Die
Thioredoxin Reduktase (EC 1.8.1.9, früher EC 1.6.4.5), auch bekannt
als NADP-Thioredoxin Reduktase, NADPH-Thioredoxin Reduktase oder
Thioredoxin: NADP+-Oxidoreduktase, katalysiert
die Reaktion von NADP+ und Thioredoxin zu
Thioredoxin-Disulfid und NADPH + H+ (1). Die Reaktion der Thioredoxin Reduktase
ist ein essentieller Schritt im Recycling der oxidierten Form von
Thioredoxin (Disulfid-Form) wodurch der Zelle reduziertes Thioredoxin
zur Verfügung
gestellt wird.
Die
cytoplasmatische Thioredoxin Reduktase – im Folgenden auch als TRR
bezeichnet – gehört zur Klasse
II der Pyridin-nukleotid-disulfid-Oxidoreduktasen. Das Enzym recycelt
die oxidierte Form von Thioredoxin und stellt der Zelle wieder reduziertes
Thioredoxin zur Verfügung.
Die TRR ist daher wichtig für
den Erhalt der Redoxhomeostase in der Zelle. Thioredoxine selbst
sind kleine hochkonservierte Oxidoreduktasen, die zwei konservierte
Cystein-Reste im aktiven Zentrum enthalten. Sie wurden ursprünglich als
Elektronendonoren für
das Enzym Ribonucleotid-Reduktase identifiziert, sind aber daneben
für eine
Vielzahl von Stoffwechselenzymen notwendig, die während ihrer
katalytischen Zyklen Disulfidbindungen ausbilden, wie z.B. der PAPS-Reduktase.
Thioredoxine sind am besten charakterisiert als Antioxidantien gegen
reaktive Sauerstoff-Spezies, aber auch der Schutz gegenüber reduktivem
Stress gehört
zu ihren Funktionen. Es wird vermutet, dass sie zusätzlich auch
bei einer Vielzahl von weiteren zellulären Vorgängen eine Rolle spielen, wie
z.B. der Proteinfaltung und deren Regulation, der Reparatur von
oxidativ geschädigten
Proteinen und im Schwefel-Stoffwechsel.
Bakterielle
und pilzliche Thioredoxinreduktasen sind Flavoenzyme und liegen
als Homodimere vor. Sie enthalten einen FAD-Cofaktor und ein Paar
von redox-aktiven Cys-Gruppen, die am Transfer der Redoxäquivalente
vom FAD auf das Substrat beteiligt sind.
Gene
für die
Thioredoxin Reduktase wurden aus verschiedenen Organismen kloniert,
darunter auch aus verschiedenen Pilzen wie Saccharomyces cerevisiae
(Swissprot Accession No.: P38816), Schizosaccharomyces pombe (Swissprot
Accession No.: Q92375), Neurospora crassa (Swissprot Accession No.
P51978), Pneumocystis carinii (Swissprot Accession No.: Q7Z7S3),
Pneumocystis jiroveci (Swissprot Accession No.: Q8J0U0) oder Penicillium
chrysogenum (Swissprot Accession No.: P43496). Die Sequenzähnlichkeiten
sind innerhalb der eukaryontischen Klassen signifikant. Thioredoxin
Reduktasen aus pflanzenpathogenen Pilzen sind dagegen bislang nicht
bekannt geworden.
Aufgabe
der vorliegenden Erfindung war es, neue Angriffspunkte von Fungiziden
in Pilzen, insbesondere in phytopathogenen Pilzen, zu identifizieren
und Verfahren zugänglich
zu machen, in denen Inhibitoren eines solchen Angriffspunktes bzw.
Polypeptids identifiziert und auf ihre fungiziden Eigenschaften
hin geprüft werden
können.
Die Aufgabe wurde gelöst,
indem aus einem phytopathogenen Pilz die für Thioredoxin Reduktase kodierende
Nukleinsäure
isoliert, das davon kodierte Polypeptid gewonnen und ein Verfahren
zur Verfügung
gestellt wurde, mit dem Inhibitoren dieses Enzyms bestimmt werden
können.
Die mit diesem Verfahren identifizierten Inhibitoren können in
vivo gegen Pilze eingesetzt werden.
Beschreibung
der Abbildungen
1: Schematische Darstellung
der von der Thioredoxin Reduktase katalysierten Reduktion des Thioredoxins
in seiner Disulfid-Form zu Thioredoxin mit freien SH-Gruppen. Bei
dieser Reaktion wird NADP+H+ zu NADP+ umgesetzt.
2: Sequenzalignment der
Aminosäuresequenz
von Thioredoxin Reduktasen aus verschiedenen Pilzen. Gezeigt werden
die homologen Bereiche zwischen den Thioredoxin Reduktasen. In den
Sequenzen wurden weiterhin die dem Prosite Motiv für Thioredoxin
Reduktasen entsprechenden Aminosäuren
gekennzeichnet. Yeast1 und Yeast2: Saccharomyces cerevisiae. PNEUCA:
Pneumocycstis carinii. PNEUJI: Pneumocystis jiroveci. POMBE: Saccharomyces
pombe. NEUCR: Neurospora crassa. PENCH: Penicillium chrysogenum.
Ustilago: Ustilago maydis.
3: SDS-Gel. Die Expression
und die Reinigung von TRR1 aus U. maydis wurde mit Hilfe von SDS-Gelen
(A) bis (C) verfolgt. Spur 1: nicht-induzierte E. coli-Zellen. Spur 2: E.coli-Zellen
nach Induktion. Spur 3: Niederschlag nach Zellaufschluß. Spur
4: Überstand
nach Zellaufschluß.
Spur 5: Waschfraktion von der Ni-NTA-Säule. Spur 6: Elutionsfraktion
nach der Ni-NTA-Säule.
Spur 7: Fraktion nach der PD-10-Säule. M: 10 kDa-Proteinstandard.
4: SDS-Gel. Die heterologe
Expression und Reinigung von Thioredoxin, dem Substrat der Thioredoxin
Reduktase, wurde mit Hilfe von SDS-Gelen (A) bis (D) verfolgt. Spur
1: nicht-induzierte E. coli-Zellen. Spur 2: E. coli-Zellen nach
Induktion. Spur 3: Niederschlag nach Zellaufschluß. Spur
4: Überstand
nach Zellaufschluß.
Spur 5: Waschfraktion von der Ni-NTA-Säule. Spur 6: Elutionsfraktion
von der Ni-NTA-Säule.
Spur 7: Fraktion nach der PD-10-Säule. M:
10 kDa-Proteinstandard. Gel (D) zeigt Proben der einzelnen Thioredoxinreinigungen.
5: Graphische Darstellung
der Kinetik der NADPH-Abnahme in einem Aktivitätstest für die Thioredoxin Reduktase.
Die enzymatische Aktivität
der Thioredoxin Reduktase (TRR1) wird anhand des Verbrauchs von
NADPH bestimmt. Dazu wurde in jeweils 16 Ansätzen die Abnahme von NADPH
anhand der Fluoreszenzänderung
(Anregung bei 360 nm, Emission bei 465 nm) in Abhängigkeit
von der Zeit untersucht
. Als
Kontrolle dienten die gleichen Ansatzbedingungen in Abwesenheit
des Enzyms (♦).
Die Kinetik zeigt eine durch die enymatische Aktivität der TRR
bedingte, nahezu lineare Abnahme der Fluoreszenzausbeute innerhalb
von 35–40
min, die dann in einen Plateaubereich übergeht.
6: Lineweaver-Burk-Plot
zur Bestimmung des KM-Wertes von Thioredoxin
(A) und NADPH (B). Die gemessenen Werte werden nach Lineweaver und
Burk dargestellt, d.h. 1/Vo = 1/Vmax + 1/S × (KM/Vmax), worin Vo die
anfängliche
Reaktionsgeschwindigkeit, Vmax die maximal
erreichbare Umsatzgeschwindigkeit und S die Substratkonzentation
ist. Vmax und KM lassen
sich dann als Abszissen- und Ordinatenabschnitt 1/Vmax bzw. 1/KM ablesen. Der KM-Wert
für E.
coli-Thioredoxin liegt bei 5 μM,
der KM-Wert für NADPH liegt zwischen 20 und 40 μM.
7: Graphische Darstellung
der Abnahme der Aktivität
der Thioredoxin Reduktase (TRR1) bei Anwesenheit eines Inhibitors.
Die Messung der Aktivität
der TRR1 erfolgte anhand der Bestimmung der NADPH-Konzentration
im Verlauf der Zeit. Eine geringere Abnahme der NADPH-Konzentration
weist auf eine geringere bzw. inhibierte enzymatische Reaktion der
TRR1 hin. Die Messungen erfolgten in Gegenwart verschiedener Konzentrationen
an n-Ethylmaleimid. Die verwendeten Konzentrationen werden in der
Legende angegeben. o.I. steht für
die Reaktion in Abwesenheit des Inhibitors, also die ungehemmte
Reaktion (Negativ-Kontrolle).
SEQ ID NO: 1 Nukleinsäuresequenz
kodierend für
die Thioredoxin Reduktase aus Ustilago maydis.
SEQ ID NO: 2
Aminosäuresequenz
der Thioredoxin Reduktase aus Ustilago maydis.
