WO2004110139A1

WO2004110139A1 - ヒト由来免疫担当細胞の製造方法

Info

Publication number: WO2004110139A1
Application number: PCT/JP2004/008784
Authority: WO
Inventors: Fumihiko Ishikawa; Mine Harada; Masaki Yasukawa
Original assignee: Kyushu Tlo Company, Limited
Priority date: 2003-06-16
Filing date: 2004-06-16
Publication date: 2004-12-23
Also published as: US20060161996A1; EP1645183A4; US7960175B2; JP4609855B2; EP1645183B1; CA2529488A1; CN1835679A; JPWO2004110139A1; EP1645183A1

Abstract

　本発明は、ヒト由来リンパ系細胞を産生することができる免疫不全動物、及びヒト由来リンパ系細胞並びにヒト抗原特異的抗体産生の方法の提供を目的とする。　上記目的の解決手段は、ヒト由来造血前駆細胞が移植された幼若な免疫不全哺乳動物であって、当該ヒト由来の造血細胞又は免疫担当細胞を産生することができる前記動物、並びに、前記動物から免疫担当細胞を回収し、該免疫担当細胞を培養し、得られる培養物からヒト由来抗体を採取することを特徴とする抗体の製造方法である。

Description

明細書ヒト由来免疫担当細胞の製造方法技術分野

本発明は、ヒトリンパ系細胞と抗原提示細胞など免疫応答に必須なる種々の細胞の生体内増殖、及ぴヒト免疫系の再構築の技術に関する。背景技術

ヒト幹細胞に関する研究は、生体内で測定することが重要であることから、免疫不全げつ歯類、又はヒッジ胎仔（Flake, A. W. et al. , 1986. Science 233 : 776-778. )を用いた異種動物間移植に基づいて行われている。 Scid- huアツセィは、 McCuneらにより 1988年に報告されており (Science 241： 1632 - 1639 (1988) )、このアツセィはヒト細胞を CB17/SCIDマウスで検出した最初の例である。その後、ヒト造血細胞を移植するためのレシピエントとして、 NOD/SCID (Pflumio， F. et al. , 1996. Blood 88 : 3731-3740. )、 NOD/RAG- l^nu11 (Shultz, L. D. et al. , 2000. Journal of Immunology 164 : 2496-2507. ) _Λ beige/nude/ scid (Dao, M. A. , and J. A. Nolta. 1998. International Journal of Molecular Medicine 1 : 257 - 264. )又は N0D/SCID/ β 2M^nu11 (Kollet, 0. et. al.， 2000. Blood 95 : 3102- 3105. )等の免疫不全マウスが多く用いられている。

しかしながら、異種動物間の幹細胞移植のレシピエントとして使用されるマウスは、 8〜12 週齢の成体マウスであることがほとんどである。また、通常の成体 SCID マウスを用いた場合において移植片を長期間維持させるには外来性サイト力インの投与が必要となり、 T 細胞を前駆細胞から分化させることが困難である (Ito, M. et al.， 2002. Blood 100 : 3175—3182. )。発明の開示

本発明は、ヒト免疫系を異種動物宿主に構築させ、免疫反応を自然又は人為的に起こすことにより、必要とされるヒト免疫細胞、特に抗原特異的な T 細胞、 B 細胞や、免疫グロブリン、サイト力イン等を産生させることを目的とする。

本発明者は上記課題を解決するため銳意研究を行った結果、免疫不全動物に造血前駆細胞又は成熟造血細胞を移植することにより上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下のとおりである。

(1)ヒト由来造血前駆細胞又は成熟造血細胞が移植された幼若な（胎児から新生児を経て生殖年令に達するまでを含む）免疫不全哺乳動物（ヒトを除く）であって、当該ヒト由来の免疫担当細胞、及び/又は当該免疫担当細胞由来の生理活性物質を産生することができる前記動物である。また、本発明は、上記幼若な免疫不全哺乳動物（ヒトを除く）を飼育してなる免疫不全哺乳動物又はその子孫である。上記幼若な免疫不全哺乳動物としては、例えば新生児免疫不全哺乳動物又は胎児免疫不全哺乳動物が挙げられる。

また、上記造血前駆細胞としては、骨髄由来、臍帯血由来、動員（G-CSF)末梢血、 ES細胞由来中肺葉系細胞又は末梢血由来の細胞例示することができる。これらの細胞は、例えば、 CD34 陽性のもの（例えば CD34⁺細胞、 CD133+細胞、 SP 細胞、 CD34+CD38—細胞、 c - kit⁺細胞あるいは CD3\ CD4一、 CD8—及ぴ CD34+細胞のもの) が挙げられる。また、免疫担当細胞としては B細胞、 T細胞、樹状細胞、 NK細胞及ぴ NKT細胞からなる群から選ばれる少なくとも 1つが挙げられる。これら免疫担当細胞は、末梢血からレシピエントを殺すことなく採取可能であり、より多数の細胞、又は前記免疫担当細胞由来の生理活性物質（例えば免疫グロブリン、サイトカイン等）を精製する場合に、骨髄、脾臓、胸腺、リンパ節などを細胞源として利用することが可能である。免疫不全哺乳動物は免疫不全マウスであることが好ましい。上記の免疫グロブリンは、例えば、 IgG、 I_gM、 IgA、 IgD及び I_gEなどの全てのアイソタイプが含まれる。

(2) さらに、本発明は、ヒト由来造血前駆細胞又は成熟造血細胞を幼若な免疫不全哺乳動物（ヒトを除く）に移植することを特徴とする、当該ヒト由来の免疫担当細胞、及び/又は当該免疫担当細胞由来の生理活性物質を産生することができる動物又はその子孫の作製方法である。幼若な免疫不全哺乳動物としては、例えば新生児免疫不全哺乳動物又は胎児免疫不全哺乳動物が挙げられる。また、造血前駆細胞としては、骨髄由来、臍帯血由来、動員（G-CSF)末梢血、 ES 細胞由来中肺葉系細胞又は末梢血由来の細胞を例示することができる。これらの細胞は、例えば、 CD34陽性のもの（例えば CD34+細胞、 CD133+細胞、 SP細胞、 CD34+CD38-細胞、 G - kit+細胞あるレ、は CD3 CD4\ CD8—及び CD34+細胞のもの）が挙げられる。免疫担当細胞としては、 B細胞、 T細胞、榭状細胞、 NK細胞及ぴ NKT細胞からなる群から選ばれる少なくとも 1つが挙げられる。また、生理活性物質としては、例えばサイトカイン及び/又は免疫グロプリンが挙げられる。上記の免疫グロプリンは、例えば、 IgG、 IgM、 IgA、 IgD及ぴ IgEなどの全てのアイソタイプが含まれる。免疫不全哺乳動物は免疫不全マウスであることが好ましい。

(3) さらに、本発明は、前記免疫不全哺乳動物又はその子孫から免疫担当細胞を回収し、当該免疫担当細胞を抗原又は適切な刺激物質の存在下で培養し、得られる培養物からヒト由来抗体を採取することを特徴とする前記抗体の製造方法である。免疫担当細胞としては、 B細胞、 T細胞、樹状細胞、 NK細胞及び NKT細胞からなる群から選ばれる少なくとも 1つが挙げられる。

