WO2005033769A1 - Lumineszenz-mikroskopie - Google Patents

Lumineszenz-mikroskopie Download PDF

Info

Publication number
WO2005033769A1
WO2005033769A1 PCT/EP2004/010345 EP2004010345W WO2005033769A1 WO 2005033769 A1 WO2005033769 A1 WO 2005033769A1 EP 2004010345 W EP2004010345 W EP 2004010345W WO 2005033769 A1 WO2005033769 A1 WO 2005033769A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
radiation
sample
excitation
arrangement
axis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2004/010345
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ulrich Simon
Rainer Danz
Ralf Wolleschensky
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jenoptik AG
Carl Zeiss Jena GmbH
Original Assignee
VEB Carl Zeiss Jena GmbH
Carl Zeiss Jena GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by VEB Carl Zeiss Jena GmbH, Carl Zeiss Jena GmbH filed Critical VEB Carl Zeiss Jena GmbH
Publication of WO2005033769A1 publication Critical patent/WO2005033769A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers

Definitions

  • the invention relates to a multi-photon luminescence microscope with at least one radiation source emitting excitation radiation, an optical excitation arrangement that focuses the excitation radiation in a focus on a sample to be examined, a detector device for detecting luminescence radiation excited on or in the sample and an optical arrangement which receives radiation emitted by the sample and supplies it to the detector device.
  • the invention is further directed to a multi-photon luminescence microscopy method in which a sample is illuminated with excitation radiation focused in one focus and radiation emitted by the sample is recorded and detected.
  • luminescence in the sample is excited.
  • a bundled excitation radiation usually laser radiation, which is matched to the generation of maximum luminescence or fluorescence, is usually used.
  • the excitation takes place in the focus area, luminescence also being stimulated in the incident or emerging light cone of the focused beam.
  • image generation the luminescence radiation is recorded by confocal detection only from the area of the focus of the excitation radiation. An image is created by scanning a sample.
  • the sample is excited by a non-linear two- or multi-photon process.
  • the excitation radiation is chosen spectrally so that at least two photons are necessary in order to achieve excitation of the material of the sample causing luminescence radiation. Since the probability of excitation is thus greatly reduced, effective excitation can only take place at very high flux densities, which are only given exactly in the focus of the bundled excitation radiation. Therefore, emission of luminescence or fluorescence radiation is only stimulated at the focal point. This situation is described, for example, in DE 198 01 139 A1, which discloses a microscope or a method of the type mentioned at the beginning.
  • Multi-photon luminescence microscopy requires high photon flux densities to ensure that two photons can work together synergistically. It is therefore an inherent problem of multi-photon luminescence microscopy to achieve the best possible efficiency of the excitation as well as the detection of the luminescence radiation.
  • optical excitation arrangement radiates the excitation radiation along an axis of incidence, which lies at an angle to a surface normal of the sample, and in that the optical detection arrangement detects the radiation emitted in the along a detection axis, which is symmetrical with respect to the surface normal to the radiation axis.
  • the object is further achieved by a multi-photon luminescence microscopy method of the type mentioned at the outset, in which the excitation radiation is irradiated along an axis of incidence which is at an angle to the surface normal of the sample, and the radiation emitted by the sample is recorded along a detection axis which is symmetrical with respect to the radiation axis with respect to the surface normal.
  • the excitation radiation and the emitted radiation are guided along axes which lie symmetrically to a surface normal of the sample.
  • This approach is surprising before the known prior art, which in multi-photon luminescence microscopy assumes that the detector device should record radiation emitted in all spatial directions as far as possible.
  • the invention is based on the finding that, in the case of multi-photon excitation of materials which are optically isotropic per se, as is the case, for example, with silicon bulk material, symmetry breaks can occur in the material. Such defects can occur, for example, with silicon in the form of doping, crystal defects or the effects of surface roughness.
  • excitation radiation radiated in at an angle to the surface normal and the luminescence radiation detected symmetrically thereto allow such symmetry calculations to be detected particularly sensitively, so that the smaller solid angles from which an external detector as used in the prior art is used to cover the largest possible solid angular range Luminescence radiation is recorded, surprisingly not automatically disadvantageous.
  • the oblique radiation or detection opens up an additional analysis option if the angle of the radiation is adjusted.
  • an adjusting device is therefore provided with which the angle of incidence or the detection can be adjusted.
  • the adjustment should preferably take place around a value of 45 °, since in this case a maximum of the luminescence intensity should occur in symmetry breaks in most cases.
  • a sample is preferably scanned by scanning, i.e. the position of the focus is adjusted on or in the sample. This requires a relative movement between the sample and the microscope, which can be achieved either by a scanning device influencing the optical beam path or alternatively and additionally by a one-dimensional or multi-dimensional translation of the sample.
  • the concept according to the invention can also be implemented in conventional laser scanning microscopes, as described, for example, in the publication R. Wolleschensky et al., "Characterization and optimization of a laser scanning microscope in the femtosecond regime", Applied Physics B 67, 1998 , Pages 87 - 94.
  • the oblique radiation of the excitation radiation and the symmetrical oblique detection of the emitted radiation can be realized by a special objective which is inserted into a nosepiece of a conventional laser
  • the optical excitation arrangement and the optical detection arrangement at least partially have a common beam path.
  • the detection arrangement has a first beam splitter, which couples radiation emitted by the sample into the beam path of the excitation arrangement, and a second beam splitter, which couples radiation emitted by the sample out of the beam path of the excitation arrangement.
  • a second beam splitter is usually present in conventional laser scanning microscopes.
