WO2005030238A1 - Peptides possedant notamment une activite anti-angiogenique et leurs applications en therapeutique - Google Patents

Peptides possedant notamment une activite anti-angiogenique et leurs applications en therapeutique Download PDF

Info

Publication number
WO2005030238A1
WO2005030238A1 PCT/FR2004/002422 FR2004002422W WO2005030238A1 WO 2005030238 A1 WO2005030238 A1 WO 2005030238A1 FR 2004002422 W FR2004002422 W FR 2004002422W WO 2005030238 A1 WO2005030238 A1 WO 2005030238A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
motif
ggxrgdmfgx
peptides
crgdmfg
Prior art date
Application number
PCT/FR2004/002422
Other languages
English (en)
Inventor
Etienne Jacotot
Annie Borgne-Sanchez
Sylvie Dupont
Dominique Rebouillat
Original Assignee
Theraptosis
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Theraptosis filed Critical Theraptosis
Priority to EP04787446A priority Critical patent/EP1680136A1/fr
Priority to US10/573,576 priority patent/US20080171697A1/en
Priority to JP2006527447A priority patent/JP2007506713A/ja
Publication of WO2005030238A1 publication Critical patent/WO2005030238A1/fr
Priority to IL174547A priority patent/IL174547A0/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to peptides having in particular an anti-angiogenic activity and to their applications in therapy.
  • the inventors' research into therapeutically active peptides led them to develop constructs which have proved to be of great interest with regard to their anti-angiogenic properties.
  • the invention therefore relates to such peptides and the use of their therapeutic properties to develop drugs. It thus relates to pharmaceutical compositions containing these peptides as active principle. It also relates to the use of these peptides to manufacture drugs with anti-angiogenic effect, for the treatment of pathologies linked to hypervascularization.
  • the peptides according to the invention are characterized in that they are cyclized peptides, corresponding to the sequence SEQ ID No.
  • Xi is either a G or a GG whose amino-terminal end is free, alkylated, acylated, in particular acetylated, or comprises a labeling group such as the biotinyl group
  • X 3 is either a motif M or a nor-Leucine motif
  • X is either a motif or a succession of two di-, tri- or tetra-peptide motifs composed of G or of a combination of G and S, such as GG, GGG, GGGG, GGS, GGGS, GGSGGS, or even
  • X 5 is a C motif whose side chain (thiol function) serves as a covalent bonding point with a 3-nitro-2-pyridinesulfenyl group (Npys; Drijfhout et al ., 1988 Int J Peptide protein Res, 32: 161-166) located on the N-terminal end of the following amino acid (L),
  • X 6 is either an R motif or a K motif - X 7 is either an R motif, either a KX 8 motif is either an R motif, or a K Xg motif is an aliphatic amino acid (such as G, or A) whose C-terminal end is amid
  • peptides contain from 25 to 35 amino acids.
  • a peptide of this type responds to the sequence SEQ ID No. 2: GG * CRGDMFG * CGGLLFIHFRIGSRHSRIG ( ⁇ indicates a disulfide bridge connecting the two motifs C).
  • Other peptides are as defined above and have an alkyl group at their N-terminal end.
  • one or more amino acids are replaced by their dextrorotatory form ( D aa).
  • Other peptides according to the invention correspond to SEQ ID No. 1 above, but have one or more peptide bonds to form bioisosteres.
  • peptides of the invention include a sequence SEQ ID No. 11: XRGDMF-GX 'exposing the RGD motif by a lactam bridge between the amino acids X (X) -CO-NH- (X'), X and X 'being amino acids such that one carries an acid group, and the other carries an amino.
  • Preferred peptides of this group correspond to the sequences SEQ ID No. 12 to SEQ ID No. 23:
  • the peptides of the invention are further characterized in that they induce apoptosis of human endothelial cells expressing the ⁇ V ⁇ 3 receptors.
  • the specificity of the peptides of the invention results from the addition of the mitochondrio-toxic part to ligands of the integrins to exert a toxicity by the way of the mitochondrio-toxicity, the ligands of the integrins being present for purposes of targeting and not themselves having angiostatic activity.
  • the treatment of primary human endothelial cells with doses of peptides of the order of a micromolar leads to a dissipation of the mitochondrial transmembrane potential ( ⁇ m), to the release of mitochondrial cytochrome c, to l 'exposure of phosphatidyl-serine and condensation of nuclear chromatin.
  • compositions according to the invention are characterized in that they contain a therapeutically effective amount of at least one peptide, as defined above, in combination with a phar aceutically acceptable vehicle.
  • These compositions are advantageously in the dosage forms suitable for their administration by injectable route. Mention will in particular be made of injectable solutions intended for administration by the intravenous route.
  • the invention further relates to the use of peptide constructs as defined above for manufacturing anti-angiogenic drugs for the treatment of pathologies due to hypervascularization. Mention will in particular be made of the treatment of solid tumors such as pulmonary tumors, adenomas, melanomas, cancers of the prostate, breast, colon, pancreas, osteosarcomas.
  • the invention also applies to the treatment of diabetic retinopathies and polyarthritis.
  • the dosages of the administration forms and the treatments will be determined by a person skilled in the art depending on the pathology to be treated and the condition of the patient. Other characteristics and advantages of the invention will be given in the examples which follow relating to the construction SEQ ID No. 2 (hereafter TEAM-VP) SEQ ID No.
  • FIGS. 1 to 3 represent, respectively, FIG. 1, the analysis of cytotoxicity on endothelial cells, FIG. 2, the recognition of the CycRGD motif by the integrins ⁇ V ⁇ 3, FIG. 3, the effects of TEAM-VP on isolated itochondria and HUVEC cells.
  • the HUVEC cells were pre-incubated or not for 30 min at room temperature with 25 ⁇ M of CycRGD, CycRAD, GRGDS and GRGES peptide before addition of FITC-CycRGD peptide (0.5 ⁇ M), then analyzed by flow cytometry (Figure 2c).
  • d Correlation between expression of integrins, binding and toxicity of peptides: The cells HUVEC, HMVECd, MCF-7, MDA, HeLa, HT-29, Jurkat, CEM and PBMC were labeled with the antibodies directed against the integrins ⁇ V ⁇ 3 and ⁇ V ⁇ 5 and analyzed by flow cytometry. The binding of the CycRGD peptide and the induction of apoptosis by TEAM-VP on the different cell types were measured (Figure 2d).
  • the FITC-CycRGD and TEAM-VP (FITC) peptides enter the HUVECs and co-locate with the dextran beads (5 hours of co-treatment).
  • the entry of TEAM-VP and dextran beads is inhibited by the treatment of sodium azide + deoxyglucose, indicating entry of the peptide by endocytosis.
  • No entry of the FITC-CycRAD peptide was observed in the HUVECs, nor was there any entry of the FITC-CycRGD peptide in the HeLa. + TEAM-VP intracellular routing:
  • HUVECs treated with TEAM-VP are observed for 8, 24 and 32 hours.
  • TEAM-VP revealed with Streptavidin-Texas Red co-distributes with lysosomes (anti-Lamp2-FITC) at 8 h of treatment and seems to leave these organelles at 24 h.
  • the isolated mitochondria were incubated with the peptide CycRGD or TEAM-VP in the presence or not of bongkrekic acid (BA, 50 ⁇ M), cyclosporin A (CsA, 10 ⁇ M), and DIDS (8 ⁇ M). Induction of the mitochondrial membrane potential drop: The isolated mitochondria were incubated with 1 ⁇ M of TEAM-VP or its controls (C1, C2, C3), labeled with JC-1 and analyzed by flow cytometry (FIG. 3a),
  • HUVEC cells were incubated for 24 hours with 15 ⁇ M of TEAM-VP peptide, CycRGD and C4 then labeled with JC-1 or with an anti-PARP or Annexin-V-FITC and analyzed by flow cytometry (Figure 3d).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