(4) さらに、本発明は、前記免疫不全哺乳動物又はその子孫を抗原又は刺激物質で免疫し、得られる免疫動物から当該ヒト由来抗体を採取することを特徴とする前記抗体の製造方法である。抗体の採取源としては、例えば血漿又は血清が挙げられる。

(5) また、本発明は、前記免疫不全哺乳動物又はその子孫に、細菌、ウィルス、腫瘍細胞及ぴ腫瘍抗原べプチドからなる群から選択されるいずれかのものが投与された疾患モデル動物又はその子孫である。上記疾患には、感染症を挙げることができる。

(6) 本発明は、被験物質を、前記免疫不全哺乳動物若しくはその子孫又は前記感染症動物若しくはその子孫に投与して、被験物質の有効性を評価することを特徴とする、免疫関連医薬のスクリーニング方法である。免疫関連医薬には、ヮクチン、抗ウィルス薬や抗生剤も含まれる。また、前記方法は、本発明のヒト抗体に対する免疫応答及ぴアレルギーに対する安全性確認（特に前臨床試験段階）において有用である。

(7) 本発明は、前記免疫不全哺乳動物又はその子孫から免疫担当細胞を回収することを特徴とする前記免疫担当細胞の製造方法である。

(8) 本発明は、前記免疫不全哺乳動物又はその子孫から回収された免疫担当細胞である。

(9) 本発明は（8)記載の免疫担当細胞を含むワクチンである。

(10) 本発明は、前記疾患モデル動物又はその子孫から免疫担当細胞を回収することを特徴とする前記免疫担当細胞の製造方法である。

(11) 本発明は、前記疾患モデル動物又はその子孫から回収された免疫担当細胞である。

(12) 本発明は（11)記載の免疫担当細胞を含むワクチンである。

(13) 本発明は、前記疾患モデル動物又はその子孫から回収されたヒト由来抗体である。

(14) 本発明は、前記免疫担当細胞を抗原又は刺激物質の存在下で培養した培養物から採取されたヒト由来抗体である。

(15) 本発明は、疾患モデル動物又はその子孫から回収されたヒト由来抗体である _c

(16) 本発明は、（15)記載のヒト由来抗体を含むワクチンである。図面の簡単な説明

図 1 Aは、レシピエントマウスにおけるヒト B細胞系（CD19+細胞）の再構築を示す図である。

図 1 Bは、レシピエントマウスに各種ヒト免疫グロブリンの発現を示す図である。

図 2は、 OVA特異的 I_gMの ELISAの結果を示す図である。

図 3は、レシピエントマウスの骨髄、脾臓及ぴ末梢血におけるヒト T細胞系の再構築を示す図である。

図 4は、リンパ系組織の FISH解析及び免疫組織学的解析の結果を示す図である _c 図 5は、 N0D/SCID/IL2rg- null マウスの骨髄（BM)におけるヒト赤血球構成物の同定を示す図である。

図 6は、 N0D/SCID/IL2rg-nullマウスの BM及び脾臓におけるヒト B細胞発生を示す図である。

図 7は、 CD19⁺ B系細胞におけるヒト免疫グロブリンの発現を示す図である。図 8は、 N0D/SCID/IL2rg- nullマウスにおけるヒト T細胞の発生を示す図である。

図 9は、 N0D/SCID/IL2rg- null マウスの脾臓におけるヒト樹状細胞の存在を示す図である。

図 1 0は、 N0D/SCID/IL2rg- null マウスの腸管における粘膜免疫の発生を示す図である。

図 1 1は、卵白アルブミンによる免疫に続く IgG⁺細胞の誘導を示す図である。図 1 2は、 N0D/SCID/IL2rg - nullマウスで産生したヒト T細胞によって介される同種異型標的細胞に対する細胞毒性を示した図である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明はヒト造血系細胞を異種哺乳動物の生体内で分化、増殖させ、異種哺乳動物においてヒト免疫系を再構築させようとして完成されたものである。具体的には、ヒト由来の造血前駆細胞を宿主である幼若な免疫不全哺乳動物（例えば SCIDマウス）に移植し、当該宿主内でヒト由来細胞を分化及ぴ増殖させることを特徴とするものである。すなわち、ヒト免疫系及ぴ造血系を免疫不全動物の体内を利用して構築するシステムを利用して、ヒト抗体の産生及ぴ腫瘍又はウィルス抗原特異的ワクチンの開発に応用することが可能である。

1 . 幼若な免疫不全哺乳動物

本発明において、ヒト由来の造血前駆細胞を移植するためのレシピエントとして使用される動物は、ヒトを除く免疫不全哺乳動物である。本発明において「幼若な」動物とは、胎児から新生児を経て生殖年令に達するまでを含み、好ましくは、胎児及び生後 7日以内、より好ましくは生後 2日以内の新生児である。幼若な免疫不全哺乳動物をレシピエントとして用いると、個体の成長に伴ってヒト免疫担当細胞も効率的に増殖するため、本発明では幼若な個体を用いることが好ましい。

哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、羊、ミ二ブタ、ブタ、サルなどが挙げられる。モデル動物が豊富であり、系統が確立されている点で免疫不全マウスであることが好ましい。免疫不全マウスとは、 T 細胞及ぴ B細胞の生産能を欠く重症複合免疫不全マウス（SCIDマウス）を意味し、特に、 NK細胞の活性を持たない N0D/SCID/ J3 2ミクログロブリンノックアウトマゥス（N0D/SCID/B2M)や NOD/SCID/common γ -chain ノックアウトマウスが好ましい。この SCIDマウスの幼若な個体を使うと、マウス生体内にヒト由来免疫細胞及ぴ造血細胞を高率に産生させることができる。上記 SCIDマウスは市販されており (Jackson Laboratory) , 当業者であれば容易に入手することが可能である。

2 . 細胞の調製及び移植

移植の対象となる造血前駆細胞は、例えば臍帯血、骨髄、末梢血、動員（G- CSF) 末梢血、 ES細胞由来中肺葉系細胞から得ることができるが、臍帯血が好ましい。臍帯血（CB) 細胞は、臨床検体（例えば臨床検査等が済んで細胞数の問題や家族歴の問題から廃棄の対象となった検体）を日本赤十字センター臍帯血バンクから得ることが可能である。また、骨髄細胞は、骨髄パンクから得ることも、骨髄穿刺によって採取された細胞、又はそのうち廃棄の対象となる細胞から得ることもできる。末梢血は、一般的血液検査に使用するために採取した血液又はその廃棄対象血液を使用することができる。また、末梢血中の幹細胞集団をより効率良く取るには、 G-CSF により骨髄中の幹細胞を動員させたあとに採取することも可能である。

次に、単核細胞（M Cs) を密度勾配遠心により上記細胞から単離する。

本発明において移植に使用される細胞は、例えば CD34陽性（CD34⁺、 CD133+細胞、 SP 細胞、 CD34⁺CD38—細胞、 c- kit⁺細胞）を表す細胞、すなわち造血前駆細胞又は成熟造血細胞である。 CD34⁺細胞は、試料を抗ヒト CD34 ミクロビーズとともにィンキュベートすることにより得ることができる。

