441 The role of presenilin cofactors in the r-secretase complex.) More recently, a number of presenilin-like membrane protein family molecules have been reported, one of them.
  • a-secretase has been regarded as a therapeutic target for AD, and it has been considered important to develop its inhibitor and establish a method for measuring its activity.
  • An object of the present invention is to provide a method for expressing an active membrane-type protease protein complex using a baculovirus and an insect cell expression system.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, created a virus that expresses presenilin, dicastrin, APH-1 and PEN-2, which are constituent molecules of the a-secretase complex, and germinated By reconstitution on the virus (Budded vis), we succeeded in obtaining an active ⁇ -secretase complex.
  • the reconstituted activity may be difficult to measure because the inactive protein is expressed in large amounts in the membrane fraction of Sf9 cells that expressed the ⁇ -secretase complex component by co-contamination.
  • the budding virus selectively accumulated the activated a-secretase complex.
  • the present invention has been completed based on these findings. That is, the present invention is as follows. (1) Eat a gene coding for a membrane-type protease protein and a gene coding for a complex constituent; baccus; virus; cultivate or breed an infected host, and germinate released from the host; A method for expressing a membrane-type protease protein complex, comprising expressing a complex of a membrane-type protease protein and a complex component in a baculovirus.
  • a baculovirus-infected host containing a gene encoding a membrane-type protease protein and a gene encoding a complex factor is cultured or bred, and germinated baculovirus is recovered from the culture or the host individual.
  • a method for producing an active membrane-type protease protein complex comprising collecting an active membrane-type protease protein complex from a collected substance.
  • an insect cell or an insect larva is used as a host.
  • the membrane-type protease protein includes presenilin, and the complex component includes dicastrin, APH-1 and PEN-2.
  • the budding baculovirus contains a membrane-type protease protein and a membrane-type protease protein complex (for example, T-secretase) formed by a complex factor.
  • Insect cells or insect larvae are used as hosts.
  • Examples of the membrane-type protease protein complex include a-secretase.
  • the present invention provides a method for screening a substance that promotes or inhibits the enzyme activity of an active membrane-type protease protein complex (for example, alpha-secretase), comprising contacting a test substance with the complex. And then measuring the protease activity of the complex.
  • an active membrane-type protease protein complex for example, alpha-secretase
  • FIG. 1 shows an outline of recovery of an active membrane-type protease protein using a budding baculovirus.
  • FIG. 2 shows the time course of human presenilin 1 expression (anti-human presenilin 1 antiserum Western plot).
  • FIG. 3 shows the results of Western blotting with each antibody in the BV fraction.
  • FIG. 4 shows the result of pulmonary dissection by co-immunoprecipitation of the ⁇ -secretase complex reconstituted in the BV fraction.
  • FIG. 5 shows a comparison of the expression level of the fragment type presenilin in the Sf9 membrane fraction and the BV fraction (Western plot using each antibody). .
  • FIG. 6 shows a comparison of in vitro secretase activity in the solubilized BV fraction.
  • FIG. 7 shows the results of enzymatic analysis of r-secretase activity reconstituted in the BV fraction.
  • the present invention relates to a method for culturing or breeding a host infected with a No5 kirovirus containing a gene encoding a membrane-type protease protein and a gene coding for a complex component, and germinating baculovirus released from the host. And a membrane-type protease protein complex.
  • a gene (cDNA) encoding a membrane-type protease is transfected into a baculovirus and infected with insect cells (for example, Sf9) or insects. Is accumulated. Proteases accumulated in infected cells and the like include active and inactive forms, whereas when proteases contained in viruses that germinate from infected cells are collected, the collected proteases Are only active forms (there are very few, if any, inactive proteases).
  • the present invention has been completed by paying attention to the fact that a budding type baculovirus contains an active form of a protease, and comprises expressing a protease protein complex in a budding type baculovirus. And collecting an active protease protein complex from the budding baculovirus.
  • Some membrane-type protease proteins activate by forming a complex with a specific protein.
  • Such a protein that forms a complex with the protease protein is referred to as “complex constituent factor” in the present invention.
  • the complex component and the membrane protein protein interact with each other between the complex components or between the complex factor and the membrane protein protein to exert the function of the membrane protease protein (ie, Activation).
  • the present invention includes a protein complex (for example, a-secretase) obtained by co-expressing a plurality of types of proteins such as a complex component.
  • a protein complex for example, a-secretase obtained by co-expressing a plurality of types of proteins such as a complex component.
  • the genes encoding these proteins may be contained in the same paculovirus or may be contained in different baculoviruses.
  • a recombinant baculovirus is prepared by introducing a gene encoding the above-mentioned membrane-type protease protein and a gene (one or more) encoding a complex component into a baculovirus. Or cultivate by infecting insects Nourish or breed. The budding baculovirus released from these hosts expresses a membrane-type protease protein complex. Then, the germinated baculovirus is recovered from the culture or the host individual. Further, by collecting the complex from the baculovirus, an activated membrane-type protease protein complex can be obtained.
  • the term “membrane type” broadly means that the target protein is present in a membrane, for example, a plasma membrane of a cell membrane, a virulence membrane, and an organelle (for example, an endoplasmic reticulum or a Golgi apparatus). I do.
  • "Protease” broadly means an enzyme capable of hydrolyzing proteins.
  • active form means having a function as a protease.
  • “In germinated baculovirus” means not only inside germinated baculovirus but also on the virus membrane.
  • the combination of the membrane-type protease protein and the complex component is not particularly limited.
  • This complex is called a secretase. That is, dicastrin, APH-1 and PEN-2 form r-secretase by forming a complex with presenilin, and the function of presenilin as a protease is exhibited.
  • Presenilin is a membrane protein identified as a causative gene of familial Alzheimer's disease, and is considered to be an active center subunit of T-secretase.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding human presenilin 1 is shown in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence of human presenilin 1 is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding human presedulin 2 is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of human presedulin 2 is shown in SEQ ID NO: 4.
  • Presenilin is activated intracellularly in combination with dicastrin, APH-1, and PEN-2, and is processed into 7 fragments.
  • Phosphorus is thought to constitute the active center of active ⁇ -secretase (Li YM, Xu M, Lai MT, Huang Q, Castro JL, DiMuzio Mower J, Harrison T, Lellis C, Nadin A, Neduvelil JG, Register RB, Sardana MK, Shearman MS, Smith AL, Shi XP, Yin KC, Shafer JA, Gardell SJ. Nature 2000, 405: 689-694 Photo activated gamma-secretase inhibitors directed to the active site covalently label presenilin 1.).
  • Nicastrin is a protein identified as one of the presenilin binding molecules (Yu G, Nishimura, Arawaka S, Levitan D, Zhang L, Tan don A, Song YQ, Rogaeva E, Chen F, Kawarai T, Supala A , Levesque L, Yu H, Yang DS, Holmes E, Milman P, Liang Y, Zhang DM, Xu DH, Sato C, Rogaev E, Smith M, Janus C, Zhang Y, Aebersold R, Farrer LS, Sorbi S, Bruni A, Fraser P, St George Hyslop P Nicastrin modulates presenilin-mediated notch / glp-1 signal transduction and betaAPP processing.Nature 2000, 407 (6800): 4854).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding human nicastrin is shown in SEQ ID NO: 5
  • the amino acid sequence of human nicastrin is shown in SEQ ID NO: 6.
  • APH-1 and ⁇ -2 were identified by genetic screening using nematodes as genes encoding proteins essential for a-secretase activity (Goutte C, Tsunozaki M, Hale VA, Priess JR (2002) APH-1 is a multipass membrane protein essential for the Notch signaling pathway in Caenorhabditis elegans embryos.Proc Natl Acad Sci USA 2002 Jan 22,99 (2): 775-779; Francis R, McGrath G, Zhang J , Ruddy DA, Sym M, Apfeld J, Nicoll M, Maxwell M, Hai B, Ellis MC, Parks AL, Xu W, Li J, Gurney M, Myers RL, Himes CS, Hiebsch R, Ruble C, Nye JS, Curtis D (2002) aph'l and pen-2 are required for Notch pathway signaling, gamma-secretase cleavage of betaAPP, and presenilin protein accumulation.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding human APH-la is shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence of human APH-la (having a 251 amino acid sequence: referred to as “251 type”) is shown in SEQ ID NO: 8.
  • APH-la has a variant (Alternative splicing variant) in which the C-terminal part is generated by alternative splicing.
  • This variant has 247 amino acid sequences (referred to as “type 247”) and 265 amino acid sequences (referred to as “type 265”).
  • the gene encoding type 247 is shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence of type 247 is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the gene encoding type 265 is shown in SEQ ID NO: 11, and the amino acid sequence of type 265 is shown in SEQ ID NO: 12.
  • SEQ ID NO: 13 shows the nucleotide sequence of the gene encoding human APH-lb
  • SEQ ID NO: 14 shows the amino acid sequence of human APH-lb
  • the nucleotide sequence of the gene encoding human PEN-2 is shown in SEQ ID NO: 15, and the amino acid sequence of human PEN-2 is shown in SEQ ID NO: 16.
  • Table 1 summarizes the nucleotide sequences of the genes encoding presenilin, dicastrin, APH-1 and PEN-2, and the amino acid sequences of these proteins.
  • APH-la (type 251) SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8
  • APH-la (type 247) SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10
  • APH-la (type 265) SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 of Table 1 but also presenilin,.
  • one or several (for example, 1 to 10) of these amino acid sequences (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, or 16) (Preferably 1 to 5) amino acids may be deleted, substituted, or added (mutant amino acid sequence).
  • function as an active membrane-type protease protein means a protease function (particularly an ⁇ -secretase function) that cleaves an intramembrane sequence in a hydrophobic environment.
  • the “stringent conditions” are, for example, a salt (sodium) concentration of 150 to 900 mM and a temperature of 55 to 75 ° C, preferably a salt (sodium) concentration of 250 to 450 mM and a temperature of 68 ° C. (Conditions for washing after hybridization).