Definitionen
Unter
dem Begriff "Homologie" bzw. "Identität" soll die Anzahl
der übereinstimmenden
Aminosäuren (Identität) mit anderen
Proteinen, ausgedrückt
in Prozent verstanden werden. Bevorzugt wird die Identität durch
Vergleiche einer gegebenen Sequenz zu anderen Proteinen mit Hilfe
von Computerprogrammen ermittelt. Weisen Sequenzen, die miteinander
verglichen werden, unterschiedliche Längen auf, ist die Identität so zu
ermitteln, dass die Anzahl an Aminosäuren, welche die kürzere Sequenz
mit der längeren
Sequenz gemeinsam hat, den prozentualen Anteil der Identität bestimmt.
Die Identität
kann standardmäßig mittels
bekannten und der Öffentlichkeit
zur Verfügung
stehenden Computerprogrammen wie z.B. ClustalW (Thompson et al., Nucleic
Acids Research 22 (1994), 4673–4680)
ermittelt werden. ClustalW wird z.B. öffentlich zur Verfügung gestellt
von Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) und Toby Gibson
(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory,
Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Germany. ClustalW kann ebenfalls
von verschiedenen Internetseiten, u.a. beim IGBMC (Institut de Génétique
et de Biologie Moléculaire
et Cellulaire, B.P.163, 67404 Illkirch Cedex, France; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)
und beim EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) sowie bei allen
gespiegelten Internetseiten des EBI (European Bioinformatics Institute,
Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK),
heruntergeladen werden. Wenn das ClustalW Computerprogramm der Version
1.8 benutzt wird, um die Identität
zwischen z.B. einem gegebenen Referenzprotein und anderen Proteinen
zu bestimmen, sind folgende Parameter einzustellen: KTUPLE = 1,
TOPDIAG = 5, WINDOW = 5, PAIRGAP = 3, GAPOPEN = 10, GAPEXTEND =
0.05, GAPDIST = 8, MAXDIV = 40, MATRIX = GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP,
NOHGAP. Eine Möglichkeit
zum Auffinden von ähnlichen
Sequenzen ist die Durchführung
von Sequenzdatenbankrecherchen. Hierbei wird eine oder werden mehrere
Sequenzen als sogenannte Abfrage ("query") vorgegeben. Diese Abfragesequenz wird
dann mittels statistischen Computerprogrammen mit Sequenzen, die
in den ausgewählten
Datenbanken enthalten sind, verglichen. Solche Datenbankabfragen
("blast searches") sind dem Fachmann
bekannt und können
bei verschiedenen Anbietern durchgeführt werden. Wird eine solche
Datenbankabfrage z.B. beim NCBI (National Center for Biotechnology
Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) durchgeführt, so
sollen die Standardeinstellungen, die für die jeweilige Vergleichsanfrage
vorgegeben sind, benutzt werden. Für Proteinsequenzvergleiche
("blastp") sind dieses folgende
Einstellungen: Limit entrez = nicht aktiviert; Filter = low complexity
aktiviert; Expect value = 10; word size = 3; Matrix = BLOSUM62;
Gap costs: Existence = 11, Extension = 1. Als Ergebnis einer solchen
Abfrage werden neben anderen Parametern auch der Anteil an Identität zwischen
der Abfragesequenz und den in den Datenbanken aufgefundenen ähnlichen
Sequenzen dargestellt. Unter einem erfindungsgemäßen Protein sollen daher im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung solche Proteine verstanden
werden, die bei der Verwendung mindestens einer der vorstehend beschriebenen
Methoden zur Identitätsbestimmung
eine Identität
von mindestens 70 % aufweisen, bevorzugt von mindestens 75 %, besonders
bevorzugt von mindestens 80 %, weiter bevorzugt von mindestens 85
%, und insbesondere von mindestens 90 %.
Der
Ausdruck "vollständige Thioredoxin
Reduktase" wie er
hierin verwendet wird, beschreibt eine Thioredoxin Reduktase, die
von einer vollständigen
kodierenden Region einer Transkriptionseinheit kodiert wird, umfassend
ein ATG-Startcodon und umfassend alle informationstragenden Exonbereiche
des im Herkunftsorganismus vorliegenden, für eine Thioredoxin Reduktase
kodierenden Gens, sowie die für
eine korrekte Termination der Transkription nötigen Signale.
Der
Ausdruck "biologische
Aktivität
einer Thioredoxin Reduktase" wie
er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Fähigkeit eines Polypeptids,
die vorstehend beschriebene Reaktion, d.h. die Reduktion von Thioredoxin
in seiner Disulfid-Form zu Thioredoxin mit freien SH-Gruppen unter
Verbrauch von NADPH+H+ zu katalysieren (1). Charakteristisch für Thioredoxin
Reduktasen sind zwei Cystein-Reste und die diese Cystein-Reste umgebenden
Aminosäuren
(2).
Der
Ausdruck "aktives
Fragment" wie er
hierin verwendet wird, beschreibt nicht mehr vollständige Nukleinsäuren kodierend
für Thioredoxin
Reduktase, die aber noch für
Polypeptide mit der biologischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase
kodieren, und die eine für
die Thioredoxin Reduktase charakteristische Reaktion wie vorne beschrieben
katalysieren können.
Solche Fragmente sind kürzer
als die oben beschriebenen vollständigen, für die Thioredoxin Reduktase
kodierenden Nukleinsäuren.
Dabei können
sowohl an den 3'- und/oder
5'-Enden der Sequenz
Nukleinsäuren
entfernt worden sein, es können
aber auch Teile der Sequenz deletiert, d.h. entfernt worden sein,
die die biologische Aktivität
der Thioredoxin Reduktase nicht entscheidend beeinträchtigen.
Eine geringere oder gegebenenfalls auch eine erhöhte Aktivität, die aber noch die Charakterisierung
bzw. Verwendung des resultierenden Thioredoxin Reduktase Fragments
gestattet, wird dabei als ausreichend im Sinne des hier verwendeten
Ausdrucks verstanden. Der Ausdruck "aktives Fragment" kann sich ebenso auf die Aminosäuresequenz
der Thioredoxin Reduktase beziehen und gilt dann analog den obigen Ausführungen
für solche
Polypeptide, die im Vergleich zur oben definierten vollständigen Sequenz
bestimmte Teile nicht mehr enthalten, wobei die biologische Aktivität des Enzyms
jedoch nicht entscheidend beeinträchtigt ist. Die Fragmente können dabei
verschiedene Länge
besitzen.
Die
Begriffe "Thioredoxin
Reduktase-Hemmtest" oder "Hemmtest " wie sie hierin verwendet
werden, beziehen sich auf ein Verfahren bzw. einen Test, der es
gestattet, die Inhibition der enzymatischen Aktivität eines
Polypeptids mit der Aktivität
einer Thioredoxin Reduktase durch eine oder mehrere chemische Verbindungen
(Kandidatenverbindung(en)) zu erkennen, wodurch die chemische Verbindung
als Inhibitor der Thioredoxin Reduktase identifiziert werden kann.
Der
Ausdruck "Gen", wie er hierin verwendet
wird, ist die Bezeichnung für
einen Abschnitt aus dem Genom einer Zelle, der für die Synthese einer Polypeptid-Kette
verantwortlich ist.
Der
Ausdruck "Fungizid" bzw. "fungizid" wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf chemische Verbindungen, die zur Bekämpfung von
human-, tier- und pflanzenpathogenen Pilzen, insbesondere von pflanzenpathogenen
Pilzen geeignet sind. Solche pflanzenpathogene Pilze werden nachfolgenden
genannt, wobei die Aufzählung
nicht abschließend
ist:
Plasmodiophoromycetes, Oomycetes, Chytridiomycetes, Zygomycetes,
Ascomycetes, Basidiomycetes und Deuteromycetes, z.B.
Pythium-Arten,
wie beispielsweise Pythium ultimum, Phytophthora-Arten, wie beispielsweise
Phytophthora infestans, Pseudoperonospora-Arten, wie beispielsweise
Pseudoperonospora humuli oder Pseudoperonospora cubensis, Plasmopara-Arten,
wie beispielsweise Plasmopara viticola, Bremia-Arten, wie beispielsweise
Bremia lactucae, Peronospora-Arten, wie beispielsweise Peronospora
pisi oder P. brassicae, Erysiphe-Arten, wie beispielsweise Erysiphe
graminis, Sphaerotheca-Arten, wie beispielsweise Sphaerotheca fuliginea,
Podosphaera-Arten, wie beispielsweise Podosphaera leucotricha, Venturia-Arten,
wie beispielsweise Venturia inaequalis, Pyrenophora-Arten, wie beispielsweise
Pyrenophora teres oder P. graminea (Konidienform: Drechslera, Syn:
Helminthosporium), Cochliobolus-Arten, wie beispielsweise Cochliobolus
sativus (Konidienform: Drechslera, Syn: Helminthosporium), Uromyces-Arten,
wie beispielsweise Uromyces appendiculatus, Puccinia-Arten, wie
beispielsweise Puccinia recondita, Sclerotinia-Arten, wie beispielsweise
Sclerotinia sclerotiorum, Tilletia-Arten, wie beispielsweise Tilletia
caries; Ustilago-Arten, wie beispielsweise Ustilago nuda oder Ustilago
avenae, Pellicularia-Arten, wie beispielsweise Pellicularia sasakii,
Pyricularia-Arten, wie beispielsweise Pyricularia oryzae, Fusarium-Arten,
wie beispielsweise Fusarium culmorum, Botrytis-Arten, Septoria-Arten, wie
beispielsweise Septoria nodorum, Leptosphaeria-Arten, wie beispielsweise
Leptosphaeria nodorum, Cercospora-Arten, wie beispielsweise Cercospora
canescens, Alternaria-Arten, wie beispielsweise Alternaria brassicae
oder Pseudocercosporella-Arten, wie beispielsweise Pseudocercosporella
herpotrichoides.