L'invention vise des peptides cyclisés, répondant à la séquence : SEQ ID N°1 : X1X2RGDX3FGX4X5LLFIHFX6IGSX7HSX8IX9, dans laquelle : - les lettres sans indice numérique correspondent aux acides aminés définis par le code international à une lettre. - X1 est G ou GG dont l'extrémité amino-terminale est libre ou non, - X2 est soit un C, auquel cas X2 = X4, les 2 C étant alors réunis par un pont disulfure, ou X2 est capable de former un pont lactame avec X4, l'un de X2 ou X4 étant un acide aminé porteur d'un groupement acide, comme A ou D, l'autre portant une fonction aminée, comme Q, N. - X3 est soit un motif M, soit un motif nor-Leucine. - X5 est un ou plusieurs motifs di- tri- ou tetra-peptidiques composés de G ou d'une combinaison de G et de S, ou encore X5 est un motif C dont la chaîne latérale sert de point de liaison covalente avec un groupe 3-nitro-2-pyridinesulfényle situé sur l'extrémité N-terminale de l'acide aminé suivant (L). - X6 est soit un motif R, soit un motif K. - X7 est soit un motif R, soit un motif K. - X8 est soit un motif R, soit un motif K. - X9 est un acide aminé aliphatique (comme G, ou A) dont l'extrémité C-terminale est amidée. Ces peptides sont utilisables comme principes actifs de médicaments, notamment pour le traitement de pathologies liées à une hyper-vascularisation.

