DE102004016252A1

DE102004016252A1 - Verfahren zum Indentifizieren von fungizid wirksamen Verbindungen basierend auf Thioredoxin Reduktasen

Info

Publication number: DE102004016252A1
Application number: DE200410016252
Authority: DE
Inventors: Edda Dr. Koopmann; Rüdiger Dr. Suelmann; Peter Prof. Dr. Schreier; Birgitta Dr. Leuthner; Thorsten Dr. Leicher
Original assignee: Bayer CropScience AG
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 2004-04-02
Filing date: 2004-04-02
Publication date: 2005-10-13
Also published as: WO2005098030A2; WO2005098030A3

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Identifizieren von Fungiziden, die Verwendung von pilzlicher Thioredoxin Reduktase zum Identifizieren von Fungiziden und die Verwendung von Inhibitoren der Thioredoxin Reduktase als Fungizide.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Identifizieren von Fungiziden, die Verwendung von pilzlicher Thioredoxin Reduktase zum Identifizieren von Fungiziden, und die Verwendung von Inhibitoren der Thioredoxin Reduktase als Fungizide.
Unerwünschtes Pilzwachstum, das in der Landwirtschaft jedes Jahr zu beträchtlichen Schäden führt, kann durch die Verwendung von Fungiziden kontrolliert werden. Die Ansprüche an Fungizide sind dabei hinsichtlich ihrer Wirksamkeit, Kosten und vor allem ihrer Umweltverträglichkeit stetig angestiegen. Es existiert deshalb ein Bedarf an neuen Substanzen bzw. Substanzklassen, die zu leistungsfähigen und umweltverträglichen neuen Fungiziden entwickelt werden können. Im Allgemeinen ist es üblich, in Gewächshaustests nach solchen neuen Leitstrukturen zu suchen. Solche Tests sind jedoch arbeitsintensiv und teuer. Die Anzahl der Substanzen, die im Gewächshaus getestet werden können, ist entsprechend begrenzt. Eine Alternative zu solchen Tests ist die Verwendung von sogenannten Hochdurchsatzverfahren (HTS = high throughput screening). Dabei werden in einem automatisierten Verfahren eine große Anzahl von Einzelsubstanzen hinsichtlich ihrer Wirkung auf Zellen, individuelle Genprodukte oder Gene getestet. Wird für bestimmte Substanzen eine Wirkung nachgewiesen, so können diese in herkömmlichen Screeningverfahren untersucht und gegebenenfalls weiter entwickelt werden.
Vorteilhafte Angriffspunkte für Fungizide werden oft in essentiellen Biosynthesewegen gesucht. Ideale Fungizide sind weiterhin solche Stoffe, die Genprodukte hemmen, die eine entscheidende Bedeutung bei der Ausprägung der Pathogenität eines Pilzes haben.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, einen geeigneten neuen Angriffspunkt für potentielle fungizide Wirkstoffe zu identifizieren und zugänglich zu machen, und ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Identifizierung von Modulatoren dieses Angriffspunkts ermöglicht, die dann als Fungizide verwendet werden können.

Die Thioredoxin Reduktase (EC 1.8.1.9, früher EC 1.6.4.5), auch bekannt als NADP-Thioredoxin Reduktase, NADPH-Thioredoxin Reduktase oder Thioredoxin: NADP⁺-Oxidoreduktase, katalysiert die Reaktion von NADP⁺ und Thioredoxin zu Thioredoxin-Disulfid und NADPH + H⁺ (1). Die Reaktion der Thioredoxin Reduktase ist ein essentieller Schritt im Recycling der oxidierten Form von Thioredoxin (Disulfid-Form) wodurch der Zelle reduziertes Thioredoxin zur Verfügung gestellt wird.

Die cytoplasmatische Thioredoxin Reduktase – im Folgenden auch als TRR bezeichnet – gehört zur Klasse II der Pyridin-nukleotid-disulfid-Oxidoreduktasen. Das Enzym recycelt die oxidierte Form von Thioredoxin und stellt der Zelle wieder reduziertes Thioredoxin zur Verfügung. Die TRR ist daher wichtig für den Erhalt der Redoxhomeostase in der Zelle. Thioredoxine selbst sind kleine hochkonservierte Oxidoreduktasen, die zwei konservierte Cystein-Reste im aktiven Zentrum enthalten. Sie wurden ursprünglich als Elektronendonoren für das Enzym Ribonucleotid-Reduktase identifiziert, sind aber daneben für eine Vielzahl von Stoffwechselenzymen notwendig, die während ihrer katalytischen Zyklen Disulfidbindungen ausbilden, wie z.B. der PAPS-Reduktase. Thioredoxine sind am besten charakterisiert als Antioxidantien gegen reaktive Sauerstoff-Spezies, aber auch der Schutz gegenüber reduktivem Stress gehört zu ihren Funktionen. Es wird vermutet, dass sie zusätzlich auch bei einer Vielzahl von weiteren zellulären Vorgängen eine Rolle spielen, wie z.B. der Proteinfaltung und deren Regulation, der Reparatur von oxidativ geschädigten Proteinen und im Schwefel-Stoffwechsel.

Bakterielle und pilzliche Thioredoxinreduktasen sind Flavoenzyme und liegen als Homodimere vor. Sie enthalten einen FAD-Cofaktor und ein Paar von redox-aktiven Cys-Gruppen, die am Transfer der Redoxäquivalente vom FAD auf das Substrat beteiligt sind.

Gene für die Thioredoxin Reduktase wurden aus verschiedenen Organismen kloniert, darunter auch aus verschiedenen Pilzen wie Saccharomyces cerevisiae (Swissprot Accession No.: P38816), Schizosaccharomyces pombe (Swissprot Accession No.: Q92375), Neurospora crassa (Swissprot Accession No. P51978), Pneumocystis carinii (Swissprot Accession No.: Q7Z7S3), Pneumocystis jiroveci (Swissprot Accession No.: Q8J0U0) oder Penicillium chrysogenum (Swissprot Accession No.: P43496). Die Sequenzähnlichkeiten sind innerhalb der eukaryontischen Klassen signifikant. Thioredoxin Reduktasen aus pflanzenpathogenen Pilzen sind dagegen bislang nicht bekannt geworden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, neue Angriffspunkte von Fungiziden in Pilzen, insbesondere in phytopathogenen Pilzen, zu identifizieren und Verfahren zugänglich zu machen, in denen Inhibitoren eines solchen Angriffspunktes bzw. Polypeptids identifiziert und auf ihre fungiziden Eigenschaften hin geprüft werden können. Die Aufgabe wurde gelöst, indem aus einem phytopathogenen Pilz die für Thioredoxin Reduktase kodierende Nukleinsäure isoliert, das davon kodierte Polypeptid gewonnen und ein Verfahren zur Verfügung gestellt wurde, mit dem Inhibitoren dieses Enzyms bestimmt werden können. Die mit diesem Verfahren identifizierten Inhibitoren können in vivo gegen Pilze eingesetzt werden.

Beschreibung der Abbildungen

1: Schematische Darstellung der von der Thioredoxin Reduktase katalysierten Reduktion des Thioredoxins in seiner Disulfid-Form zu Thioredoxin mit freien SH-Gruppen. Bei dieser Reaktion wird NADP+H⁺ zu NADP⁺ umgesetzt.

2: Sequenzalignment der Aminosäuresequenz von Thioredoxin Reduktasen aus verschiedenen Pilzen. Gezeigt werden die homologen Bereiche zwischen den Thioredoxin Reduktasen. In den Sequenzen wurden weiterhin die dem Prosite Motiv für Thioredoxin Reduktasen entsprechenden Aminosäuren gekennzeichnet. Yeast1 und Yeast2: Saccharomyces cerevisiae. PNEUCA: Pneumocycstis carinii. PNEUJI: Pneumocystis jiroveci. POMBE: Saccharomyces pombe. NEUCR: Neurospora crassa. PENCH: Penicillium chrysogenum. Ustilago: Ustilago maydis.

3: SDS-Gel. Die Expression und die Reinigung von TRR1 aus U. maydis wurde mit Hilfe von SDS-Gelen (A) bis (C) verfolgt. Spur 1: nicht-induzierte E. coli-Zellen. Spur 2: E.coli-Zellen nach Induktion. Spur 3: Niederschlag nach Zellaufschluß. Spur 4: Überstand nach Zellaufschluß. Spur 5: Waschfraktion von der Ni-NTA-Säule. Spur 6: Elutionsfraktion nach der Ni-NTA-Säule. Spur 7: Fraktion nach der PD-10-Säule. M: 10 kDa-Proteinstandard.

4: SDS-Gel. Die heterologe Expression und Reinigung von Thioredoxin, dem Substrat der Thioredoxin Reduktase, wurde mit Hilfe von SDS-Gelen (A) bis (D) verfolgt. Spur 1: nicht-induzierte E. coli-Zellen. Spur 2: E. coli-Zellen nach Induktion. Spur 3: Niederschlag nach Zellaufschluß. Spur 4: Überstand nach Zellaufschluß. Spur 5: Waschfraktion von der Ni-NTA-Säule. Spur 6: Elutionsfraktion von der Ni-NTA-Säule. Spur 7: Fraktion nach der PD-10-Säule. M: 10 kDa-Proteinstandard. Gel (D) zeigt Proben der einzelnen Thioredoxinreinigungen.

5: Graphische Darstellung der Kinetik der NADPH-Abnahme in einem Aktivitätstest für die Thioredoxin Reduktase. Die enzymatische Aktivität der Thioredoxin Reduktase (TRR1) wird anhand des Verbrauchs von NADPH bestimmt. Dazu wurde in jeweils 16 Ansätzen die Abnahme von NADPH anhand der Fluoreszenzänderung (Anregung bei 360 nm, Emission bei 465 nm) in Abhängigkeit von der Zeit untersucht

. Als Kontrolle dienten die gleichen Ansatzbedingungen in Abwesenheit des Enzyms (♦). Die Kinetik zeigt eine durch die enymatische Aktivität der TRR bedingte, nahezu lineare Abnahme der Fluoreszenzausbeute innerhalb von 35–40 min, die dann in einen Plateaubereich übergeht.

6: Lineweaver-Burk-Plot zur Bestimmung des K_M-Wertes von Thioredoxin (A) und NADPH (B). Die gemessenen Werte werden nach Lineweaver und Burk dargestellt, d.h. 1/V_o = 1/V_max + 1/S × (K_M/V_max), worin V_o die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit, V_max die maximal erreichbare Umsatzgeschwindigkeit und S die Substratkonzentation ist. V_max und K_M lassen sich dann als Abszissen- und Ordinatenabschnitt 1/V_max bzw. 1/K_M ablesen. Der K_M-Wert für E. coli-Thioredoxin liegt bei 5 μM, der K_M-Wert für NADPH liegt zwischen 20 und 40 μM.

