WO2005025769A1 - Procede d’amelioration de la phyto-remediation des sites pollues par l’apport aux plantes de glucides exogenes. - Google Patents

Procede d’amelioration de la phyto-remediation des sites pollues par l’apport aux plantes de glucides exogenes. Download PDF

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WO2005025769A1
WO2005025769A1 PCT/FR2004/002294 FR2004002294W WO2005025769A1 WO 2005025769 A1 WO2005025769 A1 WO 2005025769A1 FR 2004002294 W FR2004002294 W FR 2004002294W WO 2005025769 A1 WO2005025769 A1 WO 2005025769A1
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WO
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plant
carbohydrate
pollutant
atrazine
water
Prior art date
Application number
PCT/FR2004/002294
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English (en)
Inventor
Cécile SULMON
Gwenola Gouesbet
Ivan Couee
Abdelhak El Amrani
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Universite De Rennes 1
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Publication date
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
    • B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
    • B09C1/105—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes using fungi or plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H3/00—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria
    • A01H3/04—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria by treatment with chemicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
    • A01N43/14—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings
    • A01N43/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings with oxygen as the ring hetero atom

Definitions

  • the invention relates to the field of biological control against pollution of natural or artificial sites. More specifically, the invention relates to a phyto-remediation process intended to greatly reduce the concentration, or ideally to eliminate any presence, on a site, of polluting substances generated by human, agricultural or industrial activities.
  • the invention can also be applied to the elimination of hydrocarbons and certain heavy metals, including radionuclides, from polluted sites, it will more mainly find its application for the elimination or reduction of herbicides and pesticides.
  • the present invention will prove to be particularly useful for depolluting sites soiled by triazines, in particular atrazine, or by different classes of herbicides inhibiting photosynthesis.
  • Triazines are herbicides that have been used extensively in agriculture since the 1960s. In particular, they have been used extensively by conventional corn producers. Conventionally, in agricultural plots, atrazine pollution of approximately 5 mg L is observed in interstitial waters. Atrazine (2-chloro-4-ethylamino-6-isopropylamme-3,5,5-triazine) is a molecule which inhibits photosynthesis (more precisely photosystem II), i.e. the transformation of l light energy into electrochemical energy, causing the formation of oxygen and chlorophyll radicals which induce oxidative stress and the peroxidation of membrane lipids. The plant's photosynthesis is thus blocked and consequently its growth. Atrazine persists in water and is mobile in soil.
  • Atrazine is also strongly suspected of having harmful effects in humans, in which it is said to cause stomach cancer in particular. Many countries have therefore decided to limit or ban the use of this compound. Thus, in France, the use of atrazine in the agricultural environment has been prohibited since June 30, 2003. Atrazine remains the most widely used pesticide in the United States and in many developing countries. As regards more specifically the triazines, it is known that certain plants have become naturally resistant to these compounds. This resistance most often results from a natural genetic mutation of the psbA gene which codes for the Dl protein (to which atrazine binds to disturb and then block the photosynthesis of the plant). This mutation leads to a modification of the binding site of the Dl protein with atrazine, hence the appearance of resistance.
  • 96/32016 consists in using plants of the Brassicaceae family in the presence of bacteria of the genus Pseudomonas and Bacillus to fix certain heavy metals contained in polluted soils. These microorganisms are brought to the roots of the plant, to the plants themselves, to their seeds or even to the soil in which the plants grow.
  • the use of such bacteria is relatively complex to implement, and this, particularly due to the competition with the other bacteria present in the plant culture site. In any event, such methods find in particular their limits for the fixing of substances harmful to plants, such as herbicidal substances.
  • the objective of the present invention is to propose a new phyto-remediation process which does not have the drawbacks of the state of the art.
  • an objective of the present invention is to propose such a method which makes it possible to accumulate in plants different types of organic and metallic pollutants with increased efficiency.
  • Another objective of the present invention is to describe such a process which is economical to implement.
  • the method of the invention proposes in an original way to cultivate the phyto-remedial plant directly in the site to be depolluted in the presence, during all or part of the culture cycle, of at least one exogenous carbohydrate soluble in water. which can and assimilated by this plant.
  • the inventors have in fact observed that, surprisingly, the presence of such a sugar makes it possible to make phyto-remedial plants resistant to concentrations of pollutants hundreds of times higher than in the absence of sugar. It will be noted that, in the context of the present invention, it is possible to use such a sugar which can be assimilated by the plant alone or as a mixture with other sugars. This sugar or this mixture of sugars may also be included in a substance containing them as will be described below. There are many carbohydrates soluble in water that can be assimilated by plants. Depending on the phyto-remedial plant selected due to the nature of the pollution of the site to be treated, the nature of this exogenous carbohydrate may vary.
  • the method according to the invention could be implemented to treat different types of pollutants (hydrocarbons, certain heavy metals, herbicides, pesticides ).
  • the method according to the invention is particularly suitable for the treatment of pollutants of organic or metallic nature which induce oxidative stress which, indirectly, inhibits photosynthesis and in particular herbicides photosynthesis inhibitors.
  • this pollutant will be a herbicide belonging to the triazine family, or more generally a herbicide that inhibits photosynthesis.
