JP2003052370A - 発芽バキュロウィルスを用いた機能を有する膜型受容体蛋白質の発現法 - Google Patents
発芽バキュロウィルスを用いた機能を有する膜型受容体蛋白質の発現法Info
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 バキュロウイルスと昆虫細胞発現システムを
用いて、機能を有す膜型受容体を発現させる技術を開発
すること。 【解決手段】 相互作用蛋白質をコードする遺伝子及び
該相互作用蛋白質と相互作用して機能する膜型受容体蛋
白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換え
バキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主か
ら放出される発芽バキュロウイルス中に該相互作用蛋白
質と該膜型受容体蛋白質とを同時発現させることを含
む、機能を有する膜型受容体蛋白質を発現する方法。
用いて、機能を有す膜型受容体を発現させる技術を開発
すること。 【解決手段】 相互作用蛋白質をコードする遺伝子及び
該相互作用蛋白質と相互作用して機能する膜型受容体蛋
白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換え
バキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主か
ら放出される発芽バキュロウイルス中に該相互作用蛋白
質と該膜型受容体蛋白質とを同時発現させることを含
む、機能を有する膜型受容体蛋白質を発現する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、発芽バキュロウィ
ルスを用いた機能を有する膜型受容体蛋白質の発現方法
に関する。より詳細には、本発明は、宿主から放出され
る発芽バキュロウイルス中に相互作用蛋白質と膜型受容
体蛋白質とを同時発現させることを特徴とする機能を有
する膜型受容体蛋白質の発現方法に関する。
ルスを用いた機能を有する膜型受容体蛋白質の発現方法
に関する。より詳細には、本発明は、宿主から放出され
る発芽バキュロウイルス中に相互作用蛋白質と膜型受容
体蛋白質とを同時発現させることを特徴とする機能を有
する膜型受容体蛋白質の発現方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】バキュロウイルス発現系はバキュロウイ
ルスの高発現蛋白質、特には多角体蛋白質（polyhedri
n）遺伝子のプロモーターなどを利用して、目的遺伝子
を昆虫細胞（Ｓｆ９細胞など）で組換えを起こさせて、
大量に発現させる系である。多角体遺伝子に組換えタン
パク質を導入し、発現したタンパク質を精製する系バキ
ュロの発現系は、大腸菌やイースト菌を用いる発現系に
比べ、膜蛋白質などの疎水性領域を多く持つ蛋白質でも
発現タンパク質が凝集を作りにくく、また糖鎖の付加や
金属イオンの配位などタンパクの機能に必要な翻訳後修
飾がはいるなど利点が多いため膜受容体蛋白質の発現系
として多用されている（Tate CG, Grisshammer R., Tre
nds in Biotechnology 1996, 14, pp426-430, Heterolo
gous expression of G-protein-coupled receptors；及
び、Grisshammer R, Tate CG, Quarterly Reviews of B
iophysics 1995, 28, pp315-422, Overexpression of i
ntegral membrane proteins for structural studie
s）。
ルスの高発現蛋白質、特には多角体蛋白質（polyhedri
n）遺伝子のプロモーターなどを利用して、目的遺伝子
を昆虫細胞（Ｓｆ９細胞など）で組換えを起こさせて、
大量に発現させる系である。多角体遺伝子に組換えタン
パク質を導入し、発現したタンパク質を精製する系バキ
ュロの発現系は、大腸菌やイースト菌を用いる発現系に
比べ、膜蛋白質などの疎水性領域を多く持つ蛋白質でも
発現タンパク質が凝集を作りにくく、また糖鎖の付加や
金属イオンの配位などタンパクの機能に必要な翻訳後修
飾がはいるなど利点が多いため膜受容体蛋白質の発現系
として多用されている（Tate CG, Grisshammer R., Tre
nds in Biotechnology 1996, 14, pp426-430, Heterolo
gous expression of G-protein-coupled receptors；及
び、Grisshammer R, Tate CG, Quarterly Reviews of B
iophysics 1995, 28, pp315-422, Overexpression of i
ntegral membrane proteins for structural studie
s）。
【０００３】バキュロウイルスには多角体蛋白質を被っ
た多角体ウイルスとなって核内に存在する他にもう一つ
の生活環があり、ウイルスが増殖して他の細胞や個体に
感染するために，発芽型のウイルス（Budded virus）と
なってＳｆ９細胞の細胞膜を被って細胞外にでる。この
際に上記の多角体蛋白質に組換えた７回膜貫通型受容体
がＳｆ９の細胞膜に発現され、発芽したバキュロウイル
スのエンベロープ上に回収されることがLoiselらによっ
て報告された（Loisel TP, Ansanay H, St-Onge S, Gay
B, Boulanger P, Strosberg AD, Marullo S, Bouvier
M., Nat Biotechnol. 1997, Nov. 15(12), pp1300-130
4, Recovery of homogeneous and functional beta 2-a
drenergic receptors from extracellular baculovirus
particles）。宿主細胞に発現された７回膜貫通型受容
体は糖鎖構造など機能的でないものが多いのにくらべ、
ウイルスエンベロープ上に回収される受容体は機能的な
蛋白質のみであることが報告されている。
た多角体ウイルスとなって核内に存在する他にもう一つ
の生活環があり、ウイルスが増殖して他の細胞や個体に
感染するために，発芽型のウイルス（Budded virus）と
なってＳｆ９細胞の細胞膜を被って細胞外にでる。この
際に上記の多角体蛋白質に組換えた７回膜貫通型受容体
がＳｆ９の細胞膜に発現され、発芽したバキュロウイル
スのエンベロープ上に回収されることがLoiselらによっ
て報告された（Loisel TP, Ansanay H, St-Onge S, Gay
B, Boulanger P, Strosberg AD, Marullo S, Bouvier
M., Nat Biotechnol. 1997, Nov. 15(12), pp1300-130
4, Recovery of homogeneous and functional beta 2-a
drenergic receptors from extracellular baculovirus
particles）。宿主細胞に発現された７回膜貫通型受容
体は糖鎖構造など機能的でないものが多いのにくらべ、
ウイルスエンベロープ上に回収される受容体は機能的な
蛋白質のみであることが報告されている。
【０００４】またSREBP(sterol regulatory element bi
nding protein)２、HMG-CoA（ヒドロキシメチルクルタ
リルコエンザイムA）還元酵素、SCAP (SREBP cleavage
activating protein)、S1P ( site 1 protease) などの
小胞体（ER）膜あるいはゴルジ体膜に分布する細胞内コ
レステロールフィードバック調節に関与する膜蛋白質群
も機能を保ったままウイルスエンベロープ上に発現され
ることが報告された（Ishihara, G., Shirai, H., Yama
guchi, M., Fukuda, R., Hamakubo, T., and Kodama,
T., Atherosclerosis, 151, p290, 2000, Expression o
f cholesterol regulatory proteins on extracellular
baculoviruses）。
nding protein)２、HMG-CoA（ヒドロキシメチルクルタ
リルコエンザイムA）還元酵素、SCAP (SREBP cleavage
activating protein)、S1P ( site 1 protease) などの
小胞体（ER）膜あるいはゴルジ体膜に分布する細胞内コ
レステロールフィードバック調節に関与する膜蛋白質群
も機能を保ったままウイルスエンベロープ上に発現され
ることが報告された（Ishihara, G., Shirai, H., Yama
guchi, M., Fukuda, R., Hamakubo, T., and Kodama,
T., Atherosclerosis, 151, p290, 2000, Expression o
f cholesterol regulatory proteins on extracellular
baculoviruses）。
【０００５】一方、Ｇ蛋白質共役型受容体（GPCR; G-pr
otein coupled receptor）は創薬のターゲットとして重
要であり、ゲノムベースで約７００種と報告され（Vent
er JG, Adams MD, Myers EW, et al., Science 291, pp
1304-1351, 2001, The sequence of the human genom
e）、ホルモンのシグナル伝達機構の研究も進んでいる
（Tate CG, Grisshammer R., Trends in Biotechnology
1996, 14, pp426-430,Heterologous expression of G-
protein-coupled receptors）。GPCRは膜貫通ドメイン
を７つもち３量体Ｇ蛋白質と共役している。リガンド結
合の際に共役（カップリング）するＧ蛋白質αサブユニ
ットの種類は受容体ごとに決まっており，例えばロイコ
トリエンＢ４受容体の場合はＧｉあるいはＧｑである
（Igarashi T, Yokomizo T, Tsutsumi O, Taketani Y,
Shimizu T and Izumi T., Eur. J. Biochem., 259, pp4
19-425, 1999, Characterization of the leukotiene B
4 receptor in porcine leukocytes Separation and r
econstitution with heterotrimeric GTP-binding prot
eins）。アドレナリン受容体の場合はＧｓが共役するこ
とが知られており、Loiselらの報告によるとSf９細胞由
来のＧｓが共役して発現し、発芽ウイルス上にもコンプ
レックスを形成しているとされている（Loisel TP, Ans
anay H, St-Onge S, Gay B, Boulanger P, Strosberg A
