JP5130530B2

JP5130530B2 - 光増感用化合物

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Publication number: JP5130530B2
Application number: JP2007551086A
Authority: JP
Inventors: 哲雄長野; 泰照浦野; 能紀余郷
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2005-12-19
Filing date: 2006-12-19
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2026-12-19
Also published as: WO2007072800A1; JPWO2007072800A1

Description

本発明は新規な光増感用化合物に関するものである。

光増感剤は励起光照射により一重項酸素（¹O₂）などの活性酸素種（Reactive oxygen species、ROS）を生成する色素化合物であり、細胞の酸化ストレス応答に関する研究、活性酸素消去剤の機能評価、腫瘍組織特異的にROSを負荷し治療を行うフォトダイナミック・セラピー(PDT: Photodynamic therapy)のための医薬など幅広い用途で用いられている。代表的な光増感剤としてはローズベンガル(Rose bengal)が当業界で汎用されている。しかしながら、従来の光増感剤は生体内に投与された後に光照射により必ず活性酸素種を生成するため、酸化ストレスを与えるべき細胞や組織以外において増感剤による非特異的な障害が起こるという問題があった。例えば、光増感剤を用いてPDTを行った場合、処置後に体内に残存する光増感剤に起因する非特異的酸化ストレス（光線過敏症）が副作用と発現し、患者のQOLは大きく低下してしまう。多様な細胞のうち、特定の種類の細胞にだけ酸化ストレスを負荷することができれば、PDTにおける副作用の軽減が期待される。

本発明の課題は、標的細胞に選択的に酸化ストレスを負荷することができる光増感用化合物を提供することにある。

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、β-ガラクトシダーゼなどの加水分解酵素に代表される酵素や活性酸素種により特異的に切断される官能基を光増感剤の母核構造に導入することにより、該酵素や活性酸素種を発現している細胞に対して選択的に酸化ストレスを負荷できることを見出した。

すなわち、本発明により、下記の式(I)：
（式中、R¹は水素原子、置換基を有していてもよいC_1-12アルキル基、又は置換基を有していてもよいC_1-12アルコキシ基を示し；R²は置換基を有していてもよいC_1-12アルキル基又は置換基を有していてもよいC_1-12アルコキシ基を示し；R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、及びR⁸はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し；R⁹は酵素又は活性酸素種との接触により切断される一価の基を示す）で表される光増感用化合物が提供される。

本発明の好ましい態様によれば、R¹及びR²が低級アルコキシ基である上記の光増感用化合物；R¹がキサンテン環残基に対してパラ位の低級アルコキシ基であり、かつR²が低級アルコキシ基である上記の光増感用化合物；上記の切断が酵素による加水分解により生じる上記の光増感用化合物；上記の切断が活性酸素種との反応により生じる上記の光増感用化合物；R⁹がリン酸エステル加水分解酵素により切断されるホスホノ基である上記の光増感用化合物；R⁹がβ-ガラクトシダーゼにより切断されるβ-ガラクトピラノシル基である上記の光増感用化合物；R⁹がβ-ラクタマーゼによる環状アミドの加水分解により切断される下記の式で表される基である上記の光増感用化合物；
R⁹が糖加水分解酵素により切断される糖誘導体の残基である上記の光増感用化合物；R⁹が活性酸素種との反応で切断される4-アミノフェニル基又は4-ヒドロキシフェニル基である上記の光増感用化合物が提供される。

また、別の観点からは、下記の式(II)：
（式中、R¹¹は水素原子、置換基を有していてもよいC_1-12アルキル基、又は置換基を有していてもよいC_1-12アルコキシ基を示し；R¹²は置換基を有していてもよいC_1-12アルキル基又は置換基を有していてもよいC_1-12アルコキシ基を示し；R¹³、R¹⁴、R¹⁵、R¹⁶、R¹⁷、及びR¹⁸はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示す）で表される光増感剤が提供される。