上記造血前駆細胞源となる試料中には、造血前駆細胞のほかに T細胞に分化した細胞が含まれている。そこで、そのような T細胞を除去するために、 T細胞マ一力一に対する抗体を反応させることもできる。例えば、丽 Csをマウス抗ヒト CD3、 CD4及び/又は CD8抗体とともにインキュベートする。これを洗浄後、細胞をヒッジ抗マウス免疫磁気ビーズとともにィンキュベートし、未結合の細胞を回収する。 CD3、 CD4及び CD8はいずれも T細胞のマーカー（表面抗原）であるため、これらの抗原に対する抗体を用いて上記処理を行うことにより、 T 細胞が除去される。このようにして得られる前駆細胞の細胞表面抗原は、 CD3陰性（CD3— )、 CD4陰性 (CD4— )、 CD8陰性（CD8—)である。次に、 T細胞を除去した試料を抗ヒト CD34 ミク口ビーズとともにィンキュベートする。この操作により、 CD³4⁺を表す造血前駆細胞を得ることができる。そして、濃縮された CD34+細胞の純度が好ましくは 90% 以上となるように、細胞を磁気カラムにかける。

成熟造血細胞は、造血幹細胞おょぴ造血前駆細胞などの増殖能力を利用して、特にサイトカインなどの助けを必要とすることなく得ることができる。ただし、 G- CSF、 Steel factor, GM- CSF、 TP0、 EPOなどのサイトカインを投与することで、特定の分画を効率良く得ることも可能である。

本発明の動物は、レシピエント動物を予め放射線全身照射した後、所定の量に調製した造血前駆細胞又は成熟造血細胞をレシピエント動物（N0D/SCID/B2M、 N0D/SCID/IL2rg-null マウス等）に移植することにより得ることができる。移植する細胞数は、動物の種類に応じて適宜定めることができる。例えば、 SCIDマウスをレシピエントとした場合において、造血細胞を移植するときは 1匹あたり少なくとも 1 X 10³個であり、上限は特に限定されるものではない。好ましくは、 1 X 10³個〜 1 X 10⁷個の細胞を使用することができる。多数の細胞により、より高率なヒト細胞の分化が期待できる。

移植は、静脈経由が好ましいが、腹腔、心腔内、肝臓内移植であってもよい。静脈経由で移植する場合は、顔面静脈、尾静脈などから細胞を注入する。この場合、 26〜30ゲージ（G)の注射針（例えば 29G) を用いればよい。例えば、 T細胞が除去された 1 X 10⁵個の CB細胞（CD3— CD4— CD8—CD34+)を静脈注射により、予め lOOcGy の全身照射を受けた幼若な N0D/SCID/B2Mマウス、又は NOD. も- Prkdc^scidマウスに移植するのが望ましい。

細胞の移植後、無菌管理を十分に行いながら飼育する。「無菌管理」とは、感染症などの病原微生物や抗原物質を含まないように管理することを意味し、いわゆる SPF (Specific pathogen free) レベルの無菌室での飼育、放射線照射した餌（又は低分子化した餌）を給餌すること、あるいは滅菌水を与えることをいう。マウスの場合は、 2週〜 16週、好ましくは 3〜4週の間、上記無菌管理下で飼育すれば、免疫細胞の回収又は免疫に用いることができる。本発明においては、このような飼育された動物も提供される。このような本発明の動物には、その子孫も含まれる。子孫は、無菌環境が維持される限り、通常の交配により得ることができる。上記の通り得られた「ヒト型化動物」の体内はドナー（ヒト）由来の免疫系が確立されており、ヒト由来の免疫担当細胞などを回収することができる。本発明において、「免疫担当細胞」（免疫細胞ともいう）とは、免疫応答を成立させる細胞を意味し、抗体産生細胞又は造血細胞、具体的には B細胞、 T細胞、樹状細胞、 NK細胞、 NKT細胞などが挙げられる。

免疫担当細胞は、全身免疫、粘膜免疫（後述）のみならず、各組織においても宿主及びその組織を守るという役目を担っている。例えば、皮膚であれば、 Langerhans細胞が抗原提示を行って、真皮において動員される T細胞、 B細胞が機能する。肝臓においては、 Kuppfer 細胞が貪職能力を有している。また、神経系では、 Microglia 細胞が、神経変性を予防するべく、不要な物質を食食する。従って、本発明において、各組織における免疫担当細胞についても、ヒト免疫系を構築している。

これらのヒト由来細胞のレシピエント由来の細胞に対する比率は、造血細胞については 5〜90%、好ましくは 20〜90%であり、抗体産生細胞については 2〜 80%、好ましくは 10〜80%である。上記免疫担当細胞は、ドナーであるヒト由来の細胞であり、これらの細胞から各種生理活性物質が産生される。単球ゃ樹状細胞などが、主な抗原提示細胞

(Antigen-presenting cell) として機能する。生理活性物質としては、例えばサィトカイン、免疫グロブリンなどが挙げられる。サイトカインは、各種の血球細胞の増殖と分化を制御するタンパク質性の生理活性物質であり、インターロイキン（IL)、コロニー刺激因子（CSF)、ケモカインなどを例示することができる。これらサイト力インの異常な分泌や制御の調節破綻が各種病態と密接に関連していることが近年示唆されている。また、これらの産生減少は重症感染症に対して一種の免疫不全状態を呈する可能性が高い。また、免疫グロブリン（Ig) は、抗体の機能及び構造をもつタンパク質であり、アイソタイプには IgG、 IgM、 IgA、 IgD、 IgEがある。本発明の免疫グロブリンには、全てのアイソタイプが含まれる。 IgG 及ぴ IgAについては、それらのサブクラス（それぞれ G1〜G4、 A1〜A2)も存在し、上記免疫グロブリンに含まれる。

B細胞は表面または細胞内に Ig受容体を発現するリンパ球であり、 IgG、 IgM、 IgA、 IgDなどの免疫グロブリン、あるいは IL- 6などのサイトカインを産生する。 T 細胞は、免疫応答に関与するリンパ球であって胸腺で分化、成熟する細胞であり、 IL- 2〜； [L - 6、 IL- 9、 IL- 10、 IL-13、 IL- 14、 IL - 16などを産生する。樹状細胞は、免疫応答の開始時に捕助細胞（アクセサリー細胞）として働く樹状突起をもつた細胞であり、クラス II 主要組織適合 (MHC)抗原を発現してヘルパー T細胞への抗原提示細胞として機能する。 NK (ナチュラルキラー）細胞は、ウィルス感染細胞や腫瘍細胞などに対し、 MHC抗原に拘束されずに細胞傷害活性を示す細胞である。 NKT (ナチュラルキラー T) 細胞は、 T細胞受容体及び NK細胞マーカー（例えば CD16、 CD56) を併せ持つ細胞であり、糖脂質である αガラクトシルセラミド

( a GalCer) の刺激により IFN- γや IL- 4を産生する。

3 . キメラ現象の確認及び抗体及びワクチンの産生

ヒト由来細胞がレシピエント動物において発現していることの確認は、レシピェント動物の末梢血、骨髄細胞、その他免疫組織を採取して、これらがヒト由来のものであることを確認すればよい。

