WO2004111019A2 - Groupement protecteur clivable par les albumines seriques - Google Patents

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WO2004111019A2
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Charles Tellier
Jacques Lebreton
Thierry Dintinger
Valérie FARGEAS
Sylvain Robin
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Nantes Université
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Nantes
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D261/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-oxazole or hydrogenated 1,2-oxazole rings
    • C07D261/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-oxazole or hydrogenated 1,2-oxazole rings not condensed with other rings
    • C07D261/06—Heterocyclic compounds containing 1,2-oxazole or hydrogenated 1,2-oxazole rings not condensed with other rings having two or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D261/08—Heterocyclic compounds containing 1,2-oxazole or hydrogenated 1,2-oxazole rings not condensed with other rings having two or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
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    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a protective group, in particular of bioactive or chromogenic compounds, cleavable by serum albumin.
  • bioactive compounds such as drugs or hormones
  • prodrugs or prohormones are based on the blocking of a function essential to the biological activity of these compounds and their activation , by enzymatic cleavage of the protective group in vivo.
  • bioactive compounds makes it possible to:
  • Two types of approach are used to release the compounds at a particular site of action.
  • the enzymatic cleavage is carried out by an enzyme naturally and specifically present at the targeted site of action.
  • an enzyme naturally and specifically present at the targeted site of action.
  • anti-tumor drugs modified as prodrugs by the addition of a glucuronide group (Florent et al., J. Med. Chem. (1998) 41: 3572-3581; Leu et al., J. Med Chem. (1999) 42: 3623-3628).
  • a ⁇ -glucuronidase present in greater quantity in tumors, releases the active drug directly from cancer cells.
  • the enzymatic cleavage is carried out by an enzymatic activity carried by an antibody specifically targeting the desired actioris sites (Syrigos and Epenetos, Anticancer Res. (1999) 19: 605-614).
  • an antibody specifically targeting the desired actioris sites
  • this activation process seems delicate to implement, if only for reasons of the immunogenicity of the antibody injected.
  • One of the aims of the invention is therefore to provide a simple system for protecting bioactive compounds, such as drugs or hormones, or chromogenic compounds, by adding a protective group, in particular to form prodrugs or prohormones, the protective group being cleavable in vivo in the plasma compartment, in particular thanks to the action of serum albumin, its cleavage allowing the activation of the compounds to which it was linked, and in particular the conversion of prodrugs or prohormones , respectively in drugs and hormones.
  • a protective group in particular to form prodrugs or prohormones
  • the protective group being cleavable in vivo in the plasma compartment, in particular thanks to the action of serum albumin, its cleavage allowing the activation of the compounds to which it was linked, and in particular the conversion of prodrugs or prohormones , respectively in drugs and hormones.
  • One of the aims of the invention is also to provide a protective group capable of binding to bioactive compounds or to chromogenic compounds and of being cleaved from the compounds to which it is linked, by the catalytic action of serum albumin, in vivo or in vitro.
  • Another object of the invention is to provide bioactive compounds protected by the protective group of the invention, and in particular prodrugs or prohormones, as well as chromogenic groups linked to the protective group of the invention.
  • one of the aims of the invention is to provide a process for the synthesis of the protective group of the invention as well as of the compounds resulting from the binding of this protective group to bioactive or chromogenic compounds.
  • the present invention follows from the discovery by the Inventors that serum albumin catalyzes the cleavage of a protective group derived from isoxazole.
  • alkyl group comprising from 1 to 10 carbon atoms, said alkyl group possibly being substituted by oxygenated, sulfur, nitrogenous or halogen groups,
  • X is a group containing a heteroatom, such as -OH, -SH, -NH 2 when a is 0, or -O-, -S-, -NH- when a is 1,
  • A is a group of the following formula: Y
  • alkyl group comprising from 1 to 10 carbon atoms, said alkyl group possibly being substituted by oxygenated, sulfur, nitrogenous or halogen groups,
  • n is an integer from 1 to 10;
  • Z is a group of the following formula:
  • a more particular subject of the invention is the use of the abovementioned compounds as a cleavable protective group in the context of the protection of bioactive or chromogenic compounds, and in particular in the context of the preparation of prodrugs or prohormones respectively from drugs pu of hormones.
  • the above protective group is cleaved following the action of serum albumin, in vitro or in vivo, in particular in a human or animal organism.
  • protecting group denotes a chemical group capable of covalently bonding to a function having a chemical reactivity and / or a biological role and thus masking its chemical reactivity and / or its biological role.
  • bioactive compound denotes a compound capable of causing an effect in a living being to which it has been administered. This compound can for example be a drug or a protein.
  • chromogenic compound denotes a compound exhibiting absorption and / or emission properties of light in the ultraviolet, visible or infrared range.
  • prohormone denotes a substantially inactive form of a hormone, which can generate an active form of said hormone, following chemical or enzymatic treatment in vitro or in vivo.
  • prodrug denotes a substantially inactive form of a drug, which can generate an active form of said drug, following chemical or enzymatic treatment in vitro or in vivo.
  • serum albumin or “serum albumin” denotes a protein of the class. albumin predominantly present in blood plasma and whose molecular weight is approximately 66.5 kD.
  • the choice of A and B makes it possible to modulate the solubility of the compound (I). From a compound of formula (I) it is possible to increase the solubility of said compound by shortening the alkyl group of A and / or B, and / or by increasing the number of oxygen-containing, sulfur-containing, nitrogen-containing or halogens of said alkyl group of A and / or B. Conversely, it is possible to reduce the solubility of compound (I) by increasing the size of the alkyl group of A and / or B, and / or by decreasing the number of oxygen-substituted substituents, sulfur, nitrogen or halogen from said alkyl group of A and / or B.
  • a and B also makes it possible to modulate the rate of release of the bioactive or chromogenic compound. From a compound of formula (I) given, it is possible to decrease the rate of release of the bioactive or chromogenic compound by increasing the size of the alkyl group of A and / or B, and / or. increasing the number of oxygen, sulfur, nitrogen or halogen substituents of said group 1 alkyl of A and / or B. On the other hand, it is possible to increase the rate of release of the bioactive or chromogenic compound by reducing the size of the alkyl group of A and / or B, and / or by reducing the number of oxygen, sulfur, nitrogen or halogen substituents of said alkyl group of A and or B.
  • n of the compound of formula (I) makes it possible to modulate the accessibility of said compound to serum albumin as a function of the size of the protected bioactive or chromogenic compounds.
  • the larger the size of the bioactive or chromogenic compounds the larger the value of n can be chosen.
  • the nature of the group X makes it possible to vary the functions of the bioactive and chromogenic compounds which can be protected by the compounds of formula (I) such as in particular -OH, -NH 2 or -SH 2 .
  • the group Z is a cleavable spacer group capable of binding to the bioactive or chromogenic compounds, in particular on - H 2 functions, after activation of the group:
  • the group Z cleaves spontaneously following the action of the albumin sera; moreover, it strengthens the affinity of the protective group isoxazole for the active site of serum albumin.
  • the invention relates in particular to the aforementioned use of the compounds of general formula (TJ) below:
  • the invention relates more particularly to the aforementioned use of the compounds of formulas ITJ, LTI-a and ILT-b below:
  • the invention relates to the use of the compounds of formulas I, II, LU, LU-a or m-b. for the preparation of compounds corresponding to one of the following formulas:
  • R is a bioactive or chromogenic group and Z corresponds to the following formula:
  • the invention is in particular characterized in that the group R is a bioactive group, in particular chosen from a drug such as:
  • an anticancer agent such as daunorubicin
  • a chelating agent such as deferiprone, or a hormone, in particular peptide or steroid, such as insulin or estradiol.
  • the drugs or hormones chosen are in particular active in the blood, plasma or lymph, they target in particular the extracellular surface of the cytoplasmic membrane of the cells of the organism.
  • chelating group denotes a chemical group capable of forming a stable coordination complex with a metal ion and thus of concealing the properties of said metal ion.
  • the present invention is particularly characterized in that the chromogenic group is paranitrophenol or a fluorescent group such as umbelliferone.
  • a fluorescent group such as umbelliferone.
  • Other groups such as phenol, Torthonitrophenol, or Torthofluorophenol can also be used.
  • fluorescent group denotes a chemical group capable of emitting photons following an electronic absorption phenomenon.