  • Mutations can be introduced into the above mutant amino acid sequence by ordinary site-directed mutagenesis.
  • mutagenesis kit utilizing site-directed mutagenesis, for example QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Sutorataji Ichin Co. ), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (manufactured by Invitrogen), aKaRa Site-Directed Mutagenesis System (MutairK, Mutan-Super Express Km, etc .: manufactured by Yukara Bio Inc.).
  • the interaction between the active membrane-type protease protein complex and the substance to be catalyzed includes the interaction between the presenilin complex and a substrate (APP, Notch, ErbB4, cadherin, etc.). Interaction of presenilin complex with binding proteins (force tenin, KCMP, etc.), SpoIVFB and binding proteins (BofA, SpoIVFA Etc.).
  • binding proteins force tenin, KCMP, etc.
  • SpoIVFB binding proteins
  • the above-mentioned interaction involves, for example, infecting Sf9 cells with a cDNA encoding an unknown molecule, interacting with the presenilin complex or promoting or inhibiting some activation in the cells, and reducing the activity in the obtained paculovirus.
  • the substance to be changed may be considered.
  • Baculovirus in order to obtain an active membrane-type protease protein complex, at least one type of recombinant baculovirus containing a gene encoding a protease protein and a gene encoding a complex component can be used.
  • Baculovirus is an enveloped virus having a circular double-stranded DNA as a gene, and is a virus that infects insects and causes disease. It is susceptible to insects such as Lepidoptera, Hymenoptera and Diptera.
  • baculoviruses a group of viruses that make a large number of inclusions called polyhedra in the nuclei of infected cells is the nucleopolyhedrovirus (NPV).
  • Polyhedra are composed of a polyhedrin protein with a molecular weight of 31 kDa, are produced in large quantities late in infection, and have a large number of virus particles embedded therein. Polyhedra are essential for the virus to survive in the natural world, but are not necessary for the multiplication of the virus itself. Therefore, even if a foreign gene to be expressed is introduced in place of the polyhedron gene, the virus does not hinder at all. Infect and multiply.
  • baculovirus used in the present invention examples include Autographa californica NPV (AcNPV) of NPV subfamily, Bombyx mori NPV (BmNPV) of silkworm, and the like. Viruses can be used as vectors.
  • AcNPV Autographa californica NPV
  • BmNPV Bombyx mori NPV
  • Viruses can be used as vectors.
  • Spodoptera frugiveda is the host of AcNPV (infected, passaged cells) (Spodoptera frugiperda) cells (Sf cells) and the like, and BmNPV hosts (infected and passaged cells) include B ⁇ nl ⁇ cells and the like. Because Sf cells have a higher growth rate than BmN4 cells, etc., and AcNPV has the ability to infect human hepatocytes and human fetal kidney cells, Sf-AcNPV host-vectors are preferred. No.
  • Sf9 and Sf21 of the Spodoptera Frugiperda cell line have been established from the ovarian tissue of S. frugiperda larvae and are available from Invitrogen or Pharaiingen (San Diego, CA), ATCC, or the like.
  • live insect larvae eg, silkworms
  • the method for constructing the recombinant virus used in the present invention may be performed according to a conventional method, and can be performed, for example, by the following procedure.
  • a gene of a protein to be expressed is inserted into a transfer vector to construct a recombinant transfer vector.
  • the overall size of the transfer vector is generally several kb or less: about LOkb, of which about 3 kb is a plasmid-derived backbone, and antibiotic resistance genes such as ampicillin and bacterial DNA replication. Contains a start signal.
  • the 5 'region and the 3' region of the polyhedron gene are several kb each in addition to this backbone. Homologous recombination is caused with the body gene.
  • the transfer vector preferably contains a promoter for expressing the protein gene.
  • the promoter include a polyhedron gene promoter, a plO gene promoter, and a capsid gene promoter.
  • the type of transfer vector is not particularly limited, and for example, an AcNPV-based or BmNPV-based transfer vector can be used.
  • AcNPV transfer vectors include, for example, pEVmXIV2, pAcSGl, pVL1392 / 1393, pAcMP2 / 3, pAcJPl, pAcUW2l, pAcDZl, pBlueBacIII, pBlueBac4.5, pBlueBac4.5 / V5_His, pAcUW51, pAcAB3, pAc360, pAc360, pAc360 P Bl eBacHis2A) B, C, are like P VT-Bac33, pAcUWl, pAcUW42 / 43, Examples of BmNPV transfer vectors include the pBK283, pBK5, pBB30, pBE1, pBE2, -pBK3, pB-K52, pBKblue, pBKblue2, .pBF series, and the like. These transfer vector
  • the above-mentioned recombinant transfer vector was mixed with the virus (transfection) and then transferred to a cultured cell used as a host, or was previously infected with the virus.
  • the above transfer vector is transferred to cultured cells used as a host, and homologous recombination is caused between the recombinant transfer vector and virus genomic DNA to construct a recombinant virus.
  • cultured insect cells such as Sf9 cells and BmN cells
  • Culture conditions are appropriately determined by those skilled in the art. Specifically, when Sf9 cells are used, culture is preferably performed at about 28 ° C. in a medium containing 10% fetal bovine serum.
  • the recombinant virus thus constructed can be purified by a conventional method, for example, plaque assay.
  • the recombinant virus thus prepared cannot form a polyhedron because foreign DNA is substituted or inserted into the gene region of the polyhedron protein of the nuclear polyhedrosis virus. Therefore, it can be easily distinguished from non-recombinant virus.
  • the above-described recombinant baculovirus is infected into the above-mentioned appropriate host (cultured cells such as Sf9 and Sf21), and extracellular budding from the culture is carried out after a certain period of time (for example, after 72 hours).
  • the virus contained in the germinated baculovirus fraction can be obtained.
  • “Culture” refers to both culture supernatants and cells.
  • the recombinant baculovirus may be infected with only one type, or may be co-infected with a combination of two or more types of recombinant baculoviruses.
  • the extracellular budding baculovirus can be collected, for example, as follows. First, the culture of the infected cells is centrifuged at 500 to 1,000 g, and the supernatant containing extracellular budding virus is collected. Centrifuge this supernatant at about 30,000-50,000 g A precipitate containing the extracellular budding baculovirus can be obtained.
  • the budding cucumber quill collected as described above contains a membrane-type protease protein complex having a physiological activity.
  • the germinated baculovirus itself is also within the scope of the present invention.
  • the precipitate containing the extracellular budding baculovirus is suspended in an appropriate buffer, and the virus suspension is again applied on an appropriate concentration gradient (for example, a continuous gradient of sucrose) and centrifuged at 100,000 g. Separate and fractionate. From the obtained fractions, a fraction containing the desired protein complex can be collected.
  • an appropriate concentration gradient for example, a continuous gradient of sucrose
  • extracellular budding virus is recovered from the culture of the infected cells by centrifugation at, for example, 40,000 g.
  • the recovered pellet is suspended in an appropriate buffer, treated with a dissolving agent such as CHAPSO, and further centrifuged at 30,000 rpm to separate into a supernatant and a precipitate.
  • the solubilized target protein complex can be obtained from the supernatant.
  • the recombinant virus When an insect (eg, silkworm larva) is used as a host, the recombinant virus is inoculated into, for example, a 5th-instar silkworm larva, and the protease protein complex secreted into the body fluid of a silkworm individual 4 to 6 days later is used. It can be collected, separated and purified. Protease protein complexes can be obtained in large quantities from an organ called the silk gland.
  • the expressed protein complex (particularly the protein complex after treatment with a dissolving agent such as CHAPSO) is collected as its activated form.
  • the protein complex of the present invention is preferably at least 50% or more, more preferably 60% or more, further preferably 70% or more, further preferably 80% or more, further preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more. Activated form.
  • the protein complex of the present invention can be further purified by appropriate purification means, for example, various types of chromatography such as gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc., alone or in an appropriate combination.
  • appropriate purification means for example, various types of chromatography such as gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc., alone or in an appropriate combination.
  • the active membrane-type protease protein complex collected or purified in this manner is also included in the present invention. Confirmation that the collected or purified protein complex is the desired one can be performed by SDS-PAGE, Western blotting, ELISA or the like. It has been extremely difficult to obtain such an activated form of the membrane protease protein complex at a high ratio by the conventional method.
  • the present invention further comprises contacting a labeled test substance (for example, a ligand or a substrate) with an active membrane-type protease protein complex, and then detecting a signal of the test substance, whereby the protein complex and the protein complex are detected.
  • a labeled test substance for example, a ligand or a substrate
  • a membrane-type protease protein complex present in baculovirus can be used, but it is preferable to use an active membrane-type protease protein complex collected from baculovirus.
  • the method for measuring the interaction between the membrane-type protease protein complex and the test substance is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the ligand binding ability is measured using a labeled ligand.
  • the label any of a fluorescent label and a radiolabel may be adopted.
  • the fluorescent substance include Alexa, Pacific Blue, Cy2, FITC, Cy3, rhodamine, Texas Red, Cy5 and the like.
  • the radiolabelled substances 3 H, i3 C, i5N , 32 P and the like.
  • a germinated paculovirus containing a membrane-type protease protein complex in a buffer containing a ligand labeled with the above-mentioned labeling substance using a buffer solution suitable for binding, or recovery or purification as described above
  • the activated membrane-type protease protein complex is brought into contact (reaction).
  • the reaction conditions are appropriately selected depending on the type of the combination of the protease and the ligand.
  • the reaction solution after the reaction is absorbed and filtered on a solid support such as an appropriate filter to stop the reaction, the solid support is washed and dried, and only the complex is immobilized on the solid support.
  • the interaction between the membrane-type proteinase protein complex and the ligand (ie, ligand binding) Function can be measured.
  • the present invention provides a method for preparing a complex after contacting a test substance with the complex of the present invention.
  • a method for screening a substance that promotes or inhibits the enzymatic activity of an active membrane-type protease protein complex by measuring the protease activity is provided.
  • Test substances to be screened include, for example, peptides, polypeptides, synthetic compounds, fermented microorganisms, extracts from organisms (including plant or animal tissues, microorganisms, cells, etc.), or extracts thereof.