D, Marullo S, Bouvier M., Nat Biotechnol. 1997, No
v. 15(12), pp1300-1304, Recovery of homogeneous an
d functional beta 2-adrenergic receptors from extr
acellularbaculovirus particles）。Sf9細胞には哺乳
類細胞と同様にＧ蛋白質の各種のアイソフォームが発現
しているとされているが、その量はＧ蛋白質の種類によ
って差がある（Leopoldt D, Harteneck C, Nurnberg R,
Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol , 356, pp216
-224, 1997, G Proteins endogenously expressed inSf
9 cells: interactions with mammalian histamine rec
eptors）。GsはSf９細胞には比較的多く存在しているた
め、Loiselらの系ではウイルスに発現したアドレナリン
受容体が昆虫細胞由来のGsと共役し機能的な膜受容体が
発現されたが、Sf９には比較的量が少ないGi等の他のG
αアイソフォームと共役する受容体（例えば、ロイコト
リエンB４受容体など）の場合には、そのまま発現させ
ても親和性の高い機能的な受容体を得ることは困難であ
る。
otein coupled receptor）は創薬のターゲットとして重
要であり、ゲノムベースで約７００種と報告され（Vent
er JG, Adams MD, Myers EW, et al., Science 291, pp
1304-1351, 2001, The sequence of the human genom
e）、ホルモンのシグナル伝達機構の研究も進んでいる
（Tate CG, Grisshammer R., Trends in Biotechnology
1996, 14, pp426-430,Heterologous expression of G-
protein-coupled receptors）。GPCRは膜貫通ドメイン
を７つもち３量体Ｇ蛋白質と共役している。リガンド結
合の際に共役（カップリング）するＧ蛋白質αサブユニ
ットの種類は受容体ごとに決まっており，例えばロイコ
トリエンＢ４受容体の場合はＧｉあるいはＧｑである
（Igarashi T, Yokomizo T, Tsutsumi O, Taketani Y,
Shimizu T and Izumi T., Eur. J. Biochem., 259, pp4
19-425, 1999, Characterization of the leukotiene B
4 receptor in porcine leukocytes Separation and r
econstitution with heterotrimeric GTP-binding prot
eins）。アドレナリン受容体の場合はＧｓが共役するこ
とが知られており、Loiselらの報告によるとSf９細胞由
来のＧｓが共役して発現し、発芽ウイルス上にもコンプ
レックスを形成しているとされている（Loisel TP, Ans
anay H, St-Onge S, Gay B, Boulanger P, Strosberg A
D, Marullo S, Bouvier M., Nat Biotechnol. 1997, No
v. 15(12), pp1300-1304, Recovery of homogeneous an
d functional beta 2-adrenergic receptors from extr
acellularbaculovirus particles）。Sf9細胞には哺乳
類細胞と同様にＧ蛋白質の各種のアイソフォームが発現
しているとされているが、その量はＧ蛋白質の種類によ
って差がある（Leopoldt D, Harteneck C, Nurnberg R,
Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol , 356, pp216
-224, 1997, G Proteins endogenously expressed inSf
9 cells: interactions with mammalian histamine rec
eptors）。GsはSf９細胞には比較的多く存在しているた
め、Loiselらの系ではウイルスに発現したアドレナリン
受容体が昆虫細胞由来のGsと共役し機能的な膜受容体が
発現されたが、Sf９には比較的量が少ないGi等の他のG
αアイソフォームと共役する受容体（例えば、ロイコト
リエンB４受容体など）の場合には、そのまま発現させ
ても親和性の高い機能的な受容体を得ることは困難であ
る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記した問題
点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発
明は、バキュロウイルスと昆虫細胞発現システムを用い
て、機能を有する膜型受容体を発現させる技術を開発す
ることを解決すべき課題とした。
点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発
明は、バキュロウイルスと昆虫細胞発現システムを用い
て、機能を有する膜型受容体を発現させる技術を開発す
ることを解決すべき課題とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討した結果、受容体蛋白質とＧ蛋
白質のサブユニットとを発現するウイルスを作成し、発
芽ウイルス上で再構成することにより、親和性の高い受
容体を得ることに成功した。即ち、Gi等のSf９細胞にも
ともと存在量の少ないＧ蛋白質においても、α、β、γ
の各サブユニットの遺伝子を組み込んだウイルスを当該
受容体リコンビナントウイルスと共に昆虫細胞に感染さ
せることにより、発現された受容体は発芽型ウイルス
（Budded virus）において組み込んだ三量体Ｇ蛋白質と
コンプレックスを形成し、高親和性の結合活性を有する
ことができる。このとき共感染により受容体とＧ蛋白質
の複合体を発現させたSf９細胞の膜画分では低親和性の
受容体が大量に発現されているため高親和性の受容体の
活性だけを測定しにくいという問題があった。ところ
が、発芽型ウイルスに発現されている受容体−Ｇ蛋白質
複合体は、高親和性の結合活性が測定できることが今
回、意外なことにも判明した。本発明はこれらの知見に
基づいて完成したものである。
解決するために鋭意検討した結果、受容体蛋白質とＧ蛋
白質のサブユニットとを発現するウイルスを作成し、発
芽ウイルス上で再構成することにより、親和性の高い受
容体を得ることに成功した。即ち、Gi等のSf９細胞にも
ともと存在量の少ないＧ蛋白質においても、α、β、γ
の各サブユニットの遺伝子を組み込んだウイルスを当該
受容体リコンビナントウイルスと共に昆虫細胞に感染さ
せることにより、発現された受容体は発芽型ウイルス
（Budded virus）において組み込んだ三量体Ｇ蛋白質と
コンプレックスを形成し、高親和性の結合活性を有する
ことができる。このとき共感染により受容体とＧ蛋白質
の複合体を発現させたSf９細胞の膜画分では低親和性の
受容体が大量に発現されているため高親和性の受容体の
活性だけを測定しにくいという問題があった。ところ
が、発芽型ウイルスに発現されている受容体−Ｇ蛋白質
複合体は、高親和性の結合活性が測定できることが今
回、意外なことにも判明した。本発明はこれらの知見に
基づいて完成したものである。
【０００８】即ち、本発明によれば、相互作用蛋白質を
コードする遺伝子及び該相互作用蛋白質と相互作用して
機能する膜型受容体蛋白質をコードする遺伝子を含む少
なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿
主を培養し、該宿主から放出される発芽バキュロウイル
ス中に該相互作用蛋白質と該膜型受容体蛋白質とを同時
発現させることを含む、機能を有する膜型受容体蛋白質
を発現する方法が提供される。
コードする遺伝子及び該相互作用蛋白質と相互作用して
機能する膜型受容体蛋白質をコードする遺伝子を含む少
なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた宿
主を培養し、該宿主から放出される発芽バキュロウイル
ス中に該相互作用蛋白質と該膜型受容体蛋白質とを同時
発現させることを含む、機能を有する膜型受容体蛋白質
を発現する方法が提供される。
【０００９】好ましくは、相互作用蛋白質をコードする
遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルス
と、該相互作用蛋白質と相互作用して機能する膜型受容
体蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組
換えバキュロウィルスとを感染させた宿主を培養し、該
宿主から放出される発芽バキュロウイルス中に該相互作
用蛋白質と該膜型受容体蛋白質とを同時発現させる。
遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルス
と、該相互作用蛋白質と相互作用して機能する膜型受容
体蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組
換えバキュロウィルスとを感染させた宿主を培養し、該
宿主から放出される発芽バキュロウイルス中に該相互作
用蛋白質と該膜型受容体蛋白質とを同時発現させる。
【００１０】本発明の別の側面によれば、相互作用蛋白
質をコードする遺伝子及び該相互作用蛋白質と相互作用
して機能する膜型受容体蛋白質をコードする遺伝子を含
む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させ
た宿主を培養し、該宿主から放出される発芽バキュロウ
イルスを回収することを含む、生理活性を有する膜型受
容体蛋白質の調製方法が提供される。
質をコードする遺伝子及び該相互作用蛋白質と相互作用
して機能する膜型受容体蛋白質をコードする遺伝子を含
む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させ
た宿主を培養し、該宿主から放出される発芽バキュロウ
イルスを回収することを含む、生理活性を有する膜型受
容体蛋白質の調製方法が提供される。
【００１１】好ましくは、相互作用蛋白質をコードする
遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルス
と、該相互作用蛋白質と相互作用して機能する膜型受容
体蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組
換えバキュロウィルスとを感染させた宿主を培養し、該
宿主から放出される発芽バキュロウイルスを回収する。
好ましくは、相互作用蛋白質は共役蛋白質であり、特に
好ましくは、相互作用蛋白質はＧ蛋白質であり、膜型受
容体蛋白質はＧ蛋白質共役型受容体蛋白質である。好ま
しくは、宿主は昆虫細胞又は昆虫幼虫である。
遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルス
と、該相互作用蛋白質と相互作用して機能する膜型受容
体蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組
換えバキュロウィルスとを感染させた宿主を培養し、該
宿主から放出される発芽バキュロウイルスを回収する。
好ましくは、相互作用蛋白質は共役蛋白質であり、特に
好ましくは、相互作用蛋白質はＧ蛋白質であり、膜型受
容体蛋白質はＧ蛋白質共役型受容体蛋白質である。好ま
しくは、宿主は昆虫細胞又は昆虫幼虫である。
【００１２】本発明のさらに別の側面によれば、相互作
用蛋白質をコードする遺伝子及び該相互作用蛋白質と相
互作用して機能する膜型受容体蛋白質をコードする遺伝
子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感
染させた宿主が放出する、発芽バキュロウイルスが提供
される。好ましくは、相互作用蛋白質は共役蛋白質であ
り、特に好ましくは、相互作用蛋白質はＧ蛋白質であ
り、膜型受容体蛋白質はＧ蛋白質共役型受容体蛋白質で
ある。好ましくは、宿主は昆虫細胞又は昆虫幼虫であ
る。
用蛋白質をコードする遺伝子及び該相互作用蛋白質と相
互作用して機能する膜型受容体蛋白質をコードする遺伝
子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感
染させた宿主が放出する、発芽バキュロウイルスが提供
される。好ましくは、相互作用蛋白質は共役蛋白質であ
り、特に好ましくは、相互作用蛋白質はＧ蛋白質であ
り、膜型受容体蛋白質はＧ蛋白質共役型受容体蛋白質で
ある。好ましくは、宿主は昆虫細胞又は昆虫幼虫であ
る。
【００１３】本発明のさらに別の側面によれば、上記し
た本発明の発芽バキュロウイルスを用いて、該発芽バキ
ュロウイルス中に存在する膜型受容体蛋白質と、リガン
ドとの相互作用を分析する方法が提供される。本発明の
さらに別の側面によれば、上記した本発明の発芽バキュ
ロウイルスを用いて、被験物質の存在下において、該発
芽バキュロウイルス中に存在する膜型受容体蛋白質と、
リガンドとの相互作用を分析し、該相互作用を促進又は
阻害する物質をスクリーニングする方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のス
クリーニングする方法により得られる、膜型受容体蛋白
質とリガンドとの相互作用を促進又は阻害する物質が提
供される。
た本発明の発芽バキュロウイルスを用いて、該発芽バキ
ュロウイルス中に存在する膜型受容体蛋白質と、リガン
ドとの相互作用を分析する方法が提供される。本発明の
さらに別の側面によれば、上記した本発明の発芽バキュ
ロウイルスを用いて、被験物質の存在下において、該発
芽バキュロウイルス中に存在する膜型受容体蛋白質と、
リガンドとの相互作用を分析し、該相互作用を促進又は
阻害する物質をスクリーニングする方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のス
クリーニングする方法により得られる、膜型受容体蛋白
質とリガンドとの相互作用を促進又は阻害する物質が提
供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施態様及び実施
方法について詳細に説明する。本発明による機能を有す
る膜型受容体蛋白質を発現する方法は、相互作用蛋白質
をコードする遺伝子及び該相互作用蛋白質と相互作用し
て機能する膜型受容体蛋白質をコードする遺伝子を含む
少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた
宿主を培養し、該宿主から放出される発芽バキュロウイ
ルス中に該相互作用蛋白質と該膜型受容体蛋白質とを同
時発現させることを特徴とするものである。本発明で
は、上記のように２種類の蛋白質を共発現させるもので
あるが、上記２種類の蛋白質をコードする遺伝子は同一
の組換えバキュロウィルス中に含めてもよいし、異なる
組換えバキュロウイルス中に含めてもよい。本発明で
は、上記２種類の蛋白質をコードする遺伝子を有する組
換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿
主から放出される発芽バキュロウイルスを回収すること
により、生理活性を有する膜型受容体蛋白質を調製する
ことができる。
方法について詳細に説明する。本発明による機能を有す
る膜型受容体蛋白質を発現する方法は、相互作用蛋白質
をコードする遺伝子及び該相互作用蛋白質と相互作用し
て機能する膜型受容体蛋白質をコードする遺伝子を含む
少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを感染させた
宿主を培養し、該宿主から放出される発芽バキュロウイ
ルス中に該相互作用蛋白質と該膜型受容体蛋白質とを同
時発現させることを特徴とするものである。本発明で
は、上記のように２種類の蛋白質を共発現させるもので
あるが、上記２種類の蛋白質をコードする遺伝子は同一
の組換えバキュロウィルス中に含めてもよいし、異なる
組換えバキュロウイルス中に含めてもよい。本発明で
は、上記２種類の蛋白質をコードする遺伝子を有する組
換えバキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿
主から放出される発芽バキュロウイルスを回収すること
により、生理活性を有する膜型受容体蛋白質を調製する
ことができる。
【００１５】本明細書で言う「膜型」とは、対象の蛋白
質が細胞膜並びに細胞内小器官（例えば、小胞体やゴル
ジ体等）の形質膜に存在することを広く意味する。本明
細書で言う「受容体」とはリガンドと相互作用（結合）
する能力を有する蛋白質を広く意味し、好ましくは、リ
ガンドとの相互作用に起因する情報を細胞内に伝達する
ことができる蛋白質である。
質が細胞膜並びに細胞内小器官（例えば、小胞体やゴル
ジ体等）の形質膜に存在することを広く意味する。本明
細書で言う「受容体」とはリガンドと相互作用（結合）
する能力を有する蛋白質を広く意味し、好ましくは、リ
ガンドとの相互作用に起因する情報を細胞内に伝達する
ことができる蛋白質である。
【００１６】膜型受容体蛋白質としては、ホルモン、臭
い、味、光などに対する７回膜貫通型受容体、ＬＤＬ受
容体やスカベンジャー受容体、成長ホルモンやインスリ
ン、ＴＮＦα，グルタミン酸等に対する１回膜貫通型受
容体、ＧＡＢＡ、アセチルコリン、リアノジンなどのイ
オンチャネル型受容体およびＴ細胞受容体、Ｆｃ受容
体、などの複合体を形成するものなどが挙げられる。こ
れらの中でも本発明で使用する膜型受容体蛋白質は、相
互作用蛋白質と相互作用して機能する蛋白質である。
い、味、光などに対する７回膜貫通型受容体、ＬＤＬ受
容体やスカベンジャー受容体、成長ホルモンやインスリ
ン、ＴＮＦα，グルタミン酸等に対する１回膜貫通型受
容体、ＧＡＢＡ、アセチルコリン、リアノジンなどのイ
オンチャネル型受容体およびＴ細胞受容体、Ｆｃ受容
体、などの複合体を形成するものなどが挙げられる。こ
れらの中でも本発明で使用する膜型受容体蛋白質は、相
互作用蛋白質と相互作用して機能する蛋白質である。
【００１７】膜型受容体蛋白質と相互作用蛋白質との組
み合わせは特に限定されず、例えば以下のものが挙げら
れる。Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質とＧ蛋白質との組み
合わせ；Ｔ細胞受容体（α，β，γ，δ鎖）／ＣＤ３複
合体（γ，δ，ε，ζ，鎖）とFyn蛋白質などのSrcファ
ミリーチロシンキナーゼとの組み合わせ；Ｂ細胞受容体
とLyn，Syk，blk，lck蛋白質などのSrcファミリーチロ
シンキナーゼとの組み合わせ；並びにFcγ受容体やFcε
受容体とSyk，Csk，Lyn蛋白質などのSrcファミリーチロ
シンキナーゼとの組み合わせ：Ｇタンパク質共役型受容
体においては、三量体Ｇタンパク質と受容体タンパク質
との共役に加えて、β2アドレナリン受容体とβ−アレ
スチン(β-arrestin)あるいは Ｇタンパク質共役型受容
体キナーゼ(G-protein coupled receptor kinase,GRK)
との相互作用、メタボトロピックグルタミン酸受容体
（mglu）とホーマータンパク質(Homer)との相互作用、
β2アドレナリン受容体とＮａ+、Ｈ+ 交換因子（Na+, H
+ exchange factor）との相互作用 など (Heuss, C. an
d Gerber, U.G-protein-independent signaling by G-p
rotein-coupled receptors. TrendsNeurosci.(2000)23,
469-475)が挙げられる。
み合わせは特に限定されず、例えば以下のものが挙げら
れる。Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質とＧ蛋白質との組み
合わせ；Ｔ細胞受容体（α，β，γ，δ鎖）／ＣＤ３複
合体（γ，δ，ε，ζ，鎖）とFyn蛋白質などのSrcファ
ミリーチロシンキナーゼとの組み合わせ；Ｂ細胞受容体
とLyn，Syk，blk，lck蛋白質などのSrcファミリーチロ
シンキナーゼとの組み合わせ；並びにFcγ受容体やFcε
受容体とSyk，Csk，Lyn蛋白質などのSrcファミリーチロ
シンキナーゼとの組み合わせ：Ｇタンパク質共役型受容
体においては、三量体Ｇタンパク質と受容体タンパク質
との共役に加えて、β2アドレナリン受容体とβ−アレ
スチン(β-arrestin)あるいは Ｇタンパク質共役型受容
体キナーゼ(G-protein coupled receptor kinase,GRK)
との相互作用、メタボトロピックグルタミン酸受容体
（mglu）とホーマータンパク質(Homer)との相互作用、
β2アドレナリン受容体とＮａ+、Ｈ+ 交換因子（Na+, H
+ exchange factor）との相互作用 など (Heuss, C. an
d Gerber, U.G-protein-independent signaling by G-p
rotein-coupled receptors. TrendsNeurosci.(2000)23,
469-475)が挙げられる。
【００１８】また、メタボトロピックグルタミン酸受容
体（mglu）とRGS４、インターロイキン８Ｂ受容体とRGS
１２との結合など、RGS(Regulators of G-protein sign
aling)タンパク質とよばれるGαサブユニットに結合す
るRGSドメインを持つ一群の蛋白質（Hepler, J. R. Eme
rging roles for RGS proteins in cell signalling. T
iPS (1999) 20, 376-382）とＧ タンパク質あるいはそ
の共役型受容体との相互作用がある。Ｇ蛋白質の具体例
としては、３量体Ｇ蛋白質が挙げられる。Ｇ蛋白質のα
サブユニットとして次のものが挙げられる。Gsクラスの
Gsα、Golfα。GiクラスのGi1α、Gi2α、Gi3α、Go1
α、Go2α、Gt1α、Gt2α、Ggustα。Gq クラスの Gq
α、G11α、G14α、G15α、G16α。G12クラスのG12α、
G13α。またこれらαサブユニットと三量体を形成する
βおよびγサブユニットとして、それぞれβ1からβ5ま