7: Graphische Darstellung der Abnahme der Aktivität der Thioredoxin Reduktase (TRR1) bei Anwesenheit eines Inhibitors. Die Messung der Aktivität der TRR1 erfolgte anhand der Bestimmung der NADPH-Konzentration im Verlauf der Zeit. Eine geringere Abnahme der NADPH-Konzentration weist auf eine geringere bzw. inhibierte enzymatische Reaktion der TRR1 hin. Die Messungen erfolgten in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an n-Ethylmaleimid. Die verwendeten Konzentrationen werden in der Legende angegeben. o.I. steht für die Reaktion in Abwesenheit des Inhibitors, also die ungehemmte Reaktion (Negativ-Kontrolle).
SEQ ID NO: 1 Nukleinsäuresequenz kodierend für die Thioredoxin Reduktase aus Ustilago maydis.
SEQ ID NO: 2 Aminosäuresequenz der Thioredoxin Reduktase aus Ustilago maydis.

Definitionen

Unter dem Begriff "Homologie" bzw. "Identität" soll die Anzahl der übereinstimmenden Aminosäuren (Identität) mit anderen Proteinen, ausgedrückt in Prozent verstanden werden. Bevorzugt wird die Identität durch Vergleiche einer gegebenen Sequenz zu anderen Proteinen mit Hilfe von Computerprogrammen ermittelt. Weisen Sequenzen, die miteinander verglichen werden, unterschiedliche Längen auf, ist die Identität so zu ermitteln, dass die Anzahl an Aminosäuren, welche die kürzere Sequenz mit der längeren Sequenz gemeinsam hat, den prozentualen Anteil der Identität bestimmt. Die Identität kann standardmäßig mittels bekannten und der Öffentlichkeit zur Verfügung stehenden Computerprogrammen wie z.B. ClustalW (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673–4680) ermittelt werden. ClustalW wird z.B. öffentlich zur Verfügung gestellt von Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) und Toby Gibson (Gibson@EMBL-Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Germany. ClustalW kann ebenfalls von verschiedenen Internetseiten, u.a. beim IGBMC (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, B.P.163, 67404 Illkirch Cedex, France; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) und beim EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) sowie bei allen gespiegelten Internetseiten des EBI (European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK), heruntergeladen werden. Wenn das ClustalW Computerprogramm der Version 1.8 benutzt wird, um die Identität zwischen z.B. einem gegebenen Referenzprotein und anderen Proteinen zu bestimmen, sind folgende Parameter einzustellen: KTUPLE = 1, TOPDIAG = 5, WINDOW = 5, PAIRGAP = 3, GAPOPEN = 10, GAPEXTEND = 0.05, GAPDIST = 8, MAXDIV = 40, MATRIX = GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP. Eine Möglichkeit zum Auffinden von ähnlichen Sequenzen ist die Durchführung von Sequenzdatenbankrecherchen. Hierbei wird eine oder werden mehrere Sequenzen als sogenannte Abfrage ("query") vorgegeben. Diese Abfragesequenz wird dann mittels statistischen Computerprogrammen mit Sequenzen, die in den ausgewählten Datenbanken enthalten sind, verglichen. Solche Datenbankabfragen ("blast searches") sind dem Fachmann bekannt und können bei verschiedenen Anbietern durchgeführt werden. Wird eine solche Datenbankabfrage z.B. beim NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) durchgeführt, so sollen die Standardeinstellungen, die für die jeweilige Vergleichsanfrage vorgegeben sind, benutzt werden. Für Proteinsequenzvergleiche ("blastp") sind dieses folgende Einstellungen: Limit entrez = nicht aktiviert; Filter = low complexity aktiviert; Expect value = 10; word size = 3; Matrix = BLOSUM62; Gap costs: Existence = 11, Extension = 1. Als Ergebnis einer solchen Abfrage werden neben anderen Parametern auch der Anteil an Identität zwischen der Abfragesequenz und den in den Datenbanken aufgefundenen ähnlichen Sequenzen dargestellt. Unter einem erfindungsgemäßen Protein sollen daher im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung solche Proteine verstanden werden, die bei der Verwendung mindestens einer der vorstehend beschriebenen Methoden zur Identitätsbestimmung eine Identität von mindestens 70 % aufweisen, bevorzugt von mindestens 75 %, besonders bevorzugt von mindestens 80 %, weiter bevorzugt von mindestens 85 %, und insbesondere von mindestens 90 %.

Der Ausdruck "vollständige Thioredoxin Reduktase" wie er hierin verwendet wird, beschreibt eine Thioredoxin Reduktase, die von einer vollständigen kodierenden Region einer Transkriptionseinheit kodiert wird, umfassend ein ATG-Startcodon und umfassend alle informationstragenden Exonbereiche des im Herkunftsorganismus vorliegenden, für eine Thioredoxin Reduktase kodierenden Gens, sowie die für eine korrekte Termination der Transkription nötigen Signale.

Der Ausdruck "biologische Aktivität einer Thioredoxin Reduktase" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Fähigkeit eines Polypeptids, die vorstehend beschriebene Reaktion, d.h. die Reduktion von Thioredoxin in seiner Disulfid-Form zu Thioredoxin mit freien SH-Gruppen unter Verbrauch von NADPH+H⁺ zu katalysieren (1). Charakteristisch für Thioredoxin Reduktasen sind zwei Cystein-Reste und die diese Cystein-Reste umgebenden Aminosäuren (2).

Der Ausdruck "aktives Fragment" wie er hierin verwendet wird, beschreibt nicht mehr vollständige Nukleinsäuren kodierend für Thioredoxin Reduktase, die aber noch für Polypeptide mit der biologischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase kodieren, und die eine für die Thioredoxin Reduktase charakteristische Reaktion wie vorne beschrieben katalysieren können. Solche Fragmente sind kürzer als die oben beschriebenen vollständigen, für die Thioredoxin Reduktase kodierenden Nukleinsäuren. Dabei können sowohl an den 3'- und/oder 5'-Enden der Sequenz Nukleinsäuren entfernt worden sein, es können aber auch Teile der Sequenz deletiert, d.h. entfernt worden sein, die die biologische Aktivität der Thioredoxin Reduktase nicht entscheidend beeinträchtigen. Eine geringere oder gegebenenfalls auch eine erhöhte Aktivität, die aber noch die Charakterisierung bzw. Verwendung des resultierenden Thioredoxin Reduktase Fragments gestattet, wird dabei als ausreichend im Sinne des hier verwendeten Ausdrucks verstanden. Der Ausdruck "aktives Fragment" kann sich ebenso auf die Aminosäuresequenz der Thioredoxin Reduktase beziehen und gilt dann analog den obigen Ausführungen für solche Polypeptide, die im Vergleich zur oben definierten vollständigen Sequenz bestimmte Teile nicht mehr enthalten, wobei die biologische Aktivität des Enzyms jedoch nicht entscheidend beeinträchtigt ist. Die Fragmente können dabei verschiedene Länge besitzen.

Die Begriffe "Thioredoxin Reduktase-Hemmtest" oder "Hemmtest " wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf ein Verfahren bzw. einen Test, der es gestattet, die Inhibition der enzymatischen Aktivität eines Polypeptids mit der Aktivität einer Thioredoxin Reduktase durch eine oder mehrere chemische Verbindungen (Kandidatenverbindung(en)) zu erkennen, wodurch die chemische Verbindung als Inhibitor der Thioredoxin Reduktase identifiziert werden kann.

Der Ausdruck "Gen", wie er hierin verwendet wird, ist die Bezeichnung für einen Abschnitt aus dem Genom einer Zelle, der für die Synthese einer Polypeptid-Kette verantwortlich ist.

Der Ausdruck "Fungizid" bzw. "fungizid" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf chemische Verbindungen, die zur Bekämpfung von human-, tier- und pflanzenpathogenen Pilzen, insbesondere von pflanzenpathogenen Pilzen geeignet sind. Solche pflanzenpathogene Pilze werden nachfolgenden genannt, wobei die Aufzählung nicht abschließend ist:
Plasmodiophoromycetes, Oomycetes, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes und Deuteromycetes, z.B.
Pythium-Arten, wie beispielsweise Pythium ultimum, Phytophthora-Arten, wie beispielsweise Phytophthora infestans, Pseudoperonospora-Arten, wie beispielsweise Pseudoperonospora humuli oder Pseudoperonospora cubensis, Plasmopara-Arten, wie beispielsweise Plasmopara viticola, Bremia-Arten, wie beispielsweise Bremia lactucae, Peronospora-Arten, wie beispielsweise Peronospora pisi oder P. brassicae, Erysiphe-Arten, wie beispielsweise Erysiphe graminis, Sphaerotheca-Arten, wie beispielsweise Sphaerotheca fuliginea, Podosphaera-Arten, wie beispielsweise Podosphaera leucotricha, Venturia-Arten, wie beispielsweise Venturia inaequalis, Pyrenophora-Arten, wie beispielsweise Pyrenophora teres oder P. graminea (Konidienform: Drechslera, Syn: Helminthosporium), Cochliobolus-Arten, wie beispielsweise Cochliobolus sativus (Konidienform: Drechslera, Syn: Helminthosporium), Uromyces-Arten, wie beispielsweise Uromyces appendiculatus, Puccinia-Arten, wie beispielsweise Puccinia recondita, Sclerotinia-Arten, wie beispielsweise Sclerotinia sclerotiorum, Tilletia-Arten, wie beispielsweise Tilletia caries; Ustilago-Arten, wie beispielsweise Ustilago nuda oder Ustilago avenae, Pellicularia-Arten, wie beispielsweise Pellicularia sasakii, Pyricularia-Arten, wie beispielsweise Pyricularia oryzae, Fusarium-Arten, wie beispielsweise Fusarium culmorum, Botrytis-Arten, Septoria-Arten, wie beispielsweise Septoria nodorum, Leptosphaeria-Arten, wie beispielsweise Leptosphaeria nodorum, Cercospora-Arten, wie beispielsweise Cercospora canescens, Alternaria-Arten, wie beispielsweise Alternaria brassicae oder Pseudocercosporella-Arten, wie beispielsweise Pseudocercosporella herpotrichoides.

Von besonderem Interesse sind z.B. auch Magnaporthe grisea, Cochliobulus heterostrophus, Nectria hematococcus and Phytophtora species.

Fungizide Wirkstoffe, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Thioredoxin Reduktasen aus pflanzenpathogenen Pilzen gefunden werden, können aber auch mit Thioredoxin Reduktasen aus humanpathogenen Pilzspezies interagieren, wobei die Interaktion mit den unterschiedlichen in diesen Pilzen vorkommenden Thioredoxin Reduktasen nicht immer gleich stark sein muss.

Gegenstand der vorliegenden Erfindungen ist deshalb auch die Verwendung von Inhibitoren der Thioredoxin Reduktase zum Herstellen von Mitteln zur Behandlung von durch humanpathogene Pilze hervorgerufenen Erkrankungen.