  • Umbelliferone corresponds in particular to 4-methylumbelliferone, of the following formula:
  • a subject of the invention is also the compounds of general formula (I) below
  • alkyl group comprising from 1 to 10 carbon atoms, said alkyl group possibly being substituted by oxygenated, sulfur, nitrogenous or halogen groups,
  • X is a group containing a heteroatom, such as -OH, -SH, -NH 2 when a is 0, or -O-, -S-, -NH- when a is 1,
  • A is a group of the following formula:
  • alkyl group comprising from 1 to 10 carbon atoms, said alkyl group possibly being substituted by oxygenated, sulfur, nitrogenous or halogen groups,
  • n is an integer from 1 to 10
  • Z is a group of the following formula:
  • the invention relates in particular to the compounds of general formula (II) below
  • the invention also relates to the compounds of general formula (F) below:
  • alkyl group comprising from 1 to 10 carbon atoms, said alkyl group possibly being substituted by oxygenated, sulfur, nitrogenous or halogen groups,
  • X is a group containing a heteroatom, such as -O-, -S-, or -NH-,
  • A is a group of the following formula:
  • alkyl group comprising from 1 to 10 carbon atoms, said alkyl group possibly being substituted by oxygenated, sulfur, nitrogenous or halogen groups,
  • n is an integer from 1 to 10;
  • Z is a group of the following formula:
  • a subject of the invention is also the compounds of general formula (IV) below:
  • alkyl group comprising from 1 to 10 carbon atoms, said alkyl group possibly being substituted by oxygenated, sulfur, nitrogenous or halogen groups,
  • X is a group containing a heteroatom, such as -O-, -S-, -NH-,
  • A is a group of the following formula:
  • alkyl group comprising from 1 to 10 carbon atoms, said alkyl group possibly being substituted by oxygenated, sulfur-containing, nitrogenous or halogen groups,
  • n is an integer from 1 to 10;
  • Z is a group of the following formula:
  • R is a bioactive or chromogenic group.
  • the invention relates in particular to the compounds of general formulas (V) and (V) below:
  • the invention relates more particularly to the compounds of formulas (VI) and (NT) below:
  • the present invention relates in particular to a compound of formula IN, N, N ', NI or VI', in which R is a bioactive group chosen from a drug such as:
  • an anticancer agent such as daunorabicin
  • a chelating agent such as deferiprone, or a hormone, in particular peptide or steroid, such as insulin or estradiol.
  • the invention also relates to the use of a above compound, as a prodrug or prohormone.
  • the invention also relates to a compound of formula IN, N, V, NI or NI ', in which the chromogenic group is paranitrophenol or a fluorescent group such as umbelliferone.
  • the invention relates to a compound of formula (NIII) below:
  • a subject of the invention is also a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutically acceptable vehicle such as for example calcium carbonate, calcium phosphate, sugars, such as lactose, or starch or cellulose derivatives, gelatin, vegetable oil, polyethylene glycol, or any other vehicle conventionally used by those skilled in the art.
  • the invention relates in particular to a pharmaceutical composition as defined above, characterized in that it is presented in a form suitable for administration by the oral route or by injection.
  • the invention relates to the use of a compound of formula IN, N, V, NI or NI ', the chromogenic group being in particular paranitrophenol or a fluorescent group such as umbelliferone, and in particular of the compound of formula NU, for the determination of serum albumin in biological samples such as blood, plasma, serum or urine.
  • the invention relates to a method for assaying serum albumin in biological samples, comprising the following steps:
  • standard range denotes a series of solutions the concentration of albumin serum of which is known, the concentration of albumin serum of said solutions being advantageously between approximately 0.05 g / L and 0.6 g / L.
  • Biological samples include blood, plasma, serum or urine.
  • the above assay process is carried out at pH 10.
  • the compound of formula NII is replaced by a compound of formula NI in which the chromogenic group is a fluorescent group such as umbelliferone.
  • the method for assaying serum albumin can be automated.
  • the invention relates to a process for synthesizing the compound of the following formula
  • the invention also relates to a process for synthesizing the compound of the following formula:
  • the invention also relates to a process for the synthesis of the compound of formula II or of the compound of formula V, comprising the following steps:
  • the invention also relates to a process for the synthesis of the compound of formula m, laid of formula NI, or of the compound of formula NII, comprising the following steps:
  • FIG. 1 represents the decomposition of 4- (p-nitrophenoxy) methyl-isoxazole by human and bovine serum albumin in vitro as a function of time.
  • the abscissa axis corresponds to time, expressed in minutes, the ordinate axis corresponds to the optical density (OD) at 405 nm.
  • the kinetics were carried out in a 100 mM Tris-HCl buffer, pH 9 with a concentration of 4- (p-nitrophenoxy) methyl-isoxazole of 250 ⁇ M, the release of p-nitrophenol being followed by spectrophotometry at 405 nm.
  • the curve corresponding to the black triangles represents the decomposition obtained in the presence of human serum albumin (S AH) at the concentration of 10 ⁇ M
  • the curve corresponding to the black squares represents the decomposition obtained in the presence of bovine serum albumin (BSA) at the concentration of 10 ⁇ M
  • the curve corresponding to the white circles represents the control decomposition obtained in the presence of buffer only.
  • FIG. 2 represents the measurement of the catalytic efficiency (k cat / K m ) as a function of the pH for SAH and SAB with respect to the decomposition of 4- (p-nitrophenoxy) methyl-isoxazole.
  • the abscissa axis represents the pH
  • the ordinate axis represents the value of the ratio
  • FIG. 3 represents the inhibition of the catalytic activity of SAB and SAH by the nonanoate.
  • the x-axis represents the nonanoate concentration (in ⁇ M)
  • Y-axis tax represents the residual catalytic activity of SAB and SAH (as a percentage of maximum catalytic activity).
  • the curve represented by the white squares corresponds to the SAH
  • the curve represented by the black circles corresponds to the SAB.
  • FIG. 4 represents the inhibition of the catalytic activity of SAB by pyridoxal phosphate (PLP).
  • the abscissa axis represents the PLP concentration (in mM), Y-axis tax represents the residual catalytic activity of the SAB (as a percentage of the maximum catalytic activity).
  • Figure 5 represents the inhibition of the catalytic activity of SAB by pyridoxal phosphate (PLP).
  • the abscissa axis represents the PLP concentration (in mM)
  • Y-axis tax represents the residual catalytic activity of the SAB (as a percentage of the maximum catalytic activity).
  • FIG. 5 represents the inhibition of the decomposition activity of 4- (p-nitrophenoxy) methyl-isoxazole in human serum by the nonanoate.
  • the abscissa axis represents time in minutes
  • the ordinate axis represents the OD at 405 nm.
  • the curve represented by black squares corresponds to the kinetics of decomposition of 4- (p-nitrophenoxy) methyl-isoxazole by human serum
  • the curve represented by white circles corresponds to the kinetics of decomposition of 4- (p-mtrophenoxy) methyl-isoxazole with human serum in the presence of nonanoate (6 mM).
  • reaction b phosphoric anhydride (26.5 g, 0.19 mol, 1.2 eq.), quinoline (20 g, 0.155 mol, 1 eq.) are then successively introduced into a flask, then ethylacetaldehyde (2) (20.47 g, 0.155 mol); after 15 min.
  • reaction d 132 mmol (31 g) of diethylacetaldehyde (4) were treated with 159 mmol (11.05 g, 1.18 eq.) of hydroxylamine in 80 ml of water in the presence of 3 or 4 drops of H 2 SO 4 concentrated, for 8 hours at reflux; the mixture was then cooled and a saturated aqueous solution of cadmium chloride was added; the mixture was filtered on B ⁇ chner and the precipitate collected was dissolved in 15 ml of water; after distillation of the water-4-methyl-isoxazole solution (5), the distillate was extracted three times with diethyl ether and the organic phase was dried over calcium chloride; distillation of the reaction crude made it possible to obtain 4-methyl-isoxazole (5) in the form of a colorless oil with a yield.
  • reaction e to a solution of N-bromosuccinimide (2.41 mmol, 0.352 g, 1 eq.) and 4-methyl-isoxazole (5) (2.41 mmol, 0.200 g) in 2.1 ml of tetrachloride carbon under nitrogen was added razodiisobutyronitrile (AIBN) (0.24 mmol, 4.7 mg, 0.1 eq.); the mixture was heated at reflux for 8-10 hours then cooled to 0 ° C and filtered.
  • AIBN razodiisobutyronitrile
  • reaction f a solution of 4-bromomethyl-isoxazole (6) (10.1 mmol, 1 g) in 10 ml of water was left at reflux for 16 h. After cooling to room temperature, the reaction mixture was extracted 3 times with diethyl ether then the organic phase was decanted, dried over MgSO 4 and concentrated under reduced pressure; 4-hydroxymethyl-isoxazole (7) was thus obtained in the form of a colorless oil with a yield of 32% (0.2 g).
  • reaction g this reaction is a Mitsunobu reaction; to a solution of 4-hydroxymethyl-isoxazole (7) (2 mmol; 0.2 g), triphenylphosphine (4 mmol, 1 g, 2 eq.) and p-nitrophenol (8) (4 mmol, 0.56 g, 2 eq.) in 2 mL of anhydrous tetrahydrofuran at 0 ° C was added diethylazodicarboxylate (4 mmol, 0.636 mL, 2 eq.); after 30 minutes of reaction at 0 ° C, the reaction medium was set 5 hours at room temperature and was then concentrated under reduced pressure; after extraction (3 times) with diethyl ether then filtration over B ⁇ chner, the organic phase was washed with water, dried over MgSO 4 and concentrated under reduced pressure; purification of the reaction crude by flash chromatography on a silica column a allowed to obtain the desired product (308 mg) with a yield of 70% ”.
  • reaction f the reaction can be carried out (i) in the presence of sodium azide in N, N-dimethylformamide at room temperature for 12 hours followed by treatment of the azide formed with triphenylphosphine in a water / tetrahydrofuran mixture in proportion 1/9 at room temperature for 20 hours or (ii) with sodium hydrogen sulfide at room temperature for 12 hours, in order to respectively form 4-aminomethyl-isoxazole (10) and 4-thiomethyl-isoxazole ( 11).