  • the process will thus preferably be used to depollute sites polluted by atrazine.
  • the carbohydrate used may be in the form of a substance containing it.
  • it may be an industrial residue such as, for example, molasses from the sugar industry.
  • Various means can be envisaged for supplying such an exogenous carbohydrate to the phyto-remedial plant.
  • it may be envisaged to coat the seeds of this plant with this carbohydrate. Such a coating may be done immediately before cultivation properly, for example, by a seed producer.
  • Such coated seeds have the advantage of being able to be used with great flexibility without having to intervene on the culture medium subsequently.
  • it may also be envisaged to bring the carbohydrate or the substance containing it on the site or to integrate it into the soil.
  • the exogenous carbohydrate or the substance containing it may be provided in solid form or in liquid form in solution.
  • the quantity and concentration of such a sugar supplied to the phyto-remedial plant will depend on many factors, in particular the nature of the pollutant (s) present on the site, the concentration of these pollutants, the nature of the phyto-remediating plant, the density of phyto-remedial plants, the tolerance of this plant towards this sugar, the luminosity and the micro-climatic conditions, the richness in nitrogen of the treated site, the physicochemical nature of the site, and the soil structure.
  • the phyto-remediation plants can also water the phyto-remediation plants with a solution of 2 to 60 grams per liter of sucrose equivalent in the case of soil, and if it is a flooded site, we can adjust the site water at a final concentration of 2 to 60 grams per liter of sucrose equivalent.
  • the exogenous carbohydrate can be brought to the site before starting the culture but also after the culture has started, for example, when the seedlings have risen or both at the beginning and during the culture in one or more times .
  • the carbohydrate can be brought to an indigenous plant cover pre-existing on the site. Depending on the nature of the pollution and especially its concentration, the phyto-remedial plant used may vary.
  • a plant with deep root development such as a tree and especially poplars.
  • aquatic plants such as for example reeds.
  • fast-growing plants and in particular annual or biennial plants.
  • Several growth cycles and mowing of plants may be considered.
  • Arabidopsis thaliana serves as a model in genetics and molecular biology of plants. It is a small crucifer close to wild mustard which is very common in temperate regions and which has the advantage of being a non-agricultural plant and not selected by humans. It is therefore used as a wild and diverse plant model studies which have been carried out have made it possible to demonstrate that it was endowed with protective mechanisms against triazines and in particular against atrazine, which are dependent on the presence of sucrose.
  • FIG. 1 represents the incidence increasing levels of atrazine in a culture medium along the length of the primary roots of Arabidopsis thaliana
  • - Figure 2 shows the incidence of increasing levels of atrazine in a culture medium on the concentration of photosynthetic pigments (chlorophylls and carotenoids) in Arabidopsis thaliana
  • - Figure 3 shows the incidence of increasing levels of atrazine in a culture medium over the length of the primary roots of Arabidopsis thaliana in the presence of sucrose or glucose
  • - Figure 4 shows the incidence of increasing levels of atrazine in a culture medium on the concentration of photosynthetic pigments (chlorophylls and carotenoids) in Arabidopsis thaliana in the presence of sucrose or glucose
  • FIG. 1 represents the incidence increasing levels of atrazine in a culture medium along the length of the primary roots of Arabidopsis thaliana
  • - Figure 3 shows the incidence of increasing levels of atrazine in a culture medium over the length of the primary
  • the inventors have carried out a certain number of experiments making it possible to prove that the addition of exogenous carbohydrates soluble in exogenous water to the culture medium of the plant Arabidopsis thaliana made it possible to confer an increased tolerance to the atrazine even at high concentrations.
  • sucrose and glucose were tested.
  • Seeds of Arabidopsis thaliana (Wassilewskija ecotype) were surface sterilized according to the usual protocol and were then rinsed with absolute ethanol and dried overnight. These seeds were cultivated in petri dishes on a Murashige and Skoog culture medium (adjusted to a pH of 5.7) agar (0.8%).
  • the petri dishes were stored for 48 h at 4 ° C and then transferred to 22 ° C under a photoperiod of 16 hours per day at 4500 lux. Sucrose and glucose were added to the culture medium while no sugar was added for the controls. A growth parameter (length of the primary roots) and the pigment contents (chlorophylls and carotenoids) were measured after 15 days of culture. The levels of atrazine in plants were also measured after one month of culture. The photosynthetic pigments (chlorophylls and carotenoids) were extracted by grinding the aerial parts of the plants in 80% acetone and by measuring the absorbance of the corresponding extracts at 663 nm, 646 nm, 470 nm.
  • Figure 1 shows the results obtained on the lengths of the primary roots in mm as a function of the concentrations of atrazine tested, in the absence of sugars in the culture medium. These results show that the effect of atrazine on the length of Arabidopsis thaliana roots becomes significant at a concentration of the order of 100 nM to 250 nM. At 500 nM the inhibition of root development is complete and induces discoloration and death of the plants.
  • FIG. 2 gives the results obtained on the chlorophyll and carotenoid contents, in the absence of sugars in the culture medium. These results show that the chlorophyll levels begin to decrease for a concentration of atrazine between 50 and 100 nM, the chlorophylls and the carotenoids completely disappearing at a concentration of 500 nM.