例えば、レシピエントを免疫不全マウスとした場合は、移植後 3週から 3箇月の間に、末梢血は眼窩後叢から、骨髄細胞は大腿骨と脛骨から採取する。また、脾臓、リンパ節及び胸腺を切除後、細片化し、分離した細胞をメッシュフィルタ一に通して単一細胞懸濁液を得る。これらの細胞を FACSCalibur又は FACSVantage (Becton Dickinson) を用いたヒト CD45 (白血球共通抗原、造血系細胞の主要膜糖タンパク質）の発現解析により、ドナー由来の造血細胞であることを同定する。マウス抗ヒト抗体等により染色することも可能である。

また、本発明の動物は、ドナーであるヒト由来の免疫系が確立されている。特に、マウスの場合、骨髄、脾臓、リンパ節、末梢血、胸腺はほぼ 100%に近いヒト細胞で置換されている（以下、このようなマウスを本発明においては「ヒト型化マウス」とも呼ぶ）。従って、免疫担当細胞である B細胞（抗体産生細胞）、 B細胞を高率に含む脾臓細胞等を抗原又は適当な刺激物質で刺激することにより、ヒト由来抗体を産生させることができる。例えば、本発明の免疫担当細胞を細菌、ウィルス、腫瘍（腫瘍細胞、抗原ペプチド等を含む）の存在下で培養することによりヒト由来抗体の産生を促すことができる。抗体の産生能の測定は、 B細胞の表面抗原は CD19陽性（CD19⁺) を表すため、 CD19+細胞における IgM、 I_gG、 IgD及びの発現をセルソーター等により解析する。

さらに、本発明の動物を所定の抗原又は適当な刺激物質で免疫し、得られる免疫細胞から抗体を採取することにより、ドナー（ヒト）由来の抗原特異的抗体を得ることができる。例えば、本発明の動物又はその子孫に細菌、ウィルス、腫瘍 (腫瘍細胞、抗原ペプチド等を含む）を投与することにより、あるいは、本発明の動物又はその子孫から得た組織又は細胞を細菌、ウィルス、腫瘍（腫瘍細胞、抗原ペプチド等を含む）の存在下で培養することにより、ヒト由来抗体の産生を促し、また、ワクチンを開発することができる。前記の刺激によりパルス（刺激）された樹状細胞は、 T 細胞を効率よく誘導できることが知られている。従って、生体内でパルスした樹状細胞を選択して、ワクチンとして応用することも可能である。抗原又は適当な刺激物質の動物 1匹当たりの投与量は、マウスの場合、 10 μ g 〜l mgであり、アジュバントの有無によって適宜調節する。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（FCA)、フロイント不完全アジュパント（FIA)、水酸化アルミニウム等が挙げられる。

抗原又は適当な刺激物質の種類は特に限定されるものではなく、タンパク質、ペプチド、レクチンなどが挙げられる。

投与部位は静脈内、皮下、足（food pad)又は腹腔内である。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは 1〜2週間間隔で、 1〜3回の免疫を行う。そして、最終免疫後約一週間から二週間後に血清又は血漿中の抗体価を測定し、抗血清又は抗血漿を得る。抗体価の測定は、酵素免疫測定法 (ELI^A ； enzyme- linked immunosorbent assay) , 放射性免疫測定法（RIA ； radio i謹 no assay)等により行うこと力 ^sできる。

抗血清又は抗血漿から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、ァフィ二ティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより抗体を精製することができる。

大動物、特に免疫不全プタをレシピエントとして用いると、抗体産生において量的な利点がある。当該大動物としては、例えば IL7R、 IL2R co讓 on gamma chain, Jak/Stat, RAG - 1、 RAG - 2などをノックアウトして作製された免疫不全動物が挙げられる。

一方、質の高いワクチンの開発には、レシピエントに小動物を用いることが望ましい。小動物では、さまざまなペプチドや抗原などが、ヒト免疫系を有する本発明の動物の生体内でどの程度有効な抗腫瘍効果を有するのか、あるいはぺプチド認識効率を有するのかを容易に判定することができる。また、本発明者が開発した白血病細胞の生体内評価システムを用いれば、開発したヮクチンゃ樹状細胞、あるいは T細胞が、生体内で増殖した白血病細胞などの腫瘍細胞に、どの程度有効であるかも評価することが可能である。

従って、本発明は、被験物質を本発明の動物（幼若個体、生体、子孫、モデル動物を含む）に投与して、被験物質の有効性を評価することを特徴とする免疫関連医薬のスクリーニング方法を提供する。「免疫関連医薬」は例えば抗体医薬、ヮクチン（ペプチドゃ樹状細胞など）が代表的なものであり、抗ウィルス薬ゃ抗生剤などの感染症に対する薬剤も含む。さらに、サイト力イン療法を含む液性因子も広く含む。免疫関連医薬の投与量及び投与方法については、体表面積、体重及ぴ性別を基準として設定することが可能であり、特に静脈内、骨髄内、腹腔、肝臓、皮下などが主たる投与経路である。免疫関連医薬の対象疾患は極めて広く、例えば、腫瘍性疾患、自己免疫疾患、ウィルス性疾患、真菌性疾患、神経性疾患、寄生性疾患、難病、バクテリア性疾患、ミコパクテリゥム疾患、関節リウマチや SLE などの膠原病、白血病やリンパ衆などの造血器悪性疾患、固形腫瘍、良性の造血器および固形腫瘍性疾患、花粉症、アレルギー、アトピー、エイズなどが挙げられる。

また、当該方法は、本発明のヒト抗体に対する免疫応答及びアレルギーに対する安全性確認（特に前臨床試験段階）において有用である。

本発明の動物またはその子孫は、粘膜免疫、消化管免疫、気道免疫もヒト免疫系で構築されている。ここで、粘膜免疫とは、特に IgAなどの分泌型の免疫グロプリンを産生し、粘膜固有のリンパ小節やパイエル板などの T細胞を多数含む組織などにおける免疫をさす。消化管免疫とは、経口摂取により体内に取り込まれる細菌などの抗原に対して、不要なもの又は体に有害となるものを排除するシステム全般をさす。また、気道免疫とは、消化管免疫と同様に分泌型の免疫グロブリンを産生し、気道（鼻腔から気管支、肺胞）を経て侵入する外来性抗原に対する免疫応答全般を含むものである。

本発明のヒト型化動物における粘膜免疫系を利用すると、経口ワクチン開発、消化管感染症の解明、食物アレルギー病態の解明、アレルギー薬開発等を行うことができ、当該免疫系の応用範囲は極めて広いものである。例えば、経ロワクチンには、古典的にはポリオに対するものがよく知られているが、致死的な食中毒を引き起こす 0157ゃコレラ、赤痢などの感染症に対するものが望まれる。本発明の疾患モデル動物若しくはその子孫のから回収される体液（主に血清）若しくは細胞、又は本発明の免疫担当細胞を上記ワクチンとして用いることができる。また、クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症成長疾患は、免疫系の異常が原因とも言われている。従って、本発明の動物、方法、抗体、ワクチン等を用いたこれらの病態解明、幹細胞移植や τ細胞注入などによる新規治療法の開発なども今後応用できる。