  • Libraries. Libraries include synthetic compound libraries (such as combinatorial libraries) and peptide libraries (such as combinatorial libraries).
  • the chemicals to be screened may be natural or synthetic, and even if a single candidate chemical is tested independently, a mixture of several candidate chemicals (such as a library) May be tested. It is also possible to screen a fractionated mixture, such as a cell extract, to isolate a substance having the desired activity by repeating the fractionation.
  • a molecule or a ligand-like substance acting on an active membrane-type protease protein complex acts on any of the molecules in the complex. It is also possible to perform the assay using a protein complex.
  • test substances may be substances that are expected to promote or inhibit the interaction between the membrane-type protease protein (complex) and the substrate, or the interaction between the membrane-type protease protein and the complex constituent factor. preferable.
  • the screening method of the present invention it is possible to screen for an inhibitor or an activating drug for a membrane-type protease protein or a membrane-type protease protein complex.
  • a substance that promotes or inhibits the interaction between a membrane-type protease protein (complex) and a substrate or the interaction between a membrane-type protease protein and a component of a complex, which is obtained by the screening method of the present invention, is also included in the present invention. Within range.
  • active forms are included.
  • This active protein complex is immobilized on a substrate. Then you can get a protein chip.
  • the protein chip thus prepared can be used to screen substances that interact with the ... active membrane type.
  • Protease protein complex An active membrane-type protease protein complex is bound to a chip coated with an ion-exchange resin or metal ions, a sample to be screened is added to the chip, and a mass spectrometer (for example, MALDI-TOF, ESI / Q-TOF type). The change in mass makes it possible to identify interacting substances.
  • mass spectrometer for example, MALDI-TOF, ESI / Q-TOF type
  • Human presenilin 1 full-length cDNA was added to pBlueBac4.5TM vector (Invitrogen, Carlsbad, CA), human nicastrin or human APH-la full-length cDNA with an artificially added C-terminal tag was added to pBlueBac4.5, and human The PEN-2 full-length cDNA was incorporated into pBlueBacHis2A to prepare pBlueBac_PSl, pBlueBac'NCT-V5 / His, pBlueBac-APH-la-myc / His and pBlueBac-His-PEN-2, respectively.
  • Sf9 cells (Invitrogen) were incubated at 27 ° C in complete medium (Grace's supplemented media (GIBCOBRD) containing 10% fetal calf serum (Sigma), 100 units / ml of nisililine and 100 g / ml of straffin machine). The cells were subcultured into 10 cm diameter dishes, and the large-scale culture was performed in a 500 mL spinner flask (Wheaton) by adding 0.001% pluronic F-68 (GIBCO BRL) to the complete medium.
  • GIBCOBRD Gibric acid containing 10% fetal calf serum (Sigma), 100 units / ml of nisililine and 100 g / ml of straffin machine.
  • the cells were subcultured into 10 cm diameter dishes, and the large-scale culture was performed in a 500 mL spinner flask (Wheaton) by adding 0.001% pluronic F-68 (GIBCO BRL) to the complete medium.
  • Bac-N_Blue DNA from ApMNPV
  • pBlueBac.PSl BlueBac-NCT-V5 / His
  • a recombinant virus was prepared by co-infection with His or pBlueBac-ffis-PEN-2.
  • the addition of the tag was performed as follows.
  • Human APH-la was cloned into the pEF4 / myc / HisA vector (Invitrogen), and the cDNA containing the myc / His tag derived from the vector at the C-terminal side was incorporated into pBlueBac4.5.
  • human APH-la type 251 was used.
  • the precipitate was suspended in a cell disruption buffer (HEPES buffer containing 10% glycerol (10 mM HEPES H 7.4, 150 mM NaCl, Complete inhibitor cocktail (Roche Applied Science))), disrupted with a homogenizer, and then l, Centrifuged at 500 xg for 10 minutes. The supernatant was further centrifuged at 100,000 xg for 1 hour, and the precipitate was suspended in HEPES buffer to obtain a Sf9 cell membrane fraction. The supernatant after centrifugation at l, 000xg was centrifuged at 40,000xg for 30 minutes, and the precipitate was suspended in phosphate buffered saline (PBS) and further centrifuged at 40,000xg for 30 minutes.
  • HEPES buffer containing 10% glycerol 10 mM HEPES H 7.4, 150 mM NaCl, Complete inhibitor cocktail (Roche Applied Science)
  • the precipitate was centrifuged at l, 000x for 10 minutes, the supernatant was further centrifuged at 40,000xg for 30 minutes, and the precipitate was suspended in PBS to obtain a budding virus fraction (BV fraction).
  • BV fraction budding virus fraction
  • Anti-PS1 antiserum that recognizes human presenilin 1 (Fig. 2 “GlNr2”) using cell membrane fraction (Fig.
  • Human presenilin 1, Hitoni refuse removing emissions, human APH-la, each expression recombinant virus of human PEN-2, Sf9 cells 200ml of 2Xl0 6 cells / ml concentration, were infected with the respective virus per MOI 2 by various combinations After 72 hours, a BV fraction was prepared.
  • the expression levels of the ⁇ -secretase component in the BV fraction were as follows: anti-PS1 antiserum that recognizes human presenilin 1, anti-V5 antibody that recognizes V5 tag added to human nicastrin (Invitrogen), and myc added to APH-la.
  • Anti-myc antibody that recognizes tags (Roche Or Western Signaling using Cell Signaling Technology) and an anti-II-2 antibody that recognizes human PEN-2 (Figure 3).
  • the combination of each protein is indicated by a “+” sign.
  • "GlNr2" and “G1L3” are antibodies against human presenilin
  • "V5" is an antibody that recognizes the V5 tag added to human nicastrin
  • "myc” is a myc tag added to APH-la.
  • the antibody “PNT_3” indicates an antibody against human PEN-2.
  • anti-GlL3J recognizes an antibody against human presenilin 1 (PS1 CTF, a fragment of human presenilin 1)
  • anti-V5 "recognizes the V5 tag added to dicastrin (NCT).
  • the antibody “anti-myc” indicates an antibody that recognizes the myc tag added to APH-la
  • anti-PNT3 indicates an antibody against human PEN-2.
  • an active membrane-type protease protein or an active membrane-type protease protein complex can be expressed in a baculovirus.
  • ADVANTAGE OF THE INVENTION it becomes possible to selectively express the active protein complex of a membrane-type protease (for example, presenilin or the like) that functions by forming a complex, and inhibits or promotes the binding to a substrate. It can be used for screening for substances.
  • SEQ ID NO: 17 V5 peptide sequence
  • SEQ ID NO: 18 V5 tag nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 19 His evening peptide sequence.
  • SEQ ID NO: 20 His tag nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 21 Myc tag peptide sequence
  • SEQ ID NO: 22 mvc nucleotide sequence

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Abstract