  • FIG. 3 gives the results obtained over the length of the primary roots as a function of the atrazine content of the medium in the presence of 80 mM of sucrose or of 80 mM of glucose.
  • FIG. 7 shows the results obtained by Dot Blot, which detects all the Dl proteins. According to this figure, it can be seen that 1 ⁇ M of atrazine causes the disappearance of the Dl protein in plants which have not been cultivated in the presence of sucrose.
  • Figure 8 shows the results obtained by Western Blot. These results reveal that high concentrations of sucrose induce a decrease in the production of protein Dl in the absence of atrazine and that, on the contrary, the presence of sucrose in the culture medium and in the presence of 0.25 ⁇ M of atrazine causes a greater accumulation of Dl protein and its by-products. The same effect was observed with 1 ⁇ M of atrazine in the presence of 10 mM of sucrose.
  • the use of 80 mM of sucrose and 1 ⁇ M of atrazine causes a reduction in protein Dl and by-products.
  • the use of 80 mM of sucrose makes it possible to maintain a sufficient quantity of monomer of the protein D1, which disappears at the same concentrations of atrazine in the absence of sucrose.
  • the production of superoxide ion from the plants was tested according to the method of Fryer et al. (2002 Imaging of photo-oxidative stress responses in leaves -J. Exp. Bot. 53: 1249-1254)). As shown in Figure 6, the presence of sucrose does not prevent the production of active oxygen molecular species such as the superoxide ion which seems to increase in the presence of atrazine.
  • sucrose does not block the action of atrazine and the production of superoxide ions, but protects cells and tissues from the destructive effects of oxidative stress.
  • the atrazine contents were moreover measured in the plants and the culture medium by the conventional methods of extraction by solvents and of analysis by high performance liquid chromatography with UV detection.
  • the atrazine was extracted into a mixture of methanol and water (4: 1, v / v). After centrifugation, the supernatants were filtered through 0.45 ⁇ m filters and the organic solvents were evaporated at 40 ° C. SPE cartridges were activated by washing with 5 ml of methanol and then 5 ml of water. Each sample was applied to a column and the columns were then washed.
  • the atrazine was eluted with 2 mL of dichloromethane. The organic solvents were then evaporated and the dry residues dissolved in 500 ⁇ L of a mixture of methanol and water (1: 1). The samples were then analyzed by HPLC with UV detection. As can be seen in FIG. 9, the plants cultivated in the presence of sucrose and in the presence of atrazine at 0.5 picomoles per milligram of medium have an atrazine content of 3.7 ( ⁇ 0.3) nanomoles of atrazine per gram of fresh weight. Atrazine is therefore found at a higher concentration in the plant tissue than in the culture medium. In addition, plants treated with sucrose accumulate atrazine to a level that causes plant death in the absence of sucrose.
  • Atrazine 95 micrograms of atrazine from the surrounding agar medium.
  • Arabidospis thaliana was also cultivated on a soil contaminated at a concentration of 10 ⁇ M of atrazine in the absence of sucrose and in the presence of sucrose brought to the surface in the form of a 3% solution.
  • the cultures obtained are represented in FIG. 11 in which the pot of soil on the left corresponds to the culture in the presence of sucrose and the pot of soil on the right corresponds to the culture in the absence of sucrose.
  • the seedlings, shown in clear in this figure, are more numerous and larger when, according to the invention, sucrose has been added to the culture medium.
  • the positive effects of sucrose on growth stimulation and the ability to overaccumulate atrazine in tissues means that 12.5 g of fresh plant weight & Arabidospis can accumulate 100 micrograms of atrazine of the surrounding soil medium.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de phyto-remédiation d'un site pollué par au moins un type de polluant, ledit procédé comprenant au moins une étape consistant à cultiver sur ledit sol pollué au moins une plante phyto-remédiatrice apte à fixer au moins une partie dudit polluant et une étape ultérieure consistant à récolter ou a détruire ladite plante ayant fixé au moins une partie dudit polluant caractérisé en ce que ladite étape consistant à cultiver ladite plante est effectuée au moins en partie en présence d'au moins un glucide exogène soluble dans l'eau assimilable par ladite plante ou d'une substance contenant un tel glucide.