上記の一般式（I）で表される本発明の化合物はそれ自身は光照射に伴ない活性酸素種を生成する光増感能を有しないが、酵素又は活性酸素種との接触によるR⁹の切断によって上記の一般式(II)で表される強い光増感能を有する化合物を与える性質を有する。

別の観点からは、本発明により、細胞を殺傷する方法であって、上記の式(I)で表される化合物を細胞内に導入し、該細胞において特異的に発現する酵素又は活性酸素種と上記式(I)で表される化合物とを接触させて上記式(II)で表される化合物を生成させ、その後、励起光照射により上記式(II)から活性酸素種を発生させて該細胞を選択的に殺傷する方法が提供される。

さらに別の観点からは、フォトダイナミックセラピー用の医薬であって、上記の式(I)表される化合物を有効成分として含む医薬；悪性腫瘍治療のための上記医薬；上記医薬の製造のための上記式(I)で表される化合物の使用；及び悪性腫瘍の治療方法であって、ヒトを含む哺乳類動物に上記の式(I)で表される化合物を投与して悪性腫瘍細胞内に該化合物を取り込ませ、該細胞において特異的に発現する酵素又は活性酸素種と上記式(I)で表される化合物とを接触させて上記式(II)で表される化合物を生成させ、その後、励起光照射により上記式(II)から活性酸素種を発生させて該悪性腫瘍細胞を殺傷する方法が提供される。

化合物４及び化合物５の吸収及び蛍光スペクトルを測定した結果を示した図である。 ¹O₂によるヨウ化物イオン（I^-）の酸化反応機構を示した図である。化合物４及び化合物５の¹O₂生成能をヨウ化物イオン（I^-）の酸化反応を吸光スペクトルの時間変化として測定した結果を示した図である。（A）は化合物４の結果を示し、(B)は化合物５の結果を示す。化合物４を用いた細胞（lacZ(+)）への選択的酸化ストレス負荷を試験した結果を示した図である。

本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、例えば、炭素数１〜12個、好ましくは炭素数１〜6個、好ましくは炭素数１〜４個の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として低級アルキル基（炭素数1〜6個のアルキル基）が好ましい。低級アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、シクロプロピルメチル基、n-ペンチル基、n-ヘキシル基などを挙げることができる。

本明細書において、上記の一般式(I)中、R¹及びR²が示すC_1-12アルキル基又はC_1-12アルコキシ基のアルキル部分が置換基を有する場合、置換基の種類、個数、及び置換位置は特に限定されないが、例えば、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子のいずれでもよい）、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、スルホン酸基、又はアルキルスルホネート基などを置換基として有していてもよい。R¹及びR²が示す基としては低級アルキル基又は低級アルコキシ基であることがより好ましい。特に好ましいのは、R¹及びR²がメチル基又はメトキシ基である化合物である。

また、R¹がモノカルボキシ基置換C_1-6アルコキシ基又はモノアルコキシカルボニル置換C_1-6アルコキシ基である化合物も好ましい。特に好ましいのはR¹が4-カルボキシブトキシ基又は4-アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基である化合物である。R¹が4-アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基である本発明の光増感用化合物は高い脂溶性により細胞内に効率良く取り込まれ、かつ、細胞内に取り込まれると細胞内に存在するエステラーゼにより4-アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基が加水分解を受け高い水溶性を示すようになるため細胞内に滞留しやすくなる優れた特性を示す場合があり、本発明の化合物を細胞内に導入及び蓄積する手段として大変適している。ベンゼン環上のR¹の置換位置は特に限定されないが、キサンテン環の残基の結合位置に対してパラ位であることが好ましい。R¹及びR²が結合するベンゼン環上には、これらの置換基以外に任意の置換基が存在していてもよいが、これらがC_1-12アルキル基又は置換基を有していてもよいC_1-12アルコキシ基であることが特に好ましい。
本明細書において、上記の式(I)中、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、及びR⁸が示すハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよいが、臭素原子又はヨウ素原子であることが好ましく、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、及びR⁸のうちの1個又は2個が臭素原子又はヨウ素原子であることがより好ましい。R⁵及びR⁶が共にヨウ素原子であるか、又はそれらのうちの一方がヨウ素原子であることが特に好ましい。

