WO2005003355A1 - Verfahren zum identifizieren von fungizid wirksamen verbindungen basierend auf mevalonat kinasen aus pilzen - Google Patents

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WO2005003355A1
WO2005003355A1 PCT/EP2004/006766 EP2004006766W WO2005003355A1 WO 2005003355 A1 WO2005003355 A1 WO 2005003355A1 EP 2004006766 W EP2004006766 W EP 2004006766W WO 2005003355 A1 WO2005003355 A1 WO 2005003355A1
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WO
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mevalonate kinase
mevalonate
polypeptide
kinase
activity
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PCT/EP2004/006766
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Rüdiger SUELMANN
Edda Koopmann
Axel Trautwein
Karl-Heinz Kuck
Martin Adamczewski
Bernhard Grimmig
Rolf Kirsten
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Bayer Cropscience Aktiengesellschaft
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase

Definitions

  • the invention relates to a method for identifying fungicides, the use of mevalonate kinase to identify fungicides, and the use of inhibitors of mevalonate kinase as fungicides.
  • fungicides which are then used in the HTS process mentioned. are often sought in essential biosynthetic pathways.
  • Ideal fungicides continue to be those substances that inhibit gene products that are of crucial importance in the expression of the pathogenicity of a fungus.
  • the object of the present invention was therefore to identify a suitable new point of attack for potential fungicidal active substances and to make them accessible, and to provide a method based thereon which enables the identification of modulators of this point of attack, preferably in a high-throughput method, in order to enable the identification to enable new fungicides.
  • Figure 1 Schematic representation of the reaction catalyzed by the mevalonate kinase.
  • the mevalonate kinase catalyzes the reaction of (R) -evalonate and adenosine triphosphate to (R) -5-phosphomevalonate and adenosine diphosphate.
  • Figure 2 Homology between Mevalonate kinases from different fungi. (1) Saccharomycs cerevisiae, (2) Schizosaccharomyces pombe, (3) Ustilago maydis, (4) Neurospora crassa, (5) Magnaporthe grisea. Frames represent areas with a precisely matching sequence (consensus sequence).
  • FIG. 3 SDS gel to show the course of the heterologous expression of the Mevalonat kinase in E. coli BL21 (DB3V)
  • the overexpressed GST fusion protein has a size of 74.5 kDa. Size standards were applied in lanes M. Lane 1: Pellet fraction; lane 2: cytoplasm fraction of the overexpressed mevalonate kinase (3 hours after induction with 100mM IPTG at 30 ° C); lane 3: wash fraction after application of the cytoplasm fraction to the glutathione-Sepharose column; lane 4: elution fraction with purified mevalonate kinase.
  • Figure 4 Kinetics of the conversion of mevalonate and adenosine triphosphate at different concentrations of mevalonate kinase in the assay.
  • an assay volume of 50 ⁇ l 300 ⁇ M adenosine triphosphate, 500 ⁇ M mevalonate, 300 ⁇ M NADH, 400 ⁇ M phosphoenolpyruvate, 0.2 U pyruvate kinase and 0.4 U lactate dehydrogenase as well as different amounts of mevalonate kinase were used.
  • the protein concentrations of the mevalonate kinase used can be seen in the figure.
  • the implementation of the mevalonate was monitored using the coupled reaction with pyruvate kinase and lactate dehydrogenase.
  • the implementation of the ATP by means of mevalonate is followed by the coupled decrease in absorption at 340 nm (decrease in the NADH in a coupled reaction).
  • SEQ ED NO: 1 nucleic acid sequence coding for the mevalonate kinase from Ustilago maydis. The sequence given corresponds to the genomic DNA.
  • identity is to be understood as the number of matching amino acids (identity) with other proteins, expressed in percent.
  • the identity is preferably determined by comparing a given sequence to other proteins with the aid of computer programs. If sequences which are compared with one another have different lengths, the identity is to be determined in such a way that the number of amino acids which the shorter sequence has in common with the longer sequence determines the percentage of identity.
  • identity can be determined by means of known computer programs which are available to the public, such as, for example, ClustalW (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680).
  • ClustalW is made publicly available, for example, by Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) and Toby Gibson (Gibson @ - EMBL-Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory. Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Germany.
  • ClustalW can also be accessed from various websites, including the IGBMC (Institut de Gen ⁇ tique et de Biologie Moleisme et Cellulaire, BP163, 67404 Illkirch Cedex, France; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) and the EBI ( ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) as well as on all mirrored internet pages of the EBI (European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK).
  • sequence database searches One way to find similar sequences is to perform sequence database searches. Here, one or more sequences are specified as a so-called query. This query sequence is then compared by means of statistical computer programs with sequences that are contained in the selected databases. Such database queries (“blast searches”) are known to the person skilled in the art and can be carried out at various providers.
  • a protein according to the invention should therefore be understood in connection with the present invention to mean those proteins which, when using at least one of the above-described Above methods for identity determination have an identity of at least 50%, preferably of at least 60%, particularly preferably of at least 70%, more preferably of at least 80%, and in particular of at least 90%.
  • complete mevalonate kinase describes a mevalonate kinase encoded by a complete coding region of a transcription unit, comprising the ATG start codon and all information-bearing exon regions of the gene coding for mevalonate kinase present in the organism of origin, and the signals necessary for a correct termination of the transcription.
  • enzyme activity of a mevalonate kinase refers to the ability of a polypeptide to carry out the reaction described above, i.e. to catalyze the conversion of mevalonate and adenosine triphosphate to phosphomevalonate and adenosine diphosphate.
  • the reaction described here represents the reaction which is primarily catalyzed by the polypeptide.
  • active fragment no longer describes complete nucleic acids coding for mevalonate kinase, but which still code for polypeptides with the enzymatic activity of a mevalonate kinase and which are a reaction characteristic of the mevalonate kinase as described above can catalyze. Such fragments are shorter than the complete nucleic acids encoding the mevalonate kinase described above. Nucleic acids may have been removed at both the 3 'and / or 5' ends of the sequence, but parts of the sequence can also be deleted, i.e. that have not significantly affected the biological activity of the mevalonate kinase.
  • a lower or possibly also an increased activity, which, however, still allows the characterization or use of the resulting mevalonate kinase fragment, is understood to be sufficient in the sense of the expression used here.
  • the expression "active fragment” can also refer to the amino acid sequence of the mevalonate kinase and then applies analogously to the above explanations for those polypeptides which, in comparison to the complete sequence defined above, no longer contain certain parts, the enzymatic activity of the enzyme, however, not being decisive is impaired.
  • the fragments can have different lengths.
  • mevalonate kinase inhibition test refers to a method or a test which allows the inhibition of the enzymatic activity of a polypeptide with the enzymatic activity of a mevalonate kinase by one or more to recognize chemical compounds (candidate compound (s)), whereby the chemical compound can be identified as an inhibitor of mevalonate kinase or as a fungicide.
  • gene as used herein is the term for a portion of the genome of a cell that is responsible for the synthesis of a polypeptide chain.
  • fungicide or “fungicidal” as used in the present context refers to chemical compounds which are suitable for combating fungi, in particular phytopathogenic fungi. Such phytopathogenic fungi are mentioned below, the list is not exhaustive:
  • Pythium species such as, for example, Pythium ultimum, Phytophthora species, such as, for example, Phytophthora infestans, Pseudoperonospora species, such as, for example, Pseudoperonospora humuli or Pseudoperonospora cubensis, Plasmopara species, such as, for example, Plasmopara viticola, Bremia species. such as, for example, Bremia lactucae, Peronospora species, such as, for example, Peronospora pisi or P.
  • Erysiphe species such as, for example, Erysiphe graminis
  • Sphaerotheca species such as, for example, Sphaerotheca fuliginea
  • Podosphaera species such as, for example, Podosphaera leucotricha
  • Venturia species such as Venturia inaequalis
  • Pyrenophora species such as Pyrenophora teres or P.
  • Drechslera conidial form: Drechslera, Syn: Hehninthosporium
  • Cochliobolus species such as Cochliobolus sativus (Konidienfonn: Drechslera, Syn: Hehninthosporium species) such as Uromyces appendiculatus
  • Puccinia species such as Puccinia recondita, 'Sclerotinia species.
  • Sclerotinia sclerotiorum such as, for example, Sclerotinia sclerotiorum, Tilletia species, such as, for example, Tületia caries; Ustilago species, such as, for example, Ustilago nuda or Ustilago avenae, Pellicularia species, such as, for example, Pellicularia sasakii, Pyricularia species, such as, for example, Pyricularia oi ⁇ zae, Fusarium species.
  • Fusarium culmorum Botrytis species, Septoria species such as Septoria nodorum, Leptosphaeria species such as Leptosphaeria nodorum, Cercospora species such as Cercospora canescens, Alternaria species such as Alternaria brassicae or Pseudocercosporella species such as for example Pseudocercosporella herpotrichoides.
  • fungicidal active ingredients which are found with the aid of the mevalonate kinase according to the invention can also interact with mevalonate kinases from fungal species which are pathogenic to humans, where the interaction with the different mevalonate kinases found in these fungi need not always be the same.
  • the present invention therefore also relates to a method for identifying antifungals, i.e. of inhibitors of mevalonate kinase from human or animal pathogenic fungi, which can be used to prepare agents for the treatment of diseases caused by human or animal pathogenic fungi.
  • Yeasts such as Candida albicans, which causes thrush esophagitis and dermatitis, Candida glabrata, Candida krusei or Cryptococcus neoformans, which e.g. can cause pulmonary cryptococcosis and also torulose,
  • Mold such as Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger, e.g. cause bronchopulmonary aspergillosis or fungal sepsis, Mucor spec, Absidia spec, or Rhizopus spec, e.g. Cause zygomycoses (intravascular mycoses), Rhinosporidium seeberi, which e.g. chronic granulomatous pharyngitis and tracheitis, Madurella myzetomatis, which e.g. causes subcutaneous mycetomas, Histoplasma capsulatum, which e.g. reticuloendothelial cytomycosis and Darling M., Coccidioides immitis, z.
  • Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger e.g. cause bronchopulmonary aspergillosis or fungal sepsis, Mucor spec, Absidia spec, or Rhizopus spec,
  • fungicidal or “fungicide” shall apply equally to the terms “antifungal” or “antifungal” as well as for the terms “fungicidal” or “fungicide” in the conventional sense, i.e. related to phytopathogenic fungi.
  • Fungicidal active ingredients which are found with the aid of a mevalonate kinase obtained from a particular fungus, here for example from U. maydis, can therefore also interact with a mevalonate kinase from numerous other fungus species, in particular also with other phytopathogenic fungi, the interaction with the different Meva- found in these mushrooms.
  • lonat kinases do not always have to be equally strong. Among other things, this explains the observed selectivity of the substances active on this enzyme. - 1 -
  • competitive refers to the property of the compounds to compete with other, optionally identifiable compounds in order to compete for binding to the mevalonate kinase and to displace or be displaced by the enzyme.
  • agonist refers to a molecule that accelerates or enhances the activity of the mevalonate kinase.
  • antagonist refers to a molecule that slows or prevents the activity of the mevalonate kinase.
  • modulator represents the generic term for agonist or antagonist.
  • Modulators can be small organic chemical molecules, peptides or antibodies which bind to the polypeptides according to the invention or which influence their activity.
  • modulators can be small organic chemical molecules, peptides or antibodies which bind to a molecule which in turn binds to the polypeptides according to the invention and thereby influences their biological activity.
  • Modulators can represent natural substrates and ligands or structural or functional mimetics thereof.
  • modulator as used herein is preferably, however, those molecules which do not represent the natural substrates or ligands.
  • the mevalonate kinase (EC 2.7.1.36), hereinafter also abbreviated to MK, catalyzes the reaction of mevalonate and adenosine triphosphate to phosphomevalonate and adenosine diphosphate ( Figure 1).
  • the reaction catalyzed by the mevalonate kinase is an essential step at the beginning of the biosynthesis of ergosterol, dolichol or ubiquinone (Lees et al., 1997, Biochemistry and molecular biology of sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry and Function of Sterols, 85-99; Mercer, 1984, The biosynthesis of ergosterol. Pestic. Sci. 15 (2), 133-55; Karst and Lacroute, 1977, Ergosterol Biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae. Mol.Gen.Genet. 15, 269-277).
  • mevalonate kinase was also found in numerous other organisms, e.g. in Homo sapiens (Swissprot: Accession No .: AK023087), Mus musculus (Swissprot: Accession No .: BC005606) or Oryza sativa (Swissprot: Accession No .: AC091749).
  • sequence similarities between different MKs are significant within the eukaryotic classes, whereas the sequence identity to the bacterial enzymes is less significant.
  • the mevalonate kinase was isolated from various organisms, expressed. purified and also characterized (Tanaka et al., 1990, Purif ⁇ cation and regulation of mevalonate kinase from rat liver J. Biol. Chem. 265 (4), 2391-98; Chu, Xiusheng and Li, Ding, 2003, Cloning, expression, and purification of His-tagged rat mevalonate kinase. Prot. Exp. Purific. 27, 165-70; Schulte et al., 2000, Purification and characterization of mevalonate kinase from suspension-cultured cells of Catharanthus roseus (L.) G. Don Are. Biochem. Biophys.
  • the mevalonate kinase in fungi can be a target protein (a so-called "target") of fungicidally active substances.
  • the mevalonate kinase is not only an enzyme which is particularly important for fungi and is therefore particularly suitable for being used as a target protein for the search for further and improved fungicidally active compounds, but rather also that the fungal mevalonate kinase can actually be influenced in vitro and also in vivo by active substances and that these can be used as fungicides. Methods are also provided that can be used to identify such fungicides.
  • a method was developed which is suitable for determining the enzymatic activity of mevalonate kinase and the inhibition of this activity by one or more substances in a so-called inhibition test, and in this way modulators, preferably inhibitors of the enzyme, To be identified, for example, in HTS and UHTS processes. Identified inhibitors which already show an inhibiting effect on a given mevalonate kinase in vitro can then be tested in vivo for their fungicidal action.
  • the inhibitors of a fungal mevalonate kinase can be used as fungicides, in particular in crop protection or as antifungals in pharmaceutical indications.
  • the inhibition of the mevalonate kinase with a substance identified in a method according to the invention leads to the death or damage of the treated fungi in synthetic media or on the plant.
  • Mevalonate kinase can be obtained from various fungi that are pathogenic to plants, humans or animals, e.g. from fungi such as the plant pathogenic fungus U maydis.
  • the gene can e.g. recombinantly expressed in Escherichia coli and an enzyme preparation is produced from E. coli cells (Example 1).
  • Mevalonate kinases from phytopathogenic fungi are preferably used to identify fungicides which can be used in crop protection. If the goal is to identify fungicides or antimycotics that are to be used in pharmaceutical indications, the use of mevalonate kinases from human or animal pathogenic fungi is recommended.
  • the associated ORF open reading frame
  • UmErgl2 encoded by Umergl2 Um stands for Ustilago maydis
  • SEQ FD NO: 1 Methods known to those skilled in the art are amplified using gene-specific primers.
  • the corresponding DNA was cloned into the vector pDEST15 (Invitrogen, enables the introduction of an N-terminal GST tag) according to the manufacturer's instructions.