  • the product (7) can be replaced by another compound comprising a hydroxyl function, such as phenol, Torthonitrophenol, orthoflurophenol, or more particularly estradiol (12), deferiprone (13), 4-hydroxymethylphenol (14) to form the products (15), (16), and (17) respectively.
  • a hydroxyl function such as phenol, Torthonitrophenol, orthoflurophenol, or more particularly estradiol (12), deferiprone (13), 4-hydroxymethylphenol (14) to form the products (15), (16), and (17) respectively.
  • Insulin can also be modified according to the reaction g through the hydroxyl groups carried by its 4 tyrosines.
  • a solution of compound (17) and 4-nitrophenylchlorofomate is heated at 60 ° C for 1 hour in the presence of 1,4-dioxane to form the compound (17 '); then a solution of compound (18) or of compound (20) (1 eq.) and of compound (17 ') (1 eq.) are stirred for 15 min at room temperature in N, N'-dimethyl-formamide in presence of triethylamine (1.5 eq.).
  • the solution is then diluted with water and the product obtained (19) or (21) is extracted with ether.
  • steps f and g can be replaced by the following protocol; to a solution of ROH (1 eq) and silver oxide Ag 2 O (2 eq.) in acetonitrile (2.5 mL), a solution of 4-bromomethyl-isoxazole is added dropwise in l '' acetonitrile (2.5 mL). The mixture is stirred for 24 hours at room temperature. The solution is then filtered, evaporated and the residue taken up in CH 2 C1 2 .
  • ROH hydroxyl group described above
  • albumin serum catalyzed the release of -nitrophenol from 4- (p-nitrophenoxy) methyl-isoxazole.
  • 4- (p-nitrophenoxy) methyl-isoxazole 250 ⁇ M was placed in the presence of human serum albumin (SAH, 10 ⁇ M) or bovine (SAB, 10 ⁇ M) at 25 ° C., and the release of p-nitrophenol was followed over time by reading the optical density (OD) at 405 nm (see Figure 1).
  • the catalytic efficiency (k cat / K m ratio) of SAH (15 ⁇ M) and SAB (15 ⁇ M) with respect to the substrate 4- (p-nitrophenoxy) methyl-isoxazole was determined, according to methods well known to those skilled in the art, at a low substrate concentration (100, 150 and 200 ⁇ M), by following the release of j? -nitrophenol by spectrophotometry at 405 nm, as a function of pH, using buffers following: phosphate (pH 7-8 and 11-11.5), bicine (pH 8-9), and carbonate (pH 9-11), used at a concentration of 30 mM in the presence of NaCl (150 mM). The results obtained are presented in Figure 2.
  • PLP is a covalent inhibitor which makes it possible to identify the intervention of lysine residues in catalysis (Hollfelder et al, J. Am. Chem. Soc. (2000) 122: 1022-1029). Indeed, the aldehyde function of pyridoxal phosphate reacts with the side chain of a lysine residue to form a covalent complex.

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation des composés de la formule générale (I) en tant que groupement protecteur, notamment de composés bioactifs ou chromogènes, clivable par les albumines sériques.

Description

GROUPEMENT PROTECTEUR CLIVABLE PAR LES ALBUMINES SERIQUES
La présente invention concerne un groupement protecteur, notamment de composés bioactifs ou chromogènes, clivable par les albumines sériques.
Dans ses développements les plus récents, la protection de composés bioactifs, tels que les drogues ou les hormones, pour donner des prodrogues ou des prohormones, est basée sur le blocage d'une fonction indispensable à l'activité biologique de ces composés et leur activation, par clivage enzymatique du groupement protecteur in vivo.
La protection de composés bioactifs permet de :
(i) modifier la pharmacocinétique de ces composés,
(ii) modifier les propriétés de solubilité et de franchissement des barrières biologiques des composés en question,
(iii) libérer les composés uniquement au niveau du site d'action ciblé.
Deux types d'approches sont utilisés afin de libérer les composés au niveau d'un site d'action particulier.
Dans un premier cas, le clivage enzymatique est réalisé par une enzyme naturellement et spécifiquement présente au site d'action ciblé. C'est le cas notamment des drogues antitumorales modifiées en prodrogue par l'ajout d'un groupement glucuronide (Florent et al., J. Med. Chem. (1998) 41:3572-3581 ; Leu et al., J. Med. Chem. (1999) 42:3623-3628). Dans ce cas, une β-glucuronidase, présente en plus grande quantité au niveau des tumeurs, libère la drogue active directement auprès des cellules cancéreuses.
Dans un deuxième cas, le clivage enzymatique est réalisé par une activité enzymatique portée par un anticorps ciblant spécifiquement les sites d'actioris souhaités (Syrigos et Epenetos, Anticancer Res. (1999) 19:605-614). Dans une adaptation de ce procédé, il a été suggéré de protéger une hormone, l'insuline, pour former une proinsuline, et de l'activer par injection d'un anticorps catalytique (Worall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001) 98:13514-13518). Ce procédé d'activation semble toutefois délicat à mettre en œuvre, ne serait-ce que pour des raisons d'immunogénicité de l'anticorps injecté.
Jusqu'à présent il n'existe donc pas de système simple permettant d'activer dans le compartiment plasmatique un composé bioactif protégé par des groupements clivables.
Un des buts de l'invention est par conséquent de fournir un système simple de protection de composés bioactifs, tels que des drogues ou des hormones, ou de composés chromogènes, par ajout d'un groupement protecteur, pour former notamment des prodrogues ou des prohormones, le groupement protecteur étant clivable in vivo dans le compartiment plasmatique, en particulier grâce à l'action d'albumines sériques, son clivage permettant l'activation des composés auxquels il était lié, et notamment la conversion des prodrogues ou des prohormones, respectivement en drogues et en hormones.
Un des buts de l'invention est également de fournir un groupement protecteur susceptible de se lier à des composés bioactifs ou à des composés chromo gènes et d'être clivé des composés auxquels il est lié, par l'action catalytique d'albumines sériques, in vivo ou in vitro.
Un autre but de l'invention est de fournir des composés bioactifs protégés par le groupement protecteur de l'invention, et notamment des prodrogues ou des prohormones,, ainsi que des groupements chromogènes liés au groupement protecteur de l'invention.
Enfin, un des buts de l'invention est de fournir un procédé de synthèse du groupement protecteur de l'invention ainsi que des composés résultant de la liaison de ce groupement protecteur à des composés bioactifs ou chromogènes.
La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs que les albumines sériques catalysent le clivage d'un groupement protecteur dérivé de l'isoxazole.
Un des objets de l'invention concerne l'utilisation des composés de formule générale (I) suivante :
Figure imgf000003_0001
dans laquelle :
• W est O ou S ;
• B est
- -H,
" ou un groupe alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, ledit groupe alkyle pouvant être substitué par des groupements oxygénés, soufrés, azotés ou halogènes,
• a vaut 0 ou 1
• X est un groupe contenant un hétéroatome, tel que -OH, -SH, -NH2 lorsque a vaut 0, ou -O-, -S-, -NH- lorsque a vaut 1,
• A est un groupe de formule suivante : Y
^ I l 1
, dans laquelle Y est
-H, ou un groupe alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, ledit groupe alkyle pouvant être substitué par des groupements oxygénés, soufrés, azotés ou halogènes,
Figure imgf000004_0001
, dans laquelle n est un entier de 1 à 10 ; Z est un groupe de formule suivante :
Figure imgf000004_0002
dans laquelle J est - H, - ou un groupe de formule suivante :
Figure imgf000004_0003
en tant que groupement protecteur clivable.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation des composés susmentionnés en tant que groupement protecteur clivable dans le cadre de la protection de composés bioactifs ou chromogènes, et notamment dans le cadre de la préparation de prodrogues ou de prohormones à partir respectivement de drogues pu d'hormones.
Selon un mode de réalisation particulier, le groupement protecteur ci-dessus est clivé suite à l'action d'albumines sériques, in vitro ou in vivo, notamment dans un organisme humain ou animal.
On désigne par « groupement protecteur » un groupement chimique capable de se lier de manière covalente à une fonction ayant une réactivité chimique et/ou un rôle biologique et de masquer ainsi sa réactivité chimique et/ou son rôle biologique.
On désigne par « composé bioactif » un composé susceptible de provoquer un effet chez un être vivant auquel il a été administré. Ce composé peut par exemple être une drogue ou une protéine. On désigne par « composé chromogène » un composé présentant des propriétés d'absorption et/ou d'émission de lumière dans le domaine de l'ultraviolet, du visible ou de l'infrarouge.
On désigne par « prohormone » une forme substantiellement inactive d'une hormone, pouvant générer une forme active de ladite hormone, suite à un traitement chimique ou enzymatique in vitro ou in vivo.
On désigne par « prodrogue » une forme substantiellement inactive d'une drogue, pouvant générer une forme active de ladite drogue, suite à un traitement chimique ou enzymatique in vitro ou in vivo.
On désigne par « albumine sérique » ou « sérum albumine » une protéine de la classe . des albumines présente de manière majoritaire dans le plasma sanguin et dont le poids moléculaire est d'environ 66,5 kD.