本明細書において、上記の一般式(II)中、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵、R¹⁶、R¹⁷、及びR¹⁸で示される基は、それぞれ上記の一般式(I)中のR¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、及びR⁸が示す基に対応する。

本発明により提供される式（I）で表される光増感用化合物は、酵素又は活性酸素種との接触によりR⁹で表される基が切断されて光増感能を有する化合物（上記式(II)で表される化合物：上記式(I)においてR⁹が切断されヒドロキシ基又はヒドロキシ基がアニオン状態となった化合物に相当する）を生成することができ、式(II)で表される化合物を光増感剤として用いるための前駆体として用いることができる。R⁹で表される基を切断するための酵素としては、例えば、還元酵素、酸化酵素、又は加水分解酵素などを挙げることができ、より具体的には、例えば、β-ラクタマーゼ、チトクロームP450酸化酵素、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ヘキソサミニダーゼ、ラクターゼ、アルカリホスファターゼなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。切断のための酵素としては加水分解酵素が好ましい。加水分解酵素の典型例として、例えばβ-カラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼ、又はアルカリフォスファターゼなどを挙げることができるが、加水分解酵素は上記のものに限定されるわけではない。R⁹で表される基を切断するための活性酸素種としては、例えば、ヒドロキシラジカル、パーオキシナイトライト、又は次亜塩素酸イオンなどを挙げることができるがこれらに限定されるわけではない。

式(I)で表される本発明の光増感用化合物において、R¹及びR²の組み合わせは、(1)酵素又は活性酸素種によるR⁹の切断前には式(I)で表される化合物が実質的に光増感能を有しないように選択され、かつ(2)酵素又は活性酸素種によるR⁹の切断後には対応する式(II)で表される化合物が実質的に高い光増感能を有するように選択される。

いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、式(I)で表される本発明の化合物のベンゼン環部位の置換基R¹とR²の組み合わせはPET（Photoinduced Electron Transfer：光誘起電子移動）理論を基にして実際に合成することなく理論的に選択できる。PETとは励起光照射により生成する１重項光励起団が蛍光を発するなどして基底状態に戻る速度よりも速く近隣の電子供与部位（PETドナー）からの電子移動によって１重項光励起団が基底状態に戻る現象である。

本発明の光増感用化合物としては、酵素又は活性酸素種によるR⁹の切断前には実質的に光増感能を有せず、かつ酵素又は活性酸素種によるR⁹の切断後には対応する式(II)の化合物が実質的に強い光増感能を有することが求められる。式(I)で表される化合物については、光励起団となるキサンテン環部位とPETドナーとなるベンゼン環部位とに分割して考え、例えば、酵素又は活性酸素種によるR⁹の切断前にはPETにより１重項光励起団が基底状態に戻り、酵素又は活性酸素種によるR⁹の切断後には実質的にPETが生じないように光増感用化合物を設計すればよい。

R¹及びR²の組み合わせの選択に際して、それらが結合するベンゼン環の電子密度の情報を利用することができる。電子密度の情報は、例えば該ベンゼン環の酸化電位を量子化学的手法に従って計算することにより容易に入手することができる。該ベンゼン環の酸化電位が低くなることは該ベンゼン環の電子密度が上昇することを意味しており、これはHOMO軌道エネルギーが高くなることに対応している。例えば、該ベンゼン環部位のHOMOエネルギーを密度汎関数法（B3LYP/6-31G(d)）により求めることができる。例えば、式（I）で表される本発明の光増感用化合物のキサンテン環部位のR⁵がヨウ素原子であり、R³、R⁴、R⁶、R⁷、及びR⁸が水素原子である場合には、R¹がキサンテン環残基に対してパラ位の低級アルコキシ基であり、かつR²が低級アルコキシ基である組み合わせ、又はR²が低級アルコキシ基であり、かつR¹がR²に対してパラ位の低級アルコキシ基である組み合わせがなどが好適に選択される。