Von
besonderem Interesse sind z.B. auch Magnaporthe grisea, Cochliobulus
heterostrophus, Nectria hematococcus and Phytophtora species.
Fungizide
Wirkstoffe, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Thioredoxin Reduktasen
aus pflanzenpathogenen Pilzen gefunden werden, können aber auch mit Thioredoxin
Reduktasen aus humanpathogenen Pilzspezies interagieren, wobei die
Interaktion mit den unterschiedlichen in diesen Pilzen vorkommenden
Thioredoxin Reduktasen nicht immer gleich stark sein muss.
Gegenstand
der vorliegenden Erfindungen ist deshalb auch die Verwendung von
Inhibitoren der Thioredoxin Reduktase zum Herstellen von Mitteln
zur Behandlung von durch humanpathogene Pilze hervorgerufenen Erkrankungen.
Dabei
sind die folgenden humanpathogenen Pilze von besonderem Interesse,
die die nachfolgend genannten Krankheitsbilder hervorrufen können:
Dermatophyten,
wie z.B. Trichophyton spec., Microsporum spec., Epidermophyton floccosum
oder Keratomyces ajelloi, die z.B. Fußmykosen (Tinea pedis) hervorrufen,
Hefen,
wie z.B. Candida albicans, die Soor-Ösophagitis und Dermatitis hervorruft,
Candida glabrata, Candida krusei oder Cryptococcus neoformans, die
z.B. pulmonale Cryptococcose und auch Torulose hervorrufen können,
Schimmelpilze,
wie z.B. Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger, die z.B. bronchopulmonale
Aspergillose oder Pilzsepsis hervorrufen, Mucor spec., Absidia spec.,
oder Rhizopus spec., die z.B. Zygomykosen (intravasale Mykosen)
hervorrufen, Rhinosporidium seeberi, der z.B. chronische granulomatöse Pharyngitis
und Tracheitis hervorruft, Madurella myzetomatis, der z.B. subkutane
Myzetome hervorruft, Histoplasma capsulatum, der z.B. retikuloendotheliale
Zytomykose und M. Darling hervorruft, Coccidioides immitis, der
z. B. pulmonale Coccidioidomykose und Sepsis hervorruft, Paracoccidioides
brasiliensis, der z.B. brasilianische Blastomykose hervorruft, Blastomyces
dermatitidis, der z.B. Gilchrist-Krankheit und nordamerikanische
Blastomykose hervorruft, Loboa loboi, der z.B. Keloid-Blastomykose
und Lobo's Krankheit
hervorruft, und Sporothrix schenckii, der z.B. Sporotrichose (granulomatöse Hautmykose)
hervorruft.
Fungizide
Wirkstoffe, die mit Hilfe einer aus einem bestimmten Pilz, hier
aus Ustilago maydis, gewonnenen Thioredoxin Reduktase gefunden werden,
können
also auch. mit Thioredoxin Reduktasen aus anderen zahlreichen Pilzspezies,
gerade auch mit pflanzenpathogenen Pilzen interagieren, wobei die
Interaktion mit den unterschiedlichen in diesen Pilzen vorkommenden
Thioredoxin Reduktasen nicht immer gleich stark sein muss. Dies
erklärt
unter anderem die beobachtete Selektivität der an diesem Enzym wirksamen
Substanzen.
Der
Ausdruck "homologer
Promotor", wie er
hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der im Ursprungsorganismus
die Expression des betreffenden Gens kontrolliert. Der Ausdruck "heterologer Promotor", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf einen Promotor, der andere Eigenschaften
als derjenige Promotor aufweist, der im Ursprungsorganismus die
Expression des betreffenden Gens kontrolliert.
Der
Ausdruck "Kompetitor" wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf die Eigenschaft der Verbindungen, mit anderen,
gegebenenfalls zu identifizierenden Verbindungen um die Bindung
an der Thioredoxin Reduktase zu kompetitieren und diese vom Enzym
zu verdrängen
bzw. von dieser verdrängt
zu werden.
Der
Ausdruck "Inhibitor" bzw. "spezifischer Inhibitor", wie er hierin gebraucht
wird, bezeichnet eine Substanz, die direkt eine enzymatische Aktivität der Thioredoxin
Reduktase inhibiert. Ein solcher Inhibitor ist vorzugsweise "spezifisch", d.h. er inhibiert
gezielt die Thioredoxin Reduktase-Aktivität bei einer Konzentration die
niedriger ist als die Konzentration eines Inhibitors, die benötigt wird,
um einen anderen, damit nicht verbundenen Effekt hervorzurufen.
Vorzugsweise ist die Konzentration zweifach niedriger, insbesondere
bevorzugt fünffach
niedriger und ganz besonders bevorzugt zumindest zehnfach oder 20fach
niedriger als die Konzentration einer Verbindung, die zum Hervorrufen
eines unspezifischen Effekts benötigt
wird.
Der
Ausdruck "Modulator", wie er hierin verwendet
wird, stellt einen Oberbegriff für
Inhibitoren und Aktivatoren dar. Modulatoren können kleine organisch-chemische
Moleküle,
Peptide oder Antikörper
sein, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide
binden bzw. die deren Aktivität
beeinflussen. Weiterhin können
Modulatoren kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein,
die an ein Molekül
binden, welches wiederum an die erfindungsgemäßen Polypeptide bindet, und
dadurch deren biologische Aktivität beeinflusst. Modulatoren
können
natürliche
Substrate und Liganden darstellen oder strukturelle oder funktionelle
Mimetika davon. Bevorzugt handelt es sich beim Ausdruck "Modulator", wie er hierin verwendet
wird, jedoch um solche Moleküle,
die nicht die natürlichen
Substrate bzw. Liganden darstellen.
Beschreibung
der Erfindung
In
der vorliegenden Erfindung wird zum ersten Mal die vollständige Sequenz
einer Thioredoxin Reduktase aus dem pflanzenpathogenen Pilz Ustilago
maydis zur Verfügung
gestellt, die die weitere Erforschung von Thioredoxin Reduktasen
insbesondere aus pflanzenpathogenen Pilzen und damit die Erschließung eines
neuen Zielproteins für
die Identifizierung neuer fungizider Wirkstoffe ermöglicht.
Trotz
der umfangreichen Forschung an der Thioredoxin Reduktase war bislang
unbekannt, dass die Thioredoxin Reduktase in Pilzen ein Zielprotein
(ein so genanntes "Target") fungizid wirksamer
Substanzen sein kann. Damit wird in der vorliegenden Erfindung zum
ersten Mal gezeigt, dass die Thioredoxin Reduktase ein insbesondere
für Pilze
wichtiges Enzym darstellt und deshalb in besonderem Maße dazu
geeignet ist, als Zielprotein für
die Suche nach weiteren und verbesserten fungizid wirksamen Wirkstoffen
verwendet zu werden.
Inhibitoren
der Thioredoxin Reduktase mit einer fungiziden Wirkung wurden bisher
nicht beschrieben. Zwar verweisen verschiedene Veröffentlichung
auf die besondere Rolle der Thioredoxin Reduktase für den Stoffwechsel
von Organismen wie z.B. des Hefepilzes Saccharomyces cerevisiae.
So werden in Hefe zwei Gene als Thioredoxinreduktasen annotiert,
wobei TRR1 cytoplasmatisch lokalisiert ist und TRR2 mitochondrial vermutet
wird. Deletionsmutanten von TRR2 sind lebensfähig, hypersensitiv gegenüber Wasserstoffperoxid, zeigen
temperatursensitives Wachstum und sind auxotroph für Methionin
(Machado et al., 1997; Pearson und Merril, 1998), während Deletionsmutanten
der cytoplasmatischen TRR1 lebensunfähig sind (Giaever et al., 2002).
In einer anderen Untersuchung war die trr1-Nullmutante lebensfähig, zeigte
aber nur sehr langsames Wachstum. trr1- Mutationen waren ebenfalls
gegenüber
Wasserstoffperoxid empfindlich. Mutationen im Thioredoxinreduktase-Gen
von Neurospora crassa verursachen Cystein-Auxotrophie (K. Onai und
H. Nakashima, 1997). Allerdings nimmt keine der Veröffentlichungen
Stellung zu der Frage, ob das Enzym Thioredoxin Reduktase durch
Wirkstoffe beeinflusst, z.B. inhibiert werden kann, und ob die Bekämpfung von
Pilzen, insbesondere von pflanzenpathogenen Pilzen, in vivo mit
einem die Thioredoxin Reduktase modulierenden Wirkstoff möglich ist.
Die Thioredoxin Reduktase wurde damit als Zielprotein für Fungizide
bislang noch nicht beschrieben. Es sind keine Wirkstoffe bekannt,
die eine fungizide Wirkung aufweisen und deren Wirkort die Thioredoxin Reduktase
ist.
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, dass die
Thioredoxin Reduktase bei pflanzenpathogenen Pilzen überraschenderweise
ein Angriffspunkt oder "Target" für fungizide
Wirkstoffe ist, die Inhibition der Thioredoxin Reduktase also zur
Schädigung
oder zum Absterben des Pilzes führt.