  • the above-mentioned special objective will therefore have the first beam splitter and optics for focusing the excitation radiation or recording the emitted radiation. If the scanning device lies between the first and second beam splitters, it is ensured in a simple manner that the excitation radiation is focused on a spot from which the emitted radiation is also picked up by means of the detection arrangement.
  • a particularly simple construction of the special lens mentioned or a particularly expedient realization of the split beam path is a lens with a divided pupil, which is both part of the excitation arrangement and the detection arrangement. Then the excitation radiation can run through one part of the pupil and the detection radiation through the other part.
  • the pupil division is expediently realized by a block filter arranged upstream of the objective with respect to the sample and which filters a part of the pupil of the objective.
  • the filter can, for example, spectrally filter the excitation radiation or the emitted radiation.
  • the radiation source emits linearly polarized excitation radiation.
  • the beam splitters mentioned at the outset can then expediently be designed as pole splitters. Of course, they can alternatively or additionally be dichroic color dividers.
  • the method according to the invention makes it possible to detect an intensity maximum of the radiation emitted by the sample by adjusting the angle, and thus to open up an additional analysis possibility.
  • the sample is preferably scanned at an angle set to the maximum intensity.
  • the sample can also be scanned in a first run at a certain angle, for example equal to or close to 45 °, and the angle can be varied in at least one point of the sample to improve the contrast in a second run.
  • a selection can also be made as to whether the contrast is above a threshold value within a certain angular range.
  • the contrast dependency can also be evaluated as a function of the angle for image display.
  • FIG. 1 shows a schematic illustration of a laser scanning microscope for multi-photon luminescence microscopy
  • FIG. 2 shows an example of a special objective of the microscope of FIG. 1
  • FIG. 3 shows the beam path in the objective of FIG. 2
  • a microscope M is shown schematically in FIG. 1, which permits multi-photon fluorescence or luminescence microscopy.
  • the microscope M examines a surface 1 of a sample 2, which is a silicon semiconductor component, for example.
  • a laser 3 emits linearly polarized radiation in the form of short pulses. In one embodiment, the wavelength of the radiation is between 700 nm and 1,000 nm.
  • the radiation is directed via a first beam splitter 4 onto a scanner 5, which enables a two-axis deflection of the light beam in order to scan the surface 1.
  • the radiation of the laser 3 serving as excitation radiation falls through a tube lens 6, passes through a second beam splitter 7 without being deflected by the latter and is guided into an excitation objective 9 by means of a deflection mirror 8.
  • the excitation objective 9 focuses the excitation radiation into a focus F on the surface 1 of the sample 2.
  • the focus can of course also be in the sample.
  • the focusing takes place in an excitation cone which extends from a lens 9 to the surface 1 along a main axis of the excitation radiation.
  • This main axis 10 lies obliquely at an angle to the surface normal 11 of the surface 1.
  • the short-pulsed laser radiation from the laser 3 causes the generation of fluorescence radiation in or on the sample 2 by non-linear effects. The radiation therefore only arises in focus F.
  • the detection objective 12 is likewise focused on the focus F and thus collects the radiation from the sample 2, a detection cone DK extending along a main axis 13 of the detection.
  • the main axis 13 is symmetrical with respect to the surface normal 11 to the main axis 10.
  • the received radiation is guided via a deflection mirror 14 to the second beam splitter 7, which is dichroically designed in such a way that it deflects the detected radiation to the tube lens 6 and thus to the scanner 5.
  • the second beam splitter 7, by virtue of its dichroic properties, therefore allows the excitation radiation to pass and reflects the detected luminescent radiation.
  • This passes from the scanner 5 to the first beam splitter 4, which is also dichroic and therefore allows the luminescence radiation to pass, whereas the excitation radiation is reflected.
  • a filter 15 in front of a detector 16 filters the luminescent radiation and blocks any excitation radiation that has entered the beam path to the detector 16.
  • the detector 16 is read out by a control unit 17 which, in addition to controlling the laser 3 and the scanner 5, also controls a scanning table 18 which effects a z-adjustment of the sample 2.
  • additional filters are optionally provided in the region of the deflection mirror 14 or deflection mirror 8, which spectrally condition the excitation radiation in particular or filter excitation radiation from the radiation from the detection cone DK.
  • the special objective is designed as a combination objective 19, which carries both the excitation radiation and the detected radiation.
  • These two radiation components run in beam paths along optical axes that are offset parallel to the optical axis of the combination objective 19.
  • the optical axis of the combination lens 19 coincides with the surface normal 11.
  • the parallel offset of the beam paths ensures that the main axis 10 of the excitation radiation lies obliquely and symmetrically to the main axis 13 of the detection. At the same time, it is ensured that excitation radiation and detection radiation are related to the same focus F.
  • FIG. 3 shows a possible embodiment of the combination objective 19 in a laser scanning microscope M, only the beam path after the scanner 5 being shown.
  • the combination objective 19 is arranged downstream of the tube lens 6 in the direction of the sample 2. Between the tube lens 6 and the combination objective 19 there is a block filter 20 (in the infinity beam path), which blocks either the excitation radiation or the luminescence radiation to be detected.
  • the combination objective 19 thus has the divided pupil 21 shown in FIG. 4, which includes an excitation part 22 and a detection part 23. This division is effected by the block filter 20.
  • the angle between the main axis 10 and the surface normal 11 or the angle between the main axis 10 of the excitation radiation and the main axis 13 of the detection can be changed in order to achieve an intensity maximum or an improvement in contrast.
  • This variation can either by suitable adjustment of excitation lens 9 and detection lens 12 or by suitable adjustment of combination lens 19, which can be designed as a zoom lens or with other suitable means.
  • the area of surface 1 to be analyzed is scanned in a first pass at an angle of approximately 45 °.
  • a contrast improvement is then achieved at individual points or sub-areas by varying the angle.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)