本発明により提供される式（I）で表される光増感用化合物を細胞内に取り込ませた場合、該細胞においてR⁹で表される基を切断可能な酵素又は活性酸素種が発現している場合には該細胞内でR⁹で表される基が切断されて光増感能を有する式(II)の化合物が生成する。この状態で励起光を照射すると、該細胞内に存在する上記式(II)で表される化合物から一重項酸素（¹O₂）などの活性酸素種が生成し、該細胞が殺傷される。一方、式（I）で表される光増感用化合物を取り込んだ細胞がR⁹で表される基を切断可能な酵素又は活性酸素種を発現していない場合には式(II)で表される化合物は生成せず、光照射により一重項酸素などの活性酸素種が該細胞内で生成することはない。式(I)で表される化合物自体も光増感能を有していないことから、光照射によっても該細胞は殺傷されない。このように式（I）で表される光増感用化合物を用いることにより、R⁹で表される基を切断可能な酵素又は活性酸素種が発現している細胞のみを選択的にPDTにより殺傷することが可能である。例えば、悪性腫瘍細胞などを殺傷の標的とする場合には、該悪性腫瘍細胞において特異的に発現している酵素又は活性酸素種を選び、該酵素又は活性酸素種により切断可能な基をR⁹として選択すればよい。このような基を有する式(I)の化合物をPDT用医薬として悪性腫瘍患者に投与して励起光を照射することにより、悪性腫瘍細胞内に取り込まれて該細胞内に特異的に存在する酵素又は活性酸素種の作用により生成した式(II)の化合物が光増感剤として機能し、該悪性腫瘍細胞を選択的に殺傷できる。

従って、本発明の式(I)で表される化合物は、レポーター酵素を発現させた細胞系における細胞生物学的研究用のツールとして用いることができ、またPDT用の医薬として用いることができる。
細胞生物学的研究においては公知の遺伝子導入方法を使用することができ、外界からの刺激への応答を光照射前後で比較することで、遺伝子導入された細胞の機能、役割を解析することができる。

上記医薬を用いる場合、その投与経路は特に限定されず、経口的又は非経口的に投与することができる。経口投与に適する投与単位としての製剤の例としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、又はシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する投与単位としての製剤としては、例えば、皮下、静脈内、若しくは筋肉内注射用の注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、又は貼付剤等を挙げることができる。上記医薬は、一般的には1種又は2種以上の製剤用添加物を用いて医薬用組成物として調製することが望ましい。製剤用添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、pH調節剤、安定化剤、噴射剤、又は粘着剤等を挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの製剤用添加物は当業者に汎用されており、製剤形態に応じて適宜の製剤用添加物を選択できることは言うまでもない。上記医薬の使用量は、PDTのための医薬（例えばローズベンガルなど）の投与量に準じて適宜選択すればよい。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：化合物４及び化合物５の合成
化合物４及び化合物５の合成スキームを以下に示した。

(A)化合物２の合成
化合物１をJ. Am. Chem. Soc., 127, pp.4888-4894 (2005)に記載された方法で合成した。化合物１(30 mg, 86 μmol)、炭酸セシウム(140 mg, 429 μmol)と2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-D-ガラクトピラノシルブロマイド (282 mg, 688 μmol)を無水ジメチルホルムアミド(3 mL)中アルゴン雰囲気下室温で4時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、水と飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、化合物２を得た(51 mg, 75 μmol, 収率88%)。
¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz):δ 2.03 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 4.14-4.26 (m, 3H), 5.12-5.19 (m, 2H), 5.48-5.57 (m, 2H), 6.40 (d, J=1.8Hz, 1H), 6.58 (dd, J=9.8 Hz, 1.8 Hz, 1H), 6.64-6.70 (m, 2H), 6.82 (dd, J=8.8 Hz, 2.0 Hz, 1H), 7.06-7.09 (m, 2H), 7.11 (d, J=9.8 Hz, 1H), 7.14 (d, J=8.8 Hz, 1H).
HRMS (ESI⁺): calcd. for [M+H]⁺, 679.2027, Found, 679.2015.

