WO2005000342A1 - Peptides derives de la proteine mmp-2 et leur utilisation en immunotherapie antitumorale - Google Patents

Peptides derives de la proteine mmp-2 et leur utilisation en immunotherapie antitumorale Download PDF

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Francine Jotereau
Emmanuelle Godefroy
Elisabeth Diez
Agnès AUBRY
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Universite De Nantes
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Definitions

  • the present invention relates to peptides derived from the MMP-2 protein and to their use in tumor immunotherapy.
  • Vaccination or peptide immunotherapy is a therapeutic approach which is currently the subject of great interest in the context of the prevention or treatment of cancers. Its principle is based on the induction of an immune response towards peptides representing T epitopes of tumor antigens recognized by cytotoxic T lymphocytes (CTL), which play a major role in the elimination of cancer cells expressing these antigens on their surface.
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • the CTLs do not recognize the entire protein antigens, but peptide fragments thereof, presented by the molecules of the major histocompatibility complex (MHC) expressed on the surface of different cells. It is these peptide fragments which constitute the T epitopes.
  • MHC major histocompatibility complex
  • the epitopes presented by the major histocompatibility class I complex (MHC I) generally have 8 to 11 amino acids, and are recognized by the CD8 + T cells, which represent the major component. of the cytotoxic response.
  • the epitopes presented by the major class II histocompatibility complex (MHC II) generally have 13 to 18 amino acids and are recognized by CD4 + T cells.
  • MMPs Matrix metalloproteases
  • MMP-2 also known as gelatinase A or type IV collagenase; OMIM 120360
  • OMIM 120360 cleaves type IV collagen, gelatin, as well as other components of the extracellular matrix. This protein is expressed in many healthy cells and tissues; it is also over-expressed in many cancers.
  • MMP-2 could be efficiently primed by melanoma cells to generate T epitopes presented by MHC I, and inducing cytotoxic T lymphocytes capable of lyzing these tumor cells.
  • the present invention therefore relates to the use of a molecule chosen from: - the metalloprotease MMP-2; - a fragment of said metalloprotease comprising a T epitope presented by MHC I; - a polynucleotide encoding said metalloprotease or for said fragment; for obtaining a medicament intended for anti-tumor immunotherapy, and more particularly for the treatment of melanomas expressing MMP-2.
  • Fragments of MMP-2 which can be used in accordance with the present invention include in particular any immunogenic peptide constituted by 8 to 11 consecutive amino acids of said metalloprotease, and constituting a T epitope presented by MHC I.
  • immunogenic peptides as well as the polynucleotides encoding these peptides are also part of the subject of the present invention.
  • T epitope presented by the MHC I a peptide capable of inducing a specific CTL response against the antigen from which it is derived.
  • the inventors have identified a peptide presented by HLA-A * 0201, of sequence (code 1 letter) GLPPDVQRV (SEQ ID NO: 1).
  • This peptide is capable of inducing a specific CTL response with respect to HLA-A * 0201 melanoma cells expressing MMP-2, and is therefore in particular usable for obtaining medicaments intended for the treatment of HLA-A * patients 0201.
  • Other T epitopes according to the invention can be obtained in various ways from the MMP-2 antigen.
  • anchoring residues For example, it is known that peptides capable of forming a complex with a given MHC I allele have in common the presence, at certain positions, of particular amino acid residues, called “anchoring residues”. We have thus defined for the different alleles of the MHC I, specific anchoring patterns, involving amino acids called “primary anchoring residues”. It has also been shown that residues located outside the primary anchoring motifs (secondary anchoring residues) can exert a favorable or unfavorable effect on the affinity of the peptide for MHC.
  • the choice of peptide sequences capable of constituting epitopes presented by a given MHC I allele can be carried out, in a conventional manner, by analysis of the peptide sequence of the MMP-2 antigen, in order to select the peptides having all or part of the primary anchor pattern corresponding to this allele.
  • Different databases listing the known anchoring patterns are available: as an example, the SYFPEITHI database (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/; RAMMENSEE et al., Immunogenetics, 50, 213-219, 1999), or the base BIMAS (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind; Parker et al., J.
  • compositions comprising at least one immunogenic peptide in accordance with the invention or a polynucleotide coding for said peptide, which may in particular be multiepitopic compositions capable of generating a polyspecific CTL response, and which for this purpose also comprise one or more other epitope (s)
  • These other epitopes can be derived from MMP-2, or from one or more other antigens.
  • Multiepitopic compositions in accordance with the invention can comprise, in order to be widely usable in a population in which individuals carry HLA alleles different, epitopes presented by different MHC I molecules.