De manière avantageuse le choix de A et de B permet de moduler la solubilité du composé (I). A partir d'un composé de fomule (I) donné il est possible d'augmenter la solubilité dudit composé en raccourcissant le groupe alkyle de A et/ou B, et/ou en augmentant le nombre de substituants oxygénés, souf és, azotés ou halogènes dudit groupe alkyle de A et/ou B. A contrario il est possible de diminuer la solubilité du composé (I) en augmentant la taille du groupe alkyle de A et/ou B, et/ou en diminuant le nombre de substituants oxygénés, soufrés, azotés ou halogènes dudit groupe alkyle de A et/ou B.
Le choix de A et de B permet également de moduler la vitesse de libération du composé bioactif ou chromogène. A partir d'un composé de formule (I) donné, il est possible de diminuer la vitesse de libération du composé bioactif ou chromogène en augmentant la taille du groupe alkyle de A et/ou B, et/ou en. augmentant le nombre de substituants oxygénés, soufrés, azotés ou halogènes dudit groupe1 alkyle de A et/ou B. A contrario il est possible d'augmenter la vitesse de libération du composé bioactif ou chromogène en diminuant la taille du groupe alkyle de A et/ou B, et/ou en diminuant le nombre de substituants oxygénés, soufrés, azotés ou halogènes dudit groupe alkyle de A et ou B.
Le choix de la valeur de n du composé de formule (I) permet de moduler l'accessibilité dudit composé aux albumines sériques en fonction de la taille des composés bioactifs ou chromogènes protégés. De manière avantageuse plus la taille des composés bioactifs ou chromogènes est importante plus la valeur de n peut être choisie grande. La nature du groupement X permet de varier les fonctions des composés bioactifs et chromogènes pouvant être protégées par les composés de formule (I) tels que notamment -OH, -NH2 ou -SH2.
Le groupement Z est un groupement espaceur clivable capable de se lier aux composés bioactifs ou chromogènes, notamment sur des fonctions - H2, après activation du groupement :
Figure imgf000006_0001
en particulier par le chloroformiate de paranitrophénol pour former le groupement
Figure imgf000006_0002
Avantageusement le groupement Z se clive spontanément suite à l'action des sérums albumines ; par ailleurs il renforce l'affinité du groupement protecteur isoxazole pour le site actif des albumines sériques.
L'invention concerne en particulier l'utilisation susmentionnée des composés de formule générale (TJ) suivante :
Figure imgf000006_0003
π dans laquelle X représente -OH, -NH2 ou -SH.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée des composés de formules ITJ, LTI-a et ILT-b suivantes :
Figure imgf000006_0004
m
Figure imgf000006_0005
IÏI-a
Figure imgf000007_0001
πi-b
Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation des composés de formules I, II, LU, LU-a ou m-b. pour la préparation de composés répondant à Tune des formules suivantes :
Figure imgf000007_0002
dans lesquelles W, B, A, a et X sont tels que définis ci-dessus, R est un groupement bioactif ou chromogène et Z répond à la formule suivante :
Figure imgf000007_0003
L'invention est notamment caractérisée en ce que le groupement R est un groupement bioactif, notamment choisi parmi une drogue telle que :
- un anticancéreux, tel que la daunorubicine,
- un antiviral,
- un antibactérien, notamment un antibiotique,
- un antifongique,
- un agent chélatant, tel que la défériprone, ou une hormone, notamment peptidique ou stéroïdienne, telle que l'insuline ou l'oestradiol. Les drogues ou les hormones choisies sont en particulier actives dans le sang, le plasma ou la lymphe, elles ciblent notamment la surface extracellulaire de la membrane cytoplasmique des cellules de l'organisme.
On désigne par « groupement chélatant » un groupement chimique capable de former un complexe de coordination stable avec un ion métallique et ainsi de dissimuler les propriétés dudit ion métallique.
La défériprone correspond la formule suivante :
Figure imgf000008_0001
Ri : CH3, (CH2)20H, (CH2)3OH
Figure imgf000008_0002
La présente invention est notamment caractérisée en ce que le groupement chromogène est le paranitrophénol ou un groupement fluorescent tel que l'umbelliferone. D'autres groupements tels que le phénol, Torthonitrophénol, ou Torthofluorophénol peuvent également être utilisés.
On désigne par « groupement fluorescent » un groupement chimique capable d'émettre des photons suite à un phénomène d'absorption électronique.
L'umbelliferone correspond notamment à la 4-méthylumbelliferone, de formule suivante :
Figure imgf000008_0003
L'invention a également pour objet les composés de formule générale (I) suivante
Figure imgf000008_0004
dans laquelle :
• W est O ou S
• B est
- -H, " ou un groupe alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, ledit groupe alkyle pouvant être substitué par des groupements oxygénés, soufrés, azotés ou halogènes,
• a vaut 0 ou i,
• X est un groupe contenant un hétéroatome, tel que -OH, -SH, -NH2 lorsque a vaut 0, ou -O-, -S-, -NH- lorsque a vaut 1,
• A est un groupe de formule suivante :
Y
I
-CH-
, dans laquelle Y est
- -H,
- ou un groupe alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, ledit groupe alkyle pouvant être substitué par des groupements oxygénés, soufrés, azotés ou halogènes,
Figure imgf000009_0001
, dans laquelle n est un entier de 1 à 10 Z est un groupe de formule suivante :
Figure imgf000009_0002
dans laquelle J est - H, - ou un groupe de formule suivante :
Figure imgf000009_0003
à l'exclusion du composé de formule (III) suivante :
Figure imgf000009_0004
III
L'invention concerne en particulier les composés de formule générale (II) suivante
Figure imgf000010_0001
II dans laquelle X est -SH ou -NH2.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne également les composés de formule générale (F) suivante :
Figure imgf000010_0002
r dans laquelle :
• W est O ou S ;
• B est
- -H,
" ou un groupe alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, ledit groupe alkyle pouvant être substitué par des groupements oxygénés, soufrés, azotés ou halogènes,
• X est un groupe contenant un hétéroatome, tel que -O-, -S-, ou -NH-,
• A est un groupe de formule suivante :
Y
I
-CH-
, dans laquelle Y est
- -H,
- ou un groupe alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, ledit groupe alkyle pouvant être substitué par des groupements oxygénés, soufrés, azotés ou halogènes,
Figure imgf000010_0003
, dans laquelle n est un entier de 1 à 10 ; Z est un groupe de formule suivante :
Figure imgf000010_0004
dans laquelle J est - H, - ou un groupe de formule suivante :
Figure imgf000011_0001
En particulier, l'invention a pour objet les composés de formules suivantes
Figure imgf000011_0002
L'invention a également pour objet les composés de formule générale (IV) suivante :
Figure imgf000011_0003
IV dans laquelle :
• W est O ou S ; \
• B est
- -H,
1 ou un groupe alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, ledit groupe alkyle pouvant être substitué par des groupements oxygénés, soufrés, azotés ou halogènes,
• a vaut 0 ou i,
• X est un groupe contenant un hétéroatome, tel que -O-, -S-, -NH-,
• A est un groupe de formule suivante :
Y
I
-CH-
, dans laquelle Y est - -H,
- ou un groupe alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, ledit groupe alkyle pouvant être substitué par des groupements oxygénés, souf és, azotés ou halogènes,
Figure imgf000012_0001
, dans laquelle n est un entier de 1 à 10 ; Z est un groupe de formule suivante :
Figure imgf000012_0002
• R est un groupement bioactif ou chromogène.
L'invention concerne en particulier les composés de formules générales (V) et (V) suivantes :
Figure imgf000012_0003
V
Figure imgf000012_0004
V dans lesquelles X et R sont tels que définis ci-dessus.
L'invention concerne plus particulièrement les composés de formules (VI) et (NT) suivantes :
Figure imgf000012_0005
VI
Figure imgf000012_0006
VI' dans lesquelles R est tel que défini ci-dessus. La présente invention concerne notamment un composé de formule IN, N, N', NI ou VI', dans laquelle R est un groupement bioactif choisi parmi une drogue telle que :
- un anticancéreux, tel que la daunorabicine,
- un antiviral,
- un antibactérien, notamment un antibiotique,
- un antifongique,
- un agent chélatant, tel que la défériprone, ou une hormone, notamment peptidique ou stéroïdienne, telle que l'insuline ou l'oestradiol.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un composé ci-dessus, en tant que prodrogue ou prohormone.
L'invention concerne également un composé de formule IN, N, V, NI ou NI', dans laquelle le groupement chromogène est le paranitrophénol ou un groupement fluorescent tel que l'umbelliferone.
Selon un mode de réalisation particulier l'invention concerne un composé de formule (NIÏ) suivante :
Figure imgf000013_0001
VII
L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins un composé ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, tel que par exemple du carbonate de calcium, du phosphate de calcium, des sucres, tels que le lactose, ou des dérivés d'amidon ou de cellulose, de la gélatine, de l'huile végétale, du polyéthylène glycol, ou tout autre véhicule classiquement utilisé par l'homme de l'art.
L'invention concerne en particulier une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle est présentée sous une forme convenant pour une administration par voie orale ou par injection.