So wurde im pflanzenpathogenen Pilz Ustilago maydis ein für eine Thioredoxinreduktase
codierendes Gen identifiziert (Um 140_5). Der Knock-out dieses Gens
erwies sich als letal. In weiteren Versuchen, die auf die Zugänglichkeit der
Thioredoxin Reduktase für
Wirkstoffe in vitro und auch in vivo gerichtet waren, konnte gezeigt
werden, dass die Thioredoxin Reduktase zum Identifizieren von Modulatoren
bzw. Inhibitoren seiner enzymatischen Aktivität in geeigneten Testverfahren
verwendet werden kann, was bei einer Reihe von theoretisch interessanten
Targets nicht selbstverständlich
ist.
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde schließlich ein Verfahren entwickelt,
das geeignet ist, die Aktivität
der Thioredoxin Reduktase sowie die Hemmung dieser Aktivität durch
eine chemische Verbindung in einem so genannten Hemmtest zu bestimmen,
um auf diese Weise Inhibitoren des Enzyms z.B. in HTS- und UHTS-Verfahren
zu identifizieren und deren fungizide Eigenschaften zu bestimmen.
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde schließlich ebenfalls gefunden, dass
die Thioredoxin Reduktase in vivo durch Wirkstoffe inhibiert werden
kann und ein mit diesen Wirkstoffen behandelter pilzlicher Organismus
durch die Behandlung mit diesen Wirkstoffen geschädigt und
abgetötet
werden kann. Die Inhibitoren einer pilzlichen Thioredoxin Reduktase
können
also als Fungizide im Pflanzenschutz oder als Antimykotika in Pharmaindikationen
verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung wird beispielsweise
gezeigt, dass die Hemmung der Thioredoxin Reduktase mit einer in
einem erfindungsgemäßen Verfahren
identifizierten Substanzen zum Absterben der behandelten Pilze in
synthetischen Medien bzw. auf der Pflanze führt.
Thioredoxin
Reduktasen können
aus verschiedenen pflanzenpathogenen oder auch aus human- oder tierpathogenen
Pilzen gewonnen werden, z.B. aus Pilzen wie dem pflanzenpathogenen
Pilz U. maydis. Zur Herstellung der Thioredoxin Reduktase aus Pilzen
kann das Gen z.B. rekombinant in Escherichia coli exprimiert und
aus E. coli Zellen eine Enzympräparation
hergestellt werden (Beispiel 1). Bevorzugt werden Thioredoxin Reduktasen
aus pflanzenpathogenen Pilzen verwendet, um im Pflanzenschutz einsetzbare
Fungizide zu identifizieren. Ist das Ziel die Identifizierung von
Fungiziden bzw. Antimycotika, die in Pharmaindikationen verwendet
werden sollen, empfiehlt sich der Einsatz von Thioredoxin Reduktasen
aus human- bzw. tierpathogenen Pilzen.
So
wurde für
die Expression des von trr1 kodierten Polypeptids TRR1 aus U. maydis
der zugehörige ORF
mittels PCR nach dem Fachmann bekannten Methoden über ausgewählte Primer
amplifiziert. Die entsprechende DNA wurde in den Expressionsvektor
pTrcHis2-TOPO kloniert, so dass das TRR-Protein ausgehend vom Plasmid
ptrcTRR10 mit einem C-terminalen His6-Tag
exprimiert wird (Beispiel 1). Zur Expression der TRR1 wurde das
Plasmid ptrcTRR10 in E.coli BL21(DE3) transformiert. Das trr1-Gen
aus Ustilago maydis besitzt eine Größe von 1053 bp, es enthält kein
Intron. UM 140_5 (trr1) codiert für ein Polypeptid von 351 Aminosäuren Länge mit
einem Molekulargewicht von 39000 Dalton (3).
In
der vorliegenden Erfindung wird damit auch eine vollständige genomische
Sequenz eines pflanzenpathogenen Pilzes kodierend für eine Thioredoxin
Reduktase zur Verfügung
gestellt, und deren Verwendung bzw. die Verwendung des davon kodierten
Polypeptids zur Identifizierung von Inhibitoren des Enzyms beschrieben.
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist deshalb auch die für ein Polypeptid
mit der enzymatischen Funktion einer Thioredoxin Reduktase kodierende
Nukleinsäure
aus dem Pilz Ustilago maydis.
Thioredoxin
Reduktasen teilen sich homologe Bereiche. Typisch für Thioredoxin
Reduktasen ist eine konservierte Region enthaltend zwei Cysteine,
die an der redox-aktiven Disulfidbrücke beteiligt sind. Auch die diese
beiden Cysteine umgebenden Sequenzen sind charakteristisch für Thioredoxin
Reduktasen.
Diese
Cysteine und ihre Sequenzumgebung ist ein für Thioredoxin Reduktasen charakteristisches
Sequenzmerkmal. Durch eine geeignete Suche in der PROSITE database
kann ein solches Motiv identifiziert werden (Hofmann et al., 1999),
C-x(2)-C-D-[GA]-x(2,4)-[FY]-x(4)-[LIVM]-x-[LIVM](2)-G(3)-[DN],
wobei
die beiden Cysteine die Disulfidbrücke bilden.
PROSITE
ermöglicht
Polypeptiden eine Funktion zuzuordnen und somit Thioredoxin Reduktasen
als solche zu erkennen.
Bei
der Darstellung des Prosite Motivs wird der "Ein-Buchstaben-Code" verwendet. Das Symbol "x" steht für eine Position, an der jede
Aminosäure
akzeptiert wird. Eine variable Position, an der verschiedene bestimmte
Aminosäuren
akzeptiert werden, wird in eckigen Klammern "[...]" dargestellt, wobei die an dieser Position
möglichen
Aminosäuren
aufgezählt
werden. Aminosäuren,
die an einer bestimmten Position nicht akzeptiert werden, stehen
dagegen in geschweiften Klammern "{...}". Ein Gedankenstrich "-" trennt die einzelnen Elemente bzw.
Positionen des Motivs. Wiederholt sich eine bestimmte Position,
z.B. "x", mehrfach hintereinander,
kann dies durch Angabe der Zahl der Wiederholungen in einer nachfolgenden
Klammer dargestellt werden, z.B. "x (3)", was für "x-x-x" steht.
Ein
Prosite Motiv stellt also letztlich die Komponenten einer Konsensussequenz
dar, sowie Abstände zwischen
den beteiligten Aminosäuren
und ist damit typisch für
eine bestimmte Enzym klasse. Anhand dieses Motivs können auf
Basis der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren weitere
Polypeptide aus pflanzenpathogenen Pilzen indentifiziert bzw. zugeordnet
werden, die zur selben Klasse wie das erfindungsgemäße Polypeptid
gehören
und deshalb auch in erfindungsgemäßer Weise verwendet werden
können.
Im
Falle der Thioredoxin Reduktase aus U. maydis liegt dieses Motiv
ebenso vor wie z.B. bei S. cerevisiae, S. pombe, P. carinii, P.
jiroveci, P. chrysogenum oder N. crassa (vgl. 2).
Das
oben genannte Prosite Motiv bzw. die spezifische Konsensussequenz
sind typisch für
die erfindungsgemäßen Polypeptide,
die anhand dieser Konsensussequenzen strukturell definiert werden
können
und damit auch eindeutig identifizierbar sind.
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind deshalb auch Polypeptide aus pflanzenpathogenen
Pilzen mit der biologischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase,
die das vorstehend genannte Prosite Motiv C-x(2)-C-D-[GA]-x(2,4)-[FY]-x(4)-[LIVM]-x-[LIVM](2)-G(3)-[DN]
umfassen (siehe dazu auch 2).
Besonders
bevorzugt sind diejenigen erfindungsgemäßen Polypeptide mit der biologischen
Aktivität einer
Thioredoxin Reduktase, die das Motiv C-A-V-C-D-G-A-V-P-I-F-R-N-K-P-L-x-V-[VI]-G(3)-D umfassen.
Aufgrund
der Homologien, die bei speziesspezifischen Nukleinsäuren kodierend
für Thioredoxin
Reduktasen vorliegen, können
auch Thioredoxin Reduktasen aus anderen pflanzenpathogenen Pilzen
identifiziert und verwendet werden, um die oben gestellte Aufgabe
zu lösen,
d.h. sie können
ebenfalls zum Identifizieren von Inhibitoren einer Thioredoxin Reduktase
verwendet werden, welche wiederum als Fungizide im Pflanzenschutz
verwendet werden können.
Es ist jedoch auch denkbar einen anderen Pilz, der nicht pflanzenpathogen
ist, bzw. dessen Thioredoxin Reduktase oder die dafür kodierende
Sequenz zu verwenden, um fungizid wirkende Inhibitoren der Thioredoxin
Reduktase zu identifizieren. Aufgrund der hier angegebenen Sequenz
gemäß SEQ ID
NO: 1 und eventuell davon abgeleiteter Primer sowie gegebenenfalls
unter Zuhilfenahme der homologen Bereiche (2) und des vorstehend gezeigten Prosite
Motivs bzw. des bevorzugten Motivs wie vorstehend beschrieben, ist
es dem Fachmann möglich,
z.B. mittels PCR weitere für
Thioredoxin Reduktasen kodierende Nukleinsäuren aus anderen (pflanzenpathogenen)
Pilzen zu erhalten und zu identifizieren. Solche Nukleinsäuren und
deren Verwendung in Verfahren zum Identifizieren von fungiziden
Wirkstoffen werden als von der vorliegenden Erfindung umfasst betrachtet.