Dabei sind die folgenden humanpathogenen Pilze von besonderem Interesse, die die nachfolgend genannten Krankheitsbilder hervorrufen können:
Dermatophyten, wie z.B. Trichophyton spec., Microsporum spec., Epidermophyton floccosum oder Keratomyces ajelloi, die z.B. Fußmykosen (Tinea pedis) hervorrufen,
Hefen, wie z.B. Candida albicans, die Soor-Ösophagitis und Dermatitis hervorruft, Candida glabrata, Candida krusei oder Cryptococcus neoformans, die z.B. pulmonale Cryptococcose und auch Torulose hervorrufen können,
Schimmelpilze, wie z.B. Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger, die z.B. bronchopulmonale Aspergillose oder Pilzsepsis hervorrufen, Mucor spec., Absidia spec., oder Rhizopus spec., die z.B. Zygomykosen (intravasale Mykosen) hervorrufen, Rhinosporidium seeberi, der z.B. chronische granulomatöse Pharyngitis und Tracheitis hervorruft, Madurella myzetomatis, der z.B. subkutane Myzetome hervorruft, Histoplasma capsulatum, der z.B. retikuloendotheliale Zytomykose und M. Darling hervorruft, Coccidioides immitis, der z. B. pulmonale Coccidioidomykose und Sepsis hervorruft, Paracoccidioides brasiliensis, der z.B. brasilianische Blastomykose hervorruft, Blastomyces dermatitidis, der z.B. Gilchrist-Krankheit und nordamerikanische Blastomykose hervorruft, Loboa loboi, der z.B. Keloid-Blastomykose und Lobo's Krankheit hervorruft, und Sporothrix schenckii, der z.B. Sporotrichose (granulomatöse Hautmykose) hervorruft.

Fungizide Wirkstoffe, die mit Hilfe einer aus einem bestimmten Pilz, hier aus Ustilago maydis, gewonnenen Thioredoxin Reduktase gefunden werden, können also auch. mit Thioredoxin Reduktasen aus anderen zahlreichen Pilzspezies, gerade auch mit pflanzenpathogenen Pilzen interagieren, wobei die Interaktion mit den unterschiedlichen in diesen Pilzen vorkommenden Thioredoxin Reduktasen nicht immer gleich stark sein muss. Dies erklärt unter anderem die beobachtete Selektivität der an diesem Enzym wirksamen Substanzen.

Der Ausdruck "homologer Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der im Ursprungsorganismus die Expression des betreffenden Gens kontrolliert. Der Ausdruck "heterologer Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der andere Eigenschaften als derjenige Promotor aufweist, der im Ursprungsorganismus die Expression des betreffenden Gens kontrolliert.

Der Ausdruck "Kompetitor" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Eigenschaft der Verbindungen, mit anderen, gegebenenfalls zu identifizierenden Verbindungen um die Bindung an der Thioredoxin Reduktase zu kompetitieren und diese vom Enzym zu verdrängen bzw. von dieser verdrängt zu werden.

Der Ausdruck "Inhibitor" bzw. "spezifischer Inhibitor", wie er hierin gebraucht wird, bezeichnet eine Substanz, die direkt eine enzymatische Aktivität der Thioredoxin Reduktase inhibiert. Ein solcher Inhibitor ist vorzugsweise "spezifisch", d.h. er inhibiert gezielt die Thioredoxin Reduktase-Aktivität bei einer Konzentration die niedriger ist als die Konzentration eines Inhibitors, die benötigt wird, um einen anderen, damit nicht verbundenen Effekt hervorzurufen. Vorzugsweise ist die Konzentration zweifach niedriger, insbesondere bevorzugt fünffach niedriger und ganz besonders bevorzugt zumindest zehnfach oder 20fach niedriger als die Konzentration einer Verbindung, die zum Hervorrufen eines unspezifischen Effekts benötigt wird.

Der Ausdruck "Modulator", wie er hierin verwendet wird, stellt einen Oberbegriff für Inhibitoren und Aktivatoren dar. Modulatoren können kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide binden bzw. die deren Aktivität beeinflussen. Weiterhin können Modulatoren kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an ein Molekül binden, welches wiederum an die erfindungsgemäßen Polypeptide bindet, und dadurch deren biologische Aktivität beeinflusst. Modulatoren können natürliche Substrate und Liganden darstellen oder strukturelle oder funktionelle Mimetika davon. Bevorzugt handelt es sich beim Ausdruck "Modulator", wie er hierin verwendet wird, jedoch um solche Moleküle, die nicht die natürlichen Substrate bzw. Liganden darstellen.

Beschreibung der Erfindung

In der vorliegenden Erfindung wird zum ersten Mal die vollständige Sequenz einer Thioredoxin Reduktase aus dem pflanzenpathogenen Pilz Ustilago maydis zur Verfügung gestellt, die die weitere Erforschung von Thioredoxin Reduktasen insbesondere aus pflanzenpathogenen Pilzen und damit die Erschließung eines neuen Zielproteins für die Identifizierung neuer fungizider Wirkstoffe ermöglicht.

Trotz der umfangreichen Forschung an der Thioredoxin Reduktase war bislang unbekannt, dass die Thioredoxin Reduktase in Pilzen ein Zielprotein (ein so genanntes "Target") fungizid wirksamer Substanzen sein kann. Damit wird in der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal gezeigt, dass die Thioredoxin Reduktase ein insbesondere für Pilze wichtiges Enzym darstellt und deshalb in besonderem Maße dazu geeignet ist, als Zielprotein für die Suche nach weiteren und verbesserten fungizid wirksamen Wirkstoffen verwendet zu werden.

Inhibitoren der Thioredoxin Reduktase mit einer fungiziden Wirkung wurden bisher nicht beschrieben. Zwar verweisen verschiedene Veröffentlichung auf die besondere Rolle der Thioredoxin Reduktase für den Stoffwechsel von Organismen wie z.B. des Hefepilzes Saccharomyces cerevisiae. So werden in Hefe zwei Gene als Thioredoxinreduktasen annotiert, wobei TRR1 cytoplasmatisch lokalisiert ist und TRR2 mitochondrial vermutet wird. Deletionsmutanten von TRR2 sind lebensfähig, hypersensitiv gegenüber Wasserstoffperoxid, zeigen temperatursensitives Wachstum und sind auxotroph für Methionin (Machado et al., 1997; Pearson und Merril, 1998), während Deletionsmutanten der cytoplasmatischen TRR1 lebensunfähig sind (Giaever et al., 2002). In einer anderen Untersuchung war die trr1-Nullmutante lebensfähig, zeigte aber nur sehr langsames Wachstum. trr1- Mutationen waren ebenfalls gegenüber Wasserstoffperoxid empfindlich. Mutationen im Thioredoxinreduktase-Gen von Neurospora crassa verursachen Cystein-Auxotrophie (K. Onai und H. Nakashima, 1997). Allerdings nimmt keine der Veröffentlichungen Stellung zu der Frage, ob das Enzym Thioredoxin Reduktase durch Wirkstoffe beeinflusst, z.B. inhibiert werden kann, und ob die Bekämpfung von Pilzen, insbesondere von pflanzenpathogenen Pilzen, in vivo mit einem die Thioredoxin Reduktase modulierenden Wirkstoff möglich ist. Die Thioredoxin Reduktase wurde damit als Zielprotein für Fungizide bislang noch nicht beschrieben. Es sind keine Wirkstoffe bekannt, die eine fungizide Wirkung aufweisen und deren Wirkort die Thioredoxin Reduktase ist.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, dass die Thioredoxin Reduktase bei pflanzenpathogenen Pilzen überraschenderweise ein Angriffspunkt oder "Target" für fungizide Wirkstoffe ist, die Inhibition der Thioredoxin Reduktase also zur Schädigung oder zum Absterben des Pilzes führt. So wurde im pflanzenpathogenen Pilz Ustilago maydis ein für eine Thioredoxinreduktase codierendes Gen identifiziert (Um 140_5). Der Knock-out dieses Gens erwies sich als letal. In weiteren Versuchen, die auf die Zugänglichkeit der Thioredoxin Reduktase für Wirkstoffe in vitro und auch in vivo gerichtet waren, konnte gezeigt werden, dass die Thioredoxin Reduktase zum Identifizieren von Modulatoren bzw. Inhibitoren seiner enzymatischen Aktivität in geeigneten Testverfahren verwendet werden kann, was bei einer Reihe von theoretisch interessanten Targets nicht selbstverständlich ist.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde schließlich ein Verfahren entwickelt, das geeignet ist, die Aktivität der Thioredoxin Reduktase sowie die Hemmung dieser Aktivität durch eine chemische Verbindung in einem so genannten Hemmtest zu bestimmen, um auf diese Weise Inhibitoren des Enzyms z.B. in HTS- und UHTS-Verfahren zu identifizieren und deren fungizide Eigenschaften zu bestimmen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde schließlich ebenfalls gefunden, dass die Thioredoxin Reduktase in vivo durch Wirkstoffe inhibiert werden kann und ein mit diesen Wirkstoffen behandelter pilzlicher Organismus durch die Behandlung mit diesen Wirkstoffen geschädigt und abgetötet werden kann. Die Inhibitoren einer pilzlichen Thioredoxin Reduktase können also als Fungizide im Pflanzenschutz oder als Antimykotika in Pharmaindikationen verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung wird beispielsweise gezeigt, dass die Hemmung der Thioredoxin Reduktase mit einer in einem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Substanzen zum Absterben der behandelten Pilze in synthetischen Medien bzw. auf der Pflanze führt.

Thioredoxin Reduktasen können aus verschiedenen pflanzenpathogenen oder auch aus human- oder tierpathogenen Pilzen gewonnen werden, z.B. aus Pilzen wie dem pflanzenpathogenen Pilz U. maydis. Zur Herstellung der Thioredoxin Reduktase aus Pilzen kann das Gen z.B. rekombinant in Escherichia coli exprimiert und aus E. coli Zellen eine Enzympräparation hergestellt werden (Beispiel 1). Bevorzugt werden Thioredoxin Reduktasen aus pflanzenpathogenen Pilzen verwendet, um im Pflanzenschutz einsetzbare Fungizide zu identifizieren. Ist das Ziel die Identifizierung von Fungiziden bzw. Antimycotika, die in Pharmaindikationen verwendet werden sollen, empfiehlt sich der Einsatz von Thioredoxin Reduktasen aus human- bzw. tierpathogenen Pilzen.

So wurde für die Expression des von trr1 kodierten Polypeptids TRR1 aus U. maydis der zugehörige ORF mittels PCR nach dem Fachmann bekannten Methoden über ausgewählte Primer amplifiziert. Die entsprechende DNA wurde in den Expressionsvektor pTrcHis2-TOPO kloniert, so dass das TRR-Protein ausgehend vom Plasmid ptrcTRR10 mit einem C-terminalen His₆-Tag exprimiert wird (Beispiel 1). Zur Expression der TRR1 wurde das Plasmid ptrcTRR10 in E.coli BL21(DE3) transformiert. Das trr1-Gen aus Ustilago maydis besitzt eine Größe von 1053 bp, es enthält kein Intron. UM 140_5 (trr1) codiert für ein Polypeptid von 351 Aminosäuren Länge mit einem Molekulargewicht von 39000 Dalton (3).

In der vorliegenden Erfindung wird damit auch eine vollständige genomische Sequenz eines pflanzenpathogenen Pilzes kodierend für eine Thioredoxin Reduktase zur Verfügung gestellt, und deren Verwendung bzw. die Verwendung des davon kodierten Polypeptids zur Identifizierung von Inhibitoren des Enzyms beschrieben.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb auch die für ein Polypeptid mit der enzymatischen Funktion einer Thioredoxin Reduktase kodierende Nukleinsäure aus dem Pilz Ustilago maydis.

Thioredoxin Reduktasen teilen sich homologe Bereiche. Typisch für Thioredoxin Reduktasen ist eine konservierte Region enthaltend zwei Cysteine, die an der redox-aktiven Disulfidbrücke beteiligt sind. Auch die diese beiden Cysteine umgebenden Sequenzen sind charakteristisch für Thioredoxin Reduktasen.