Abstract

Es wird beschrieben eine Mehr-Photonen-Lumineszenz-Mikroskop mit mindestens einer Anregungsstrahlung abgebenden Strahlungsquelle (3), einer optischen Anregungsanordnung (3, 4, 5, 8), die die Anregungsstrahlung in einem Fokus (F) auf eine zu untersuchende Probe (2) bündelt einer Detektoreinrichtung (15, 16) zum Erfassen von an oder in der Probe (2) angeregter Lumineszenzstrahlung und einer optischen Detektions-Anordnung (15, 14, 7, 5), die von der Probe (2) emittierte Strahlung aufnimmt und der Detektoreinrichtung (15, 16) zuführt, wobei die optische Anregungsanordnung (3, 4, 5, 8) die Anregungsstrahlung entlang einer Einfallsachse, (10) einstrahlt, die unter einem Winkel zu einer Flächennormalen (11) der Probe (2) liegt und die optische Detektionsanordnung (12, 14, 7, 5) die emittierte Strahlung entlang einer Detektionsachse (13) aufnimmt, weiche bezüglich der Flächennormalen (11 ) symmetrisch zur Einstrahlungsachse (10) liegt.

Description

Lumineszenz-Mikroskopie
Die Erfindung bezieht sich auf ein Mehr-Photonen-Lumineszenz-Mikroskop mit mindestens einer Anregungsstrahlung abgebenden Strahlungsquelle, einer optischen Anregungsanordnung, die die Anregungsstrahlung in einem Fokus auf eine zu untersuchende Probe bündelt, einer Detektoreinrichtung zum Erfassen von an oder in der Probe angeregter Lumineszenzstrahlung und einer optischen Anordnung, die von der Probe emittierte Strahlung aufnimmt und der Detektoreinrichtung zuführt. Die Erfindung auf weiter auf ein Mehr-Photonen- Lumineszenz-Mikroskopieverfahren gerichtet, bei dem eine Probe mit in einem Fokus gebündelter Anregungsstrahlung beleuchtet und von der Probe emittierte Strahlung aufgenommen und detektiert wird.
Bei herkömmlicher Fluoreszenz-Mikroskopie wird Lumineszenz in der Probe angeregt. Dabei wird üblicherweise eine gebündelte, auf die Erzeugung maximaler Lumineszenz oder Fluoreszenz abgestimmter Anregungsstrahlung, meist Laserstrahlung verwendet. Die Anregung erfolgt dabei im Fokusbereich, wobei auch im einfallenden bzw. ausfallenden Lichtkegel des fokussierten Strahlenbündels Lumineszenz stimuliert wird. Zur Bilderzeugung wird die Lumineszenzstrahlung durch eine konfokale Detektion nur aus dem Bereich des Fokus der Anregungsstrahlung aufgenommen. Durch Abrastern einer Probe entsteht ein Bild.
In einer Sonderform der Lumineszenz-Mikroskopie erfolgt die Anregung der Probe durch einen nicht-linearen Zwei- oder Mehrphotonenprozeß. Die Anregungsstrahlung ist dabei spektrakso gewählt, daß mindestens zwei Photonen nötig sind, um eine Lumineszenzstrahlung bewirkende Anregung des Materials der Probe zu erreichen. Da die Anregungswahrscheinlichkeit damit stark vermindert ist, kann eine effektive Anregung nur bei sehr hohen Flußdichten erfolgen, die nur exakt im Fokus der gebündelten Anregungsstrahlung gegeben sind. Deshalb wird nur im Fokuspunkt eine Emission von Lumineszenz- oder Fluoreszenzstrahlung angeregt. Dieser Sachverhalt ist beispielsweise in der DE 198 01 139 A1 beschrieben, die ein Mikroskop beziehungsweise ein Verfahren der eingangs genannten Art offenbart. Bei der Mehr-Photonen-Lumineszenz-Mikroskopie sind hohe Photonenflußdichten erforderlich, um sicherzustellen, daß zwei Photonen in synergistischer Weise zusammenwirken können. Es ist deshalb ein inhärentes Problem der Mehr-Photonen-Lumineszenz-Mikroskopie einen möglichst guten Wirkungsgrad der Anregung wie auch der Detektion der Lumineszenzstrahlung zu erreichen.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mehr-Photonen-Lumineszenz-Mikroskop der eingangs genannte Art beziehungsweise ein Mehr-Photonen-Lumineszenz- Mikroskopieverfahren der eingangs genannten Art so weiterzubilden, daß eine besonders effektive Anregung und Detektion erreicht wird.
Diese Aufgabe wird mit einem Mehr-Photonen-Lumineszenz-Mikroskop der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß die optische Anregungsanordnung die Anregungsstrahlung entlang einer Einfallsachse einstrahlt, die unter einem Winkel zu einer Flächennormalen der Probe liegt, und daß die optische Detektionsanordnung die im emittierte Strahlung entlang einer Detektionsachse aufnimmt, welche bezüglich der Flächennormalen symmetrisch zur Einstrahlungsachse liegt. Die Aufgabe wird weiter durch ein Mehr-Photonen-Lumineszenz- Mikroskopieverfahren der eingangs genannten Art gelöst, bei dem die Anregungsstrahlung entlang einer Einfallsachse eingestrahlt wird, die unter einem Winkel zur Flächennormalen der Probe liegt, und die von der Probe emittierte Strahlung entlang einer Detektionsachse aufgenommen wird, welche bezüglich der Flächenormalen symmetrisch zur Einstrahlungsachse liegt.