(B)化合物３の合成
少量の水に溶かしたヨウ素酸(18 mg, 104 μmol)を化合物２(47 mg, 63 μmol)とヨウ素(15 mg, 119 μmol)のエタノール(4 mL)溶液中に20分かけて滴下し、室温で15分撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、水と飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物３を得た(40 mg, 50 μmol, 収率 72%)。
¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): δ 2.03 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 4.16-4.30 (m, 3H), 5.15-5.24 (m, 2H), 5.25-5.33 (m, 2H), 6.62-6.74 (m, 3H), 6.89 (dd, 1H, J=9.0 Hz, 2.4 Hz), 7.05-7.14 (m, 2H), 7.17-7.24 (m, 2H).
MS (ESI⁺) 805 [M+H]⁺.

(C)化合物４の合成
化合物３(36 mg, 45 μmol)の2 mLメタノール溶液にナトリウムメトキシド (11 mg, 196 μmol)を加えた。0 ℃で1時間撹拌後、反応液をアンバーライトIR-120 plus (H⁺)で中和した。アンバーライトをろ過し、ろ液を減圧留去した。残渣を逆相プレパラティブTLC（RP18W）で精製し、化合物４を得た(22 mg, 45 μmol, 定量的)
¹H-NMR (CD₃OD, 300 MHz): δ 3.54 (1H, dd), 3.62 (s, 3H), 3.65-3.86 (m, 5H), 3.82 (s, 3H), 5.04 (d, 1H, J=7.7 Hz), 6.56 (d, 1H, J=9.7 Hz), 6.65-6.73 (m, 2H), 7.04 (dd, 1H, J=9.0Hz, 2.4 Hz), 7.09 (d, 1H, J=8.7 Hz), 7.14 Hz (d, 1H, J=9.7 Hz), 7.22 (d, 1H, J=9.0 Hz), 7.33 (d, 1H, J=2.4 Hz).
¹³C-NMR (CD₃OD, 75 MHz): δ 30.76, 56.22, 62.39, 70.15, 72.04, 74.72, 77.41, 80.70, 99.95, 102.40, 104.77, 106.59, 114.31, 116.69, 117.36, 120.29, 126.99, 131.69, 132.75, 133.24, 152.48, 156.03, 159.53, 160.87, 164.44, 164.53, 182.84.
HRMS (ESI⁺): calcd. for [M+H]⁺, 637.0571, Found, 637.0550.

(D)化合物５の合成
化合物４ (7 mg, 11 μmol)を無水ジメチルスルホキシド(100 μL)に溶解し、これを100 mmol/Lナトリウムリン酸緩衝液(pH7.4)を用いて最終的に3 mmol/L塩化マグネシウム、2000U β‐ガラクトシダーゼを含む溶液11 mLとして反応液を調整した。この反応液を37 ℃で30分撹拌した。反応液をジクロロメタンで抽出して有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、化合物５ (4.1 mg, 8.4 μmol, 収率 77%)を得た。
¹H-NMR (CD₃OD, 300 MHz): δ 3.74 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 6.65 (d, 1H, J=9.7 Hz), 6.76-6.83 (m, 2H,), 6.86 (dd, 1H, J=9.0 Hz, 2.0 Hz), 7.02 (d, 1H, J=2.0 Hz), 7.18 (d, 1H, J=8.8 Hz), 7.23 (d, 1H, J=9.7 Hz), 7.26 (d, 1H, J=9.0Hz).
¹³C-NMR (CD₃OD, 75 MHz): δ 56.14, 56.21, 79.79, 99.91, 103.44, 106.48, 114.63, 115.46, 118.10, 118.32, 125.17, 132.28, 132.64, 132.94, 153.63, 157.54, 159.48, 160.36, 164.38, 169.25, 181.50.
HRMS (ESI⁺): calcd. for [M+H]⁺, 475.0042, Found. 475.0090.