  • the resulting plasmid pDEST15_umergl2 contains the complete coding sequence of Umergl2 in an N-terminal fusion with a GST tag from the vector.
  • the UmErgl2 fusion protein has a calculated mass of 74.5 kDa (see Example 1 and Figure 3).
  • the plasmid pDEST15_umergl2 was then used for the recombinant expression of UmErgl2 in E. coli BL21 (DE3) (cf. Example 1).
  • the present invention thus also provides a further complete genomic sequence of a phytopathogenic fungus coding for a mevalonate kinase, and the use thereof, or the use of the polypeptide encoded thereby, for identifying inhibitors of the enzyme and the use thereof as fungicides.
  • the present invention therefore also relates to the nucleic acid from the Ustilago maydis fungus which codes for a polypeptide with the enzymatic function of a mevalonate kinase.
  • Mevalonate kinases share homologous areas. Typical of mevalonate kinases is a conserved region that is involved in the binding of ATP. This ATP binding site is a characteristic feature of the sequence for mevalonate kinases. Such a motif can be identified by a suitable search in the PROSITE database (Hofmann K., Bucher P., Falquet L., Bairoch A. (1999) "The PROSITE database, its Status in 1999". Nucleic Acids Res. 27, 215). It can be represented as follows: [LIVM] - [PK] -x- [GSTA] -x (0, l) -G- [LM] - [GS] -SS- [GSA] - [GSTAC],
  • PROSITE enables polypeptides to be assigned a function and thus to recognize mevalonate kinases as such.
  • the "one-letter code” is used to display the Prosite motif.
  • the symbol “x” stands for a position where every amino acid is accepted.
  • a variable position at which various specific amino acids are accepted is shown in square brackets "[...]", whereby the possible amino acids at this position are listed.
  • Amino acids that are not accepted at a certain position, however, are enclosed in braces “ ⁇ ... ⁇ ”.
  • a dash “-” separates the individual elements or positions of the motif. Repeats a certain position, e.g. "x”, several times in succession, this can be represented by specifying the number of repetitions in a subsequent bracket, e.g. "x (3)” which stands for "x-x-x".
  • a Prosite motif ultimately represents the components of a consensus sequence, as well as the distances between the amino acids involved, and is therefore typical for a certain enzyme class.
  • further polypeptides from phytopathogenic fungi can be identified or assigned on the basis of the nucleic acids according to the invention which belong to the same class as the polypeptide according to the invention and can therefore also be used in the manner according to the invention.
  • PIGAGLGSSA The above-mentioned Prosite motif or the specific consensus sequence are typical of the polypeptides according to the invention, which can be structurally defined on the basis of these consensus sequences and are therefore also clearly identifiable.
  • the present invention therefore also relates to polypeptides from phytopathogenic fungi with the enzymatic activity of a mevalonate kinase which have the above-mentioned prostite motif [LIVM] - [PK] -x- [GSTA] -x (0, 1) -G- [LM ] - [GS] -SS- [GSA] - [GSTAC], preferably those polypeptides which comprise the above-mentioned motif PxGxGLGSSA, and particularly preferably those polypeptides which comprise the consensus sequence PIGAGLGSSA.
  • a mevalonate kinase which have the above-mentioned prostite motif [LIVM] - [PK] -x- [GSTA] -x (0, 1) -G- [LM ] - [GS] -SS- [GSA] - [GSTAC], preferably those polypeptides which comprise the above-mentioned motif PxGxGLGSSA, and particularly preferably those
  • mevalonate kinases from other phytopathogenic fungi can also be identified and used to solve the above-mentioned problem, i.e. they can also be used to identify inhibitors of a mevalonate kinase, which in turn can be used as fungicides in crop protection.
  • mevalonate kinases from other phytopathogenic fungi can also be identified and used to solve the above-mentioned problem, i.e. they can also be used to identify inhibitors of a mevalonate kinase, which in turn can be used as fungicides in crop protection.
  • another fungus which is not pathogenic to the plant, or its mevalonate kinase or the sequence coding therefor, in order to identify fungicidal inhibitors of the mevalonate kinase.
  • nucleic acids coding for mevalonate kinases from other (phytopathogenic) fungi by means of PCR.
  • nucleic acids and their use in methods for identifying fungicidal active substances are considered to be encompassed by the present invention.
  • the present invention particularly preferably relates to the nucleic acids coding for the Ustilago maydis mevalonate kinase with the SEQ ID NO: 1 and the nucleic acids coding for the polypeptides according to SEQ ID NO: 2 or active fragments thereof.
  • the nucleic acids according to the invention are in particular single-stranded or double-stranded deoxyribonucleic acids (DNA) or ribonucleic acids (RNA).
  • DNA deoxyribonucleic acids
  • RNA ribonucleic acids
  • Preferred embodiments are fragments of genomic DNA, and cDNAs.
  • the nucleic acids according to the invention particularly preferably comprise a sequence selected from a) a sequence according to SEQ ID NO: 1, b) sequences which code for a polypeptide which comprises the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2 and c) sequences which have at least 90% identity with the sequences defined under a) and b) and for the sequence motif [LIVM ] - [PK] -x- [GSTA] -x (0, l) -G- [LM] - [GS] -SS- [GSA] - [GSTAC].
  • the present invention is not limited to the use of U. maydis mevalonate kinase.
  • polypeptides with the enzymatic activity of a mevalonate kinase can also be used or obtained from other fungi, preferably from phytopathogenic fungi, which can then be used in a process according to the invention.
  • the Mevalonate kinase from U. maydis is preferably used.
  • the present invention furthermore relates to DNA constructs which comprise a nucleic acid according to the invention and a homologous or heterologous promoter.
  • homologous promoter refers to a promoter which controls the expression of the gene in question in the original organism.
  • heterologous promoter refers to a promoter which has different properties than the promoter which controls the expression of the gene in question in the original organism.
  • heterologous promoters depends on whether pro- or eukaryotic cells or cell-free systems are used for expression.
  • heterologous promoters are the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus for plant cells, the alcohol dehydrogenase promoter for yeast cells, the T3, T7 or SP6 promoters for prokaryotic cells or cell-free systems.
  • Fungal expression systems such as e.g. the Pichia pastoris system can be used, the transcription here being driven by the methanol-inducible AOX promoter.
  • the present invention furthermore relates to vectors which contain a nucleic acid according to the invention, a regulatory region according to the invention or a DNA construct according to the invention.
  • All phages, plasmids, phagmids, phasmids, cosmids, YACs, BACs, artificial chromosomes or particles which are suitable for particle bombardment can be used as vectors.
  • Preferred vectors are, for example, the p4XXprom.
  • Vector series Moberg, D., Müller, R., Funk, M.,. 1995.
  • Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Genes 156, 119-122) for yeast cells, pSPORT vectors (Fa. Life Technologies) for bacterial cells, or the gateway vectors (from Life Technologies) for various expression systems in bacterial cells, plants, P. pastoris, S. cerevisiae or insect cells.
  • the present invention also relates to host cells which contain a nucleic acid according to the invention, a DNA construct according to the invention or a vector according to the invention.
  • host cell refers to cells which naturally do not contain the nucleic acids according to the invention.
  • Suitable host cells are both prokaryotic cells, preferably E. coli, and eukaryotic cells, such as cells from Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, insects, plants, frog oocytes and cell lines from mammals.
  • the present invention furthermore relates to polypeptides with the enzymatic activity of a mevalonate kinase, which are encoded by the nucleic acids according to the invention.
  • polypeptides according to the invention preferably comprise an amino acid sequence selected from
  • polypeptides refers to both short amino acid chains, commonly referred to as peptides, oligopeptides, or oligomers, and longer amino acid chains, commonly referred to as proteins. It encompasses amino acid chains that can be modified either by natural processes, such as post-translational processing, or by chemical processes that are state of the art. Such modifications can occur at various locations and multiple times in a polypeptide, such as, for example, on the peptide backbone, on the amino acid side chain, on the amino and / or on the carboxy terminus.
  • acetylations include, for example, acetylations, acylations, ADP ribosylations, amidations, covalent linkages with flavins, heme components, nucleotides or Nucleotide derivatives, lipids or lipid derivatives or phosphatidylinositol, cyclizations, disulfide bridging, demethylations, cystine formations, formylations, gamma-carboxylations, glycosylations, hydroxylations, iodinations, methylations, myristoylations, oxidations, proteolytic processes, selylations, phosphorylations and tRNA-mediated additions of amino acids.
  • polypeptides according to the invention can be in the form of "mature” proteins or as parts of larger proteins, e.g. as fusion proteins. Furthermore, they can have secreting or "leader” sequences, pro sequences, sequences which enable simple purification, such as multiple histidine residues, or additional stabilizing amino acids.
  • the proteins according to the invention can also be present as they are naturally present in their organism of origin, from which they can be obtained directly, for example. Active fragments of a mevalonate kinase can also be used in the method according to the invention as long as they enable the determination of the enzymatic activity of the polypeptide or its inhibition by a candidate compound.
  • polypeptides used in the methods according to the invention can have deletions or amino acid substitutions in comparison to the corresponding regions of naturally occurring mevalonate kinases, as long as they at least still show the enzymatic activity of a complete mevalonate kinase.
  • Conservative substitutions are preferred. Such conservative substitutions include variations in which one amino acid is replaced by another amino acid from the following group:
  • Mevalonate Kinase is based on preparative electrophoresis, FPLC, HPLC (e.g. using gel filtration, reverse phase or slightly hydrophobic columns), gel filtration, differential precipitation, ion exchange chromatography or affinity chromatography (see .. Example 1).
  • a rapid method for isolating mevalonate kinases that are synthesized by host cells begins with the expression of a fusion protein, whereby the fusion partner can be easily affinity-purified.
  • the fusion partner can be, for example, a GST tag (see example 1).
  • the fusion protein can then be purified on glutathione-Sepharose column.
  • the fusion partner can be separated by partial proteolytic cleavage, for example on a link between the fusion partner and the polypeptide according to the invention to be purified.
  • the linker can be designed to include target amino acids, such as arginine and lysine residues, which define sites for trypsin cleavage. Standard cloning techniques using oligonucleotides can be used to create such linkers.
  • purification processes are based on preparative electrophoresis, FPLC, HPLC (e.g. using gel filtration, reverse phase or slightly hydrophobic columns), gel filtration, differential precipitation, ion exchange chromatography and affinity chromatography.
  • composition containing the polypeptides according to the invention is preferably enriched at least 10-fold and particularly preferably at least 100-fold with respect to the protein content compared to a preparation from the host cells.
  • polypeptides according to the invention can also be affinity-purified without a fusion partner using antibodies which bind to the polypeptides.
  • the method for producing polypeptides with the enzymatic activity of a mevalonate kinase is thus characterized by
  • the cells obtained in this way, containing the polypeptide according to the invention or the purified polypeptide obtained in this way, are suitable for use in methods for identifying modulators or inhibitors of mevalonate kinase.
  • the present invention also relates to the use of polypeptides from fungi, preferably from phytopathogenic or human or animal pathogenic fungi, which have the enzymatic activity of a mevalonate kinase, in methods for identifying inhibitors of these polypeptides, and the use of these inhibitors of mevalonate kinase as fungicides.
  • Fungicidal active ingredients that are found with the help of a mevalonate kinase from a particular fungal species can also interact with mevalonate kinases from other fungal species, although the interaction with the different mevalonate kinases occurring in these fungi does not always have to be equally strong. This explains, among other things, the selectivity of active substances.
  • the use of active ingredients which have been found with a mevalonate kinase of a particular fungal species as fungicides in other fungal species can be attributed to the fact that mevalonate kinases from different fungal species are relatively close and show pronounced homology in larger areas. Figure 2 clearly shows that such homology exists over considerable sequence sections between U. maydis, S.
  • Methods which are suitable for identifying modulators, in particular inhibitors or antagonists, of the polypeptides according to the invention are generally based on determining the activity or the biological functionality of the polypeptide.
  • both whole-cell-based methods in vivo methods
  • methods based on the use of the polypeptide isolated from the cells which can be present in purified or partially purified form or as a crude extract, are also possible.
  • These cell-free in vitro methods can be used just like in vivo methods on a laboratory scale, but preferably also in HTS or UHTS methods.
  • tests can be carried out on fungal cultures in order to test the fungicidal activity of the compounds found.
  • test systems that aim to test compounds and natural extracts are preferably geared towards high throughput numbers in order to maximize the number of substances tested in a given period of time.
  • Test systems that are based on cell-free work require purified or semi-purified protein. They are suitable for a "first" test, which primarily aims to detect a possible influence of a substance on the target protein. Once such an initial check has been made and one or more compounds, extracts etc found, the effect of such compounds can be investigated even more specifically in the laboratory.
  • the inhibition or activation of the polypeptide according to the invention can be checked again in vitro in order to then test the effectiveness of the compound on the target organism, here one or more phytopathogenic fungi.
  • the compound can then optionally be used as a starting point for the further search and development of fungicidal compounds which are based on the original structure, but which are optimized, for example, in terms of effectiveness, toxicity or selectivity.
  • modulators e.g. a synthetic reaction mix (eg products of in vitro transcription) or a cellular component such as a membrane, a compartment or any other preparation which contains the polypeptides according to the invention, together with an optionally labeled substrate or ligand of the polypeptides in the presence and absence of a Candidate molecule, which can be an antagonist, are incubated.
  • the ability of the candidate molecule to inhibit the activity of the polypeptides of the invention will e.g. recognizable by a reduced binding of the optionally labeled ligand or by a reduced implementation of the optionally labeled substrate.
  • Molecules that inhibit the biological activity of the polypeptides according to the invention are good antagonists.
  • An example of a method with which modulators of the polypeptides according to the invention can be found is a displacement test in which, under suitable conditions, the polypeptides according to the invention and a potential modulator with a molecule which is known to bind to the polypeptides according to the invention, such as a natural substrate or ligands or a substrate or ligand mimetic.
  • the polypeptides of the invention themselves can be labeled, e.g. fluorimetric or colorimetric, so that the number of polypeptides that are bound to a ligand or that have undergone a reaction can be determined exactly.
  • the binding can also be followed by means of the optionally labeled substrate, ligand or substrate analog. In this way, the effectiveness of antagonists can be measured.
  • Test systems check both inhibitory or suppressive effects of the substances as well as stimulatory effects.
  • the effectiveness of a substance can be checked using concentration-dependent test series. Control approaches olme test substances or without enzyme can be used to evaluate the effects.
  • the host cells which are available with the aid of the present invention and contain nucleic acids coding for a 'mevalonate kinase according to the invention. Development of test systems based on cells enables the identification of substances that modulate the activity of the polypeptides according to the invention.
  • the modulators to be identified are preferably small organic chemical compounds.
  • a method for identifying a compound which modulates the activity of a mevalonate kinase from fungi and which can be used as a fungicide in crop protection is therefore preferably that
  • a polypeptide with the enzymatic activity of a mevalonate kinase preferably from fungi and particularly preferably from phytopathogenic fungi, or a host cell containing such a polypeptide in contact with a chemical compound or with a mixture of chemical compounds under conditions which bring about the interaction of the allow chemical connections to the polypeptide
  • the compound which specifically inhibits the activity of the polypeptide according to the invention is particularly preferably determined.
  • activity refers to the biological activity of the polypeptide according to the invention.
  • the fact is used that a molecule of adenosine diphosphate (ADP) is released in the reaction of the mevalonate kinase.
  • ADP adenosine diphosphate
  • the activity or the increase or decrease in the activity of the polypeptide according to the invention can therefore be determined by detecting the resulting ADP.
  • the lower or inhibited activity of the polypeptide according to the invention is tracked on the basis of the detection of the resulting ADP by coupling to the subsequent reaction of the pyruvate kinase and lactate dehydrogenase.
  • the pyruvate kinase converts phosphoenolpyruvate to pyruvate using ADP, which in turn is used by the lactate dehydrogenase to oxidize NADH to NAD.
  • the increasing NAD concentration or decreasing NADH concentration due to the coupled reaction concentration can be determined by spectrometry by absorption or fluorescence measurement (at 340 nm or an excitation wavelength of 360nm and an emission wavelength of 465nm).
  • the measurement can also be carried out in formats common to HTS or UHTS assays, e.g. in microtiter plates in which e.g. a total volume of 5 to 50 ⁇ l per batch or per well is presented and the individual components are present in the desired final concentrations (cf. Example 2).
  • the compound to be tested, potentially inhibiting or activating the activity of the enzyme is e.g. in a suitable concentration in test buffer containing mevalonate, adenosine triphosphate, phosphoenol pyruvate and the coupled auxiliary enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase.
  • the polypeptide according to the invention is then added in test buffer and the reaction is started thereby.
  • the mixture is then incubated at a suitable temperature and the decrease in absorption is measured at 340 nm.
  • the incubation period can be varied over a longer period. Incubation is preferably carried out for 5 to 60 minutes, preferably for 15 to 45 minutes, ie on average about 30 minutes.
  • the coupled enzyme test is e.g. in Tanaka et al., 1990.
  • a further measurement is carried out in a corresponding approach, but without the addition of a candidate molecule and without the addition of a polypeptide according to the invention (negative control).
  • a further measurement is again carried out in the absence of a candidate molecule, but in the presence of the polypeptide according to the invention (positive control). Negative and positive controls thus give the comparison values for the batches in the presence of a candidate molecule.
  • Table I shows an example of a compound that could be identified as an inhibitor of mevalonate kinase using a method according to the invention.
  • inhibitors of a mevalonate kinase according to the invention identified with the aid of a method according to the invention are suitable for damaging or killing fungi.
  • a solution of the active substance to be tested is pipetted into the cavities of microtiter plates. After the solvent has evaporated, medium is added to each cavity. A suitable concentration of spores or mycelium of the fungus to be tested is added to the medium beforehand. The resulting concentrations of the active ingredient are e.g. 0.1, 1, 10 and 100 ppm.
  • the plates are then incubated on a shaker at a temperature of approximately 22 ° C. until sufficient growth can be determined in the untreated control.
  • the evaluation is carried out photometrically at a wavelength of 620 nm.
  • the dose of active ingredient can be determined from the measurement data of the various concentrations, which leads to a 50% inhibition of fungal growth compared to the untreated control (ED 50 ).
  • ED 50 the untreated control
  • Table TJ shows the results of such a test as ED 50 values for a compound found in an inventive procedure (see Table I). The compound has a fungicidal effect on various fungi.
  • the present invention therefore also relates to the use of modulators of mevalonate kinase from fungi, preferably from phytopathogenic fungi as fungicides, and to methods for combating fungal attack in plants by applying an inhibitor of the fungal mevalonate kinase to the fungus or from the fungus infested plant.
  • the present invention also relates to fungicides which have been identified using a method according to the invention.
  • the identified active ingredients can be converted into the usual formulations, such as solutions, emulsions, suspensions, powders, foams, pastes, granules, aerosols, very fine encapsulations in polymeric substances and in coating compositions for seeds, and ULV cold and warm fog formulations.
  • formulations are made in a known manner, e.g. by mixing the active ingredients with extenders, that is to say liquid solvents, pressurized liquefied gases and / or solid carriers, if appropriate using surface-active agents,
  • organic solvents can, for example, also be used as auxiliary solvents.
  • the following are essentially suitable as liquid solvents: aromatics, such as xylene, toluene or alkylnaphthalenes, chlorinated aromatics or chlorinated aliphatic hydrocarbons, such as chlorobenzenes, chlorethylenes or methylene chloride, aliphatic hydrocarbons substances such as cyclohexane or paraffins, for example petroleum fractions, alcohols, such as butanol or glycol, and their ethers and esters, ketones, such as acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone or cyclohexanone, strongly polar solvents, such as dimethylformamide and dimethyl sulfoxide, and water.
  • Liquefied gaseous extenders or carriers mean liquids which are gaseous at normal temperature and under normal pressure, for example aerosol propellants, such as halogenated hydrocarbons and butane, propane, nitrogen and carbon dioxide.
  • aerosol propellants such as halogenated hydrocarbons and butane, propane, nitrogen and carbon dioxide.
  • solid carriers for example, natural rock powders such as kaolins, clays, talc, chalk, quartz, attapulgite, montmorillonite or diatomaceous earth and synthetic rock powders such as highly disperse silica, aluminum oxide and silicates.
  • Possible solid carriers for granules are: e.g.
  • Suitable emulsifiers and / or foam-generating agents are: for example nonionic and anionic emulsifiers, such as polyoxyethylene fatty acid esters, polyoxyethylene fatty alcohol ethers, for example alkylaryl polyglycol ethers, alkyl sulfonates, alkyl sulfates, aryl sulfonates and protein hydrolyzates.
  • Possible dispersing agents are, for example, lignin sulfite waste liquor and methyl cellulose.
  • Adhesives such as carboxymethyl cellulose, natural and synthetic polymers in the form of powders, granules or latices, such as gum arabic, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, and natural phospholipids such as cephalins and lecithins, and synthetic phospholipids can be used in the formulations.
  • Other additives can be mineral and vegetable oils.
  • Dyes such as inorganic pigments, e.g. Iron oxide, titanium oxide, ferrocyan blue and organic dyes such as alizarin, azo and metal phthalocyanine dyes and trace non-alcoholic substances such as salts of iron, manganese, boron, copper, cobalt, molybdenum and zinc can be used.
  • the formulations generally contain between 0.1 and 95 percent by weight of active compound, preferably between 0.5 and 90%.
  • the active compounds according to the invention can also be used in a mixture with known fungicides, bactericides, acaricides, nematicides or insecticides, in order, for example, to to spread the spectrum of activity or to prevent the development of resistance.
  • fungicides bactericides
  • acaricides nematicides or insecticides
  • synergistic effects are obtained, i.e. the effectiveness of the mixture is greater than the effectiveness of the individual components.
  • the application rates may vary. can be varied within a wide range after application.
  • all plants and parts of plants can be treated. Plants are understood here to mean all plants and plant populations, such as desired and undesired wild plants or crop plants (including naturally occurring crop plants). Crop plants can be plants which can be obtained by conventional breeding and optimization methods or by biotechnological and genetic engineering methods or combinations of these methods, including the transgenic plants and including the plant cultivars which can or cannot be protected by plant breeders' rights.
  • Plant parts are to be understood to mean all above-ground and underground parts and organs of the plants, such as shoots, leaves, flowers and roots, examples being leaves, needles, stems, stems, flowers, fruiting bodies, fruits and seeds as well as roots, tubers and rhizomes.
  • the plant parts also include crops and vegetative and generative propagation material, for example cuttings, tubers, rhizomes, offshoots and seeds.
  • the treatment of the plants and parts of plants with the active compounds according to the invention is carried out directly or by acting on their surroundings, living space or storage space using the customary treatment methods, e.g. by dipping, spraying, vaporizing, atomizing, scattering, spreading and, in the case of propagation material, in particular in the case of seeds, furthermore by coating in one or more layers.
  • the ORF was amplified from genomic DNA from Ustilago maydis using gene-specific primers.
  • the corresponding DNA an amplifier of 1059 bp in length, was intercloned into the vector pDON201 from Invitrogen and then cloned into the vector pDEST15 (Invitrogen) by recombination.
  • the resulting plasmid pDEST15_umergl2 contains the complete coding sequence of umergl2 in an N-terminal fusion with the GST tag, which is part of the vector.
  • the UmErgl2 fusion protein has a calculated mass of 74.5 kDa.
  • the plasmid pDEST15__umergl2 was transformed into E. coli BL21 (DE3).
  • a preculture was inoculated into the transformants in 50 ml of selection medium. These cells were incubated overnight at 37 ° C. and then diluted 1:20 in selection medium (LB medium with 100 ⁇ g / ml ampicillin). Induction was carried out at an OD ⁇ oo nm of 0.8 with 0.1 mM IPTG (final concentration) at 30 ° C. After 3 h induction, the cells were harvested and worked up directly.
  • the digestion was carried out by sonication in lysis buffer (100 mM Tris-HCl, pH 8, 5 M DTT, 5 mM MgCl 2 , 0.1% Triton, 10 ⁇ M ATP) after previous lysozyme treatment (15 minutes, 30 ° C, 1 mg / ml final in lysis buffer).
  • lysis buffer 100 mM Tris-HCl, pH 8, 5 M DTT, 5 mM MgCl 2 , 0.1% Triton, 10 ⁇ M ATP
  • 384-well microtiter plates from Greiner were used to identify modulators of the Mevalonate kinase.
  • the negative control was pipetted into the first and second column. This was composed of 5 ⁇ l of solution (5% DMSO in H 2 0), 20 ⁇ l of solution 2 (100 mM Tris / HCl pH 7.5, 15 mM MgCl 2 , 12.5 mM glutathione, 0.25% BSA) and 25 ⁇ l solution 3 (100 mM Tris / HCl pH 7.5, 15 mM MgCl 2 , 20 mM KCl, 0.6 mM ATP, 0.8 mM PEP, 0.6 mM NADH, 20 mM DTT, 0.02% Tween 20) with 200 mU pyruvate kinase, 400 mU lactate dehydrogenase.
  • solution 3 100 mM Tris / HCl pH 7.5, 15 mM MgCl 2 , 20 mM KCl, 0.6 mM ATP, 0.8 mM PEP, 0.6 mM
  • the positive control was pipetted into the third and fourth column. This was composed of 5 ⁇ l solution (5% DMSO in H 2 0), 20 ⁇ l solution 4 (100 mM Tris / HCl pH 7.5, 15 mM MgCl 2 , 12.5 mM glutathione, 0.25% BSA, 0, 1 ⁇ g mevalonate kinase) and 25 ⁇ l solution 3 (100 mM Tris / HCl pH 7.5, 15 mM MgCl 2 , 20 mM KCl, 0.6 mM ATP, 0.8 mM PEP, 0.6 mM NADH, 20 mM DTT, 0.02% Tween 20) with 200 mU pyruvate kinase, 400 mU lactate dehydrogenase.
  • 5 ⁇ l solution 5% DMSO in H 2 0
  • 20 ⁇ l solution 4 100 mM Tris / HCl pH 7.5, 15 mM Mg
  • a test substance at a concentration of 2 ⁇ M in DMSO was placed in the remaining columns, H 2 0 being used to dilute the substance.
  • 20 ⁇ l of solution 4 100 mM Tris / HCl pH 7.5, 15 mM MgCl 2 , 12.5 mM glutathione, 0.25% BSA, 0.1 ⁇ g mevalonate kinase
  • 25 ⁇ l solution were added to start the reaction 3 (100mM Tris / HCl pH 7.5, 15mM MgCl 2 , 20mM KCl, 0.6mM ATP, 0.8mM PEP, 0.6mM NADH, 20mM DTT, 0.02% Tween 20) with 200 mU pyruvate kinase and 400 mU lactate dehydrogenase added.
  • the subsequent measurement was carried out by determining the absorption at 340 nm in a SPECTRA
  • the resulting concentration of the emulsifier was 300 ppm.
  • the plates were then incubated on a shaker at a temperature of 22 ° C. until sufficient growth was found in the untreated control.
  • the expansion was carried out photometrically at a wavelength of 620 nm.
  • the dose of active ingredient which leads to a 50% inhibition of fungal growth compared to the untreated control (ED 50 ) is calculated from the measurement data of the different concentrations.

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Identifizieren von Fungiziden, die Verwendung von Mevalonat Kinase zum Identifizieren von Fungiziden, und die Verwendung von Inhibitoren der Mevalonat Kinase als Fungizide.

Description

Verfahren zum Identifizieren von fungizid wirksamen Verbindungen basierend auf Mevalonat Kinasen aus Pilzen
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Identifizieren von Fungiziden, die Verwendung von Mevalonate Kinase zum Identifizieren von Fungiziden, und die Verwendung von Inhibitoren der Mevalonate Kinase als Fungizide.
Unerwünschtes Pilzwachstum, das in der Landwirtschaft jedes Jahr zu beträchtlichen Schäden führt, kann durch die Verwendung von Fungiziden kontrolliert werden. Die Ansprüche an Fungizide sind dabei hinsichtlich ihrer Wirksamkeit, Kosten und vor allem ihrer Umweltverträglichkeit stetig angestiegen. Es existiert deshalb ein Bedarf an neuen Substanzen bzw. Substanzklassen, die zu leistungsfähigen und umweltverträglichen neuen Fungiziden entwickelt werden können. Im Allgemeinen ist es üblich, in Gewächshaustests nach solchen neuen Leitstrukturen zu suchen. Solche Tests sind jedoch arbeitsintensiv und teuer. Die Anzahl der Substanzen, die im Gewächshaus getestet werden können, ist entsprechend begrenzt. Eine Alternative zu solchen Tests ist die Verwendung von sogenannten Hochdurchsatzverfahren (HTS = high throughput screening). Dabei werden in einem automatisierten Verfahren eine große Anzahl von Einzelsubstanzen hinsichtlich ihrer Wirkung auf Zellen, individuelle Genprodukte oder Gene getestet. Wird für bestimmte Substanzen eine Wirkung nachgewiesen, so können diese in herkömmlichen Screeningverfahren untersucht und gegebenenfalls weiter entwickelt werden.
Vorteilhafte neue Angriffspunkte für Fungizide, die dann in den genannten HTS-Verfahren genutzt. werden können, werden oft in essentiellen Biosynthesewegen gesucht. Ideale Fungizide sind weiterhin solche Stoffe, die Genprodukte hemmen, die eine entscheidende Bedeutung bei der Ausprägung der Pathogenität eines Pilzes haben.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, einen geeigneten neuen Angriffspunkt für potentielle fungizide Wirkstoffe zu identifizieren und zugänglich zu machen, und darauf basierend ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Identifizierung von Modulatoren dieses Angriffspunkts vorzugsweise in einem Hochdurchsatzverfahren ermöglicht, um damit die Identifizierung neuer Fungizide zu ermöglichen. Abbildungen und Sequenzprotokoll
Abbildung 1 : Schematische Darstellung der von der Mevalonat Kinase katalysierten Reaktion. Die Mevalonat Kinase katalysiert die Reaktion von (R)-Mevalonat und Adenosintriphosphat zu (R)-5-Phosphomevalonat und Adenosindiphosphat.
Abbildung 2: Homologie zwischen Mevalonat Kinasen aus verschiedenen Pilzen. (1) Saccha- romycs cerevisiae, (2) Schizosaccharomyces pombe, (3) Ustilago maydis, (4) Neurospora crassa, (5) Magnaporthe grisea. Rahmen geben Bereiche mit einer genau übereinstimmenden Sequenz wieder (Konsensussequenz).
Abbildung 3 : SDS-Gel zur Darstellung des Verlaufs der heterologen Expression der Mevalo- nat Kinase in E. coli BL21 (DB3V Das überexprimierte GST-Fusionsprotein hat eine Größe von 74,5 kDa. In den Spuren M wurden Größenstandards aufgetragen. Spur 1: Pelletfraktion; Spur 2: Cytoplasmafraktion der überexprimierten Mevalonat Kinase (3 Stunden nach Induktion mit lOOmM IPTG bei 30°C); Spur 3: Waschfraktion nach dem Auftragen der Cytoplasmafraktion auf die Glutathion-Sepharose Säule; Spur 4: Elutionsfraktion mit angereinigter Mevalonat Kinase.
Abbildung 4: Kinetik der Umsetzung von Mevalonat und Adenosintriphosphat bei unterschiedlichen Konzentrationen der Mevalonat Kinase im Assay. In einem Assay- volumen von 50 μl wurden 300 μM Adenosintriphosphat, 500 μM Mevalonat, 300 μM NADH, 400 μM Phosphoenolpyruvat, 0,2 U Pyruvat Kinase und 0,4 U Laktat Dehydrogenase sowie unterschiedliche Mengen an Mevalonat Kinase eingesetzt. Die verwendeten Proteinkonzentrationen der Mevalonat Kinase sind der Abbildung zu entnehmen. Die Umsetzung des Mevalonat wurde anhand der gekoppelten Reaktion mit Pyruvat Kinase und Laktat Dehydrogenase verfolgt. Dabei wird die Umsetzung des ATP mittels Mevalonat durch die gekoppelte Absorptionsabnahme bei 340 nm (Abnahme des NADH in gekoppelter Reaktion) verfolgt.
SEQ ED NO:l Nukleinsäuresequenz kodierend für die Mevalonat Kinase aus Ustilago maydis. Die angegebene Sequenz entspricht der genomischen DNA.
SEQ DO NO: 2 Aminosäuresequenz der Mevalonat Kinase aus Ustilago maydis. Definitionen
Unter dem Begriff "Homologie" bzw. "Identität" soll die Anzahl der übereinstimmenden Aminosäuren (Identität) mit anderen Proteinen, ausgedrückt in Prozent verstanden werden. Bevorzugt wird die Identität durch Vergleiche einer gegebenen Sequenz zu anderen Proteinen mit Hilfe von Computerprogrammen ermittelt. Weisen Sequenzen, die miteinander verglichen werden, unterschiedliche Längen auf, ist die Identität so zu ermitteln, dass die Anzahl an Aminosäuren, welche die kürzere Sequenz mit der längeren Sequenz gemeinsam hat, den prozentualen Anteil der Identität bestimmt. Die Identität kann standardmäßig mittels bekannten und der Öffentlichkeit zur Verfügung stehenden Computerprogrammen wie z.B. ClustalW (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680) ermittelt werden. ClustalW wird z.B. öffentich zur Verfügung gestellt von Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) und Toby Gibson (Gibson@- EMBL-Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory. Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Germany. ClustalW kann ebenfalls von verschiedenen Intemetseiten, u.a. beim IGBMC (Institut de Genέtique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire, B.P.163, 67404 Illkirch Cedex, France; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) und beim EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) sowie bei allen gespiegelten Intemetseiten des EBI (European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK), heruntergeladen werden. Wenn das ClustalW Computerprogramm der Version 1.8 benutzt wird, um die Identität zwischen z.B. einem gegebenen Referenzprotein und anderen Proteinen zu bestimmen, sind folgende Parameter einzu- stellen: KTUPLE=1, TOPDIAG=5, WTNDOW=5, PATRGAP=3, GAPOPEN=10, GAPEX- TEND-0.05, GAPDIST=8, MAXDIV-40, MATRIX=GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP. Eine Möglichkeit zum Auffinden von ähnlichen Sequenzen ist die Durchführung von Sequenzdatenbankrecherchen. Hierbei wird eine oder werden mehrere Sequenzen als sogenannte Abfrage ("query") vorgegeben. Diese Abfragesequenz wird dann mittels statistischen Computer- programmen mit Sequenzen, die in den ausgewählten Datenbanken enthalten sind, verglichen. Solche Datenbankabfragen ("blast searches") sind dem Fachmann bekannt und können bei verschiedenen Anbietern durchgeführt werden. Wird eine solche Datenbankabfrage z.B. beim NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbbnlm.nih.gov/) durchgeführt, so sollen die Standardeinstellungen, die für die jeweilige Vergleichsanfrage vorgegeben sind, benutzt werden. Für Proteinsequenzvergleiche ("blastp") sind dieses folgende Einstellungen: Limit entrez = nicht aktiviert; Filter = low complexity aktiviert; Expect value = 10; ord size = 3; Matrix = BLOSUM62; Gap costs: Existence = 11, Extension = 1. Als Ergebnis einer solchen Abfrage werden neben anderen Parametern auch der Anteil an Identität zwischen der Abfragesequenz und den in den Datenbanken aufgefundenen ähnlichen Sequenzen dargestellt. Unter einem erfindungsgemäßen Protein sollen daher im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung solche Proteine verstanden werden, die bei der Verwendung mindestens einer der vorstehend beschrie- benen Methoden zur Identitätsbestimmung eine Identität von mindestens 50 % aufweisen, bevorzugt von mindestens 60 %, besonders bevorzugt von mindestens 70 %, weiter bevorzugt von mindestens 80 %, und insbesondere von mindestens 90 %.
Der Ausdruck "vollständige Mevalonat Kinase" wie er hierin verwendet wird, beschreibt eine Mevalonat Kinase, die von einer vollständigen kodierenden Region einer Transkriptionseinheit kodiert wird, umfassend das ATG-Startcodon und alle informationstragenden Exonbereiche des im Herkunftsorganismus vorliegenden, für Mevalonat Kinase kodierenden Gens, sowie die für eine korrekte Termination der Transkription nötigen Signale.
Der Ausdruck "enzymatische Aktivität einer Mevalonat Kinase" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Fähigkeit eines Polypeptids, die vorstehend beschriebene Reaktion, d.h. die Umsetzung von Mevalonat und Adenosintriphosphat zu Phosphomevalonat und Adenosin- diphosphat zu katalysieren. Die beschriebene Reaktion stellt dabei die vorrangig vom Polypeptid katalysierte Reaktion dar. Polypeptide, die die beschriebene Reaktion nur unter bestimmten, nicht natürlichen Bedingungen katalysieren können, oder dazu im Vergleich zur vorrangig von ihnen katalysierten Reaktion nur in sehr geringem Ausmaß in der Lage sind, werden nicht umfasst.
Der Ausdruck "aktives Fragment" wie er hierin verwendet wird, beschreibt nicht mehr vollständige Nukleinsäuren kodierend für Mevalonat Kinase, die aber noch für Polypeptide mit der enzyma- tischen Aktivität einer Mevalonat Kinase kodieren, und die eine für die Mevalonat Kinase charakteristische Reaktion wie vorne beschrieben katalysieren können. Solche Fragmente sind kürzer als die oben beschriebenen vollständigen, für die Mevalonat Kinase kodierenden Nukleinsäuren. Dabei können sowohl an den 3 '- und/oder 5 '-Enden der Sequenz Nukleinsäuren entfernt worden sein, es können aber auch Teile der Sequenz deletiert, d.h. entfernt worden sein, die die biologische Aktivität der Mevalonat Kinase nicht entscheidend beeinträchtigen. Eine geringere oder gegebenenfalls auch eine erhöhte Aktivität, die aber noch die Charakterisierung bzw. Verwendung des resultierenden Mevalonat Kinase Fragments gestattet, wird dabei als ausreichend im Sinne des hier verwendeten Ausdrucks verstanden. Der Ausdruck "aktives Fragment" kann sich ebenso auf die Aminosäuresequenz der Mevalonat Kinase beziehen und gilt dann analog den obigen Ausführungen für solche Polypeptide, die im Vergleich zur oben definierten vollständigen Sequenz bestimmte Teile nicht mehr enthalten, wobei die enzymatische Aktivität des Enzyms jedoch nicht entscheidend beeinträchtigt ist. Die Fragmente können dabei verschiedene Längen besitzen.
Der Begriff "Mevalonat Kinase Hemmtest" oder "Hemmtest", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Verfahren bzw. einen Test, der es gestattet, die Inhibition der enzymatischen Aktivität eines Polypeptids mit der enzymatischen Aktivität einer Mevalonat Kinase durch eine oder mehrere chemische Verbindungen (Kandidatenverbindung(en)) zu erkennen, wodurch die chemische Verbindung als Inhibitor der Mevalonat Kinase bzw. als Fungizid identifiziert werden kann.
Der Ausdruck "Gen", wie er hierin verwendet wird, ist die Bezeichnung für einen Abschnitt aus dem Genom einer Zelle, der für die Synthese einer Polypeptid-Kette verantwortlich ist.
Der Ausdruck "Fungizid" bzw. "fungizid" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf chemische Verbindungen, die zur Bekämpfung von Pilzen, insbesondere von pflanzenpathogenen Pilzen geeignet sind. Solche pflanzenpathogene Pilze werden nachfolgend genannt, wobei die Aufzählung nicht abschließend ist:
Plasmodiophoromycetes, Oomycetes, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomy- cetes und Deuteromycetes, z.B .
Pythium-Arten, wie beispielsweise Pythium ultimum, Phytophthora-Arten, wie beispielsweise Phy- tophthora infestans, Pseudoperonospora-Arten, wie beispielsweise Pseudoperonospora humuli oder Pseudoperonospora cubensis, Plasmopara-Arten, wie beispielsweise Plasmopara viticola, Bremia- Arten. wie beispielsweise Bremia lactucae, Peronospora- Arten, wie beispielsweise Peronospora pisi oder P. brassicae, Erysiphe-Arten, wie beispielsweise Erysiphe graminis, Sphaerotheca-Arten, wie beispielsweise Sphaerotheca fuliginea, Podosphaera-Arten, wie beispielsweise Podosphaera leuco- tricha, Venturia-Arten, wie beispielsweise Venturia inaequalis, Pyrenophora-Arten, wie beispielsweise Pyrenophora teres oder P. graminea (Konidienform: Drechslera, Syn: Hehninthosporium), Cochliobolus-Arten, wie beispielsweise Cochliobolus sativus (Konidienfonn: Drechslera, Syn: Hehninthosporium), Uromyces-Arten, wie beispielsweise Uromyces appendiculatus, Puccinia-Arten, wie beispielsweise Puccinia recondita, ' Sclerotinia-Arten. wie beispielsweise Sclerotinia sclerotiorum, Tilletia-Arten, wie beispielsweise Tületia caries; Ustilago-Arten, wie beispielsweise Ustilago nuda oder Ustilago avenae, Pellicularia-Arten, wie beispielsweise Pellicularia sasakii, Pyricularia-Arten, wie beispielsweise Pyricularia oiγzae, Fusarium-Arten. wie beispielsweise Fusarium culmorum, Botrytis-Arten, Septoria-Arten, wie beispielsweise Septoria nodorum, Leptosphaeria-Arten, wie beispielsweise Leptosphaeria nodorum, Cercospora-Arten, wie beispielsweise Cercospora canescens, Alternaria-Arten, wie beispielsweise Alternaria brassicae oder Pseudocercosporella-Arten, wie beispielsweise Pseudocercosporella herpotrichoides.
Von besonderem Interesse sind z.B. auch Magnaporthe grisea, Cochliobulus heterostrophus, Nectria hematococcus und Phytophtora species.
Fungizide Wirkstoffe, die mit Hilfe der erfmdungsgemäßen Mevalonat Kinase gefunden werden, können aber auch mit Mevalonat Kinasen aus humanpathogenen Pilzspezies interagieren, wobei die Interaktion mit den unterschiedlichen in diesen Pilzen vorkommenden Mevalonat Kinasen nicht immer gleich stark sein muss.
Gegenstand der vorliegenden Erfindungen ist deshalb auch ein Verfahren zum Identifizieren von Antimykotika, d.h. von Inhibitoren der Mevalonat Kinase aus human- oder tierpathogenen Pilzen, die zum Herstellen von Mitteln zur Behandlung von durch human- oder tierpathogene Pilze hervorgerufenen Erkrankungen verwendet werden können.
Dabei sind die folgenden humanpathogenen Pilze von besonderem Interesse, die unter anderem die nachfolgend genannten Krankheitsbilder hervorrufen können:
Dennatophyten, wie z.B. Trichophyton spec, Microsporum spec, Epidermophyton floccosum oder Keratomyces ajelloi, die z.B. Fußmykosen (Tinea pedis) hervorrufen,
Hefen, wie z.B. Candida albicans, die Soor-Ösophagitis und Dermatitis hervorruft, Candida glabrata, Candida krusei oder Cryptococcus neoformans, die z.B. pulmonale Cryptococcose und auch Torulose hervorrufen können,
Schimmelpilze, wie z.B. Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger, die z.B. bronchopulmonale Aspergillose oder Pilzsepsis hervorrufen, Mucor spec, Absidia spec, oder Rhizopus spec, die z.B. Zygomykosen (intravasale Mykosen) hervorrufen, Rhinosporidium seeberi, der z.B. chronische granulomatöse Pharyngitis und Tracheitis hervorruft, Madurella myzetomatis, der z.B. subkutane Myzetome hervorruft, Histoplasma capsulatum, der z.B. retikuloendotheliale Zytomykose und M. Darling hervorruft, Coccidioides immitis, der z. B. pulmonale Coccidioidomykose und Sepsis her- vorruft, Paracoccidioides brasiliensis, der z.B. brasilianische Blastomykose hervorruft, Blas- tomyces dermatitidis, der z.B. Gilchrist-Kranklieit und nordamerikanische Blastomykose hervorruft, Loboa loboi, der z.B. Keloid-Blastomykose und Lobo's Krankheit hervorruft, und Sporothrix schenckii, der z.B. Sporotrichose (granulomatöse Hautmykose) hervorruft.
Im Folgenden sollen die Begriffe "fungizid" bzw. "Fungizid" gleichermaßen für die Begriffe "antimykotisch" bzw. "Antimykotikum" als auch für die Begriffe "fungizid" bzw. "Fungizid" im herkömmlichen Sinne, d.h. bezogen auf pflanzenpathogene Pilze, verwendet werden.
Fungizide Wirkstoffe, die mit Hilfe einer aus einem bestimmten Pilz, hier z.B. aus U. maydis, gewonnenen Mevalonat Kinase gefunden werden, können also auch mit einer Mevalonat Kinase aus zahlreichen anderen Pilzspezies, gerade auch mit weiteren pflanzenpathogenen Pilzen inter- agieren, wobei die Interaktion mit den unterschiedlichen in diesen Pilzen vorkommenden Meva- . lonat Kinasen nicht immer gleich stark sein muss. Dies erklärt unter anderem die beobachtete Selektivität der an diesem Enzym wirksamen Substanzen. - 1 -
Der Ausdruck "Kompetitor" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Eigenschaft der Verbindungen, mit anderen, gegebenenfalls zu identifizierenden Verbindungen um die Bindung an der Mevalonat Kinase zu kompetitieren und diese vom Enzym zu verdrängen bzw. von dieser verdrängt zu werden.
Der Ausdruck "Agonist", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das die Aktivität der Mevalonat Kinase beschleunigt oder verstärkt.
Der Ausdruck "Antagonist", oder auch "Inhibitor" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das die Aktivität der Mevalonat Kinase verlangsamt oder verhindert.
Der Ausdruck "Modulator", wie er hierin verwendet wird, stellt den Oberbegriff zu Agonist bzw. Antagonist dar. Modulatoren können kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide binden bzw. die deren Aktivität beeinflussen. Weiterhin können Modulatoren kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an ein Molekül binden, welches wiederum an die erfindungsgemäßen Polypeptide bindet, und dadurch deren biologische Aktivität beeinflusst. Modulatoren können natürliche Substrate und Liganden darstellen oder strukturelle oder funktioneile Mimetika davon. Bevorzugt handelt es sich beim Ausdruck "Modulator", wie er hierin verwendet wird, jedoch um solche Moleküle, die nicht die natürlichen Substrate bzw. Liganden darstellen.
Beschreibung der Erfindung
Die Mevalonat Kinase (EC 2.7.1.36), im Folgenden auch mit MK abgekürzt, katalysiert die Reaktion von Mevalonat und Adenosintriphosphat zu Phosphomevalonat und Adenosindiphosphat (Abbildung 1).
Die von der Mevalonat Kinase katalysierte Reaktion ist ein essentieller Schritt am Anfang der Biosynthese von Ergosterol, Dolichol oder Ubichinon (Lees et al., 1997, Biochemistry and molecular biology of sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry and Function of Sterols, 85-99; Mercer, 1984, The biosynthesis of ergosterol. Pestic. Sei. 15(2), 133-55; Karst und Lacroute, 1977, Ergosterol Biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae. Mol.Gen.Genet. 15 , 269- 277).
Gene kodierend für die Mevalonat Kinase wurden bereits in verschiedenen Pilzen identifiziert: in den Hefen Saccharomyces cerevisiae (Swissprot Accession No.: X55875) und Schizosaccharo- myces pombe (Swissprot Accession No.: AB000541), oder in Neurospora crassa (Swissprot Accession No.: NCB11N2). Aus den pflanzenpathogenen Pilzen Magnaporthe grisea und Fusarium sporotrichioides sind Sequenzfragmente des für die Mevalonat Kinase kodierenden Gens bekannt. Daneben wurde die Mevalonat Kinase auch in zahlreichen anderen Organismen gefunden, so z.B. in Homo sapiens (Swissprot: Accession No.: AK023087), Mus musculus (Swissprot: Accession No.: BC005606) oder Oryza sativa (Swissprot: Accession No.: AC091749).
Die Sequenzähnlichkeiten zwischen verschiedenen MKs sind innerhalb der eukaryontischen Klassen signifikant, während hingegen die Sequenzidentität zu den bakteriellen Enzymen weniger signifikant ist.
Die Mevalonat Kinase wurde aus verschiedenen Organismen isoliert, exprimiert. gereinigt und auch charakterisiert (Tanaka et al., 1990, Purifϊcation and regulation of mevalonate kinase from rat liver J. Biol. Chem. 265(4), 2391-98; Chu, Xiusheng und Li, Ding, 2003, Cloning, expression, and purification of His-tagged rat mevalonate kinase. Prot. Exp. Purific. 27, 165-70; Schulte et al., 2000, Purification and characterization of mevalonate kinase from suspension-cultured cells of Catharanthus roseus (L.) G. Don. Are. Biochem. Biophys. 378(2), 287-298; Oulmouden und Karst, 1991, Nucleotide sequence of the ERG 12 gene of Saccharomyces cerevisiae encoding mevalonate kinase. Curr. Genet. 19, 9-14).
In der vorliegenden Erfindung wird nun zum ersten Mal die vollständige Sequenz einer Mevalonat Kinase aus dem pflanzenpathogenen Pilz Ustilago maydis zur Verfügung gestellt, die die weitere Erforschung von Mevalonat Kinasen insbesondere aus pflanzenpathogenen Pilzen und damit die Erschließung eines neuen Zielproteins für die Identifizierung neuer fungizider Wirkstoffe ermöglicht.
Trotz umfangreicher Forschungen an der Mevalonat Kinase war bislang unbekannt, dass die Mevalonat Kinase in Pilzen ein Zielprotein (ein so genanntes "Target") fungizid wirksamer Substanzen sein kann.
Für bereits bekannte Inhibitoren der Mevalonat Kinase wurde keine fungizide Wirkung beschrieben (siehe z.B. Hinson et al., 1997, Post-translational regulation of mevalonate kinase by inter- mediates of the cholesterol and nonsterol isoprene biosynthetic pathways. J. Lipid Res. 38, 2216- 2223; Tanaka et al., 1990). Zwar verweisen verschiedene Veröffentlichung auf die besondere Rolle der Mevalonat Kinase (z.B. öulmouden und Karst, 1991) für den Stoffwechsel von Pilzen wie z.B. des Hefepilzes Saccharomyces cerevisiae und beschreiben auch, dass die Zerstörung des Hefe-Gens ERG12, welches für die Mevalonat Kinase kodiert, für S. cerevisiae letal ist (Öulmouden und Karst, 1990, Isolation of the ERG12 gene of Saccharomyces cerevisiae encoding mevalonate kinase. Gene, 88, 253-257). Keine der Veröffentlichungen nimmt jedoch Stellung zu der Frage, ob das Enzym Mevalonat Kinase durch Wirkstoffe beeinflusst, z.B. inhibiert werden kann, und ob eine Behandlung von Pilzen in vivo mit einem die Mevalonat Kinase modulierenden Wirkstoff zur Bekämpfung dieser Pilze möglich ist. Die Mevalonat Kinase wurde damit als Zielprotein für Fungizide bislang noch nicht beschrieben. Es sind keine Wirkstoffe bekannt, die eine fungizide Wirkung aufweisen und deren Wirkort die Mevalonat Kinase ist.
Damit wird in der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal gezeigt, dass die Mevalonat Kinase nicht nur ein insbesondere für Pilze wichtiges Enzym darstellt und deshalb in besonderem Maße dazu geeignet ist, als Zielprotein für die Suche nach weiteren und verbesserten fungizid wirksamen Wirkstoffen verwendet zu werden, sondern auch, dass die pilzliche Mevalonat Kinase tatsächlich in vitro und auch in vivo durch Wirkstoffe beeinflusst werden kann und dass diese als Fungizide verwendet werden können. Weiterhin werden Verfahren zur Verfügung gestellt, die zur Identifizierung solcher Fungizide verwendet werden können.
So wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Verfahren entwickelt, das geeignet ist, die enzymatische Aktivität der Mevalonat Kinase sowie die Hemmung dieser Aktivität durch eine oder mehrere Substanzen in einem so genannten Hemmtest zu bestimmen, und auf diese Weise Modulatoren, bevorzugt Inhibitoren des Enzyms, z.B. in HTS- und UHTS-Verfahren zu identifizieren. Identifizierte Inhibitoren, die in vitro bereits eine inhibierende Wirkung auf eine gegebene Mevalonat Kinase zeigen, können dann in vivo auf ihre fungizide Wirkung geprüft werden. Die Inhibitoren einer pilzlichen Mevalonat Kinase können als Fungizide insbesondere im Pflanzenschutz oder auch als Antimykotika in Pharmaindikationen verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung wird beispielsweise gezeigt, dass die Hemmung der Mevalonat Kinase mit einer in einem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Substanz zum Absterben oder zur Schädigung der behandelten Pilze in synthetischen Medien bzw. auf der Pflanze führt.
Mevalonat Kinase kann aus verschiedenen pflanzen- oder auch human- oder tierpathogenen Pilzen gewonnen werden, z.B. aus Pilzen wie dem pflanzenpathogenen Pilz U maydis. Zur Gewinnung der Mevalonat Kinase aus Pilzen kann das Gen z.B. rekombinant in Escherichia coli exprimiert und aus E. coli Zellen eine Enzympräparation hergestellt werden (Beispiel 1). Bevorzugt werden Mevalonat Kinasen aus pflanzenpathogenen Pilzen verwendet, um im Pflanzenschutz einsetzbare Fungizide zu identifizieren. Ist das Ziel die Identifizierung von Fungiziden bzw. Antimycotika, die in Pharmaindikationen verwendet werden sollen, empfiehlt sich der Einsatz von Mevalonat Kinasen aus human- bzw. tierpathogenen Pilzen.
Um eine Mevalonat Kinase aus einem pflanzenpathogenen Pilz zur Verfügung zu stellen, wurde für die Expression der von Umergl2 (Um steht für Ustilago maydis) gemäß SEQ FD NO:l kodierten Mevalonat Kinase UmErgl2 der zugehörige ORF (open reading frame) aus genomischer DNA nach dem Fachmann bekannten Methoden über genspezifische Primer amplifϊziert. Die entsprechende DNA wurde gemäß den Angaben des Herstellers in den Vektor pDEST15 (Invitrogen, ermöglicht die Einführung eines N- terminalen GST-Tags) kloniert. Das resultierende Plasmid pDEST15_umergl2 enthält die vollständige kodierende Sequenz von Umergl2 in einer N-termi- nalen Fusion mit einem GST-Tag aus dem Vektor. Das UmErgl2 Fusionsprotein besitzt eine berechnete Masse von 74,5 kDa (vgl. Beispiel 1 und Abbildung 3).
Das Plasmid pDEST15_umergl2 wurde dann zur rekombinanten Expression von UmErgl2 in E. coli BL21 (DE3) verwendet (vgl. Beispiel 1).
In der vorliegenden Erfindung wird damit auch eine weitere vollständige genomische Sequenz eines pflanzenpathogenen Pilzes kodierend für eine Mevalonat Kinase zur Verfügung gestellt, und deren Verwendung bzw. die Verwendung des davon kodierten Polypeptids zur Identifizierung von Inhibitoren des Enzyms sowie deren Verwendung als Fungizide beschrieben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb auch die für ein Polypeptid mit der enzyma- tischen Funktion einer Mevalonat Kinase kodierende Nukleinsäure aus dem Pilz Ustilago maydis.
Mevalonat Kinasen teilen sich homologe Bereiche. Typisch für Mevalonat Kinasen ist eine konservierte Region, die bei der Bindung von ATP beteiligt ist. Diese ATP-Bindungsstelle ist ein für Mevalonat Kinasen charakteristisches Sequenzmerkmal. Durch eine geeignete Suche in der PROSITE database kann ein solches Motiv identifiziert werden (Hofmann K., Bucher P., Falquet L., Bairoch A. (1999) "The PROSITE database, its Status in 1999". Nucleic Acids Res. 27, 215). Es kann wie folgt dargestellt werden: [LIVM]-[PK]-x-[GSTA]-x(0,l)-G-[LM]-[GS]-S-S-[GSA]-[GSTAC],
PROSITE ermöglicht Polypeptiden eine Funktion zuzuordnen und somit Mevalonat Kinasen als solche zu erkennen.
Bei der Darstellung des Prosite Motivs wird der "Ein-Buchstaben-Code" verwendet. Das Symbol "x" steht für eine Position, an der jede Aminosäure akzeptiert wird. Eine variable Position, an der verschiedene bestimmte Aminosäuren akzeptiert werden, wird in eckigen Klammern "[...]" dargestellt, wobei die an dieser Position möglichen Aminosäuren aufgezählt werden. Aminosäuren, die an einer bestimmten Position nicht akzeptiert werden, stehen dagegen in geschweiften Klammern "{...}". Ein Gedankenstrich "-" trennt die einzelnen Elemente bzw. Positionen des Motivs. Wiederholt sich eine bestimmte Position, z.B. "x", mehrfach hintereinander, kann dies durch Angabe der Zahl der Wiederholungen in einer nachfolgenden Klammer dargestellt werden, z.B. "x (3)", was für "x-x-x" steht.
Ein Prosite Motiv stellt also letztlich die Komponenten einer Konsensussequenz dar, sowie Abstände zwischen den beteiligten Aminosäuren und ist damit typisch für eine bestimmte Enzymklasse. Anhand dieses Motivs können auf Basis der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren weitere Polypeptide aus pflanzenpathogenen Pilzen indentifiziert bzw. zugeordnet werden, die zur selben Klasse wie das erfindungsgemäße Polypeptid gehören und deshalb auch in erfindungsgemäßer Weise verwendet werden können.
Im Falle der Mevalonat Kinase aus 17. maydis liegt dieses Motiv ebenso vor wie bei S. cerevisiae, S. pombe, Magnaporthe grisea oder N. crassa (vgl. Abbildung 2). Die spezifische Konsensus- sequenz für eine erfindungsgemäße Mevalonat Kinase, die zur Identifizierung bzw. Zuordnung weiterer erfindungsgemäßer Polypeptide genutzt werden kann, ist deshalb bevorzugt
P-x-G-x-G-L-G-S-S-A,
und besonders bevorzugt die Konsensussequenz
P-I-G-A-G-L-G-S-S-A. Das oben genannte Prosite Motiv bzw. die spezifische Konsensussequenz sind typisch für die erfindungsgemäßen Polypeptide, die anhand dieser Konsensussequenzen strukturell definiert werden können und damit auch eindeutig identifizierbar sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind deshalb auch Polypeptide aus pflanzenpathogenen Pilzen mit der enzymatischen Aktivität einer Mevalonat Kinase, die das vorstehend genannte Prosite Motiv [LIVM]-[PK]-x-[GSTA]-x(0,l)-G-[LM]-[GS]-S-S-[GSA]-[GSTAC] umfassen, bevorzugt solche Polypeptide, die das vorstehend genannte Motiv P-x-G-x-G-L-G-S-S-A umfassen, und besonders bevorzugt solche Polypeptide, die die Konsensussequenz P-I-G-A-G-L-G-S-S-A umfassen.
Aufgrund der Homologien, die bei speziesspezifischen Nukleinsäuren kodierend für Mevalonat Kinasen vorliegen, können auch Mevalonat Kinasen aus anderen pflanzenpathogenen Pilzen identifiziert und verwendet werden, um die oben gestellte Aufgabe zu lösen, d.h. sie können ebenfalls zum Identifizieren von Inhibitoren einer Mevalonat Kinase verwendet werden, welche wiederum als Fungizide im Pflanzenschutz verwendet werden können. Es ist jedoch auch denkbar einen anderen Pilz, der nicht pflanzenpathogen ist, bzw. dessen Mevalonat Kinase oder die dafür kodierende Sequenz zu verwenden, um fungizid wirkende Inhibitoren der Mevalonat Kinase zu identifizieren. Aufgrund der hier angegebenen Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 und eventuell davon abgeleiteten Primern sowie gegebenenfalls unter Zuhilfenahme des vorstehend gezeigten Prosite Motivs ist es dem Fachmann möglich, z.B. mittels PCR weitere für Mevalonat Kinasen kodierende Nukleinsäuren aus anderen (pflanzenpathogenen) Pilzen zu erhalten und zu identifizieren. Solche Nukleinsäuren und deren Verwendung in Verfahren zum Identifizieren von fungiziden Wirkstoffen werden als von der vorliegenden Erfindung umfasst betrachtet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind insbesondere bevorzugt die für die Mevalonat Kinase aus Ustilago maydis kodierenden Nukleinsäuren mit der SEQ ID NO:l sowie die für die Polypep- tide gemäß SEQ ID NO:2 oder aktive Fragmente davon kodierenden Nukleinsäuren.
Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich insbesondere um einzelsträngige oder doppelsträngige Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Ribonukleinsäuren (RNA). Bevorzugte Ausführungsformen sind Fragmente genomischer DNA, und cDNAs.
Besonders bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eine Sequenz ausgewählt aus a) einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, b) Sequenzen, die für ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst und c) Sequenzen, welche eine zumindest 90 %-ige Identität mit den unter a) und b) definierten Sequenzen aufweisen und für das Sequenzmotiv [LIVM]-[PK]-x- [GSTA]-x(0,l)-G-[LM]-[GS]-S-S-[GSA]-[GSTAC] kodieren.
Wie bereits vorstehend ausgeführt, ist die vorliegende Erfindung nicht nur auf die Verwendung von Mevalonat Kinase aus U. maydis beschränkt. In analoger und dem Fachmann bekannter Weise können auch aus anderen Pilzen, vorzugsweise aus pflanzenpathogenen Pilzen, Polypeptide mit der enzymatischen Aktivität einer Mevalonat Kinase verwendet oder gewonnen werden, die dann in einem erfindungsgemäßen Verfaliren eingesetzt werden können. Bevorzugt wird die Mevalonat Kinase aus U. maydis verwendet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin DNA-Konstrukte, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und einen homologen oder heterologen Promotor umfassen.
Der Ausdruck "homologer Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Pro- motor, der im Ursprungsorganismus die Expression des betreffenden Gens kontrolliert. Der Ausdruck "heterologer Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der andere Eigenschaften als derjenige Promotor aufweist, der im Ursprungsorganismus die Expression des betreffenden Gens kontrolliert.
Die Auswahl von heterologen Promotoren ist davon abhängig, ob zur Expression pro- oder eukaryotische Zellen oder zellfreie Systeme verwendet werden. Beispiele für heterologe Promotoren sind der 35S Promoter des Blumenkohlmosaikvirus für pflanzliche Zellen, der Promoter der Alkoholdehydrogenase für Hefezellen, die T3-, T7- oder SP6-Promotoren für prokaryotische Zellen oder zellfreie Systeme.
Bevorzugt sollten pilzliche Expressionssysteme wie z.B. das Pichia pastoris-System verwendet werden, wobei hier die Transkription durch den Methanol induzierbaren AOX-Promotor angetrieben wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Vektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, eine erfindungsgemäße regulatorische Region oder ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt enthalten. Als Vektoren können alle in molekularbiologischen Laboratorien verwendete Phagen, Plasmide, Phagmide, Phasmide, Cosmide, YACs, BACs, künstliche Chromosomen oder Partikel, die für einen Partikelbeschuss geeignet sind, verwendet werden. Bevorzugte Vektoren sind z.B. die p4XXprom. Vektorserie (Mumberg, D., Müller, R., Funk, M.,.1995. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene 156, 119-122) für Hefezellen, pSPORT- Vektoren (Fa. Life Technologies) für bakterielle Zellen, oder den Gateway Vektoren (Fa. Life Technologies) für verschiedene Expressionssysteme in bakteriellen Zellen, Pflanzen, P. pastoris, S. cerevisiae oder Insektenzellen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Wirtszellen, die eine erfindungsgemäße Nuk- leinsäure, ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten.
Der Ausdruck "Wirtszelle", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die natürlicher- weise die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren nicht enthalten.
Als Wirtszellen eignen sich sowohl prokaryotische Zellen, vorzugsweise E. coli, als auch eukaryo- tische Zellen, wie Zellen von Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Insekten, Pflanzen, Froschoozyten und Zelllinien von Säugern.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Polypeptide mit der enzymatischen Akti- vität einer Mevalonat Kinase, die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodiert werden.
Bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Polypeptide eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus
(a) der Sequenz gemäß SEQ ED NO:2,
(b) Sequenzen, welche eine 95 %ige Identität mit der unter a) definierten Sequenz haben, und das Sequenzmotiv [LIVM]-[PK]-x-[GSTA]-x(0,l)-G-[LM]-[GS]-S-S-[GSA]- [GSTAC] umfassen und
(c) Fragmente der unter a) und b) angegebenen Sequenzen, welche die gleiche enzymatische Aktivität aufweisen wie die unter a) definierte Sequenz.
Der Ausdruck "Polypeptide", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich sowohl auf kurze Aminosäureketten, die gewöhnlich als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, als auch auf längere Aminosäureketten, die gewöhnlich als Proteine bezeiclmet werden. Er umfasst Aminosäureketten, die entweder durch natürliche Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische Verfahren, die Stand der Technik sind, modifiziert sein können. Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in einem Polypeptid vorkommen, wie beispielsweise am Peptid-Rückgrat, an der Aminosäure-Seitenkette, am Amino- und/oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen beispielsweise Acetylierungen, Acylierungen, ADP-Ribosylie- rungen, Amidierungen, kovalente Verknüpfungen mit Flavinen, Häm-Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid-Derivaten, Lipiden oder Lipid-Derivaten oder Phosphatidylinositol, Cyclisierungen, Disulfidbrückenbildungen, Demethylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma-Carb- oxylierungen, Glycosylierungen, Hydroxylierungen, Iodierungen, Methylierungen, Myristoylie- rungen, Oxidationen, proteolytische Prozessierungen, Phosphorylierungen, Selenoylierungen und tRNA-vermittelte Additionen von Aminosäuren.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in Form "reifer" Proteine oder als Teile größerer Proteine, z.B. als Fusionsproteine, vorliegen. Weiterhin können sie Sezernierungs- oder "Leader"- Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine einfache Reinigung ermöglichen, wie mehrfache Histidin-Reste, oder zusätzliche stabilisierende Aminosäuren aufweisen. Die erfindungsgemäßen Proteine können ebenfalls so vorliegen, wie sie natürlicherweise in ihrem Herkunftsorganismus vorliegen, aus dem sie zum Beispiel direkt gewonnen werden können. In den erfindungsgemäßen Verfahren können ebenso aktive Fragmente einer Mevalonat Kinase eingesetzt werden, solange sie die Bestimmung der enzymatischen Aktivität des Polypeptids bzw. deren Inhibition durch eine Kandidatenverbindung ermöglichen.
Die in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Polypeptide können im Vergleich zu den entsprechenden Regionen von natürlich vorkommenden Mevalonat Kinasen Deletionen oder Aminosäuresubstitutionen aufweisen, solange sie zumindest noch die enzymatische Aktivität einer vollständigen Mevalonat Kinase zeigen. Konservative Substitutionen sind bevorzugt. Solche konservativen Substitutionen umfassen Variationen, wobei eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure aus der folgenden Gruppe ersetzt wird:
1. Kleine aliphatische, nicht-polare oder wenig polare Reste: Ala, Ser, Thr, Pro und Gly;
2. Polare, negativ geladene Reste und deren Amide: Asp, Asn, Glu und Gin;
3. Polare, positiv geladene Reste: His, Arg und Lys;
4. Große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, He, Val und Cys; und 5. Aromatische Reste: Phe, Tyr und Trp.
Ein mögliches Reinigungsverfahren der Mevalonat Kinase basiert auf präparativer Elektrophorese, FPLC, HPLC (z.B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasen- oder leicht hydrophoben Säulen), Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch-Chromatographie oder Affinitätschromatographie (vgl.. Beispiel 1).
Ein schnelles Verfahren zum Isolieren von Mevalonat Kinasen, die von Wirtszellen synthetisiert werden, beginnt mit der Expression eines Fusionsproteins, wobei der Fusionspartner auf einfache Weise affinitätsgereinigt werden kann. Der Fusionspartner kann beispielsweise ein GST-Tag sein (vgl. Beispiel 1). Das Fusionsprotein kann dann an Glutathion-Sepharosesäule gereinigt werden. Der Fusionspartner kann durch partielle proteolytische Spaltung beispielsweise an Linkem zwischen dem Fusionspartner und dem zu reinigenden erfindungsgemäßen Polypeptid abgetrennt werden. Der Linker kann so gestaltet werden, dass er Ziel-Aminosäuren, wie Arginin- und Lysin- Reste einschließt, die Stellen für eine Spaltung durch Trypsin definieren. Um solche Linker zu erzeugen, können Standard-Klonierungsverfahren unter Verwendung von Oligonukleotiden angewendet werden.
Weitere mögliche Reinigungsverfahren basieren wiederum auf präparativer Elektrophorese, FPLC, HPLC (z.B. unter Anwendung von Gelfütrations-, Reversphasen- oder leicht hydrophoben Säulen), Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch-Chromatographie und Affϊni- tätschromatographie .
Die Ausdrücke "Isolierung oder Reinigung", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide von anderen Proteinen oder anderen Makromolekülen der Zelle oder des Gewebes abgetrennt werden. Vorzugsweise ist eine die erfindungsgemäßen Polypeptide enthaltende Zusammensetzung hinsichtlich des Proteingehalts gegenüber einer Präparation aus den Wirtszellen mindestens 10-fach und besonders bevorzugt mindestens 100-fach angereichert.
Die erfϊndungsgemäßen Polypeptide können auch ohne Fusionspartner mit Hilfe von Antikörpern, die an die Polypeptide binden, affinitätsgereinigt werden.
Das Verfahren zum Herstellen von Polypeptiden mit der enzymatischen Aktivität einer Mevalonat Kinase, wie z.B. des Polypeptids UmErgl25 ist damit gekennzeichnet ist durch
(a) das Kultivieren einer Wirtszelle enthaltend zumindest eine exprimierbare Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Polypeptid aus Pilzen mit der enzymatischen Aktivität einer Mevalonat Kinase unter Bedingungen, die die Expression dieser Nukleinsäure gewährleisten, oder
(b) das Exprimieren einer exprimierbaren Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Polypeptid aus Pilzen mit der enzymatischen Aktivität einer Mevalonat Kinase in einem in vitro- System, und
(c) die Gewinnung des Polypeptids aus der Zelle, dem Kulturmedium oder dem in vitro- System.
Die so erhaltenen Zellen enthaltend das erfindungsgemäße Polypeptid oder das so erhaltene gerei- nigte Polypeptid sind geeignet, in Verfahren zum Identifizieren von Modulatoren bzw. Inhibitoren der Mevalonat Kinase verwendet zu werden. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung von Polypeptiden aus Pilzen, bevorzugt aus pflanzenpathogenen bzw. human- oder tierpathogenen Pilzen, welche die enzymatische Aktivität einer Mevalonat Kinase besitzen, in Verfahren zum Identifizieren von Inhibitoren dieser Polypeptide, und die Verwendung dieser Inhibitoren der Mevalonat Kinase als Fungizide.
Fungizide Wirkstoffe, die mit Hilfe einer Mevalonat Kinase aus einer bestimmten Pilzspezies gefunden werden, können auch mit Mevalonat Kinasen aus anderen Pilzspezies interagieren, wobei die Interaktion mit den unterschiedlichen in diesen Pilzen vorkommenden Mevalonat Kinasen nicht immer gleich stark sein muss. Dies erklärt unter anderem die Selektivität wirksamer Substanzen. Die Verwendung von Wirkstoffen, die mit einer Mevalonat Kinase einer bestimmten Pilz- Spezies gefunden wurden, als Fungizide auch bei anderen Pilze-Spezies kann darauf zurückgeführt werden, dass sich Mevalonat Kinasen aus verschiedenen Pilzspezies relativ nahe stehen und in größeren Bereichen eine ausgeprägte Homologie zeigen. So wird in Abbildung 2 deutlich, dass eine solche Homologie über beträchtliche Sequenzabschnitte hinweg zwischen U. maydis, S. cerevisiae, N. crassa, S. pombe und M. grisea besteht und damit die Wirkung der mit Hilfe der Mevalonat Kinase aus U. maydis gefundenen Substanzen nicht auf U. maydis beschränkt bleibt. In Verfahren zum Identifizieren von Fungiziden werden deshalb bevorzugt Polypeptide mit der enzymatischen Aktivität einer Mevalonat Kinase verwendet, die eine Konsensussequenz gemäß Abbildung 2 aufweisen.
Verfaliren, die geeignet sind, Modulatoren, insbesondere Inhibitoren bzw. Antagonisten der erfindungsgemäßen Polypeptide zu identifizieren, beruhen in aller Regel auf der Bestimmung der Aktivität bzw. der biologischen Funktionalität des Polypeptids. Dazu kommen prinzipiell sowohl auf ganzen Zellen beruhende Verfahren (in vivo Verfahren) in Frage, wie auch Verfahren, die auf der Verwendung des aus den Zellen isolierten Polypeptids beruhen, das in gereinigter oder teilweise gereinigter Form oder auch als Rohextrakt vorliegen kann. Diese zellfreien in vitro Verfahren können ebenso wie in vivo Verfahren im Labormaßstab, in bevorzugter Weise aber auch in HTS oder UHTS Verfahren genutzt werden. Im Anschluss an die in vivo oder in vitro Identifizierung von Modulatoren des Polypeptids können Tests an Pilzkulturen durchgeführt werden, um die fungizide Wirksamkeit der gefundenen Verbindungen zu prüfen.
Viele Testsysteme, die die Prüfung von Verbindungen und natürlichen Extrakten zum Ziel haben, sind bevorzugt auf hohe Durchsatzzahlen ausgerichtet, um die Zahl der untersuchten Substanzen in einem gegebenen Zeitraum zu maximieren. Testsysteme, die auf zellfreiem Arbeiten beruhen, brauchen gereinigtes oder semi-gereinigtes Protein. Sie sind geeignet für eine "erste" Prüfung, die in erster Linie darauf abzielt, einen möglichen Einfluss einer Substanz auf das Zielprotein zu detektieren. Ist eine solche erste Prüfung erfolgt und eine oder mehrere Verbindungen, Extrakte etc gefunden, kann die Wirkung solcher Verbindungen im Labor noch gezielter untersucht werden. So kann in einem ersten Schritt die Inhibierung oder Aktivierung des erfindungsgemäßen Polypeptids in vitro noch einmal geprüft werden, um im Anschluss daran die Wirksamkeit der Verbindung am Zielorganismus, hier einem oder mehreren pflanzenpathogenen Pilzen, zu testen. Die Verbindung kann dann gegebenenfalls als Ausgangspunkt für die weitere Suche und Entwicklung von fungiziden Verbindungen verwendet werden, die auf der ursprünglichen Struktur basieren, jedoch z.B. hinsichtlich Wirksamkeit, Toxizität oder Selektivität optimiert sind.
Um Modulatoren aufzufinden, kann z.B. ein synthetischer Reaktionsmix (z.B. Produkte der in vitro Transkription) oder ein zellulärer Bestandteil, wie eine Membran, ein Kompartiment oder irgend- eine andere Präparation, die die erfindungsgemäßen Polypeptide enthält, zusammen mit einem gegebenenfalls markierten Substrat oder Liganden der Polypeptide in Gegenwart und Abwesenheit eines Kandidatenmoleküls, das ein Antagonist sein kann, inkubiert werden. Die Fähigkeit des Kandidatenmoleküls, die Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide zu hemmen, wird z.B. erkennbar an einer verringerten Bindung des gegebenenfalls markierten Liganden oder an einer verringerten Umsetzung des gegebenenfalls markierten Substrates. Moleküle, die die biologische Aktivität der erfϊndungsgemäßen Polypeptide hemmen, sind gute Antagonisten.
Ein Beispiel für ein Verfahren, mit welchem Modulatoren der erfindungsgemäßen Polypeptide aufgefunden werden können, ist ein Verdrängungstest, bei dem man unter dafür geeigneten Bedingungen die erfindungsgemäßen Polypeptide und einen potenziellen Modulator mit einem Molekül, das bekanntermaßen an die erfindungsgemäßen Polypeptide bindet, wie einem natürlichen Substrat oder Liganden oder einem Substrat- oder Liganden-Mimetikum zusammenbringt. Die erfindungsgemäßen Polypeptide selbst können markiert werden, z.B. fluorimetrisch oder colorimetrisch, so dass man die Anzahl der Polypeptide, die an einen Liganden gebunden sind oder die eine Umsetzung mitgemacht haben, exakt bestimmen kann. Ebenso kann jedoch die Bindung mittels des gegebenenfalls markierten Substrats, Liganden bzw. Substratanalogen verfolgt werden. Auf diese Weise lässt sich die Effektivität von Antagonisten ermessen.
Effekte wie Zelltoxizität werden in diesen in vitro Systemen in der Regel ignoriert. Die Testsysteme überprüfen dabei sowohl inhibierende bzw. suppressive Effekte der Substanzen, als auch stimulatorische Effekte. Die Effektivität einer Substanz kann durch konzentrationsabhängige Test- reihen überprüft werden. Kontrollansätze olme Testsubstanzen bzw. ohne Enzym können zur Bewertung der Effekte herangezogen werden.
Durch die anhand der vorliegenden Erfindung verfügbaren, für eine erfindungsgemäße ' Mevalonat Kinase kodierende Nukleinsäuren enthaltenden Wirtszellen, wird die Entwick- lung von Testsystemen, die auf Zellen basieren, zur Identifizierung von Substanzen ermöglicht, die die Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide modulieren.
Vorzugsweise handelt es sich bei den zu identifizierenden Modulatoren um kleine organischchemische Verbindungen.
Ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die die Aktivität einer Mevalonat Kinase aus Pilzen moduliert und die als Fungizid im Pflanzenschutz verwendet werden kann, besteht demnach bevorzugt darin, dass man
a) ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Mevalonat Kinase, bevorzugt aus Pilzen und besonders bevorzugt aus pflanzenpathogenen Pilzen, oder eine Wirtszelle enthaltend ein solches Polypeptid mit einer chemischen Verbindung oder mit einem Gemisch von chemischen Verbindungen unter Bedingungen in Kontakt bringt, die die Interaktion der chemischen Verbindungen mit dem Polypeptid erlauben,
b) die Aktivität dieses Polypeptids bei Abwesenheit der chemischen Verbindung mit der Aktivität des Polypeptids bei Anwesenheit der chemischen Verbindung oder des Gemisches von chemischen Verbindungen vergleicht,
c) die chemische Verbindung auswählt, die die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids spezifisch moduliert, und gegebenenfalls
d) die fungizide Wirkung der ausgewählten Verbindung in vivo prüft.
Besonders bevorzugt wird dabei diejenige Verbindung bestimmt, die die Aktivität des erfindungs- gemäßen Polypeptids spezifisch inhibiert. Der Begriff "Aktivität", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die biologische Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Tatsache genutzt, dass bei der Reaktion der Mevalonat Kinase ein Molekül Adenosindiphosphat (ADP) freigesetzt wird. Die Aktivität bzw. die Ab- oder Zunahme der Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids kann deswegen durch den Nachweis des entstehenden ADP bestimmt werden. Dabei wird die geringere bzw. inhibierte Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids anhand des Nachweises des entstehenden ADP durch Kopplung an die nachgeschaltete Reaktion der Pyruvat Kinase und Laktat Dehydrogenase verfolgt. Die Pyruvatkinase setzt dabei unter Verbrauch von ADP Phosphoenolpyruvat zu Pyruvat um, welches wiederum von der Laktat Dehydrogenase zur Oxidation von NADH zu NAD verwendet wird. Die durch die gekoppelte Reaktion steigende NAD-Konzentration bzw. abnehmende NADH-Kon- zentration kann photospektrometrisch durch Absorptions- oder Fluoreszenzmessung (bei 340 nm bzw. einer Anregungswellenlänge von 360nm und einer Emissionswellenlänge von 465nm) bestimmt werden.
Die Messung kann auch in für HTS- oder UHTS-Assays gängigen Formaten erfolgen, z.B. in Mikrotiterplatten, in denen z.B. ein Gesamtvolumen von 5 bis 50 μl pro Ansatz bzw. pro Well vorgelegt wird und die einzelnen Komponenten in der gewünschten Endkonzentrationen vorliegen (vgl. Beispiel 2). Dabei wird die zu testende, potentiell die Aktivität des Enzyms inhibierende oder aktivierende Verbindung (Kandidatenmolekül) z.B. in einer geeigneten Konzentration in Testpuffer enthaltend Mevalonat, Adenosintriphosphat, Phosphoenolpyruvat und die gekoppelten Hilfsenzyme Pyruvat Kinase und Laktat Dehydrogenase vorgelegt. Dann wird das erfindungsgemäße Polypeptid in Testpuffer zugegeben und die Reaktion dadurch gestartet. Der Ansatz wird dann bei einer geeigneten Temperatur inkubiert und die Absorptionsabnahme bei 340 nm gemessen. Die Inkubationsdauer kann dabei über einen größeren Zeitraum variiert werden. Bevorzugt erfolgt eine Inkubation für 5 bis 60, bevorzugt für 15 bis 45 Minuten, im Mittel also etwa 30 Minuten. Der gekoppelte Enzymtest wird z.B. in Tanaka et al., 1990, beschrieben.
Eine weitere Messung erfolgt in einem entsprechenden Ansatz, jedoch ohne Zugabe eines Kandidatenmoleküls und ohne Zugabe eines erfindungsgemäßen Polypeptids (Negativkontrolle). Eine weitere Messung erfolgt wiederum bei Abwesenheit eines Kandidatenmoleküls, jedoch bei Anwesenheit des erfindungsgemäßen Polypeptids (Positivkontrolle). Negativ- und Positivkontrolle erge- ben damit die Vergleichswerte zu den Ansätzen bei Anwesenheit eines Kandidatenmoleküls.
Um optimale Bedingungen für ein Verfaliren zum Identifizieren von Inhibitoren der Mevalonat Kinase bzw. zur Bestimmung der Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide zu ermitteln, kann es vorteilhaft sein, den jeweiligen KM-Wert des verwendeten erfindungsgemäßen Polypeptids zu bestimmen. Dieser gibt dann Aufschluss über die bevorzugt zu verwendende Konzentration des bzw. der Substrate. Im Fall der Mevalonat Kinase aus U. maydis konnte ein KM von 130 μM für Adenosintriphosphat und ein KM von 200 μM für Mevalonat bestimmt werden.
Mit Hilfe der vorstehend beispielhaft beschriebenen Verfahren konnten im Rahmen der vorliegenden Erfindung Verbindungen identifiziert werden, die die pilzliche Mevalonat Kinase inhibieren, und die in der Lage sind, Pilze verschiedener Spezies zu schädigen (z.B. Wachstumshemmung) bzw. abzutöten.
Es versteht sich von selbst, dass neben den genannten Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität einer Mevalonat Kinase bzw. der Inhibition dieser Aktivität und zum Identifizieren von Fungiziden auch andere, z.B. bereits bekannte, Verfahren bzw. Hemmtests verwendet wer- den können, solange diese Verfahren es gestatten, die Aktivität einer Mevalonat Kinase zu bestimmen und eine Inhibition dieser Aktivität durch eine Kandidtatenverbindung zu erkennen. Ein alternatives Verfahren beruht z.B. auf dem Einsatz radioaktiv markierten ATPs (Öulmouden und Karst, 1991).
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren koimten auf diese Weise Inhibitoren der Mevalonat Kinase identifiziert werden.
In Tabelle I wird beispielhaft eine Verbindung gezeigt, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren als ein Inhibitor der Mevalonat Kinase identifiziert werden konnte.
Tabelle I
Figure imgf000022_0001
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte weiter gezeigt werden, dass die mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten Inhibitoren einer erfindungsgemäßen Mevalonat Kinase geeignet sind, Pilze zu schädigen oder abzutöten.
Dazu kann z.B. in die Kavitäten von Mikrotiterplatten eine Lösung des zu prüfenden Wirkstoffs pipettiert werden. Nachdem das Lösungsmittel abgedampft ist, wird zu jeder Kavität Medium hinzugefügt. Das Medium wird vorher mit einer geeigneten Konzentration von Sporen bzw. Mycel des zu prüfenden Pilzes versetzt. Die resultierenden Konzentrationen des Wirkstoffes betragen z.B. 0,1, 1, 10 und 100 ppm.
Die Platten werden anschließend auf einem Schüttler bei einer Temperatur von etwa 22°C inku- biert, bis in der unbehandelten Kontrolle ein ausreichendes Wachstum feststellbar ist.
Die Auswertung erfolgt photometrisch bei einer Wellenlänge von 620 nm. Aus den Messdaten der verschiedenen Konzentrationen kann die Wirkstoff dosis bestimmt werden, die zu einer 50 %-igen Hemmung des Pilzwachstums gegenüber der unbehandelten Kontrolle führt (ED50). Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass mit einem erfindungsgemäßen Verfahren Inliibitoren der Mevalonat Kinase identifiziert werden konnten, die eine fungizide Wirkung in vivo besitzen. In Tabelle TJ sind die Ergebnisse eines solchen Tests als ED50- Werte für eine in einem erfmduiigs- gemäßen Verfaliren gefundene Verbindung (vgl. Tab. I) beispielhaft wiedergegeben. Die Verbindung zeigt bei verschiedenen Pilzen eine fungizide Wirkung.
Tabelle II
Figure imgf000023_0001
Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher ebenfalls auf die Verwendung von Modulatoren der Mevalonat Kinase aus Pilzen, bevorzugt aus pflanzenpathogenen Pilzen als Fungizide und auf Verfahren zum Bekämpfen von Pilzbefall bei Pflanzen, indem man einen Inhibitor der pilzlichen Mevalonat Kinase auf den Pilz bzw. die vom Pilz befallene Pflanze einwirken lässt. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Fungizide, die mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifiziert wurden.
Verbindungen, die mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifiziert werden, und die aufgrund der Inhibition der pilzlichen Mevalonat Kinase eine fungizide Wirkung aufweisen, können somit zur Herstellung von fungiziden Mitteln verwendet werden. Die identifzierten Wirkstoffe können in Abhängigkeit von ihren jeweiligen physikalischen uήd/oder chemischen Eigenschaften in die üblichen Formulierungen überführt werden, wie Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Pulver, Schäume, Pasten, Granulate, Aerosole, Feinstverkapselungen in polymeren Stoffen und in Hüllmassen für Saatgut, sowie ULV-Kalt- und Warmnebel-Formulierungen. Diese Formulierungen werden in bekannter Weise hergestellt, z.B. durch Vermischen der Wirkstoffe mit Streckmitteln, also flüssigen Lösungsmitteln, unter Druck stehenden verflüssigten Gasen und/oder festen Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln,
• also Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln und/oder schaumerzeugenden Mitteln. Im Falle der Benutzung von Wasser als Streckmittel können z.B. auch organische Lösungsmittel als Hilfslösungs- mittel verwendet werden. Als flüssige Lösungsmittel kommen im wesentlichen in Frage: Aromaten, wie Xylol, Toluol oder Alkylnaphthaline, chlorierte Aromaten oder chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Chlorbenzole, Chlorethylene oder Methylenchlorid, aliphatische Kohlenwasser- stoffe, wie Cyclohexan oder Paraffine, z.B. Erdölfraktionen, Alkohole, wie Butanol oder Glycol sowie deren Ether und Ester, Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon oder Cyclohexanon, stark polare Lösungsmittel, wie Dimethylformamid und Dünethylsulfoxid, sowie Wasser. Mit verflüssigten gasförmigen Streckmitteln oder TrägerstofFen sind solche Flüssigkeiten gemeint, welche bei normaler Temperatur und unter Normaldruck gasförmig s d, z.B. Aerosol- Treibgase, wie Halogenkohlenwasserstoffe sowie Butan, Propan, Stickstoff und Kohlendioxid. Als feste Trägerstoffe kommen in Frage: z.B. natürliche Gesteinsmehle, wie Kaoline, Tonerden, Talkum, Kreide, Quarz, Attapulgit, Montmorillonit oder Diatomeenerde und synthetische Gesteinsmehle, wie hochdisperse Kieselsäure, Aluminiumoxid und Silikate. Als feste Trägerstoffe für Granulate kommen in Frage: z.B. gebrochene und fraktionierte natürliche Gesteine wie Calcit, Marmor, Bims, Sepiolith, Dolomit sowie synthetische Granulate aus anorganischen und organischen Mehlen sowie Granulate aus organischem Material wie Sägemehl, Kokosnußschalen, Maiskolben und Tabakstengel. Als Emu- lgier und/oder schaumerzeugende Mittel kommen in Frage: z.B. nichtionogene und anionische Emul- gatoren, wie Polyoxyethylen-Fettsäureester, Polyoxyethylen-Fettalkoholether, z.B. Alkylarylpolygly- colether, Alkylsulfonate, Alkylsulfate, Arylsulfonate sowie Eiweißhydrolysate. Als Dispergiermittel kommen in Frage: z.B. Lignin-Sulfitablaugen und Methylcellulose.
Es können in den Formulierungen Haftmittel wie Carboxymethylcellulose, natürliche und synthetische pulverige, körnige oder latexfonnige Polymere verwendet werden, wie Gummiarabicum, Polyvinylalkohol, Polyvinylacetat, sowie natürliche Phospholipide, wie Kephaline und Lecithine, und synthetische Phospholipide. Weitere Additive können mineralische und vegetabile Öle sein.
Es können Farbstoffe wie anorganische Pigmente, z.B. Eisenoxid, Titanoxid, Ferrocyanblau und organische Farbstoffe, wie Alizarin-, Azo- und Metallphthalocyaninfarbstoffe und Spurennälirstoffe, wie Salze von Eisen, Mangan, Bor, Kupfer, Kobalt, Molybdän und Zink verwendet werden.
Die Formulierungen enthalten im allgemeinen zwischen 0,1 und 95 Gewichtsprozent Wirkstoff, vorzugsweise zwischen 0,5 und 90 %.
Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können als solche oder in ihren Formulierungen auch in Mischung mit bekannten Fungiziden, Bakteriziden, Akariziden, Nematiziden oder Insektiziden verwendet werden, um so z.B. das Wirkungsspektrum zu verbreitem oder Resistenzentwicklungen vorzubeugen. In vielen Fällen erhält man dabei synergistische Effekte, d.h. die Wirksamkeit der Mischung ist größer als die Wirksamkeit der Einzelkomponenten.