Mit
Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
sowie gemäß den vorstehend
beschriebenen Verfahren erhaltene Sequenzen aus anderen pflanzenpathogenen
Pilzen können
weitere für
eine Thioredoxin Reduktase kodierende Nukleinsäuresequenzen aus anderen Pilzen
identifiziert werden.
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind daher Nukleinsäuren aus pflanzenpathogenen
Pilzen, die für
ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase
kodieren, insbesondere Polypeptide, die die vorstehend beschriebenen
Motive umfassen.
Bevorzugt
sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren aus
den vorstehend im Abschnitt Definitionen genannten pflanzenpathogenen
Pilzspezies, die für
ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase
kodieren.
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist insbesondere bevorzugt die für die Thioredoxin
Reduktase aus Ustilago maydis kodierende Nukleinsäure mit
der SEQ ID NO: 1 sowie die für
die Polypeptide gemäß SEQ ID
NO: 2 oder aktive Fragmente davon kodierenden Nukleinsäuren.
Bei
den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt
es sich insbesondere um einzelsträngige oder doppelsträngige Desoxyribonukleinsäuren (DNA)
oder Ribonukleinsäuren
(RNA). Bevorzugte Ausführungsformen
sind Fragmente genomischer DNA und cDNAs.
Besonders
bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eine
Sequenz aus pflanzenpathogenen Pilzen kodierend für ein Polypeptid
mit der enzymatischen Aktivität
einer Thioredoxin Reduktase ausgewählt aus
- a)
einer Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 1,
- b) Sequenzen, die für
ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID
NO: 2 umfasst,
- c) Sequenzen, die für
ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase
kodieren, welches das Motiv C-x(2)-C-D-[GA]-x(2,4)-[FY]-x(4)-[LIVM]-x-[LIVM](2)-G(3)-[DN]
und bevorzugt das Motiv C-A-V-C-D-G-A-V-P-I-F-R-N-K-P-L-x-V-[VI]-G(3)-D umfasst,
- d) Sequenzen, welche an die unter a) und b) definierten Sequenzen
bei einer Hybridisierungstemperatur von 42–65°C hybridisieren, und
- e) Sequenzen, welche eine zumindest 80 %ige, bevorzugt zumindest
85 %ige und besonders bevorzugt eine zumindest 90 %ige Identität mit den
unter a) und b) definierten Sequenzen aufweisen.
Wie
bereits vorstehend ausgeführt,
ist die vorliegende Erfindung nicht nur auf die Thioredoxin Reduktase
aus Ustilago maydis beschränkt.
In analoger und dem Fachmann bekannter Weise können auch aus anderen Pilzen,
vorzugsweise aus pflanzenpathogenen Pilzen, Polypeptide mit der
Aktivität
einer Thioredoxin Reduktase gewonnen werden, die dann z.B. in einem
erfindungsgemäßen Verfahren
eingesetzt werden können.
Bevorzugt wird allerdings die Thioredoxin Reduktase aus Ustilago
maydis verwendet.
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind weiterhin DNA-Konstrukte, die eine
erfindungsgemäße Nukleinsäure und
einen homologen oder heterologen Promotor umfassen.
Die
Auswahl von heterologen Promotoren ist davon abhängig, ob zur Expression pro-
oder eukaryotische Zellen oder zellfreie Systeme verwendet werden.
Beispiele für
heterologe Promotoren sind der 35S Promoter des Blumenkohlmosaikvirus
für pflanzliche
Zellen, der Promoter der Alkoholdehydrogenase für Hefezellen, die T3-, T7-
oder SP6-Promotoren für
prokaryotische Zellen oder zellfreie Systeme.
Bevorzugt
sollten pilzliche Expressionssysteme wie z.B. das Pichia pastoris-System
verwendet werden, wobei hier die Transkription durch den Methanol
induzierbaren AOX-Promotor angetrieben wird.
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind ferner Vektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, eine
erfindungsgemäße regulatorische
Region oder ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt enthalten.
Als Vektoren können
alle in molekularbiologischen Laboratorien verwendete Phagen, Plasmide,
Phagmide, Phasmide, Cosmide, YACs, BACs, künstliche Chromosomen oder Partikel,
die für
einen Partikelbeschuss geeignet sind, verwendet werden.
Bevorzugte
Vektoren sind z.B. die p4XXprom. Vektorserie (Mumberg et al., 1995)
für Hefezellen, pSPORT-Vektoren
(Fa. Life Technologies) für
bakterielle Zellen, oder den Gateway Vektoren (Fa. Life Technologies)
für verschiedene
Expressionssysteme in bakteriellen Zellen, Pflanzen, P. pastoris,
S. cerevisiae oder Insektenzellen.
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind auch Wirtszellen, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein
erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt
oder einen erfindungsgemäßen Vektor
enthalten.
Der
Ausdruck "Wirtszelle", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf Zellen, die natürlicherweise die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren nicht
enthalten.
Als
Wirtszellen eignen sich sowohl prokaryotische Zellen, vorzugsweise
E. coli, als auch eukaryotische Zellen, wie Zellen von Saccharomyces
cerevisiae, Pichia pastoris, Insekten, Pflanzen, Froschoozyten und
Zelllinien von Säugern.
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Polypeptide mit der biologischen
Aktivität
einer Thioredoxin Reduktase, die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodiert
werden.
Bevorzugt
umfassen die erfindungsgemäßen Polypeptide
eine Aminosäuresequenz
aus pflanzenpathogenen Pilzen ausgewählt aus
- (a)
der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 2,
- (b) Sequenzen, welche eine zumindest 80 %ige, bevorzugt eine
zumindest 85 %ige, besonders bevorzugt eine 90 %ige und insbesondere
bevorzugt eine 95 %ige Identität
mit der unter a) definierten Sequenz haben,
- (c) den unter b) angegebenen Sequenzen, welche das Motiv C-x(2)-C-D-[GA]-x(2,4)-[FY]-x(4)-[LIVM]-x-[LIVM](2)-G(3)-[DN]
und bevorzugt das Motiv C-A-V-C-D-G-A-V-P-I-F-R-N-K-P-L-x-V-[VI]-G(3)-D umfassen,
und
- (d) Fragmenten der unter a) bis c) angegebenen Sequenzen, welche
die gleiche biologische Aktivität
aufweisen wie die unter a) definierte Sequenz.
Der
Ausdruck "Polypeptide", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich sowohl auf kurze Aminosäureketten, die gewöhnlich als
Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, als auch
auf längere
Aminosäureketten,
die gewöhnlich
als Proteine bezeichnet werden. Er umfasst Aminosäureketten,
die entweder durch natürliche
Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische
Verfahren, die Stand der Technik sind, modifiziert sein können. Solche
Modifikationen können
an verschiedenen Stellen und mehrfach in einem Polypeptid vorkommen,
wie beispielsweise am Peptid-Rückgrat,
an der Aminosäure-Seitenkette, am
Amino- und/oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen beispielsweise
Acetylierungen, Acylierungen, ADP-Ribosylierungen, Amidierungen,
kovalente Verknüpfungen
mit Flavinen, Häm-Anteilen,
Nukleotiden oder Nukleotid-Derivaten, Lipiden oder Lipid-Derivaten
oder Phophatidylinositol, Cyclisierungen, Disulfidbrückenbildungen,
Demethylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma-Carboxylierungen,
Glycosylierungen, Hydroxylierungen, Iodierungen, Methylierungen, Myristoylierungen,
Oxidationen, proteolytische Prozessierungen, Phosphorylierungen,
Selenoylierungen und tRNA-vermittelte Additionen von Aminosäuren.
Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
können
in der Form "reifer" Proteine oder als
Teile größerer Proteine,
z.B. als Fusionsproteine, vorliegen. Weiterhin können sie Sezernierungs- oder "Leader"-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen,
die eine einfache Reinigung ermöglichen,
wie mehrfache Histidin-Reste, oder zusätzliche stabilisierende Aminosäuren aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Proteine
können
ebenfalls so vorliegen, wie sie natürlicherweise in ihrem Herkunftsorganismus
vorliegen, aus dem sie zum Beispiel direkt gewonnen werden können. In
den erfindungsgemäßen Verfahren
können
ebenso aktive Fragmente einer Thioredoxin Reduktase eingesetzt werden,
solange sie die Bestimmung der enzymatischen Aktivität des Polypeptids
bzw. deren Inhibition durch eine Kandidatenverbindung ermöglichen.
Die
in den erfindungsgemäßen Verfahren
eingesetzten Polypeptide können
im Vergleich zu den entsprechenden Regionen von natürlich vorkommenden
Thioredoxin Reduktasen Deletionen oder Aminosäuresubstitutionen aufweisen,
solange sie zumindest noch die biologische Aktivität einer
vollständigen
Thioredoxin Reduktase zeigen. Konservative Substitutionen sind bevorzugt.
Solche konservativen Substitutionen umfassen Variationen, wobei
eine Aminosäure
durch eine andere Aminosäure
aus der folgenden Gruppe ersetzt wird:
- 1. Kleine
aliphatische, nicht-polare oder wenig polare Reste: Ala, Ser, Thr,
Pro und Gly;
- 2. Polare, negativ geladene Reste und deren Amide: Asp, Asn,
Glu und Gln;
- 3. Polare, positiv geladene Reste: His, Arg und Lys;
- 4. Große
aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val und Cys; und
- 5. Aromatische Reste: Phe, Tyr und Trp.
Ein
mögliches
Reinigungsverfahren der Thioredoxin Reduktase basiert auf präparativer
Elektrophorese, FPLC, HPLC (z.B. unter Anwendung von Gelfiltrations-,
Reversphasen- oder leicht hydrophoben Säulen), Gelfiltration, differentieller
Präzipitation,
Ionenaustausch-Chromatographie oder Affinitätschromatographie (vgl. Beispiel
2).
Ein
schnelles Verfahren zum Isolieren von Thioredoxin Reduktase, die
von Wirtszellen synthetisiert werden, beginnt mit der Expression
eines Fusionsproteins, wobei der Fusionspartner auf einfache Weise
affinitätsgereinigt
werden kann. Der Fusionspartner kann beispielsweise ein MBP- oder bevorzugt auch
ein Histidin-Tag sein (vgl. Beispiel 2). Das Fusionsprotein kann
dann an Amylose-Resin oder im Falle des Vorliegens eines Histidin-Tags
z.B. an einer Ni-NTA-Säule gereinigt
werden. Der Fusionspartner kann durch partielle proteolytische Spaltung
beispielsweise an Linkern zwischen dem Fusionspartner und dem zu
reinigenden erfindungsgemäßen Polypeptid
abgetrennt werden. Das Protein mit einem His-Tag kann durch Imidazol-enthaltende
Puffer von der Säule
entfernt werden. Der Linker kann so gestaltet werden, dass er Ziel-Aminosäuren, wie Arginin-
und Lysin-Reste einschließt,
die Stellen für
eine Spaltung durch Trypsin definieren. Um solche Linker zu erzeugen,
können
Standard-Klonierungsverfahren unter Verwendung von Oligonukleotiden
angewendet werden.
Weitere
mögliche
Reinigungsverfahren basieren wiederum auf präparativer Elektrophorese, FPLC, HPLC
(z.B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasen- oder leicht
hydrophoben Säulen),
Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch-Chromatographie
und Affinitätschromatographie.
Die
Ausdrücke "Isolierung oder Reinigung", wie sie hierin
verwendet werden, bedeuten, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide
von anderen Proteinen oder anderen Makromolekülen der Zelle oder des Gewebes
abgetrennt werden. Vorzugsweise ist eine die erfindungsgemäßen Polypeptide
enthaltende Zusammensetzung hinsichtlich des Proteingehalts gegenüber einer
Präparation
aus den Wirtszellen mindestens 10-fach und besonders bevorzugt mindestens
100-fach angereichert.
Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
können
auch ohne Fusionspartner mit Hilfe von Antikörpern, die an die Polypeptide
binden, affinitätsgereinigt
werden.
Das
Verfahren zum Herstellen von Polypeptiden mit der Aktivität einer
Thioredoxin Reduktase, wie z.B. des Polypeptids TRR1 aus U. maydis,
ist damit gekennzeichnet durch
- (a) das Kultivieren
einer Wirtszelle enthaltend zumindest eine exprimierbare Nukleinsäuresequenz
kodierend für
ein Polypeptid aus Pilzen mit der biologischen Aktivität einer
Thioredoxin Reduktase unter Bedingungen, die die Expression dieser
Nukleinsäure
gewährleisten,
oder
- (b) das Exprimieren einer exprimierbaren Nukleinsäuresequenz
kodierend für
ein Polypeptid aus Pilzen mit der biologischen Aktivität einer
Thioredoxin Reduktase in einem in vitro-System, und
- (c) die Gewinnung des Polypeptids aus der Zelle, dem Kulturmedium
oder dem in vitro-System.
Die
so erhaltenen Zellen enthaltend das erfindungsgemäße Polypeptid
oder das so erhaltene gereinigte Polypeptid sind geeignet, in Verfahren
zum Identifizieren von Modulatoren bzw. Inhibitoren der Thioredoxin
Reduktase verwendet zu werden.
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung von Polypeptiden
aus Pilzen, bevorzugt aus pflanzenpathogenen Pilzen, welche zumindest
eine biologische Aktivität
einer Thioredoxin Reduktase ausüben,
in Verfahren zum Identifizieren von Fungiziden, wobei die Inhibitoren
der Thioredoxin Reduktase als Fungizide verwendet werden können. Besonders
bevorzugt wird die Thioredoxin Reduktase aus Ustilago maydis verwendet.
Fungizide
Wirkstoffe, die mit Hilfe einer Thioredoxin Reduktase aus einer
bestimmten Pilzspezies gefunden werden, können auch mit Thioredoxin Reduktase
aus anderen Pilzspezies interagieren, wobei die Interaktion mit
den unterschiedlichen in diesen Pilzen vorkommenden Thioredoxin
Reduktase nicht immer gleich stark sein muss. Dies erklärt unter
anderem die Selektivität
wirksamer Substanzen. Die Nutzung der Wirkstoffe, die mit einer
spezifischen Thioredoxin Reduktase gefunden wurden, als Fungizid
auch bei anderen Pilzen kann darauf zurückgeführt werden, dass sich Thioredoxin
Reduktasen aus verschiedenen Pilzspezies sehr nahe stehen und in
größeren Bereichen
eine ausgeprägte
Homologie zeigen. So wird an 2 deutlich,
dass eine solche Homologie über
beträchtliche
Sequenzabschnitte hinweg zwischen S. cerevisiae, N. crassa, S. pombe,
P. carinii, P. jiroveci, P. chrysogenum und U. maydis besteht und
damit die Wirkung der z.B. mit Hilfe der Thioredoxin Reduktase aus
U. maydis gefundenen Substanzen nicht auf U. maydis beschränkt bleibt.
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist deshalb auch ein Verfahren zum Identifizieren
von Fungiziden durch Testen von potentiellen Inhibitoren bzw. Modulatoren
der enzymatischen Aktivität
der Thioredoxin Reduktase (Kandidatenverbindung oder Testverbindung)
in einem Thioredoxin Reduktase-Hemmtest.
Verfahren,
die geeignet sind, Modulatoren, insbesondere Inhibitoren bzw. Antagonisten
der erfindungsgemäßen Polypeptide
zu identifizieren, beruhen in aller Regel auf der Bestimmung der
Aktivität
bzw. der biologischen Funktionalität des Polypeptids. Dazu kommen
prinzipiell sowohl auf ganzen Zellen beruhende Verfahren (in vivo
Verfahren) in Frage, wie auch Verfahren, die auf der Verwendung
des aus den Zellen isolierten Polypeptids beruhen, das in gereinigter
oder teilweise gereinigter Form oder auch als Rohextrakt vorliegen kann.
Diese zellfreien in vitro Verfahren können ebenso wie in vivo Verfahren
im Labormaßstab,
in bevorzugter Weise aber auch in HTS oder UHTS Verfahren genutzt
werden. Im Anschluss an die in vivo oder in vitro Identifizierung
von Modulatoren des Polypeptids können Tests an Pilzkulturen
durchgeführt
werden, um die fungizide Wirksamkeit der gefundenen Verbindungen
zu prüfen.
Viele
Testsysteme, die die Prüfung
von Verbindungen und natürlichen
Extrakten zum Ziel haben, sind bevorzugt auf hohe Durchsatzzahlen
ausgerichtet, um die Zahl der untersuchten Substanzen in einem gegebenen
Zeitraum zu maximieren. Testsysteme, die auf zellfreiem Arbeiten
beruhen, brauchen gereinigtes oder semi-gereinigtes Protein. Sie
sind geeignet für
eine "erste" Prüfung, die
in erster Linie darauf abzielt, einen möglichen Einfluss einer Substanz
auf das Zielprotein zu detektieren. Ist eine solche erste Prüfung erfolgt
und eine oder mehrere Verbindungen, Extrakte etc. gefunden, kann
die Wirkung solcher Verbindungen im Labor noch gezielter untersucht
werden. So kann in einem ersten Schritt die Inhibierung oder Aktivierung
des erfindungsgemäßen Polypeptids
in vitro noch einmal geprüft
werden, um im Anschluss daran die Wirksamkeit der Verbindung am
Zielorganismus, hier einem oder mehreren pflanzenpathogenen Pilzen,
zu testen. Die Verbindung kann dann gegebenenfalls als Ausgangspunkt
für die
weitere Suche und Entwicklung von fungiziden Verbindungen verwendet
werden, die auf der ursprünglichen
Struktur basieren, jedoch z.B. hinsichtlich Wirksamkeit, Toxizität oder Selektivität optimiert
sind.
Um
Modulatoren aufzufinden, kann z.B. ein synthetischer Reaktionsmix
(z.B. Produkte der in vitro Transkription) oder ein zellulärer Bestandteil,
wie eine Membran, ein Kompartiment oder irgendeine andere Präparation,
die die erfindungsgemäßen Polypeptide
enthält,
zusammen mit einem gegebenenfalls markierten Substrat oder Liganden
der Polypeptide in Gegenwart und Abwesenheit eines Kandidatenmoleküls inkubiert werden.
Die Fähigkeit
des Kandidatenmoleküls
die enzymatische Aktivität
der erfindungsgemäßen Polypeptide
zu hemmen, wird z.B. erkennbar an einer verringerten Bindung des
gegebenenfalls markierten Liganden oder an einer verringeren Umsetzung
des gegebenenfalls markierten Substrates. Moleküle, die die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide
hemmen, sind gute Antagonisten bzw. Inhibitoren.
Die
Detektion der biologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide
kann durch ein so genanntes Reportersystem verbessert werden. Reportersysteme
in dieser Hinsicht umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
colorimetrisch oder fluorimetrische nachweisbare Substrate, die
in ein Produkt umgewandelt werden oder ein Reportergen, das auf
Veränderungen
der Aktivität
oder der Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide anspricht oder
andere bekannte Bindungstests.
Ein
weiteres Beispiel für
ein Verfahren, mit welchem Modulatoren der erfindungsgemäßen Polypeptide aufgefunden
werden können,
ist ein Verdrängungstest,
bei dem man unter dafür
geeigneten Bedingungen die erfindungsgemäßen Polypeptide und einen potenziellen
Modulator mit einem Molekül,
das bekanntermaßen an
die erfindungsgemäßen Polypeptide
bindet, wie einem natürlichen
Substrat oder Liganden oder einem Substrat- oder Liganden-Mimetikum
zusammenbringt. Die erfindungsgemäßen Polypeptide selbst können markiert
werden, z.B. fluorimetrisch oder colorimetrisch, so dass man die
Anzahl der Polypeptide, die an einen Liganden gebunden sind oder
die eine Umsetzung mitgemacht haben, exakt bestimmen kann. Ebenso
kann jedoch die Bindung mittels des gegebenenfalls markierten Substrats,
Liganden bzw. Substratanalogen verfolgt werden. Auf diese Weise
lässt sich
die Effektivität
eines Antagonisten ermessen.
Effekte
wie Zelltoxizität
werden in diesen in vitro Systemen in der Regel ignoriert. Die Testsysteme überprüfen dabei
sowohl inhibierende bzw. suppressive Effekte der Substanzen, als
auch stimulatorische Effekte. Die Effektivität einer Substanz kann durch
konzentrationsabhängige
Testreihen überprüft werden.
Kontrollansätze
ohne Testsubstanzen bzw. ohne Enzym können zur Bewertung der Effekte
herangezogen werden.
Durch
die anhand der vorliegenden Erfindung verfügbaren, für eine erfindungsgemäße Thioredoxin Reduktase
kodierende Nukleinsäuren
enthaltenden Wirtszellen, wird auch die Entwicklung von Testsystemen, die
auf Zellen basieren, zur Identifizierung von Substanzen ermöglicht,
die die Aktivität
der erfindungsgemäßen Polypeptide
modulieren.
Vorzugsweise
handelt es sich bei den zu identifizierenden Modulatoren um kleine
organischchemische Verbindungen.
Ein
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die die Aktivität einer
Thioredoxin Reduktase aus Pilzen moduliert und die als Fungizid
im Pflanzenschutz verwendet werden kann, besteht bevorzugt darin, dass
man
- a) ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder eine Wirtszelle
enthaltend dieses Polypeptid mit einer chemischen Verbindung oder
mit einem Gemisch von chemischen Verbindungen unter Bedingungen
in Kontakt bringt, die die Interaktion einer chemischen Verbindung
mit dem Polypeptid erlauben,
- b) die Aktivität
des erfindungsgemäßen Polypeptids
bei Abwesenheit einer chemischen Verbindung mit der Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids
bei Anwesenheit einer chemischen Verbindung oder eines Gemisches
von chemischen Verbindungen vergleicht, und
- e) die chemische Verbindung auswählt, die die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids
spezifisch moduliert, und gegebenenfalls
- d) die fungizide Wirkung der ausgewählten Verbindung in vivo prüft.
Besonders
bevorzugt wird dabei diejenige Verbindung bestimmt, die die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids
spezifisch inhibiert. Der Begriff "Aktivität", wie er hier verwendet wird, bezieht
sich auf die biologische Aktivität
des erfindungsgemäßen Polypeptids.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Tatsache genutzt, dass die Thioredoxin Reduktase die Reduktion
von oxidiertem Thioredoxin unter Verbrauch von NADPH katalysiert.
Diese Umsetzung kann z.B. in Gegenwart von Insulin durchgeführt werden,
das als Thioredoxin regenerierendes System verwendet werden kann,
da durch die Thioredoxinreduktase reduziertes Thioredoxin als Disulfidreduktase
Insulin zu oxidiertem Insulin umsetzt und dabei selbst wieder in
den oxidierten Zustand überführt wird.
Dieses oxidierte Thioredoxin dient dann als Substrat der Thioredoxin
Reduktase. Bei der Reaktion der Thioredoxin Reduktase wird dann NADPH
verbraucht. Der Versuchsansatz lässt
sich wie folgt schematisch darstellen:
Die
Messung der enzymatischen Aktivität der Thioredoxin Reduktase
bzw. die Hemmung dieser enzymatischen Aktivität durch einen Inhibitor erfolgt
dann auf Basis der abnehmenden NADPH-Konzentration und kann photospektrometrisch
durch Absorptions- oder Fluoreszenzmessung (Absorptionsabnahme bei
340 nm bzw. Fluoreszenzabnahme bei 340 nm (Emission bei 465 nm))
bestimmt werden (5).
Dabei wird die geringere bzw. inhibierte Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids
anhand der photospektrometrischen Bestimmung des Grades der Abnahme
der NADPH-Konzentration relativ zu einem Kontrollansatz verfolgt.
Wird die Thioredoxinreduktase inhibiert, so erfolgt keine enzymatische
Umsetzung des NADPHs. Die Fluoreszenintensität des Ansatzes sollte der des
Kontrollansatzes entsprechen, da keine Änderung der NADPH-Konzentration
erfolgt. Eine Zunahme der NADPH-Konzentration kann sich ergeben,
wenn die enzymatische Aktivität der
Thioredoxin Reduktase so stark inhibiert wird, dass das durch die
Reaktion mit Insulin oxidierte Thioredoxin nicht mehr reduziert
wird und sich damit anreichert.
Alternativ
kann die Menge des NADPH z.B. auch nach erfolgter Reaktion durch
Umsetzung von Resazurin zu Resorufin in Gegenwart von PMS (Phenazin-methosulfat)
fluorimetrisch (Excitation 550 nm, Emission 595 nm) im Vergleich
zur eingesetzten Menge bestimmt werden. Hierbei werden in einer
chemischen Reaktion die Elektronen von NADPH zunächst auf PMS übertragen.
Das reduzierte PMS ist dann in der Lage, Resazurin zu Resorufin
zu reduzieren. Die Konzentration an Resurofin kann anschließend fluorimetrisch
(Excitation 550 nm, Emission 595 nm) detektiert werden. Durch Vergleich
mit der Konzentratin an Resorufin im Kontrollansatz kann dann die Menge
an umgesetztem NADPH bestimmt werden. NADPH reduziert also nicht
fluoreszierendes Resazurin zu intensiv rot fluoreszierendem Resorufin.
PMS dient als Redoxmediator.
Die
Messung kann auch in für
HTS- oder UHTS-Assays gängigen
Formaten erfolgen, z.B. in Mikrotiterplatten, in denen z.B. ein
Gesamtvolumen von 5 bis 50 μl
pro Ansatz bzw. pro Well vorgelegt wird und die einzelnen Komponenten
in einer der vorstehend angegebenen Endkonzentrationen vorliegen.
Dabei wird die zu testende, potentiell die Aktivität des Enzyms
inhibierende oder aktivierende Verbindung (Kandidatenmolekül) z.B.
in einer geeigneten Konzentration in Testpuffer enthaltend die für die Reaktion
nötigen
Komponenten vorgelegt. Dann wird das erfindungsgemäße Polypeptid
im oben genannten Testpuffer zugegeben und die Reaktion damit gestartet.
Der Ansatz wird dann z.B. bis zu 30 Minuten bei einer geeigneten
Temperatur inkubiert und z.B. die Fluoreszenzabnahme (Extinktion
340 nm; Emission 465 nm) gemessen.
Eine
weitere Messung erfolgt in einem entsprechenden Ansatz, jedoch ohne
Zugabe eines Kandidatenmoleküls
und ohne Zugabe eines erfindungsgemäßen Polypeptids (Negativkontrolle).
Eine weitere Messung erfolgt wiederum bei Abwesenheit eines Kandidatenmoleküls, jedoch
bei Anwesenheit des erfindungsgemäßen Polypeptids (Positivkontrolle).
Negativ- und Positivkontrolle ergeben damit die Vergleichswerte
zu den Ansätzen
bei Anwesenheit eines Kandidatenmoleküls.
Um
optimale Bedingungen für
ein Verfahren zum Identifizieren von Inhibitoren der Thioredoxin
Reduktase bzw. zur Bestimmung der Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide
zu ermitteln, kann es vorteilhaft sein, den jeweiligen KM-Wert des verwendeten erfindungsgemäßen Polypeptids
zu bestimmen. Dieser gibt Aufschluss über die bevorzugt zu verwendende
Konzentration des bzw. der Substrate. Im Fall der Thioredoxin Reduktase
aus U. maydis konnte ein KM von 5 μM für E. coli
Thioredoxin und ein KM von 20–40 μM für NADPH bestimmt
werden (6).
Mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren
konnten auf diese Weise Inhibitoren der Thioredoxin Reduktase identifiziert
werden.
Es
versteht sich von selbst, dass neben den genannten Verfahren zur
Bestimmung der enzymatischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase
bzw. der Inhibition dieser Aktivität und zum Identifizieren von
Fungiziden auch andere, z.B. bereits bekannte, Verfahren bzw. Hemmtests
verwendet werden können,
solange diese Verfahren es gestatten, die Aktivität einer
Thioredoxin Reduktase zu bestimmen und eine Inhibition dieser Aktivität durch
eine Kandidatenverbindung zu erkennen.