例２：化合物４及び化合物５の分光学的特性
化合物４及び化合物５の吸収及び蛍光スペクトル（励起波長490 nm）を測定した。測定は1 μmol/Lとなるように化合物４及び化合物５の0.1 mmol/L ナトリウムリン酸緩衝液（0.1%のジメチルホルムアミドを共溶媒として含む）を調製して行った。蛍光量子収率は0.1 mmol/L水酸化ナトリウム水溶液中でのフルオレセインを0.85として算出した。結果を図１及び表1に示す。

化合物４は蛍光を発しないが、化合物５は490 nmの励起光によって526 nmを極大波長とする蛍光を発した。

例３：化合物４及び化合物５の¹O₂生成能の測定
化合物４及び化合物４とβ-ガラクトシダーゼとの反応によって生成する化合物５に光照射し、生成する¹O₂をヨウ化物イオン（I^-）の酸化反応を追跡することにより測定した。リン酸緩衝液中で¹O₂によるI^-の酸化は図２に示したように進行し、生成する三ヨウ化物イオン（I₃ ^-）は351 nmに吸収を有するので、反応に伴う351 nmにおける吸光度の上昇を測定することにより化合物４及び化合物５の¹O₂生成能を測定することができる。

100 mmol/L ヨウ化カリウムを含むナトリウムリン酸緩衝液(100 mmol/L, pH7.4)に化合物４及び化合物５を1 μmol/Lとなるように溶解し、光照射（490 nm、2.7 mW）を行い、2分ごとに吸収スペクトルを測定してI₃ ^-に由来する351 nmの吸光度変化を追跡した。結果を図３及び表２に示す。表２中、ａ）slopeはI₃ ^-の生成速度を351nmの吸光度の時間変化より算出した値、ｂ）ε₄₉₀は490nmのモル吸光係数、ｃ）Φ_Δは¹O₂生成の相対効率をε₄₉₀とslopeから算出した値、ｄ）Φ_Δ(rel)は化合物４及び化合物５の¹O₂生成の相対効率とフルオレセインの¹O₂生成の相対効率との相対値、ｅ）ε・Φ_Δ(rel)は化合物５のI₃ ^-の生成速度と化合物４のI₃ ^-の生成速度との相対値をそれぞれ示す。

化合物４は光照射によってI^-の酸化反応をほとんど引き起こさなかったが、β-ガラクトシダーゼとの反応後に生成する化合物５では光照射に伴い顕著な351 nmの吸光度の上昇が観察されI^-の酸化反応を引き起こしていることが分かった。この化合物５によるI^-の酸化反応効率はコントロールとして用いたフルオレセインと比較して約5倍大きな値であり、酵素反応後の化合物５の¹O₂生成能が十分大きいことが分かった。以上の結果から、化合物４はβ-ガラクトシダーゼ依存的に¹O₂生成能が約20倍上昇するスイッチング能を有することが示された。

例４：化合物４を用いた細胞（lacZ(+)）への選択的酸化ストレス負荷
β-ガラクトシダーゼ依存的に¹O₂生成能が約20倍上昇する化合物４を（lacZ(+)）細胞及び（lacZ(-)）細胞に適用し、β-ガラクトシダーゼの発現の有無によって光照射に伴う酸化ストレス負荷（細胞死）に変化が認められるか否かを検討した。
試験は被検細胞としてlacZを発現したHEK293細胞（lacZ(+)）と発現していないHEK293細胞（（lacZ(-)）を用い、それぞれ以下の方法で行った。なお、HEK293細胞（lacZ(+)）とHEK293細胞（（lacZ(-)）はガラスボトムディシュ（無処理）に接着してDMEM（Dulbecco's modified Eagle medium）培地中で培養し、細胞密度が2〜5×10⁵ cell/mLとなったものを用いた。