  • compositions according to the invention can also further comprise at least one epitope presented by a MHC II molecule, and capable of inducing an auxiliary T response.
  • a composition according to the invention it comprises at least one chimeric polypeptide comprising one or more copies of an immunogenic peptide according to the invention.
  • said chimeric polypeptide further comprises one or more copies of at least one other immunogenic epitope. It is possible, for example, to inject the patient to be treated with an immunogenic peptide, or a composition in accordance with the invention as defined above, optionally combined with an appropriate adjuvant.
  • polynucleotides in accordance with the invention preferably integrated into nucleic acid vectors, in particular viral vectors such as adenoviruses, can also be directly administered by injection to the patient to be treated.
  • the present invention also encompasses antigen presenting cells having a T epitope derived from MMP-2 according to the invention.
  • Antigen presenting cells according to the invention can be obtained from all cells capable of presenting an antigen via the MHC I. In particular, they can be obtained from professional antigen presenting cells, for example dendritic cells. According to a preferred embodiment of the present invention, said antigen presenting cells are loaded in vi tro using an immunogenic peptide according to the invention, as described for example by BAKKER et al.
  • said antigen-presenting cells are transfected in vitro with a polynucleotide comprising a sequence coding for an immunogenic peptide in accordance with the invention, for example a polynucleotide coding for the protein MMP- 2 or for a fragment thereof.
  • the antigen presenting cells according to the invention can then be injected into the patient to be treated, as described for example by KAPLAN et al. (J. Immunol., 163 (2), 699-707, 1999) or KIM and aZ.
  • the present invention also encompasses the use of the protein MMP-2, or a fragment thereof, and in particular of an immunogenic peptide according to the invention, for the detection of CTLs directed against MMP-2 in a sample.
  • These peptides can also be used to carry out the specific sorting of these CTLs.
  • the CTLs thus isolated can then be amplified in vitro and reinjected in large numbers (of the order of a billion) to the patient.
  • the present invention thus relates to a process for the preparation of CTLs directed against MMP-2, characterized in that it comprises the selection, from CTLs taken from a patient suffering from melanoma, of those recognizing the protein MMP-2, or a fragment thereof, and in particular a peptide in accordance with the invention, and the in vitro multiplication of the T lymphocytes thus selected.
  • the present invention also relates to a preparation of CTLs directed against the MMP-2 protein, and in particular a preparation of CTLs capable of being obtained by the process defined above.
  • the present invention also encompasses drugs comprising an active principle chosen from: an immunogenic peptide in accordance with the invention; - a multiepitopic composition in accordance with the invention; - a polynucleotide according to the invention; an antigen presenting cell according to the invention; a preparation of CTLs in accordance with the invention.
  • an active principle chosen from: an immunogenic peptide in accordance with the invention; - a multiepitopic composition in accordance with the invention; - a polynucleotide according to the invention; an antigen presenting cell according to the invention; a preparation of CTLs in accordance with the invention.
  • EXAMPLE 1 CHARACTERIZATION OF A CTL CLONE (CLONE M134.12) RECOGNIZING HLA-A2 MELANOMA LINES.
  • CTL clones were obtained by stimulating with autologous tumor cells (according to the protocol described by PANDOLFINO et al., 1992, Eur. J. Immunol.,
  • TIL lymphocytes infiltrating tumors
  • HLA A * 0201, B * 0801, Cw * 0701 lymphocytes infiltrating tumors
  • CTL M134.12 lymphocytes infiltrating tumors
  • the CTL clone M134.12 was co-cultivated in the presence of the autologous line M134, and of various allogenic lines (M17, M113, M147, M153, M204, FM25, FM29, IPC 277/5, M25, M44, M88, M102, M117, M171, M199, M200) from melanomas of different HLA A * 0201 patients. After 6 hours of culture, the supernatants were removed and their TNF ⁇ concentration was determined by measuring the cytotoxicity of these culture supernatants for clone 13 of WEHI 164, as described by DE PLAEN et al. (Methods, 12, 125-42, 1997). The results are illustrated in Figure 1.
  • the CTL clone M134.12. recognizes, in addition to the M134 line, nine allogeneic melanoma cell lines expressing HLA A * 0201. This indicates that this CTL clone recognizes an antigen common to these lines and presented by the HLA A * 0201 allele.
  • EXAMPLE 2 IDENTIFICATION OF THE ANTIGEN RECOGNIZED BY THE CLONE CTL M134.12.
  • a cDNA library was constructed from the mRNAs of the tumor cell line M134. Construction of the cDNA Library The Poly- (A) + mRNAs were extracted from M134 cells using the Fast Track 2.0 kit (Invitrogen Corp., Oxon, UK). The synthesis of cDNA from purified mRNAs was carried out using a kit (Stratagene Inc., La Jolla, CA).