また、本発明の動物又はその子孫は疾患モデル動物（特に感染症モデル動物、腫瘍モデル動物）として用いることができる。その中でも、特にウィルス感染症モデル動物として期待される。特にウィルスは、種特異的であるために、ヒトの HIV, HSVなど現在臨床上重要と思われているウィルスはマウスに感染しない。従つて、これまではマウスヘルぺス、マウスレトロゥイノレスなど同じ系統のウイノレスを用いて感染実験を行うのみで、 HIV を直接用いることができないことが問題であった。本発明のモデル動物は、ヒトの免疫系を保有するために、疾患モデルは、細菌、真菌、ウィルスをマウスに感染させることで作製することができる。本発明の疾患モデルは、抗原を i g〜mg 単位において、様々な量を投与することで得ることができる。投与経路は、前述したとおり、静脈、骨髄、肝臓、腹腔、皮下などを例示することができる。抗原については、細菌、真菌、ウィルスの他、 OVAだけではなく、タンパク、ペプチド、細胞などをふくむ。

例えば、本発明者はすでに、 HIV， HTLV-1 などのウィルスの生体内での観察において、彼等が宿主とするヒト CD4陽性細胞が、マウス体内で、例えば幹細胞から分化し、成熟 T細胞が直接生着することを効率に確認している。従って、上記のウィルスを含めた数々の臨床上問題となるウィルスの感染実験に用いることが期待される。

4 . その他のキメラ現象の試験

(1) 組織学的解析

レシピエントマウスを解剖後、組織を固定化又は凍結する。パラホルムアルデヒド固定化組織は、段階的な濃度のアルコールを用いて脱水し、パラフィンに埋め込むことが好ましい。ミクロトーム又はクライオスタツト等を用いて切片を作製し、それぞれの切片について、通常の免疫組織染色を行うことができる。

(2) 蛍光 in situハイブリダィゼ"シヨン（FISH) 法

FISH法とは、染色体の遺伝子座位を決める周知技術であり、蛍光物質などにて標識した一本鎖プローブ DNAを染色体 DNAの相補性部位でハイブリダイズさせ、特異的に求める細胞などの部位を顕微鏡下で同定するというものである。実施例

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

〔実施例 1〕免疫不全マウスへのヒト造血細胞の移植

臍帯血（CB) 細胞を日本赤十字センター臍帯血バンクから得た。書面によるィンフォームドコンセントを得た後に、廃棄対象となった臍帯血から CB細胞を採取した。単核細胞（MNCs) を、密度勾配（リンパ球分離培地、 ICN Biomedicals) を用いて 370 X g、 30分間の遠心により CBから単離した。 MNCsをマウス抗ヒト CD3、 C D4、 CD8抗体（BD Immunocytometry) とともに、 4°Cで 30分間ィンキュベートした。洗浄後、細胞をヒッジ抗マウス免疫磁気ビーズ（DYNAL) とともに 4°Cで 30分間インキュベートし、未結合の細胞を回収した。 CD34+集団を単離するために、 T細胞除去試料を、抗ヒト CD34ミクロビーズ（Miltenyi Biotech) とともに 40分間ィンキュペートした（製造者プロトコールにしたがった。）。細胞を磁気カラムに 2回通した結果、濃縮された CD34+細胞の純度は 90%以上となった。

上記のように調製した CB細胞（CD3-CD4— CD8— CD34⁺、 1 X 10⁵個）を、予め 100cGy の全身照射を受けた新生児 N0D/SCID/B2Mマウス（Jackson Laboratory) に静脈注射により移植し、ヒト由来免疫細胞を初めとするヒト免疫系が構築されたマウスを作製した。

〔実施例 2〕マウス生体内におけるヒト由来 B系細胞の解析

マウス生体内におけるヒトリンパ細胞の再構築の有無を調べるため、ヒト CD45+ 細胞であって CD19+細胞（B細胞）の移植レベルについて、多重造血組織解析を行つた。

移植後、飼育 3箇月目のレシピエントマウスの骨髄（BM)、脾臓、末梢血（PB)、リンパ節（LN)の中にヒト由来 B系細胞が存在するか否かを解析した。 BM、脾臓、 PB、 LNを FITC結合免疫グロブリン及ぴ PE結合 CD19で染色した。

結果を図 1 A及び図 1 Bに示す。図 1 Aにおいて、 aは BM、 bは脾臓、 cは PB、 d は LNから採取した細胞のフローサイトメトリーである。各リンパ組織において、高レベルのヒト CD45+CD19+細胞が同定された。図 1 Aの a〜dに示す各数値（それぞれ 64. 6, 23. 6, 50. 1， 44. 6)は、各組織から採取した細胞全体の中に占める CD45+CD19+細胞の比率（％) を示す。

また、図 1 Bの 16枚のパネルにおいて、 1段目（e)、 2段目（f )、 3段目（g)、 4 段目（h)のパネルは、それぞれ BM、脾臓、 PB、 LN 由来の造血細胞を、 FITC-結合 IgM (1 列目）、 IgD ( 2列目）、 IgG ( 3列目）、 IgA ( 4列目）及ぴ PE-結合 CD19 抗体により染色したときの結果を示す。各パネル内の数値は、 CD19+細胞の中の免疫グロブリンの各クラスを発現する細胞の比率（％) を示す。例えば eの 1列目の 90. 1は、 IgMを発現する骨髄由来細胞の比率である。

これらの結果から、 BM、脾臓、 PB、 LNの各組織において、ヒト由来免疫グロブリンが高率に発現していることが示された。

次に、マウスにおいて生着したヒトリンパ系細胞の抗原特異性応答を調べるため、実施例 1で作製したマウスを 100 gの卵白アルブミン（OVA)で免疫し、 OVA- 特異的 IgM及び IgGの存在を ELISAにより解析した。レシピエントマウスの血漿を 10倍（IgM解析用）又は 3倍（IgG解析用）に希釈し、各サンプルについて吸光度を測定した。また、レシピエントマウスから B細胞を採取し、 RPMI/FCS (ゥシ胎児血清）/ Pokeweed mitogen培地で 5日培養した。その後培養上清中の免疫グロブリンを ELISAにより測定した。陰性対照として、ヒト血清中の免疫グロブリンを測定した。

結果を図 2に示す。図 2においてパネル aは I_gM、パネル bは IgGについての結果である。グラフは、左から血漿、培養上清、陰性対照 1 (ヒト血清）、陰性対照 2 (陰性対照 1の血清の 1/10量）を示す。図 2より、抗原特異的 IgM及び IgG が高率に産生されていることが示された c

〔実施例 3〕 B系細胞の分化と成熟化

レシピエントマウスの末梢血（PB)、骨髄（BM) 及び脾臓からセルソーターによりヒト CD19⁺細胞（B細胞）を採取し、 B細胞による IgM、 IgG、 IgD及び IgAの発現を調べた。 CD19⁺細胞における IgM/IgD の表面発現は PBでは 90. 0/_β/54· 0%、 BM では 19. 7%/3. 4°/o 脾臓では 59. 0%/22. 7%であった。