Selon un autre mode de réalisation l'invention concerne l'utilisation d'un composé de formule IN, N, V, NI ou NI', le groupement chromogène étant en particulier le paranitrophénol ou un groupement fluorescent tel que l'umbelliferone, et notamment du composé de formule NU, pour le dosage de la sérum albumine dans des échantillons biologiques tels que le sang, le plasma, le sérum ou l'urine. Selon un mode de réalisation particulier l'invention concerne un procédé de dosage de la sérum albumine dans des échantillons biologiques, comprenant les étapes suivantes :
- ajouter le composé de formule NIJ, à un échantillon biologique dont on souhaite déterminer la concentration en sérum albumine, à une concentration d'environ 50 à 200 μmol.L"1,
- incuber ledit échantillon biologique auquel a été ajouté ledit composé, à une température d'environ 20°C à 37°C, durant environ 20 à 60 min,
- mesurer l'absorbance dudit échantillon biologique auquel a été ajouté ledit composé, après incubation, à une longueur d'onde d'environ 405 nm,
- comparer la valeur d'absorbance obtenue à celles d'une gamme étalon de sérum albumine, afin de déterminer la concentration en sérum albumine de l'échantillon biologique de départ.
On désigne par « gamme étalon » une série de solutions dont la concentration en sérum albumine est connue, la concentration en sérum albumine desdites solutions étant avantageusement comprise entre environ 0,05 g/L et 0,6 g/L.
Les échantillons biologiques sont notamment du sang, du plasma, du sérum ou de l'urine.
Selon un mode de réalisation préféré le procédé de dosage ci-dessus est effectué à pH 10.
Selon un autre mode de réalisation préféré du procédé de dosage ci-dessus, le composé de formule NII est remplacé par un composé de formule NI dans lequel le groupement chromogène est un groupement fluorescent tel que l'umbelliferone.
Avantageusement le procédé de dosage de la sérum albumine est automatisable.
L'invention concerne un procédé de synthèse du composé de fprmule suivante
Figure imgf000014_0001
ou du composé de formule suivante :
Figure imgf000014_0002
dans lesquelles B, Z, R et a sont tels que définis ci-dessus, comprenant les étapes suivantes : - traitement du composé de formule (CU) :
Figure imgf000015_0001
par du chlorhydrate d'hydroxylamine, notamment dans du méthanol à chaud, pour former le composé de formule (β) :
Figure imgf000015_0002
- traitement du composé de formule (β) par de l'acide chlorhydrique concentré, notamment dans de l'acide acétique, pour former le composé de formule (7) :
Figure imgf000015_0003
- traitement du composé de formule (γ) par du chloroformiate d'éthyle, notamment en présence de triéthylamine dans du tétrahydrofurane, pour former le composé de formule (δ) :
Figure imgf000015_0004
- traitement du composé de formule (δ) par du borohydrure de sodium, notamment dans un mélange eau/tétrahydrofurane en proportion 1/9 pour former le composé de formule (ë) :
Figure imgf000015_0005
- éventuellement traitement du composé de formule (e) par du 4-hydroxyméthylphénol et éventuellement par du chloroformiate de paranitrophénol, pour former le composé de formule
Figure imgf000016_0001
-éventuellement traitement du composé de formule (e) ou du composé de formule (ζ) par un groupement R, notamment en présence de N-succinimide, de triphénylphosphine, de diéthylazodicarboxylate, dans du tétrahydrofurane, pour former un composé de formule suivante :
Figure imgf000016_0002
L'invention concerne également un procédé de synthèse du composé de formule suivante :
Figure imgf000016_0003
ou du composé de formulé suivante,
Figure imgf000016_0004
dans lesquelles B, Z, R et a sont tels que définis ci-dessus, comprenant les étapes suivantes - traitement du composé de formule (η) :
Figure imgf000016_0005
V par du thiocyanate d'ammonium pour former le composé de formule (θ) :
Figure imgf000016_0006
- traitement du composé de formule (θ) par du N-bromo-succinimide, du CCL-. et de razodiisobutyronitrile pour former le composé de formule (i) :
Figure imgf000017_0001
- traitement du composé de formule (i) par de l'eau, du N,N-diméthylformamide ou de .'hydrogénosulfide de sodium pour former un composé de formule (K) :
Figure imgf000017_0002
K
- éventuellement traitement du composé de formule (K) par du 4-hydroxyméthylphénol et éventuellement par du chloroformiate de paranitrophénol, pour former le composé de formule (λ) :
Figure imgf000017_0003
λ
- éventuellement traitement du composé de formule (K) OU du composé de formule (λ) par un groupement R, notamment en présence de N-succinimide, de triphénylphosphine, de diéthylazodicarboxylate, dans du tétrahydrofurane, pour former un composé de formule suivante :
Figure imgf000017_0004
L'invention concerne également un procédé de synthèse du composé de formule II ou du composé de formule V, comprenant les étapes suivantes :
- traitement du propanai par de l'éthanol et du CaCl2 pour former de l'éthyl- acétaldéhyde,
- traitement de l'éthyl-acétaldéhyde par de l'acide phosphorique et de la quinoléine pour former de Téthyl-1-propényl éther, - traitement de Féthyl-1-propényl ether, par de l'orthoformiate d'éthyl et de Tétherate de trifuoroborane pour former du diethyl-acétaldéhyde,
- traitement du diethyl-acétaldéhyde par de l'hydroxylamine et de l'acide sulfurique pour former la 4-méthyl-isoxazole,
- traitement de la 4-méthyl-isoxazole par du N-bromo-succinimide, du CCL-. et de razodiisobutyronitrile pour former la 4- bromométhyl-isoxazole,
- traitement de la 4-bromométhyl-isoxazole par de l'eau, ou de Tazoture de sodium puis de la triphénylphosphine, ou de Thydrogénosulfide de sodium, pour former un composé de formule LT, éventuellement traitement d'un composé de formule II par un groupement R tel que défini ci-dessus, , notamment en présence triphényl phosphine, de diéthyl-azodicarboxylate, de N-succinimide et de tétrahydrofurane, pour former un composé de formule N. L'invention concerne également un procédé de synthèse du composé de formule m, posé de formule NI, ou du composé de formule NII, comprenant les étapes suivantes :
- traitement du propanai par de l'éthanol et du CaCl2 pour former de l'éthyl- acétaldéhyde,
- traitement de l'éthyl-acétaldéhyde par de l'acide phosphorique et de la quinoléine pour former de l'éthyl-1-propényl éther,
- traitement de Féfhyl-1-propényl ether, par de l'orthoformiate d'éthyl et de Tétherate de trifuoroborane pour former du diethyl-acétaldéhyde,
- traitement du diethyl-acétaldéhyde par de l'hydroxylamine et de l'acide sulfurique pour former la 4-méthyl-isoxazole,
- traitement de la 4-méthyl-isoxazole par du Ν-bromo-succinimide, du CCLt et de Tazodiisobutyronitrile pour former la 4- bromométhyl-isoxazole,
- traitement de la 4-bromométhyl-isoxazole par de l'eau, pour former le composé de formule m, éventuellement traitement composé de formule III par un groupement R tel que défini ci-dessus, notamment le 4-para-nitrophénol, notamment en présence triphényl phosphine, de diéthyl-azodicarboxylate, de Ν-succinimide et de tétrahydrofurane, pour former le composé de formule NI, et notamment le composé de formule NE. DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1
La figure 1 représente la décomposition du 4-(p-nitrophénoxy)méthyl-isoxazole par les albumines sériques humaine et bovine in vitro en fonction du temps. L'axe des abscisses correspond au temps, exprimé en minute, l'axe des ordonnées correspond à la densité optique (DO) à 405 nm. Les cinétiques ont été réalisées dans un tampon Tris-HCl 100 mM, pH 9 avec une concentration en 4-(p-nitrophénoxy)méthyl-isoxazole de 250 μM, la libération du p- nitrophénol étant suivie par spectrophotométrie à 405 nm. La courbe correspondant aux triangles noirs représente la décomposition obtenue en présence de sérum albumine humaine (S AH) à la concentration de 10 μM, la courbe correspondant aux carrés noirs représente la décomposition obtenue en présence de sérum albumine bovine (SAB) à la concentration de 10 μM et la courbe correspondant aux cercles blancs représente la décomposition témoin obtenue en présence de tampon uniquement.
Figure 2
La figure 2 représente la mesure de l'efficacité catalytique (kcat/Km) en fonction du pH pour la SAH et la SAB vis-à-vis de la décomposition du 4-(p-nitrophénoxy)méthyl-isoxazole. L'axe des abscisses représente le pH, l'axe des ordonnées représente la valeur du rapport
9 1 1 koat m (xlO M" .min" ). La courbe représentée par des cercles noirs correspond à la SAB et la courbe représentée par ces carrés blancs correspond à la SAH.
Figure 3
La figure 3 représente l'inhibition de l'activité catalytique de la SAB et de la SAH par le nonanoate. L'axe des abscisses représente la concentration en nonanoate (en μM), Taxe des ordonnées représente l'activité catalytique résiduelle de la SAB et de la SAH (en pourcentage de l'activité catalytique maximale). La courbe représentée par les carrés blancs correspond à la SAH, la courbe représentée par les cercles noirs correspond à la SAB.