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde auch gefunden, dass die
mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Verfahrens
identifizierten Inhibitoren einer erfindungsgemäßen Thioredoxin Reduktase geeignet
sind, gegebenenfalls in einer geeigneten Formulierung, Pilze zu
schädigen
oder zu töten.
Dazu
kann z.B. in die Kavitäten
von Mikrotiterplatten eine Lösung
des zu prüfenden
Wirkstoffs pipettiert werden. Nachdem das Lösungsmittel abgedampft ist,
wird zu jeder Kavität
Medium hinzugefügt.
Das Medium wird vorher mit einer geeigneten Konzentration von Sporen
bzw. Mycel des zu prüfenden
Pilzes versetzt. Die resultierenden Konzentrationen des Wirkstoffes
betragen z.B. 0,1, 1, 10 und 100 ppm.
Die
Platten werden anschließend
auf einem Schüttler
bei einer Temperatur von etwa 22°C
inkubiert, bis in der unbehandelten Kontrolle ein ausreichendes
Wachstum feststellbar ist.
Die
Auswertung erfolgt photometrisch bei einer Wellenlänge von
620 nm. Aus den Messdaten der verschiedenen Konzentrationen kann
die Wirkstoffdosis bestimmt werden, die zu einer 50 %igen Hemmung
des Pilzwachstums gegenüber
der unbehandelten Kontrolle führt
(ED50). Die vorliegende Erfindung bezieht
sich daher ebenfalls auf die Verwendung von Modulatoren der Thioredoxin
Reduktase aus Pilzen, bevorzugt aus pflanzenpathogenen Pilzen als
Fungizide. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Fungizide,
die mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifiziert
wurden.
Verbindungen,
die mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifiziert
werden, und die aufgrund der Inhibition der pilzlichen Thioredoxin
Reduktase eine fungizide Wirkung aufweisen, können somit zur Herstellung
von fungiziden Mitteln verwendet werden.
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf die Verwendung
von Modulatoren der Thioredoxin Reduktase aus Pilzen, bevorzugt
aus pflanzenpathogenen Pilzen als Fungizide und auf Verfahren zum
Bekämpfen
von Pilzbefall bei Pflanzen, indem man einen Inhibitor einer Thioredoxin
Reduktase auf den Pilz und/oder die befallene Pflanze einwirken
lässt.
Bevorzugt handelt es sich dabei um Inhibitoren einer Thioredoxin
Reduktase aus einem pflanzenpathogenen Pilz.
Die
identifzierten Wirkstoffe können
in Abhängigkeit
von ihren jeweiligen physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften
in die üblichen
Formulierungen überführt werden,
wie Lösungen,
Emulsionen, Suspensionen, Pulver, Schäume, Pasten, Granulate, Aerosole,
Feinstverkapselungen in polymeren Stoffen und in Hüllmassen
für Saatgut,
sowie ULV-Kalt- und Warmnebel-Formulierungen.
Diese
Formulierungen werden in bekannter Weise hergestellt, z.B. durch
Vermischen der Wirkstoffe mit Streckmitteln, also flüssigen Lösungsmitteln,
unter Druck stehenden verflüssigten
Gasen und/oder festen Trägerstoffen,
gegebenenfalls unter Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln, also Emulgiermitteln und/oder
Dispergiermitteln und/oder schaumerzeugenden Mitteln. Im Falle der
Benutzung von Wasser als Streckmittel können z.B. auch organische Lösungsmittel
als Hilfslösungsmittel
verwendet werden. Als flüssige Lösungsmittel
kommen im wesentlichen in Frage: Aromaten, wie Xylol, Toluol oder
Alkylnaphthaline, chlorierte Aromaten oder chlorierte aliphatische
Kohlenwasserstoffe, wie Chlorbenzole, Chlorethylene oder Methylenchlorid,
aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Cyclohexan oder Paraffine,
z.B. Erdölfraktionen,
Alkohole, wie Butanol oder Glycol sowie deren Ether und Ester, Ketone,
wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon oder Cyclohexanon,
stark polare Lösungsmittel,
wie Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid, sowie Wasser. Mit verflüssigten
gasförmigen
Streckmitteln oder Trägerstoffen
sind solche Flüssigkeiten
gemeint, welche bei normaler Temperatur und unter Normaldruck gasförmig sind,
z.B. Aerosol-Treibgase,
wie Halogenkohlenwasserstoffe sowie Butan, Propan, Stickstoff und
Kohlendioxid. Als feste Trägerstoffe
kommen in Frage: z.B. natürliche
Gesteinsmehle, wie Kaoline, Tonerden, Talkum, Kreide, Quarz, Attapulgit,
Montmorillonit oder Diatomeenerde und synthetische Gesteinsmehle,
wie hochdisperse Kieselsäure,
Aluminiumoxid und Silikate. Als feste Trägerstoffe für Granulate kommen in Frage:
z.B. gebrochene und fraktionierte natürliche Gesteine wie Calcit,
Marmor, Bims, Sepiolith, Dolomit sowie synthetische Granulate aus
anorganischen und organischen Mehlen sowie Granulate aus organischem
Material wie Sägemehl,
Kokosnußschalen,
Maiskolben und Tabakstengel. Als Emulgier und/oder schaumerzeugende
Mittel kommen in Frage: z.B. nichtionogene und anionische Emulgatoren,
wie Polyoxyethylen-Fettsäureester,
Polyoxyethylen-Fettalkoholether, z.B. Allcylarylpolyglycolether,
Alkylsulfonate, Alkylsulfate, Arylsulfonate sowie Eiweißhydrolysate.
Als Dispergiermittel kommen in Frage: z.B. Lignin-Sulfitablaugen
und Methylcellulose.
Es
können
in den Formulierungen Haftmittel wie Carboxymethylcellulose, natürliche und
synthetische pulverige, körnige
oder latexförmige
Polymere verwendet werden, wie Gummiarabicum, Polyvinylalkohol,
Polyvinylacetat, sowie natürliche
Phospholipide, wie Kephaline und Lecithine, und synthetische Phospholipide. Weitere
Additive können
mineralische und vegetabile Öle
sein.
Es
können
Farbstoffe wie anorganische Pigmente, z.B. Eisenoxid, Titanoxid,
Fenocyanblau und organische Farbstoffe, wie Alizarin-, Azo- und
Metallphthalocyaninfarbstoffe und Spurennährstoffe, wie Salze von Eisen,
Mangan, Bor, Kupfer, Kobalt, Molybdän und Zink verwendet werden.
Die
Formulierungen enthalten im allgemeinen zwischen 0,1 und 95 Gewichtsprozent
Wirkstoff, vorzugsweise zwischen 0,5 und 90 %.
Die
erfindungsgemäßen Wirkstoffe
können
als solche oder in ihren Formulierungen auch in Mischung mit bekannten
Fungiziden, Bakteriziden, Akariziden, Nematiziden oder Insektiziden
verwendet werden, um so z.B. das Wirkungsspektrum zu verbreitern
oder Resistenzentwicklungen vorzubeugen. In vielen Fällen erhält man dabei
synergistische Effekte, d.h. die Wirksamkeit der Mischung ist größer als
die Wirksamkeit der Einzelkomponenten.
Beim
Einsatz der erfindungsgemäßen Verbindungen
als Fungizide können
die Aufwandmengen je nach Applikation innerhalb größerer Bereiche
variiert werden.
Erfindungsgemäß können alle
Pflanzen und Pflanzenteile behandelt werden. Unter Pflanzen werden hierbei
alle Pflanzen und Pflanzenpopulationen verstanden, wie erwünschte und
unerwünschte
Wildpflanzen oder Kulturpflanzen (einschließlich natürlich vorkommender Kulturpflanzen).
Kulturpflanzen können
Pflanzen sein, die durch konventionelle Züchtungs- und Optimierungsmethoden
oder durch biotechnologische und gentechnologische Methoden oder
Kombinationen dieser Methoden erhalten werden können, einschließlich der transgenen
Pflanzen und einschließlich
der durch Sortenschutzrechte schützbaren
oder nicht schützbaren Pflanzensorten.
Unter Pflanzenteilen sollen alle oberirdischen und unterirdischen
Teile und Organe der Pflanzen, wie Sproß, Blatt, Blüte und Wurzel
verstanden werden, wobei beispielhaft Blätter, Nadeln, Stengel, Stämme, Blüten, Fruchtkörper, Früchte und
Samen sowie Wurzeln, Knollen und Rhizome aufgeführt werden. Zu den Pflanzenteilen
gehört
auch Erntegut sowie vegetatives und generatives Vermehrungsmaterial,
beispielsweise Stecklinge, Knollen, Rhizome, Ableger und Samen.
Die
erfindungsgemäße Behandlung
der Pflanzen und Pflanzenteile mit den Wirkstoffen erfolgt direkt oder
durch Einwirkung auf deren Umgebung, Lebensraum oder Lagerraum nach
den üblichen
Behandlungsmethoden, z.B. durch Tauchen, Sprühen, Verdampfen, Vernebeln,
Streuen, Aufstreichen und bei Vermehrungsmaterial, insbesondere
bei Samen, weiterhin durch ein- oder mehrschichtiges Umhüllen.
Die
nachfolgenden Beispiele illustrieren verschiedene Aspekte der vorliegenden
Erfindung und sind nicht limitieren auszulegen.