脾臓細胞をさらにャマゴボウマイトジェン（P丽）を用いて試験管内で 5 日間培養した。また、 100 /x g/mlの OVAで免疫したレシピエントマウスも作製した。続いて、培養上清及ぴ血漿中へのヒト免疫グロブリンの分泌を ELISAを用いて調べた（表 1)。 PWMを用いた 5日間培養の培地（上清）は、 114 ng/ml〜19. 8 μ g/ml の IgM、2. 6〜47. 6 ng/mlの IgG、及び 1. 9〜5. 7 ng/mlの IgAを含んでいた（表 1)。ヒト免疫グロプリンの産生

試料血漿/ "免疫原 IgM IgG IgA

1 血漿 ZOVA 225000 823 553

2 培地/ OVA 19800 47. 6 5. 7

3 血漿 23000 13 40

4 培地 114 2. 6 1. 9

5 血漿 47700 4. 1 10. 3

6 血漿 17200 5 9. 4

(産生量単位 ng/ml) レシピエントマウスから採取した血漿は、 17. 2〜225 i g/mlの IgM、 4. 1〜823 ng/mlの IgG、及ぴ 9. 4〜553 ng/mlの IgAを含んでいた。

表 1に示す通り、レシピエントマウスを OVAで免疫した場合、ヒト B細胞は、 0VA特異的 IgMを含めて、多量の IgM、 IgG及び IgAを分泌した。従って、本実施例において、新生児 N0D/SCID/B2Mマウスにおいて産生されるヒト B細胞は、成熟してヒト由来 IgM及ぴ IgDを産生し、さらに抗原特異的かつヒト由来の IgM、 IgG 2004/008784 及び I_gAを産生する機能を有することが示された。

これらの知見から、本発明のマウスにより得られる B細胞は、ヒト抗体産生細胞として使用するに止まらず、重症感染症の病原微生物や腫瘍に対するヒト免疫グロブリン（モノクローナル抗体）を産生するため極めて有用であることが示された。

〔実施例 4〕マウス生体内におけるヒト由来 T系細胞の解析

本実施例では、レシピエントマウスの BM、脾臓及び PBにおけるヒト T細胞の存在（CD45及び CD3)についてフローサイトメトリー解析を行なった。

結果を図 3に示す。図 3 a〜cの各パネルはそれぞれ BM (a)、脾臓（b)、 PB (c)の解析結果である。 T細胞は、 B細胞と比較して少数ではあるが分化しており、レシピエントへの移植後 3箇月目の CD3+細胞は、 BMで 0. 17¾、脾臓で 1. 44% 、 PBで 1. 8%であった。

HLA— DR⁺CDllc⁺表現型を特徴とする抗原提示細胞 (APCs) は、 BMで 1. 09% (図 3 d) であった。なお、胸腺において、 CD19⁺IgM⁺の B細胞が同定された（図 3 e)。

〔実施例 5〕リンパ系組織の FISH解析と免疫蛍光分析

in situ でのヒトリンパ細胞の分布を調べるために、レシピエントマウスに由来する脾臓を用いて、ヒト及びマウス染色体について二重 FISH解析を行なった。 FISHは、常法に従った（Vysis)。サンプル角爭析には、レーザースキャニング共焦点顕微鏡（LSM510Meta : Carl Zeiss)を用いた。

ヒト X染色体プローブを用いた実験から、 FACS分析の結果に矛盾しない高頻度のヒト細胞が得られた。ヒト及ぴマウス X染色体を用いた二重 FISH分析から、マウス起源の間質細胞も、脾臓に存在することが明らかとなった（図 4 )。

ヒト細胞は、緑色のシグナル（ヒト X染色体）として同定された（図 4 a)。レシピエントマウス由来の脾臓細胞の一部は、マウス抗ヒト CD3で赤色に染色された (図 4 。図 4 bはパネル aと bを重ね合わせた図であり、青く染まっている箇所は核を示す。 2004/008784 レシピエントマウスは、移植前にはいずれの成熟リンパ細胞も欠いているが、ヒト CB由来 T細胞除去 CD34+細胞を移植することにより、マウス内でヒト由来リンパ系組織をうまく再構築することができた。

また、組織標本について免疫組織染色を行なった。マウスから採取した脾臓組織の免疫組織染色の結果を図 4 d及ぴ eに示す。大多数の脾臓細胞は、抗ヒト IgM 陽性（d)、抗ヒト IgD陽性（e) に赤く染色され、極めて高率にヒト由来脾臓細胞が生着ていることが示された。さらに、脾臓組織をマウス抗ヒト CD3で染色した結果、脾臓の一部が抗ヒト CD3で陽性（赤色）に染色された（図 4 f)。そして、濾胞樹状細胞に対する特異抗体を用いて免疫染色を行うことにより、ヒト APCs の存在も確認することができた（図 4 g)。

〔実施例 6〕異種宿主におけるヒト細胞の多細胞系再構築

本実施例は、造血細胞によって再構築される「ヒト型化マウス」を開発することを目的とした。ヒト CB造血幹細胞 Z前駆体細胞のレシピエントには、新生児 N0D/SCID/IL2rg-null (NOD. Cg-Prkdc^scidIL2r^^mWI/^z) マウス（Jackson Laboratory)を用い、当該マウスへのヒト造血幹細胞の移植は実施例 1に記載の方法とほぼ同様の方法で行った。臍帯血（CB) 細胞は日本赤十字センター臍帯血バンクから得た。書面によるインフォームドコンセントを得た後に、廃棄対象となつた臍帯血から CB細胞を採取した。マウス抗ヒト CD3、 CD4、 CD8、 CDllb、 CD19、 CD20、 CD56及びグリコホリン Aモノクローナル抗体 (BD Immunocytometry) を用いて単核細胞 (MNCs) から Lin (lineage- antigen)陽性細胞を除いた。 CD34+造血幹細胞集団を高純度で単離するために、単核細胞を抗ヒト CD34 ミクロビーズ (Miltenyi Biotech) とともに 10°Cで 30分間ィンキュベートし（製造者プロトコールにしたがった。）、細胞を磁気カラムに 2回通した。その結果、濃縮された CD34⁺細胞の純度は 95%以上となり、 CD19⁺細胞及び CD3+細胞の割合は 0. 1%以下となった。上記のように調製した Lin— CD34+細胞（1 X 10⁵個）を静脈注射により移植する前に、予め新生 N0D/SCID/IL2rg- nullマウス及び N0D/SCID/ j3 2m^nu11マウスに 100cGyの全身照射を施した。 2004/008784

N0D/SCID/IL2rg-nullマウスは、成熟 B及ぴ T細胞が完全に欠損していることに加えて、 ΝΚ細胞の活性レベルが著しく低いために、当該マウスをレシピエントに用いる場合には、異種細胞を拒絶する危険性を低下させることができる。また、新生児は免疫的に未成熟であるため、新生児レシピエントが成長する間に、ヒト幹細胞は定着し、そこから分化した造血系の細胞を得ることができる。実際、 1 X 10⁵個の Lin— CD34+細胞は、レシピエントマウスの BMに効率的に移植され、 1次または 2次リンパ臓器において多細胞系銃の分化した細胞を生じさせた。