Erfindungsgemäß ist es also vorgesehen, die Anregungsstrahlung und die emittierte Strahlung entlang Achsen zu führen, die symmetrisch zu einer Flächennormalen der Probe liegen. Dieser Ansatz ist vor dem bekannten Stand der Technik, der bei der Mehr-Photonen-Lumineszenz- Mikroskopie davon ausgeht, daß die Detektoreinrichtung möglichst in alle Raumrichtung emittierte Strahlung aufnehmen soll, überraschend. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß er bei der Mehr-Photonen-Anregung von Materialen, die per se optisch isotrop sind, wie dies beispielsweise bei Silizium-Volumenmaterial der Fall ist, durch Fehlstellen im Material zu Symmetriebrechungen kommen kann. Solche Fehlstellen können beispielsweise bei Silizium in Form von Dotierungen, Kristallfehlern oder Auswirkungen von Oberflächenrauhigkeiten kommen. Die schräg zur Flächennormalen eingestrahlte Anregungsstrahlung und symmetrisch dazu detektierte Lumineszenzstrahlung erlaubt es, solche Symmetriebrechnungen besonders empfindlich nachweisen zu können, so daß der gegenüber einem externen Detektor, wie er im Stand der Technik zum Abdecken eines möglichst großen Raumwinkelbereichs verwendet wird, geringere Raumwinkel, aus denen Lumineszenzstrahlung aufgenommen wird, überraschenderweise nicht automatisch nachteilig ist.
Die schräge Einstrahlung bzw. Detektion erschließt eine zusätzliche Analysemöglichkeit, wenn eine Verstellung des Winkels der Einstrahlung erfolgt. Es ist deshalb in einer Weiterbildung des Mehr-Photonen-Lumineszenz-Mikroskops eine Versteileinrichtung vorgesehen, mit der der Winkel des Einfalls bzw. der Detektion verstellbar ist. Vorzugsweise soll die Verstellung um einen Wert von 45° herum erfolgen, da bei diesem Wert bei Symmetriebrechungen in den meisten Fällen ein Maximum der Lumineszenzintensität auftreten sollte.
Die Abtastung einer Probe erfolgt vorzugsweise durch Abscannen, d.h. die Lage des Fokus wird auf oder in der Probe verstellt. Dies bedingt eine Relativbewegung zwischen Probe und Mikroskop, die entweder durch eine den optischen Strahlengang beeinflussende Scaneinrichtung oder alternativ sowie zusätzlich durch eine ein- oder mehrdimensionale Translation der Probe erreicht werden kann.
Das erfindungsgemäße Konzept läßt sich auch bei herkömmlichen Laser-Scanning- Mikroskopen realisieren, wie sie beispielsweise in der Veröffentlichung R. Wolleschensky et al., „Characterization and optimisation of a laser-scanning microscope in the femtosecond regime", Applied Physics B 67, 1998, Seiten 87 - 94, beschrieben ist. Bei einem solchen herkömmlichen Mehr-Photonen-Luminenszenz-Mikroskop läßt sich die schräge Einstrahlung der Anregungsstrahlung sowie die symmetrisch dazu liegende schräge Detektion der emittierten Strahlung durch ein Spezialobjektiv realisieren, das in einen Objektivrevolver eines herkömmlichen Laser-Scanning-Mikroskops einsetzbar ist. Bei einem solchen Sonderobjektiv weisen die optischen Anregungsanordnung und die optische Detektionsanordnung zumindest teilweise einen gemeinsamen Strahlengang auf.
Ein solcher gemeinsamer Strahlengang ermöglicht auf einfache Weise ein Abscannen der Probe durch Verstellung des Fokus. Für eine solche Weiterbildung ist es bevorzugt, daß die Detektionsanordnung einen ersten Strahlteiler, der von der Probe emittierte Strahlung in den Strahlengang der Anregungsanordnung einkoppelt, und einen zweiten Strahlteiler aufweist, der von der Probe emittierte Strahlung aus den Strahlengang der Anregungsanordnung auskoppelt. Ein solcher zweiter Strahlteiler ist üblicherweise in herkömmlichen Laser-Scanning-Mikroskopen vorhanden. Das erwähnte Spezialobjektiv wird also den ersten Strahlteiler sowie Optiken zur Fokussierung der Anregungsstrahlung bzw. Aufnahme der emittierten Strahlung aufweisen. Liegt die Scaneinrichtung zwischen erstem und zweiten Strahlteiler, ist auf einfache Weise sichergestellt, daß die Fokussierung der Anregungsstrahlung auf einen Fleck erfolgt, von dem auch die emittierte Strahlung mittels der Detektionsanordnung aufgenommen wird.