Figure 4
La figure 4 représente Tinhibition de l'activité catalytique de la SAB par le pyridoxal phosphate (PLP). L'axe des abscisses représente la concentration en PLP (en mM), Taxe des ordonnées représente l'activité catalytique résiduelle de la SAB (en pourcentage de l'activité catalytique maximale). Figure 5
La figure 5 représente l'inhibition de l'activité de décomposition du 4-(p- nitrophénoxy)méthyl-isoxazole du sérum humain par le nonanoate. L'axe des abscisses représente le temps en minutes, l'axe des ordonnées représente la DO à 405 nm. La courbé représentée par des carrés noirs correspond à la cinétique de décomposition du 4-(p- nitrophénoxy)méthyl-isoxazole par du sérum humain, la courbe représentée par des cercles blancs correspond à la cinétique de décomposition du 4-(p-mtrophénoxy)méthyl-isoxazole par du sérum humain en présence de nonanoate (6 mM).
EXEMPLES
Exemple 1
Synthèse du 4-(^-nitrophénoxy)méthyl-isoxazole
Le 4-(p-nitrophénoxy)méthyl-isoxazole a été synthétisé selon le schéma réactionnel suivant
Figure imgf000021_0001
(2)
36 %
Figure imgf000021_0002
(8)
Brièvement, les réactions suivantes ont été effectuées :
- réaction a : du propanai (1) (22 mL, 0,30 mol) a été ajouté goutte à goutte à une solution de CaCl2 (2,79 g, 25 mmol, 0,09 équivalents (éq.)) dans 34 mL d'éthanol (0,58 mol, 1,9 éq.) à 0°C ; après 2 jours à température ambiante puis décantation, la phase supérieure a été recueillie et lavée trois fois avec de l'eau puis séchée sur K2CO3 ; la purification du brut réactionnel par distillation sous pression réduite (température d'ébullition (Ta,) 63 °C, pression (P) 100 mmHg) a permis d'obtenir 9,39 g d'éthylacétaldéhyde (2) sous la forme d'une huile incolore avec un rendement de 49% ; une caractérisation RMN du produit obtenu a été effectuée ; RMN 1H (200 MHz, CDC13) : δ=0,91 (t, 3H, H ; 1,21 (t, 6H, H5, H5') ; 1,59 (m, 2H, H2) ; 3,41-3,72 (q, 4H, BU, H4') ; 4,41 (t, 1H, H3) ; RMN 13C (50 MHz, CDC13) : δ=8,7 (Q) ; 15,1 (C5) ; 26,4 (C2) ; 60,7 (C4) ;103,9 (C3).
réaction b : dans un ballon ont été introduits successivement de T anhydride phosphorique (26,5 g, 0,19 mol, 1,2 éq.), de la quinoline (20 g, 0,155 mol, 1 éq.) puis l'éthylacétaldéhyde (2) (20,47 g, 0,155 mol) ; après 15 min. sous agitation magnétique, l'éthyl-1-propényl éther (3) a été distillé in situ (Téb=40-60°C, P=760 mmHg) et a été obtenu sous la forme d'une huile incolore avec un rendement de 83% (11,02 g) ; RMN 1H (200 MHz, CDC13) : δ=l,23 (t, 3H, H5) ; 1,56 (d, 3H, H ; 3,76 (q, 2H, H4) ; 4,35 (m, 1H, H2) ; 5,92 (d, 1H, H3) ; RMN 13C (50 MHz, CDC13) : δ=8,87 (C5) ; 15,20 (Ci) ; 26,49 (C4) ; 60,76 (C2) ; 103,99 (C3) ;
réaction c : à 11,14 ml d'orthoformiate d'éthyle (67 mmol, 0,80 éq.) a été ajouté de Tétherate de trifluoroborane (0,04 mL, 0,04 mmol, 5.10"4 éq.) et la solution a été chauffée à 40°C ; à cette solution a été ajouté un mélange d'éthyl- 1-propényl éther (3) (9,28 mL, 84 mmol) et d'orthoformiate d'éthyle (11,14 mL, 67 mmol, 0,8 éq.) ; après refroidissement à température ambiante, la solution a été lavée avec une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 10%, séchée sur MgSO4 puis concentrée sous pression réduite ; la distillation du brut réactionnel sous pression réduite (Téb=70°C, P=17 mmHg) a permis d'obtenir le produit désiré sous la forme d'une huile incolore avec un rendement de 36% (6,99 g) ; RMN 1H (200 MHz, ÇDC13) : δ=0,92 (d, 3H, H0 ; 1,17 (t, 12H, H5, H5', H5", H5'") ; 1,98 (m, 1H, H2) ; 3,47 (q, 8H, H,, EU', BU", HV") ; 4,40 (d, 2H, H3) ; RMN 13C (50 MHz, CDC13) : δ=7,81 (Ci) ; 15,29 (C5) ; 40,66 (C2) ; 62,77 (C4) ; 104,01 (C3) ;
réaction d : 132 mmol (31 g) de diéthylacétaldéhyde (4) ont été traités par 159 mmol (11,05 g, 1,18 éq.) d'hydroxylamine dans 80 ml d'eau en présence de 3 ou 4 gouttes de H2SO4 concentré, durant 8 heures à reflux ; le mélange a ensuite été refroidi et une solution aqueuse saturée de chlorure de cadmium a été ajoutée ; le mélange a été filtré sur Bϋchner et le précipité recueilli a été mis en solution dans 15 mL d'eau ; après distillation de la solution eau-4-méthyl-isoxazole (5), le distillât a été extrait trois fois avec de T éther diéthylique et la phase organique a été séchée sur chlorure de calcium ; la distillation du brut réactionnel a permis d'obtenir le 4-méthyl-isoxazole (5) sous la forme d'une huile incolore avec un rendement . de 73% (8 g) ; la température d'ébullition (Téb) mesurée était de 105°C à une pression (P) de 760 mmHg ; les données de RMN 1H (200 MHz, CDC13) donnent δ=20,7 (s, 3H, H6) ; 8,12 (s, 1H, H3) ; 8,18 (s, 1H, H5) et les données de RMN 13C (50 MHz, CDC13) donnent δ=6,73 (C6) ; 113,64 (C4) ; 151,1 (C3) ; 154,55 (C5) ;
réaction e : à une solution de N-bromosuccinimide (2,41 mmol, 0,352 g, 1 éq.) et de 4- méthyl-isoxazole (5) (2,41 mmol, 0,200 g) dans 2,1 mL de tétrachlorure de carbone sous azote a été ajouté de razodiisobutyronitrile (AIBN) (0,24 mmol, 4,7 mg, 0,1 éq.) ; le mélange a été chauffé à reflux pendant 8 à 10 heures puis refroidi à 0°C et filtré. Le filtrat a été concentré puis distillé sous pression réduite (Téb=l 50°C, P=8 mmHg) afin d'obtenir le 4-bromométhyl-isoxazole (6) sous la forme d'une huile incolore avec un rendement de 44% (0,172 g) ; RMN 1H (200 MHz, CDC13) : δ=4,34 (s, 2H, H6) ; 8,32 (s, 1H, H3) ; 8,45 (s, 1H, H5) ;
réaction f : une solution de 4-bromométhyl-isoxazole (6) (10,1 mmol, 1 g) dans 10 mL d'eau a été laissée à reflux pendant 16 h. Après refroidissement à température ambiante, le mélange réactionnel a été extrait 3 fois par de T éther diéthylique puis la phase organique a été décantée, séchée sur MgSO4 et concentrée sous pression réduite ; le 4-hydroxyméthyl-isoxazole (7) a ainsi été obtenu sous la forme d'une huile incolore avec un rendement de 32% (0,2 g). RMN 1H (200 MHz, CDC13) : δ=4,65 (s, 2H, H6) ; 8,31 (s, 1H, H3) ; 8,41 (s, 1H, H5) ; ,,
réaction g : cette réaction est une réaction de Mitsunobu ; à une solution de 4- hydroxyméthyl-isoxazole (7) (2 mmol ; 0,2 g), de triphénylphosphine (4 mmol, 1 g, 2 éq.) et de p-nitrophénol (8) (4 mmol, 0,56 g, 2 éq.) dans 2 mL de tétrahydrofurane anhydre à 0°C a été ajouté du diéthylazodicarboxylate (4 mmol, 0,636 mL, 2 éq.) ;après 30 minutes de réaction à 0°C, le milieu réactionnel a été mis 5 heures à température ambiante et a été ensuite concentré sous pression réduite ; après extraction (3 fois) par de Téther diéthylique puis filtration sur Bϋchner, la phase organique a été lavée par de l'eau, séchée sur MgSO4 et concentrée sous pression réduite ; la purification du brut réactionnel par chromatographie flash sur colonne de silice a permis d'obtenir le produit désiré (308 mg) avec un rendement de 70%». RMN 1H (200 MHz, CDC13) : δ=4,34 (s, 2H, H6) ; 8,34 (s, 1H, H3) ; 8,53 (s, 1H, H5) ; 8,10 (d, 2Har) ; 6,88 (d, 2Har) ;
Diverses adaptations de ce protocole ont été mises en œuvre :
a. Les réactions f et g ont été remplacées par une seule étape, comme cela est décrit ci- après ; à une solution de p-nitrophénol (430 mg, 3,1 mmol) et de carbonate de potassium (210 mg, 1,54 mmol) dans du DMF anhydre (2,5 mL), est ajoutée goutte à goutte une solution de 4-bromométhyl-isoxazole dans du DMF anhydre (2,5 mL). Le mélange est agité 2 heures à température ambiante. La solution est ensuite diluée avec de l'eau (10 mL) et extraite avec du CH2C12. La phase organique est séchée sur MgSO4, concentrée sous pression réduite, et purifiée par chromatographie flash (CH2C12) pour donner le 4-(p-rritrophénoxy)méthyl- isoxazole (80 mg, 30%).
b. Lors de la réaction f, la réaction peut être réalisée (i) en présence d'azoture de sodium dans du N,N-diméthylformamide à température ambiante pendant 12 heures suivie du traitement de Tazoture formé avec de la triphénylphosphine dans un mélange eau/tétrahydrofurane en proportion 1/9 à température ambiante pendant 20 heures ou (ii) avec de l'hydrogenosulfide de sodium à température ambiante pendant 12 heures, afin de former respectivement du 4-aminométhyl-isoxazole (10) et du 4-thiométhyl-isoxazole (11).