(1)培地を除去し、細胞を2CaRinger（150 mmol/L 塩化ナトリウム、4 mmol/L 塩化カリウム、2 mmol/L 塩化カルシウム、1 mmol/L 塩化マグネシウム、 5.6 mmol/L グルコース、5 mmol/L HEPES（2-［4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル］エタンスルホン酸）、 pH 7.4） 1 mLで2回洗浄した。
(2)化合物４の25 μmol/L 2CaRinger液1 mL加えた。
(3)2 時間室温でインキュベートした。
(4)2CaRinger 1 mLで2回洗浄し、直ちに微分干渉コントラスト（DIC）像・蛍光像(NIBAフィルターを使用)を撮影した。
(5)490 nmの光（6.8 mW/cm²）を細胞の一部に1分間照射し、直ちにDIC像・蛍光像(NIBAフィルターを使用)を撮影した。
(6)細胞外液をDMEM培地 2 mLに換えてCO₂ インキュベーターに入れ、4 時間インキュベートした。4 時間後、2CaRinger 1 mLで2回洗浄した。
(7)細胞外液を2 μmol/L, Calcein/AM、4 μmol/L エチジウムホモダイマー-1 (EthD-1)の 2CaRinger液1 mLに換え、30 分間室温でインキュベート後、2CaRinger 1 mLで2回洗浄した。
(8)生死判別試験をCalcein イメージング(生細胞)及びEthD-1イメージング（死細胞）の二色蛍光イメージングによって行った。Calcein イメージングにはBP470-490励起フィルターとBA510-550蛍光フィルターを、EthD-1イメージングにはBP530-550励起フィルターとBA590蛍光フィルターを使用した。

結果を図４に示す。（A-C）は化合物４を取り込ませたHEK293細胞（lacZ(＋)）のDIC像（A）、光照射前の蛍光像（B）及び光照射後の蛍光像（C）を示している。（D-F）は化合物４を取り込ませたHEK293細胞（lacZ(‐)）のDIC像（D）、光照射前の蛍光像（E）及び光照射後の蛍光像（F）を示している。（G-R）は細胞の一部に光照射後、DMEM培地で４時間培養した後で観察した結果である。（G-I）は化合物４を取り込ませて光照射したHEK293細胞（lacZ(＋)）のDIC像（G）、calcein AM(生細胞マーカー)染色による蛍光像（H）及びEthD-1(細胞死マーカー)染色による蛍光像（I）を示している。（J-L）は化合物４を取り込ませて光照射しなかった時のHEK293細胞（lacZ(＋)）のDIC像（J）、calcein AM染色による蛍光像（K）及びEthD-1染色による蛍光像（L）を示している。（M-O）は化合物４を取り込ませて光照射したHEK293細胞（lacZ(‐)）のDIC像（M）、calcein AM染色による蛍光像（N）及びEthD-1染色による蛍光像（O）を示している。（P-R）は化合物４を取り込ませて光照射しなかった時のHEK293細胞（lacZ(‐)）のDIC像（P）、calcein AM染色による蛍光像（Q）及びEthD-1染色による蛍光像（R）を示している。スケールバーは5 μmを示している。