Eine besonders einfache Bauweise des erwähnten Sonderobjektivs bzw. eine besonders zweckmäßige Realisierung des geteilten Strahlengangs ist ein Objektiv mit geteilter Pupille, das sowohl Teil der Anregungsanordnung als auch der Detektionsanordnung ist. Dann kann durch einen Teil der Pupille die Anregungsstrahlung, durch den anderen Teil die Detektionsstrahlung laufen. Zweckmäßigerweise wird man die Pupillenteilung durch einen dem Objektiv in Bezug auf die Probe vorgeordneten Blockfilter realisieren, der einen Teil der Pupille des Objektivs filtert. Dabei kann der Filter beispielsweise die Anregungsstrahlung oder die emittierte Strahlung spektral filtern.
Zur Detektion der eingangs erwähnten Symmetriebrechung ist es zweckmäßig, linear polarisierten Anregungsstrahlung zu verwenden, da dann ein zusätzlicher Polarisationseffekt dahingehend auftritt, daß die Polarisationsrichtung zwischen Anregungsstrahlung und detektierter Strahlung um 90° verschoben liegt. Es ist deshalb bevorzugt, daß die Strahlungsquelle linear polarisierte Anregungsstrahlung abgibt. Die eingangs erwähnten Strahlteiler können dann zweckmäßigerweise als Polteiler ausgeführt werden. Natürlich können sie alternativ oder zusätzlich dichroitische Farbteiler sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, durch die Verstellung des Winkels ein Intensitätsmaximum der von der Probe emittierten Strahlung zu detektieren, und damit eine zusätzliche Analysemöglichkeit zu erschließen.
Vorzugsweise erfolgt ein Abscannen der Probe mit auf das Intensitätsmaximum eingestellten Winkel. Alternativ kann die Probe auch in einem ersten Durchlauf mit einem bestimmten Winkel, beispielsweise gleich oder nahe 45°, abgescannt werden und in einem zweiten Durchlauf an zumindest einem Punkt der Probe der Winkel zur Kontrastverbesserung variiert werden.
Alternativ kann eine Auswahl auch dahingehend erfolgen, ob der Kontrast innerhalb eines gewissen Winkelbereichs über einen Schwellwert liegt. Auch kann die Kontrastabhängigkeit als Funktion des Winkels zur Bilddarstellung ausgewertet werden.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beispielshalber noch näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt: Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Laser-Scanning-Mikroskops zur Mehr-Photonen- Lumineszenz-Mikroskopie, Fig. 2 ein Beispiel für ein Spezialobjektiv des Mikroskops der Figur 1 , Fig. 3 den Strahlengang im Objektiv der Figur 2 sowie Fig. 4 eine Pupillenteilung beim Objektiv der Figur 2.
In Figur 1 ist schematisch ein Mikroskop M dargestellt, das Mehr-Photonen-Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Mikroskopie erlaubt. Das Mikroskop M untersucht dabei eine Oberfläche 1 einer Probe 2, die beispielsweise ein Siliziumhalbleiterbauelement ist. Ein Laser 3 gibt linear polarisierte Strahlung in Form kurzer Pulse ab. Die Wellenlänge der Strahlung liegt in einer Ausführungsform zwischen 700 nm und 1.000 nm. Die Strahlung wird über einen ersten Strahlteiler 4 auf einen Scanner 5 gelenkt, der eine zweiachsige Ablenkung des Lichtstrahls ermöglicht, um die Oberfläche 1 abzurastern. Nach der Ablenkung durch den Scanner 5 fällt die als Anregungsstrahlung dienende Strahlung des Lasers 3 durch eine Tubuslinse 6, passiert einen zweiten Strahlteiler 7, ohne von diesem abgelenkt zu werden und wird mittels eines Umlenkspiegels 8 in ein Anregungsobjektiv 9 geleitet.
Das Anregungsobjektiv 9 fokussiert die Anregungsstrahlung in einen Fokus F auf der Oberfläche 1 der Probe 2. Gemäß dem bekannten Prinzip der Laser-Scanning-Mikroskopie kann der Fokus natürlich auch in der Probe liegen. Die Fokussierung erfolgt dabei in einem Anregungskegel, der sich längs einer Hauptachse der Anregungsstrahlung vom Objektiv 9 zur Oberfläche 1 erstreckt. Diese Hauptachse 10 liegt schräg unter einem Winkel zur Flächennormalen 11 der Oberfläche 1. Die kurz gepulste Laserstrahlung des Lasers 3 bewirkt in oder an der Probe 2 die Entstehung von Fluoreszenzstrahlung durch nicht-lineare Effekte. Die Strahlung entsteht also nur im Fokus F.