Description

Procédé d'amélioration de la phyto-remédiation des sites pollués par l'apport aux plantes de glucides exogènes. L'invention concerne le domaine de la lutte biologique contre la pollution des sites naturels ou artificiels. Plus précisément, l'invention concerne un procédé de phyto-remédiation ayant pour vocation de diminuer fortement la concentration, ou idéalement de supprimer toute présence, dans un site, de substances polluantes générées par des activités humaines, agricoles ou industrielles. Bien que l'invention pourra aussi être appliquée à l'élimination des hydrocarbures et de certains métaux lourds, y compris des radionucléides, des sites pollués, elle trouvera plus principalement son application pour l'élimination ou l'abattement des herbicides et des pesticides. Notamment, la présente invention se révélera particulièrement utile pour dépolluer les sites souillés par des triazines, notamment l' atrazine, ou par différentes classes d'herbicides inhibiteurs de la photosynthèse. Les triazines sont des herbicides qui ont été abondamment utilisés en agriculture depuis les années 60. Elles ont notamment été employées de façon massive par les producteurs de maïs conventionnels. On observe classiquement dans les parcelles agricoles une pollution à l' atrazine d'environ 5 mg L dans les eaux interstitielles. L'atrazine (2-chloro-4-éthylamino-6-isopropylamme-l,3,5-triazine) est une molécule qui inhibe la photosynthèse (plus précisément le photosystème II), c'est-à-dire la transformation de l'énergie lumineuse en énergie électrochimique, provoquant la formation de radicaux oxygènes et chlorophylles qui induisent un stress oxydatif et la peroxydation des lipides membranaires. La photosynthèse de la plante se trouve ainsi bloquée et conséquemment sa croissance. L'atrazine persiste dans l'eau et est mobile dans le sol. Ce composé passe ensuite dans les eaux de surface par la dissolution de ses particules polluantes dans les eaux de pluie. Il n'est donc pas rare d'en trouver aussi dans les prélèvements d'eau potable de certaines régions françaises, telles que la Bretagne, le sud-ouest ou l'Ile-de-France, à des taux dix fois plus élevés que le seuil anciennement autorisé en France (0,1 mg/L). Des décennies d'utilisation des triazines sur les sols agricoles ont donc laissé des sols pollués dont il est souhaitable maintenant d'entreprendre la réhabilitation. De plus, les sites de production, de stockage, ou d'épandage accidentel, à fort niveau de pollution, se sont multipliés. En effet, de nombreuses études ont montré que l'impact de l'atrazine sur l'environnement et notamment sur la faune était très inquiétant. Ainsi, des anomalies alarmantes ont été relevées chez certains amphibiens aux Etats-Unis. L'atrazine est également fortement suspectée d'avoir des effets nocifs chez l'homme chez qui elle serait à l'origine notamment de cancers de l'estomac. De nombreux pays ont donc décidé de limiter ou d'interdire l'utilisation de ce composé. Ainsi, en France, l'utilisation d'atrazine dans le milieu agricole est interdite depuis le 30 juin 2003. L'atrazine reste cependant le pesticide le plus utilisé aux Etats-Unis et dans beaucoup de pays en voie de développement. En ce qui concerne plus précisément les triazines, on sait que certaines plantes sont devenues naturellement résistantes à ces composés. Cette résistance résulte le plus souvent d'une mutation génétique naturelle du gène psbA qui code la protéine Dl (à laquelle l'atrazine se lie pour perturber puis bloquer la photosynthèse de la plante). Cette mutation conduit à une modification du site de liaison de la protéine Dl avec l'atrazine d'où l'apparition de résistances. La résistance à l'atrazine peut aussi résulter d'une adaptation biochimique de la plante. Ainsi le sorgho en augmentant les activités Glutathion-S- transférases peut «s' immuniser » contre l'atrazine. Il a été proposé dans l'état de la technique des plantes transgéniques chez lesquelles un gène d'origine bactérienne a été introduit, gène qui permet d'intégrer dans ces plantes un système de dégradation de l'atrazine. Toutefois, de telles plantes constituent des organismes génétiquement modifiés qui n'ont actuellement pas la faveur de l'opinion publique. On connaît par ailleurs dans l'état de la technique des procédés de phyto- remédiation des sites pollués. De tels procédés consistent à cultiver sur les sites pollués des plantes phyto-remédiatrices qui fixent dans leurs tissus, au cours de leur croissance, tout ou partie de la pollution contenue dans ces sites. Ainsi, la technique décrite dans la demande de brevet internationale WO
96/32016 consiste à utiliser des plants de la famille Brassicaceae en présence de bactéries du genre Pseudomonas et Bacillus pour fixer certains métaux lourds contenus dans des sols pollués. Ces micro-organismes sont apportés sur les racines de la plante, sur les plants eux-mêmes, sur leurs graines ou bien encore dans le sol dans lequel les plantes poussent. L'utilisation de telles bactéries est relativement complexe à mettre en œuvre, et ce, particulièrement du fait de la compétition avec les autres bactéries présentes dans le site de culture des plantes. En tout état de cause, de tels procédés trouvent notamment leurs limites pour la fixation des substances nocives vis-à-vis des plantes, telles que les substances herbicides . L'objectif de la présente invention est de proposer un nouveau procédé de phyto-remédiation ne présentant pas les inconvénients de l'état de l'art. Notamment, un objectif de la présente invention est de proposer un tel procédé qui permette d'accumuler dans les plantes différents types de polluants organiques et métalliques avec une efficacité accrue. Encore un objectif de