でおよびγ1からγ11まで挙げられる。
体（mglu）とRGS４、インターロイキン８Ｂ受容体とRGS
１２との結合など、RGS(Regulators of G-protein sign
aling)タンパク質とよばれるGαサブユニットに結合す
るRGSドメインを持つ一群の蛋白質（Hepler, J. R. Eme
rging roles for RGS proteins in cell signalling. T
iPS (1999) 20, 376-382）とＧ タンパク質あるいはそ
の共役型受容体との相互作用がある。Ｇ蛋白質の具体例
としては、３量体Ｇ蛋白質が挙げられる。Ｇ蛋白質のα
サブユニットとして次のものが挙げられる。Gsクラスの
Gsα、Golfα。GiクラスのGi1α、Gi2α、Gi3α、Go1
α、Go2α、Gt1α、Gt2α、Ggustα。Gq クラスの Gq
α、G11α、G14α、G15α、G16α。G12クラスのG12α、
G13α。またこれらαサブユニットと三量体を形成する
βおよびγサブユニットとして、それぞれβ1からβ5ま
でおよびγ1からγ11まで挙げられる。
【００１９】Ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質（そのリガン
ドを括弧内に示す）の具体例としては、以下のものが挙
げられる。 （１）ロドプシン／βアドレナリン受容体様 G タンパ
ク質共役型受容体タンパク質として、BLT１（ロイコト
リエンB4），ETA, ETB(エンドセリン)，AT1(アンギオテ
ンシン)，EDG(スフィンゴシンリン酸)，CCR, CXCR (ケ
モカイン), α1、α2、β1、β2、β3（ノルエピネフリ
ン）、M1, M2, M3（アセチルコリン）、5-HT1A（セロト
ニン）、NK-1（サブスタンスP）、Y1（ニューロペプチ
ドY）、B1,B2（ブラジキニン）、V1A（バソプレッシ
ン）、CB1, CB2（アナンダマイド）, D1, D2, D3（ドー
パミン），におい受容体，MT1, MT2, MT3（メラトニ
ン），光受容体などが挙げられる。 （２）グルカゴン／VIP(Vasoactive intestinal peptid
e)/カルシトニン受容体様 G タンパク質共役型受容体タ
ンパク質として、カルシトニン受容体（カルシトニ
ン）、VIP1, VIP2 （Vasoactive intestinal peptid
e）、CRF1（corticotropin-releasing factor）, PTH
受容体（パラトルモン）などが挙げられる。 （３）代謝型神経伝達物質／カルシウム受容体様 G タ
ンパク質共役型受容体タンパク質として、mglu1, mglu2
（グルタミン酸）、GABAB（γ-アミノ酪酸），味受容体
などが挙げられる。（Gether, U. Uncovering molecula
r mechanisms involved in activation of Gprotein-co
upled receptors. Endocrine Reviews (2000) 21, 90-1
13）（1998Receptor and Ion Channel Nomenclature Su
pplement, Trends in Pharmacological Science, 199
8）
ドを括弧内に示す）の具体例としては、以下のものが挙
げられる。 （１）ロドプシン／βアドレナリン受容体様 G タンパ
ク質共役型受容体タンパク質として、BLT１（ロイコト
リエンB4），ETA, ETB(エンドセリン)，AT1(アンギオテ
ンシン)，EDG(スフィンゴシンリン酸)，CCR, CXCR (ケ
モカイン), α1、α2、β1、β2、β3（ノルエピネフリ
ン）、M1, M2, M3（アセチルコリン）、5-HT1A（セロト
ニン）、NK-1（サブスタンスP）、Y1（ニューロペプチ
ドY）、B1,B2（ブラジキニン）、V1A（バソプレッシ
ン）、CB1, CB2（アナンダマイド）, D1, D2, D3（ドー
パミン），におい受容体，MT1, MT2, MT3（メラトニ
ン），光受容体などが挙げられる。 （２）グルカゴン／VIP(Vasoactive intestinal peptid
e)/カルシトニン受容体様 G タンパク質共役型受容体タ
ンパク質として、カルシトニン受容体（カルシトニ
ン）、VIP1, VIP2 （Vasoactive intestinal peptid
e）、CRF1（corticotropin-releasing factor）, PTH
受容体（パラトルモン）などが挙げられる。 （３）代謝型神経伝達物質／カルシウム受容体様 G タ
ンパク質共役型受容体タンパク質として、mglu1, mglu2
（グルタミン酸）、GABAB（γ-アミノ酪酸），味受容体
などが挙げられる。（Gether, U. Uncovering molecula
r mechanisms involved in activation of Gprotein-co
upled receptors. Endocrine Reviews (2000) 21, 90-1
13）（1998Receptor and Ion Channel Nomenclature Su
pplement, Trends in Pharmacological Science, 199
8）
【００２０】本発明では、上記したような発現させるた
めの蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の
組換えバキュロウィルスを使用する。昆虫に感染して病
気を起こすウイルスであるバキュロウイルスは、環状の
二本鎖ＤＮＡを遺伝子としてもつエンベロープウイルス
で、鱗翅目、膜翅目および双翅目などの昆虫に感受性を
示す。バキュロウイルスの中で、感染細胞の核内に多角
体（ポリヒドラ）と呼ばれる封入体を大量につくる一群
のウイルスが核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）である。多
角体は、分子量３１ｋＤａのポリヘドリンタンパクより
構成され、感染後期に大量につくられその中に多数のウ
イルス粒子を埋め込んでいる。多角体はウイルスが自然
界で生存するためには必須であるが、ウイルスの増殖そ
のものには必要ないので、多角体遺伝子の代わりに発現
させたい外来遺伝子を挿入してもウイルスは全く支障な
く感染し増殖する。
めの蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の
組換えバキュロウィルスを使用する。昆虫に感染して病
気を起こすウイルスであるバキュロウイルスは、環状の
二本鎖ＤＮＡを遺伝子としてもつエンベロープウイルス
で、鱗翅目、膜翅目および双翅目などの昆虫に感受性を
示す。バキュロウイルスの中で、感染細胞の核内に多角
体（ポリヒドラ）と呼ばれる封入体を大量につくる一群
のウイルスが核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）である。多
角体は、分子量３１ｋＤａのポリヘドリンタンパクより
構成され、感染後期に大量につくられその中に多数のウ
イルス粒子を埋め込んでいる。多角体はウイルスが自然
界で生存するためには必須であるが、ウイルスの増殖そ
のものには必要ないので、多角体遺伝子の代わりに発現
させたい外来遺伝子を挿入してもウイルスは全く支障な
く感染し増殖する。
【００２１】本発明で用いられるバキュロウイルスとし
ては、ＮＰＶのキンウワバ亜科のオートグラファ・カリ
フォルニカ（Autographa californica）ＮＰＶ（ＡｃＮ
ＰＶ）やカイコのボンビックス・モリ（Bombyx mori ）
ＮＰＶ（ＢｍＮＰＶ）などのウイルスがベクターとして
用いることができる。ＡｃＮＰＶの宿主（感染、継代細
胞）としてはスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera
frugiperda ）細胞（Ｓｆ細胞）などが挙げられ、Ｂｍ
ＮＰＶの宿主（感染、継代細胞）としてはＢｍＮ４細胞
などが挙げられる。Ｓｆ細胞は、ＢｍＮ４細胞などに比
べ増殖速度が速いこと、また、ＡｃＮＰＶはヒト肝細胞
およびヒト胎児腎細胞などにも感染する能力を有するこ
とから、ＡｃＮＰＶ系のベクターが好ましい。
ては、ＮＰＶのキンウワバ亜科のオートグラファ・カリ
フォルニカ（Autographa californica）ＮＰＶ（ＡｃＮ
ＰＶ）やカイコのボンビックス・モリ（Bombyx mori ）
ＮＰＶ（ＢｍＮＰＶ）などのウイルスがベクターとして
用いることができる。ＡｃＮＰＶの宿主（感染、継代細
胞）としてはスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera
frugiperda ）細胞（Ｓｆ細胞）などが挙げられ、Ｂｍ
ＮＰＶの宿主（感染、継代細胞）としてはＢｍＮ４細胞
などが挙げられる。Ｓｆ細胞は、ＢｍＮ４細胞などに比
べ増殖速度が速いこと、また、ＡｃＮＰＶはヒト肝細胞
およびヒト胎児腎細胞などにも感染する能力を有するこ
とから、ＡｃＮＰＶ系のベクターが好ましい。
【００２２】宿主としては、Spodoptera Frugiperda細
胞系統Sf9およびSf21などがS．frugiperda幼虫の卵巣組
織から確立しており、Invitrogen社あるいはPharmingen
社（San Diego，CA）、又はATCCなどから入手可能であ
る。さらに、生きている昆虫幼虫を宿主細胞系として使
用することもできる。
胞系統Sf9およびSf21などがS．frugiperda幼虫の卵巣組
織から確立しており、Invitrogen社あるいはPharmingen
社（San Diego，CA）、又はATCCなどから入手可能であ
る。さらに、生きている昆虫幼虫を宿主細胞系として使
用することもできる。
【００２３】本発明で用いる組換えウイルスを構築する
方法は、常法に従って行えばよく、例えば次の手順で行
うことができる。先ず、発現させたい蛋白質の遺伝子を
トランスファーベクターに挿入して組換えトランスファ
ーベクターを構築する。トランスファーベクターの全体
の大きさは一般的には数ｋｂ〜１０ｋｂ程度であり、そ
のうちの約３ｋｂはプラスミド由来の骨格であり、アン
ピシリン等の抗生物質耐性遺伝子と細菌のＤＮＡ複製開
始のシグナルを含んでいる。通常のトランスファーベク
ターではこの骨格以外に、多角体遺伝子の５’領域と
３’領域をそれぞれ数ｋｂずつ含み、以下に述べるよう
なトランスフェクションを行った際に、この配列間で目
的遺伝子と多角体遺伝子との間で相同組換えが引き起こ
る。また、トランスファーベクターには蛋白質遺伝子を
発現させるためのプラモーターを含むことが好ましい。
プロモーターとしては、多角体遺伝子のプロモーター、
ｐ１０遺伝子のプロモーター、キャプシド遺伝子のプロ
モーターなどが挙げられる。
方法は、常法に従って行えばよく、例えば次の手順で行
うことができる。先ず、発現させたい蛋白質の遺伝子を
トランスファーベクターに挿入して組換えトランスファ
ーベクターを構築する。トランスファーベクターの全体
の大きさは一般的には数ｋｂ〜１０ｋｂ程度であり、そ
のうちの約３ｋｂはプラスミド由来の骨格であり、アン
ピシリン等の抗生物質耐性遺伝子と細菌のＤＮＡ複製開
始のシグナルを含んでいる。通常のトランスファーベク
ターではこの骨格以外に、多角体遺伝子の５’領域と
３’領域をそれぞれ数ｋｂずつ含み、以下に述べるよう
なトランスフェクションを行った際に、この配列間で目
的遺伝子と多角体遺伝子との間で相同組換えが引き起こ
る。また、トランスファーベクターには蛋白質遺伝子を
発現させるためのプラモーターを含むことが好ましい。
プロモーターとしては、多角体遺伝子のプロモーター、
ｐ１０遺伝子のプロモーター、キャプシド遺伝子のプロ
モーターなどが挙げられる。
【００２４】トランスファーベクターの種類は特に限定
されない。トランスファーベクターの具体例としては、
ＡｃＮＰＶ系トランスファーベクターとしては、ｐＥＶ
ｍＸＩＶ２、ｐＡｃＳＧ１、ｐＶＬ１３９２／１３９
３、ｐＡｃＭＰ２／３、ｐＡｃＪＰ１、ｐＡｃＵＷ２
１、ｐＡｃＤＺ１、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＡｃＵ
Ｗ５１、ｐＡｃＡＢ３、ｐＡｃ３６０、ｐＢｌｕｅＢａ
ｃＨｉｓ、ｐＶＴ−Ｂａｃ３３、ｐＡｃＵＷ１、ｐＡｃ
ＵＷ４２／４３などが挙げられ、ＢｍＮＰＶ系トランス
ファーベクターとしては、ｐＢＫ２８３、ｐＢＫ５、ｐ
ＢＢ３０、ｐＢＥ１、ｐＢＥ２、ｐＢＫ３、ｐＢＫ５
２、ｐＢＫｂｌｕｅ、ｐＢＫｂｌｕｅ２、ｐＢＦシリー
ズ（以上、フナコシ株式会社、藤沢薬品工業株式会社等
から入手可能）などが挙げられる。
されない。トランスファーベクターの具体例としては、
ＡｃＮＰＶ系トランスファーベクターとしては、ｐＥＶ
ｍＸＩＶ２、ｐＡｃＳＧ１、ｐＶＬ１３９２／１３９
３、ｐＡｃＭＰ２／３、ｐＡｃＪＰ１、ｐＡｃＵＷ２
１、ｐＡｃＤＺ１、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＡｃＵ
Ｗ５１、ｐＡｃＡＢ３、ｐＡｃ３６０、ｐＢｌｕｅＢａ
ｃＨｉｓ、ｐＶＴ−Ｂａｃ３３、ｐＡｃＵＷ１、ｐＡｃ
ＵＷ４２／４３などが挙げられ、ＢｍＮＰＶ系トランス
ファーベクターとしては、ｐＢＫ２８３、ｐＢＫ５、ｐ
ＢＢ３０、ｐＢＥ１、ｐＢＥ２、ｐＢＫ３、ｐＢＫ５
２、ｐＢＫｂｌｕｅ、ｐＢＫｂｌｕｅ２、ｐＢＦシリー
ズ（以上、フナコシ株式会社、藤沢薬品工業株式会社等
から入手可能）などが挙げられる。
【００２５】次に、組換えウイルスを作製するために、
上記の組換えトランスファーベクターをウイルスと混合
した後、宿主として用いる培養細胞に移入するか、ある
いは予めウイルスで感染させた宿主として用いる培養細
胞に上記のトランスファーベクターを移入し、組換えト
ランスファーベクターとウイルスゲノムＤＮＡとの間に
相同組み換えを起こさせ、組み換えウイルスを構築す
る。
上記の組換えトランスファーベクターをウイルスと混合
した後、宿主として用いる培養細胞に移入するか、ある
いは予めウイルスで感染させた宿主として用いる培養細
胞に上記のトランスファーベクターを移入し、組換えト
ランスファーベクターとウイルスゲノムＤＮＡとの間に
相同組み換えを起こさせ、組み換えウイルスを構築す
る。
【００２６】ここで宿主として用いる培養細胞とは、上
記した宿主が挙げられ、通常、昆虫培養細胞（Ｓｆ９細
胞やＢｍＮ細胞など）である。培養条件は、当業者によ
り適宜決定されるが、具体的にはＳｆ９細胞を用いた場
合は１０％ウシ胎児血清を含む培地で、２８℃前後で培
養することが好ましい。このようにして構築された組み
換えウイルスは、常法、例えばプラークアッセイなどに
よって精製することができる。なお、このようにして作
製された組換えウイルスは、核多角体病ウイルスの多角
体蛋白質の遺伝子領域に外来のＤＮＡが置換または挿入
されており多角体を形成することができないため、非組
換えウイルスと容易に区別することが可能である。
記した宿主が挙げられ、通常、昆虫培養細胞（Ｓｆ９細
胞やＢｍＮ細胞など）である。培養条件は、当業者によ
り適宜決定されるが、具体的にはＳｆ９細胞を用いた場
合は１０％ウシ胎児血清を含む培地で、２８℃前後で培
養することが好ましい。このようにして構築された組み
換えウイルスは、常法、例えばプラークアッセイなどに
よって精製することができる。なお、このようにして作
製された組換えウイルスは、核多角体病ウイルスの多角
体蛋白質の遺伝子領域に外来のＤＮＡが置換または挿入
されており多角体を形成することができないため、非組
換えウイルスと容易に区別することが可能である。
【００２７】本発明の方法では、前記の組換えバキュロ
ウイルスを、上記した適当な宿主（Spodoptera Frugipe
rda細胞系統Sf9およびSf21などの培養細胞、又は昆虫幼
虫など）に感染させ、一定時間後（例えば、７２時間後
等）に培養上清から細胞外発芽ウイルス（budded viru
s, BV）を遠心などの分離操作によって回収することに
より、目的蛋白質を回収することができる。なお、組換
えバキュロウイルスは１種類のみ感染させてもよいし、
２種類以上の組換えバキュロウイルスを組み合わせて共
感染させてもよい。
ウイルスを、上記した適当な宿主（Spodoptera Frugipe
rda細胞系統Sf9およびSf21などの培養細胞、又は昆虫幼
虫など）に感染させ、一定時間後（例えば、７２時間後
等）に培養上清から細胞外発芽ウイルス（budded viru
s, BV）を遠心などの分離操作によって回収することに
より、目的蛋白質を回収することができる。なお、組換
えバキュロウイルスは１種類のみ感染させてもよいし、
２種類以上の組換えバキュロウイルスを組み合わせて共
感染させてもよい。
【００２８】細胞外発芽バキュロウイルスの回収は、例
えば、以下のように行うことができる。先ず感染細胞の
培養液を５００〜１，０００ｇで遠心分離して、細胞外
発芽バキュロウイルスを含む上清を回収する。この上清
を約３０，０００〜５０，０００ｇで遠心分離して細胞
外発芽バキュロウイルスを含む沈殿物を得ることができ
る。上記のようにして回収される発芽バキュロウイルス
は、生理活性を有する膜型受容体蛋白質を含むものであ
り、当該発芽バキュロウイルス自体も本発明の範囲内で
ある。この細胞外発芽バキュロウイルスを含む沈殿物を
適当な緩衝液に懸濁し、再度、適当な濃度勾配（例え
ば、スクロースの連続勾配等）の上にウイルスの懸濁物
を重ね、１００，０００ｇで遠心分離して分画する。得
られた画分の中から所望の蛋白質を含む画分を選択する
ことができる。
えば、以下のように行うことができる。先ず感染細胞の
培養液を５００〜１，０００ｇで遠心分離して、細胞外
発芽バキュロウイルスを含む上清を回収する。この上清
を約３０，０００〜５０，０００ｇで遠心分離して細胞
外発芽バキュロウイルスを含む沈殿物を得ることができ
る。上記のようにして回収される発芽バキュロウイルス
は、生理活性を有する膜型受容体蛋白質を含むものであ
り、当該発芽バキュロウイルス自体も本発明の範囲内で
ある。この細胞外発芽バキュロウイルスを含む沈殿物を
適当な緩衝液に懸濁し、再度、適当な濃度勾配（例え
ば、スクロースの連続勾配等）の上にウイルスの懸濁物
を重ね、１００，０００ｇで遠心分離して分画する。得
られた画分の中から所望の蛋白質を含む画分を選択する
ことができる。
【００２９】さらに、発現させた蛋白質を可溶化した形
態で得る場合には、感染細胞の培養液から例えば４００
００gで遠心分離することにより細胞外発芽ウイルスを
回収する。この回収されたペレットを適当な緩衝液に懸
濁し、lyso-phosphatidylcholin 等の溶解剤で処理し、
さらに３００００ｒｐｍで遠心分離を行うことにより上
清と沈澱に分離する。可溶化された目的蛋白質は上清中
に回収することができる。
態で得る場合には、感染細胞の培養液から例えば４００
００gで遠心分離することにより細胞外発芽ウイルスを
回収する。この回収されたペレットを適当な緩衝液に懸
濁し、lyso-phosphatidylcholin 等の溶解剤で処理し、
さらに３００００ｒｐｍで遠心分離を行うことにより上
清と沈澱に分離する。可溶化された目的蛋白質は上清中
に回収することができる。
【００３０】上記した本発明の方法により回収される発
現蛋白質は、その活性化形態として回収されることを特
徴とする。本発明の方法により回収される蛋白質は、好
ましくは少なくとも５０％以上、より好ましくは６０％
以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは
８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好まし
くは９５％以上が活性化形態で回収される。このような
活性化形態の膜受容体蛋白質を高い割合で回収すること
は従来法では不可能であった。
現蛋白質は、その活性化形態として回収されることを特
徴とする。本発明の方法により回収される蛋白質は、好
ましくは少なくとも５０％以上、より好ましくは６０％
以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは
８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好まし
くは９５％以上が活性化形態で回収される。このような
活性化形態の膜受容体蛋白質を高い割合で回収すること
は従来法では不可能であった。
【００３１】本発明はさらに、相互作用蛋白質をコード
する遺伝子及び該相互作用蛋白質と相互作用して機能す
る膜型受容体蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくと
も１種の組換えバキュロウィルスとを感染させた宿主が
放出する、発芽バキュロウイルスを用いて、該発芽バキ
ュロウイルス中に存在する膜型受容体蛋白質と、リガン
ドとの相互作用を分析する方法を提供する。
する遺伝子及び該相互作用蛋白質と相互作用して機能す
る膜型受容体蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくと
も１種の組換えバキュロウィルスとを感染させた宿主が
放出する、発芽バキュロウイルスを用いて、該発芽バキ
ュロウイルス中に存在する膜型受容体蛋白質と、リガン
ドとの相互作用を分析する方法を提供する。
【００３２】膜型受容体蛋白質とリガンドとの相互作用
の測定方法は特に限定されず、当業者であれば適宜選択
することができる。、一例としては、放射標識したリガ
ンドを用いてリガンド結合能を測定することができる。
具体的には、[3H]などで放射標識したリガンドを含む緩
衝液（結合に適した緩衝液を使用）に膜型受容体蛋白質
を含む発芽バキュロウイルスを加えて反応させる。な
お、反応条件は受容体とリガンドの組み合わせの種類に
より適宜選択する。反応後の反応液を適当なフィルター
等の固相担体に吸着ろ過させて反応停止し、該固相担体
を洗浄および乾燥させ、複合体のみを固相担体上に固定
する。シンチレーションカウンターを用いて固相担体の
放射活性を測定することにより、膜型受容体蛋白質とリ
ガンドとの相互作用（即ち、リガンド結合能）を測定す
ることができる。
の測定方法は特に限定されず、当業者であれば適宜選択
することができる。、一例としては、放射標識したリガ
ンドを用いてリガンド結合能を測定することができる。
具体的には、[3H]などで放射標識したリガンドを含む緩
衝液（結合に適した緩衝液を使用）に膜型受容体蛋白質
を含む発芽バキュロウイルスを加えて反応させる。な
お、反応条件は受容体とリガンドの組み合わせの種類に
より適宜選択する。反応後の反応液を適当なフィルター
等の固相担体に吸着ろ過させて反応停止し、該固相担体
を洗浄および乾燥させ、複合体のみを固相担体上に固定