実施例 2と同様に、移植後 3ヶ月目のレシピエントマウス生体内におけるヒト由来 B系細胞を解析した。 FACSCalibur (Becton Dicinson)を用いてヒト CD45とその系列マーカー（lineage marker)の発現を解析した。その結果、レシピエントマウスの造血系において、全てのヒト造血系構成要素を含んでいた。レシピエントマウスの BMでは、ヒト GPA+赤血球は 9. 5 ±6. 2 % (n=5)、ヒト CD41⁺巨核球は 1. 64 ±0. 42 % (n=5)の頻度で存在した（図 5 A)。

また、ヒト CB由来 Lin— CD34+細胞は、 BM内で CD33+脊髄細胞、 CD19+B細胞、及ぴ CD3+T細胞を産生した（それぞれ図 5 B〜D)。

この N0D/SCID/IL2rg-nullマウスの優位性を評価するために、既存のマウスの系統の中で最も移植効率のよいと考えられている N0D/SCID/ ]3 2m^nu11マウス

(Jackson Laboratory)と移植レベルについて比較した。 1 X 10⁵個の Lin— CD34+由来のヒト CB細胞を N0D/SCID/p2m^nu11 マウスに、又は N0D/SCID/IL2R-yc^nu11マウスに移植した。そして、移植 3ヶ月後のレシピエントマウスの BM、脾臓、及ぴ末梢血（PB)におけるヒト CD45⁺細胞の移植レべルを解析した。

その結果、 PBでは、 N0D/SCID/IL2rg- nullマウス（68. 9± 11. 6%、n=5)は N0D/SCID/ 2m^nu11マウス（12. 4±5. 9%、 n=5)に比べてヒト細胞の移植レベルが有意に高く、ヒト成熟赤血球（図 5E) 及び血小板（図 5F) の両方が、ヒト白血球と共に確認された。 N0D/SCID/IL2rg- nullマウスは BM(72. 9 ±9. 8°/。、 n=⁵)及ぴ脾臓（54. 5 ±8. 0%、 n=5) においても高率の移植レベルを示した（表 2 )。

BM、脾臓と同じく末梢血においてもヒト細胞が循環するために、特に外因性の抗原またはサイトカインで刺激される場合に、ヒト細胞の遊走や流動を解析することが可能である。表 2 N0D/SCID/ β 2m^nu11 マウス及び N0D/SCID/IL2r_g- null マウスにおけるヒト CD45+細胞のキメラ化

strain Mouse BM ioleen PB

46. 1% 22. 0% 10. 4% 31. 5% 24. 3% 11. 6% null

N0D/SCID/P2m' 18. 1% 20. 7% 6. 9%

30. 4% 31. 2% 20. 7% mean +/— SD 31. 5 +/ - 11. 5% 22. 6 +/ - 4. 7% 12. 4 +/ - 5. 9%

70. 9% 66. 8% 71. 2%

2 81. 4% 47. 1% 81. 7%

N0D/SCID/IL2rg— null 3 58. 8% 49. 5% 50. 1%

4 83. 1% 51. 1% 68. 0%

70. 1% 58. 1% 73. 3% mean +/- SD 72. 9 +/- 9. 8% 54. 5 +/_ 8. 0% 68. 9 +/ - 11. 6%

〔実施例 7〕 N0D/SCID/IL2rg-nullにおけるヒト免疫系の分化

実施例 6により、レシピエントマウス（N0D/SCID/IL2R- yc^nu11マウス）の免疫系において、ヒト B細胞、 T細胞及び樹状細胞の存在を確認できた。 B細胞発生の各段階、つまり、 CD19+CD20^hi成熟 B細胞（図 6 A、 D)、 CD10+CD19+未成熟 B細胞（図 6 B、 E)及ぴ CD34+CD19⁺pro- B細胞（図 6 C、 F)は、移植されたマウスの BM (図 6 A - C) 及ぴ脾臓の両方で確認できた（図 6 D-F)。

続いて、移植後 3月におけるヒト免疫グロブリンの各アイソタイプの発現を、 BM、末梢血（PB)及び脾臓（SP)由来のヒト CD19+細胞において調査した。

結果を図 7に示す。各ドットプロット中の数字は、細胞由来を示す各マーカー JP2004/008784 別の抗体と各免疫グロプリンクラスの抗体とに両陽性を示した細胞の割合（％) を示す。図 7は、リンパ組織で分化する CD19⁺B系細胞において免疫グロブリンが発現することは、当該リンパ組織がヒト免疫系に変化したことを示している。そして、 BMにおいては B前駆細胞が保たれ発現し、末梢血（PB)では成熟 IgM+及び IgD⁺B細胞が産生された（図 7 )。 BM及ぴ脾臓においてヒト IgA⁺B細胞が存在することは、ヒト細胞によって粘膜免疫系が再構築されることを示している。

次に、上記 B細胞の機能を調べるために、レシピエントの血清に含まれるヒト免疫グロブリンの産生量を ELISA法により定量した。ヒト CB由来 Lin— CD34⁺細胞の移植 3月後の N0D/SCID/p2m^nu11 マウス及ぴ N0D/SCID/IL2rg- nul lマウスを用いて、血清中のヒト IgM及び IgG抗体産生量を ELISAにより解析した。

その結果、検査した全てのレシピエントの血清においてヒト IgM (600 ± 197 /z g/ml、 n=3)及ぴヒト IgG (256· 7 ± 76. 4 μ _§/ηι1、 η=3)が存在した。従って、本実施例により、ヒト免疫グロプリンが効果的に産生することを確認することができた (表 3 )。表 3 レシピエントマウス血清中のヒト IgM及び IgGの産生

Strain Mouse IgM (μg/ l) IgG ( g/ml)

1 820 190

N0D/SCID/IL2rg- null 2 540 240

3 680 340

mean +/— SD 600 +/ - 197 256. 7 +/ - 76. 4 移植された前記の N0D/SCID/ β 2m^nu11マウス及び N0D/SCID/IL2rg - nul lマウスにおける免疫グロブリン産生レベルの大きな違いは、レシピエントの血清中のヒト IgG クラス抗体量においてみられる。すなわち、効果的なクラススィッチが、 N0D/SCID/IL2rg-null レシピエントマウスにおけるヒト免疫系への変化よつて調節されていることを示すものである。 4 008784 次に、異種宿主におけるヒト T細胞の発生を解析した。胸腺（図 8 A)及び脾臓（図 8 B)におけるヒト T細胞の発生をフローサイトメトリーで解析した。

結果を図 8に示す。胸腺では未成熟 CD4+CD8+二重陽性 T細胞が 88. 1%を占めたのに対し（A)、 2次リンパ組織である脾臓では CM+CD8—または CM D8+といった一重陽性ヒト T細胞が大部分を占めた（B)。