Sie wird mittels eines Detektionsobjektivs aufgenommen, wobei das Detektionsobjektiv 12 ebenfalls auf den Fokus F fokussiert ist und damit die Strahlung von der Probe 2 sammelt, wobei ein Detektionskegel DK sich entlang einer Hauptachse 13 der Detektion erstreckt. Die Hauptachse 13 liegt bezüglich der Flächennormalen 11 symmetrisch zur Hauptachse 10.
Die aufgenommene Strahlung wird über einen Umlenkspiegel 14 zum zweiten Strahlteiler 7 geführt, der dichroitisch so ausgebildet ist, daß er die detektierte Strahlung zur Tubuslinse 6 und damit zum Scanner 5 umlenkt. Der zweite Strahlteiler 7 läßt also vermöge seiner dichroitischen Eigenschaften die Anregungsstrahlung passieren und reflektiert die detektierte Lumineszenzstrahlung. Diese gelangt so vom Scanner 5 zum ersten Strahlteiler 4, der ebenfalls dichroitisch ausgebildet ist und deshalb die Lumineszenzstrahlung passieren läßt, wogegen die Anregungsstrahlung reflektiert wird. Ein Filter 15 vor einem Detektor 16 filtert die Lumineszenzstrahlung und blockt eventuell in den Strahlengang zum Detektor 16 gelangte Anregungsstrahlung ab. Der Detektor 16 wird von einer Steuereinheit 17 ausgelesen, die neben der Steuerung des Lasers 3 und des Scanners 5 auch einen Scantisch 18 steuert, der eine z- Verstellung der Probe 2 bewirkt.
Zusätzlich zu den für das Mikroskop 1 beschriebenen Filtern und Optikeinheiten sind im Bereich des Umlenkspiegels 14 bzw. des Umlenkspiegels 8 optional noch weitere Filter vorgesehen, die die Anregungsstrahlung insbesondere spektral konditionieren bzw. aus der Strahlung aus dem Detektionskegel DK Anregungsstrahlung ausfiltern.
Die Einheit aus Umlenkspiegel 8 und Anregungsobjektiv 9 sowie aus Detektionsobjektiv 12 und Umlenkspiegel 14 bildet in einer Ausgestaltung des Mikroskops M zusammen mit dem zweiten Strahlteiler 9 ein Spezialobjektiv, daß in einen Objektivrevolver eines herkömmlichen Laser- Scanning-Mikroskops einsetzbar ist.
In einer weiteren Ausgestaltung ist das Spezialobjektiv als Kombinationsobjektiv 19 ausgeführt, das sowohl die Anregungsstrahlung als auch die detektierte Strahlung führt. Diese beiden Strahlungsanteile verlaufen dabei in Strahlengängen entlang optischer Achsen, die parallel zur optischen Achse des Kombinationsobjektivs 19 versetzt ist. Die optische Achse des Kombinationsobjektivs 19 fällt mit der Flächennormalen 11 zusammen. Durch den Parallelversatz der Strahlengänge ist erreicht, daß die Hauptachse 10 der Anregungsstrahlung schräg und symmetrisch zur Hauptachse 13 der Detektion liegt. Gleichzeitig ist sichergestellt, daß Anregungsstrahlung und Detektionsstrahlung auf denselben Fokus F bezogen sind.
Figur 3 zeigt eine mögliche Ausführungsform des Kombinationsobjektivs 19 in einem Laser- Scanning-Mikroskop M, wobei nur der Strahlengang nach dem Scanner 5 eingezeichnet ist. Das Kombinationsobjektiv 19 ist der Tubusliπse 6 in Richtung auf die Probe 2 nachgeordnet. Zwischen Tubuslinse 6 und Kombinationsobjektiv 19 liegt (im Unendlichstrahlengang) ein Blockfilter 20, der entweder die Anregungsstrahlung oder die zu detektierende Lumineszenzstrahlung abblockt. Das Kombinationsobjektiv 19 hat dadurch die in Figur 4 gezeigte geteilte Pupille 21 , die einen Anregungsteil 22 sowie ein Detektionsteil 23 beinhaltet. Diese Teilung ist durch den Blockfilter 20 bewirkt.
Zur Mikroskopie mit dem Mikroskop M kann in einer bevorzugten Ausgestaltung der Winkel zwischen Hauptachse 10 und Flächennormale 11 bzw. der Winkel zwischen Hauptachse 10 der Anregungsstrahlung und Hauptachse 13 der Detektion verändert werden, um ein Intensitätsmaximum bzw. eine Kontrastverbesserung zu erreichen. Diese Variation kann entweder durch geeignete Verstellung von Anregungsobjektiv 9 und Detektionsobjektiv 12 erfolgen oder durch geeignete Verstellung des Kombinationsobjektivs 19, das dazu als Zoom- Objektiv oder mit anderen geeigneten Mitteln ausgestaltet sein kann.
In einer vorzugsweisen Ausgestaltung wird in einem ersten Durchlauf einem Winkel von etwas 45° das zu analysierende Gebiet der Oberfläche 1 abgescannt. Anschließend wird an einzelnen Punkten oder Teilgebieten eine Kontrastverbesserung erreicht, indem eine Variation des Winkels erfolgt.