する。シンチレーションカウンターを用いて固相担体の
放射活性を測定することにより、膜型受容体蛋白質とリ
ガンドとの相互作用（即ち、リガンド結合能）を測定す
ることができる。
【００３３】さらに本発明は、相互作用蛋白質をコード
する遺伝子及び該相互作用蛋白質と相互作用して機能す
る膜型受容体蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくと
も１種の組換えバキュロウィルスとを感染させた宿主が
放出する、発芽バキュロウイルスを用いて、被験物質の
存在下において、該発芽バキュロウイルス中に存在する
膜型受容体蛋白質と、リガンドとの相互作用を分析し、
該相互作用を促進又は阻害する物質をスクリーニングす
る方法を提供する。
する遺伝子及び該相互作用蛋白質と相互作用して機能す
る膜型受容体蛋白質をコードする遺伝子を含む少なくと
も１種の組換えバキュロウィルスとを感染させた宿主が
放出する、発芽バキュロウイルスを用いて、被験物質の
存在下において、該発芽バキュロウイルス中に存在する
膜型受容体蛋白質と、リガンドとの相互作用を分析し、
該相互作用を促進又は阻害する物質をスクリーニングす
る方法を提供する。
【００３４】スクリーニングに供される被験物質として
は、例えばペプチド、ポリペプチド、合成化合物、微生
物発酵物、生物体（植物又は動物の組織、微生物、又は
細胞などを含む）からの抽出物、あるいはそれらのライ
ブラリーが挙げられる。ライブラリーとしては、合成化
合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーな
ど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブ
ラリーなど）などが挙げられる。スクリーニングに供さ
れる化学物質は、天然物でも合成物でもよく、また候補
となる単一の化学物質を独立に試験しても、いくつかの
候補となる化学物質の混合物（ライブラリーなどを含
む）について試験をしてもよい。また、細胞抽出物のよ
うな混合物を分画したものについてスクリーニングを行
い、分画を重ねて、所望の活性を有する物質を単離する
ことも可能である。
は、例えばペプチド、ポリペプチド、合成化合物、微生
物発酵物、生物体（植物又は動物の組織、微生物、又は
細胞などを含む）からの抽出物、あるいはそれらのライ
ブラリーが挙げられる。ライブラリーとしては、合成化
合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーな
ど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブ
ラリーなど）などが挙げられる。スクリーニングに供さ
れる化学物質は、天然物でも合成物でもよく、また候補
となる単一の化学物質を独立に試験しても、いくつかの
候補となる化学物質の混合物（ライブラリーなどを含
む）について試験をしてもよい。また、細胞抽出物のよ
うな混合物を分画したものについてスクリーニングを行
い、分画を重ねて、所望の活性を有する物質を単離する
ことも可能である。
【００３５】これらの被験物質は、膜型受容体蛋白質と
リガンドとの相互作用を促進又は阻害することが予想さ
れる物質であることが好ましい。本発明のスクリーニン
グ方法により、膜型受容体蛋白質に対する阻害薬または
活性化薬物をスクリーニングすることが可能である。本
発明のスクリーニング方法により得られる、膜型受容体
蛋白質とリガンドとの相互作用を促進又は阻害する物質
も本発明の範囲内である。以下の実施例により本発明を
さらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限
定されるものではない。
リガンドとの相互作用を促進又は阻害することが予想さ
れる物質であることが好ましい。本発明のスクリーニン
グ方法により、膜型受容体蛋白質に対する阻害薬または
活性化薬物をスクリーニングすることが可能である。本
発明のスクリーニング方法により得られる、膜型受容体
蛋白質とリガンドとの相互作用を促進又は阻害する物質
も本発明の範囲内である。以下の実施例により本発明を
さらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限
定されるものではない。
【００３６】
【実施例】実施例１：Ｇ蛋白質共役型受容体を発現する
組換えバキュロウイルスの調製 ＢＬＴ１は、アラキドン酸から生成されるロイコトリエ
ンＢ4（ＬＴＢ4）の受容体である（Serhan, C. N., Hae
ggstrom, J. Z. and Leslie, C. C. Lipid mediator ne
tworks in cell signaling: update and impact of cyt
okines.(1996)FASEB J. 10, 1147-1158）。BLT1は細胞
膜に存在するＧ蛋白質共役型受容体であり、ＬＴＢ4の
特異的結合により細胞内情報伝達が引き起こされる（Yo
komizo, T., Masuda, M., Kato, K., Toda, A., Izumi,
T. and Shimizu, T. LeukotrieneB4 receptor. Clonin
g and intracellular signaling. (2000) Am. J. Respi
r.Crit. Care. Med. 161, S51-S55）。
組換えバキュロウイルスの調製 ＢＬＴ１は、アラキドン酸から生成されるロイコトリエ
ンＢ4（ＬＴＢ4）の受容体である（Serhan, C. N., Hae
ggstrom, J. Z. and Leslie, C. C. Lipid mediator ne
tworks in cell signaling: update and impact of cyt
okines.(1996)FASEB J. 10, 1147-1158）。BLT1は細胞
膜に存在するＧ蛋白質共役型受容体であり、ＬＴＢ4の
特異的結合により細胞内情報伝達が引き起こされる（Yo
komizo, T., Masuda, M., Kato, K., Toda, A., Izumi,
T. and Shimizu, T. LeukotrieneB4 receptor. Clonin
g and intracellular signaling. (2000) Am. J. Respi
r.Crit. Care. Med. 161, S51-S55）。
【００３７】（１）細胞の培養と感染、および発芽型バ
キュロウイルスの収集 ヒトＢＬＴ１全長ｃＤＮＡ（Yokomizo, T., Izumi, T.,
Chang, K., Takuwa,Y. and Shimizu, T. A G-protein-
coupled receptor for leukotriene B4 thatmediates c
hemotaxis. (1997) Nature 387, 620-624）をpBlueBac
4.5TMベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）あるいはp
BlueBacHis2Aへ組み込み、それぞれpBlueBac-BLT1およ
びpBluBac-His-BLT1を作成した。Ｓｆ９細胞（Invitrog
en）は完全培地（１０％ウシ胎児血清（Sigma）、１０
０units／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌスト
レプトマイシンを含むGrace's supplemented media（GI
BCOBRL））で２７℃で１０ｃｍ径ディッシュに継代培養
した。大量培養は１Ｌ容量のスピナーフラスコ（Wheato
n）にて完全培地に０．００１％pluronic F-68（GIBCO
BRL）を添加して行なった。組み換えバキュロウイルス
の作成は説明書（Bac-N-BlueTM Transfection Kit, Inv
itrogen）に従い、Sf9細胞にBac-N-Blue DNA（ApMNPV由
来）とpBlueBac-BLT1あるいはpBluBac-His-BLT1とを共
感染させ組み換えウイルスを作成した。
キュロウイルスの収集 ヒトＢＬＴ１全長ｃＤＮＡ（Yokomizo, T., Izumi, T.,
Chang, K., Takuwa,Y. and Shimizu, T. A G-protein-
coupled receptor for leukotriene B4 thatmediates c
hemotaxis. (1997) Nature 387, 620-624）をpBlueBac
4.5TMベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）あるいはp
BlueBacHis2Aへ組み込み、それぞれpBlueBac-BLT1およ
びpBluBac-His-BLT1を作成した。Ｓｆ９細胞（Invitrog
en）は完全培地（１０％ウシ胎児血清（Sigma）、１０
０units／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌスト
レプトマイシンを含むGrace's supplemented media（GI
BCOBRL））で２７℃で１０ｃｍ径ディッシュに継代培養
した。大量培養は１Ｌ容量のスピナーフラスコ（Wheato
n）にて完全培地に０．００１％pluronic F-68（GIBCO
BRL）を添加して行なった。組み換えバキュロウイルス
の作成は説明書（Bac-N-BlueTM Transfection Kit, Inv
itrogen）に従い、Sf9細胞にBac-N-Blue DNA（ApMNPV由
来）とpBlueBac-BLT1あるいはpBluBac-His-BLT1とを共
感染させ組み換えウイルスを作成した。
【００３８】（２）発芽型バキュロウイルスにおける受
容体発現のELISAによる解析 Ｓｆ９細胞を１Ｌ容量のスピナーフラスコ（Wheaton）
に２×１０6個／ｍｌ濃度で５００ｍｌ培養し、上記
（１）で作成した組み換えウイルスをＭＯＩ＝５で感染
させ、７２時間後の培養液を実験に用いた。培養液は
１，０００×ｇ、１０分間遠心し、沈澱および上清に分
離した。沈澱は細胞破砕緩衝液（20 mM Tris-HCl pH 7.
4、0.25 M sucrose、10 mM MgCl2、1 mM EDTA、0.5mM P
MSF、2 mM DTT）に懸濁し超音波破砕後、１０，０００
×ｇ、３０分遠心し、さらに上清を１００，０００×
ｇ、１時間超遠心し、沈澱をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に
懸濁し細胞膜画分とした。１，０００×ｇの遠心後の上
清は１０，０００×ｇ、１５分遠心後、上清を４５，０
００×ｇ、３０分遠心し、沈澱をＰＢＳに懸濁後さらに
４５，０００×ｇ、３０分遠心し、沈澱をＰＢＳに懸濁
し発芽型ウイルス画分（ＢＶ画分）とした。
容体発現のELISAによる解析 Ｓｆ９細胞を１Ｌ容量のスピナーフラスコ（Wheaton）
に２×１０6個／ｍｌ濃度で５００ｍｌ培養し、上記
（１）で作成した組み換えウイルスをＭＯＩ＝５で感染
させ、７２時間後の培養液を実験に用いた。培養液は
１，０００×ｇ、１０分間遠心し、沈澱および上清に分
離した。沈澱は細胞破砕緩衝液（20 mM Tris-HCl pH 7.