  • the neo-synthesized cDNAs were ligated to Eco RI adapters, then digested with Xho I and finally inserted at the Eco RI and Xho I sites of the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (Invitrogen Corp.).
  • the recombinant plasmids obtained were electroporated in the E. coli XL1 strain (Stratagene Inc., La Jolla, CA). After electroporation, nearly 60,000 clones resistant to ampicillin were isolated. To allow the screening of these clones, 574 groups (each of 100 bacterial clones resistant to ampicillin) were created.
  • the plasmid DNA of each of the groups was extracted by alkaline lysis using the QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen S.A., Courtaboeuf, France). This plasmid DNA was then co-transfected, in COS-7 cells, with an HLA A * 0201 vector (pHLA A * 0201, obtained from T. Boon, LICR, Brussels, Belgium).
  • DMEM fetal calf serum
  • antibiotics and L-glutamine were transfected with the vector pHLA- A * 0201, alone or in combination with the plasmid DNA from one of the groups in the M134 cDNA library.
  • the transfection was performed according to the DEAE-dextran-chloroquine protocol (BRICHARD, Exp. Med. 1993, 1 (78): 489-495).
  • 2.10 4 COS-7 cells were transfected with 100 ng of plasmid pHLA-A * 0201 and, for co-transfection, 100 ng of plasmid DNA from the M134 library.
  • the sequencing of pNA134-A shows that it contains a 1.3 kb cDNA whose sequence corresponds to the 3 'end of the sequence coding for the metalloprotease MMP-2 (accession number: NM_004530).
  • the MMP-2 protein is therefore the antigen recognized by the CTL clone M134.12.
  • the insert of plasmid pNA134-A codes for amino acids 501-661 of MMP-2.
  • the CTL clone M134.12 of the plasmids containing truncated variants of the cDNA insert of NA134-A fragment 20 coding for amino acids 501-661 of MMP-
  • MMP-2 was also built. Each of these plasmids was co-transfected with pHLA A * 0201 in COS-7 cells, which were then tested for their capacity to induce the secretion of TNF ⁇ by the CTL clone M134.12. The constructs tested are shown diagrammatically in FIG. 3 which also indicates their capacity to induce or not the secretion of TNF ⁇ by the CTL clone M134.12. These results show that the T epitope recognized by the CTL clone M134.12 is located between amino acids 556 and 593 of MMP-2.
  • GLPPDVQRV sequences SEQ ID NO: 1
  • LGLPPDVQRV SEQ ID NO: 2
  • LPPDVQRV SEQ ID NO: 3
  • GLPPDVQR SEQ ID NO: 4
  • EXAMPLE 3 EXPRESSION OF MMP-2 IN DIFFERENT CELL TYPES AND SPECIFIC RECOGNITION OF MELANOMA CELLS BY M134.12 CTLS It is known that MMP-2 is expressed constitutively by tissues such as the endometrium, the liver or aorta (KHASIGOV, Biochemistry, 2001), and by a large number of cell types such as macrophages, trophoblasts (YAMAMOTO, Cancer.

Abstract

L'invention est relative à des peptides constituant des épitopes T de l'antigène MMP-2, présentés par le CMH I. Ces peptides sont utilisables notamment en immunothérapie anti-tumorale.