本発明は、膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードする遺伝子を含むバキュロウイルスを感染させた宿主を培養又は飼育し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルス中に膜型プロテアーゼ蛋白質と複合体構成因子との複合体を発現させることを特徴とする、膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の発現方法を提供する。

Description

明 細 書 発芽バキュロウィルスを用いた活性型膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の発現方法 技術分野
本発明は、 発芽パキュロウィルスを用いた膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の 発現方法に関する。 より詳細には、 本発明は、 宿主から放出される発芽バキュ口 ウィルス中に膜型蛋白質複合体を発現させることを特徴とする、 プロテアーゼ活 性を有する膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の発現方法に関する。 ： 背景技術
バキュロウィルス発現系は、 バキュロウィルスの高発現蛋白質、 特に多角体蛋 白質 （polyhedrin) 遺伝子のプロモーターなどを利用して、 目的遺伝子を昆虫細 胞 （Sf9 細胞など） で組換えを起こさせて大量に発現させる系である。 多角体遺 伝子に組換えタンパク質をコードする遺伝子を導入し、 発現したタンパク質を精 製するバキュロウィルス発現系は、 大腸菌やィースト菌を用いる発現系に比べ、 膜蛋白質などの疎水性領域を多く持つ蛋白質でも発現タンパク質が凝集を作りに くく、 また糖鎖の付加や金属イオンの配位等のタンパク質の機能に必要な翻訳後 修飾が生じるなど利点が多いため、 膜受容体蛋白質の発現系として多用されてい る (Tate CG, Griss ammer R.， Trends in Biotechnology 1996, 14， pp426-430, Heterologous expression of G-protein-coupled receptors ;及び、 Grisshammer R, Tate CG, Quarterly Reviews of Biophysics 1995, 28, pp315'422， Overexpression oi integral membrane proteins for structural studies)。
バキュロウィルスには、 多角体蛋白質を被った多角体ウィルスとなって核内に 存在する他に、 もう一つの生活環がある。 すなわち、 ウィルスが増殖して他の細 胞ゃ個体に感染するために発芽型のウィルス （Budded virus) となり、 この発芽 型ウィルスが Sf9細胞の細胞膜を被って細胞外に出るというものである。 この際 に、 上記の多角体蛋白質に組換えた 7回膜貫通型受容体が Sf9の細胞膜に発現さ れ、発芽したバキュロウィルスのエンベロープ上に回収されることが Loiselらに よって報告された （Loisel TP! Ansanay H, St-Onge S, Gay B, Boulanger P, Strosberg AD, Marullo S, Bouvier Μ·， Nat Biotechnol. 1997, Nov. 15(12), ppl300-1304, Recovery of homogeneous and functional beta 2-adrenergic receptors from extracellular baculo virus particles)。宿主糸 E に発現された 7 IHj 膜貫通型受容体は、 糖鎖構造など機能的でないものが多いのに対し、 ウィルスェ ンべロープ上に回収される受容体は機能的な蛋白質のみであることが報告されて いる。
また、 SREBP(sterol regulatory element binding protein) 2、 HMG'CoA (ヒ ドロキシメチルクル夕リルコェンザィム A) 還元酵素、 SCAP (SREBP cleavage activating protein)、 SIP ( site 1 protease) などの小胞体 (ER) 膜又はゴルジ体 膜に分布する膜蛋白質群 （例えば細胞内コレステロールフィードパック調節に関 与するもの） も、 機能を保ったままウィルスエンベロープ上に発現されることが 報告された (Ishihara, G„ Shirai, H" Yamaguchi, Μ·， Fukuda, ., Hamakubo, T.， and Kodama, T.， Atherosclerosis, 151, p290, 2000, Expression of cholesterol regulatory proteins on extracellular baculoviruses)。 さらに、 G蛋白質共役型 受容体 （GPCR; G-protein coupled receptor) は、 膜貫通ドメインを 7つ持ち、 3量体 G蛋白質と共役 （カップリング） しているが、 受容体蛋白質と G蛋白質の サブュニッ卜とを発現するウィルスを作成し、 発芽ウィルス上で再構成すること により、 親和性の高い受容体を得る事が可能であることが報告されている (Masuda K, Itoh H， Sakihama T， Akiyama C, Takahas i K, Fukuda R, Yokomizo T, Shimiz T， Kodama T, Hamakubo T" J Biol Chem. 2003 278(27)^24552-24562, A combinatorial G protein-coupled receptor reconstitution system on budded baculovirus. Evidence for Galpha and Galp ao coupling to a human leukotriene B4 receptor.)。
ところで、 アルツハイマー病 (Alzheimer's disease, AD)は、 大脳皮質の神経細 胞の変性 ·脱落により、 記憶を中心に広汎な知的機能の障害を呈する神経変性疾 患であり、 老年者に生じる痴呆の原因としては最も頻度が高い。 AD 脳において は、 神経細胞脱落と表裏一体の関係をもって /3アミロイドと呼ばれる異常タンパ ク質が蓄積する.ことが特徵 _で¾る （Selkoe DJ, Physiol Rev 2001， 81(2)：741-766. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy.)。 ）3 ^■ロイドは、 AD ¾に 老人斑、 血管アミロイドの病理学的形態をとつて蓄積し、 生化学的には 40〜42 アミノ酸からなる Α )3ペプチドから構成される。 Α βは前駆体 ΑΡΡから 2段階の 切断を受けて生成され、 細胞外に分泌される。 この第 2段階目において、 ァ -セク レターゼと呼ばれる酵素の蛋白質分解活性により ΑΡΡの C末端断片は膜内部分 で切断を受け、 Α /3が形成されて細胞外に放出される。 その切断部位には多様性 があり、 Α /3の C末端の 90%は 40位、 10%は 42位で生じるが （Suzuki N et alScience 264:1336， 1994)、 j8アミロイドとしての凝集性は A /3 42がより高く、 AD脳においても初期から優先的に蓄積する (Iwatsubo T, Odaka A， Suzuki N， Mizusawa H， Nukina N, Ihara Y. Neuron. 1994, 13(l):45-53， Visualization of A beta 42(43) and. A beta 40 in senile plaques with end-specific A beta monoclonals: evidence that an initially deposited species is A beta 42(43).)。 家族性 AD の主要な病因遺伝子の産物であるプレセ二リン蛋白質 (presenilin; PS)は、 膜結合型ァスパラギン酸性プロテアーゼであるァ -セクレターゼの触媒サ プュニットに一致することが示されている（Wolfe MS, Xia W, Ostaszewski BL, Diehl TS, Kimberly WT, Selkoe DJ (1999) Two transmembrane aspartates in presenilin-1 required for presenilin endoproteolysis and garnma'secretase activity. Nature 398(6727)：513-517 Li YM, Xu M, Lai MT, Huang Q, Castro JL, DiMuzio Mower J, Harrison T, Lellis C, Nadin A, Neduvelil JG, Register KB, Sardana MK, Shearman MS, Smith AL, Shi XP, Yin C, Shafer JA， Gardell SJ (2000) Photoactivated gamma- secretase inhibitors directed to the active site covalently label presenilin 1. Nature 2000 Jun 8,405(6787):689'94.)。
また、 ァ -セクレターゼは、 フラグメント型プレセ二リンを含む、 分子量 250〜 500キロダルトン以上の巨大膜内複合体を形成し、 膜蛋白質である複合体構成因 子 (cofactor)と結合してプロテァ一ゼ活性を発揮することが明らかとなっている。 そして、 本発明者らは、 プレセ二リンに加えて、 二カストリン (NCT)、 APH-1及 び PEN-2と呼ばれる 3種類の膜蛋白質が共同して T -セクレターゼ複合体の基本 骨格を形成す _¾ことを明ら にした （Takasugi Ν,. Tomita T, Hayashi I, Tsuruoka M， Niimura M， Takahashi Y, Thinakaran G, Iwatsubo T Nature 2003， 422:438-441 The role of presenilin cofactors in the r -secretase complex.) さらに最近、 プレセ二リン様の膜蛋白質ファミリー分子が多数報告 され、 それらのうちひとつが新規プロテアーゼ SPPであることが明らかにされ、 γ -セクレターゼ同様の膜結合型プロテアーゼが多数存在することが示唆されて レ る (Weihofen A, Martoglio B. Intramembrane-cleaving proteases: controlled liberation of proteins and bioactive peptides. (2003) Trends Cell Biol. 13(2):71-78)。
このような状況のもと、 ァ -セクレターゼは ADの治療標的として重視され、 そ の阻害剤開発及び活性測定法の確立が重要と考えられてきた。 しかし、 膜内で蛋 白質分解酵素活性を示し、 複数の膜蛋白質からなるプロテア一ゼ複合体として形 成されるァ-セクレ夕一ゼを、活性を保った状態で再構成することは従来困難とさ れてきた。 発明の開示
本発明は、 バキュロウィルスと昆虫細胞発現システムを用いて、 活性型の膜型 プロテア一ゼ蛋白質複合体を発現させるための方法を提供することを目的とする。 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、 ァ -セクレターゼ複 合体の構成分子であるプレセ二リン、 二カストリン、 APH-1及び PEN-2を発現 するウィルスを作成し、 発芽ウィルス （Budded vi s) 上で再構成することによ り、活性型ァ-セクレ夕一ゼ複合体を得ることに成功した。 このとき共 染により ァ -セクレターゼ複合体構成因子を発現させた Sf9 細胞の膜画分では不活性型の 蛋白質が大量に発現されているため、 再構成された活性を測定しにくいという可 能性があった。 ところが、 発芽型ウィルスには、 活性型ァ -セクレターゼ複合体が 選択的に集積していた。 本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。 すなわち、 本発明は以下の通りである。 ( 1 ) 膜型プロテアーゼ蛋白質をコ一ドする遺伝子及び複合体構成因子をコード する遺伝子を食.むバキュ口.ウイ.ルス ¾感染させた宿主を培養又は飼育し、 該宿主 から放出される発芽バキュロウィルス中に膜型プロテアーゼ蛋白質と複合体構成 因子との複合体を発現させることを特徴とする、 膜型プロテア一ゼ蛋白質複合体 の発現方法。
( 2 ) 膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコード する遺伝子を含むバキュロウィルスを感染させた宿主を培養又は飼育し、 培養物 又は宿主個体から発芽バキュロウィルスを回収し、 得られる回収物から活性型の 膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を採取することを特徴とする、 活性型の膜型プロ テア一ゼ蛋白質複合体の製造方法。
( 3 )上記 (1)又は (2)記載の発明において、膜型プロテアーゼ蛋白質としてはプレ セニリンが拳げられ、複合体構成因子としては二カストリン、 APH-1及び PEN-2 が挙げられる。 これらのプロテア一ゼ及び複合体構成因子により形成される膜型 プロテア一ゼ蛋白質複合体は、 ァ -セクレターゼである。
また、上記 (1)又は (2)記載の方法において、宿主として昆虫細胞又は昆虫幼虫が 使用される。
( 4 ) 膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコード する遺伝子を含むバキュロウィルスを感染させた宿主が放出する、 発芽バキュ口 ウィルス。
. ここで、 膜型プロテアーゼ蛋白質としては、 プレセ二リンが挙げられ、 複合体 構成因子としては二カストリン、 APH-1及び PEN-2が挙げられる。
上記発芽バキュロウィルスは、 膜型プロテアーゼ蛋白質及び複合体構^ g因子に より形成される膜型プロテア一ゼ蛋白質複合体（例えば T -セクレ夕一ゼ） を含有 する。
また、 宿主として昆虫細胞又は昆虫幼虫が使用される。
( 5 ) 上記発芽バキュロウィルスから採取される、 活性型の膜型プロテアーゼ蛋 白質複合体。膜型プロテア一ゼ蛋白質複合体としては、 例えばァ -セクレターゼが 挙げられる。 ( 6 ) 活性型の膜型プロテア一ゼ蛋白質複合体 （例えばァ -セクレターゼ） と相互 作用する物質を.分析する方去 あつて、 標識された被験物笋と上記複合体とを接 触させた後、 当該被験物質のシグナルを検出することを含む前記方法。
さらに、 本発明は、 活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体 （例えばァ-セクレ 夕ーゼ）の酵素活性を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法であって、 被験物質と上記複合体とを接触させた後、 当該複合体のプロテアーゼ活性を測定 することを含む方法を提供する。
( 7 ) 上記活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体 （例えば T -セクレ夕一ゼ） が 配列されたプロテインチップ。 図面の簡単な説明
図 1は、 発芽型バキュロウィルスを用いて活性型膜型プロテアーゼ蛋白質を回 収する概要を示す。
図 2は、 ヒトプレセニリン 1発現のタイムコース （抗ヒトプレセニリン 1抗血 清ウェスタンプロット） を示す。
図 3は、 BV画分における各抗体によるウエスタンブロッ卜の結果を示す。 図 4は、 BV画分に再構成されたァ-セクレ夕一ゼ複合体の免疫共沈法による解 祈の結果を示す。
図 5は、 Sf9膜画分及び BV画分におけるフラグメント型プレセ二リン発現量 の比較 （各抗体によるウエスタンプロット） を示す。 .