4、0.25 M sucrose、10 mM MgCl2、1 mM EDTA、0.5mM P
MSF、2 mM DTT）に懸濁し超音波破砕後、１０，０００
×ｇ、３０分遠心し、さらに上清を１００，０００×
ｇ、１時間超遠心し、沈澱をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に
懸濁し細胞膜画分とした。１，０００×ｇの遠心後の上
清は１０，０００×ｇ、１５分遠心後、上清を４５，０
００×ｇ、３０分遠心し、沈澱をＰＢＳに懸濁後さらに
４５，０００×ｇ、３０分遠心し、沈澱をＰＢＳに懸濁
し発芽型ウイルス画分（ＢＶ画分）とした。
【００３９】ＢＶ画分におけるＢＬＴ１の発現量は受容
体Ｃ末端を認識する抗ＢＬＴ１抗血清（Cayman）を用い
たＥＬＩＳＡにより確認した（図１）。その結果、野生
型バキュロウイルスを感染させた場合と比較して、１０
０ｎｇ以上のタンパク質量のＢＶ画分において受容体の
発現による抗体結合を確認した。また、Ｎ末端にHis-ta
gを融合させた受容体発現ＢＶ画分について、抗His-tag
抗体を用いたＥＬＩＳＡを行なった場合、同様な結果を
確認した（図２）。
体Ｃ末端を認識する抗ＢＬＴ１抗血清（Cayman）を用い
たＥＬＩＳＡにより確認した（図１）。その結果、野生
型バキュロウイルスを感染させた場合と比較して、１０
０ｎｇ以上のタンパク質量のＢＶ画分において受容体の
発現による抗体結合を確認した。また、Ｎ末端にHis-ta
gを融合させた受容体発現ＢＶ画分について、抗His-tag
抗体を用いたＥＬＩＳＡを行なった場合、同様な結果を
確認した（図２）。
【００４０】組み換えウイルス感染後のＳｆ９細胞培養
液について、０から９６時間まで２４時間毎に培養液を
採取し、細胞膜画分および１，０００×ｇ、１０分遠心
後の上清を１０，０００×ｇ、１０分間遠心した上清
（上清画分）を調製し、時間経過における受容体発現量
の変化を確認した（図３）。各時間における細胞膜画分
１μｇおよび上清画分２００μｌを用いて、抗ＢＬＴ１
抗血清によるＥＬＩＳＡを行ない、細胞膜画分では４８
時間後から受容体の発現を確認した。上清画分では７２
時間後から受容体の発現を確認した。この結果は、７２
時間後の培養液中に受容体を含むウイルスが発現するこ
とを示す。
液について、０から９６時間まで２４時間毎に培養液を
採取し、細胞膜画分および１，０００×ｇ、１０分遠心
後の上清を１０，０００×ｇ、１０分間遠心した上清
（上清画分）を調製し、時間経過における受容体発現量
の変化を確認した（図３）。各時間における細胞膜画分
１μｇおよび上清画分２００μｌを用いて、抗ＢＬＴ１
抗血清によるＥＬＩＳＡを行ない、細胞膜画分では４８
時間後から受容体の発現を確認した。上清画分では７２
時間後から受容体の発現を確認した。この結果は、７２
時間後の培養液中に受容体を含むウイルスが発現するこ
とを示す。
【００４１】ＢＶ画分および細胞膜画分について受容体
発現量の比較を、抗ＢＬＴ１抗血清によるＥＬＩＳＡに
より行なった（図４）。タンパク質量各１μｇにおい
て、ＢＶ画分における受容体発現量は細胞膜画分の約１
／２であった。
発現量の比較を、抗ＢＬＴ１抗血清によるＥＬＩＳＡに
より行なった（図４）。タンパク質量各１μｇにおい
て、ＢＶ画分における受容体発現量は細胞膜画分の約１
／２であった。
【００４２】（３）発芽型バキュロウイルスにおける受
容体に対するリガンド結合能解析 ＢＶ画分および細胞膜画分のリガンド結合能は、各サン
プルに対する［3Ｈ］ＬＴＢ4結合実験により確認した
（図５）。［3Ｈ］ＬＴＢ4結合実験は、［3Ｈ］を含むb
inding buffer（50 mM Tris-HCl pH 7.4、10 mM MgC
l2、10 mM NaCl、0.1% fatty acid-free BSA）にＬＴＢ
4ＢＶ画分あるいは細胞膜画分を加えて反応液量２００
μｌとし、室温で１時間反応させて行なった。反応液を
GF/C glass microfiber filter（Whatman）に吸着ろ過
させて反応停止し、フィルターを氷冷binding buffer
２ｍｌで３回洗浄後、乾燥させ、シンチレーションカウ
ンターを用いて放射活性を測定した。非特異的結合は反
応液中に１０μＭの ＬＴＢ4を加えることで算出し
た。
容体に対するリガンド結合能解析 ＢＶ画分および細胞膜画分のリガンド結合能は、各サン
プルに対する［3Ｈ］ＬＴＢ4結合実験により確認した
（図５）。［3Ｈ］ＬＴＢ4結合実験は、［3Ｈ］を含むb
inding buffer（50 mM Tris-HCl pH 7.4、10 mM MgC
l2、10 mM NaCl、0.1% fatty acid-free BSA）にＬＴＢ
4ＢＶ画分あるいは細胞膜画分を加えて反応液量２００
μｌとし、室温で１時間反応させて行なった。反応液を
GF/C glass microfiber filter（Whatman）に吸着ろ過
させて反応停止し、フィルターを氷冷binding buffer
２ｍｌで３回洗浄後、乾燥させ、シンチレーションカウ
ンターを用いて放射活性を測定した。非特異的結合は反
応液中に１０μＭの ＬＴＢ4を加えることで算出し
た。
【００４３】ＢＬＴ１あるいはHis-tagＢＬＴ１発現Ｂ
Ｖ画分に対する［3Ｈ］ＬＴＢ4結合量は各受容体発現Ｓ
ｆ９細胞膜画分の３〜４倍程度であった。上記（２）お
よびこの結果から、ＢＶ画分に発現した受容体は細胞膜
画分に発現したものよりも高いリガンド結合能を持つ割
合が多いことが考えられる。
Ｖ画分に対する［3Ｈ］ＬＴＢ4結合量は各受容体発現Ｓ
ｆ９細胞膜画分の３〜４倍程度であった。上記（２）お
よびこの結果から、ＢＶ画分に発現した受容体は細胞膜
画分に発現したものよりも高いリガンド結合能を持つ割
合が多いことが考えられる。
【００４４】実施例２：発芽型バキュロウイルスにおけ
るＧ蛋白質共役型受容体およびＧ蛋白質の共発現 ＢＬＴ１は細胞内でＧｉ様あるいは一部のＧｑ様Ｇ蛋白
質と共役し、ＬＴＢ4の特異的結合によって共役するＧ
蛋白質が活性化される（Gaudreau, R., Gouill, C. L.,
Metaoui, S., Lemire, S., Stankova, J. and Rola-Pl
eszczynski, M.Signalling through the leukotriene B
4 receptor involves bothαｉ andα１６, but notα
ｑ orα１１G-protein subunits. (1998) Biochem J. 3
35, 15-18）。Ｓｆ９に発現するＧ蛋白質は主にＧｓ様
およびＧｑ様Ｇ蛋白質であり、Ｇｉ様Ｇ蛋白質の発現量
が少ないことが報告されている（Obosi, L., Schuette,
D. G., Europe-Finner, N., Beadle, D. J., Hen, R.,
King, L. A. and Bermudez, I. Functional character
ization of the Drosophila 5-HTdro1 and 5-HTdro 2B s
erotonin receptors in insect cells: activation of
a Gas-like proteinby 5HTdro1 but lack of coupling
to inhibitory G-proteins by 5-HTdro2B.(1996) FEBS
Lett. 381, 233-236）。
るＧ蛋白質共役型受容体およびＧ蛋白質の共発現 ＢＬＴ１は細胞内でＧｉ様あるいは一部のＧｑ様Ｇ蛋白
質と共役し、ＬＴＢ4の特異的結合によって共役するＧ
蛋白質が活性化される（Gaudreau, R., Gouill, C. L.,
Metaoui, S., Lemire, S., Stankova, J. and Rola-Pl
eszczynski, M.Signalling through the leukotriene B
4 receptor involves bothαｉ andα１６, but notα
ｑ orα１１G-protein subunits. (1998) Biochem J. 3
35, 15-18）。Ｓｆ９に発現するＧ蛋白質は主にＧｓ様
およびＧｑ様Ｇ蛋白質であり、Ｇｉ様Ｇ蛋白質の発現量
が少ないことが報告されている（Obosi, L., Schuette,
D. G., Europe-Finner, N., Beadle, D. J., Hen, R.,
King, L. A. and Bermudez, I. Functional character
ization of the Drosophila 5-HTdro1 and 5-HTdro 2B s
erotonin receptors in insect cells: activation of
a Gas-like proteinby 5HTdro1 but lack of coupling
to inhibitory G-proteins by 5-HTdro2B.(1996) FEBS
Lett. 381, 233-236）。
【００４５】（１）Ｇ蛋白質共発現における受容体発現
量の比較 ラットＧ蛋白質αおよびβ、γサブユニット（Ｇαｉ
１、Ｇβ１、Ｇγ２）の各組み換えウイルスとHis-tag
BLT1発現組み換えウイルスとを、２×１０6細胞／ｍｌ
濃度のＳｆ９細胞２００ｍｌに各ウイルスあたりＭＯＩ
＝２で感染させ、７２時間後にＢＶ画分を調製し、抗Ｂ
ＬＴ１抗血清を用いたＥＬＩＳＡにより受容体発現を確
認した（図６）。ＢＶ画分における受容体発現量は、受
容体発現組み換えウイルスのみを感染させた場合が最も
高く、次いでＧαｉ１組み換えウイルスを加えた場合、
Ｇβ１およびＧγ２組み換えウイルスを加えた場合、Ｇ
αｉ１およびＧβ１、Ｇβ２組み換えウイルスを加えた
場合の順に低下が認められた。このことから、受容体お
よびＧ蛋白質発現組み換えウイルスをそれぞれＭＯＩ＝
２で共感染させた場合、感染させるウイルスの種類数が
増えるに従い受容体発現量が低下すると考えられる。ま
た、Ｇ蛋白質（Ｇαｉ１、Ｇβ１、Ｇγ２）の組み換え
ウイルスのみを感染させた場合では、野生型のバキュロ
ウイルスを感染させた場合と同程度に低い抗体結合しか
認められなかった。
量の比較 ラットＧ蛋白質αおよびβ、γサブユニット（Ｇαｉ
１、Ｇβ１、Ｇγ２）の各組み換えウイルスとHis-tag
BLT1発現組み換えウイルスとを、２×１０6細胞／ｍｌ
濃度のＳｆ９細胞２００ｍｌに各ウイルスあたりＭＯＩ
＝２で感染させ、７２時間後にＢＶ画分を調製し、抗Ｂ
ＬＴ１抗血清を用いたＥＬＩＳＡにより受容体発現を確
認した（図６）。ＢＶ画分における受容体発現量は、受
容体発現組み換えウイルスのみを感染させた場合が最も
高く、次いでＧαｉ１組み換えウイルスを加えた場合、
Ｇβ１およびＧγ２組み換えウイルスを加えた場合、Ｇ
αｉ１およびＧβ１、Ｇβ２組み換えウイルスを加えた
場合の順に低下が認められた。このことから、受容体お
よびＧ蛋白質発現組み換えウイルスをそれぞれＭＯＩ＝
２で共感染させた場合、感染させるウイルスの種類数が
増えるに従い受容体発現量が低下すると考えられる。ま
た、Ｇ蛋白質（Ｇαｉ１、Ｇβ１、Ｇγ２）の組み換え
ウイルスのみを感染させた場合では、野生型のバキュロ
ウイルスを感染させた場合と同程度に低い抗体結合しか