Description

PEPTIDES DERIVES DE LA PROTEINE MMP-2 ET LEUR UTILISATION EN IMMUNOTHERAPIE ANTI UMORALE. La présente invention est relative à des peptides dérivés de la protéine MMP-2 et à leur utilisation en immunothérapie antitumorale. La vaccination ou immunothérapie peptidique est une approche thérapeutique qui fait actuellement l'objet d'un grand intérêt dans le cadre de la prévention ou du traitement des cancers. Son principe repose sur l'induction d'une réponse immune vis-à-vis de peptides représentant des epitopes T d' antigènes tumoraux reconnus par les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) , qui jouent un rôle majeur dans l'élimination des cellules cancéreuses exprimant ces antigènes à leur surface. On rappellera que les CTL ne reconnaissent pas les antigènes protéiques entiers, mais des fragments peptidiques de ceux-ci, présentés par les molécules du complexe majeur d' histocompatibilité (CMH) exprimées à la surface de différentes cellules. Ce sont ces fragments peptidiques qui constituent les epitopes T. Les epitopes présentés par le complexe majeur d' histocompatibilité de classe I (CMH I) ont généralement 8 à 11 acides aminés, et sont reconnus par les cellules T CD8+, qui représentent la composante majeure de la réponse cytotoxique. Les epitopes présentés par le complexe majeur d' histocompatibilité de classe II (CMH II) ont généralement 13 à 18 acides aminés et sont reconnus par les cellules T CD4+. L'identification de ces epitopes, et notamment de ceux présentés par le CMH I (compte tenu du rôle essentiel de la réponse CD8+ dans la cytotoxicité) , constitue donc une étape essentielle pour le développement de compositions d'immunothérapie anti-tumorale. Le mélanome est une tumeur maligne cutanée qui se développe aux dépens des mélanocytes epidermiques que sont les cellules pigmentaires de la peau. En France, on dénombre actuellement de 9 à 10 nouveaux cas pour 100.000 habitants chaque année, soit près de 5.000 nouveaux malades . Deux classes principales d'antigènes associés aux mélanomes (MAA) sont connues : les antigènes spécifiques, peu ou pas exprimés dans les tissus normaux, et les antigènes de différenciation mélanocytaire, qui sont également exprimés par les mélanocytes (pour revue, voir CASTELLI et al . , 2000, J Cell Physiol , 182, 323-31 ; KIRKIN et al . , 2002, Cancer Invest, 20, 222-36). En raison de la forte prévalence des cancers de type mélanome, il est souhaitable d'identifier d'autres antigènes tumoraux capables d'induire une réponse immunitaire cytotoxique antitumorale. Les métalloprotéases matricielles (MMP) sont des endopeptidases Zn-dépendantes qui sont responsables de la dégradation de différents composants protéiques de la matrice extracellulaire (ECM) et des membranes basales (KHASIGOV et al . , 2001, Biochemistry . , 66(2), 130-40). A l'heure actuelle, 21 membres de la famille MMP sont connus chez l'homme. La sur-expression des MMPs est observée dans un grand nombre de cancers humains et est associée à un faible taux de survie. En effet, les MMPs ont la capacité de potentialiser la progression tumorale en augmentant la croissance cellulaire, la migration cellulaire et l'angiogenèse (EGEBLAD and WERB, 2002, Nat . Rev. Cancer., 2(3), 161-74). La protéine MMP-2 (également dénommée gélatinase A ou collagénase de type IV ; OMIM 120360) clive le collagène de type IV, la gélatine, ainsi que d'autres composants de la matrice extracellulaire. Cette protéine est exprimée dans nombre de cellules et de tissus sains ; elle est également sur-exprimée dans de nombreux cancers. De nombreuses études ont montré qu'elle est impliquée dans la progression tumorale, les métastases et l'angiogenèse (LIOTTA et al . , 1980, Nature., 284 (5751), 67-8 ; ITOH et al . , 1998, Cancer. Res., 58(5), 1048-51 ; BROOKS et al . , 1998, Cell., 92(3), 391-400). Du fait de sa sur-expression dans de nombreux types de tumeurs, et de son implication dans la transformation maligne et dans l'angiogenèse tumorale, il a été proposé d'utiliser MMP-2 comme cible de traitements antitumoraux, en inhibant son activité (EGEBLAD and WERB, précité ; COUSSENS et al . , 2002, Science, 295 (5564), 2387-92) . Cependant, la protéine MMP-2 n'était pas considérée jusqu'à présent comme un antigène cible capable d'induire une réponse cytotoxique antitumorale. A fortiori, aucun épitope T de MMP-2 n'avait été identifié. Les Inventeurs ont maintenant découvert que