lacZ(+)細胞に化合物４を負荷すると細胞内で蛍光上昇が観察されたが(B)、lacZ(-)細胞では蛍光上昇が観察されなかった（E）。化合物４は無蛍光性であること、化合物４とβ-ガラクトシダーゼとの反応によって生成する化合物５が蛍光性を有していることから、以上の結果は化合物４が細胞膜を透過し、細胞内に取り込まれ後、lacZ(+)細胞においてはβ-ガラクトシダーゼと反応して化合物５に変換されたこと、及びlacZ(-)細胞においては化合物４は細胞内に取り込まれるもののβ-ガラクトシダーゼが存在しないため化合物５に変換されなかったことを示す。化合物５が生成したlacZ(+)細胞に1分間光照射（490 nm）を行うと速やかに化合物５の蛍光の褪色が観察された(C)。また光照射後細胞外液をDMEM培地に置換してCO₂インキュベーターで4時間培養を続けたところ、光照射した部位においてのみ細胞の形態に顕著な変化が見られた(G)。この細胞をCalcein/AMとEthD-1で染色し観察したところ、Calcein/AMの蛍光は観察されず、EthD-1の蛍光が観察されたことから死細胞であると判定された(H-I)。光照射を行っていない部位を観察したところ、大きな形態的変化はなく（J）、Calcein/AMとEthD-1の染色でも細胞が生存していることが確かめられた(K-L)。同様の条件でlacZ(-)の細胞に化合物４を負荷して光照射を行っても、細胞死は観察されなかった(M-O)。また、lacZ(-)細胞に化合物４を負荷したのみで光を照射しなかった細胞でも細胞死は観察されなかった(P-R)。
以上の結果より、化合物４を用いることで、光照射によってlacZ(+)の細胞だけに選択的に酸化ストレスをかけ、細胞死へと誘導できることが示された。

本発明により提供される式(I)で表される光増感用化合物を用いてPDTを行うことにより標的細胞を選択的に殺傷することが可能になるので、本発明の化合物は副作用が軽減されたPDT用医薬として極めて有用である。

Claims

下記の式(I)：
（式中、R¹は水素原子、置換基を有していてもよいC_1-12アルキル基、又は置換基を有していてもよいC_1-12アルコキシ基を示し；R²は置換基を有していてもよいC_1-12アルキル基又は置換基を有していてもよいC_1-12アルコキシ基を示し；R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、及びR⁸はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し；R⁹は酵素との接触により切断される一価の基又は活性酸素種との接触により切断される4-アミノフェニル基あるいは4-ヒドロキシフェニル基を示す。ただし、R ⁵ 及びR ⁶ が同時に水素原子であることはない。）で表される光増感用化合物。
上記の切断が酵素による加水分解により生じる請求の範囲第１項に記載の光増感用化合物。
R⁹がリン酸エステル加水分解酵素により切断されるホスホノ基である請求の範囲第２項に記載の光増感用化合物。
R⁹がβ-ガラクトシダーゼにより切断されるβ-ガラクトピラノシル基である請求の範囲第３項に記載の光増感用化合物。
フォトダイナミックセラピー用の医薬であって、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載の光増感用化合物を有効成分として含む医薬。
悪性腫瘍治療のための請求項５に記載の医薬。
下記の式(II)：
（式中、R¹¹は水素原子、置換基を有していてもよいC_1-12アルキル基、又は置換基を有していてもよいC_1-12アルコキシ基を示し；R¹²は置換基を有していてもよいC_1-12アルキル基又は置換基を有していてもよいC_1-12アルコキシ基を示し；R¹³、R¹⁴、R¹⁵、R¹⁶、R¹⁷、及びR¹⁸はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示す）で表される光増感剤。
細胞を殺傷するために用いる医薬であって、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載の式(I)で表される光増感用化合物を細胞内に導入し、該細胞において特異的に発現する酵素又は活性酸素種と上記式(I)で表される光増感用化合物とを接触させて請求の範囲第７項に記載の上記式(II)で表される対応の化合物を生成させ、その後、励起光照射を行って上記式(II)で表される化合物により活性酸素種を発生させて該細胞を選択的に殺傷する医薬。
悪性腫瘍の治療のために用いる医薬であって、ヒトを含む哺乳類動物に請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載の式(I)で表される光増感用化合物を投与して悪性腫瘍細胞内に該光増感用化合物を取り込ませ、該細胞において特異的に発現する酵素又は活性酸素種と上記式(I)で表される光増感用化合物とを接触させて請求の範囲第７項に記載の式(II)で表される化合物を生成させ、その後、励起光照射を行って上記式(II)で表される化合物により活性酸素種を発生させて該悪性腫瘍細胞を殺傷する医薬。