Diese Cysteine und ihre Sequenzumgebung ist ein für Thioredoxin Reduktasen charakteristisches Sequenzmerkmal. Durch eine geeignete Suche in der PROSITE database kann ein solches Motiv identifiziert werden (Hofmann et al., 1999),
C-x(2)-C-D-[GA]-x(2,4)-[FY]-x(4)-[LIVM]-x-[LIVM](2)-G(3)-[DN],
wobei die beiden Cysteine die Disulfidbrücke bilden.

PROSITE ermöglicht Polypeptiden eine Funktion zuzuordnen und somit Thioredoxin Reduktasen als solche zu erkennen.

Bei der Darstellung des Prosite Motivs wird der "Ein-Buchstaben-Code" verwendet. Das Symbol "x" steht für eine Position, an der jede Aminosäure akzeptiert wird. Eine variable Position, an der verschiedene bestimmte Aminosäuren akzeptiert werden, wird in eckigen Klammern "[...]" dargestellt, wobei die an dieser Position möglichen Aminosäuren aufgezählt werden. Aminosäuren, die an einer bestimmten Position nicht akzeptiert werden, stehen dagegen in geschweiften Klammern "{...}". Ein Gedankenstrich "-" trennt die einzelnen Elemente bzw. Positionen des Motivs. Wiederholt sich eine bestimmte Position, z.B. "x", mehrfach hintereinander, kann dies durch Angabe der Zahl der Wiederholungen in einer nachfolgenden Klammer dargestellt werden, z.B. "x (3)", was für "x-x-x" steht.

Ein Prosite Motiv stellt also letztlich die Komponenten einer Konsensussequenz dar, sowie Abstände zwischen den beteiligten Aminosäuren und ist damit typisch für eine bestimmte Enzym klasse. Anhand dieses Motivs können auf Basis der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren weitere Polypeptide aus pflanzenpathogenen Pilzen indentifiziert bzw. zugeordnet werden, die zur selben Klasse wie das erfindungsgemäße Polypeptid gehören und deshalb auch in erfindungsgemäßer Weise verwendet werden können.

Im Falle der Thioredoxin Reduktase aus U. maydis liegt dieses Motiv ebenso vor wie z.B. bei S. cerevisiae, S. pombe, P. carinii, P. jiroveci, P. chrysogenum oder N. crassa (vgl. 2).

Das oben genannte Prosite Motiv bzw. die spezifische Konsensussequenz sind typisch für die erfindungsgemäßen Polypeptide, die anhand dieser Konsensussequenzen strukturell definiert werden können und damit auch eindeutig identifizierbar sind.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind deshalb auch Polypeptide aus pflanzenpathogenen Pilzen mit der biologischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase, die das vorstehend genannte Prosite Motiv C-x(2)-C-D-[GA]-x(2,4)-[FY]-x(4)-[LIVM]-x-[LIVM](2)-G(3)-[DN] umfassen (siehe dazu auch 2).

Besonders bevorzugt sind diejenigen erfindungsgemäßen Polypeptide mit der biologischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase, die das Motiv C-A-V-C-D-G-A-V-P-I-F-R-N-K-P-L-x-V-[VI]-G(3)-D umfassen.

Aufgrund der Homologien, die bei speziesspezifischen Nukleinsäuren kodierend für Thioredoxin Reduktasen vorliegen, können auch Thioredoxin Reduktasen aus anderen pflanzenpathogenen Pilzen identifiziert und verwendet werden, um die oben gestellte Aufgabe zu lösen, d.h. sie können ebenfalls zum Identifizieren von Inhibitoren einer Thioredoxin Reduktase verwendet werden, welche wiederum als Fungizide im Pflanzenschutz verwendet werden können. Es ist jedoch auch denkbar einen anderen Pilz, der nicht pflanzenpathogen ist, bzw. dessen Thioredoxin Reduktase oder die dafür kodierende Sequenz zu verwenden, um fungizid wirkende Inhibitoren der Thioredoxin Reduktase zu identifizieren. Aufgrund der hier angegebenen Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 und eventuell davon abgeleiteter Primer sowie gegebenenfalls unter Zuhilfenahme der homologen Bereiche (2) und des vorstehend gezeigten Prosite Motivs bzw. des bevorzugten Motivs wie vorstehend beschrieben, ist es dem Fachmann möglich, z.B. mittels PCR weitere für Thioredoxin Reduktasen kodierende Nukleinsäuren aus anderen (pflanzenpathogenen) Pilzen zu erhalten und zu identifizieren. Solche Nukleinsäuren und deren Verwendung in Verfahren zum Identifizieren von fungiziden Wirkstoffen werden als von der vorliegenden Erfindung umfasst betrachtet.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz sowie gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltene Sequenzen aus anderen pflanzenpathogenen Pilzen können weitere für eine Thioredoxin Reduktase kodierende Nukleinsäuresequenzen aus anderen Pilzen identifiziert werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Nukleinsäuren aus pflanzenpathogenen Pilzen, die für ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase kodieren, insbesondere Polypeptide, die die vorstehend beschriebenen Motive umfassen.

Bevorzugt sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren aus den vorstehend im Abschnitt Definitionen genannten pflanzenpathogenen Pilzspezies, die für ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase kodieren.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere bevorzugt die für die Thioredoxin Reduktase aus Ustilago maydis kodierende Nukleinsäure mit der SEQ ID NO: 1 sowie die für die Polypeptide gemäß SEQ ID NO: 2 oder aktive Fragmente davon kodierenden Nukleinsäuren.

Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich insbesondere um einzelsträngige oder doppelsträngige Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Ribonukleinsäuren (RNA). Bevorzugte Ausführungsformen sind Fragmente genomischer DNA und cDNAs.

Besonders bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eine Sequenz aus pflanzenpathogenen Pilzen kodierend für ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase ausgewählt aus

a) einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1,
b) Sequenzen, die für ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst,
c) Sequenzen, die für ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase kodieren, welches das Motiv C-x(2)-C-D-[GA]-x(2,4)-[FY]-x(4)-[LIVM]-x-[LIVM](2)-G(3)-[DN] und bevorzugt das Motiv C-A-V-C-D-G-A-V-P-I-F-R-N-K-P-L-x-V-[VI]-G(3)-D umfasst,
d) Sequenzen, welche an die unter a) und b) definierten Sequenzen bei einer Hybridisierungstemperatur von 42–65°C hybridisieren, und
e) Sequenzen, welche eine zumindest 80 %ige, bevorzugt zumindest 85 %ige und besonders bevorzugt eine zumindest 90 %ige Identität mit den unter a) und b) definierten Sequenzen aufweisen.

Wie bereits vorstehend ausgeführt, ist die vorliegende Erfindung nicht nur auf die Thioredoxin Reduktase aus Ustilago maydis beschränkt. In analoger und dem Fachmann bekannter Weise können auch aus anderen Pilzen, vorzugsweise aus pflanzenpathogenen Pilzen, Polypeptide mit der Aktivität einer Thioredoxin Reduktase gewonnen werden, die dann z.B. in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können. Bevorzugt wird allerdings die Thioredoxin Reduktase aus Ustilago maydis verwendet.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin DNA-Konstrukte, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und einen homologen oder heterologen Promotor umfassen.

Die Auswahl von heterologen Promotoren ist davon abhängig, ob zur Expression pro- oder eukaryotische Zellen oder zellfreie Systeme verwendet werden. Beispiele für heterologe Promotoren sind der 35S Promoter des Blumenkohlmosaikvirus für pflanzliche Zellen, der Promoter der Alkoholdehydrogenase für Hefezellen, die T3-, T7- oder SP6-Promotoren für prokaryotische Zellen oder zellfreie Systeme.

Bevorzugt sollten pilzliche Expressionssysteme wie z.B. das Pichia pastoris-System verwendet werden, wobei hier die Transkription durch den Methanol induzierbaren AOX-Promotor angetrieben wird.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Vektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, eine erfindungsgemäße regulatorische Region oder ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt enthalten. Als Vektoren können alle in molekularbiologischen Laboratorien verwendete Phagen, Plasmide, Phagmide, Phasmide, Cosmide, YACs, BACs, künstliche Chromosomen oder Partikel, die für einen Partikelbeschuss geeignet sind, verwendet werden.

Bevorzugte Vektoren sind z.B. die p4XXprom. Vektorserie (Mumberg et al., 1995) für Hefezellen, pSPORT-Vektoren (Fa. Life Technologies) für bakterielle Zellen, oder den Gateway Vektoren (Fa. Life Technologies) für verschiedene Expressionssysteme in bakteriellen Zellen, Pflanzen, P. pastoris, S. cerevisiae oder Insektenzellen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Wirtszellen, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten.

Der Ausdruck "Wirtszelle", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die natürlicherweise die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren nicht enthalten.

Als Wirtszellen eignen sich sowohl prokaryotische Zellen, vorzugsweise E. coli, als auch eukaryotische Zellen, wie Zellen von Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Insekten, Pflanzen, Froschoozyten und Zelllinien von Säugern.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Polypeptide mit der biologischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase, die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodiert werden.

Bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Polypeptide eine Aminosäuresequenz aus pflanzenpathogenen Pilzen ausgewählt aus

(a) der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2,
(b) Sequenzen, welche eine zumindest 80 %ige, bevorzugt eine zumindest 85 %ige, besonders bevorzugt eine 90 %ige und insbesondere bevorzugt eine 95 %ige Identität mit der unter a) definierten Sequenz haben,
(c) den unter b) angegebenen Sequenzen, welche das Motiv C-x(2)-C-D-[GA]-x(2,4)-[FY]-x(4)-[LIVM]-x-[LIVM](2)-G(3)-[DN] und bevorzugt das Motiv C-A-V-C-D-G-A-V-P-I-F-R-N-K-P-L-x-V-[VI]-G(3)-D umfassen, und
(d) Fragmenten der unter a) bis c) angegebenen Sequenzen, welche die gleiche biologische Aktivität aufweisen wie die unter a) definierte Sequenz.

Der Ausdruck "Polypeptide", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich sowohl auf kurze Aminosäureketten, die gewöhnlich als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, als auch auf längere Aminosäureketten, die gewöhnlich als Proteine bezeichnet werden. Er umfasst Aminosäureketten, die entweder durch natürliche Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische Verfahren, die Stand der Technik sind, modifiziert sein können. Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in einem Polypeptid vorkommen, wie beispielsweise am Peptid-Rückgrat, an der Aminosäure-Seitenkette, am Amino- und/oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen beispielsweise Acetylierungen, Acylierungen, ADP-Ribosylierungen, Amidierungen, kovalente Verknüpfungen mit Flavinen, Häm-Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid-Derivaten, Lipiden oder Lipid-Derivaten oder Phophatidylinositol, Cyclisierungen, Disulfidbrückenbildungen, Demethylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma-Carboxylierungen, Glycosylierungen, Hydroxylierungen, Iodierungen, Methylierungen, Myristoylierungen, Oxidationen, proteolytische Prozessierungen, Phosphorylierungen, Selenoylierungen und tRNA-vermittelte Additionen von Aminosäuren.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in der Form "reifer" Proteine oder als Teile größerer Proteine, z.B. als Fusionsproteine, vorliegen. Weiterhin können sie Sezernierungs- oder "Leader"-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine einfache Reinigung ermöglichen, wie mehrfache Histidin-Reste, oder zusätzliche stabilisierende Aminosäuren aufweisen. Die erfindungsgemäßen Proteine können ebenfalls so vorliegen, wie sie natürlicherweise in ihrem Herkunftsorganismus vorliegen, aus dem sie zum Beispiel direkt gewonnen werden können. In den erfindungsgemäßen Verfahren können ebenso aktive Fragmente einer Thioredoxin Reduktase eingesetzt werden, solange sie die Bestimmung der enzymatischen Aktivität des Polypeptids bzw. deren Inhibition durch eine Kandidatenverbindung ermöglichen.

Die in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Polypeptide können im Vergleich zu den entsprechenden Regionen von natürlich vorkommenden Thioredoxin Reduktasen Deletionen oder Aminosäuresubstitutionen aufweisen, solange sie zumindest noch die biologische Aktivität einer vollständigen Thioredoxin Reduktase zeigen. Konservative Substitutionen sind bevorzugt. Solche konservativen Substitutionen umfassen Variationen, wobei eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure aus der folgenden Gruppe ersetzt wird:

1. Kleine aliphatische, nicht-polare oder wenig polare Reste: Ala, Ser, Thr, Pro und Gly;
2. Polare, negativ geladene Reste und deren Amide: Asp, Asn, Glu und Gln;
3. Polare, positiv geladene Reste: His, Arg und Lys;
4. Große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val und Cys; und
5. Aromatische Reste: Phe, Tyr und Trp.

Ein mögliches Reinigungsverfahren der Thioredoxin Reduktase basiert auf präparativer Elektrophorese, FPLC, HPLC (z.B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasen- oder leicht hydrophoben Säulen), Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch-Chromatographie oder Affinitätschromatographie (vgl. Beispiel 2).

Ein schnelles Verfahren zum Isolieren von Thioredoxin Reduktase, die von Wirtszellen synthetisiert werden, beginnt mit der Expression eines Fusionsproteins, wobei der Fusionspartner auf einfache Weise affinitätsgereinigt werden kann. Der Fusionspartner kann beispielsweise ein MBP- oder bevorzugt auch ein Histidin-Tag sein (vgl. Beispiel 2). Das Fusionsprotein kann dann an Amylose-Resin oder im Falle des Vorliegens eines Histidin-Tags z.B. an einer Ni-NTA-Säule gereinigt werden. Der Fusionspartner kann durch partielle proteolytische Spaltung beispielsweise an Linkern zwischen dem Fusionspartner und dem zu reinigenden erfindungsgemäßen Polypeptid abgetrennt werden. Das Protein mit einem His-Tag kann durch Imidazol-enthaltende Puffer von der Säule entfernt werden. Der Linker kann so gestaltet werden, dass er Ziel-Aminosäuren, wie Arginin- und Lysin-Reste einschließt, die Stellen für eine Spaltung durch Trypsin definieren. Um solche Linker zu erzeugen, können Standard-Klonierungsverfahren unter Verwendung von Oligonukleotiden angewendet werden.

Weitere mögliche Reinigungsverfahren basieren wiederum auf präparativer Elektrophorese, FPLC, HPLC (z.B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasen- oder leicht hydrophoben Säulen), Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch-Chromatographie und Affinitätschromatographie.

Die Ausdrücke "Isolierung oder Reinigung", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide von anderen Proteinen oder anderen Makromolekülen der Zelle oder des Gewebes abgetrennt werden. Vorzugsweise ist eine die erfindungsgemäßen Polypeptide enthaltende Zusammensetzung hinsichtlich des Proteingehalts gegenüber einer Präparation aus den Wirtszellen mindestens 10-fach und besonders bevorzugt mindestens 100-fach angereichert.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch ohne Fusionspartner mit Hilfe von Antikörpern, die an die Polypeptide binden, affinitätsgereinigt werden.

Das Verfahren zum Herstellen von Polypeptiden mit der Aktivität einer Thioredoxin Reduktase, wie z.B. des Polypeptids TRR1 aus U. maydis, ist damit gekennzeichnet durch

(a) das Kultivieren einer Wirtszelle enthaltend zumindest eine exprimierbare Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Polypeptid aus Pilzen mit der biologischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase unter Bedingungen, die die Expression dieser Nukleinsäure gewährleisten, oder
(b) das Exprimieren einer exprimierbaren Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Polypeptid aus Pilzen mit der biologischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase in einem in vitro-System, und
(c) die Gewinnung des Polypeptids aus der Zelle, dem Kulturmedium oder dem in vitro-System.

Die so erhaltenen Zellen enthaltend das erfindungsgemäße Polypeptid oder das so erhaltene gereinigte Polypeptid sind geeignet, in Verfahren zum Identifizieren von Modulatoren bzw. Inhibitoren der Thioredoxin Reduktase verwendet zu werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung von Polypeptiden aus Pilzen, bevorzugt aus pflanzenpathogenen Pilzen, welche zumindest eine biologische Aktivität einer Thioredoxin Reduktase ausüben, in Verfahren zum Identifizieren von Fungiziden, wobei die Inhibitoren der Thioredoxin Reduktase als Fungizide verwendet werden können. Besonders bevorzugt wird die Thioredoxin Reduktase aus Ustilago maydis verwendet.

Fungizide Wirkstoffe, die mit Hilfe einer Thioredoxin Reduktase aus einer bestimmten Pilzspezies gefunden werden, können auch mit Thioredoxin Reduktase aus anderen Pilzspezies interagieren, wobei die Interaktion mit den unterschiedlichen in diesen Pilzen vorkommenden Thioredoxin Reduktase nicht immer gleich stark sein muss. Dies erklärt unter anderem die Selektivität wirksamer Substanzen. Die Nutzung der Wirkstoffe, die mit einer spezifischen Thioredoxin Reduktase gefunden wurden, als Fungizid auch bei anderen Pilzen kann darauf zurückgeführt werden, dass sich Thioredoxin Reduktasen aus verschiedenen Pilzspezies sehr nahe stehen und in größeren Bereichen eine ausgeprägte Homologie zeigen. So wird an 2 deutlich, dass eine solche Homologie über beträchtliche Sequenzabschnitte hinweg zwischen S. cerevisiae, N. crassa, S. pombe, P. carinii, P. jiroveci, P. chrysogenum und U. maydis besteht und damit die Wirkung der z.B. mit Hilfe der Thioredoxin Reduktase aus U. maydis gefundenen Substanzen nicht auf U. maydis beschränkt bleibt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb auch ein Verfahren zum Identifizieren von Fungiziden durch Testen von potentiellen Inhibitoren bzw. Modulatoren der enzymatischen Aktivität der Thioredoxin Reduktase (Kandidatenverbindung oder Testverbindung) in einem Thioredoxin Reduktase-Hemmtest.

Verfahren, die geeignet sind, Modulatoren, insbesondere Inhibitoren bzw. Antagonisten der erfindungsgemäßen Polypeptide zu identifizieren, beruhen in aller Regel auf der Bestimmung der Aktivität bzw. der biologischen Funktionalität des Polypeptids. Dazu kommen prinzipiell sowohl auf ganzen Zellen beruhende Verfahren (in vivo Verfahren) in Frage, wie auch Verfahren, die auf der Verwendung des aus den Zellen isolierten Polypeptids beruhen, das in gereinigter oder teilweise gereinigter Form oder auch als Rohextrakt vorliegen kann. Diese zellfreien in vitro Verfahren können ebenso wie in vivo Verfahren im Labormaßstab, in bevorzugter Weise aber auch in HTS oder UHTS Verfahren genutzt werden. Im Anschluss an die in vivo oder in vitro Identifizierung von Modulatoren des Polypeptids können Tests an Pilzkulturen durchgeführt werden, um die fungizide Wirksamkeit der gefundenen Verbindungen zu prüfen.

Viele Testsysteme, die die Prüfung von Verbindungen und natürlichen Extrakten zum Ziel haben, sind bevorzugt auf hohe Durchsatzzahlen ausgerichtet, um die Zahl der untersuchten Substanzen in einem gegebenen Zeitraum zu maximieren. Testsysteme, die auf zellfreiem Arbeiten beruhen, brauchen gereinigtes oder semi-gereinigtes Protein. Sie sind geeignet für eine "erste" Prüfung, die in erster Linie darauf abzielt, einen möglichen Einfluss einer Substanz auf das Zielprotein zu detektieren. Ist eine solche erste Prüfung erfolgt und eine oder mehrere Verbindungen, Extrakte etc. gefunden, kann die Wirkung solcher Verbindungen im Labor noch gezielter untersucht werden. So kann in einem ersten Schritt die Inhibierung oder Aktivierung des erfindungsgemäßen Polypeptids in vitro noch einmal geprüft werden, um im Anschluss daran die Wirksamkeit der Verbindung am Zielorganismus, hier einem oder mehreren pflanzenpathogenen Pilzen, zu testen. Die Verbindung kann dann gegebenenfalls als Ausgangspunkt für die weitere Suche und Entwicklung von fungiziden Verbindungen verwendet werden, die auf der ursprünglichen Struktur basieren, jedoch z.B. hinsichtlich Wirksamkeit, Toxizität oder Selektivität optimiert sind.

Um Modulatoren aufzufinden, kann z.B. ein synthetischer Reaktionsmix (z.B. Produkte der in vitro Transkription) oder ein zellulärer Bestandteil, wie eine Membran, ein Kompartiment oder irgendeine andere Präparation, die die erfindungsgemäßen Polypeptide enthält, zusammen mit einem gegebenenfalls markierten Substrat oder Liganden der Polypeptide in Gegenwart und Abwesenheit eines Kandidatenmoleküls inkubiert werden. Die Fähigkeit des Kandidatenmoleküls die enzymatische Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide zu hemmen, wird z.B. erkennbar an einer verringerten Bindung des gegebenenfalls markierten Liganden oder an einer verringeren Umsetzung des gegebenenfalls markierten Substrates. Moleküle, die die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide hemmen, sind gute Antagonisten bzw. Inhibitoren.

Die Detektion der biologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide kann durch ein so genanntes Reportersystem verbessert werden. Reportersysteme in dieser Hinsicht umfassen, sind aber nicht beschränkt auf colorimetrisch oder fluorimetrische nachweisbare Substrate, die in ein Produkt umgewandelt werden oder ein Reportergen, das auf Veränderungen der Aktivität oder der Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide anspricht oder andere bekannte Bindungstests.

Ein weiteres Beispiel für ein Verfahren, mit welchem Modulatoren der erfindungsgemäßen Polypeptide aufgefunden werden können, ist ein Verdrängungstest, bei dem man unter dafür geeigneten Bedingungen die erfindungsgemäßen Polypeptide und einen potenziellen Modulator mit einem Molekül, das bekanntermaßen an die erfindungsgemäßen Polypeptide bindet, wie einem natürlichen Substrat oder Liganden oder einem Substrat- oder Liganden-Mimetikum zusammenbringt. Die erfindungsgemäßen Polypeptide selbst können markiert werden, z.B. fluorimetrisch oder colorimetrisch, so dass man die Anzahl der Polypeptide, die an einen Liganden gebunden sind oder die eine Umsetzung mitgemacht haben, exakt bestimmen kann. Ebenso kann jedoch die Bindung mittels des gegebenenfalls markierten Substrats, Liganden bzw. Substratanalogen verfolgt werden. Auf diese Weise lässt sich die Effektivität eines Antagonisten ermessen.