MMP-2 pouvait être apprêtée efficacement par des cellules de mélanome pour générer des epitopes T présentés par le CMH I, et induisant des lymphocytes T cytotoxiques capables de lyser ces cellules tumorales. La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation d'une molécule choisie parmi : - la metalloprotease MMP-2 ; - un fragment de ladite metalloprotease comprenant un épitope T présenté par le CMH I ; - un polynucléotide codant pour ladite metalloprotease ou pour ledit fragment ; pour l'obtention d'un médicament destiné à l'immunothérapie anti-tumorale, et plus particulièrement au traitement de mélanomes exprimant MMP-2. Des fragments de MMP-2 utilisables conformément à la présente invention englobent notamment tout peptide immunogene constitué par 8 à 11 acides aminés consécutifs de ladite metalloprotease, et constituant un épitope T présenté par le CMH I. Ces peptides immunogènes, ainsi que les polynucléotides codant pour ces peptides, font également partie de l'objet de la présente invention. Dans le cadre de l'exposé de la présente invention, on entend par « épitope T présenté par le CMH I » un peptide capable d' induire une réponse CTL spécifique contre l'antigène dont il est issu. A titre d' exemple non limitatif de réalisation de la présente invention, les Inventeurs ont identifié un peptide présenté par HLA-A*0201, de séquence (code 1 lettre) GLPPDVQRV (SEQ ID NO : 1) . Ce peptide est capable d' induire une réponse CTL spécifique vis-à-vis de cellules de mélanomes HLA- A*0201 exprimant MMP-2, et est donc notamment utilisable pour l'obtention de médicaments destinés au traitement de patients HLA-A*0201. D'autres epitopes T conformes à l'invention peuvent être obtenus de diverses manières à partir de l'antigène MMP-2. Par exemple, il est connu que des peptides susceptibles de former un complexe avec un allèle du CMH I donné ont en commun la présence, à certaines positions, de résidus d'acides aminés particuliers, dénommés « résidus d'ancrage ». On a ainsi défini pour les différents allèles du CMH I, des motifs d'ancrage spécifiques, impliquant des acides aminés dénommés « résidus d'ancrage primaires ». Il a aussi été montré que des résidus situés en dehors des motifs d'ancrage primaires (résidus d'ancrage secondaires) pouvaient exercer un effet favorable ou défavorable sur l'affinité du peptide pour le CMH. Le choix des séquences peptidiques susceptibles de constituer des epitopes présentés par un allèle du CMH I donné, peut s'effectuer, de manière classique, par l'analyse de la séquence peptidique de l'antigène MMP-2, afin de sélectionner les peptides possédant tout ou partie du motif d'ancrage primaire correspondant à cet allèle. Différentes bases de données répertoriant les motifs d'ancrage connus sont disponibles : à titre d'exemples, on citera la base SYFPEITHI (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/; RAMMENSEE et al., Immunogenetics, 50, 213-219, 1999), ou la base BIMAS (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind ; Parker et al., J. I munol. 152, 163, 1994;. La présente invention a également pour objet des compositions comprenant au moins un peptide immunogene conforme à l'invention ou un polynucleotide codant pour ledit peptide. Il peut s'agir en particulier de compositions multiépitopiques, capables de générer une réponse CTL polyspécifique, et qui dans ce but comprennent également un ou plusieurs autre (s) épitope (s) immunogene (s) . Ces autres epitopes peuvent être issus de MMP-2, ou d'un ou plusieurs autres antigènes. Des compositions multiépitopiques conformes à l'invention peuvent comprendre, pour être largement utilisables sur une population dont les individus portent des allèles HLA différents, des epitopes présentés par différentes molécules du CMH I. Elles peuvent également comprendre en outre au moins un épitope présenté par une molécule du CMH II, et capable, d'induire une réponse T auxiliaire. Selon un mode de réalisation préféré d'une composition conforme à l'invention, elle comprend au moins un polypeptide chimérique comprenant une ou plusieurs copies d'un peptide immunogene conforme à l'invention. Dans le cas d'une composition multiépitopique, ledit polypeptide chimérique comprend en outre une ou plusieurs copies d'au moins un autre épitope immunogene. On peut par exemple injecter au patient à traiter un peptide immunogene, ou une composition conformes à l'invention tels que définis ci-dessus, éventuellement associés à un adjuvant approprié. De même, des polynucléotides conformes à l'invention, de préférence intégrés dans des vecteurs d'acide nucléique, notamment des vecteurs viraux tels que des adénovirus, peuvent également être directement administrés par injection au patient à traiter. La présente invention englobe également des cellules présentatrices de l'antigène présentant un épitope T issu de MMP-2 conforme à l'invention. Des cellules présentatrices de l'antigène conformes à 1 ' invention peuvent être obtenues à partir de toutes les cellules capables de présenter un antigène via le CMH I. Notamment, elles peuvent être obtenues à partir de cellules présentatrices de l'antigène professionnelles, par exemple des cellules dendritiques . Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, lesdites cellules présentatrices de l'antigène sont chargées in vi tro à l'aide d'un peptide immunogene selon l'invention, comme décrit par exemple par BAKKER et al . (Cancer Res . , 55, 5330-5334, 1995) ou VAN ELSAS et al . (Eur. J. Immunol., 26, 1683-1689, 1996). Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, lesdites cellules présentatrices de l'antigène sont transfectées in vitro par un polynucleotide comprenant une séquence codant pour un peptide immunogene conforme à l'invention, par exemple un polynucleotide codant pour la protéine MMP-2 ou pour un fragment de celle-ci. Les cellules présentatrices de l'antigène conformes à l'invention peuvent ensuite être injectées au patient à traiter, comme décrit par exemple par KAPLAN et al . (J. Immunol., 163(2), 699-707, 1999) ou KIM et a-Z. (Annals of Surgical Oncology, 5(1), 64-76, 1998). La présente invention englobe aussi l'utilisation de la protéine MMP-2, ou d'un fragment de celle-ci, et notamment d'un peptide immunogene selon l'invention, pour la détection de CTLs dirigés contre MMP- 2 dans un prélèvement biologique obtenu à partir d'un sujet atteint de mélano e. Ces peptides peuvent également être utilisés pour réaliser le tri spécifique de ces CTLs. Les CTLs ainsi isolés peuvent ensuite être amplifiés in vitro et réinjectés en grand nombre (de l'ordre du milliard) au patient. La présente invention a ainsi pour objet un procédé de préparation de CTLs dirigés contre MMP-2, caractérisé en ce qu'il comprend la sélection, à partir de CTLs prélevés sur un patient atteint de mélanome, de ceux reconnaissant la protéine MMP-2, ou un fragment de celle- ci, et notamment un peptide conforme à l'invention, et la multiplication in vi tro des lymphocytes T ainsi sélectionnés. La présente invention a également pour objet une préparation de CTLs dirigés contre la protéine MMP-2, et en particulier une préparation de CTLs susceptibles d'être obtenue par le procédé défini ci-dessus. La présente invention englobe également les médicaments comprenant un principe actif choisi parmi : un peptide immunogene conforme à l'invention ; - une composition multiépitopique conforme à l'invention ; - un polynucleotide conforme à l'invention ; une cellule présentatrice de l'antigène conforme à 1 ' invention ; une préparation de CTLs conforme à l'invention. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'induction d'une réponse cytotoxique antitumorale par un peptide conforme à l'invention issu de l'antigène MMP-2.
EXEMPLE 1 : CARACTERISATION D'UN CLONE CTL (CLONE M134.12) RECONNAISSANT DES LIGNEES DE MELANOME HLA-A2. Des clones CTL ont été obtenus en stimulant par des cellules tumorales autologues (selon le protocole décrit par PANDOLFINO et al . , 1992, Eur . J. Immunol . ,
22(7), 1795-802) des lymphocytes infiltrant les tumeurs (TIL) d'un patient (HLA A*0201, B*0801, Cw*0701) atteint de mélanome. Ces clones CTL sont capables de lyser spécifiquement les cellules tumorales autologues, et de sécréter du TNFα et de l' IFNγ en réponse à la stimulation par ces cellules L'un de ces clones (CTL M134.12) a été retenu pour la suite des expérimentations. Le clone CTL M134.12 a été co-cultivé en présence de la lignée autologue M134, et de différentes lignées allogéniques (M17, M113, M147, M153, M204, FM25, FM29, IPC 277/5, M25, M44, M88, M102, M117, M171, M199, M200) issues de mélanomes de différents patients HLA A*0201. Après 6 heures de culture, les surnageants ont été prélevés et leur concentration en TNFα a été déterminée par mesure de la cytotoxicité de ces surnageants de culture pour le clone 13 de WEHI 164, comme décrit par DE PLAEN et al. (Methods, 12, 125-42, 1997) . Les résultats sont illustrés dans la Figure 1. En ordonnée, la concentration de TNFα en pg/ml . En abscisse, les différentes lignées testées. Le clone CTL M134.12. reconnaît, outre la lignée M134, neuf lignées cellulaires allogéniques de mélanome exprimant HLA A*0201. Ceci indique que ce clone CTL reconnaît un antigène commun à ces lignées et présenté par l' allèle HLA A*0201.
EXEMPLE 2 : IDENTIFICATION DE L'ANTIGENE RECONNU PAR LE CLONE CTL M134.12. Pour identifier l'antigène reconnu par le clone CTL M134.12, une banque d'ADNc a été construite à partir des ARNm de la lignée cellulaire tumorale M134. Construction de la banque d'ADNc Les ARNm Poly- (A) + ont été extraits à partir des cellules M134 en utilisant le kit Fast Track 2.0 (Invitrogen Corp., Oxon, UK) . La synthèse d'ADNc à partir des ARNm purifiés a été effectuée à l'aide d'un kit (Stratagene Inc., La Jolla, CA) . Les ADNc néo-synthétisés ont été ligaturés à des adaptateurs Eco RI, puis digérés par Xho I et enfin insérés au niveau des sites Eco RI et Xho I du vecteur d'expression eucaryote pcDNA3.1 (Invitrogen Corp.). Les plasmides recombinants obtenus ont été électroporés dans la souche E. coli XLl (Stratagene Inc., La Jolla, CA) . Après électroporation, près de 60.000 clones résistants à l' ampicilline ont été isolés. Pour permettre le criblage de ces clones, 574 groupes (chacun de 100 clones bactériens résistants à l' ampicilline) ont été créés. L'ADN plasmidique de chacun des groupes a été extrait par lyse alcaline à l'aide du kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen S .A. , Courtaboeuf, France) . Cet ADN plasmidique a ensuite été co- transfecté, dans des cellules COS-7, avec un vecteur HLA A*0201 (pHLA A*0201, obtenu auprès de T. Boon, LICR, Bruxelles, Belgique) .
Transfection des cellules COS-7 Les cellules COS-7, cultivées dans du milieu
DMEM (Sigma) contenant 1 g de glucose/litre et 10% de sérum de veau foetal, des antibiotiques et de la L- glutamine, ont été transfectées par le vecteur pHLA- A*0201, seul ou en association avec l'ADN plasmidique issu de l'un des groupes de la banque d'ADNc de M134. La transfection a été effectuée selon le protocole à la DEAE- dextran-chloroquine (BRICHARD, Exp. Med. 1993, 1(78): 489- 495). 2.104 cellules COS-7 ont été transfectées avec 100 ng de plasmide pHLA-A*0201 et, pour la co-transfection, 100 ng d'ADN plasmidique de la banque de M134. 48h après transfection, ces cellules COS-7 ont été utilisées pour stimuler le clone CTL M134.12 T. Après 6 heures de co- culture, les surnageants de culture ont été prélevés et leur concentration en TNF a été déterminée par la mesure de leur cytotoxicite pour le clone 13 de WEHI 164, comme décrit ci-dessus. Parmi les groupes testés, un groupe positif (270) a été identifié. 96 plasmides distincts de ce groupe ont été testés individuellement pour leur capacité à induire la sécrétion de TNFα par le clone CTL M134.12. L'un de ces plasmides, dénommé pNA134-A, induisant une sécrétion de TNFα comparable à celle obtenue en présence de la lignée cellulaire M134 a été sélectionné. La Figure 2 compare la sécrétion de TNFα par le clone CTL M134.12, en l'absence de cellules stimulatrices, en présences de cellules M134, en présence de cellules COS-7 non-transfectées, en présence de cellules COS-7 transfectées par le plasmide pHLA-A*0201 seul, et en présence de cellules COS-7 co-transfectées par les plasmides pHLA-A*0201 et pNA134-A.
Le séquencage de pNA134-A montre qu'il contient un ADNc de l,3kb dont la séquence correspond à l'extrémité 3' de la séquence codant pour la metalloprotease MMP-2 (numéro d'accession : NM_004530) . La protéine MMP-2 est donc l'antigène reconnu par le clone CTL M134.12. L' insert du plasmide pNA134-A code pour les acides aminés 501-661 de MMP-2. Afin de mieux préciser la région de MMP-2 reconnue par le clone CTL M134.12 des plasmides contenant des variants tronqués de l' insert d'ADNc de NA134-A (fragment 20 codant pour les acides aminés 501-661 de MMP-
2, et fragment 25 codant pour les acides aminés 501-556 de
MMP-2) ont été construits. Un plasmide comprenant la totalité de l'ADNc de
MMP-2 a également été construit. Chacun de ces plasmides a été co-transfecté avec pHLA A*0201 dans des cellules COS-7, qui ont ensuite été testées pour leur capacité à induire la sécrétion de TNFα par le clone CTL M134.12. Les constructions testées sont schématisées sur la Figure 3 qui indique également leur capacité à induire ou non la sécrétion de TNFα par le clone CTL M134.12. Ces résultats montrent que l' épitope T reconnu par le clone CTL M134.12 se situe entre les acides aminés 556 et 593 de MMP-2. Une série de peptides (séquences GLPPDVQRV (SEQ ID NO : 1), LGLPPDVQRV (SEQ ID NO : 2), LPPDVQRV (SEQ ID NO : 3) et GLPPDVQR (SEQ ID NO : 4)) dérivés de la région 556-593 de la protéine MMP-2 ont été synthétisés (Synt:em Nîmes, France). Ces peptides ont été utilisés pour sensibiliser des cellules T2 marquées au 51Cr. Ces cellules ont été incubées 60 minutes à 37 °C avec différentes concentrations de chacun des peptides à tester. Des cellules effectrices CTL M134.12 ont ensuite été rajoutées dans un rapport cellules effectrices/cellules cibles de 10/1. La quantité de 51Cr relarguée dans le surnageant est mesurée 4 heures plus tard. Les résultats sont illustrés par la Figure 4. En ordonnée, le pourcentage de lyse spécifique. En abscisse, la concentration de peptide LGLPPDVQRV (•) , GLPPDVQRV { M ) , LPPDVQRV (À), ou GLPPDVQR (X) en nM. Ces résultats montrent que le peptide GLPPDVQRV est le plus efficace pour sensibiliser les cellules T2 à la lyse par le clone CTL M134.12.
EXEMPLE 3 : EXPRESSION DE MMP-2 DANS DIFFERENTS TYPES CELLULAIRES, ET RECONNAISSANCE SPECIFIQUE DE CELLULES DE MELANOME PAR LES CTLS M134.12 Il est connu que MMP-2 est exprimé de façon constitutive par des tissus comme l'endomètre, le foie ou l'aorte (KHASIGOV, Biochemistry, 2001), et par un nombre important de types cellulaires tels que les macrophages, les trophoblastes (YAMAMOTO, Cancer. Res., 1996), les lymphocytes T activés par l'IL-2 (LEPPERT, JI,1995 Esparza J. , BLOOD," 1999), les fibroblastes, les kératinocytes, les chondrocytes, les cellules endothéliales, les monocytes, ou les ostéoblastes (BIRKEDAL-HANSEN, Crit . Rev. Oral. Biol . Med. , 1993). La capacité du clone CTL M134.12 à reconnaître des cellules (tumorales ou saines) de différents types, exprimant MMP-2 (expression vérifiée par RT-PCR et immunohistochimie) et HLA-A2 a été testée, par mesure de la sécrétion de TNFα par le clone CTL M134.12 en réponse à la stimulation par ces cellules. Le protocole utilisé est identique à celui décrit à l'exemple 1 ci-dessus. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau I ci-dessous.
Tableau I
Figure imgf000014_0001
Ces résultats montrent que 10 des lignées cellulaires de mélanome qui expriment MMP-2 sont reconnues par le clone CTL M134.12. En revanche, bien qu'exprimant MMP-2 et HLA-A2, aucune des autres lignées de cellules cancéreuses, et aucune lignée de cellules non-cancéreuses n'est reconnue par le clone CTL M134.12. En conclusion, malgré le profil d' expression ubiquitaire de la protéine MMP-2, seules les cellules de mélanome paraissent avoir la capacité de présenter efficacement un épitope de cette protéine.

Claims

REVENDICATIONS 1) Utilisation d'une molécule choisie parmi : - la metalloprotease MMP-2 ; un fragment de ladite metalloprotease comprenant un épitope T présenté par le CMH I ; un polynucleotide codant pour ladite metalloprotease ou pour ledit fragment ; pour l'obtention d'un médicament destiné à l'immunothérapie anti-tumorale. 2) Peptide immunogene constituant un épitope T présenté par le CMH I, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment de 8 à 11 acides aminés consécutifs de la metalloprotease MMP-2. 3) Peptide immunogene selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est défini par la séquence
GLPPDVQRV. 4) Polynucleotide codant pour un peptide selon une quelconque des revendications 2 ou 3. 5) Composition comprenant au moins un peptide selon une quelconque des revendications 2 ou 3, ou un polynucleotide selon la revendication 4. 6) Utilisation d'un peptide selon une quelconque des revendications 2 ou 3, ou d'un polynucleotide selon la revendication 4 pour l'obtention d'un médicament. 7) Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné au traitement de mélanomes. 8) Cellule présentatrice de l'antigène isolée exprimant une molécule du CMH I, caractérisée en ce qu'elle est chargée in vi tro par un peptide selon une quelconque des revendications 2 ou 3. 9) Cellule présentatrice de l'antigène exprimant une molécule du CMH I, caractérisée en ce qu'elle est transfectee par un polynucleotide comprenant une séquence codant pour un peptide immunogene selon une quelconque des revendications 2 ou 3. 10) Utilisation de la metalloprotease MMP-2 ou d'un fragment de celle-ci pour la détection de lymphocytes T cytotoxiques dirigés contre MMP-2 dans un prélèvement biologique obtenu à partir d'un sujet atteint de mélanome. 11) Procédé de préparation de lymphocytes T cytotoxiques dirigés contre la metalloprotease MMP-2, caractérisé en ce qu'il comprend la sélection, à partir de lymphocytes T cytotoxiques prélevés sur un patient atteint de mélanome, de ceux reconnaissant MMP-2 ou un fragment de celle-ci, et la multiplication in vi tro des lymphocytes T ainsi sélectionnés. 12) Préparation de lymphocytes T cytotoxiques dirigés contre la metalloprotease MMP-2, laquelle préparation est susceptible d'être obtenue par le procédé selon la revendication 11. 13) Médicament, comprenant un principe actif choisi parmi : - un peptide immunogene selon une quelconque des revendications 2 ou 3 ; - un polynucleotide selon la revendication 4 ; une cellule présentatrice de l'antigène selon une quelconque des revendications 8 ou 9 ; une préparation de lymphocytes T cytotoxiques selon la revendication 12.
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