Description

" PEPTIDES POSSÉDANT NOTAMMENT UNE ACTIVITÉ ANTI-ANGIOGÉNIQUE ET LEURS APPLICATIONS EN THÉRAPEUTIQUE "
L'invention se rapporte à des peptides possédant notamment une activité anti-angiogénique et à leurs applications en thérapeutique . Les recherches des inventeurs concernant des peptides thérapeutiquement actifs les ont amené à élaborer des constructions qui se sont révélées de grand intérêt au regard de leurs propriétés anti-angiogéniques . L'invention vise donc de tels peptides et la mise à profit de leurs propriétés thérapeutiques pour élaborer des médicaments. Elle vise ainsi les compositions pharmaceutiques renfermant ces peptides à titre de principe actif. Elle vise également l'utilisation de ces peptides pour fabriquer des médicaments à effet anti-angiogénique, pour le traitement de pathologies liées à une hypervascularisation. Les peptides selon l'invention sont caractérisés en ce qu'il s'agit de peptides cyclisés, répondant à la séquence SEQ ID N°l : XιX2RGDX3FGX4X5LLFIHFX5IGSX7HSX8IX9 dans laquelle : les lettres sans indice numérique correspondent aux acides aminés définis par le code international à une lettre . Xi est soit un G soit un GG dont l'extrémité amino- terminale est libre, alkylée, acylée, notamment acétylée, ou comporte un groupe de marquage comme le groupe biotinyle, X2 est soit un C, auquel cas X2 = X4, les 2 C étant alors réunis par un pont disulfure, ou X2 est capable de former un pont lactame avec X4, l'un de X2 ou X4 étant un acide aminé porteur d'un groupement acide, comme A ou D, l'autre portant une fonction aminée, comme Q, N. X3 est soit un motif M, soit un motif nor-Leucine X est soit un motif, soit une succession de deux motifs di-, tri- ou tetra-peptidiques composée de G ou d'une combinaison de G et de S, comme GG, GGG, GGGG, GGS, GGGS, GGSGGS, ou encore X5 est un motif C dont la chaîne latérale (fonction thiol) sert de point de liaison covalente avec un groupe 3-nitro-2-pyridinesulfényle (Npys; Drijfhout et al., 1988 Int J Peptide protein Res, 32:161-166) situé sur l'extrémité N-terminale de l'acide aminé suivant (L) , X6 est soit un motif R, soit un motif K - X7 est soit un motif R, soit un motif K X8 est soit un motif R, soit un motif K Xg est un acide aminé aliphatique (comme G, ou A) dont l'extrémité C-terminale est amidée. Ces peptides comportent de 25 à 35 acides aminés. Un peptide de ce type répond à la séquence SEQ ID N°2 : GG*CRGDMFG*CGGLLFIHFRIGSRHSRIG (^indique un pont disulfure reliant les deux motifs C) . D'autres peptides sont tels que définis ci-dessus et présentent un groupe alkylé à leur extrémité N-terminale. Dans d'autres peptides encore, un ou plusieurs acides aminés sont remplacés par leur forme dextrogyre (Daa) . D'autres peptides selon l'invention répondent à la SEQ ID N°l ci-dessus, mais comportent une ou plusieurs liaisons peptidiques pour former des bioisostères . On citera par exemple la réduction d'un pont amide en -CH2NH-,ou une réaction de rétro-inverso, tels que définis par Goodman et Ro (1995, dans Burger's Médicinal Chemistry. Fifth ed vol.l pages 803- 861, édité par ME olff) . Comme variants du peptide de séquence SEQ ID N°2 exposant le motif RGD par un pont disulfure entre deux cystéines, on citera les peptides de séquences SEQ ID N°3 à 10: SEQ ID N°3 : GG*CRGDMFG*CGGLLRIHFRIGSRHSRIG
SEQ ID N°4 : GG*CRGDMFG*CGG-LFIHFRIGSRHSRIG
SEQ ID N°5 : GG*CRGDMFG*CGGSLFIHFRIGSRHSRIG
SEQ ID N°6 : GG*CRGDMFG*CGGLLFIHFKIGSRHSRIG
SEQ ID N°7 : GG*CRGDMFG*CGGLLFIHFNRIGSRHSRIG (NR représentant un motif N-alkylarginine)
SEQ ID N°8 : GG*CRGDMFG*CGGLLSRHFRIGSRHSRIG
SEQ ID N°9 : GG*CRGDMFG*CGGLLSIHFRIGSRHSRIG
SEQ ID N°10 : GG*CRGDMFG*CGGLLFRHFRIGSRHSRIG
D'autres peptides de l'invention comportent une séquence SEQ ID N°ll : X-R-G-D-M-F-GX' exposant le motif RGD par un pont lactame entre les acides aminés X (X) -C-O-NH- (X' ) , X et X' étant des acides aminés tels que l'un porte un groupement acide, et l'autre porte une aminé . Des peptides préférés de ce groupe répondent aux séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°23 :
SEQ ID N°12 : GGXRGDMFGX' GGLLFIHFRIGCRHSRIG
SEQ ID N°13 : GGXRGDMFGX' GGLLFIFFRIGCRFSRIG
SEQ ID N°14 : GGXRGDMFGX' GGLLFIHFRIGSRHSRIG
SEQ ID N°15 : GGXRGDMFGX' GGLLRIHFRIGSRHSRIG
SEQ ID N°16 : GGXRGDMFGX' GG-LFIHFRIGSRHSRIG
SEQ ID N°17 : GGXRGDMFGX' GGSLFIHFRIGSRHSRIG
SEQ ID N°18 : GGXRGDMFGX' GGLLFIHFKIGSRHSRIG
SEQ ID N°19 : GGXRGDMFGX' GGLLFIHFRIGSRHSRIG (NR représentant un motif N-alkylarginine)
SEQ ID N°20 : GGXRGDMFGX' GGLLSRHFRIGSRHSRIG
SEQ ID N°21 : GGXRGDMFGX' GGLLSIHFRIGSRHSRIG
SEQ ID N°22 : GGXRGDMFGX' GGLLFRHFRIGSRHSRIG
SEQ ID N°23 : GGXRGDMFGX' GGLLFIHFRIGSRHSRIG Lesdites séquences peuvent être modifiées, c'est-à-dire correspondre au peptide natif mais comporter un ou plusieurs acides différents, modifiés chimiquement, des lors que ces modifications n'affecte pas la fonction recherchée. On citera notamment le remplacement de Met par nor-Leu, Arg par N-alkyl Arg, qui permet en particulier de stabiliser la construction. Ces modifications comprennent également un groupe acyle, notamment acétyle en N-terminal. Les peptides de l'invention sont encore caractérisés en ce qu'ils induisent l'apoptose de cellules endotheliales humaines exprimant les récepteurs αVβ3. Ils sont en outre avantageusement caractérisés en ce qu'ils subissent une endocytose par des cellules endotheliales humaines exprimant les récepteurs αVβ3, se localisent au niveau du compartiment itochondrial et exercent un effet mitochondriotoxique . Lorsqu'on met en contact un peptide tel qu'élaboré ci- dessus, ou tel que défini ci-dessus, avec des cellules endotheliales, on observe une reconnaissance spécifique des intégrines Vβ3 à la surface des cellules endotheliales, ce qui permet l' endocytose du peptide chimère. Une fois internalisé, le peptide se localise transitoirement dans les lysosomes, comme montré en microscopie confocale et se distribue progressivement dans le compartiment mitochondrial. On notera que la spécificité des peptides de l'invention résulte de l'ajout de la partie mitochondrio-toxique à des ligands des intégrines pour exercer une toxicité par la voie de la mitochondrio-toxicité, les ligands des intégrines étant présents à des fins de ciblage et n'ayant pas eux-mêmes d'activité angiostatique. Comme illustré par les exemples donnés ci-après, le traitement de cellules endotheliales primaires humaines avec des doses de peptides de l'ordre du micromolaire conduit à une dissipation du potentiel transmembranaire mitochondrial (Δψm) , à la libération de cytochrome c mitochondrial, à l'exposition de phosphatidyl-sérine et à la condensation de chromatine nucléaire. Ces constructions peptidiques présentent l'avantage d'une absence de toxicité sur les cellules Vβ3 négatives. L'invention vise donc également la mise à profit de ces propriétés pour induire sélectivement PMM et l'apoptose de cellules endotheliales angiogéniques dans le cadre de stratégies thérapeutiques, notamment anti-cancer, traitement de la polyarthrite, de la rétinopathie diabétique. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité thérapeutique ent efficace d'au moins un peptide, tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule phar aceutiquement acceptable. Ces compositions se présentent avantageusement sous les formes galéniques appropriées pour leur administration par voie injectable. On citera en particulier les solutions injectables destinées à une administration par voie intra veineuse. L'invention vise en outre l'utilisation de constructions peptidiques telles que définies ci-dessus pour fabriquer des médicaments anti-angiogéniques pour le traitement de pathologies dues à une hypervascularisation. On citera en particulier le traitement de tumeurs solides telles que les tumeurs pulmonaires, les adénomes, les mélanomes, les cancers de la prostate, du sein, du colon, du pancréas, les ostéosarcomes . L'invention s'applique également au traitement de rétinopathies diabétiques et de polyarthrites . Les posologies des formes d'administration et les traitements seront déterminés par l'homme du métier en fonction de la pathologie à traiter et de l'état du patient. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés dans les exemples qui suivent se rapportant à la construction SEQ ID N°2 ( ci-après TEAM-VP) SEQ ID N°2 : GG*CRGDMFG*C-GG-LLFIHFRIGSRHSRIG-amide avec ou sans biotine, "*" indiquant une cyclisation par formation d'un pont disulfure. Il sera fait référence aux figures 1 à 3, qui représentent, respectivement, la figure 1, l'analyse de la cytotoxicité sur des cellules endotheliales, la figure 2, la reconnaissance du motif CycRGD par les intégrines αVβ3, la figure 3, les effets de TEAM-VP sur des itochondries isolées et des cellules HUVEC.
Exemples : Analyse de la cytotoxicité de TEAM-VP sur cellules endotheliales a. Les cellules HUVEC ont été incubées pendant 24h avec 5-30 μM de peptide CycRGD, LLFIHFRIGSRHSRIG-amide (C4) ou TEAM-VP, puis marquées avec la 7-AAD et analysées par cytométrie en flux (Figure la) . b. Les cellules HUVEC ont été incubées pendant 24, 48, 72 et 96h avec 15 μM de TEAM-VP puis marquées avec la 7-AAD et analysées par cytométrie en flux (Figure lb) .
Reconnaissance du motif CycRGD par les intégrines αVβ3 a. Analyse de la liaison cellulaire : Les cellules HUVEC ont été incubées pendant 45 min à température ambiante avec les peptides suivants : GGCRGDMFGCGG-amide (RGD linéaire) , GG*CRADMFG*CGG-amide (CycRAD) et GG*CRGDMFG*CGG-amide (CycRGD) (0,5 à 2 μM) marqués FITC et analysées par cytométrie en flux (Figure 2a) . b. Chasse du peptide CycRGD par lui-même: Les cellules HUVEC ont été pré-incubées ou non pendant 30 min à température ambiante avec 200 μM de peptide CycRGD non marqué avant ajout de peptide FITC-CycRGD (10 μM) pendant 45 min et analysées par cytométrie en flux (Figure 2b) . c. Compétition pour les sites intégrines.:
Les cellules HUVEC ont été pré-incubées ou non pendant 30 min à température ambiante avec 25 μM de peptide CycRGD, CycRAD, GRGDS et GRGES avant ajout de peptide FITC-CycRGD (0,5 μM) , puis analysées par cytométrie en flux (Figure 2c) . d. Corrélation entre expression des intégrines, liaison et toxicité des peptides : Les cellules HUVEC, HMVECd, MCF-7, MDA, HeLa, HT-29, Jurkat, CEM et PBMC ont été marquées avec les anticorps dirigés contre les intégrines αVβ3 et αVβ5 et analysées par cytométrie en flux. La liaison du peptide CycRGD et l'induction d' apoptose par TEAM-VP sur les différents types cellulaire ont été mesurées (Figure 2d) .
+ Etude du processus d'entrée des peptides :
Les peptides FITC-CycRGD et TEAM-VP (FITC) rentrent dans les HUVEC et co-localisent avec les billes de dextran (5h de co- traitement) . L'entrée de TEAM-VP et des billes de dextran est inhibée par le traitement Azide de sodium + Déoxyglucose, indiquant une entrée du peptide par endocytose. On n'observe pas d'entrée du peptide FITC-CycRAD dans les HUVEC, ni d'entrée du peptide FITC-CycRGD dans les HeLa. + Routage intracellulaire de TEAM-VP :
On observe au confocal des HUVEC traitées avec TEAM-VP pendant 8, 24 et 32h.
TEAM-VP révélé avec la Streptavidine-Texas Red co-distribue avec les lysosomes (anti-Lamp2-FITC) à 8h de traitement et semblerait quitter ces organelles à 24h. TEAM-VP révélé avec la Streptavidine-FITC co-distribue partiellement avec les mitochondries (anti-VDAC) à 24h et totalement à 32h. On n'observe pas de co-distribution avec l'appareil de Golgi (anti-Golgin) tout au long du traitement.
Effets de TEAM-VP sur des mitochondries isolées et des cellules HUVEC a. Effet sur les mitochondries isolées : Induction du gonflement mitochondrial :
Les mitochondries isolées ont été incubées avec le peptide CycRGD ou TEAM-VP en présence ou non d'acide bongkrékique (BA, 50 μM) , de cyclosporine A (CsA, 10 μM) , et de DIDS (8 μM) . Induction de la chute de potentiel membranaire mitochondrial : Les mitochondries isolées ont été incubées avec 1 μM de TEAM- VP ou ses contrôles (C1,C2,C3), marquées au JC-1 et analysées en cytométrie de flux (Figure 3a) ,
SEQ ID N°24 Cl= GG*CRADMFG*CGGLLFlHFRIGSRHSRIGamide SEQ ID N°25 Cl= GG*CRGDMFG*CGGLLFIHFAIGSRHSAIGamide SEQ ID N°26 C3= RKKRRQRRRGGLLFIHFRIGSRHSRIGamide
b. Relargage de cytochrome c :
Les mitochondries isolées ont été incubées avec l'Alaméthicine (5 ug/ml) ou TEAM-VP (10 μM) et le surnageant analysé en Western Blot avec un anti-cytochrome c (Figure 3b) . c. Analyse de l'apoptose nucléaire :
Les cellules HUVEC traitées avec TEAM-VP (15-40 μM) en présence ou non d'inhibiteur de caspases pendant 8, 16, 24 et 48h ont été marquées au Hoechst et observées au microscope inversé. Les pourcentages de cellules présentant des noyaux intacts, de stade I ou de stade II sont reportés (Figure 3c) . d. Induction du la chute de potentiel membranaire mitochondrial et exposition des phosphatidyl serines in cellula :
Les cellules HUVEC ont été incubées pendant 24h avec 15 μM de peptide TEAM-VP, CycRGD et C4 puis marquées au JC-1 ou avec un anti-PARP ou à l' Annexin-V-FITC et analysées par cytométrie en flux (Figure 3d) .
+ Relargage cytochrome C in cellula :
Relargage de cytochrome c observé en microscopie après 24h de traitement avec TEAM-VP (10 μM) et double marquage des cellules fixées avec un anti-cytochrome c et un anti-VDAC.
+ Chute de potentiel membranaire mitochondrial in cellula :
Chute de potentiel observée au microscope après marquage au
JC-1 des cellules HUVEC traitées pendant 16-24h avec 15 μM de peptide TEAM-VP.
Modèles animaux :
Les modèles animaux mis en œuvre pour démontrer l'efficacité des produits correspondent à ceux classiquement utilisés (voir notamment Kisher et al., 2001 Cancer Research 61:7669-7674,
Galaup et al., 2003 Mol Therapy 7:731-740).

Claims

REVENDICATIONS
1 . Peptides possédant notamment une activité anti- angiogénique, caractérisés en ce qu' il s ' agit de peptides cyclisés , répondant à la séquence SEQ ID N° l : XιX2RGDX3FGX4X5LLFIHFX6IGSX7HSX8IXg dans laquelle : les lettres sans indice numérique correspondent aux acides aminés définis par le code international à une lettre. Xi est soit un G soit un GG dont l'extrémité amino- terminale est libre, alkylée, acylée, notamment acétylée, ou comporte un groupe de marquage comme le groupe biotinyle, X2 est soit un C, auquel cas X2 = X4, les 2 C étant alors réunis par un pont disulfure, ou X2 est capable de former un pont lactame avec X4, l'un de X2 ou X4 étant un acide aminé porteur d'un groupement acide, comme A ou D, l'autre portant une fonction aminée, comme Q, N. X3 est soit un motif M, soit un motif nor-Leucine X5 est soit un motif, soit une succession de deux motifs di-, tri- ou tetra-peptidiques composée de G ou d'une combinaison de G et de S, comme GG, GGG, GGGG, GGS, GGGS, GGSGGS, ou encore X5 est un motif C dont la chaîne latérale (fonction thiol) sert de point de liaison covalente avec un groupe 3-nitro-2-pyridinesulfényle situé sur l'extrémité N-terminale de l'acide aminé suivant (L) . X6 est soit un motif R, soit un motif K X7 est soit un motif R, soit un motif K X8 est soit un motif R, soit un motif K Xg est un acide aminé aliphatique (comme G, ou A) dont l'extrémité C-terminale est amidée.
2. Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il répond à la séquence SEQ ID N°2 : GG*CRGDMFG*CGGLLFIHFRIGSRHSRIG (*indique un pont disulfure reliant les deux motifs C) .
3. Peptides selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils sont modifiés par rapport au peptide natif et présentent notamment un groupe alkylé à leur extrémité N- terminale et/ou en ce qu'un ou plusieurs acides aminés sont remplacés par leur forme dextrogyre (Daa) et/ou en ce qu'ils comportent une ou plusieurs liaisons peptidiques pour former des bioisosteres, par exemple la réduction d'un pont amide en -CH2NH-, ou une réaction de rétro-inverso.
4. Peptides selon la revendication 2, dans lesquels le motif RGD est exposé par un pont disulfure entre deux cystéines, en particulier les peptides de séquences SEQ ID N°3 à 10:
SEQ ID N°3 : GG*CRGDMFG*CGGLLRIHFRIGSRHSRIG
SEQ ID N°4 GG*CRGDMFG*CGG-LFIHFRIGSRHSRIG SEQ ID N°5 GG*CRGDMFG*CGGSLFIHFRIGSRHSRIG SEQ ID N°6 GG*CRGDMFG*CGGLLFIHFKIGSRHSRIG SEQ ID N°7
Figure imgf000013_0001
TR représentant un motif N-alkylarginine)
SEQ ID N°8 : GG*CRGDMFG*CGGLLSRHFRIGSRHSRIG SEQ ID N°9 : GG*CRGDMFG*CGGLLSIHFRIGSRHSRIG SEQ ID N°10 : GG*CRGDMFG*CGGLLFRHFRIGSRHSRIG 5. Peptides selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils comportent une séquence
SEQ ID N°ll : X-R-G-D-M-F-G-X' exposant le motif RGD par un pont lactame entre les acides aminés X (X) -C-O-NH- (X' ) , X et X' étant des acides aminés tels que l'un porte un groupement acide, et l'autre porte une aminé. 6. Peptides selon la revendication 5, caractérisés en ce qu'ils répondent aux séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°23 : SEQ ID N°12 GGXRGDMFGX ' GGLLFIHFRIGCRHSRIG SEQ ID N°13 GGXRGDMFGX ' GGLLFIFFRIGCRFSRIG SEQ ID N°14 GGXRGDMFGX ' GGLLFIHFRIGSRHSRIG SEQ ID N°15 GGXRGDMFGX ' GGLLRIHFRIGSRHSRIG SEQ ID N°16 GGXRGDMFGX ' GG-LFIHFRIGSRHSRIG SEQ ID N°17 GGXRGDMFGX ' GGSLFIHFRIGSRHSRIG SEQ ID N°18 GGXRGDMFGX ' GGLLFIHFKIGSRHSRIG SEQ ID N°19 GGXRGDMFGX ' GGLLFIHFNRIGSRHSRIG (NR représentant un motif N-alkylarginine)
SEQ ID N°20 GGXRGDMFGX ' GGLLSRHFRIGSRHSRIG SEQ ID N°21 GGXRGDMFGX ' GGLLSIHFRIGSRHSRIG SEQ ID N°22 GGXRGDMFGX ' GGLLFRHFRIGSRHSRIG SEQ ID N°23 GGXRGDMFGX ' GGLLFIHFRIGSRHSRIG 7. Peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à
6, caractérisés qu'ils induisent l'apoptose de cellules endotheliales humaines exprimant les récepteurs αVβ3. 8. Peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à
7, caractérisés en ce qu'ils subissent une endocytose par des cellules endotheliales humaines exprimant les récepteurs αVβ3, se localisent au niveau du compartiment mitochondrial et exercent un effet mitochondriotoxique. 9. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité therapeutiquement efficace d'au moins un peptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 8, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 10. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 9, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous les formes galeniques appropriées pour leur administration par voie injectable, en particulier sous forme de solutions injectables destinées à une administration par voie intra veineuse. 11. Utilisation de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour fabriquer des médicaments anti- angiogéniques pour le traitement de pathologies dues à une hypervascularisation. 12. Utilisation selon la revendication 11, pour la fabrication de médicaments pour le traitement de tumeurs solides telles que les tumeurs pulmonaires, les adénomes, les mélanomes, les cancers de la prostate, du sein, du colon, du pancréas, les ostéosarcomes, le traitement de rétinopathies diabétiques et de polyarthrites.
PCT/FR2004/002422 2003-09-25 2004-09-24 Peptides possedant notamment une activite anti-angiogenique et leurs applications en therapeutique WO2005030238A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP04787446A EP1680136A1 (fr) 2003-09-25 2004-09-24 Peptides possedant notamment une activite anti-angiogenique et leurs applications en therapeutique
US10/573,576 US20080171697A1 (en) 2003-09-25 2004-09-24 Peptides Having For Example Antiangiogenic Activity and Applications Thereof In Therapeutics
JP2006527447A JP2007506713A (ja) 2003-09-25 2004-09-24 例えば、抗血管新生活性を有するペプチドおよび治療におけるその適用
IL174547A IL174547A0 (en) 2003-09-25 2006-03-23 Peptides having, for example, an antiangiogenic activity and applications thereof in therapeutics

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0311270A FR2860236B1 (fr) 2003-09-25 2003-09-25 Peptides possedant notamment une activite anti-angiogenique et leurs applications en therapeutique
FR0311270 2003-09-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005030238A1 true WO2005030238A1 (fr) 2005-04-07

Family

ID=34307172

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2004/002422 WO2005030238A1 (fr) 2003-09-25 2004-09-24 Peptides possedant notamment une activite anti-angiogenique et leurs applications en therapeutique

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20080171697A1 (fr)
EP (1) EP1680136A1 (fr)
JP (1) JP2007506713A (fr)
FR (1) FR2860236B1 (fr)
IL (1) IL174547A0 (fr)
WO (1) WO2005030238A1 (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008004130A2 (fr) * 2006-06-30 2008-01-10 Theraptosis S.A. Peptides de ciblage de complexe de port de transition de perméabilité mitochondrial pour induction d'apoptose thérapeutique et applications biologiques

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080228056A1 (en) 2007-03-13 2008-09-18 Michael Blomquist Basal rate testing using frequent blood glucose input
US7751907B2 (en) 2007-05-24 2010-07-06 Smiths Medical Asd, Inc. Expert system for insulin pump therapy
US8221345B2 (en) 2007-05-30 2012-07-17 Smiths Medical Asd, Inc. Insulin pump based expert system
US20090177147A1 (en) 2008-01-07 2009-07-09 Michael Blomquist Insulin pump with insulin therapy coaching
EP2289555A1 (fr) * 2009-08-24 2011-03-02 OrgaNext Research B.V. Procédé de traitement des faiblesses
US8882701B2 (en) 2009-12-04 2014-11-11 Smiths Medical Asd, Inc. Advanced step therapy delivery for an ambulatory infusion pump and system
US9238100B2 (en) 2012-06-07 2016-01-19 Tandem Diabetes Care, Inc. Device and method for training users of ambulatory medical devices
US10357606B2 (en) 2013-03-13 2019-07-23 Tandem Diabetes Care, Inc. System and method for integration of insulin pumps and continuous glucose monitoring
US10201656B2 (en) 2013-03-13 2019-02-12 Tandem Diabetes Care, Inc. Simplified insulin pump for type II diabetics
US10016561B2 (en) 2013-03-15 2018-07-10 Tandem Diabetes Care, Inc. Clinical variable determination
RU2625752C2 (ru) * 2013-11-19 2017-07-18 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Вещество, обладающее антиангиогенной активностью
US9669160B2 (en) 2014-07-30 2017-06-06 Tandem Diabetes Care, Inc. Temporary suspension for closed-loop medicament therapy
US10569016B2 (en) 2015-12-29 2020-02-25 Tandem Diabetes Care, Inc. System and method for switching between closed loop and open loop control of an ambulatory infusion pump
CN109620949A (zh) * 2016-03-13 2019-04-16 曹帅 一种用于治疗骨癌的药物组合物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000049038A2 (fr) * 1999-02-19 2000-08-24 Ulrich Schubert Peptides de synthese de la proteine virale regulatrice (vpr) du virus de l'immunodeficience humaine de type 1 (vih1) et leur utilisation
WO2001092542A2 (fr) * 2000-05-30 2001-12-06 Ich Productions Limited Vecteurs ciblant l'integrine avec activite de transfection accrue
WO2004031768A2 (fr) * 2002-10-02 2004-04-15 Theraptosis S.A. Techniques de recherche de modulateurs du fonctionnement mitochondrial et nouveaux modulateurs obtenus

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030077826A1 (en) * 2001-02-02 2003-04-24 Lena Edelman Chimeric molecules containing a module able to target specific cells and a module regulating the apoptogenic function of the permeability transition pore complex (PTPC)

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000049038A2 (fr) * 1999-02-19 2000-08-24 Ulrich Schubert Peptides de synthese de la proteine virale regulatrice (vpr) du virus de l'immunodeficience humaine de type 1 (vih1) et leur utilisation
WO2001092542A2 (fr) * 2000-05-30 2001-12-06 Ich Productions Limited Vecteurs ciblant l'integrine avec activite de transfection accrue
WO2004031768A2 (fr) * 2002-10-02 2004-04-15 Theraptosis S.A. Techniques de recherche de modulateurs du fonctionnement mitochondrial et nouveaux modulateurs obtenus