Claims

Patentansprüche
1. Mehr-Photonen-Lumineszenz-Mikroskop mit - mindestens einer Anregungsstrahlung abgebenden Strahlungsquelle (3),
- einer optischen Anregungsanordnung (3, 4, 5, 8), die die Anregungsstrahlung in einem Fokus (F) auf eine zu untersuchende Probe (2) bündelt,
- einer Detektoreinrichtung (15, 16) zum Erfassen von an oder in der Probe (2) angeregter Lumineszenzstrahlung und - einer optischen Detektions-Anordnung (15, 14, 7, 5), die von der Probe (2) emittierte Strahlung aufnimmt und der Detektoreinrichtung (15, 16) zuführt, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Anregungsanordnung (3, 4, 5, 8) die Anregungsstrahlung entlang einer Einfallsachse (10) einstrahlt, die unter einem Winkel zu einer Flächennormalen (11) der Probe (2) liegt und die optische Detektionsanordnung (12, 14, 7, 5) die emittierte Strahlung entlang einer Detektionsachse (13) aufnimmt, welche bezüglich der Flächennormalen (11 ) symmetrisch zur Einstrahlungsachse (10) liegt.
2. Mikroskop nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Versteileinrichtung mittels der der Winkel verstellbar ist, vorzugsweise um einen Wert von 45° herum.
3. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, gekennzeichnet durch eine
Scaneinrichtung (5) mit der die Lage des Fokus (F) an oder in der Probe (2) verstellbar ist, vorzugsweise dreidimensional verstellbar ist.
4. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Anregungsanordnung (3, 4, 5, 8) und die optische Detektionsanordnung (12, 14, 7, 5) zumindest teilweise einen gemeinsamen Strahlengang (7, 6, 5, 4) aufweisen.
5. Mikroskop nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektionsanordnung einen ersten Strahlteiler (7), der von der Probe (2) emittierte Strahlung in den Strahlengang der
Anregungsanordnung (3, 4, 5, 8) einkoppelt, und einen zweiten Strahlteiler (4) aufweist, der von der Probe (2) emittierte Strahlung aus dem Strahlengang der Anregungsanordnung (3, 4, 5, 8) auskoppelt.
6. Mikroskop nach den Ansprüchen 3 und5, dadurch gekennzeichnet, daß die Scaneinrichtung (5) zwischen erstem und zweiten Strahlteiler (7, 4) liegt.
7. Mikroskop nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch ein Objektiv (19) mit geteilter Pupille (21 ), das sowohl Teil der Anregungsanordnung als auch der Detektionsanordnung ist.
8. Mikroskop nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch einen dem Objektiv (19) in bezug auf die Probe (2) vorgeordneten Blockfilter (2), der einen Teil der Pupille (21) des Objektives (19) filtert.
9. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlungsquelle (3) linear polarisierte Anregungsstrahlung abgibt.
10. Mikroskop nach den Ansprüchen 5 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß erster und zweiter Strahlteiler (7, 4) als Polteiler ausgeführt sind.
11. Mehr-Photonen-Lumineszenz-Mikroskopieverfahren, bei dem eine Probe (2) mit in einem Fokus (F) gebündelter Anregungsstrahlung beleuchtet und von der Probe (2) emittierte Strahlung aufgenommen und detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungsstrahlung entlang einer Einfallsachse (10) eingestrahlt wird, die unter einem Winkel zu einer Flächennormalen (11) der Probe (2) liegt, und die von der Probe (2) emittierte Strahlung entlang einer Detektionsachse (13) aufgenommen wird, welche bezüglich der Flächenormalen (11) symmetrisch zur Einstrahlungsachse (10) liegt.
12. Verfahren nach Anspruch (11), dadurch gekennzeichnet, daß der Winkel verstellt wird, um ein Intensitätsmaximum der von der Probe (2) emittierten Strahlung zu detektieren.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe (2) durch zwei- oder dreidimensionale Verschiebung der Lage des Fokusses (F) auf oder in der Probe (2) abgescannt wird.
14. Verfahren nach den Ansprüche 13 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe (2) in einem ersten Durchlauf mit einem Winkel gleich oder nahe 45° abgescannt wird und in einem zweiten Durchlauf an zumindest einem Punkt der Probe (2) der Winkel zur Kontrastverbesserung variiert wird.
PCT/EP2004/010345 2003-09-23 2004-09-15 Lumineszenz-mikroskopie Ceased WO2005033769A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2003144063 DE10344063A1 (de) 2003-09-23 2003-09-23 Lumineszenz-Mikroskopie
DE10344063.1 2003-09-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005033769A1 true WO2005033769A1 (de) 2005-04-14