la présente invention est de décrire un tel procédé qui soit économique à mettre en oeuvre. Ces différents objectifs sont atteints grâce à l'invention qui concerne un procédé de phyto-remédiation d'un site pollué par au moins un type de polluant, ledit procédé comprenant au moins une étape consistant à cultiver sur ledit site pollué au moins une plante phyto-remédiatrice apte à fixer au moins une partie dudit polluant et une étape ultérieure consistant à récolter ou a détruire ladite plante ayant fixé au moins une partie dudit polluant, caractérisé en ce que ladite étape consistant à cultiver ladite plante est effectuée au moins en partie en présence d'au moins un glucide exogène soluble dans l'eau assimilable par ladite plante ou d'une substance contenant un tel glucide. Ainsi, le procédé sur l'invention propose de façon originale de cultiver la plante phyto-remédiatrice directement dans le site à dépolluer en présence, pendant tout ou une partie du cycle de culture, d'au moins un glucide exogène soluble dans l'eau qui peut et assimilable par cette plante. Les inventeurs ont en effet observé que, d'une façon surprenante, la présence d'un tel sucre permettait de rendre les plantes phyto-remédiatrices résistantes à des concentrations de polluants des centaines de fois plus élevées qu'en absence de sucre. On notera que, dans le cadre de la présente invention, on pourra utiliser un tel sucre assimilable par la plante seul ou en mélange avec d'autres sucres. Ce sucre ou ce mélange de sucres pourra également être inclus dans une substance les contenant comme il sera décrit ci-après. Il existe de nombreux glucides solubles dans l'eau assimilables par les plantes. En fonction de la plante phyto-remédiatrice sélectionnée en raison de la nature de la pollution du site à traiter, la nature de ce glucide exogène pourra varier. Toutefois, préférentiellement il s'agira d'un mono-saccharide, d'un di-saccharide ou d'un tri-saccharide. Ainsi, selon une variante de l'invention, il pourra s'agir de glucose. Selon une variante préférée entre toutes, ce sucre exogène sera constitué par du saccharose. En effet, ce glucide correspond à la forme principale de transport des sucres dans les végétaux et de distribution dans les tissus de la plante. Comme déjà indiqué, le procédé selon l'invention pourrait être mis en œuvre pour traiter différents types de polluants (hydrocarbures, certains métaux lourds, herbicides, pesticides...). Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté au traitement des polluants de nature organique ou métallique qui induisent un stress oxydatif qui, indirectement, inhibe la photosynthèse et notamment aux herbicides inhibiteurs de la photosynthèse. Toutefois, d'une façon préférentielle, ce polluant sera un herbicide appartenant à la famille des triazines, ou plus généralement un herbicide inhibiteur de la photosynthèse. Le procédé sera ainsi préférentiellement utilisé pour dépolluer les sites pollués par l'atrazine. Selon une variante intéressante de l'invention, le glucide utilisé pourra être sous la forme d'une substance le contenant. Ainsi, il pourra s'agir d'un résidu industriel tel que, par exemple, des mélasses provenant de l'industrie sucrière. II pourra être envisagé différents moyens pour apporter un tel glucide exogène à la plante phyto-remédiatrice. Selon un mode de réalisation, il pourra être envisagé d'enrober les graines de cette plante avec ce glucide. Un tel enrobage pourra être fait extemporanément à la culture proprement, par exemple, par un grainetier. De telles graines enrobées présentent l'avantage de pouvoir être utilisées avec beaucoup de souplesse sans avoir à intervenir sur le milieu de culture ultérieurement. Toutefois, selon un autre mode de réalisation, il pourra aussi être envisagé d'apporter le glucide ou la substance contenant celui-ci sur le site ou de l'intégrer dans le sol. Dans ce cas, le glucide exogène ou la substance le contenant pourra être apporté sous forme solide ou encore sous forme liquide en solution. La quantité et la concentration en un tel sucre apporté à la plante phyto- remédiatrice seront fonction de nombreux facteurs, notamment la nature du ou des polluants présents dans le site, la concentration en ces polluants, la nature de la plante phyto-rémediatrice, la densité de plantes phyto-remédiatrices, la tolérance de cette plante vis-à-vis de ce sucre, la luminosité et les conditions micro-climatiques, la richesse en azote du site traité, la nature physicochimique du site, et la structure du sol. A titre indicatif, on pourra utiliser un traitement de 50 grammes à 500 grammes de glucides par mètre carré. A titre indicatif, on pourra aussi arroser les plantes phyto-remédiatrices avec une solution de 2 à 60 grammes par litre d'équivalent saccharose dans le cas de sol, et s'il s'agit d'un site inondé, on pourra ajuster l'eau du site à une concentration finale de 2 à 60 grammes par litre d'équivalent saccharose. On notera également que le glucide exogène pourra être apporté au site avant de débuter la culture mais aussi après que la culture aura commencé, par exemple, lorsque les semis auront levé ou à la fois au début et en cours de culture en une ou plusieurs fois. On notera également que le glucide pourra être apporté à un couvert végétal autochtone pré-existant sur le site. En fonction de la nature de la pollution et surtout de sa concentration, la plante phyto-remédiatrice utilisée pourra varier. Ainsi, pour les sites à pollution profonde, on pourra choisir une plante à développement racinaire profond, tel qu'un arbre et notamment des peupliers. Dans le cas des sites très humides ou contenant des eaux chargées en polluant, on pourra utiliser des plantes aquatiques telles que par exemple les roseaux. Par contre, pour les sites relativement peu pollués, il pourra être envisagé d'utiliser des plantes à croissance rapide et notamment des plantes annuelles ou bisannuelles. Plusieurs cycles de croissance et des fauchage des plantes pourront être envisagés. Parmi celles-ci, on peut citer notamment, le trèfle, le ray-grass, Arabidopsis thaliana et les plantes de la famille des crucifères (Brassicaceae) et en particulier les moutardes et les espèces du genre Brassica. On notera que Arabidopsis thaliana sert de modèle en génétique et en biologie moléculaire des plantes. Il s'agit d'une petite crucifère proche de la moutarde sauvage qui est très commune dans les régions tempérées et qui présente l'avantage d'être une plante non agricole et non sélectionnée par l'homme. Elle est donc utilisée comme modèle de plante sauvage et diverses études qui ont été menées dessus ont permis de mettre en évidence qu'elle était dotée de mécanismes de protection contre les triazines et notamment contre l'atrazine, qui sont dépendants de la présence de saccharose. L'invention, ainsi que les différents avantages qu'elle présente seront mieux compris grâce à la description qui va suivre d'un mode de réalisation de celle-ci donnée en référence aux figures, dans lesquels : - la figure 1 représente l'incidence de teneurs croissantes en atrazine dans un milieu de culture sur la longueur des racines primaires d' Arabidopsis thaliana ; - la figure 2 représente l'incidence de teneurs croissantes en atrazine dans un milieu de culture sur la concentration en pigments photosynthétiques (chlorophylles et caroténoïdes) chez Arabidopsis thaliana ; - la figure 3 représente l'incidence de teneurs croissantes en atrazine dans un milieu de culture sur la longueur des racines primaires d' Arabidopsis thaliana en présence de saccharose ou de glucose ; - la figure 4 représente l'incidence de teneurs croissantes en atrazine dans un milieu de culture sur la concentration en pigments photosynthétiques (chlorophylles et caroténoïdes) chez Arabidopsis thaliana en présence de saccharose ou de glucose ; - la figure 5 représente l'incidence de teneurs croissantes en saccharose sur l'efficacité du photosystème II, en l'absence et en présence d' atrazine; - la figure 6 représente l'incidence de teneurs croissantes en atrazine sur la production d'ion superoxyde (responsable du stress oxydatif) en présence de 10 rnM de saccharose ; - la figure 7 représente un Dot Blot qui montre la variation de la teneur de l'ensemble des formes de la protéine cible de l'atrazine (protéine Dl du photosystème II) en présence de concentrations croissantes d' atrazine et de différentes concentration de saccharose; - la figure 8 représente un Western Blot qui montre la variation de la protéine cible en fonction de concentrations variables d' atrazine et de saccharose ; - la figure 9 représente la concentration d' atrazine dans les plants en fonction de la pollution du milieu environnant ; - la figure 10 montre les quantités d'atrazine fixées par Arabidopsis en fonction de la quantité de plantules introduites dans le milieu de culture ; - la figure 11 montre, en vue de dessus, deux cultures d Arabidopsis sur terreau présentant une contamination à l'atrazine de 10 μM en présence ou non de saccharose ; - la figure 12 montre les quantités d'atrazine fixées par Arabidopsis en fonction de la quantité de plantules cultivées sur terreau. Les inventeurs ont mené à bien un certain nombre d'expériences permettant de prouver que l'addition de glucides exogènes solubles dans l'eau exogène au milieu de culture de la plante Arabidopsis thaliana permettait de conférer à celle-ci une tolérance accrue à l'atrazine même à des concentrations élevées. Dans ce cadre, le saccharose et le glucose ont été testés. Des graines d' Arabidopsis thaliana (écotype Wassilewskija) ont été stérilisées en surface selon le protocole habituel et ont ensuite été rincées à l'éthanol absolu et séchées pendant une nuit. Ces graines ont été cultivées dans des boîtes de Pétri sur un milieu de culture Murashige and Skoog (ajusté à un pH de 5,7) gélose (0,8%). Les boîtes de Pétri ont été stockées pendant 48 h à 4°C puis transférées à 22°C sous une photopériode de 16 heures par jour à 4500 lux. Le saccharose et le glucose ont été ajoutés au milieu de culture alors qu'aucun sucre n'a été ajouté pour les témoins. Un paramètre de croissance (longueur des racines primaires ) et les teneurs en pigments (chlorophylles et caroténoïdes) ont été mesurés après 15 jours de culture. Les teneurs en atrazine dans les plantes ont également été mesurées après un mois de culture. Les pigments photosynthétiques (chlorophylles et caroténoïdes) ont été extraits en broyant les parties aériennes des plants dans 80% d'acétone et en mesurant l'absorbance des extraits correspondants à 663 nm, 646 nm, 470 nm. Les teneurs en ces pigments ont été exprimées en μg/mL et déterminées selon la méthode de Lichtenthaler et al. (1983 Biochem.Soc.Trans.l 1,591-592). La figure 1 indique les résultats obtenus sur les longueurs des racines primaires en mm en fonction des concentrations d'atrazine testées, en l'absence de sucres dans le milieu de culture. Ces résultats montrent que l'effet de l'atrazine sur la longueur des racines à Arabidopsis thaliana devient significatif à une concentration de l'ordre de 100 nM à 250 nM. A 500 nM l'inhibition du développement des racines est complète et induit une décoloration et la mort des plants. Ces résultats indiquent clairement que l'inhibition de la croissance induite par l'atrazine dépend de la concentration en ce composé, comme le représente la courbe de régression hyperbolique (R2 = 0,93) représentée en trait plein sur la figure 1 qui donne un I50de 120 nM pour l'inhibition de l'atrazine. La figure 2 donne quant à elle les résultats obtenus sur les teneurs en chlorophylles et en caroténoïdes, en l'absence de sucres dans le milieu de culture. Ces résultats montrent que les taux de chlorophylles commencent à diminuer pour une concentration d'atrazine comprise entre 50 et 100 nM, les chlorophylles et les caroténoïdes disparaissant complètement à une concentration de 500 nM. La figure 3 donne les résultats obtenus sur la longueur des racines primaires en fonction de la teneur en atrazine du milieu en présence de 80 mM de saccharose ou de 80 mM de glucose. Ces résultats montrent que des taux de 1 à 10 μM d'atrazine ont un effet inhibiteur, mais non-léthal, sur la longueur des racines primaires mais que paradoxalement des concentrations plus hautes en atrazine permettent d'améliorer la croissance des racines. Cette augmentation de croissance est plus importante en présence de saccharose qu'en présence de glucose. La figure 4 indique les résultats obtenus sur les teneurs en pigments photosynthétiques (taux de chlorophylles et de caroténoïdes) en présence de 80 mM de saccharose ou de 80 mM de glucose. Ces résultats indiquent que si l'atrazine provoque une diminution des taux de chlorophylles et de caroténoïdes dans les feuilles en présence de glucose et de saccharose, la production de ces pigments n'est toutefois pas supprimée alors qu'elle l'est en absence de sucre (voir figure 2). Dans une autre série d'expérience, des plants d Arabidopsis thaliana ont été cultivés sur le milieu de culture décrit ci-dessus en absence de saccharose et en présence de 10 mM et 80 mM de saccharose d'une part et en absence d'atrazine et en présence de 0,25 μM et de 1 μM d'atrazine d'autre part. Les résultats indiqués sur la figure 5 montrent que des concentrations croissantes de saccharose contribuent à maintenir l'activité du photosystème II en présence de doses d'atrazine qui sont léthales ou sub-léthales en l'absence de saccharose. L'activité du photosystème II est suivie par la mesure de la fluorescence des chlorophylles. Afin d'estimer les niveaux de protéine Dl (monomère de 31 kD et sous produits à 21,5 kD), les protéines membranaires des plants ont été isolées selon la méthode de Pilgrim et al. (1998 Plant.J.13 2-77-186). Les niveaux de la teneur totale en protéine cible, la protéine Dl du photosystème II, ont été estimés par analyse Dot Blot. Ensuite, les différentes formes ont été analysées par séparation sur gel d'électrophorèse en condition dénaturante et western
Blot. La figure 7 montre les résultats obtenus par Dot Blot, qui détecte toutes les protéines Dl. Selon cette figure, on peut constater que 1 μM d'atrazine provoque la disparition de la protéine Dl chez les plants n'ayant pas été cultivés en présence de saccharose. La figure 8 montre les résultats obtenus par Western Blot. Ces résultats révèlent que de fortes concentrations en saccharose induisent une diminution de production de la protéine Dl en absence d'atrazine et qu'au contraire la présence de saccharose dans le milieu de culture et en présence de 0,25 μM d'atrazine provoque une plus grande accumulation de protéine Dl et de ses sous-produits. Le même effet a été observé avec 1 μM d'atrazine en présence de 10 mM de saccharose. Par contre l'utilisation de 80 mM de saccharose et de 1 μM d'atrazine provoque une diminution de protéine Dl et des sous-produits. L'utilisation de 80 mM de saccharose permet toutefois de maintenir une quantité suffisante de monomère de la protéine Dl, qui disparaît aux mêmes concentrations d'atrazine en l'absence de saccharose. Par ailleurs, la production d'ion superoxyde des plants a été testée selon la méthode de Fryer et al. (2002 Imaging of photo-oxidative stress responses in leaves -J. Exp. Bot. 53 : 1249-1254)). Comme le montre la figure 6, la présence de saccharose n'empêche pas la production d'espèces moléculaires d'oxygène actif tel que l'ion superoxyde qui semble augmenter en présence d'atrazine. La présence de saccharose ne bloque pas l'action de l'atrazine et la production d'ions superoxydes, mais protège les cellules et les tissus des effets destructeurs du stress oxydatif. Les teneurs en atrazine ont par ailleurs été mesurées dans les plants et le milieu de culture par les méthodes classiques d'extraction par des solvants et d'analyse par chromatographie liquide haute performance avec détection UV. L'atrazine a été extraite dans un mélange de méthanol et d'eau (4 :l,v/v). Après centrifugation, les surnageants ont été filtrés sur des filtres de 0,45 μm et les solvants organiques ont été évaporés à 40°C. Des cartouches SPE ont été activées par lavage avec 5 mL de méthanol puis 5 mL d'eau. Chaque échantillon a été appliqué sur colonne et les colonnes ont ensuite été lavées. L'atrazine a été éluée avec 2 mL de dichlorométhane. Les solvants organiques ont ensuite été évaporés et les résidus secs dissous dans 500 μL d'un mélange de méthanol et d'eau (1 :1). Les échantillons ont ensuite été analysés par HPLC avec une détection UV. Comme on peut le voir sur la figure 9, les plants cultivés en présence de saccharose et en présence d'atrazine à 0,5 picomoles par milligramme de milieu présentent une teneur en atrazine de 3,7 (± 0,3) nanomoles d'atrazine par gramme de poids frais. L'atrazine se retrouve donc à une concentration plus élevée dans le tissu de la plante que dans le milieu de culture. De plus, les plantes traitées avec du saccharose accumulent l'atrazine à un niveau qui provoque la mort des plantes en l'absence de saccharose. Il apparaît que la tolérance à l'atrazine basée sur l'utilisation du saccharose, selon la présente invention, n'est pas associée à une baisse du niveau d'atrazine dans les tissus mais, au contraire, à une suraccumulation de l'atrazine. Comme il apparaît sur la figure 10, les effets positifs du saccharose sur la stimulation de la croissance et la capacité à suraccumuler l'atrazine dans les tissus font que 8 g de masse fraîche de plants d' Arabidospis peuvent accumuler
95 microgrammes d'atrazine du milieu agar environnant. Au cours d'expériences complémentaires Arabidospis thaliana a aussi été cultivé sur un terreau contaminé à une concentration de 10 μM d'atrazine en l'absence de saccharose et en présence de saccharose apporté en surface sous forme de solution à 3 %. Les cultures obtenues sont représentées à la figure 11 sur laquelle le pot de terreau de gauche correspond à la culture en présence de saccharose et le pot de terreau de droite correspond à la culture en absence de saccharose. Les plantules, figurant en clair sur cette figure, sont plus nombreuses et plus grosses lorsque, selon l'invention, du saccharose a été ajouté au milieu de culture. Comme il apparaît sur la figure 12, les effets positifs du saccharose sur la stimulation de la croissance et la capacité à suraccumuler l'atrazine dans les tissus font que 12,5 g de masse fraîche de plants & Arabidospis peuvent accumuler 100 microgrammes d'atrazine du milieu terreau environnant. Ces expériences ont montré que l'utilisation d'un glucide exogène soluble dans l'eau lors de la culture d'une plante phyto-remédiatrice permet de conférer à cette plante une très grande tolérance aux polluants sans gêner sa croissance et en permettant l'accumulation de ce polluant dans celle-ci. La stimulation de croissance, et donc de biomasse, et la protection des photosystèmes et des cellules contre le stress oxydatif par l'apport de sucres exogènes font que l'invention pourra être utilisée pour améliorer l'accumulation dans les tissus de plantes phyto-remédiatrices d'une large gamme de polluants organiques et métalliques, autres que les herbicides. L'invention pourra donc être mise en œuvre pour constituer un filtre végétal avec des espèces de plantes variées dans le but, par exemple, de protéger des sites sensibles. L'utilisation de glucide, selon la présente invention, pourrait être envisagée pour la dépollution de site contaminé.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de phyto-remédiation d'un site pollué par au moins un type de polluant, ledit procédé comprenant au moins une étape consistant à cultiver sur ledit site pollué au moins une plante phyto-remédiatrice apte à fixer au moins une partie dudit polluant et une étape ultérieure consistant à récolter ou a détruire ladite plante ayant fixé au moins une partie dudit polluant caractérisé en ce que ladite étape consistant à cultiver ladite plante est effectuée au moins en partie en présence d'au moins un glucide exogène soluble dans l'eau assimilable par ladite plante ou d'une substance contenant un tel glucide.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit glucide exogène soluble dans l'eau est un mono-saccharide, un disaccharide, ou un tri- saccharide.
3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que ledit glucide exogène soluble dans l'eau est du glucose.
4. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que ledit glucide exogène soluble dans l'eau est du saccharose.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que ledit polluant est un polluant de nature organique ou métallique qui induit un stress oxydatif qui, indirectement, inhibe la photosynthèse.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que ledit polluant est un herbicide inhibiteur de la photosynthèse.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que ledit polluant est un pesticide appartenant à la famille des triazines.
8. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que ledit polluant est l'atrazine.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la substance contenant ledit glucide est un résidu industriel.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que ladite étape consistant à cultiver ladite plante en présence d'au moins un glucide exogène soluble dans l'eau assimilable par ladite plante, consiste à utiliser des graines de ladite plante enrobées avec ledit glucide.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que ladite étape consistant à cultiver ladite plante en présence d'au moins un glucide exogène soluble dans l'eau assimilable par ladite plante, comprend une étape consistant à apporter ledit glucide ou la substance contenant celui-ci sur ou dans ledit site.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que ladite plante est constituée par un couvert végétal préexistant sur ledit site.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 caractérisé en ce que ladite plante est un arbre à croissance rapide.
14. Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que ledit arbre est le peuplier.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 caractérisé en ce que ladite plante est une plante aquatique.
16. Procédé selon la revendications 15 caractérisé en ce que ladite plante est du roseau
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 caractérisé en ce que ladite plante est un plante annuelle ou bisannuelle.
18. Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce que ladite plante est choisi dans le groupe constitué par le trèfle, le ray-grass, Arabidopsis thaliana, par les plantes de la famille des crucifères (Brassicaceae) et notamment les moutardes et les espèces du genre Brassica .
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 caractérisé en ce que ledit glucide est apporté à ladite plante à raison de 50 à 500 grammes de glucide par mètre carré de surface à traiter.
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