Effekte wie Zelltoxizität werden in diesen in vitro Systemen in der Regel ignoriert. Die Testsysteme überprüfen dabei sowohl inhibierende bzw. suppressive Effekte der Substanzen, als auch stimulatorische Effekte. Die Effektivität einer Substanz kann durch konzentrationsabhängige Testreihen überprüft werden. Kontrollansätze ohne Testsubstanzen bzw. ohne Enzym können zur Bewertung der Effekte herangezogen werden.

Durch die anhand der vorliegenden Erfindung verfügbaren, für eine erfindungsgemäße Thioredoxin Reduktase kodierende Nukleinsäuren enthaltenden Wirtszellen, wird auch die Entwicklung von Testsystemen, die auf Zellen basieren, zur Identifizierung von Substanzen ermöglicht, die die Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide modulieren.

Vorzugsweise handelt es sich bei den zu identifizierenden Modulatoren um kleine organischchemische Verbindungen.

Ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die die Aktivität einer Thioredoxin Reduktase aus Pilzen moduliert und die als Fungizid im Pflanzenschutz verwendet werden kann, besteht bevorzugt darin, dass man

a) ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder eine Wirtszelle enthaltend dieses Polypeptid mit einer chemischen Verbindung oder mit einem Gemisch von chemischen Verbindungen unter Bedingungen in Kontakt bringt, die die Interaktion einer chemischen Verbindung mit dem Polypeptid erlauben,
b) die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids bei Abwesenheit einer chemischen Verbindung mit der Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids bei Anwesenheit einer chemischen Verbindung oder eines Gemisches von chemischen Verbindungen vergleicht, und
e) die chemische Verbindung auswählt, die die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids spezifisch moduliert, und gegebenenfalls
d) die fungizide Wirkung der ausgewählten Verbindung in vivo prüft.

Besonders bevorzugt wird dabei diejenige Verbindung bestimmt, die die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids spezifisch inhibiert. Der Begriff "Aktivität", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die biologische Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Tatsache genutzt, dass die Thioredoxin Reduktase die Reduktion von oxidiertem Thioredoxin unter Verbrauch von NADPH katalysiert. Diese Umsetzung kann z.B. in Gegenwart von Insulin durchgeführt werden, das als Thioredoxin regenerierendes System verwendet werden kann, da durch die Thioredoxinreduktase reduziertes Thioredoxin als Disulfidreduktase Insulin zu oxidiertem Insulin umsetzt und dabei selbst wieder in den oxidierten Zustand überführt wird. Dieses oxidierte Thioredoxin dient dann als Substrat der Thioredoxin Reduktase. Bei der Reaktion der Thioredoxin Reduktase wird dann NADPH verbraucht. Der Versuchsansatz lässt sich wie folgt schematisch darstellen:

Die Messung der enzymatischen Aktivität der Thioredoxin Reduktase bzw. die Hemmung dieser enzymatischen Aktivität durch einen Inhibitor erfolgt dann auf Basis der abnehmenden NADPH-Konzentration und kann photospektrometrisch durch Absorptions- oder Fluoreszenzmessung (Absorptionsabnahme bei 340 nm bzw. Fluoreszenzabnahme bei 340 nm (Emission bei 465 nm)) bestimmt werden (5). Dabei wird die geringere bzw. inhibierte Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids anhand der photospektrometrischen Bestimmung des Grades der Abnahme der NADPH-Konzentration relativ zu einem Kontrollansatz verfolgt. Wird die Thioredoxinreduktase inhibiert, so erfolgt keine enzymatische Umsetzung des NADPHs. Die Fluoreszenintensität des Ansatzes sollte der des Kontrollansatzes entsprechen, da keine Änderung der NADPH-Konzentration erfolgt. Eine Zunahme der NADPH-Konzentration kann sich ergeben, wenn die enzymatische Aktivität der Thioredoxin Reduktase so stark inhibiert wird, dass das durch die Reaktion mit Insulin oxidierte Thioredoxin nicht mehr reduziert wird und sich damit anreichert.

Alternativ kann die Menge des NADPH z.B. auch nach erfolgter Reaktion durch Umsetzung von Resazurin zu Resorufin in Gegenwart von PMS (Phenazin-methosulfat) fluorimetrisch (Excitation 550 nm, Emission 595 nm) im Vergleich zur eingesetzten Menge bestimmt werden. Hierbei werden in einer chemischen Reaktion die Elektronen von NADPH zunächst auf PMS übertragen. Das reduzierte PMS ist dann in der Lage, Resazurin zu Resorufin zu reduzieren. Die Konzentration an Resurofin kann anschließend fluorimetrisch (Excitation 550 nm, Emission 595 nm) detektiert werden. Durch Vergleich mit der Konzentratin an Resorufin im Kontrollansatz kann dann die Menge an umgesetztem NADPH bestimmt werden. NADPH reduziert also nicht fluoreszierendes Resazurin zu intensiv rot fluoreszierendem Resorufin. PMS dient als Redoxmediator.

Die Messung kann auch in für HTS- oder UHTS-Assays gängigen Formaten erfolgen, z.B. in Mikrotiterplatten, in denen z.B. ein Gesamtvolumen von 5 bis 50 μl pro Ansatz bzw. pro Well vorgelegt wird und die einzelnen Komponenten in einer der vorstehend angegebenen Endkonzentrationen vorliegen. Dabei wird die zu testende, potentiell die Aktivität des Enzyms inhibierende oder aktivierende Verbindung (Kandidatenmolekül) z.B. in einer geeigneten Konzentration in Testpuffer enthaltend die für die Reaktion nötigen Komponenten vorgelegt. Dann wird das erfindungsgemäße Polypeptid im oben genannten Testpuffer zugegeben und die Reaktion damit gestartet. Der Ansatz wird dann z.B. bis zu 30 Minuten bei einer geeigneten Temperatur inkubiert und z.B. die Fluoreszenzabnahme (Extinktion 340 nm; Emission 465 nm) gemessen.

Eine weitere Messung erfolgt in einem entsprechenden Ansatz, jedoch ohne Zugabe eines Kandidatenmoleküls und ohne Zugabe eines erfindungsgemäßen Polypeptids (Negativkontrolle). Eine weitere Messung erfolgt wiederum bei Abwesenheit eines Kandidatenmoleküls, jedoch bei Anwesenheit des erfindungsgemäßen Polypeptids (Positivkontrolle). Negativ- und Positivkontrolle ergeben damit die Vergleichswerte zu den Ansätzen bei Anwesenheit eines Kandidatenmoleküls.

Um optimale Bedingungen für ein Verfahren zum Identifizieren von Inhibitoren der Thioredoxin Reduktase bzw. zur Bestimmung der Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide zu ermitteln, kann es vorteilhaft sein, den jeweiligen K_M-Wert des verwendeten erfindungsgemäßen Polypeptids zu bestimmen. Dieser gibt Aufschluss über die bevorzugt zu verwendende Konzentration des bzw. der Substrate. Im Fall der Thioredoxin Reduktase aus U. maydis konnte ein K_M von 5 μM für E. coli Thioredoxin und ein K_M von 20–40 μM für NADPH bestimmt werden (6).

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren konnten auf diese Weise Inhibitoren der Thioredoxin Reduktase identifiziert werden.

Es versteht sich von selbst, dass neben den genannten Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase bzw. der Inhibition dieser Aktivität und zum Identifizieren von Fungiziden auch andere, z.B. bereits bekannte, Verfahren bzw. Hemmtests verwendet werden können, solange diese Verfahren es gestatten, die Aktivität einer Thioredoxin Reduktase zu bestimmen und eine Inhibition dieser Aktivität durch eine Kandidatenverbindung zu erkennen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde auch gefunden, dass die mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten Inhibitoren einer erfindungsgemäßen Thioredoxin Reduktase geeignet sind, gegebenenfalls in einer geeigneten Formulierung, Pilze zu schädigen oder zu töten.

Dazu kann z.B. in die Kavitäten von Mikrotiterplatten eine Lösung des zu prüfenden Wirkstoffs pipettiert werden. Nachdem das Lösungsmittel abgedampft ist, wird zu jeder Kavität Medium hinzugefügt. Das Medium wird vorher mit einer geeigneten Konzentration von Sporen bzw. Mycel des zu prüfenden Pilzes versetzt. Die resultierenden Konzentrationen des Wirkstoffes betragen z.B. 0,1, 1, 10 und 100 ppm.

Die Platten werden anschließend auf einem Schüttler bei einer Temperatur von etwa 22°C inkubiert, bis in der unbehandelten Kontrolle ein ausreichendes Wachstum feststellbar ist.

Die Auswertung erfolgt photometrisch bei einer Wellenlänge von 620 nm. Aus den Messdaten der verschiedenen Konzentrationen kann die Wirkstoffdosis bestimmt werden, die zu einer 50 %igen Hemmung des Pilzwachstums gegenüber der unbehandelten Kontrolle führt (ED₅₀). Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher ebenfalls auf die Verwendung von Modulatoren der Thioredoxin Reduktase aus Pilzen, bevorzugt aus pflanzenpathogenen Pilzen als Fungizide. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Fungizide, die mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifiziert wurden.

Verbindungen, die mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifiziert werden, und die aufgrund der Inhibition der pilzlichen Thioredoxin Reduktase eine fungizide Wirkung aufweisen, können somit zur Herstellung von fungiziden Mitteln verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf die Verwendung von Modulatoren der Thioredoxin Reduktase aus Pilzen, bevorzugt aus pflanzenpathogenen Pilzen als Fungizide und auf Verfahren zum Bekämpfen von Pilzbefall bei Pflanzen, indem man einen Inhibitor einer Thioredoxin Reduktase auf den Pilz und/oder die befallene Pflanze einwirken lässt. Bevorzugt handelt es sich dabei um Inhibitoren einer Thioredoxin Reduktase aus einem pflanzenpathogenen Pilz.

Die identifzierten Wirkstoffe können in Abhängigkeit von ihren jeweiligen physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften in die üblichen Formulierungen überführt werden, wie Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Pulver, Schäume, Pasten, Granulate, Aerosole, Feinstverkapselungen in polymeren Stoffen und in Hüllmassen für Saatgut, sowie ULV-Kalt- und Warmnebel-Formulierungen.