図 6は、可溶化された BV画分におけるインビトロア-セクレ夕ーゼ活性の比較 を示す。
図 7は、 BV画分に再構成された r -セクレ夕一ゼ活性の酵素学的解析結果を示 す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。 本発明は、 膜型プロテアーゼ蛋白質をコ一ドする遺伝子及び複合体構成因子を コードする遺伝子を含むノ 5キ ロウィルスを感染させた宿主を培養又は飼育し、 該宿主から放出される発芽バキュロウィルス中に膜型プロテアーゼ蛋白質複合体 を発現させることを特徴とするものである。
図 1に示すように、 膜型プロテアーゼをコードする遺伝子 （cDNA) をバキュ ロウィルスに卜ランスフエクトし、 これを昆虫細胞 （例えば Sf9)又は昆虫に感染 させると、 感染細胞内又は感染昆虫の体内にプロテアーゼが蓄積される。 感染細 胞等に蓄積されるプロテア一ゼには活性型と不活性型が含まれているのに対し、 感染細胞等から発芽するウィルス中に含まれるプロテアーゼを採取すると、 採取 されたプロテア一ゼは活性型のもののみとなる （不活性型のプロテアーゼが含ま れていたとしてもごくわずかである）。本発明は、発芽型のバキュロウィルス中に 活性型となるプ口テア一ゼが含まれている点に着目して完成されたものであり、 発芽型バキュロウィルスにプロテアーゼ蛋白質複合体を発現させることを特徴と し、 また、 発芽型バキュロウィルスから活性型プロテアーゼ蛋白質複合体を採取 することを特徴とする。
膜型プロテア一ゼ蛋白質の中には、 特定の蛋白質と複合体を形成して活性化す るものが存在する。 このように、 プロテアーゼ蛋白質と複合体を形成する蛋白質 を、 本発明において 「複合体構成因子」 という。 複合体構成因子及び膜型プロテ ァーゼ蛋白質は、 複合体構成因子同士で、 あるいは複合体構成因子と膜型プロテ ァーゼ蛋白質との間で、 それぞれ相互作用して膜型プロテアーゼ蛋白質の機能を 発揮 （つまり活性化） させる。
本発明では、 複合体構成因子等の複数種類の蛋白質を共発現させて得られる蛋 白質複合体 （例えばァ -セクレターゼ） を含む。 複数種類の蛋白質を共発現させる 場合は、 これらの蛋白質をコードする遺伝子を同一のパキュロウィルス中に含め てもよいし、 異なるバキュロウィルス中に含めてもよい。
本発明においては、 上記膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子、 及び複 合体構成因子をコードする遺伝子 （1種又は複数種） をバキュロウィルスに導入 して組換えバキュロウィルスを作製し、 これを昆虫細胞又は昆虫に感染させて培 養又は飼育する。 これらの宿主から放出される発芽バキュロウィルス中に膜型プ 口テア—ゼ蛋 g質複合体を発舆させる。 そして、 培養物又は宿主個体から発芽バ キュロウィルスを回収する。 さらに、 バキュロウィルスから当該複合体を採取す ることで、 活性化された膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を得ることができる。 ここで、 本発明において 「膜型」 とは、 対象の蛋白質が膜、 例えば細胞膜、 ゥ ィルス膜及び細胞内小器官 （例えば、 小胞体やゴルジ体等） の形質膜に存在する ことを広く意味する。 また、 「プロテアーゼ」 とは蛋白質を加水分解する能力を有 する酵素を広く意味する。 そして、 「活性型」 とは、 プロテアーゼとしての機能を 有することを意味する。 「発芽バキュロウィルス中」 とは、 発芽バキュロウィルス の内部だけでなく、 ウィルス膜上も意味する。
2 . 膜型プロテアーゼ蛋白質複合体
膜型プロテアーゼ蛋白質と複合体構成因子との組み合わせは特に限定されず、 例えば、 膜型プロテアーゼ蛋白質であるプレセ二リンと、 複合体構成因子である 二カストリン、 APH-1及び PEN-2と呼ばれる 3種の蛋白質とにより構成される 複合体が挙げられる。 この複合体はァ-セクレタ一ゼと呼ばれている。 すなわち、 二カストリン、 APH-1及び PEN-2がプレセ二リンと複合体を形成することによ つて r -セクレターゼとなり、プレセニリンのプロテアーゼとしての機能が発揮さ れる。
プレセ二リンは、 家族性アルツハイマー病の原因遺伝子として同定された膜蛋 白質であり、 T -セクレターゼの活性中心サブュニッ卜であると考えられている。 (Sherrington R, Rogaev EI, Liang Ύ, Rogaeva EA, Levesque G, Ikeda M， Chi H, Lin C, Li vi, Holm an K, et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature. 1995, 375(6534):754-760)。 ヒトプレセニリン 1をコードする遺伝子の塩基配列を配列 番号 1に、 ヒトプレセニリン 1のアミノ酸配列を配列番号 2に示す。 ヒトプレセ 二リン 2をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号 3に、 ヒトプレセ二リン 2の ァミノ酸配列を配列番号 4に示す。 プレセニリンは、 細胞内で二カストリン、 APH-1、 PEN-2と共役して活性化さ れ、プロセシングを受けて 7ラグメントとなる。（Takasugi N， Tomita T， Hayashi I, Tsuruoka M， Niimura M, Takahashi Y, Thinakaran G, Iwatsubo T Nature 2003, 422:438-441 The role of presenilin cofactors in the r -secretase complex.) このフラグメント型プレセ二リンが活性型ァ -セクレターゼの活性中 心サブュニットを構成しているものと考えられている （Li YM, Xu M, Lai MT, Huang Q, Castro JL, DiMuzio Mower J, Harrison T, Lellis C, Nadin A, Neduvelil JG, Register RB, Sardana MK, Shearman MS, Smith AL， Shi XP, Yin KC, Shafer JA， Gardell SJ. Nature 2000, 405:689-694 Photo activated gamma-secretase inhibitors directed to the active site covalently label presenilin 1.)。
二カストリンは、 プレセニリン結合分子の一つとして同定された蛋白質である (Yu G, Nishimura , Arawaka S, Levitan D， Zhang L, Tan don A, Song YQ, Rogaeva E, Chen F, Kawarai T, Supala A, Levesque L, Yu H, Yang DS, Holmes E, Milman P, Liang Y, Zhang DM, Xu DH, Sato C, Rogaev E, Smith M, Janus C, Zhang Y, Aebersold R, Farrer LS, Sorbi S, Bruni A, Fraser P, St George Hyslop P Nicastrin modulates presenilin-mediated notch/glp-1 signal transduction and betaAPP processing. Nature 2000, 407(6800):48·54·)。 ヒ卜ニカス卜リンを コードする遺伝子の塩基配列を配列番号 5に、 ヒトニカストリンのアミノ酸配列 を配列番号 6に示す。
APH-1及び ΡΕΝ-2は、 線虫を用いた遺伝学的スクリーニングにより、 ァ -セク レターゼ活性に必須の蛋白質をコードする遺伝子として同定されたものである (Goutte C, Tsunozaki M, Hale VA, Priess JR (2002) APH-1 is a multipass membrane protein essential for the Notch signaling pathway in Caenorhabditis elegans embryos. Proc Natl Acad Sci U S A 2002 Jan 22,99(2)：775-779； Francis R, McGrath G, Zhang J, Ruddy DA, Sym M， Apfeld J, Nicoll M, Maxwell M， Hai B, Ellis MC, Parks AL, Xu W, Li J, Gurney M, Myers RL, Himes CS, Hiebsch R, Ruble C, Nye JS, Curtis D (2002) aph'l and pen-2 are required for Notch pathway signaling, gamma-secretase cleavage of betaAPP, and presenilin protein accumulation. Dev Cell 3:85-97 )。 ヒ 卜 APH-laをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号 7に、 ヒト APH-laのァミノ 酸配列 （251個のアミノ酸配列を有するもの：「251型」 という） を配列番号 8に 示す。
ここで、 APH-laには、 その C末端部分が選択的スプライシングにより生じた 変異体 (Alternative splicing variant)が存在する。 この変異体は 247個のアミノ 酸配列 （「247型」 という） 及び 265個のアミノ酸配列 （「265型」 という） を有 している。 247型をコードする遺伝子を配列番号 9に、 247型のアミノ酸配列を 配列番号 10に示す。 また、 265型をコードする遺伝子を配列番号 11に、 265型 のアミノ酸配列を配列番号 12に示す。
ヒト APH-lbをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号 13に、 ヒト APH-lb のアミノ酸配列を配列番号 14に示す。 また、 ヒト PEN-2をコードする遺伝子の 塩基配列を配列番号 15に、 ヒト PEN-2のアミノ酸配列を配列番号 16に示す。 プレセ二リン、 二カストリン、 APH-1及び PEN-2をコードする遺伝子の塩基 配列、 並びにこれらの蛋白質のアミノ酸配列の配列番号を表 1にまとめた。
表 1
塩基配列 ァミノ酸配列
プレセニリン 1 配列番号 1 配列番号 2
プレセ二リン 2 配列番号 3 配列番号 4
二カス卜リン 配列番号 5 配列番号 6
APH-la (251型） 配列番号 7 配列番号 8
APH-la (247型） 配列番号 9 配列番号 10
APH-la (265型） 配列番号 11 配列番号 12
APH-lb 配列番号 13 配列番号 14
PEN-2 配列番号 15 配列番号 16 ここで、 本発明においては、 表 1の配列番号に示すアミノ酸配列のみならず、 プレセニリン、 ..二カストリ 、. APH-1及び PEN-2が複台.体を形成したときに活 性型膜型プロテアーゼ蛋白質複合体としての機能を有する限り、 これらのァミノ 酸配列 (配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14又は 16) において 1個又は数個 （例 えば 1個〜 10個、 好ましくは 1個〜 5個） のアミノ酸が欠失、 置換又は付加され たアミノ酸配列（変異型アミノ酸配列） を含むものであってもよい。 「活性型膜型 プロテアーゼ蛋白質としての機能」 とは、 疎水性環境にある膜内配列を切断する プロテアーゼ機能 （特にァ-セクレ夕一ゼ機能） を意味する。