認められなかった。
【００４６】（２）Ｇ蛋白質共発現におけるリガンド結
合能の比較 ラットＧ蛋白質αおよびβ、γサブユニット（Ｇαｉ
１、Ｇβ１、Ｇγ２）の各組み換えウイルスとHis-tag
BLT1発現組み換えウイルスとを、２×１０6細胞／ｍｌ
濃度のＳｆ９細胞２００ ｍｌに各ウイルスあたりＭＯ
Ｉ＝２で感染させ、７２時間後にＢＶ画分を調製し、実
施例１の（３）で示したリガンド結合実験によりＧ蛋白
質の共発現によるリガンド結合能への影響を確認した
（図７）。
合能の比較 ラットＧ蛋白質αおよびβ、γサブユニット（Ｇαｉ
１、Ｇβ１、Ｇγ２）の各組み換えウイルスとHis-tag
BLT1発現組み換えウイルスとを、２×１０6細胞／ｍｌ
濃度のＳｆ９細胞２００ ｍｌに各ウイルスあたりＭＯ
Ｉ＝２で感染させ、７２時間後にＢＶ画分を調製し、実
施例１の（３）で示したリガンド結合実験によりＧ蛋白
質の共発現によるリガンド結合能への影響を確認した
（図７）。
【００４７】各ＢＶ画分０．３、１、３μｇにおける
０．２５ｎＭ［3Ｈ］ＬＴＢ4結合能は、Ｈｉｓ−ｔａｇ
ＢＬＴ１発現組み換えウイルスおよびラットＧ蛋白質α
およびβ、γサブユニット（Ｇαｉ１、Ｇβ１、Ｇγ
２）を共感染させた場合最も高く、次いで受容体および
Ｇαｉ１組み換えウイルスを共感染させた場合、受容体
およびＧβ１、Ｇγ２組み換えウイルスを共感染させた
場合の順に低下した。また、受容体およびＧβ１、Ｇγ
２組み換えウイルスを共感染させた場合では、受容体発
現組み換えウイルスのみを感染させた場合とリガンド結
合能は変化しなかった。この結果から、受容体のリガン
ド結合能はＧ蛋白質αサブユニットが共発現することに
より増加し、さらにＧ蛋白質αおよびβ、γサブユニッ
トを共発現させることにより最も高くなることを確認し
た。
０．２５ｎＭ［3Ｈ］ＬＴＢ4結合能は、Ｈｉｓ−ｔａｇ
ＢＬＴ１発現組み換えウイルスおよびラットＧ蛋白質α
およびβ、γサブユニット（Ｇαｉ１、Ｇβ１、Ｇγ
２）を共感染させた場合最も高く、次いで受容体および
Ｇαｉ１組み換えウイルスを共感染させた場合、受容体
およびＧβ１、Ｇγ２組み換えウイルスを共感染させた
場合の順に低下した。また、受容体およびＧβ１、Ｇγ
２組み換えウイルスを共感染させた場合では、受容体発
現組み換えウイルスのみを感染させた場合とリガンド結
合能は変化しなかった。この結果から、受容体のリガン
ド結合能はＧ蛋白質αサブユニットが共発現することに
より増加し、さらにＧ蛋白質αおよびβ、γサブユニッ
トを共発現させることにより最も高くなることを確認し
た。
【００４８】受容体発現ＢＶ画分０．３μｇに対する０
から２ｎＭ濃度［3Ｈ］ＬＴＢ4の結合活性を確認した
（図８）。受容体およびＧ蛋白質αおよびβ、γサブユ
ニットを共発現させた場合、受容体のみを発現させた場
合よりも低リガンド濃度での結合活性が上昇した。この
結果は、受容体とＧ蛋白質αおよびβ、γサブユニット
とをＢＶ画分に共発現させることにより、発現した受容
体がリガンドに対して高親和性に結合することを示して
いる。
から２ｎＭ濃度［3Ｈ］ＬＴＢ4の結合活性を確認した
（図８）。受容体およびＧ蛋白質αおよびβ、γサブユ
ニットを共発現させた場合、受容体のみを発現させた場
合よりも低リガンド濃度での結合活性が上昇した。この
結果は、受容体とＧ蛋白質αおよびβ、γサブユニット
とをＢＶ画分に共発現させることにより、発現した受容
体がリガンドに対して高親和性に結合することを示して
いる。
【００４９】
【発明の効果】本発明により、ＧＰＣＲを始めＴ細胞受
容体などの複合体を作って機能する膜型受容体を発現す
ることが可能となり、結合を阻害するあるいは模倣する
物質やシグナル伝達を阻害あるいは模倣する物質のスク
リーニングに使用することができる。
容体などの複合体を作って機能する膜型受容体を発現す
ることが可能となり、結合を阻害するあるいは模倣する
物質やシグナル伝達を阻害あるいは模倣する物質のスク
リーニングに使用することができる。
【図１】図１は、ＢＶ画分における抗ＢＬＴ１抗血清に
よるＥＬＩＳＡの結果を示す。
よるＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２】図２は、ＢＶ画分における抗ヒスタミン抗体に
よるＥＬＩＳＡの結果を示す。
よるＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図３】図３は、ＢＬＴ１発現のタイムコース（抗ＢＬ
Ｔ１抗血清ＥＬＩＳＡ）を示す。
Ｔ１抗血清ＥＬＩＳＡ）を示す。
【図４】図４は、ＢＬＴ１発現量の比較（抗ＢＬＴ１抗
体ＥＬＩＳＡ）を示す。
体ＥＬＩＳＡ）を示す。
【図５】図５は、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）結合
活性の比較を示す。
活性の比較を示す。
【図６】図６は、各種Ｇ蛋白質サブユニット組み換えウ
イルスを共感染した発芽ウイルスにおけるＢＬＴ１の発
現（抗ＢＬＴ１抗血清によるＥＬＩＳＡ）を示す。
イルスを共感染した発芽ウイルスにおけるＢＬＴ１の発
現（抗ＢＬＴ１抗血清によるＥＬＩＳＡ）を示す。
【図７】図７は、ＨｉｓＢＬＴ１と各種Ｇ蛋白質サブユ
ニット組み換えウイルスを共感染したＢＶ画分に対する
［3Ｈ］ＬＴＢ4の結合を示す。
ニット組み換えウイルスを共感染したＢＶ画分に対する
［3Ｈ］ＬＴＢ4の結合を示す。
【図８】図８は、ＢＬＴ１と各種Ｇ蛋白質を共発現させ
た発芽ウイルスにおける［3Ｈ］ＬＴＢ4結合活性を示
す。
た発芽ウイルスにおける［3Ｈ］ＬＴＢ4結合活性を示
す。
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
//(Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Ｃ１２Ｒ 1:93）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:93）
(72)発明者 伊東 広
東京都町田市南成瀬６−５−１ブランシュ
Ｉ−２
(72)発明者 増田 一之
東京都世田谷区経堂５−23−13−201
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA63 BA80 CA04 DA02
EA02 GA11 HA01
4B063 QA18 QQ20 QR59 QR77 QR79
QR80 QS24 QS28
4B064 AG01 AG20 CA10 CA19 CC24
4B065 AA90X AA90Y AA95X AB01
AC14 BA02 CA24
Claims (14)
- 【請求項１】 相互作用蛋白質をコードする遺伝子及び
該相互作用蛋白質と相互作用して機能する膜型受容体蛋
白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換え
バキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主か
ら放出される発芽バキュロウイルス中に該相互作用蛋白
質と該膜型受容体蛋白質とを同時発現させることを含
む、機能を有する膜型受容体蛋白質を発現する方法。 - 【請求項２】 相互作用蛋白質をコードする遺伝子を含
む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスと、該相互
作用蛋白質と相互作用して機能する膜型受容体蛋白質を
コードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュ
ロウィルスとを感染させた宿主を培養し、該宿主から放
出される発芽バキュロウイルス中に該相互作用蛋白質と
該膜型受容体蛋白質とを同時発現させることを含む、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 相互作用蛋白質をコードする遺伝子及び
該相互作用蛋白質と相互作用して機能する膜型受容体蛋
白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換え
バキュロウィルスを感染させた宿主を培養し、該宿主か
ら放出される発芽バキュロウイルスを回収することを含
む、生理活性を有する膜型受容体蛋白質の調製方法。 - 【請求項４】 相互作用蛋白質をコードする遺伝子を含
む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスと、該相互
作用蛋白質と相互作用して機能する膜型受容体蛋白質を
コードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュ
ロウィルスとを感染させた宿主を培養し、該宿主から放
出される発芽バキュロウイルスを回収することを含む、
請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 相互作用蛋白質が共役蛋白質である、請
求項１から４の何れかに記載の方法。 - 【請求項６】 相互作用蛋白質がＧ蛋白質であり、膜型
受容体蛋白質がＧ蛋白質共役型受容体蛋白質である、請
求項１から５の何れかに記載の方法。 - 【請求項７】 宿主が昆虫細胞又は昆虫幼虫である、請
求項１から６の何れかに記載の方法。 - 【請求項８】 相互作用蛋白質をコードする遺伝子及び
該相互作用蛋白質と相互作用して機能する膜型受容体蛋
白質をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換え
バキュロウィルスを感染させた宿主が放出する、発芽バ
キュロウイルス。 - 【請求項９】 相互作用蛋白質が共役蛋白質である、請
求項８に記載の発芽ベキュロウイルス。 - 【請求項１０】 相互作用蛋白質がＧ蛋白質であり、膜
型受容体蛋白質がＧ蛋白質共役型受容体蛋白質である、
請求項８又は９に記載の発芽バキュロウイルス。 - 【請求項１１】 宿主が昆虫細胞又は昆虫幼虫である、
請求項８から１０の何れかに記載の発芽バキュロウイル
ス。 - 【請求項１２】 請求項８から１１の何れかに記載の発
芽バキュロウイルスを用いて、該発芽バキュロウイルス
中に存在する膜型受容体蛋白質と、リガンドとの相互作
用を分析する方法。 - 【請求項１３】 請求項８から１１の何れかに記載の発
芽バキュロウイルスを用いて、被験物質の存在下におい
て、該発芽バキュロウイルス中に存在する膜型受容体蛋
白質と、リガンドとの相互作用を分析し、該相互作用を
促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法。 - 【請求項１４】 請求項１３に記載のスクリーニングす
る方法により得られる、膜型受容体蛋白質とリガンドと
の相互作用を促進又は阻害する物質。
Priority Applications (6)
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|---|---|---|---|
| JP2001246977A JP2003052370A (ja) | 2001-08-16 | 2001-08-16 | 発芽バキュロウィルスを用いた機能を有する膜型受容体蛋白質の発現法 |
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