Beim Einsatz der erfindungsgemäßen Verbindungen als Fungizide können die Aufwandmengen je . nach Applikation innerhalb größerer Bereiche variiert werden. Erfindungsgemäß können alle Pflanzen und Pflanzenteile behandelt werden. Unter Pflanzen werden hierbei alle Pflanzen und Pflanzenpopulationen verstanden, wie erwünschte und unerwünschte Wildpflanzen oder Kulturpflanzen (einschließlich natürlich vorkommender Kulturpflanzen). Kulturpflanzen können Pflanzen sein, die durch konventionelle Züchtungs- und Optimierungs- methoden oder durch biotechnologische und gentechnologische Methoden oder Kombinationen dieser Methoden erhalten werden können, einschließlich der transgenen Pflanzen und einschließlich der durch Sortenschutzrechte schützbaren oder nicht schützbaren Pflanzensorten. Unter Pflanzenteilen sollen alle oberirdischen und unterirdischen Teile und Organe der Pflanzen, wie Spross, Blatt, Blüte und Wurzel verstanden werden, wobei beispielhaft Blätter, Nadeln, Stängel, Stämme, Blüten, Fruchtkörper, Früchte und Samen sowie Wurzeln, Knollen und Rhizome aufgeführt werden. Zu den Pflanzenteilen gehört auch Emtegut sowie vegetatives und generatives Vermehrungsmaterial, beispielsweise Stecklinge, Knollen, Rhizome, Ableger und Samen.
Die erfindungsgemäße Behandlung der Pflanzen und Pflanzenteile mit den Wirkstoffen erfolgt direkt oder durch Einwirkung auf deren Umgebung, Lebensraum oder Lagerraum nach den üblichen Behandlungsmethoden, z.B. durch Tauchen, Sprühen, Verdampfen, Vernebeln, Streuen, Aufstreichen und bei Vermehrungsmaterial, insbesondere bei Samen, weiterhin durch ein- oder mehrschichtiges Umhüllen.
Die nachfolgenden Beispiele illustrieren verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung und sind nicht limitierend auszulegen.
Beispiele
Beispiel 1
Klonierung. Expression und Reinigung von umerg!2 bzw. UmErgl2 aus Ustilago maydis
Für die Klonierung von Umergl2 bzw. dessen Expression wurde der ORF aus genomischer DNA aus Ustilago maydis über genspezilϊsche Primer amplifiziert. Die entsprechende DNA, ein Ampli- kon von 1059 bp Länge, wurde in den Vektor pDON201 von Invitrogen zwischenkloniert und anschließend über Rekombination in den Vektor pDEST15 (Invitrogen) kloniert. Das resultierende Plasmid pDEST15_umergl2 enthält die vollständige kodierende Sequenz von umergl2 in einer N- terminalen Fusion mit dem GST-Tag, das Bestandteil des Vektors ist. Das UmErgl2 Fusionspro- tein besitzt eine berechnete Masse von 74,5 kDa.
Für die heterologe Expression wurde das Plasmid pDEST15__umergl2 in E. coli BL21 (DE3) transformiert. Von den Transformanten wurde eine Vorkultur in 50 ml Selektionsmedium angeimpft. Diese Zellen wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und anschließend 1:20 in Selektionsmedium (LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin) verdünnt. Die Induktion erfolgte bei einer ODβoonm von 0,8 mit 0,1 mM IPTG (Endkonzentration) bei 30°C. Nach 3 h Induktion wurden die Zellen geemtet und direkt aufgearbeitet.
Der Aufschluss erfolgte durch Sonifϊzieren in Lysepuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8, 5 M DTT, 5 mM MgCl2, 0,1 % Triton, 10 μM ATP) nach vorangegangener Lysozym Behandlung (15 Minuten, 30°C, 1 mg/ml final in Lysepuffer). Die durch Zentrifugation (15 min bei 4°C, 10 000 g) erhaltene Cytoplasmafraktion wurde für die Aufreinigung des exprimierten Proteins verwendet. Nach Filtration durch eine 0,45 μm Nalgene Filtrationseinheit erfolgte die Reinigung nach dem Standartprotokoll des Herstellers für Glutathion-Sepharose Säulen unter Verwendung des folgenden Laufpuffers (100 mM Tris/HCl, pH 7,5; 10 μM ATP, 5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 10 % Glyce- rin). Als Elutionspuffer wurde 50 mM Tris/HCl pH 8,0, 5 mM DTT, 5 mM MgCl2, 10 μM ATP, 10 % Glycerin mit 20 mM reduziertem Glutathion verwendet. Das gereinigte Protein wurde bei - 80°C gelagert. Aus 250 ml Kulturmedium konnte etwa 2,5 mg lösliches Protein isoliert werden, das in Verfahren zum Identifizieren von Modulatoren der Mevalonat Kinase verwendet werden konnte. Beispiel 2
(A) Identifzierung von Modulatoren der Mevalonat Kinase in 384-Well-MTP in einem gekoppelten Assav
Zur Identifizierung von Modulatoren der Mevalonat Kinase wurden 384-Well-Mikrotiterplatten von Greiner verwendet.
In die erste und zweite Spalte wurde die Negativ-Kontrolle pipettiert. Diese setzte sich zusammen aus 5 μl Lösungl ( 5 % DMSO in H20), 20 μl Lösung2 (100 mM Tris/HCl pH 7,5, 15 mM MgCl2, 12,5 mM Glutathion, 0,25 % BSA) und 25 μl Lösung 3 (100 mM Tris/HCl pH 7,5, 15 mM MgCl2, 20 mM KCl, 0,6 mM ATP, 0,8 mM PEP, 0,6 mM NADH, 20 mM DTT, 0,02 % Tween 20) mit 200 mU Pyruvat Kinase, 400 mU Lactat Dehydrogenase.
In die dritte und vierte Spalte wurde die Positiv-Kontrolle pipettiert. Diese setzte sich zusammen aus 5μl Lösungl (5 % DMSO in H20), 20 μl Lösung4 (100 mM Tris/HCl pH 7,5, 15 mM MgCl2, 12,5 mM Glutathion, 0,25 % BSA, 0,1 μg Mevalonat Kinase) und 25 μl Lösung 3 (100 mM Tris/HCl pH 7,5, 15 mM MgCl2, 20 mM KCl, 0,6 mM ATP, 0,8 mM PEP, 0,6 mM NADH, 20 mM DTT, 0,02 % Tween 20) mit 200 mU Pyruvat Kinase, 400 mU Lactat Dehydrogenase.
In die verbleibenden Spalten wurde eine Prüfsubstanz in einer Konzentration von 2 μM in DMSO vorgelegt, wobei zum Verdünnen der Substanz H20 verwendet wurde. Nach Zugabe von 20 μl Lösung 4 (100 mM Tris/HCl pH 7,5, 15 mM MgCl2, 12,5 mM Glutathion, 0,25 % BSA, 0,1 μg Mevalonat Kinase) wurden zum Start der Reaktion 25 μl Lösung 3 (100 mM Tris/HCl pH 7,5, 15 mM MgCl2, 20 mM KCl, 0,6 mM ATP, 0,8 mM PEP, 0,6 mM NADH, 20 mM DTT, 0,02 % Tween 20) mit 200 mU Pyruvat Kinase und 400 mU Lactat Dehydrogenase zugegeben. Es folgte eine Inkubation bei 25 °C für 20 Minuten. Die anschließende Messung erfolgte durch Bestimmung der Absorption bei 340 nm in einem für MTP geeigneten SPECTRAFluor Plus von Tecan.
Beispiel 3
Nachweis der fungiziden Wirkung der identifizierten Inhibitoren der Mevalonat Kinase
In die Kavitäten von Mikrotiterplatten wurde eine methanolische Lösung des anhand eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten Wirkstoffs in der gewünschten Menge, versetzt mit einem Emulgator, pipettiert. Nachdem das Lösungsmittel abgedampft war, wurden je Kavität 200 μl Potatoe-Dextrose-Medium hinzugefügt. Das Medium wurde vorher mit geeigneten Kon- zentrationen von Sporen bzw. Mycelen des zu prüfenden Pilzes versetzt.
Die resultierende Konzentration des Emulgators betrug 300 ppm. Die Platten wurden anschließend auf einem Schüttler bei einer Temperatur von 22°C inkubiert, bis in der unbehandelten Kontrolle ein ausreichendes Wachstum feststellbar war. Die Ausweitung erfolgte photometrisch bei einer Wellenlänge von 620 nm. Aus den Messdaten der verschiedenen Konzentrationen wird die Wirkstoffdosis, die zu einer 50 %igen Hemmung des Pilzwachstums gegenüber der unbehandelten Kontrolle führt (ED50), berechnet.
Literatur
1. Chu, Xiusheng und Li, Ding, 2003, Cloning, expression, and purification of His-tagged rat mevalonate kinase. Prot. Exp. Purific. 27, 165-70.
2. Hinson et al., 1997, Post-translational regulation of mevalonate kinase by intermediates of the cholesterol and nonsterol isoprene biosynthetic pathways. J. LipidRes. 38, 2216-2223.
3. Hofmann K. et al., 1999, The PROSITE database, its Status in 1999. Nucleic Acids Res. 27, 215.
4. Karst und Lacroute, 1977, Ergosterol Biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae. Mol.Gen.Genet. 154, 269-277. 5. Lees et al., 1997, Biochemistry and molecular biology of sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry and Function ofSterols, 85-99.
6. Mercer, 1984, The biosynthesis of ergosterol. Pestic. Sei. 15(2), 133-55.
7. Mumberg et al, 1995, Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene 156, 119-122. 8. Öulmouden und Karst, 1990, Isolation of the ERG12 gene of Saccharomyces cerevisiae encoding mevalonate kinase. Gene, 88, 253-257
9. Öulmouden und Karst, 1991, Nucleotide sequence of the ERG 12 gene of Saccharomyces cerevisiae encoding mevalonate kinase. Curr. Genet. 19, 9-14.
10. Schulte et al., 2000, Purification and characterization of mevalonate kinase from suspension-cultured cells of Catharanthus roseus (L.) G. Don. Are. Biochem. Biophys. 378(2), 287-298.
11. Tanaka et al., 1990, Purification and regulation of mevalonate kinase from rat liver J. Biol. Chem. 265(4), 2391-98.
12. Thompson et al, 1994, Nucleic Acids Research 22, 4673-4680.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Identifizieren von Fungiziden, dadurch gekennzeichnet, dass man
(a) ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Mevalonat Kinase mit einer chemischen Verbindung oder einem Gemisch von chemischen Verbindungen unter Bedingungen, die die Interaktion der chemischen Verbindung mit dem Polypeptid erlauben, in Kontakt bringt,
(b) die Aktivität der Mevalonat Kinase bei Abwesenheit der chemischen Verbindung mit der Aktivität der Mevalonat Kinase bei Anwesenheit der chemischen Verbindung oder des Gemisches von chemischen Verbindungen vergleicht, und (c) die chemische Verbindung, die die Mevalonat Kinase spezifisch inhibiert, auswählt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man
(a) das bei der Reaktion der Mevalonat Kinase entstehende ADP mit Hilfe einer Pyruvatkinase zu ATP umsetzt, (b) das dabei entstehende Pyruvat mit Hilfe einer Laktat Dehydrogenase unter NADH- Verbrauch zu Laktat umsetzt, und
(c) den Verbrauch des NADHs anhand einer Absorptionsänderung verfolgt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Hemmung der enzymatischen Aktivität anhand einer geringeren Zunahme der ADP-Konzentration bestimmt.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem weiteren Schritt die fungizide Wirkung der identifizierten Verbindung testet, indem man sie mit einem Pilz in Kontakt bringt.
5. Verfaliren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Mevalonat Kinase aus einem Pilz verwendet.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Mavalonat Kinase aus einem pflanzenpathogenen Pilz verwendet.
7. Verfahren zum Bekämpfen von pflanzenpathogenen Pilzen, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Inhibitor einer pilzlichen Mevalonat Kinase auf den Pilz oder die vom Pilz befallene Pflanze einwirken lässt.
8. Verwendung von Inhibitoren eines Polypeptids mit der Aktivität einer Mevalonat Kinase, welche durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 identifiziert werden, als Fungizide.
9. Nukleinsäure, kodierend für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Mevalonat Kinase, dadurch gekennzeichnet, dass sie für eine Mevalonat Kinase aus U. maydis kodiert.
10. Nukleinsäuren aus pflanzenpathogenen Pilzen, dadurch gekeimzeiclmet, dass sie eine Sequenz umfassen, die ausgewählt ist aus: a) einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, b) Sequenzen, die für ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst und c) Sequenzen, welche eine zumindest 90 %ige Identität mit den unter a) und b) definierten Sequenzen aufweisen und für das Sequenzmotiv [LIVM]-[PK]-x-[GSTA]- x(0,l)-G-[LM]-[GS]-S-S-[GSA]-[GSTAC] kodieren.
11. DNA-Konstrukt umfassend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 oder 10 und einen heterologen Promotor.
12. Vektor umfassend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 oder 10, oder ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 11.
13. Vektor gemäß Anspruch 12, dadurch gekeimzeichnet, dass die Nukleinsäure funktioneil mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, die die Expression der Nukleinsäure in pro- oder eukaryotischen Zellen gewährleisten.
14. Wirtszelle enthaltend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 oder 10, ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 11 oder- einen Vektor gemäß Anspruch 12 oder 13.
15. Wirtszelle gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine prokaryo- tische oder eukaryotische Zelle handelt.
16. Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Mevalonat Kinase, welches von einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 9 oder 10 kodiert wird.
17. Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Mevalonat Kinase, welches eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ JD NO: 2 umfasst.
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0505941A2 (de) * 1991-03-28 1992-09-30 E.R. SQUIBB & SONS, INC. Peptifluorin und Neopeptifluorin
EP0955363A2 (de) * 1998-05-06 1999-11-10 F. Hoffmann-La Roche Ag DNS Sequenzen kodierend für Enzyme für die Herstellung von Isoprenoiden
US20020119546A1 (en) * 1998-11-05 2002-08-29 Falco Saverio Carl Squalene synthesis enzymes
WO2003012129A2 (en) * 2001-07-25 2003-02-13 Arrow Therapeutics Limited Shikimate kinase from s. aureus for drug discovery
WO2004070038A1 (de) * 2003-02-05 2004-08-19 Basf Aktiengesellschaft Mevalonat kinase als target für fungizide

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0505941A2 (de) * 1991-03-28 1992-09-30 E.R. SQUIBB & SONS, INC. Peptifluorin und Neopeptifluorin
EP0955363A2 (de) * 1998-05-06 1999-11-10 F. Hoffmann-La Roche Ag DNS Sequenzen kodierend für Enzyme für die Herstellung von Isoprenoiden
US20020119546A1 (en) * 1998-11-05 2002-08-29 Falco Saverio Carl Squalene synthesis enzymes
WO2003012129A2 (en) * 2001-07-25 2003-02-13 Arrow Therapeutics Limited Shikimate kinase from s. aureus for drug discovery
WO2004070038A1 (de) * 2003-02-05 2004-08-19 Basf Aktiengesellschaft Mevalonat kinase als target für fungizide

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