Diese Formulierungen werden in bekannter Weise hergestellt, z.B. durch Vermischen der Wirkstoffe mit Streckmitteln, also flüssigen Lösungsmitteln, unter Druck stehenden verflüssigten Gasen und/oder festen Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln, also Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln und/oder schaumerzeugenden Mitteln. Im Falle der Benutzung von Wasser als Streckmittel können z.B. auch organische Lösungsmittel als Hilfslösungsmittel verwendet werden. Als flüssige Lösungsmittel kommen im wesentlichen in Frage: Aromaten, wie Xylol, Toluol oder Alkylnaphthaline, chlorierte Aromaten oder chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Chlorbenzole, Chlorethylene oder Methylenchlorid, aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Cyclohexan oder Paraffine, z.B. Erdölfraktionen, Alkohole, wie Butanol oder Glycol sowie deren Ether und Ester, Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon oder Cyclohexanon, stark polare Lösungsmittel, wie Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid, sowie Wasser. Mit verflüssigten gasförmigen Streckmitteln oder Trägerstoffen sind solche Flüssigkeiten gemeint, welche bei normaler Temperatur und unter Normaldruck gasförmig sind, z.B. Aerosol-Treibgase, wie Halogenkohlenwasserstoffe sowie Butan, Propan, Stickstoff und Kohlendioxid. Als feste Trägerstoffe kommen in Frage: z.B. natürliche Gesteinsmehle, wie Kaoline, Tonerden, Talkum, Kreide, Quarz, Attapulgit, Montmorillonit oder Diatomeenerde und synthetische Gesteinsmehle, wie hochdisperse Kieselsäure, Aluminiumoxid und Silikate. Als feste Trägerstoffe für Granulate kommen in Frage: z.B. gebrochene und fraktionierte natürliche Gesteine wie Calcit, Marmor, Bims, Sepiolith, Dolomit sowie synthetische Granulate aus anorganischen und organischen Mehlen sowie Granulate aus organischem Material wie Sägemehl, Kokosnußschalen, Maiskolben und Tabakstengel. Als Emulgier und/oder schaumerzeugende Mittel kommen in Frage: z.B. nichtionogene und anionische Emulgatoren, wie Polyoxyethylen-Fettsäureester, Polyoxyethylen-Fettalkoholether, z.B. Allcylarylpolyglycolether, Alkylsulfonate, Alkylsulfate, Arylsulfonate sowie Eiweißhydrolysate. Als Dispergiermittel kommen in Frage: z.B. Lignin-Sulfitablaugen und Methylcellulose.

Es können in den Formulierungen Haftmittel wie Carboxymethylcellulose, natürliche und synthetische pulverige, körnige oder latexförmige Polymere verwendet werden, wie Gummiarabicum, Polyvinylalkohol, Polyvinylacetat, sowie natürliche Phospholipide, wie Kephaline und Lecithine, und synthetische Phospholipide. Weitere Additive können mineralische und vegetabile Öle sein.

Es können Farbstoffe wie anorganische Pigmente, z.B. Eisenoxid, Titanoxid, Fenocyanblau und organische Farbstoffe, wie Alizarin-, Azo- und Metallphthalocyaninfarbstoffe und Spurennährstoffe, wie Salze von Eisen, Mangan, Bor, Kupfer, Kobalt, Molybdän und Zink verwendet werden.

Die Formulierungen enthalten im allgemeinen zwischen 0,1 und 95 Gewichtsprozent Wirkstoff, vorzugsweise zwischen 0,5 und 90 %.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können als solche oder in ihren Formulierungen auch in Mischung mit bekannten Fungiziden, Bakteriziden, Akariziden, Nematiziden oder Insektiziden verwendet werden, um so z.B. das Wirkungsspektrum zu verbreitern oder Resistenzentwicklungen vorzubeugen. In vielen Fällen erhält man dabei synergistische Effekte, d.h. die Wirksamkeit der Mischung ist größer als die Wirksamkeit der Einzelkomponenten.

Beim Einsatz der erfindungsgemäßen Verbindungen als Fungizide können die Aufwandmengen je nach Applikation innerhalb größerer Bereiche variiert werden.

Erfindungsgemäß können alle Pflanzen und Pflanzenteile behandelt werden. Unter Pflanzen werden hierbei alle Pflanzen und Pflanzenpopulationen verstanden, wie erwünschte und unerwünschte Wildpflanzen oder Kulturpflanzen (einschließlich natürlich vorkommender Kulturpflanzen). Kulturpflanzen können Pflanzen sein, die durch konventionelle Züchtungs- und Optimierungsmethoden oder durch biotechnologische und gentechnologische Methoden oder Kombinationen dieser Methoden erhalten werden können, einschließlich der transgenen Pflanzen und einschließlich der durch Sortenschutzrechte schützbaren oder nicht schützbaren Pflanzensorten. Unter Pflanzenteilen sollen alle oberirdischen und unterirdischen Teile und Organe der Pflanzen, wie Sproß, Blatt, Blüte und Wurzel verstanden werden, wobei beispielhaft Blätter, Nadeln, Stengel, Stämme, Blüten, Fruchtkörper, Früchte und Samen sowie Wurzeln, Knollen und Rhizome aufgeführt werden. Zu den Pflanzenteilen gehört auch Erntegut sowie vegetatives und generatives Vermehrungsmaterial, beispielsweise Stecklinge, Knollen, Rhizome, Ableger und Samen.

Die erfindungsgemäße Behandlung der Pflanzen und Pflanzenteile mit den Wirkstoffen erfolgt direkt oder durch Einwirkung auf deren Umgebung, Lebensraum oder Lagerraum nach den üblichen Behandlungsmethoden, z.B. durch Tauchen, Sprühen, Verdampfen, Vernebeln, Streuen, Aufstreichen und bei Vermehrungsmaterial, insbesondere bei Samen, weiterhin durch ein- oder mehrschichtiges Umhüllen.

Die nachfolgenden Beispiele illustrieren verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung und sind nicht limitieren auszulegen.