Figure imgf000024_0001
c. Lors de la réaction g, le produit (7) peut être remplacé par un autre composé comportant une fonction hydroxyle, tel que le phénol, Torthonitrophénol, l'orthoflurophénol, ou plus particulièrement l'oestradiol (12), la défériprone (13), le 4-hydroxyméthylphénol (14) pour former respectivement les produits (15), (16), et (17).
Figure imgf000025_0001
Ri : CH3, (CH2)2OH, (CH2)3OH
Figure imgf000025_0002
(12) (13) (14)
Figure imgf000025_0003
CH3, (CH2)2OH, (CH2)30H
Figure imgf000025_0004
Figure imgf000025_0005
(15) (16) (17)
L'insuline peut également être modifiée selon la réaction g par le biais des groupements hydroxyles portés par ses 4 tyrosines.
Le composé (17), après activation par le chloroformiate de paranitrophénol, peut ensuite être utilisé notamment pour se lier à des molécules comportant des fonctions hydroxyles ou aminés libres telles que Foestrone (18) pour former le composé (19) ou la daunorubicine (20) pour former le composé (21) ci-dessous. Brièvement, une solution de composé (17) et 4- nitrophénylchlorofomate est chauffée à 60°C durant 1 heure en présence de 1,4-dioxane pour former le composé (17') ; ensuite une solution de composé (18) ou de composé (20) (1 éq.) et de composé (17') (1 éq.) sont agités durant 15 min à température ambiante dans du N,N'- diméthyl-formamide en présence de triéthylamine (1,5 éq.). La solution est alors diluée avec de l'eau et le produit obtenu (19) ou (21) est extrait à F éther.
Figure imgf000025_0006
(17')
Figure imgf000026_0001
(20) (21 )
d. Enfin, pour les composés comprenant un groupement hydroxyle décrits ci-dessus (ROH), les étapes f et g peuvent être remplacées par le protocole suivant ; à une solution de ROH (1 éq) et d'oxyde d'argent Ag2O (2 éq.) dans l'acétonitrile (2,5 mL), est ajoutée goutte à goutte une solution de 4-bromométhyl-isoxazole dans l'acétonitrile (2,5 mL). Le mélange est agité 24 heures à température ambiante. La solution est ensuite filtrée, évaporée et le résidu repris dans du CH2C12. La solution est lavée à l'eau, puis la phase organique est séchée sur MgSO4) concentrée sous pression réduite, et purifiée par chromatographie flash (CH2C12) pour donner le dérivé correspondant du méthyl-isoxazole (RO- méthyl-isoxazole).
Exemple 2
Décomposition du 4-(p-nitrophénoxy)méthyl-isoxazole par les sérum albumines in vitro
Il a été mis en évidence, de manière inattendue, que les sérum albumines catalysaient la libération du -nitrophénol à partir du 4-(p-nitrophénoxy)méthyl-isoxazole. Le 4-(p-nitrophénoxy)méthyl-isoxazole (250 μM) a été mis en présence de sérum albumine humaine (SAH, 10 μM) ou bovine (SAB, 10 μM) à 25°C, et la libération de p- nitrophénol a été suivie au cours du temps par lecture de la densité optique (DO) à 405 nm (voir Figure 1). Les résultats obtenus indiquent que dans ces conditions la quantité de p- nitrophénol libérée est proportionnelle au temps écoulé et que sa vitesse de libération est de 0,13 μM min en présence de SAH, 0,15 μM/min en présence de SAB et de 0,003 μM/min en absence d'albumines.
L'efficacité catalytique des albumines sériques a ensuite été étudiée entre pH 7,0 et 11,5.
L'efficacité catalytique (rapport kcat/Km) de la SAH (15 μM) et de la SAB (15 μM) vis-à-vis du substrat 4-(p-nitrophénoxy)méthyl-isoxazole a été déterminée, selon des méthodes bien connues de l'homme de Fart, à faible concentration en substrat (100, 150 et 200 μM), en suivant la libération du j?-nitrophénol par spectrophotométrie à 405 nm, en fonction du pH, à l'aide des tampons suivants : phosphate (pH 7-8 et 11-11,5), bicine (pH 8- 9), et carbonate (pH 9-11), utilisés à la concentration de 30 mM en présence de NaCl (150 mM). Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 2. L'ajustement des données à l'équation kcat/Km = (kcat/Km)max/(l+10 Ka"pH) a permis de déterminer un (kcat/Km)rnax de 3,2.102 M"1.min"1 et un pKa de 10,6 pour la SAB, ainsi qu'un (kcat Krαhnax de 3,5.102 M"1.min"1 et un pKa de 10,7 pour la SAH.
Globalement les résultats obtenus indiquent que la réaction est plus efficace à pH basique. L'analyse de la Figure 2 suggère la participation à la catalyse de la forme déprotormée de résidus possédant un pKa de 10,6 pour la SAB et de 10,7 pour la SAH, ce qui semble correspondre au groupement aminé de résidus lysine ou à lg. fonction hydroxyle de résidus tyrosine qui pourraient jouer le rôle de base générale dans la catalyse.
Afin d'identifier les sites responsable de cette catalyse, des tests d'inhibition par l'acide nonanoïque (HOOC-(CH2)7-CH3) et le pyridoxal phosphate (PLP) ont été réalisés.
De la SAH (15 μM) et de la SAB (15 μM) ont été incubées en tampon bicine pH 9,0, NaCl 150 mM en présence de concentrations variables de nonanoate (0 à 300 μM) durant 30 min. La libération du -nitrophénol à partir du 4-(p-nitrophénoxy)méthyl-isoxazole (200 μM) a alors été suivie par spectrophotométrie à 405 nm (Figure 3) sur 60 min à 25°C. Ces tests montrent que l'activité de décomposition du 4-(p-nitrophénoxy)méthyl-isoxazole est complètement inhibée par le nonanoate tant pour la SAH que pour la SAB. Les acides gras à longue chaîne, tel que le nonanoate, interagissent avec les albumines sériques au niveau de leurs différents sites d'interaction hydrophobes. Cela indique que la catalyse de cette réaction a lieu au niveau d'un seul ou des deux sites IIA et IDA (Carter et Ho, Adv. Protein Chem. (1994) 45:153-203) de ces deux protéines, sites où se déroule aussi l'élimination de Kemp sur le 5-nitro-benzisoxazole (Hollfelder et al. J. Am. Chem. Soc. (2000) 122:1022-1029). Des résidus lysine et arginine interagissent au sein de ces sites avec de nombreuses molécules anioniques.
Afin de mieux identifier la nature des résidus impliqués dans la catalyse, des tests d'inhibition de l'activité par le pyridoxal phosphate ont été réalisés sur la SAB. Le PLP est un inhibiteur covalent qui permet d'identifier l'intervention de résidus lysine dans la catalyse (Hollfelder et al, J. Am. Chem. Soc. (2000) 122:1022-1029). En effet, la fonction aldéhydique du pyridoxal phosphate réagit avec la chaîne latérale d'un résidu lysine pour former un complexe covalent.
De la SAB (15 μM) a été incubée dans un tampon bicine 50 mM pH 9,0, NaCl 150 mM en présence de concentrations variables de PLP (0 à 1 mM) durant 10 h à 20°C à l'obscurité. Le 4-(p-nitrophénoxy)méthyl-isoxazole a alors été ajouté et la libération du p- nitrophénol a été suivie par spectrophotométrie à 405 nm (Figure 4) durant 60 min à 25°C. Ces tests d'inhibition montrent que 70 % de l'activité de la SAB est vraisemblablement portée par un résidu lysine, probablement la lysine 222 du domaine IIA de la protéine.
Exemple 3
Décomposition du 4-(p-nitrophénoxy)méthyl-isoxazole par du sérum humain
La décomposition du 4-(p-nitrophénoxy)méthyl-isoxazole a éljé étudiée dans du sérum humain dans des conditions proches des conditions physiologiques : 250 μM de 4-(p- nitrophénoxy)méthyl-isoxazole ont été incubés dans du sérum humain à pH 7,7 à 25°C en présence ou en absence de 6 mM nonanoate. La libération du -nitrophénol a été suivie à 405 irai (Figure 5). L'inhibition totale de l'activité de décomposition par le nonanoate dans le sérum humain montre que le 4-(p-nitrophénoxy)méthyl-isoxazole est stable en conditions physiologiques et que seule la SAH est responsable de sa dégradation. Par ailleurs, en absence d'inhibiteur et dans les conditions de l'expérience la vitesse de dégradation dans le sérum humain est de 0,28 μM/min.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation des composés de formule générale (I) suivante :
Figure imgf000029_0001
I dans laquelle :
• W est O ou S ;
• B est
- -H,
" ou un groupe alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, ledit groupe alkyle pouvant être substitué par des groupements oxygénés, soufrés, azotés ou halogènes,
• a vaut 0 ou 1
• X est un groupe contenant un hétéroatome, tel que -OH, -SH, -NH2 lorsque a vaut 0, ou -O-, -S-, -NH- lorsque a vaut 1,
• A est un groupe de formule suivante :
Y
I
-CH-
, dans laquelle Y est
- -H,
- ou un groupe alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, ledit groupe alkyle pouvant être substitué par des groupements oxygénés, soufrés, azotés ou halogènes,
Figure imgf000029_0002
, dans laquelle n est un entier de 1 à 10 Z est un groupe de formule suivante :
Figure imgf000029_0003
dans laquelle J est - H, ou un groupe de formule suivante :
Figure imgf000030_0001
en tant que groupement protecteur clivable.
2. Utilisation selon la revendication 1, des composés de formule générale (ïï) suivante
1 5
II dans laquelle X représente -OH, -NH2 ou -SH.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, des composés de formules III, III-a et IJI-b suivantes :
Figure imgf000030_0002
III
Figure imgf000030_0003
Ill-a
Figure imgf000030_0004
Ill-b
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, des composés de formules I, II, m, Hl-a ou rfl-b, pour la préparation de composés répondant à l'une des formules suivantes :
Figure imgf000031_0001
dans lesquelles W, B, A, a et X sont tels que définis dans la revendication 1, R est un groupement bioactif ou chromogène et Z répond à la formule suivante :
Figure imgf000031_0002
5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que le groupement R est un groupement bioactif, notamment choisi parmi une drogue telle que :
- un anticancéreux, tel que la daunorubicine,
- un antiviral,
- un antibactérien, notamment un antibiotique,
- un antifongique, •!
- un agent chélatant, tel que la défériprone, ou une hormone, notamment peptidique ou stéroïdienne, telle que l'insuline ou l'oestradiol.
6. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que le groupement chromogène est le paranitrophénol ou un groupement fluorescent tel que l'umbelliferone.
7. Composés de formule générale (F) suivante :
Figure imgf000032_0001
F dans laquelle :
• W est O ou S ;
• B est
- -H,
" ou un groupe alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, ledit groupe alkyle pouvant être substitué par des groupements oxygénés, soufrés, azotés ou halogènes,
• X est un groupe contenant un hétéroatome, tel que -O-, -S-, ou -NH-,
• A est un groupe de formule suivante :
Y
I
" """ , dans laquelle Y est
- -H,
- ou un groupe alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, ledit groupe alkyle pouvant être substitué par des groupements oxygénés, soufrés, azotés ou halogènes,
Figure imgf000032_0002
, dans laquelle n est un entier de 1 à 10 ; Z est un groupe de formule suivante :
Figure imgf000032_0003
dans laquelle J est - H, - ou un groupe de formule suivante
Figure imgf000032_0004
8. Composés selon la revendication 7, de formules suivantes :
Figure imgf000033_0001
9. Composés de formule générale (IN) suivante :
Figure imgf000033_0002
TV dans laquelle :
• W est O ou S ;
• B est
- "H,
" ou un groupe alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, ledit groupe alkyle pouvant être substitué par des groupements oxygénés, soufrés, azotés ou halogènes,
• a vaut 0 ou i,
• X est un groupe contenant un hétéroatome, tel que -O-, -S-, -ΝH-,
• A est un groupe de formule suivante :
" """ - , dans laquelle Y est
- -H,
- ou un groupe alkyle comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, ledit groupe alkyle pouvant être substitué par des groupements oxygénés, soufrés, azotés ou halogènes,
Figure imgf000033_0003
, dans laquelle n est un entier de 1 à 10 ; • Z est un groupe de formule suivante : O
R est un groupement bioact -if ou chromo-gèΛne.
10. Composés selon la revendication 9, de formules générales (N) et (N5) suivantes :
Figure imgf000034_0001
V
Figure imgf000034_0002
dans lesquelles X et R sont tels que définis dans la revendication 9.
11. Composés selon la revendication 10, de formules (NI) et (NF) suivantes
Figure imgf000034_0003
VI
Figure imgf000034_0004
VF dans lesquelles R est tel que défini dans la revendication 9.
12. Composé selon l'une des revendications 9 à 11, dans lequel R est un groupement bioactif choisi parmi une drogue telle que :
- un anticancéreux, tel que la daunorubicine,
- un antiviral, - un antibactérien, notamment un antibiotique,
- un antifongique,
- un agent chélatant, tel que la défériprone, ou une hormone, notamment peptidique ou stéroïdienne, telle que l'insuline ou l'oestradiol.
13. Composé selon l'une des revendications 9 à 11, dans lequel le groupement chromogène est le paranitrophénol ou un groupement fluorescent tel que l'umbelliferone.
14. Composé selon la revendication 13, de formule (NII) suivante :
Figure imgf000035_0001
VII
15. Utilisation du composé selon la revendication 12, en tant que prodrogue ou prohormone.
16. Composition pharmaceutique comprenant au moins un composé selon la revendication 12, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
17. Composition pharmaceutique selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle est
I présentée sous une forme convenant pour une admimstration par voie orale par injection.
18. Utilisation d'un composé de formule IN, N, N', NI ou VF, selon l'une des revendications 9 à 11 et 13, et notamment du composé de formule Nπ selon la revendication 14, pour le dosage de la sérum albumine dans des échantillons biologiques tels que le sang, le plasma, le sérum ou l'urine.
19. Procédé de dosage de la sérum albumine dans des échantillons biologiques, comprenant les étapes suivantes : ajouter le composé de formule Nu selon la revendication 14, à un échantillon biologique dont on souhaite déterminer la concentration en sérum albumine, à une concentration d'environ 50 à 200 μmol.L"1,
- incuber ledit échantillon biologique auquel a été ajouté ledit composé, à une température d'environ 20°C à 37°C, durant environ 20 à 60 min,
- mesurer l'absorbance dudit échantillon biologique auquel a été ajouté ledit composé, après incubation, à une longueur d'onde d'environ 405 nm,
- comparer la valeur d'absorbance obtenue à celle d'une gamme étalon de sérum albumine, afin de déterminer la concentration en sérum albumine de l'échantillon biologique de départ.
20. Procédé de synthèse du composé de formule U selon la revendication 2 ou du composé de formule N selon la revendication 10, comprenant les étapes suivantes :
- traitement du propanai par de Féthanol et du CaCl2 pour former de l'éthyl- acétaldéhyde,
- traitement de l'éthyl-acétaldéhyde par de l'acide phosphorique et de la quinoléine pour former de l'éthyl-1-propényl éther,
- traitement de l'éthyl-1-propényl ether, par de l'orthoformiate d'éthyl et de Fétherate de trifuoroborane pour former du diethyl-acétaldéhyde,
- traitement du diethyl-acétaldéhyde par de l'hydroxylamine et de l'acide sulfurique pour former la 4-méthyl-isoxazole,
- traitement de la 4-méthyl-isoxazole par du Ν-bromo-succinimide, du CC14 et de l'azodiisobutyronitrile pour former la 4- bromométhyl-isoxazole,
- traitement de la 4-bromométhyl-isoxazole par de l'eau, ou de Fazoture de sodium puis de la Iriphénylphosphine, ou de l'hydrogenosulfide de sodium, pour former un composé de formule II selon la revendication 2,
- éventuellement traitement d'un composé de formule II selon la revendication 2 par un groupement R tel que défini dans la revendication 9, pour former un composé de formule N selon la revendication 10.
21. Procédé de synthèse du composé de formule LU selon la revendication 3, du composé de formule NI selon la revendication 11, ou du composé de formule NII selon la revendication 14, comprenant les étapes suivantes : - traitement du propanai par de Féthanol et du CaCl2 pour former de l'éthyl- acétaldéhyde,
- traitement de l'éthyl-acétaldéhyde par de l'acide phosphorique et de la quinoléine pour former de l'éthyl-1-propényl éther,
- traitement de Féthyl-1-propényl ether, par de l'orthoformiate d'éthyl et de Fétherate de trifuoroborane pour former du diethyl-acétaldéhyde,
- traitement du diethyl-acétaldéhyde par de l'hydroxylamine et de l'acide sulfurique pour former la 4-méthyl-isoxazole,
- traitement de la 4-méthyl-isoxazole par du N-bromo-succinimide, du CCL* et de l'azodiisobutyronitrile pour former la 4- bromométhyl-isoxazole,
- traitement de la 4-bromométhyl-isoxazole par de l'eau, pour former le composé de formule III selon la revendication 3,
- éventuellement traitement composé de formule ni selon la revendication 3 par un groupement R tel que défini dans la revendication 9, notamment le 4-para- nitrophénol, pour former le composé de formule NI selon la revendication 11, et notamment le composé de formule Nπ selon la revendication 14.
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