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COSTANTINI P ET AL: "Mitochondrion as a novel target of anticancer chemotherapy.", JOURNAL OF THE NATIONAL CANCER INSTITUTE. 5 JUL 2000, vol. 92, no. 13, 5 July 2000 (2000-07-05), pages 1042 - 1053, XP009008236, ISSN: 0027-8874 *
HAUBNER R ET AL: "STEREOISOMERIC PEPTIDE LIBRARIES AND PEPTIDOMIMETICS FOR DESIGNING SELECTIVE INHIBITORS OF THE ALPHAVBETA3 INTEGRIN FOR A NEW CANCER THERAPY", ANGEWANDTE CHEMIE. INTERNATIONAL EDITION, VERLAG CHEMIE. WEINHEIM, DE, vol. 36, 1997, pages 1375 - 1389, XP001008836, ISSN: 0570-0833 *
KAWAGUCHI MICHIYA ET AL: "A novel synthetic Arg-Gly-Asp-containing peptide cyclo(-RGDfdbdV-) is the potent inhibitor of angiogenesis", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 288, no. 3, 2 November 2001 (2001-11-02), &, pages 711 - 717, XP002274582, ISSN: 0006-291X *
KUMAR C CHANDRA: "Integrin alphavbeta3 as a therapeutic target for blocking tumor-induced angiogenesis.", CURRENT DRUG TARGETS, vol. 4, no. 2, February 2003 (2003-02-01), &, pages 123 - 131, XP009027835, ISSN: 1389-4501 *
RUEGG C ET AL: "Vascular integrins: Pleiotropic adhesion and signaling molecules in vascular homeostasis and angiogenesis.", CMLS CELLULAR AND MOLECULAR LIFE SCIENCES, vol. 60, no. 6, June 2003 (2003-06-01), &, pages 1135 - 1157, XP001180259, ISSN: 1420-682X *
SCHRAA ASTRID J ET AL: "Endothelial cells internalize and degrade RGD-modified proteins developed for tumor vasculature targeting.", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE : OFFICIAL JOURNAL OF THE CONTROLLED RELEASE SOCIETY. 4 OCT 2002, vol. 83, no. 2, 4 October 2002 (2002-10-04), pages 241 - 251, XP004383634, ISSN: 0168-3659 *
WESTLIN W F: "Integrins as targets of angiogenesis inhibition.", CANCER JOURNAL (SUDBURY, MASS.) 2001 NOV-DEC, vol. 7 Suppl 3, November 2001 (2001-11-01), pages S139 - S143, XP009027919, ISSN: 1528-9117 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008004130A2 (fr) * 2006-06-30 2008-01-10 Theraptosis S.A. Peptides de ciblage de complexe de port de transition de perméabilité mitochondrial pour induction d'apoptose thérapeutique et applications biologiques
WO2008004130A3 (fr) * 2006-06-30 2008-07-31 Theraptosis S A Peptides de ciblage de complexe de port de transition de perméabilité mitochondrial pour induction d'apoptose thérapeutique et applications biologiques

Also Published As

Publication number Publication date
US20080171697A1 (en) 2008-07-17
FR2860236B1 (fr) 2006-01-06
FR2860236A1 (fr) 2005-04-01
EP1680136A1 (fr) 2006-07-19
JP2007506713A (ja) 2007-03-22
IL174547A0 (en) 2006-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2005030238A1 (fr) Peptides possedant notamment une activite anti-angiogenique et leurs applications en therapeutique
Greenwood et al. The cyclic cystine knot miniprotein MCoTI-II is internalized into cells by macropinocytosis
US9169290B2 (en) Peptides and their use
JP7095037B2 (ja) アポｅ模倣ペプチド及び血漿コレステロールを取り除くためのより高い効果
CY1107051T1 (el) Αντι-διηθητικα και αντι-αγγειογενετικα θραυσματα ουροκινασης και η χρηση τους
ES2327986T3 (es) Liberacion intranuclear de compuestos dirigida por la proteina de choque termico de 70 kd.
EP3166959A1 (fr) Peptides de ciblage qui lient s. mutans, constructions comprenant lesdits peptides et utilisations correspondantes
JP2008501310A6 (ja) 胃腸障害の治療のための方法および組成物
JP2008501310A (ja) 胃腸障害の治療のための方法および組成物
JP2017526640A5 (fr)
Tati et al. Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis
US7306944B2 (en) Advanced cell-transducing transport domain-target protein-transport domain fusion protein and uses thereof
Borgne-Sanchez et al. Targeted Vpr-derived peptides reach mitochondria to induce apoptosis of αvβ3-expressing endothelial cells
AU2004247286A1 (en) Peptides enhancing CEH activity or inhibiting ACAT activity, pharmaceutical compositions comprising these peptides and their use in the treatment of atherosclerosis
FR2622587A1 (fr) Peptide lysyl-arginyl-aspartyl-serine et ses applications en tant que medicament, notamment antithrombotique
Montagnani Marelli et al. Oxime bond-linked daunorubicin-GnRH-III bioconjugates exert antitumor activity in castration-resistant prostate cancer cells via the type I GnRH receptor
JP6924151B2 (ja) 免疫寛容及び非免疫寛容エラスチン様組換えペプチドならびに使用方法
US20230174582A1 (en) Vipr2 antagonist peptide
WO2020230780A1 (fr) PEPTIDE INHIBITEUR DE Ras
WO2003026700A2 (fr) Compositions pour la vectorisation d'anticorps a travers la barriere hematoencephalique et leur utilisation pour le diagnostic ou le traitement des maladies du systeme nerveux central
Soleimani Expression, regulation and the role of SLC26 Cl−/HCO3− exchangers in kidney and gastrointestinal tract
WO2016063969A1 (fr) Peptide de liaison à l'hémagglutinine
JP2013071904A (ja) 抗インフルエンザウイルス活性を有するペプチド
Azmi et al. Self-assembling lipopeptides with a potent activity against Gram-positive bacteria, including multidrug resistant strains
JP2016515137A (ja) アポリポタンパク質模倣体及びその使用

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 174547

Country of ref document: IL

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006527447

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004787446

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004787446

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10573576

Country of ref document: US