Beispiel 1
Klonierung, Expression und Reinigung der TRR1 aus U. maydis
Für die heterologe Expression des trr1-Gens wurde das Gen mit genspezifischen Oligonucleotiden mittels PCR amplifiziert und in den Expressionsvektor pTrcHis2-TOPO kloniert, so dass das TRR-Protein ausgehend vom Plasmid ptrcTRR10 mit einem C-terminalen His₆-Tag exprimiert wird.
Zur Expression der 7RR1 wurde das Plasmid ptrcTRR10 in E.coli BL21(DE3) transformiert. Als Vorkultur wurden 5 ml Selektionsmedium (dYT mit 100 μg/ml Ampicillin) mit einer Einzelkolonie angeimpft und bei 37°C über Nacht im Schüttler inkubiert. Die Hauptkultur (dYT mit 100 μg/ml Ampicillin) wurde 1 : 40 angeimpft und bei 37°C unter Schütteln inkubiert, nach Erreichen einer OD₆₀₀ von 0,8 wurde die Kultur durch Zugabe von 1 mM IPTG (Endkonzentration) induziert. Nach einer Inkubationszeit von 4 h bei 37°C wurden die Zellen geerntet und anschließend bei –20°C eingefroren. Die Zellen können auf diese Weise mehrere Monate bei –20°C ohne Aktivitätsverlust gelagert werden. 2 g Zellen wurden in 5 ml Bindepuffer (40 mM Tris/HCl pH 8.0, 100 mM NaCl) resuspendiert, 600 ng Lysozym und 500 ng DNaseI zugegeben. Die Zellsuspension wurde unter Rühren auf Eis 30 min inkubiert. Der Aufschluss erfolgte durch 3 Zyklen „Freeze and Thaw". Nach einer Zentrifugation bei 11000 rpm und 4°C für 30 Minuten wurde der Überstand auf eine Ni-NTA-Säule (Volumen: 2 ml), die mit Puffer A (20 mM Tris/HCl, pH 8.0, 5 mM MgCl₂, 150 mM NaCl) äquilibriert war, aufgetragen. Die Säule wurde mit 8 ml Puffer A gewaschen, die Elution erfolgte mit 7 ml Puffer A + 100 mM Imidazol (1). Anschließend wurde die Proteinfraktion über eine NAP25-Säule entsalzt und in Lagerungspuffer (50 mM Tris/HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA) überführt. Aus 500 ml-E. coli-Kultur können ca. 8.8 mg lösliche TRR isoliert werden. Der Proteinlösung wurde bei –80°C eingefroren. Das auf diese Weise isolierte Enzym ist bei –80°C ca. 2 Monate ohne Aktivitätsverlust lagerbar.
Beispiel 2
Klonierung, Expression und Reinigung des E. coli Thioredoxins (Substrat)
Zur Expression von Thioredoxin in E. coli wurde das Plasmid pEt32A (Novagen, siehe http://www.merckbiosciences.de/product/69015) in E.coli BL21(DE3) transformiert. Als Vorkultur wurden 5 ml Selektionsmedium (dYT (double Yeast Tryptone) mit 100 μg/ml Ampicillin) mit einer Einzelkolonie angeimpft und bei 37°C über Nacht im Schüttler inkubiert. Die Hauptkultur (dYT mit 100 μg/ml Ampicillin) wurde 1:40 angeimpft und bei 37°C unter Schütteln inkubiert, nach Erreichen einer OD₆₀₀ von 0,8 wurde die Kultur durch Zugabe von 1 mM IPTG (Endkonzentration) induziert. Nach einer Inkubationszeit von 4 h bei 37°C wurden die Zellen geerntet und anschließend bei –20°C eingefroren. Die Zellen können auf diese Weise mehrere Monate bei –20°C ohne Aktivitätsverlust gelagert werden. 6 g Zellen wurden in 94 ml Bindepuffer (40 mM Tris/HCl pH 8.0, 100 mM NaCl) resuspendiert und Lysozym und DNaseI zugegeben. Die Zellsuspension wurde unter Rühren auf Eis 30 min inkubiert. Der Aufschluss erfolgte mittels Ultraschall in einem Rosettenkranzgefäß mit 8 Zyklen à 90 sec und jeweils 90 sec Pause (gekühlt mit Eiswasser). Nach einer Zentrifugation bei 13000 rpm (Eppendorfzentrifuge) und 4°C für 30 Minuten wurde der Überstand auf eine Ni-NTA-Säule (Volumen: 8 ml), die mit Puffer A (20 mM Tris/HCl, pH 8.0, 5 mM MgCl₂, 150 mM NaCl) äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde mit 30 ml Puffer A gewaschen, die Elution erfolgte mit 30 ml Puffer A + 100 mM Imidazol (4).. Anschließend wurde die Proteinfraktion über eine NAP25-Säule entsalzt und in Lagerungspuffer (50 mM Tris/HCl, pH 8.0) überführt. Aus 60 Litern einer E. coli-Kultur wurde ca. 1 g lösliches Thioredoxin isoliert.
Die Proteinlösung wurde bei –20°C eingefroren. Das auf diese Weise isolierte Enzym ist bei –20°C mehrere Monate ohne Aktivitätsverlust lagerbar.
Beispiel 3
Bestimmung der idealen Substratkonzentrationen (K_M-Werte) zur Durchführung eines Thioredoxin Reduktase-Hemmtests
3.1 K_M-Wert-Bestimmung für Thioredoxin aus E. coli
Für das Substrat Thioredoxin wurde der K_M-Wert mittels der anfänglichen Fluoreszenz-abnahme bei 360 nm/465 nm bestimmt. Aufgrund der starken Schwankungen bei sehr kleinen Thioredoxin-Konzentrationen, der unterschiedlichen Qualität der Thioredoxin-Präparationen und der unterschiedlichen Hintergrundabnahme an NADPH wurden leicht variierende K_M-Werte erhalten. Aus dem Lineweaver-Burk-Plot (6(A)) ergibt sich ein K_M-Wert zwischen 0,75–5 μM. Die Messungen wurde mit 300 ng TRR durchgeführt. Die Menge an eingesetztem Thioredoxin wurde dabei variiert, um einen optimalen read-out zu erhalten. Dabei zeigte sich bei etwa 1 μM Thioredoxin (heterolog in E. coli exprimiert, vgl. Beispiel 2), was etwa dem niedrigsten bestimmten K_M-Wert und etwa ein sechstel des höchsten bestimmten K_M-Werts entspricht, ein gutes Verhältnis zwischen read-out und Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren.
3.2 K_M-Wert-Bestimmung für NADPH
Um einen möglichst hohen read-out in einem für die Durchführung von Screening-Verfahren akzeptablen Zeitfenster zu erhalten, wurde der Test mit verschiedenen Konzentrationen von NADPH durchgeführt. Gemessen wird der Verbrauch von NADPH in Abhängigkeit von der eingesetzten NADPH-Konzentration. Die TRR1-Konzentration betrug 300 ng in einem Reaktionsvolumen von 50 μl. Die Auftragung erfolgte als Lineweaver-Burk-Plot (6(B)). Der K_M-Wert der Thioredoxin Reduktase für NADPH aus E.coli beträgt laut Literatur 3–8 μM. Da die NADPH-Fluoreszenz auch als Meßparameter dient, wurde die K_M-Wert-Bestimmung parallel durch Nachweis der entstehenden freien SH-Gruppen des Thioredoxins mit DTNB durchgeführt und die Absorptionsänderung gemessen. Es ergab sich ein K_M-Wert für NADPH von 16–40 μM aus der Messung mit NADPH. Die Durchführung eines Screening-Verfahrens bzw. eines Hemmtests wird deshalb z.B. mit 30 μM NADPH durchgeführt, um einen ausreichenden read-out zu erhalten.
Beispiel 4
Prüfung der Funktionalität des Thioredoxin Reduktase-Hemmtests mit Hilfe eines bekannten Inhibitors der Thioredoxin Reduktase
Als Inhibitor der Thioredoxin Reduktase wird in der Literatur N-Ethylmaleimid (M_r 125,1 g/mol) beschrieben. Um zu prüfen, ob mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens Inhibitoren der Thioredoxin Reduktase identifiziert werden können, wurde das Verfahren anhand dieses bekannten Inhibitors getestet. Der Test wurde in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen an N-Ethylmaleimid durchgeführt. Es zeigte sich dabei, dass die NADPH-Fluoreszenz in Gegenwart von hohen Konzentrationen an Inhibitor zunächst sehr stark abnimmt. Daneben kann N-Ethylmaleimid auch Thioredoxin selbst als „SH-Gruppen-Reagens" hemmen. Die Messung (7) zeigt, dass die Hemmwirkung wie erwünscht konzentrationsabhängig ist, jedoch erst sehr hohe Konzentrationen an N-Ethylmaleimid zu einer vollständigen Reaktionshemmung führen. Unter Inkaufnahme des Verlustes eines Teils der NADPH-Fluoreszenz durch den Inhibitor ist der Hemmstoff für diesen Test als Kontrollhemmstoff geeignet.
Beispiel 5
Identifzierung von Modulatoren der Thioredoxin Reduktase in 384-well-MTP in einem Assay mit Thioredoxin regenerierendem System
In den Spalten 1 und 2 der MTP wurde die Negativ-Kontrolle pipettiert. Diese setzte sich zusammen aus 5 μl 5% (v/v) DMSO, 20 μl Substratlösung (18,75 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 7.4; 1,25 nM EDTA, 75 μM NADPH) und 25 μl Enzymlösung ohne TRR (15 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 7.4; 1 mM EDTA, 256 μM Insulin, 40 nM/μl Thioredoxin). In die Spalten 3 und 4 wurde die Positiv-Kontrolle pipettiert. Diese setzte sich zusammen aus 5 μl 5% (v/v) DMSO, 20 μl Substratlösung (18,75 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 7.4; 1,25 mM EDTA, 75 μM NADPH) und 25 μl Enzymlösung (15 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 7.4; 1 mM EDTA, 256 μM Insulin, 40 nM/μl Thioredoxin und 4.8 ng/μl TRR). In die übrigen Spalten wurden Prüfsubstanzen in einer Konzentration von 10 μM in DMSO vorgelegt, wobei zum Verdünnen der Substanz H₂O verwendet wurde. Nach Zugabe von 20 ml Substratlösung (18,75 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 7.4; 1,25 mM EDTA, 75 μM NADPH) wurden zum Start der Reaktion 25 μl Enzymlösung (15 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 7.4; 1 mM EDTA, 256 μM Insulin, 40 nM/μl Thioredoxin und 4.8 ng/μl TRR) zugegeben. Es erfolgte eine Inkubation bei 30°C für 45 min. Anschließend wurden 50 μl eines Resazurin/PMS-Mixes (300 mM Natriumacetat pH 5.8, 1% (v/v) DMSO, 20 mM PMS, 10 μM Resazurin) zugegeben. Das während der Reaktion nicht umgesetzte NADPH reagiert mit Resazurin in Gegenwart von PMS zu fluoreszierendem Resorufin. Der Nachweis des Resorufins erfolgte durch Bestimmung der Abnahme der Fluoreszenzintensität bei 595 nm (Excitation 550 nm) in einem geeigneten SPECTRAFluor Plus Reader der Firma Tecan.
Beispiel 6
Nachweis der fungiziden Wirkung der identifizierten Inhibitoren der Thioredoxin Reduktase
In die Kavitäten von Mikrotiterplatten werden eine methanolische Lösung des anhand eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten Wirkstoffs (Bsp. 3), versetzt mit einem Emulgator, pipettiert. Nachdem das Lösungsmittel abgedampft ist, werden je Kavität 200 μl Potatoe-Dextrose-Medium hinzugefügt. Das Medium wird vorher mit geeigneten Konzentrationen von Sporen bzw. Mycelen des zu prüfenden Pilzes versetzt.
Die resultierenden Konzentrationen des Wirkstoffs beträgt z.B. 0,1, 1, 10 und 100 ppm. Die resultierende Konzentration des Emulgators beträgt 300 ppm.
Die Platten werden anschließend auf einem Schüttler bei einer Temperatur von 22°C inkubiert, bis in der unbehandelten Kontrolle ein ausreichendes Wachstum feststellbar ist. Die Auswertung erfolgt photometrisch bei einer Wellenlänge von 620 nm. Aus den Messdaten der verschiedenen Konzentrationen wird die Wirkstoffdosis, die zu einer 50 %igen Hemmung des Pilzwachstums gegenüber der unbehandelten Kontrolle führt (ED₅₀), berechnet.
Literatur

1. Giaever G. et al. (2002): Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature 418, 387–91.
2. Hofmann, K. et al. (1999): The PROSITE database, ist status in 1999. Nucl. Acid Res. 27, 215–219.
3. Machado A. K. et al. (1997): Thioredoxin reductase-dependent inhibition of MCB cell cycle box activity in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 272 (27), 17045–54.
4. Mumberg, D. et al. (1995): Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene 156, 119–122.
5. Onai und Nakshima (1997): Mutation of the cys-9 gene, which encodes thioredoxin reductase, affects the circadian conidiation rhythm in Neurospora crassa. Genetics 146, 101–110.
6. Pearson G. D. and Merrill G. F.: Deletion of the Saccharomyces cerevisiae TRR1 gene encoding thioredoxin reductase inhibits p53-dependent reporter gene expression. J. Biol. Chem. 273(10), 5431–4.

Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zum Identifizieren von Fungiziden, dadurch gekennzeichnet, dass man (a) ein pilzliches Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase mit einer chemischen Verbindung oder einem Gemisch von chemischen Verbindungen unter Bedingungen, die die Interaktion der chemischen Verbindung mit dem Polypeptid erlauben, in Kontakt bringt, (b) die Aktivität der Thioredoxin Reduktase bei Abwesenheit einer chemischen Verbindung mit der Aktivität der Thioredoxin Reduktase bei Anwesenheit einer chemischen Verbindung oder eines Gemisches von chemischen Verbindungen vergleicht, und (c) die chemische Verbindung, die die Thioredoxin Reduktase spezifisch inhibiert, auswählt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Aktivität der Thioredoxin Reduktase anhand der Abnahme der NADPH-Konzentration bestimmt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Hemmung der enzymatischen Aktivität der Thioredoxin Reduktase bei Anwesenheit einer chemischen Verbindung anhand einer geringeren Abnahme der NADPH-Konzentration im Vergleich zur enzymatischen Aktivität der Thioredoxin Reduktase bei Abwesenheit einer chemischen Verbindung bestimmt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man Aktivität der Thioredoxin Reduktase in Anwesenheit von Insulin bestimmt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem weiteren Schritt die fungizide Wirkung der identifizierten Verbindung testet, indem man sie mit einem Pilz in Kontakt bringt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Thioredoxin Reduktase aus einem pflanzenpathogenen Pilz verwendet.
Verfahren zum Bekämpfen von Pilzbefall bei Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Inhibitor einer pilzlichen Thioredoxin Reduktase auf den Pilz und/oder seinen Lebensraum einwirken lässt.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man den Inhibitor mit einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 identifiziert.
Verwendung von Inhibitoren von Polypeptiden mit der Aktivität einer Thioredoxin Reduktase als Fungizide.
Verwendung von Inhibitoren eines Polypeptids mit der Aktivität einer Thioredoxin Reduktase, welche durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 identifiziert werden, als Fungizide.
Nukleinsäure, kodierend für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einem pflanzenpathogenen Pilz stammt.
Nukleinsäure gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus: a) einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, b) Sequenzen, die für ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst, c) Sequenzen, die für ein Polypeptid kodieren, welches das Motiv C-x(2)-C-D-[GA]-x(2,4)-[FY]-x(4)-[LIVM]-x-[LIVM](2)-G(3)-[DN] umfasst, d) Sequenzen, welche an die unter a) und b) definierten Sequenzen bei einer Hybridisierungstemperatur von 42–65°C hybridisieren, und e) Sequenzen, welche eine zumindest 80 %ige, bevorzugt eine zumindest 85 %ige und besonders bevorzugt eine zumidest 90 %ige Identität mit den unter a) und b) definierten Sequenzen aufweisen.
DNA-Konstrukt umfassend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 11 oder 12 und einen heterologen Promotor.
Vektor umfassend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 11 oder 12, oder ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 12.
Vektor gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure funktionell mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, die die Expression der Nukleinsäure in pro- oder eukaryotischen Zellen gewährleisten.
Wirtszelle enthaltend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 11 oder 12, ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 13 oder einen Vektor gemäß Anspruch 14 oder 15.
Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase, welches von einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 11 oder 12 kodiert wird.
Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Thioredoxin Reduktase, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus: a) der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2, b) Sequenzen, welche eine zumindest 80 %ige, bevorzugt eine zumindest 85 %ige, besonders bevorzugt eine 90 %ige und insbesondere bevorzugt eine 95 %ige Identität mit der unter a) definierten Sequenz haben, c) den unter b) angegebenen Sequenzen, welche das Motiv C-x(2)-C-D-[GA]-x(2,4)-[FY]-x(4)-[LIVM]-x-[LIVM](2)-G(3)-[DN] und bevorzugt das Motiv C-A-V-C-D-G-A-V-P-I-F-R-N-K-P-L-x-V-[VI]-G(3)-D umfassen.