さらに、 プレセ二リン、 二カストリン、 APH-1及び PEN-2のアミノ酸配列を それぞれコードする遺伝子に限らず、上記表 1の配列番号に示す塩基配列 (配列番 号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13又は 15) に相補的な配列とストリンジェン卜な 条件下でハイブリダィズし、 かつ、 プレセ二リン、 二カストリン、 APH-1 及び PEN-2 が複合体を形成したときに膜型プロテアーゼ蛋白質としての活性を有す るときのそれぞれの蛋白質をコードする遺伝子も含まれる。「ストリンジェントな 条件」 とは、 例えば、 塩 （ナトリウム） 濃度が 150〜900mMであり、 温度が 55 〜75°C、 好ましくは塩 （ナトリウム） 濃度が 250〜450mMであり、 温度が 68°C での条件 （ハイブリダィズ後の洗浄時の条件） をいう。
上記変異型アミノ酸配列は、 通常の部位特異的突然変異誘発法によって変異を 導入することができる。 遺伝子に変異を導入するには、 Kunkel 法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用 キット、例えば QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit (ストラタジ一ン 社製）、 GeneTailorTM Site -Directed Mutagenesis System (インビトロジェン社 製)、 aKaRa Site -Directed Mutagenesis System (MutairK、 Mutan- Super Express Km等：夕カラバイオ社製） を用いて行うことができる。
本発明において、 活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体とその触媒の対象と なる物質との間の相互作用として、 プレセ二リン複合体と基質 （APP、 Notch, ErbB4、 カドヘリンなど） との相互作用、 プレセ二リン複合体と結合蛋白質 （力 テニン、 KCMPなど） との相互作用、 SpoIVFBと結合蛋白質 （BofA、 SpoIVFA など） との相互作用などが挙げられる。 （Urban S, Freeman M. Intramembrane proteolysis controls diverse signalling pathways throughout evolution. (2002) Curr Opin Genet Dev. 12(5):512-518. ) ( Weihofen A, Martoglio B. Intramembrane -cleaving proteases: controlled liberation of proteins and bioactive peptides. (2003) Trends Cell Biol. 13(2):71'78)
上記相互作用は、例えば Sf9細胞に未知の分子をコードする cDNAを感染させ、 細胞内でプレセニリン複合体と相互作用ないし何らかの活性化を促進または阻害 して、 得られたパキュロウィルス中の活性を変化させる物質について検討すれば よい。
3 . 組換えウィルスの作製及びプロテアーゼの発現
本発明において、 活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を取得するために、 プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードする遺伝子 を含む少なくとも 1種の組換えバキュロウィルスを使用することができる。 バキ ュロウィルスは、 環状の二本鎖 DNAを遺伝子としてもつエンベロープウィルス であり、 昆虫に感染して病気を起こすウィルスである。 そして、 鱗翅目、 膜翅目 および双翅目などの昆虫に感受性を示す。 バキュロウィルスの中で、 感染細胞の 核内に多角体 （ポリヒドラ） と呼ばれる封入体を大量に作る一群のウィルスが核 多角体病ウィルス (NPV)である。多角体は、 分子量 31kDaのポリヘドリンタンパ クより構成されており、 感染後期に大量に作られ、 その中に多数のウィルス粒子 を埋め込んでいる。多角体はウィルスが自然界で生存するためには必須であるが、 ウィルスの増殖そのものには必要ないため、 多角体遺伝子の代わりに発現させた い外来遺伝子を揷入してもウィルスは全く支障なく感染し増殖する。
本発明で用いられるバキュロウィルスとしては、 NPVのキンゥヮバ亜科のォー トグラファ 'カリフォルニ力 （Autographa californica) NPV(AcNPV) カイコ のボンビックス ·モリ （Bombyx mori) NPV(BmNPV)などが挙げられ、 これら のウィルスをベクターとして用いることができる。
AcNPV の宿主 （感染、 継代細胞） としてはスポドプテラ · フルギベルダ (Spodoptera frugiperda) 細胞 （Sf細胞） などが挙げられ、 BmNPVの宿主 （感 染、 継代細胞） としては B^nl^細胞などが挙げられる。 .Sf細胞は、 BmN4細胞 などに比べ増殖速度が速いこと、 また、 AcNPV はヒト肝細胞およびヒト胎児腎 細胞などにも感染する能力を有することから、 Sf- AcNPV系の宿主-ベクターが好 ましい。
Spodoptera Frugiperda細胞系統の Sf9および Sf21は、 S. frugiperda幼虫の 卵巣組織から確立しており、 Invitrogen社若しくは Pharaiingen社（San Diego, CA)、 又は ATCCなどから入手可能である。 さらに、 生きている昆虫幼虫 （例え ばカイコ） を宿主細胞系として使用することもできる。
本発明で用いる組換えウィルスを構築する方法は、 常法に従って行えばよく、 例えば次の手順で行うことができる。 先ず、 発現させたい蛋白質の遺伝子をトラ ンスファーベクターに挿入して組換えトランスファ一ベクターを構築する。 トラ ンスファーベクターの全体の大きさは一般的には数 kb〜： LOkb程度であり、 その うちの約 3kbはプラスミド由来の骨格であり、 アンピシリン等の抗生物質耐性遺 伝子と細菌の DNA複製開始のシグナルを含んでいる。 通常のトランスファ一ベ ク夕一ではこの骨格以外に、 多角体遺伝子の 5 '領域と 3 '領域をそれぞれ数 kbず つ含み、 トランスフエクシヨンを行った際に、 この配列間で目的遺伝子と多角体 遺伝子との間で相同組換えが引き起こされる。
また、 トランスファ一ベクターには蛋白質遺伝子を発現させるためのプロモー ターを含むことが好ましい。 プロモーターとしては、 多角体遺伝子のプロモ一タ 一、 plO遺伝子のプロモーター、 キヤプシド遺伝子のプロモ一夕一などが挙げら れる。
トランスファーベクターの種類は特に限定されるものではなく、例えば AcNPV 系又は BmNPV系トランスファーベクターを使用することができる。
AcNPV系卜ランスファーべクタ一としては、 例えば pEVmXIV2、 pAcSGl、 pVL1392/1393 , pAcMP2/3、 pAcJPl、 pAcUW2l、 pAcDZl、 pBlueBacIII , pBlueBac4.5、 pBlueBac4.5/V5_His、 pAcUW51、 pAcAB3、 pAc360, pBlueBacHis, PBl eBacHis2A) B, C、 PVT-Bac33, pAcUWl、 pAcUW42/43などが挙げられ、 BmNPV系トランスファ一ベクターとしては、例えば pBK283、 pBK5、 pBB30、 pBEl、 pBE2、— pBK3、 pB—K52、 pBKblue, pBKblue2、 . pBF シリーズなどが挙 げられる。 これらのトランスファーベクターは、 Invitrogen、 フナコシ株式会社、 藤沢薬品工業株式会社等から容易に入手可能である。
次に、 組換えウィルスを作製するために、 上記の組換えトランスファーベクタ —をウィルスと混合した後 (卜ランスフエクシヨン）、宿主として用いる培養細胞 に移入するか、 あるいは予めウィルスで感染させた宿主として用いる培養細胞に 上記のトランスファーベクターを移入し、 組換えトランスファーベクターとウイ ルスゲノム DNAとの間に相同組み換えを起こさせ、 組み換えウィルスを構築す る。
ここで宿主として培養細胞を用いる場合は、 通常、 昆虫培養細胞 （Sf9細胞や BmN細胞など） が採用される。 培養条件は、 当業者により適宜決定されるが、 具体的には Sf9細胞を用いるときは、 10%ゥシ胎児血清を含む培地で、 28°C前後 で培養することが好ましい。 このようにして構築された組み換えウィルスは、 常 法、 例えばプラークアツセィなどによって精製することができる。 なお、 このよ うにして作製された組換えウィルスは、 核多角体病ウィルスの多角体蛋白質の遺 伝子領域に外来の DNAが置換または揷入されており、 多角体を形成することが できないため、 非組換えウィルスと容易に区別することが可能である。
本発明の方法では、 前記の組換えバキュロウィルスを、 上記の適当な宿主（Sf9 および Sf21などの培養細胞） に感染させ、 一定時間後 （例えば、 72時間後等） に培養物から細胞外発芽ウィルス （budded virus, BV) を遠心などの分離操作に よって回収することにより、 その発芽バキュロウィルス画分中に含有される目的 蛋白質複合体を得ることができる。 「培養物」 とは、 培養上清及び細胞のいずれを も意味する。 なお、 組換えバキュロウィルスは 1種類のみ感染させてもよいし、 2種類以上の組換えバキュロウィルスを組み合わせて共感染させてもよい。
細胞外発芽バキュロウィルスの回収は、 例えば、 以下のように行うことができ る。 先ず感染細胞の培養液を 500〜： l,000gで遠心分離して、 細胞外発芽バキュ口 ゥィルスを含む上清を回収する。 この上清を約 30，000〜50,000gで遠心分離して 細胞外発芽バキュロウィルスを含む沈殿物を得ることができる。 上記のようにし て回収される 芽バキュ口クイルスは、 生理活性を有する膜型プロテアーゼ蛋白 質複合体を含むものである。 なお、 当該発芽バキュロウィルス自体も本発明の範 囲内である。
この細胞外発芽バキュロウィルスを含む沈殿物を適当な緩衝液に懸濁し、再度、 適当な濃度勾配 （例えば、 スクロースの連続勾配等） の上にウィルスの懸濁物を 重ね、 100，000gで遠心分離して分画する。得られた画分の中から所望の蛋白質複 合体を含む画分を採取することができる。
さらに、 発現させた蛋白質複合体を可溶化した形態で得る場合には、 感染細胞 の培養液から例えば 40,000gで遠心分離することにより細胞外発芽ウィルスを回 収する。 この回収されたペレットを適当な緩衝液に懸濁し、 CHAPSO 等の溶解 剤で処理し、さらに 30,000rpmで遠心分離を行うことにより上清と沈澱に分離す る。 可溶化された目的蛋白質複合体は上清中から得ることができる。
宿主として昆虫 （例えばカイコ幼虫） を用いる場合は、 組換えウィルスを例え ば 5齢カイコ幼虫に接種して感染させ、 4〜6日後にカイコの個体の体液中に分 泌したプロテアーゼ蛋白質複合体を採取 '分離し、 精製すればよい。 プロテア一 ゼ蛋白質複合体は、 絹糸腺と呼ばれる器官から大量に得ることができる。
上記発現蛋白質複合体 （特に CHAPSO等の溶解剤で処理した後の蛋白質複合 体） は、 その活性化形態として採取される。 本発明の蛋白質複合体は、 好ましく は少なくとも 50%以上、より好ましくは 60%以上、さらに好ましくは 70%以上、 さらに好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以上、 特に好ましくは 95% 以上が活性化形態である。
本発明の蛋白質複合体は、 適当な精製手段、 例えばゲルろ過、 イオン交換クロ マトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィ 一を単独で又は適宜組み合わせてさらに精製することも可能である。 このように して採取又は精製した活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体も、 本発明に含ま れる。 採取又は精製された蛋白質複合体が目的のものであることの確認は、 SDS-PAGE, ウエスタンブロッテイング、 ELISA等により行うことができる。 なお、 このような活性化形態の膜プロテアーゼ蛋白質複合体を高い割合で得る ことは従来法では極めて ¾難 あった。
4 . 相互作用の分析
本発明はさらに、 標識された被験物質 （例えばリガンド又は基質） と活性型の 膜型プロテアーゼ蛋白質複合体とを接触させた後、 当該被験物質のシグナルを検 出することによって、 前記蛋白質複合体と相互作用する物質を分析する方法を提 供する。
蛋白質複合体は、 バキュロウィルス中に存在する膜型プロテアーゼ蛋白質複合 体を使用することも可能であるが、 バキュロウィルスから採取した活性型の膜型 プロテアーゼ蛋白質複合体を使用することが好ましい。
膜型プロテアーゼ蛋白質複合体と被験物質との相互作用の測定方法は特に限定 されず、 当業者であれば適宜選択することができる。 一例として、 標識したリガ ンドを用いてリガンド結合能を測定する。 標識は、 蛍光標識、 放射標識のいずれ を採用してもよい。 蛍光物質としては、 例えば Alexa系、 Pacific Blue、 Cy2、 FITC、 Cy3、 ローダミン、 テキサスレッド、 Cy5などが挙げられる。 放射標識物 質としては、 3H、 i3C, i5N, 32P等が挙げられる。
具体的には、 上記標識物質で標識したリガンドを含む緩衝液 （結合に適した緩 衝液を使用） に、 膜型プロテア一ゼ蛋白質複合体を含む発芽パキュロウィルス、 又は前記の通り回収若しくは精製した活性型膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を接 触 （反応） させる。 なお、 反応条件はプロテアーゼとリガンドとの組み合わせの 種類により適宜選択する。 反応後の反応液を適当なフィルタ一等の固相担体に吸 着ろ過させて反応を停止し、 当該固相担体を洗浄および乾燥させ、 複合体のみを 固相担体上に固定する。 シンチレーシヨンカウンターを用いて固相担体の放射活 性を測定し、 又は蛍光光度計を用いて蛍光強度を測定することにより、 膜型プロ テアーゼ蛋白質複合体とリガンドとの相互作用 （即ち、 リガンド結合能） を測定 することができる。
また、 本発明は、 被験物質と本発明の複合体とを接触させた後、 複合体のプロ テア一ゼ活性を測定することにより、 活性型の膜型プロテア一ゼ蛋白質複合体の 酵素活性を促進又は阻害す-る物質をスクリーニングする方法を提供する。
スクリーニングに供される被験物質としては、例えばぺプチド、ポリべプチド、 合成化合物、 微生物発酵物、 生物体 （植物又は動物の組織、 微生物、 又は細胞な どを含む） からの抽出物、 あるいはそれらのライブラリーが挙げられる。 ライブ ラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリ一など）、 ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。 スクリーニングに供される化学物質は、 天然物でも合成物でもよく、 また候補と なる単一の化学物質を独立に試験しても、 いくつかの候補となる化学物質の混合 物 （ライブラリーなどを含む） について試験をしてもよい。 また、 細胞抽出物の ような混合物を分画したものについてスクリーニングを行い、 分画を重ねて、 所 望の活性を有する物質を単離することも可能である。
さらに、 本発明においては、 活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体に作用す る分子ないしリガンド様の物質が、 その複合体のうちどの分子に作用しているか について、 パキュロウィルス上の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を用いてアツセ ィすることも可能である。
これらの被験物質は、膜型プロテアーゼ蛋白質（複合体）と基質との相互作用、 あるいは膜型プロテアーゼ蛋白質と複合体構成因子との相互作用を促進又は阻害 することが予想される物質であることが好ましい。 本発明のスクリーニング方法 により、 膜型プロテアーゼ蛋白質または膜型プロテアーゼ蛋白質複合体に対する 阻害薬または活性化薬物をスクリーニングすることが可能である。 本発明のスク リーニング方法により得られる、 膜型プロテアーゼ蛋白質 （複合体） と基質との 相互作用、 あるいは膜型プロテアーゼ蛋白質と複合体構成因子との相互作用を促 進又は阻害する物質も本発明の範囲内である。
5 . プロテインチップ
本発明のパキュロウィルスから採取される膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の中 には、 活性型のものが含まれている。 この活性型蛋白質複合体を基板上に固定す ると、 プロテインチップを得ることができる。 このようにして作製されたプロテ インチップは、...活性型の膜型.プロテアーゼ蛋白質複合体と相互作用する物質をス クリーニングするために使用することができる。 活性型の膜型プロテアーゼ蛋白 質複合体を、 イオン交換樹脂や金属イオンなどをコーティングしたチップに結合 させ、 スクリーニングの対象となる試料をチップに添加し、 質量分析器 （例えば MALDI-TOF型、 ESI/Q-TOF型のもの等） を使用して質量を測定する。 質量の 変化により、 相互作用した物質を同定することが可能である。 以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明は実施例によ つて限定されるものではない。
実施例 1
7一セクレ夕—ゼ構成因子 （ヒトプレセ二リン 1、 ヒトニカストリン、 ヒト APH-la、 ヒト PEN-2) を発現する組換えバキュロウィルスの調製
( 1 ) 細胞の培養と感染、 および発芽型バキュロウィルスの収集
ヒトプレセニリン 1 全長 cDNA を pBlueBac4.5TM ベクタ一 （Invitrogen, Carlsbad, CA) に、 C末端側にタグを人工的に付加したヒトニカストリン又はヒ ト APH-la 全長 cDNA を pBlueBac4.5 に、 ヒ ト PEN-2 全長 cDNA を pBlueBacHis2Aへ組み込み、それぞれ pBlueBac_PSl、 pBlueBac'NCT-V5/His、 pBlueBac-APH- la-myc/Hisおよび pBlueBac-His-PEN-2を作製した。 Sf9細胞 (Invitrogen) は完全培地 （10%ゥシ胎児血清 （Sigma)、 100 units/mlぺニシリ ンおよび 100 g/ml ス卜レフ卜マ シンを含む Grace's supplemented media (GIBCOBRD )で 27°Cで 10cm径ディッシュに継代培養した。大量培養は、 500 mL容量のスピナ一フラスコ （Wheaton) にて完全培地に 0.001% pluronic F-68 (GIBCO BRL) を添加して行なった。 組み換えバキュロウィルスの作製は説明 書（Bac-N-Blue™ Transfection Kit, Invitrogen)に従い、 Sf9細胞に Bac-N_Blue DNA ( ApMNPV 由来） と 、 pBlueBac.PSl 、 BlueBac-NCT-V5/His、 pBlueBac-APH-l-myc/His又は pBlueBac-ffis-PEN-2とを共感染させ、組み換え ウィルスを作製した。 本実施例では、 タグの付加に関し、 以下の通り行った。
(i) ヒトプレセニリン 1は、.タグ付加はせず、 そのまま pBlueBac4.5に組み込 んだ。 -
(ii) ヒトニカストリンは、 pEF6-TOPO/V5/Hisベクタ一 （Invitrogen) にクロ —ニングし、 C末側にベクタ一由来の V5/Hisタグを含んだ cDNAを pBlueBac4.5 に組み込んだ。 ヒ トニカス ト リ ンの遺伝子には、 V5 タ グ部分 (GKPIPNPLLGLDST (配列番号 17) ) 及び Hisタグ部分 （HHHHHH (配列番 号 19) ) を付加した。
V5タグ部分の塩基配列： '
GGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACG (配列番号 18)
Hisタグ部分の塩基配列： CATCATCACCATCACCAT (配列番号 20)
(iii) ヒト APH-laは、 pEF4/myc/HisAベクター （Invitrogen) にクローニング し、 C末側にベクター由来の myc/Hisタグを含んだ cDNAを pBlueBac4.5に組 み込んだ。 なお、 ヒト APH-laは、 251型を使用した。
APH-laの mycタグ部分 （EQKLISEEDL (配列番号 21) ) の配列： GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG (配列番号 22)
His夕グ部分 （HHHHHH：配列番号 19) の配列： CATCATCACCATCACCAT (配列番号 20)
ヒトニカストリン及びヒト APH-laは、 終始コドン.（TAG) を省き、 タグを付 加したものを pBlueBac4.5に組み込んだ。
(iv)ヒト PEN-2は、 N末側付加した His夕グは pBlueBacHis2のベクター由来 のものを使用した。 ヒト PEN-2 については、 開始コドン （ATG) を省き、 pBlueBacHis2Aに組み込んだ。
( 2 ) 発芽型バキュロウィルスにおけるプロテア一ゼ発現のウエスタンプロット による解析
Sf9細胞を 500 mL容量のスピナ一フラスコ (Wheaton) に 2xl06個/ ml濃度 で 250ml培養し、 上記 (1)で作製した組み換えウィルスを感染多重度 （MOI) =5 で感染させ、 72時間後の培養液を実験に用いた。 培養液を l,000xgで 10分間遠 心し、 沈澱及び.上清に分離し.た。 沈澱は細胞破砕緩衝液. (10% glycerol を含む HEPES緩衝液 （10 mM HEPES H 7.4、 150 mM NaCl、 Complete inhibitor cocktail (Roche Applied Science) ) ) に懸濁しホモジェナイザーにて破砕後、 l,500xg、 10 分遠心した。 さらに上清を 100，000xg、 1 時間超遠心し、 沈澱を HEPES 緩衝液に懸濁し Sf9 細胞膜画分とした。 l,000xg の遠心後の上清を 40,000xg で 30 分遠心し、 沈澱をリン酸緩衝液 （PBS) に懸濁した後、 さらに 40,000xg、 30分遠心した。沈澱を l,000x で 10分遠心し、上清をさらに 40，000xg、 30分遠心し、 沈澱を PBSに懸濁して発芽型ウィルス画分 （BV画分） とした。 組み換えウィルス感染後の Sf9細胞培養液について、 0から 96時間まで 24時 間毎に培養液を採取し、 細胞膜画分および l,000xgで遠心した BV画分の上清画 分を調製し、 時間経過におけるプロテア一ゼ発現量の変化を確認した （図 2 )。 各 時間における細胞膜画分 （図 2 「cell」） l g及び上清画分 （図 2 「； BV」） 200 1を用いて、 ヒトプレセニリン 1を認識する抗 PS1抗血清 （図 2 「GlNr2」） に よるウエスタンプロットを行った。 結果を図 2に示す。 図 2の左端の数字は分子 量 （kD) を表す。 その結果、 細胞膜および上清画分いずれにおいても 48時間後 からヒトプレセニリン 1 (PSlwt) の発現を確認した （図 2の矢頭印）。 この結果 は、 48時間後の培養液中にプロテアーゼを含むウィルスが発現することを示す。 実施例 2
発芽型バキュロウィルスにおけるァ-セクレ夕一ゼ複合体構成蛋白質の共発現 ( 1 ) ァ -セクレターゼ複合体構成蛋白質の共感染.