Family

ID=34353022

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2004/010345 Ceased WO2005033769A1 (de) 2003-09-23 2004-09-15 Lumineszenz-mikroskopie

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE10344063A1 (de)
WO (1) WO2005033769A1 (de)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5969854A (en) * 1996-07-23 1999-10-19 Carl Zeiss Jena Gmbh Confocal microscope with double-objective system
DE19851240C1 (de) * 1998-11-06 2000-03-02 Europ Lab Molekularbiolog Fluoreszenzmikroskop mit Mehrphotonenanregung
US6423956B1 (en) * 2000-07-28 2002-07-23 Optical Biopsy Technologies Fiber-coupled, high-speed, integrated, angled-dual-axis confocal scanning microscopes employing vertical cross-section scanning

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5969854A (en) * 1996-07-23 1999-10-19 Carl Zeiss Jena Gmbh Confocal microscope with double-objective system
DE19851240C1 (de) * 1998-11-06 2000-03-02 Europ Lab Molekularbiolog Fluoreszenzmikroskop mit Mehrphotonenanregung
US6423956B1 (en) * 2000-07-28 2002-07-23 Optical Biopsy Technologies Fiber-coupled, high-speed, integrated, angled-dual-axis confocal scanning microscopes employing vertical cross-section scanning

Also Published As

Publication number Publication date
DE10344063A1 (de) 2005-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1664888B1 (de) Rastermikroskop mit evaneszenter beleuchtung
EP1660924B1 (de) Rastermikroskop
DE10137155B4 (de) Optische Anordnung und Scanmikroskop
DE10356826B4 (de) Rastermikroskop
DE102012017920B4 (de) Optikanordnung und Lichtmikroskop
WO1998003892A1 (de) Konfokales mikroskop mit einem doppelobjektiv-system
DE20216583U1 (de) Mikroskop und Durchflusszytometer
WO2002059677A1 (de) Optisches system und verfahren zum anregen und messen von fluoreszenz an oder in mit fluoreszensfarbstoffen behandelten proben
DE10056382A1 (de) Lichtquelle zur Beleuchtung in der Scanmikroskopie und Scanmikroskop
EP2181352A1 (de) Mikroskop mit innenfokussierung
EP1523693B1 (de) Optische vorrichtung zum vereinigen von lichtstrahlen
DE102004017956A1 (de) Mikroskop zur Untersuchung der Lebensdauer angeregter Zustände in einer Probe
DE4331570C2 (de) Verfahren zum optischen Anregen einer Probe
EP1678545B1 (de) Mikroskop mit evaneszenter probenbeleuchtung
DE10120424B4 (de) Scanmikroskop und Auskoppelelement
WO2008037346A1 (de) Laserscanningmikroskop mit element zur pupillenmanipulation
DE102004034988A1 (de) Lichtrastermikroskop und Verwendung
DE102006021996B4 (de) Mikroskop und Verfahren zur Totalinternen Reflexions-Mikroskopie
EP1168031A2 (de) Mikroskop-Aufbau
DE102004029733B4 (de) Rastermikroskop und Verfahren zur Rastermikroskopie
DE10333445B4 (de) Konfokales Rastermikroskop
WO2005033769A1 (de) Lumineszenz-mikroskopie
DE10252005B4 (de) Rauscharmes Mikroskop
DE19950225A1 (de) Anordnung zur optischen Abtastung eines Objekts
EP1049952B1 (de) Anordnung zur optischen abtastung eines objekts

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase