WO2005014027A1 - Verwendung von chemokinen und diese enthaltende pharmazeutische zubereitungen - Google Patents

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chemokine
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mesenchymal
pharmaceutical preparation
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PCT/EP2004/007581
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Jochen Ringe
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Definitions

  • the present invention relates to the use of chemokines and / or a nucleic acid encoding a chemokine for recruiting mesenchymal precursor and / or stem cells in vivo and in vitro.
  • the present invention also relates to pharmaceutical preparations containing these substances, which are preferably intended for the recruitment of mesenchymal precursors and / or stem cells for tissue building.
  • Osteoarthritis is the most common joint disorder worldwide. In the course of this primary degenerative joint disease there is a progressive destruction of the local overall guiding surface, 'degeneration of the articular cartilage. The result is pain and reduced function and mobility.
  • the factors that influence the development of osteoarthritis include age, gender, weight, osteoporosis, mechanical overuse, malposition and trauma.
  • these cells are injected into the defect area covered with a periosteal flap (ACT, autologous chondrocyte transplantation) or, after packaging, inserted into the defect cartilage (chondrogenesis) or three-dimensional biomaterials that promote bone maturation (osteogenesis) [see also US-A-5,891,455].
  • ACT autologous chondrocyte transplantation
  • chondrogenesis defect cartilage
  • osteogenesis three-dimensional biomaterials that promote bone maturation
  • newer methods aim at the regeneration of defects directly in the tissue, the in situ regeneration.
  • biomaterials are introduced into the defect, which are provided with biologically active factors, such as growth and differentiation factors, adhesion molecules, extracellular matrix molecules and chemotactic factors, in order to direct mesenchymal " cells to the defect location and to stimulate them there to regenerate the defective tissue.
  • chemotactic factors Proteins that have the property of supporting human cells during migration or stimulating them to migrate are referred to as chemotactic factors. These are, for example, extracellular matrix molecules and secreted proteins that diffuse in the tissue.
  • Chemotactic factors include a number of proteins such as growth and differentiation factors (for example from the Transforming Growth Factor (TGF) family, the Bone Morphogenetic Protein (BMP) family, the Cartilage Derived Morphogenetic Proteins (CDMP), from the Fibroblast Growth Factor (FGF) Family, the connective tissue growth factor (CTGF), from the platelet derived growth factor (PDGF) family, from the vascular endothelial growth factor (VEGF) family, or the epidermal growth factor (EGF) family), extracellular matrix molecules (for example Osteopontin, fibronectin, hyaluronic acid, heparin, thrombospondin, collagens, vitronectin) and chemokines (CCL, CXCL, CX 3 CL
  • DE 199 describes the use of extracellular matrix molecules (osteopontin) and secreted growth and differentiation factors (cartilage derived morphogenetic protein) as chemotactic factors which induce mesenchymal cells not only for immigration into the defect but also for tissue-specific maturation 57 388A.
  • Matrix molecules do not diffuse in the tissue, so they are only of limited use as demotactic factors.
  • Some of the secreted proteins adhere to matrix proteins, which in turn limits their freedom of movement. However, they also have a differentiating effect. If the differentiation is made too early, the tissue will not be formed at the desired location. Furthermore, decoupling of recruiting and differentiation is not possible. The choice of the chemotactic factor also determines the differentiation process.
  • the previously used methods therefore first require the production of autologous, tissue-forming cells, which the patient has to be implanted at the place where new tissue (usually cartilage or bone) is to be rebuilt.
  • new tissue usually cartilage or bone
  • the extraction of autologous cells is time-consuming and, for the patient, involves at least an upstream biopsy, if not an operation to obtain the cell material.
  • the present invention relates to the use of a chemokine and / or a nucleic acid encoding a chemokine for the production of a pharmaceutical preparation.
  • the pharmaceutical preparation for recruiting mesenchymal, preferably local mesenchymal progenitor cells is preferably intended for building up tissue, preferably from the bone marrow.
  • the invention relates to the use of a chemokine and / or a nucleic acid encoding a chemokine for the recruitment of mesenchymal, preferably local mesenchymal progenitor cells from the bone marrow in vitro.
  • the chemokine is preferably selected from the group consisting of CCL19, CCL21, CCL27, CCL28, CCL20, CXCL9, CXCLIO, CXCLl l, CXCL16, CXCL13, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CXCL12, CCL2, CCL8, CCL13, CCL25, CCL25 CCL4, CCL5, CCL7, CCL14, CCL15, CCL16, CCL23, CX 3 CL1, XCL1, XCL2, CCL1, CCL17, CCL22, CCL11, CCL24, CCL26, CXCLl, CXCL2, CXCL3, and CXCL7, more preferably from the group consisting from CCL19, CCL21, CCL27, CCL28, CCL20, CXCL9, CXCLIO, CXCLll, CXCL16, CXCL13, and CXCL5, CXCL6, CXCL8, CXCL12, CCL2, CCL
  • a chemokine or a mixture of chemokines can be used.
  • a chemokine fragment or derivative that has the ability to bind to a chemokine receptor can be used. In any case, it can be a natural or synthetic chemokine.
  • the nucleic acid encoding a chemokine can be in the form of RNA, DNA, cDNA, or ssDNA and can be of natural or synthetic origin.
  • the pharmaceutical preparation is preferably in a form suitable for injection. It can also contain: one or more suitable excipients; one or more biodegradable polymers; at least one active ingredient selected from differentiation and growth factors and mixtures thereof, the differentiation and growth factors preferably inducing chondrogenesis or osteogenesis, and mixtures of 2 or more of these.
  • the invention relates to a pharmaceutical preparation containing a chemokine as defined above.
  • the invention finally relates to a pharmaceutical preparation containing a nucleic acid as defined above.
  • Figure 1 Evidence of the expression of the chemokine receptors in human mesenchymal stem cells using RT-PCR.
  • proteins of the chemokine family can be used for the recruitment of mesenchymal progenitor cells, in particular mesenchymal stem cells, for example from the bone marrow, wherein the recruitment can take place in vivo and in vitro.
  • recruitment can be used to heal tissue defects, especially pathogenetic and / or traumatic and / or age-related cartilage defects, cartilage lesions, bone defects and fractures.
  • the chemokine (s) are made available at a specific location. From here, a concentration gradient builds up due to the diffusion. Because of this concentration gradient, the mesenchymal cells are directed to the respective location, which is referred to as recruitment. The corresponding stimulus to the cells is mediated by binding the chemokines to specific chemokine receptors.
  • the present invention is based on the finding that human or animal mesenchymal precursor and stem cells have corresponding receptors.
  • the expression or the presence of these receptors in human or animal mesenchymal precursor and stem cells has not previously been described in the scientific literature and is documented therein.
  • the mesenchymal precursor and stem cells react to chemokines precisely because of the expression of these receptors and can therefore migrate due to the chemokine signal.
  • the response and the rate of migration presumably depend on the expression level of the receptor on the respective cell.
  • the ligands of the most highly expressed receptors are thus presumably those chemokines to which the mesenchymal precursors and stem cells respond most strongly.
  • the probability decreases that the cells react chemotactically to the chemokines corresponding to the chemokine receptor and migrate.
  • the potential of the chemokines is used according to the invention to recruit mesenchymal, preferably even local precursor and stem cells to a specific location, for example a defect location (for example a cartilage lesion) in situ.
  • Chemokines are proteins (5-20 kDa) that play an important physiological role in a variety of processes such as hematopoiesis of blood stem cells and chemotaxis of leukocytes.
  • Chemotaxis is understood to mean the positive or negative movement reaction of moving organisms or cells, triggered by a chemical stimulus, towards or away from the stimulus, the cell membrane of which is activated by corresponding "chemotactic substances" (chemokines, chemotaxins). This activation is mediated by a corresponding cell surface receptor (chemokine receptor) to which the chemokine binds.
  • chemokine receptor cell surface receptor
  • the chemotaxis of certain target cells triggered specifically to a defect location is also referred to as “recruitment”.
  • chemokines are similar and are characterized by an unchangeable arrangement of four cysteines. Depending on the location of the first two cysteines, the chemistry family is divided into four subfamilies: CC, CXC, CX C and C chemokines, with representatives of the C subfamily having only two cysteines (see Table 1 below). A more detailed description can be found in Murphy et al. (2000) "International Union of pharma- 'cology. XXII. Nomenclature of chemokine receptors. "Pharmacol Rev 52: 145-176, which is incorporated herein by reference. In the following, the nomenclature presented by Murphy et al.
  • chemokines themselves are called CCL, CXCL, CX 3 CL and XCL, where "L” stands for ligand.
  • L stands for ligand.
  • chemokines and their receptors are expressed by a large number of hematopoietic and non-hematopoietic cells. Chemokine activity is initiated by binding to a specific G protein-coupled receptor. Although most of the investigations into the mode of action of chemokines have so far been carried out on leukocytes, their function extends far beyond leukocyte physiology. Chemokine receptors are classified as receptors for CCL, CXCL, CX 3 CL and XCL and are systematically designated CCR, CXCR, CX 3 CR and XCR ("R" stands for receptor) (see Table 1 below).
  • chemokines can have multiple chemokines
  • the amino acid sequences of the chemokine receptors are 25-80% identical to one another and 25% identical to many other G protein-coupled receptors [Murphy et al. (2000) "International union of phatmacology. XXII. Nomenclature of chemokine receptors . " Pharmacol Rev 52 -.145-176].
  • the N-terminus is on the extracellular side of the membrane and is mostly glycolyzed, while the C-terminus is on the cytoplasmic side and is phosphorylated. Three extracellular loops alternate with three intracellular and connect seven hydrophobic transmembrane domains.
  • a two-step model for receptor activation has been developed: chemokine binding to the receptor first leads to a change in the conformation of the chemokine, followed by activation of the receptor by the N-terminus of the chemokine.
  • GDP bound to the ⁇ -subunit of the G protein is exchanged for GTP.
  • the G protein dissociates from the receptor and triggers a cascade of biochemical reactions in the cytoplasmic space.
  • CC and CXC receptors have been detected in monocytes, lymphocytes, basophilic and eosinophilic granulocytes and chondrocytes.
  • the CC chemokine receptor family includes eleven CC receptors (CCR1-CCR11). They have seven characteristic sequence sections which distinguish them from the 6 receptors of the CXCR family (CXCR1-CXCR6).
  • chemokines of numbers 1-39, preferably numbers 1-18, and particularly preferably numbers 1-8 from Table 4 are preferably used. These can be in the form of the chemokines, their fragments and or derivatives, but also in the form of one Chemokine-encoding nucleic acid (e.g. DNA, cDNA, RNA, ssDNA) can be used.
  • a fragment of a chemokine is understood to mean a peptide which comprises a partial sequence of the amino acid sequence of the chemokine.
  • a derivative of a chemokine means a peptide or protein with a Amino acid sequence which is derived from the amino acid sequence of a chemokine by deletion, substitution, addition or point mutation. It is essential for suitable fragments and / or derivatives to maintain the binding ability to the chemokine receptor and preferably also the binding specificity.
  • a pharmaceutical preparation containing the chemokine and / or a nucleic acid encoding the chemokine is prepared by conventional methods.
  • the pharmaceutical preparation is preferably intended for injection. Suitable processes for the preparation of pharmaceutical preparations containing proteins and nucleic acids and auxiliaries suitable therefor are known and shall not be described here. The design of such a preparation lies in the skill of the expert. For example, injection solutions, fibrin glue, substrates for transplantation, matrices, tissue patches or sutures are suitable.
  • the preparation is then introduced into the tissue defect such as a bone or cartilage defect, preferably by means of injection, a fibrin glue, a substrate, a matrix or a patch.
  • tissue defects such as a bone or cartilage defect
  • Suitable substrates are known, for example, from DE 199 57 388, which is incorporated herein by reference.
  • a connection to the bone marrow space can be created to attract mesenchymal precursor and / or stem cells. After the mesenchymal cells have migrated into the bone or cartilage defect, these cells build up a regenerating tissue that fills the defect and stabilizes it.
  • growth and differentiation factors that promote osteogenesis or chondrogenesis, the structure of the bony or cartilaginous regenerated tissue can be supported.
  • the invention thus preferably relates to the use of chemokines for the production of pharmaceutical preparations for the recruitment of local mesenchymal progenitor cells from the bone marrow for the regeneration of pathological or traumatic joint defects, predominantly in the case of arthrosis.
  • Mesenchymal progenitor cells and stem cells in the sense of the present invention are cells which have the property of developing into one or more mesenchymal tissues. Examples include: cartilage with chondrocytes, bones with osteocytes, tendons with tenocytes, ligaments with tenocytes, cardiac muscle with cardiomyocytes, connective tissue with fibroblasts, fibrous tissue with fibroblastoid cells, neuronal tissue with astrocytes and neurons.
  • the progenitor cells can therefore be progenitor cells of chondrocytes, osteocytes, tenocytes, cardiomyocytes, fibroblasts, fibroblastic cells, astrocytes or neurons.
  • the progenitor cells can be progenitor cells / stem cells of cartilage cells that only develop into cartilage cells, or progenitor cells that have the ability to develop in cartilage and bone cells, or progenitor cells that have the ability possess to develop exclusively in bone cells.
  • the mesenchymal progenitor cells are "attracted" by the chemokines contained in the preparation from the surrounding tissue close to the joint, preferably from the bone marrow, and directed to the defect site.
  • the mesenchymal progenitor cells remain there and form a bony regenerative tissue in the bone defect and a cartilaginous defect in the cartilage defect.
  • a similar attracting can of course also be used in vitro for the cultivation of corresponding cells, for example from biopsies.
  • mesenchymal stem cells are mesenchymal progenitor cells which have the ability to develop into several, at least into two different, mesenchymal tissues.
  • the present invention relates to the use of chemokines for the recruitment of mesenchymal precursor or stem cells from the bone marrow.
  • chemokines for the recruitment of mesenchymal precursor or stem cells from the bone marrow.
  • arthroscopically small channels are drilled from the defect site of the cartilage into the bone tissue underlying the cartilage, so that a connection is created between the defect site and the bone marrow.
  • the introduction of chemokines in the de- effet attracts mesenchymal precursors or stem cells, which settle in the defect and form a regenerated tissue that closes the defect.
  • nucleic acids encoding a chemokine can be provided. It is advantageous here to introduce RNA, DNA, cDNA or ssDNA, which are taken up by local cells, read off and released as a mature protein.
  • the chemokines used to recruit mesenchymal progenitor cells are mixed with biodegradable polymers or biomaterials.
  • Biodegradable polymers in the sense of the invention are those, preferably three-dimensional polymer structures, which have no toxic effects on cells, do not cause an immune reaction and promote the tissue build-up of cartilage or bone.
  • the introduction of biodegradable polymers with chemokines into the defect to be closed leads to the attraction of mesenchymal progenitor cells, which immigrate directly into the polymer tissue and find a three-dimensional polymer structure there for optimal tissue maturation in cartilage or bone.
  • polymers or biomaterials examples include polylactide, polyglycolide, poly (lactide-glycolide), polylysine, polycaprolactone, alginate, agarose, fibrin, hyaluronic acid, polysaccharides, cellulose, collagens and hydroxylappatite.
  • the chemokines can also be used together with growth and differentiation factors in the same (or also administered in separate preparations).
  • the joint use of chemokine, polymer and growth and differentiation factors is very particularly preferred.
  • the introduction of such a mixture into the defect has the advantage that the attracted mesenchymal progenitor cells, in addition to the optimal polymer structure that already promotes tissue maturation, are additionally stimulated by tissue growth and differentiation factors.
  • the present invention relates to the use of chemokines together with growth and differentiation factors which induce cartilage maturation.
  • the factors that induce cartilage maturation in the sense of the present invention are growth and differentiation factors that are developmentally a Stimulate precursor cell for differentiation and maturation into a chondrocytic cell type or a mature cartilage cell for the production of cartilage matrix. It is advantageous here to use members of the cartilage-derived morphogenetic protein (CDMP) and bone morphogenetic porteins (BMP) family, but also insulin.
  • CDMP cartilage-derived morphogenetic protein
  • BMP bone morphogenetic porteins
  • the present invention relates to the use of chemokines together with growth and differentiation factors which induce bone maturation.
  • Bone maturation-inducing factors in the sense of the present invention are growth and differentiation factors which, in developmental biology, stimulate a precursor cell for differentiation and maturation into a bony cell type or a mature bone cell for the production of bone matrix. It is advantageous here to use members of the family of bone morphogenetic porteins (BMP), particularly preferably members BMP -2 and BMP-7.
  • BMP bone morphogenetic porteins
  • MSC human mesenchymal stem cells
  • a maximum of 3 ml of ophthalmic marrow punctate are mixed with 10 ml of PBS and centrifuged for 10 minutes and 310 g at room temperature.
  • the cell pellet is resuspended and washed again with PBS (8000 mg / l NaCl, 200 mg / l KCl, 1150 mg / l Na 2 HPO 4 , 200 mg / l KH 2 PO 4 ).
  • the cells are taken up in 20 ml of DME medium (with 10-20% FBS, 2% HEPES, 4 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin).
  • the homogeneity of the culture of human mesenchymal stem cells obtained is verified by means of FACS analysis, the surface antigens Endoglin and ALCAM being detected and the surface antigens CD34, CD 45 and CD 14 not being detected. This has been confirmed.
  • Tri Reagent LS TM is used to isolate the total RNA.
  • the MSC are cultivated to confluence. After discarding the cell culture medium, a layer of 0.4 ml of Tri Reagent LS TM per 10 cm 2 of growth area is overlaid to lyse the cells.
  • the lysate is transferred to a sterile reaction vessel and incubated for 5 minutes at room temperature (RT).
  • the lysate is mixed with 0.1 ml bromine-chloropropane (BCP) per 0.75 ml Tri Rea-. gent LS TM added, shaken for 15 seconds and incubated at RT for 10 minutes. A subsequent centrifugation for 15 minutes at 4 ° C and 12000 g leads to phase separation.
  • BCP bromine-chloropropane
  • the aqueous phase is to be removed in 200 ⁇ l aliquots and transferred to a reaction vessel.
  • the RNA solution is mixed with 0.5 ml of isopropanol per 0.75 ml of Tri Reagent LS TM and left at -20 ° C for at least 7 minutes.
  • the precipitated RNA is pelleted by centrifugation for 8 minutes at 4 ° C and 12000 g.
  • the resulting RNA pellet is washed with 70% EtOH, air-dried and taken up in 20 ⁇ l DEPC-H 2 O. To dissolve the pellet, it is heated to 55 ° C. for 10 minutes.
  • the content of isolated total RNA is determined by a photometric measurement.
  • RNA for the cDNA synthesis, 5 ⁇ g total RNA in 10 ⁇ l DEPC-H 2 O are used and 1 ⁇ l oligo (dT) 12-18 primers (one upper and one lower primer as indicated in Table 2) are added to achieve To be denatured for 10 minutes at 70 ° C. After denaturation, the reaction mixture is stored on ice and treated with 4 ⁇ l 5 ⁇ buffer (0.25 M Tris / HCl, pH 8.3; 0.375 M KCl; 15 mM MgCl 2 ), 2 ⁇ l 0.1 M DTT, 1 ⁇ l dNTP ( 10 mM each) and 0.4 ⁇ l RNase inhibitor added. After an incubation period of 2 min at 37 ° C, the reaction mixture with 1 ul.
  • 4 ⁇ l 5 ⁇ buffer (0.25 M Tris / HCl, pH 8.3; 0.375 M KCl; 15 mM MgCl 2 ), 2 ⁇ l 0.1 M DTT, 1 ⁇ l dNT
  • SuperScript TM Rerverser Transcriptase provided to be incubated for another 60 minutes at 37 ° C. After the addition of 40 ⁇ l TE (10/1, pH 7.8), the enzyme is inactivated at 92 ° C. for 10 minutes. 2.0 ⁇ l cDNA are used for the RT-PCR reactions.
  • 1 ⁇ l cDNA are used per PCR reaction.
  • 2 ⁇ l 10 ⁇ PCR buffer, 2 ⁇ l 25 mM MgCl 2 , 0.2 ⁇ l 10 M dNTPs, 1 ⁇ l 5 nM primer (Table 2) and 0.5 U Taq DNA polymerase are added to the cDNA and made up to a final volume of 20 ⁇ l with H 2 O.
  • a standard reaction cycle is based on denaturation at 95 ° C. for 1 minute, hybridization of the primers at a temperature specific for the primer (T a ⁇ ) for 15 seconds and a DNA synthesis reaction at 72 ° C. for 15 seconds. This cycle is repeated a total of 35 times.
  • Table 3 Expression and level of expression of chemokine receptors in human mesenchymal stem cells
  • the ligands of the most highly expressed receptors are those chemokines to which the mesenchymal stem cells are most responsive and migrate. As the level of expression decreases, the probability decreases that the stem cells chemotactically react and migrate to the chemokine corresponding to the chemokine receptor. Based on this, it follows that human mesenchymal stem cells are strongest by stimulation with chemokine no. 1, decreasing to chemokine no. 39 of Table 4, activate and have them recruited in situ.
  • Table 4 Chemokines for in situ recruitment of mesenchymal progenitor cells
  • small connecting channels between the bone marrow space and the joint cavity are first created through multiple fine bores (1-2 mm).
  • a wool-like polymer construct polyglycolide
  • hyaluronic acid and chemotactic chemokine CCL19
  • 1.2 ml of fibrin glue with 1000 ng growth factor (cartilage derived morphogenetic protein) and 2000 ng chemokine (CXCL9) are placed in the medullary canal after making the openings Cartilage defect introduced and solidified by the simultaneous addition of 100 ul thrombin.
  • the isolated, expanded and checked human mesenchymal stem cells show a dose-dependent chemotactic activity against the chemokine CXCL12 (SDF-l ⁇ ). This was demonstrated using a 96-Multiwell chemotaxis test.
  • the 96-Multiwell Chemotaxis plates used here consist of an upper and a lower part of a well, which are separated by a permeable polycarbonate membrane (pore diameter 8 ⁇ m).
  • the CXCLl 2 introduced in the lower part creates a concentration gradient across the membrane, activated cells from the upper part of the well or the well migrate into the membrane and into the lower part of the well (the well).
  • the cells are first cultivated in normal DMEM culture medium.
  • the culture medium is removed approximately 22 hours before the test, the cells are washed with PBS and, until the test, in serum-free diet medium (DME medium, contains 1.0 g / 1 glucose, 0.2% bovine serum albumin, 2 mM L-glutamine; 100 U / ml penicillin; 100 ⁇ g / ml streptomycin).
  • DME medium contains 1.0 g / 1 glucose, 0.2% bovine serum albumin, 2 mM L-glutamine; 100 U / ml penicillin; 100 ⁇ g / ml streptomycin.
  • the cells are trypsinized, the cell number and vitality determined and again taken up in the diet medium. 3 ⁇ 10 4 cells are used in 40 ⁇ l of diet medium per upper well (upper well) of a 96-well plate.
  • the top of the filter (non-migrated side) is wiped to remove the non-migrated cells.
  • the cells on the underside of the filter (migrated cells) are kept for 3 min. fixed with ice-cold ethanol / acetone (1: 1 v / v) and stained with the quick staining system Hemacolor® from Merck.
  • the membrane is kept moist and three representative photo fields per well are counted. The distribution of the cells in the respective well is assessed beforehand at a lower magnification.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Chemokinen und/oder ein Chemokin kodierenden Nucleinsäuren zur Rekrutierung mesenchymaler Vorläufer- und/oder Stammzellen in vivo und in vitro. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem diese Substanzen enthaltende pharmazeutische Zubereitungen, die vorzugsweise zur Rekrutierung von mesenchymalen Vorläufer- und/oder Stammzellen zum Gewebsaufbau bestimmt sind.

Description

Verwendung von Chemokinen und diese enthaltende Pharmazeutische Zubereitungen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Nerwendung von Chemokinen und/oder ein Chemokin kodierenden Nucleinsäuren zur Rekrutierung mesenchymaler Vorläufer- und/oder Stammzellen in vivo und in vitro. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem diese Substanzen enthaltende pharmazeutische Zubereitungen, die vorzugsweise zur Rekrutierung von mesenchy- malen Vorläufer- und/oder Stammzellen zum Gewebsaufbau bestimmt sind.
Gebiet der Erfindung
Die Osteoarthrose ist die häufigste Gelenkerlαrankung weltweit. Im Verlauf dieser primär degenerativen Gelenkerkrankung kommt es zu einer schrittweisen lokalen Zerstörung der Ge- lenkoberfläche,' der Degeneration des artikularen Knorpels. Die Folge sind Schmerzen und eine eingeschränkte Funktion und Beweglichkeit. Die Faktoren, welche die Entstehung einer Osteoarthrose beeinflussen, sind unter anderem das Alter, das Geschlecht, das Gewicht, Oste- oporose, mechanische Überbeanspruchung, Fehlstellungen und Traumen.
Konventionelle orthopädische Therapieverfahren, wie „Debridement", „Gelenkshaving", „Microfracture" und „Drilling", sind oftmals nur unzureichend wirksam. Als letzte Konsequenz bleibt häufig nur ein rekonstruktiver Eingriff mit endoprothetischem Gelenkersatz. Alternative Verfahren zur Wiederherstellung von Gelenkknorpel oder auch von Knochen nutzen die Techniken des Tissue Engineering, der künstlichen Gewebezüchtung. Hierzu werden dem Patienten autologe Knorpelzellen oder mesenchymale Vorläufer- oder Stammzellen entnommen und in aufwendigen Zellkulturverfahren vermehrt. In einer zweiten Operation werden diese Zellen in den mit einem Periostlappen abgedeckten Defelctbereich injiziert (ACT, Autologe Chondrozyten Transplantation) oder nach Verpackung in die Knorpel- (Chondrogene- se) oder auch Knochenreifung (Osteogenese) fördernde dreidimensionale Biomaterialien in den Defekt eingebracht [siehe auch US- A- 5,891,455]. Neuere Methoden hingegen zielen auf die Regeneration von Defekten direkt im Gewebe, die in situ Regeneration, ab. Hierzu werden Biomaterialien in den Defekt eingebracht, welche mit biologisch aktiven Faktoren, wie Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, Adhäsionsmolekülen, extrazellulären Matrixmolekülen und chemotaktischen Faktoren, versehen sind, um mesenchymale "Zellen an den Defektort zu dirigieren und dort zur Regeneration des defekten Gewebes anzuregen.
Als chemotaktische Faktoren werden Proteine bezeichnet, die die Eigenschaft besitzen, humane Zellen bei der Migration zu unterstützen oder diese zur Migration anzuregen. Hierbei handelt es sich beispielsweise um extrazelluläre Matrixmoleküle und seze nierte Proteine, die im Gewebe diffundieren. Chemotaktische Faktoren umfassen eine Reihe von Proteinen wie Wachstums- und Differenzierungsfaktoren (beispielsweise aus der Transforming Growth Factor (TGF) Familie, der Bone Morphogenetic Protein (BMP) Familie, die Cartilage Derived Morphogenetic Proteins (CDMP), aus der Fibroblast Growth Factor (FGF) Familie, den Con- nective Tissue Growth Factor (CTGF), aus der Platelet Derived Growth Factor (PDGF) Familie, aus der Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Familie, oder der Epidermal Growth Factor (EGF) Familie), extrazelluläre Matrixmoleküle (beispielsweise Osteopontin, Fibronectin, Hyaluronsäure, Heparin, Thrombospondin, Collagene, Vitronectin) und Chemokine (CCL, CXCL, CX3CL und XCL).
Die Verwendung von extrazellulären Matrixmolekülen (Osteopontin) und sezernierten Wachstums- und Differenzierungsfaktoren (cartilage derived morphogenetic protein) als chemotaktische Faktoren, die mesenchymale Zellen nicht nur zur Einwanderung in den De- fekt, sondern gleichzeitig auch zum gewebespezifischen Reifen induzieren, ist in der DE 199 57 388A beschrieben. Matrixmoleküle diffundieren im Gewebe nicht, daher sind sie als demotaktische Faktoren nur bedingt geeignet. Einige der sezernierten Proteine haften an Matrixproteinen, was wiederum ihre Bewegungsfreiheit emschränkt. Sie haben jedoch auch einen differenzierenden Effekt. Erfolgt die Differenzierung zu früh, wird das Gewebe nicht am gewünschten Ort gebildet. Weiterhin ist keine Entkopplung von Rekrutierung und Differenzierung möglich. Die Wahl des chemotaktischen Faktors bestimmt auch den Differenzierungsvorgang. Die bislang angewandten Verfahren erfordern daher zunächst die Gewinnung von autologen, Gewebe bildenden Zellen, die dem Patienten an dem Ort, an dem neues Gewebe (meist Knorpel oder Knochen) wieder aufgebaut werden soll, implantiert werden müssen. Die Gewinnung auto loger Zellen ist jedoch zeitaufwändig und für den Patienten mindestens mit einer vorgeschalteten Biopsie, wenn nicht einer Operation zur Gewinnung des Zellmaterials verbunden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft in einer ersten Ausf hrungsform die Verwendung eines Chemokins und/oder einer ein Chemokin kodierenden Nucleinsäure zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung. Vorzugsweise ist die pharmazeutische Zubereitung zur Rekrutierung mesenchymaler, vorzugsweise ortständiger mesenchymaler Vorläuferzellen vorzugsweise aus dem Knochenmark zum Gewebsaufbau bestimmt.
In einer zweiten alternativen Ausfuhrungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines Chemokins und/oder einer ein Chemokin kodierenden Nucleinsäure zur Rekrutierung mesenchymaler, vorzugsweise ortsständiger mesenchymaler Vorläuferzellen aus dem Knochenmark in vitro.
Vorzugsweise ist das Chemokin ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus CCL19, CCL21, CCL27, CCL28, CCL20, CXCL9, CXCLIO, CXCLl l, CXCL16, CXCL13, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CXCL12, CCL2, CCL8, CCL13, CCL25, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL14, CCL15, CCL16, CCL23, CX3CL1, XCL1, XCL2, CCL1, CCL17, CCL22, CCL11, CCL24, CCL26, CXCLl, CXCL2, CXCL3, und CXCL7, stärker bevorzugt aus der Gruppe, bestehend aus CCL19, CCL21, CCL27, CCL28, CCL20, CXCL9, CXCLIO, CXCLll, CXCL16, CXCL13, und CXCL5, CXCL6, CXCL8, CXCL12, CCL2, CCL8, CCL13 und CCL25, am meisten bevorzugt aus der Gruppe, bestehend aus CCL19, CCL21, CCL27, CCL28, CCL20, CXCL9, CXCLIO, und CXCLll. Es kann ein Chemokin oder eine Mischung von Chemokinen verwendet werden. Alternativ kann ein Chemokin-Fragment oder ein Chemokin-Derivat verwendet werden, das die Fähigkeit hat, an einen Chemokinrezeptor zu binden. In jedem Falle kann es sich um ein natürliches oder synthetisches Chemokin handelt.
Die ein Chemokin kodierende Nucleinsäure kann in Form von RNA, DNA, cDNA, oder ssDNA vorliegen und kann natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein.
Vorzugsweise liegt die pharmazeutische Zubereitung in einer zur Injektion geeigneten Form vor. Sie kann zusätzlich enthalten: einen oder mehrere geeignete Hilfsstoffe; ein oder mehrere biologisch abbaubaren Polymeren; mindestens einen aktiven Wirkstoff, ausgewählt unter Differenzierungs- und Wachstumsfaktoren sowie Mischungen davon, wobei die Differenzierungs- und Wachstumsfaktoren vorzugsweise die Chondrogenese oder die Osteogenese induzieren, und Mischungen von 2 oder mehr derselben.
In einer dritten Ausfuhrungsform betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zubereitung, enthaltend ein wie oben definiertes Chemokin.
In einer vierten Ausfuhrungsform betrifft die Erfindung schließlich eine pharmazeutische Zubereitung, enthaltend eine wie oben definierte Nucleinsäure.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Abbildung 1 : Nachweis der Expression der Chemokinrezeptoren in humanen mesenchyma- len Stammzellen mittels RT-PCR.
Abbildung 2: Nachweis der dosisabhängigen Stammzellwanderung als Reaktion auf CXCLl 2. Genaue Beschreibung der Erfindung
Erfindungsgemäß können Proteine der Familie der Chemokine zur Rekrutierung von mesen- chymalen Vorläuferzellen, insbesondere mesenchymalen Stammzellen beispielsweise aus dem Knochenmark verwendet werden, wobei die Rekrutierung in vivo und in vitro erfolgen kann. Therapeutisch kann die Rekrutierung bei der Heilung von Gewebsdefekten, insbesondere pathogenetisch und/oder traumatisch und/oder altersbedingten Knorpeldefekten, Knorpelläsionen, Knochendefekten und -brächen genutzt werden.
Das oder die Chemokine werden an einem bestimmten Ort zur Verfügung gestellt. Von hieraus baut sich aufgrund der Diffusion ein Konzentrationsgradient auf. Aufgrund dieses Konzentrationsgradienten werden die mesenchymalen Zellen an den jeweiligen Ort gelenkt, was als Rekrutierung bezeichnet wird. Der entsprechende Reiz an die Zellen wird durch Bindung der Chemokine an spezifische Chemokinrezeptoren vermittelt.
Die vorliegende Erfindung baut auf der Erkenntnis auf, dass humane oder tierische mesenchymalen Vorläufer- und Stammzellen über entsprechende Rezeptoren verfugen. Die Expression bzw. das Vorhandensein dieser Rezeptoren in humanen oder tierischen mesenchymalen Vorläufer- und Stammzellen ist in der wissenschaftlichen Literatur bisher nicht beschrieben und wird hierin belegt.
Ohne hieran gebunden sein zu wollen, wird davon ausgegangen, dass die mesenchymalen Vorläufer- und Stammzellen eben aufgrund der Expression dieser Rezeptoren auf Chemokine reagieren und somit aufgrund des Chemokinsignals wandern können. Das Ansprechverhalten und die Wanderungsgeschwindigkeit hängen dabei vermutlich von der Expressionshöhe des Rezeptors auf der jeweiligen Zelle ab. Die Liganden der am höchsten exprimierten Rezeptoren sind somit vermutlich diejenigen Chemokine, auf eiche die mesenchymalen Vorläuferund Stammzellen am stärksten ansprechen.
Mit abnehmendem Expressionsniveau sinkt die Wahrscheinlichkeit, daß die Zellen auf die dem Chemokinrezeptor korrespondierenden Chemokine chemotaktisch reagieren und wandern. Die Wanderungseigenschaften der Vorläufer- und Stammzellen und das „Anlock"- Potential der Chemokine wird erfindungsgemäß genutzt, um in situ mesenchymale, vorzugsweise sogar ortsständige Vorläufer- und Stammzellen zu einem bestimmten Ort, beispielsweise einem Defektort (z.B. einer Knorpelläsion) zu rekrutieren.
Chemokine sind Proteine (5-20 kDa), die eine wichtige physiologische Rolle bei einer Vielzahl von Prozessen wie der Hämatopoiese von Blutstammzellen und der Chemotaxis von Leukozyten spielen. Unter Chemotaxis wird die durch einen chemischen Reiz ausgelöste positive oder negative, in Richtung auf den Reiz hin bzw. von ihm fort erfolgende Bewegungsreaktion beweglicher Organismen oder Zellen, deren Zellmembran durch entsprechende "chemotaktische Stoffe" (Chemokine, Chemotaxine) aktiviert wird, verstanden. Diese Aktivierung wird durch einen korrespondierenden Zeiloberflächenrezeptor (Chemokinrezeptor) vermittelt, an den das Chemokin bindet. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die zielgerichtet auf einen Defektort hin ausgelöste Chemotaxis bestimmter Zielzellen auch als "Rekrutierung" bezeichnet.
Die Aminosäuresequenzen aller Chemokine sind ähnlich und durch eine unveränderliche Anordnung von vier Cysteinen gekennzeichnet. Je nach Lage der ersten zwei Cysteine wird die Chemokmfamihe in vier Subfamilien unterteilt: CC-, CXC-, CX C- und C-Chemokine, wobei die Vertreter der C-Subfamilie nur zwei Cysteine aufweisen (siehe Tabelle 1 unten). Eine detailliertere Darstellung findet sich in Murphy et al. (2000) „International union of pharma- ' cology. XXII. Nomenclature of chemokine receptors." Pharmacol Rev 52 : 145-176, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. Im Folgenden wird zur Bezeichnung von bevorzugten, erfindungsgemäß zu verwendenden Chemokinen die von Murphy et al. dargestellte Nomenklatur herangezogen. Die Chemokine selbst werden als CCL, CXCL, CX3CL und XCL bezeichnet. Dabei steht "L" für Ligand. Neben den Nomenklaturnamen werden in der Literatur häufig auch Trivialnamen benutzt.
Die Chemokine und ihre Rezeptoren werden von einer großen Zahl hämatopoietischer und nicht hämatopoietischer Zellen exprimiert. Die Chemokinaktivität wird durch die Bindung an einen spezifischen G-Protein gekoppelten Rezeptor initiiert. Obwohl die meisten Untersuchungen bezüglich der Wirkungsweise von Chemokinen bisher an Leukozyten durchgeführt wurden, erstreckt sich ihre Funktion weit über die Leukozytenphysiologie. Chemokinrezeptoren sind klassifiziert als Rezeptoren für CCL, CXCL, CX3CL und XCL und werden systematisch mit CCR, CXCR, CX3CR und XCR bezeichnet („R" steht für Rezeptor) (siehe Tabelle 1 unten). Einige von ihnen können mehrere Chemokine einer Subfamilie binden. Die Aminosäuresequenzen der Chemokinrezeptoren sind untereinander zu 25-80% identisch und zu 25%o identisch mit vielen anderen G-Protein gekoppelten Rezeptoren [Murphy et al. (2000) „ International union of phatmacology. XXII. Nomenclature of chemokine receptors." Pharmacol Rev 52 -.145-176].
Der N-Terminus befindet sich auf der extrazellulären Seite der Membran und ist meistens glykolysiert, während sich der C-Terminus auf der zytoplasmatischen Seite befindet und phosphoryliert ist. Drei extrazelluläre Schleifen wechseln sich mit drei intrazellulären ab und verbinden sieben hydrophobe transmembrane Domänen. Ein Zweistufenmodel für die Rezeptoraktivierung wurde entwickelt: Die Chemokmbindung an den Rezeptor führt zuerst zu einer Konformationsänderung des Chemokins und daraufhin folgt die Aktivierung des Rezeptors durch den N-Terminus des Chemokins. Dabei wird an die α-Untereinheit des G- Proteins gebundenes GDP durch GTP ausgetauscht. Das G-Protein dissoziiert vom Rezeptor ab und löst im zytoplasmatischen Raum eine Kaskade biochemischer Reaktionen aus.
CC- und CXC-Rezeptoren wurden bei Monozyten, Lymphozyten, basophilen und eosino- philen Granulozyten sowie Chondrozyten nachgewiesen. Zur CC-Chemokinrezeptorfamilie gehören elf CC-Rezeptoren (CCR1-CCR11). Sie weisen sieben charakteristische Sequenzab- schnitte auf, die sie von den 6 Rezeptoren der CXCR-Familie (CXCR1-CXCR6) unterscheiden.
Tabelle 1 : Humane Chemokinrezeptoren und ihre Liganden
Figure imgf000009_0001
Die Erfinder haben in ihren Untersuchungen eine Abstufung der Expression der verschiedenen Chemokinrezeptoren auf mesenchymalen Zellen festgestellt. In der unten gegebenen Tabelle 3 ist diese Abstufung dargestellt. Hieraus ergibt sich wiederum der bevorzugte Einsatz der an die am häufigsten exprimierten Rezeptoren bindenden Chemokine im Rahmen der erfindungs gemäßen Verwendung.
Bevorzugt verwendet man die Chemokine der Nummern 1-39, vorzugsweise der Nummern 1- 18, und besonders bevorzugt der Nummern 1-8 aus Tabelle 4. Diese können in Form der Chemokine, von deren Fragmenten und oder Derivaten aber auch in Form von einer ein Chemokin kodierenden Nucleinsäure (beispielsweise DNA, cDNA, RNA, ssDNA) verwendet werden. Unter einem Fragment eines Chemokins wird erfindungsgemäß ein Peptid verstanden, das eine Teilsequenz der Aminosäuresequenz des Chemokins umfasst. Unter einem Derivat eines Chemokins wird erfindungsgemäß ein Peptid oder Protein verstanden mit einer Aminosäuresequenz, die sich durch Deletion, Substitution, Addition oder Punktmutation von der Aminosäuresequenz eines Chemokins ableitet. Wesentlich für geeignete Fragmente und/oder Derivate ist der Erhalt der Bindungsfähigkeit an den Chemokinrezeptor sowie vorzugsweise auch der Bindungsspezifizität.
Zur diagnostischen und/oder therapeutischen Verwendung wird eine das Chemokin und/ oder eine das Chemokin kodierende Nucleinsäure enthaltende pharmazeutische Zubereitung nach herkömmlichen Verfahren hergestellt. Vorzugsweise ist die pharmazeutische Zubereitung zur Injektion bestimmt. Geeignete Verfahren zur Herstellung von Proteinen und Nucleinsäuren enthaltenden pharmazeutischen Zubereitungen sowie hierfür geeignete Hilfsstoffe sind bekannt und sollen hier nicht beschrieben werden. Das Design einer solchen Zubereitung liegt im Können des Fachmanns. Geeignet sind beispielsweise Injektionslösungen, Fibrinkleber, Substrate zu Transplantation, Matrices, Gewebe-Patches oder Nahtmaterialien.
Die Zubereitung wird nun zur Anwendung in den Gewebsdefekt wie einen Knochen- oder Knorpeldefekt eingebracht vorzugsweise mittels Injektion, eines Fibrinklebers, eines Substrats, emer Matrix oder eines Patches. Geeignete Substrate sind beispielsweise aus der DE 199 57 388 bekannt, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Zur Anlockung von mesenchymalen Vorläufer- und/oder Stammzellen kann eine Verbindung zum Knochenmarksraum geschaffen werden. Nach Einwanderung der mesenchymalen Zellen in den Knochen- oder Knorpeldefekt bauen diese Zellen im Defekt ein den Defekt ausfüllendes und stabilisierendes Regeneratgewebe auf. Durch Zumischen von die Osteogenese oder Chondroge- nese fördernden Wachstums- und Differenzierungsfaktoren kann der Aufbau des knöchernen oder knorpeligen Regeneratgewebes unterstützt werden.
Die Erfindung betrifft somit bevorzugt die Verwendung von Chemokinen zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen zum Rekrutieren von ortsständigen mesenchymalen Vorläuferzellen aus dem Knochenmark zur Regeneration von krankhaften oder traumatischen Gelenkdefekten, vorwiegend bei Arthrose. Mesenchymale Vorläuferzellen und Stammzellen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Zellen, welche die Eigenschaft besitzen, sich in ein oder auch mehrere mesenchymale Gewebe zu entwickeln. Als Beispiele sein genannt: Knorpel mit Chondrocyten, Knochen mit Oste- ocyten, Sehnen mit Tenocyten, Bänder mit Tenocyten, Herzmuskel mit Cardiomyocyten, Bindegewebe mit Fibroblasten, fibröses Gewebe mit fibroblastoiden Zellen, neuronales Gewebe mit Astrozyten und Neuronen. Es kann sich bei den Vorläuferzellen also um Vorläuferzellen von Chondrozyten, Osteocyten, Tenocyten, Cardiomyocyten, Fibroblasten, fibroblasti- sche Zellen, Astrozyten oder Neurone handeln. Beispielsweise kann es sich also bei den Vorläuferzellen um Vorläuferzellen/Stammzellen von Knorpelzellen handeln, die sich ausschließlich zu Knorpelzellen entwickeln, oder auch um Vorläuferzellen, die die Fähigkeit besitzen, sich in Knorpel- und Knochenzellen zu entwickeln, oder auch um Vorläuferzellen, die die Fähigkeit besitzen, sich in ausschließlich in Knochenzellen zu entwickeln.
Während der Anwendung werden die mesenchymalen Vorläuferzellen durch die in der Zubereitung enthaltenen Chemokine aus dem umliegenden gelenksnahen Gewebe, bevorzugt aus dem Knochenmark, "angelockt" und zum Defektort dirigiert. Dort verbleiben die mesenchymalen Vorläuferzellen und bilden im Knochendefekt ein knöchernes und im Knorpeldefekt ein knorpeliges Regeneratgewebe aus. Ein ähnliches Anlocken kann selbstredend auch in vitro zur Kultivierung entsprechender Zellen bspw. aus Biopsien genutzt werden.
Die Erfindung betrifft in einer bevorzugten Ausführungsform die Verwendung von Chemokinen zum Rekrutieren von mesenchymalen Stammzellen. Mesenchymale Stammzellen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind mesenchymale Vorläuferzellen, welche die Fähigkeit besitzen sich in mehrere, wenigstens in zwei verschiedene mesenchymale Gewebe zu entwickeln.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Chemokinen zum Rekrutieren von mesenchymalen Vorläufer- oder Stammzellen aus dem Knochenmark. Hierzu werden arthroskopisch kleine Kanäle vom Defektort des Knorpels in das dem Knorpel unterliegende Knochengewebe gebohrt, so daß eine Verbindung zwischen Defektort und Knochenmark entsteht. Das Einbringen von Chemokinen in den De- fekt sorgt für ein Anlocken von mesenchymalen Vorläufer- oder Stammzellen, welche sich im Defekt ansiedeln und dort ein den Defekt verschließendes Regeneratgewebe ausbilden.
Alternativ kann die Verwendung von ein Chemokin kodierenden Nucleinsäuren vorgesehen sein. Vorteilhaft ist hier das Einbringen von RNA, DNA, cDNA oder ssDNA, welche von ortsständigen Zellen aufgenommen, abgelesen und als reifes Protein ausgeschüttet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform werden die zur Rekrutierung von mesenchymalen Vorläuferzellen verwendeten Chemokine mit biologisch abbaubaren Polymeren oder Biomaterialien gemischt. Biologisch abbaubare Polymere im Sinne der Erfindung sind diejenigen, vorzugsweise drei-dimensionalen Polymerstrukturen, welche auf Zellen keine toxischen Einflüsse ausüben, keine Immunreaktion hervorrufen und den Gewebeaufbau von Knorpel oder Knochen fördern. Das Einbringen von biologisch äbbaubaren Polymeren mit Chemokinen in den zu schließenden Defekt führt zum Anlocken von mesenchymalen Vorläuferzellen, welche direkt in das Polymergewebe einwandern und dort eine drei-dimensionale Polymerstruktur zur optimalen Gewebereifung in Knorpel oder Knochen vorfinden. Beispiele für solche Polymere oder Biomaterialien sind Polylactid, Polyglycolid, Poly(lactid-glycolid), Polylysin, Polycaprolacton, Alginat, Agarose, Fibrin, Hyaluronsäure, Polysaccharide, Cellu- lose, Kollagene und Hydroxylappatit.
Die Chemokine können auch gemeinsam mit Wachstums- und Differenzierungsfaktoren in derselben (oder auch in getrennten Zubereitungen verabreicht) verwendet werden. Ganz besonders bevorzugt ist die gemeinsame Verwendung von Chemokin, Polymer und Wachstumsund Differenzierungsfaktoren. Das Einbringen solch eines Gemisches in den Defekt birgt den Vorteil, daß die angelockten mesenchymalen Vorläuferzellen neben der optimalen, die Gewebereifung bereits fördernden Polymerstruktur noch zusätzlich durch Wachstums- und Differenzierungsfaktoren zur Gewebereifung angeregt werden.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Chemokinen zusammen mit Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, die die Knorpelreifung induzieren. Die Knorpelreifung induzierende Faktoren im Sinne der hier vorliegenden Erfindung sind Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, die entwicklungsbiologisch eine Vorläuferzelle zur Differenzierung und Reifung in einen chondrozytären Zelltyp oder eine reife Knorpelzelle zur Produktion von Knorpelmatrix anregen. Vorteilhaft ist hierbei die Verwendung von Mitgliedern der Familie der cartilage derived morphogenetic proteins (CDMP) und bone morphogenetic porteins (BMP), aber auch von Insulin.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Chemokinen zusammen mit Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, die die Knochenreifung induzieren. Die Knochenreifung induzierende Faktoren im Sinne der hier vorliegenden Erfindung sind Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, die entwicklungsbiologisch eine Vorläuferzelle zur Differenzierung und Reifung in einen knöchernen Zelltyp oder eine reife Knochenzelle zur Produktion von Knochenmatrix anregen. Vorteilhaft ist hierbei die Verwendung von Mitgliedern der Familie der bone morphogenetic porteins (BMP), besonders bevorzugt die Mitglieder BMP -2 und BMP-7.
Die Erfindung soll anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht werden. Diese sollen jedoch die Erfindung nicht einschränken.
Beispiele
Beispiel 1
Isolierung und Kultivierung humaner mesenchymaler Stammzellen
Die Isolierung humaner mesenchymaler Stammzellen (MSC) wurde nach einem bereits beschriebenen Protokoll zur Gewinnung von MSC aus dem Knochenmark wie folgt durchgeführt:
Maximal 3 ml l^ochenmarkspunktat werden mit 10 ml PBS gemischt und für 10 Min. und 310 g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das Zellpellet wird resuspendiert und erneut mit PBS (8000mg/l NaCl, 200mg/l KCl, 1150mg/l Na2HPO4, 200mg/l KH2PO4) gewaschen. Die Zellen werden in 20 ml DME-Medium (mit 10-20% FBS, 2% HEPES, 4 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin) aufgenommen. Je 5 ml dieser Zellsuspension werden auf 20 ml eines Percoll-Dichtegradienten der Dichte 1,073 g/ml gegeben. Die Zellen werden bei 900 g für 32 Min. zentrifugiert. Die obere Phase wird in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt. Nach Zugabe des 2,5- fachen Volumens PBS erfolgt erneut eine Zentrifugation bei 310 g für 6 Minuten. Das Zellpellet wird in DME-Medium aufgenommen.
1,5*105-3,5*105 Zellen cm2 werden zur Kultur in eine Zellkulturflasche geben und bei 37°C, 5% CO2 in DME-Medium (Biochrom AG, Berlin, Katalog Nr. FG0415, Dulbeccos Modifiziertes Eagle Medium mit 3,7g/l NaHCO3, l,0g/L D-Glucose) inkubiert. Der erste Mediumwechsel erfolgt nach 72 Stunden, dann alle 3-4 Tage. Die so isolierten Zellen wachsen nach 2- 3 Wochen konfluent und werden dann mittels Trypsinieren in einer Zelldichte von 6.000 Zellen/cm2 Kulturoberfläche in ein neues Kulturgefäß überführt (Passage 1). Nach circa einer Woche werden die Zellen erneut trypsinisiert (Passage 2).
Die Homogenität der erhaltenen Kultur humaner mesenchymaler Stammzellen wird mittels FACS-Analyse verifiziert, wobei die Oberflächenantigene Endoglin und ALCAM nachzuweisen und die Oberflächenantigene CD34, CD 45 und CD 14 nicht nachzuweisen sind. Dies wurde bestätigt.
Beispiel 2
Genexpressionsanalyse zum Nachweis der Chemokinrezeptoren
Die isolierten, expandierten und überprüften humanen mesenchymalen Stammzellen expri- mieren Chemokinrezeptoren. Dies wurde mittels RT-PCR bei mehreren humanen Patienten (n=3) wie folgt nachgewiesen:
a. Isolation der Gesamt-RNA
Für das Isolieren der Gesamt-RNA wird Tri Reagent LS™ eingesetzt. Die MSC werden bis zur Konfluenz kultiviert. Nach Verwerfen des Zellkulturmediums wird zur Lyse der Zellen der Zellrasen mit 0,4 ml Tri Reagent LS™ pro 10 cm2 Wachstumsfläche überschichtet. Das Lysat wird in ein steriles Reaktionsgefäß überführt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Das Lysat wird mit 0,1 ml Brom-Chlor-Propan (BCP) pro 0,75 ml Tri Rea-. gent LS™ versetzt, für 15 Sekunden geschüttelt und für 10 Minuten bei RT inkubiert. Eine anschließende Zentrifugation für 15 Minuten bei 4°C und 12000 g führt zur Phasentrennung. Die wässrige Phase ist in 200 μl Aliquots abzunehmen und in ein Reaktionsgefäß zu überführen. Die RNA-Lösung wird mit 0,5 ml Isopropanol pro 0,75 ml Tri Reagent LS™ versetzt und für mindestens 7 Minuten bei -20°C belassen. Die gefällte RNA wird durch Zentrifugation für 8 Minuten bei 4°C und 12000 g pelletiert. Das resultierende RNA-Pellet ist mit 70% EtOH zu waschen, an der Luft zu trocknen und in 20 μl DEPC-H2O aufzunehmen. Zur Lösung des Pellets wir es für 10 Minuten auf 55°C erhitzt. Der Gehalt an isolierter Gesamt- RNA wird durch eine photometrische Messung bestimmt.
b. cDNA-Svnthese:
Zur cDNA-Synthese werden 5 μg Gesamt-RNA in 10 μl DEPC-H2O eingesetzt und mit 1 μl Oligo-(dT)12-18 Primern (je einem upper und einem lower Primer wie in Tabelle 2 angegeben) versetzt, um für 10 Min. bei 70°C denaturiert zu werden. Nach der Denaturierung wird der Reaktionsansatz auf Eis gelagert und mit 4μl 5x Puffer (0,25 M Tris/HCl, pH 8,3; 0,375 M KCl; 15 mM MgCl2), 2 μl 0,1 M DTT, 1 μl dNTP (je 10 mM) und 0,4 μl RNase Inhibitor versetzt. Nach einer Inkubationszeit von 2 Min. bei 37°C wird der Reaktionsansatz mit 1 μl . SuperScript™ Rerverser Transkriptase versehen, um für weitere 60 Minuten bei 37°C inkubiert zu werden. Nach der Zugabe von 40 μl TE (10/1, pH 7,8) wird das Enzym für 10 Min. bei 92°C inaktiviert. Für die RT-PCR Reaktionen werden 2,0 μl cDNA eingesetzt.
Als Standard werden pro PCR-Reaktion 1 μl cDNA eingesetzt. Zu der cDNA werden in einem PCR-Reaktionsgefäß 2 μl lOx PCR-Puffer, 2 μl 25 mM MgCl2, 0,2 μl 10 M dNTPs, 1 μl 5 nM Primer (Tabelle 2) und 0,5 U Taq DNA Polymerase gegeben und mit H2O auf ein Endvolumen von 20 μl aufgefüllt. Ein Standardreaktionszyklus geht von einer Denaturierung bei 95°C für 1 Min., einer Hybridisierung der Primer bei einer für die Primer spezifischen Temperatur (Taπ) für 15 Sek. und einer DNA-Synthesereaktion bei 72°C für 15 Sek. aus. Dieser Zyklus wird insgesamt 35 mal wiederholt. Abschließend läßt man den Ansatz für 3 Min. bei 72°C. Die PCR-Produkte werden mittels Gelelektrophorese aufgetrennt. Die DNA- Fragmente wurden aus dem Gel eluiert und in den Vektor pGEM-T Easy (Promega) kloniert. Nach Amplifizieren in E. coli wurde das entsprechende Plasmid isoliert und zum Nachweis, daß mittels der in Tabelle 2 verwendeten Oligonukleotide die korrespondierenden Chemokinrezeptoren amplifiziert wurden, sequenziert und durch Vergleich mit der bekannten Sequenz bestätigt. Tabelle 2: Oligonukleotide zum Nachweis der Expression humaner Chemokinrezeptoren
Figure imgf000016_0001
Die für mehrere Patienten (n-3) durchgeführten Expressionsanalysen von humanen mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark im Hinblick auf die Präsenz von humanen Chemokinrezeptoren (Abbildung 1) ergaben eine hohe Expression der Rezeptoren 1-9, eine mittlere Expression der Rezeptoren 10-17 und eine schwache Expression der Rezeptoren 18- 19 (Tabelle 3).
Tabelle 3 : Expression und Expressionsniveau von Chemokinrezeptoren in humanen mesenchymalen Stammzellen
Figure imgf000017_0001
Die differierenden Expressionshöhen legen Nahe, daß hierbei die Liganden der am höchsten exprimierten Rezeptoren diejenigen Chemokine sind, auf eiche die mesenchymalen Stammzellen am Stärksten ansprechen und wandern. Mit abnehmendem Expressionsniveau sinkt die Wahrscheinlichkeit, daß die Stammzellen auf das dem Chemokinrezeptor korrespondierende Chemokine chemotaktisch reagieren und wandern. Hiervon ausgehend ergibt sich, daß sich humane mesenchymale Stammzellen am Stärksten durch Stimulieren mit Chemokin-Nr. 1, abnehmend zu Chemokin-Nr. 39 der Tabelle 4, aktivieren und in situ rekrutieren lassen. Tabelle 4: Chemokine zur in situ Rekrutierung von mesenchymalen Vorläuferzellen
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000018_0002
Beispiel 3
Zur Behandlung einer ausgeprägt arthrotisch deformierten Gelenkoberfläche werden zunächst durch multiple feine Bohrungen (1-2 mm) kleine Verbindungskanäle zwischen dem Knochenmarksraum und der Gelenkshöhle hergestellt. Darauf folgend wird ein wolleartiges Po- lymerkonstrukt (Polyglykolid), kombiniert mit Hyaluronsäure und chemotaktische wirkenden Chemokin (CCL19), mit Fibrin- oder Acrylkleber über die Gelenkfläche geklebt und ange- passt.
Beispiel 4:
Zur Behandlung der Gelenkfläche aus Beispiel 3 mit einer Defektgröße von 6 cm2 wird nach Herstellung der Öffnungen in den Markraum 1.2 ml Fibrinkleber mit 1000 ng Wachstumsfaktor (cartilage derived morphogenetic protein) und 2000 ng Chemokin (CXCL9) in den Knorpeldefekt eingebracht und durch die gleichzeitige Zugabe von 100 μl Thrombin verfestigt.
Beispiel 5
Chemotaktische Aktivität des Chemokins CXCL12 (SDF-lα) auf mesenchymale Stammzellen des Knochenmarks D
Die isolierten, expandierten und überprüften humanen mesenchymalen Stammzellen zeigen eine dosisabhängige chemotaktische Aktivität gegenüber dem Chemokin CXCL12 (SDF-lα). Dies wurde mittels eines 96-Multiwell Chemotaxis Tests nachgewiesen. Die hierin verwendeten 96-Multiwell Chemotaxis Platten bestehen aus einem oberen und einem unteren Teil einer Vertiefung (Well), die durch eine permeable Polycarbonatmembran (Porendurchmesser 8μm) getrennt werden. Das im unteren Teil eingebrachte CXCLl 2 erzeugt über die Membran einen Konzentrationsgradienten, aktivierte Zellen aus dem oberen Teil der Vertiefung bzw. des Wells migrieren in die Membran und in den unteren Teil der Vertiefung (des Wells). Der Nachweis erfolgt wie folgt:
Die Zellen werden zunächst in normalem DMEM Kulturmedium kultiviert. Etwa 22 Stunden vor dem Test wird das Kulturmedium entfernt, die Zellen mit PBS gewaschen und bis zum Test in serumfreiem Diätmedium (DME-Medium, enthält 1,0 g/1 Glucose, 0,2% bovines Serumalbumin, 2 mM L-Glütamin; 100 U/ml Penicillin; 100 μg/ml Streptomycin) gehalten. Direkt vor Beginn des Tests werden die Zellen trypsiniert, die Zellzahl und Vitalität bestimmt und erneut in Diätmedium aufgenommen. Es werden 3xl04 Zellen in 40 μl Diätmedium pro oberer Vertiefung (oberem Well) einer 96-Wellplatte eingesetzt.
Zur Bestimmung der dosisabhängigen chemotaktischen Aktivität von CXCL12 (SDF-IGI) wird dies in verschiedenen Konzentrationen (1-500 nM) zum Diätmedium gegeben und 35 μl dieses Mediums als Triplet in das untere Well gegeben. Als Kontrollansätze werden zum einen 3xl04 Zellen in 40 μl Diätmedium pro oberen Well und 30 μl serumhaltiges Kulturmedium ohne Chemokin im unteren Well (Positivkontrolle) und zum anderen 3x104 Zellen in 40 μl Diätmedium pro oberen Well und 30 μl Diätmedium ohne Chemokin im unteren Well (Negativkontrolle) eingesetzt. Die 96-Well Chemotaxis Platten werden für 20 Stunden bei 37°C unter 5% CO2 Atmosphäre inkubiert. Die Oberseite des Filters (nicht migrierte Seite) wird abgewischt, um die nicht migrierten Zellen zu entfernen. Die Zellen auf der Unterseite des Filters (migrierte Zellen) werden für 3 min. mit eiskaltem Ethanol/Aceton (1:1 v/v) fixiert und mit dem Schnellfärbesystem Hemacolor® der Firma Merck angefärbt. Die Membran wird feucht gehalten und drei repräsentative Fotofelder pro Well ausgezählt. Vorher wird bei geringerer Vergrößerung die Verteilung der Zellen in dem jeweiligen Well beurteilt.
Diese Untersuchungen von humanen mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark im Hinblick auf die chemotaktische Aktivität von CXCL12 (SDF-lα) ergaben als einen dosisabhängigen Effekt dieses Chemokins auf humane mesenchymalen Stammzellen . Dies ist in Fig. 2 gezeigt. Die höchste gemessene Antwort der Zellen wurde bei einer Konzentration von etwa 500 nM gemessen. Ab einer Konzentration von etwas unter 100 nM entspricht die Zahl gewanderter Zellen etwa der Zahl in der Negativkontrolle gewanderter Zellen. Dies belegt die erfindungsgemäße Rekrutierungswirkung von Chemokinen auf mesenchymale Vorläuferzellen des Knochenmarks in signifikanter Weise.

Claims

Patentansprüche:
1. Verwendung eines Chemokins und/oder einer ein Chemokin kodierenden Nucleinsäure zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung.
2. Verwendung nach Anspruch 1, worin die pharmazeutische Zubereitung zur Rekrutierung mesenchymaler, vorzugsweise ortsständiger mesenchymaler Vorläuferzellen und oder Stammzellen zum Gewebsaufbau bestimmt ist.
3. Verwendung eines Chemokins und/oder einer ein Chemokin kodierenden Nucleinsäure zur Rekrutierung mesenchymaler, vorzugsweise ortsständiger mesenchymaler Vorläuferzellen und/oder Stammzellen in vitro.
4. Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin das Chemokin ausgewählt ist aus der, Gruppe, bestehend aus CCL19, CCL21, CCL27, CCL28, CCL20, CXCL9, CXCLIO, CXCLl l, CXCL16, CXCL13, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CXCL12, CCL2, CCL8, CCL13, CCL25, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL14, CCL15, CCL16, CCL23, CX3CL1, XCL1, XCL2, CCL1, CCL17, CCL22, CCL11, CCL24, CCL26, CXCLl, CXCL2, CXCL3 und CXCL7.
5. Verwendung nach Anspruch 4, worin das Chemokin ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus CCL19, CCL21, CCL27, CCL28, CCL20, CXCL9, CXCLIO, CXCLll, CXCL16, CXCL13, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CXCL12, CCL2, CCL8, CCL13 und CCL25.
6. Verwendung nach Anspruch 5, worin das Chemokin ausgewählt ist aus der Gruppe, • bestehend aus CCL19, CCL21, CCL27, CCL28, CCL20, CXCL9, CXCLIO und CXCLll.
7. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin eine Mischung von Chemokinen verwendet wird.
8. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin ein Chemokin-Fragment oder ein Chemokin-Derivat verwendet wird, das die Fähigkeit hat, an einen Chemokinrezeptor zu binden.
9. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin es sich um ein natürliches oder synthetisches Chemokin handelt.
10. Verwendung nach Anspruch 1, worin die ein Chemokin kodierende Nucleinsäure in Form von RNA, DNA, cDNA, oder ssDNA.
11. Verwendung nach Anspruch 1 , worin die ein Chemokin kodierende Nucleinsäure natürlichen oder synthetischen Ursprungs ist.
12. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die mesenchymalen Vorläuferzellen mesenchymale Stammzellen sind, die vorzugsweise aus dem Knochenmark rekrutiert werden.
13. Verwendung nach Anspruch 1 , worin die pharmazeutische Zubereitung in einer zur Inj ektion geeigneten Form vorliegt.
14. Verwendung nach Anspruch 13, worin die pharmazeutische Zubereitung zusätzlich enthält: einen oder mehrere geeignete Hilfsstoffe, ein oder mehrere biologisch abbaubare Polymere, - mindestens einen aktiven Wirkstoff, ausgewählt unter Differenzierungs- und Wachstumsfaktoren sowie Mischungen davon, und Mischungen von 2 oder mehr derselben.
15. Verwendung nach Anspruch 3 in Kombination mit einem aktiven Wirkstoff, ausgewählt unter Differenzierungs- und Wachstumsfaktoren sowie Mischungen davon.
16. Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, wobei die Differenzierungs- und Wachstumsfaktoren die Chondrogenese oder die Osteogenese induzieren.
17. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend ein wie in einem der Ansprüche 4 bis 9 definiertes Chemokin.
18. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend eine wie in einem der Ansprüche 10 oder 11 definierte Nucleinsäure.
19. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 17 oder 18, die zusätzlich enthält: einen oder mehrere geeignete Hilfsstoffe, ein oder mehrere biologisch abbaubare Polymere, - mindestens einen aktiven Wirkstoff, ausgewählt unter Differenzierungs- und Wachstumsfaktoren sowie Mischungen davon, und Mischungen von 2 oder mehr derselben.
20. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 17 oder 18, die vorliegt in Form einer Injektionslösung, Fibrinkleber, eines Substrates zur Transplantation, einer Matrix, eines Gewebe-Patches oder Nahtmaterial.
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