ヒトプレセニリン 1、 ヒトニカストリン、 ヒト APH-la、 ヒト PEN-2の各発現 組み換えウィルスを、 2xl06細胞/ ml濃度の Sf9細胞 200mlに、 さまざまな組み 合わせにより各ウィルスあたり MOI=2で感染させ、 72時間後に BV画分を調製 した。 BV画分におけるァ -セクレターゼ構成因子の発現量は、 ヒトプレセニリン 1を認識する抗 PS1抗血清、 ヒトニカストリンに付加した V5タグを認識する抗 V5抗体（Invitrogen)、 APH- laに付加した mycタグを認識する抗 myc抗体（Roche または Cell Signaling Technology)、 ヒト PEN-2を認識する抗 ΡΕΝ-2抗体を用 いたウェスタンプロットにより.確認した （図 3 )。 図 3において、 各蛋白質の組合 せを 「 +」 印で示す。 図 3において、 「GlNr2」 および 「G1L3」 はヒトプレセニ リンに対する抗体、 「V5」 はヒトニカストリンに付加した V5 タグを認識する抗 体、 「myc」 は APH-laに付加した mycタグを認識する抗体、 「PNT_3」 はヒト PEN-2に対する抗体を示す。
4種類の各発現組み換えウィルスをすベて Sf9細胞に感染させると、 活性型プ レセニリンとして考えられているフラグメント型プレセニリンを生じることが観 察されたが （図 3 「PS1 NTF」 および 「PS1 CTF」）、 他のいずれの組み合わせに よってもフラグメント型プレセ二リンを生じることはなかった。 またこの BV画 分を 1% CHAPSOにより可溶化し、 それぞれの特異抗体によって免疫沈降 （IP) した後、 各抗体でウエスタンプロット解析した。 その結果、 いずれの分子も相互 作用していることが明らかとなった （図 4 )。 図 4において、 「anti-GlL3J はヒ トプレセニリン 1 (ヒトプレセ二リン 1のフラグメント型である PS1 CTF) に対 する抗体、 「anti-V5」 は二カストリン （NCT) に付加した V5タグを認識する抗 体、 「anti-myc」 は APH-laに付加した mycタグを認識する抗体、 「anti-PNT3」 はヒト PEN-2に対する抗体を示す。
4分子を共発現させた Sf9細胞の膜画分とそれ由来の BV画分を同時にウェス タンプロット解析したところ、 Sf9細胞においては発現させたヒトプレセニリン 1のほとんどが不活性型である全長型 （図 5 「PS1 FL」） にとどまっていたのに 対し （図 5 「Sf9 cells」）、 BV画分においては全長型プレセ二リンはほとんど見 られず （図 5 「Budded Virus」）、 選択的に活性型であるフラグメント型プレセ二 リンが集積しているのが観察された （図 5 「； PS1 NTF」）。
共感染により生じた各 BV画分を 1 % CHAPSOにより可溶化し、 人工基質を 用いた in vitro ァ-セクレタ一ゼアツセィ系により、 ァ -セクレターゼ活性を de novo 合成された A i3の集積を指標に用いて測定した （Takasugi N, Tomita T， Hayashi I, Tsuruoka M, ISiiimura M， Takanashi , Thinakaran G, iwatsubo T Nature 2003, 422:438-441 The role of presenilin cofactors in the γ -secretase complex; Takahashi Y, Hayashi I， Tominari Y et al.: Sulindac sulfide is a non'competitiye gamma：. secr.etase inhibitor that preferentially reduces Abeta 42 generation. J Biol Chem 2003 Mar 2003, :10，）。
その結果、 4分子を共感染させた BV画分においてのみ人工基質の切断活性が 観察された （図 6 )。 この活性は既知のァ-セクレ夕一ゼ阻害剤 （L-685，458 およ び DAPT) によって阻害されたこと、 またプレセ二リンの活性に必須であると考 えられている 385 番目のァスパラギン酸をァラニンに置換した変異体 （図 7 「PS1D385A」） においては活性が失われていたことなどから、 活性を持つァ-セ クレターゼ複合体が Sf9細胞中で再構成され、 選択的に BV画分中に集積したこ とを表すものと考えられた （図 7 )。 産業上の利用の可能性
本発明により、 活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質又は活性型の膜型プロテア一 ゼ蛋白質複合体をバキュロウィルスに発現させることができる。本発明によれば、 複合体を形成して機能する膜型プロテアーゼ （例えばプレセ二リン等） の活性型 蛋白質複合体を選択的に発現することが可能となり、 基質との結合を阻害又は促 進する物質のスクリーニングに使用することができる。 配列表フリーテキスト
配列番号 17： V5夕グぺプチド配列
配列番号 18： V5タグヌクレオチド配列
配列番号 19： His夕グぺプチド配列 . 配列番号 20： Hisタグヌクレオチド配列
配列番号 21： mycタグべプチド配列
配列番号 22： mvc夕グヌクレオチド配列

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードす る遺伝子を含むバキュロウィルスを感染させた宿主を培養又は飼育し、 該宿 主から放出される発芽バキュロウィルス中に膜型プロテアーゼ蛋白質と複合 体構成因子との複合体を発現させることを特徴とする、 膜型プロテアーゼ蛋 白質複合体の発現方法。
2 . 膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードす る遺伝子を含むバキュロウィルスを感染させた宿主を培養又は飼育し、 培養 物又は宿主個体から発芽バキュロウィルスを回収し、 得られる回収物から活 性型の膜型プロテア一ゼ蛋白質複合体を採取することを特徴とする、 活性型 の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の製造方法。
3 . 膜型プロテア一ゼ蛋白質がプレセニリンである請求項 1又は 2記載の方法。
4 . 複合体構成因子が二カストリン、 APH-1及び PEN-2である請求項 1又は 2 記載の方法。
5 .膜型プロテア一ゼ蛋白質複合体がァ -セクレターゼである請求項 1又は 2記載 の方法。
6 . 宿主が昆虫細胞又は昆虫幼虫である、 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の 方法。
7 . 膜型プロテア一ゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードす る遺伝子を含むバキュロウィルスを感染させた宿主が放出する、 発芽パキュ ロウィルス。
8 . 膜型プロテア一ゼ蛋白質がプレセ二リンである請求項 7記載の発芽バキュ口 ウィルス。
9 . 複合体構成因子が二カストリン、 APH-1及び PEN-2である請求項 7記載の 発芽バキュロウィルス。
1 0 . 膜型プロテア一ゼ蛋白質複合体を含有する、 請求項 7〜 9のいずれか 1項 に記載の発芽バキュロウィルス。
1 1 .膜型プロテア一ゼ蛋白質複合体がァ-セクレ夕一ゼである請求項 1 0記載の 発芽バキ .口ウィル X。
1 2 . 宿主が昆虫細胞又は昆虫幼虫である、 請求項 7〜 1 1のいずれか 1項に記 載の発芽バキュロウィルス。
1 3 . 請求項 7〜 1 2のいずれか 1項に記載の発芽パキュロウィルスから採取さ れる、 活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体。
1 4 .膜型プロテアーゼ蛋白質複合体がァ -セクレターゼである請求項 1 3記載の 複合体。
1 5 . 活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体と相互作用する物質を分析する方 法であって、 標識された被験物質と請求項 1 3又は 1 4記載の複合体とを接 触させた後、 当該被験物質のシグナルを検出することを含む前記方法。
1 6 . 活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の酵素活性を促進又は阻害する物 質をスクリーニングする方法であって、 被験物質と請求項 1 3又は 1 4記載 の複合体とを接触させた後、 当該複合体のプロテアーゼ活性を測定すること を含む前記方法。
1 7 .膜型プロテア一ゼ蛋白質複合体がァ -セクレターゼである請求項 1 5又は 1 6記載の方法。
1 8 . 請求項 1 3又は 1 4記載の複合体が配列されたプロテインチップ。
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