さらに、免疫蛍光試験によって移植された T細胞を同定した。胸腺における T 細胞を抗ヒト CD4抗体（図 8 C)及ぴ抗ヒト CD8抗体（図 8 D)で染色した。パラホルムアルデヒドで固定した切片を、温めたクェン酸バッファーで処置し、抗体で免疫染色した。検出はレーザースキャニング共焦点顕微鏡（LSM510Meta : Carl Zeiss) を用いた。図 8 Eは、図 8 Cと Dとの重ね合わせ像であり、これにより、胸腺細胞の大部分は CD4と CD8の 2重陽性であることが示された。一方、脾臓を抗ヒト CD4 抗体（緑）と抗ヒト CD8 (赤）で染色すると、 CD4または CD8—重陽性の T細胞が優性であった（図 8 F)。

以上の結果より、免疫染色によって、レシピエントの胸腺において CD4⁺CD8⁺T 細胞、 CD4+CD8— T細胞、 CD4— CD8⁺ヒト T細胞が組織的構造を形成していることが明らかとなった。脾臓の,ような 2次リンパ組織では、一重陽性 T細胞は 1. 39±0. 61 (n=5, 0. 94-2. 43) CD4/CD8比で存在した。上記結果は、ヒト CB-幹細胞/前駆体細胞由来 T細胞が成熟及び增殖刺激を受けることを示しており、このことは、ヒト生体におけるものと同一であることを意味する。

抗原に対する免疫応答が最適に変化するには、樹状細胞又は単核細胞が抗原提示細胞として機能することが必要である。そこで、 N0D/SCID/IL2R-yc^nulマウスの脾臓におけるヒト樹状細胞の存在を検討した。

結果を図 9に示す。図 9 Aには、脾臓における HLA—DR+CD11C+細胞の存在をフロ一サイトメトリ一で示した。図 9 Bは、抗ヒト CDllc抗体による免疫染色により、ヒト樹状細胞が予想された形態学的特徴を保持していることを示した図である。図 9 A より、 HLA— DR+CDllc+樹状細胞は 1. 32 土 0. 54% (n=6) の頻度で N0D/SCID/IL2rg-null レシピエントマウスの脾臓に存在することが示された。また、ヒト CDllcで免疫染色することによって、移植されたヒト樹状細胞はマウス臓器における形態学的特徴を有することが示された（図 9 B)。レシピエントの脾臓において、ヒト CD19⁺細胞及ぴ CD3⁺細胞により組織化された構造が形成することに伴い（図 9 C及び!)）、異種リンパ組織においてヒト免疫系が機能的に再構築することが、ヒト樹状細胞の存在によって示された。

以上の結果から、免疫系において必要不可欠な 3つの要素であるヒト由来 T細胞、 B細胞及び抗原提示細胞は、異種宿主（マウス）において適切な成熟を伴つて CB Lin— CD34+細胞から高率に分化することが示された。

〔実施例 8〕ヒト粘膜免疫の再構築

胃腸管系の組織は、外因性の抗原に対する粘膜免疫による宿主防御を支える主要な部位である。本発明者は、レシピエントマウスの BM及ぴ脾臓において IgA⁺ B 系細胞の存在することを確認したことから、異種宿主の消化管においてヒト免疫細胞が存在するかを調べた。胃から直腸にかけての消化管をマウスから摘出し、 PBS で染色した後、 3%パラホルムアルデヒドで 1時間室温で固定した。パラフィン包埋サンプルをにスライスし、免疫染色に用いた。免疫蛍光試験はレーザ一スキャニング共焦点顕微鏡を用いた。

結果を図 1 0に示す。図 1 0は、 N0D/SCID/IL2rg- null マウスの消化管における粘膜免疫の発生を示している。図 1 O A及び Bは、 DAPIによる核染色とともに、抗ヒト CD3抗体 (A、緑)及び抗ヒト IgA抗体（B、赤）で免疫染色することによつて、レシピエントマウスの腸管標本においてヒト粘膜免疫が存在することを示す。図 1 0 Cは、絨毛の輪郭を DICイメージングによって明らかにした図である。図 1 0 Dは、 A、 B及ぴ Cの像を重ね合わせたものである。図 1 0 A〜D力ら、免疫蛍光試験によって、レシピエントマウスの腸管絨毛にヒト IgA+ B細胞及ぴヒト CD3+ T 細胞が共に含まれていることが示された。つまり、この結果は、粘膜免疫がヒト Lin— CD34+幹細胞/前駆細胞によって再構築されたことを示している。加えて、移植マウスの回腸の漿膜下で節構造が認められた（図 1 0 E)。

Peyer' sパッチ様構造を、抗ヒト IgA (赤）、及ぴ抗ヒト CD3 (緑）抗体で染色すると、上皮下ドームにおいてヒト T細胞を豊富に含んでいることが明らかとなつた（図 1 0 F)。以上のように、マウス腸間膜リンパ節もヒト細胞によって著しく再構築されていた。したがって、本発明のモデルは、胃腸管におけるヒト粘膜免疫系の役割を解析するための実験動物として有用である。〔実施例 9〕移植された B細胞による抗原特異的免疫グロプリンの産生ヒト免疫系の組織的な応答を調べるために、そして ill i Oにおける抗原特異的なヒト抗体の産生を調べるために、移植 3月後に 3匹の N0D/SCID/IL2rg- null レシピエントマウスに 2回卵白アルブミン（100 _t g、 sigma) で免疫した。卵白ァルブミンは、の水酸化アルミニウム（sigma)で乳化させて用いた。当該免疫後のフローサイトメトリーによって解析した結果、 2回免疫後 2週間経たレシピエントマウスの BMにおいて、ヒト CD38⁺IgG⁺細胞が効果的に誘導されていることが示された（図 1 1 )。図 1 1 A及ぴ Bは卵白アルブミン免疫前及ぴ後におけるレシピエントマウスの BM細胞を、フローサイトメトリーによってヒト IgG+細胞の存在によって分析した図である。

次に、免疫化レシピエントマウスの血清を用いて、卵白アルブミン特異的なヒト IgM 及ぴ IgG の産生を測定した。上記の 3匹の免疫化マウス、即ち N0D/SCID/IL2rg-null レシピエントマウスを卵白アルブミンで免疫した 2週間後に、レシピエントマウスの血清を採取し、卵白アルブミン特異的なヒト IgM及び IgGの存在を ELISA法によって解析した。ャギ抗ヒト IgM及ぴ IgG抗体は、 Bethyl から購入し、これらはマウス抗ヒト IgM及ぴ IgG抗体とクロス反応しないことを確認した後に用いた。免疫をしていない N0D/SCID/IL2rg- null レシピエントマウス由来の血清を、非特異的 IgM及び IgG対照として用いた。卵白アルブミン特異的なヒト IgM及ぴ IgG抗体を解析するために、 96マルチウヱルプレートの底に、 lOO ^ g/ml濃度の卵白アルブミンをプレーティングして ELISA法に用いた。

その結果、 ELISAによって、ヒト IgM (図 1 1 C白カラム）及ぴ IgG (図 1 1 C黒カラム）の光学濃度（Optical Density) は、免疫化レシピエント（Recipient)の血清では非免疫化レシピエント（control)と比較して非常に高いことが示された。また、ヒト細胞のキメラ化が高いレベルであることも示された（図 1 1 )。卵白アルブミンが T依存性抗原であるとを考慮すると、ヒト免疫系特性に変化したヒト樹状細胞、 Τ細胞及ぴ Β細胞は、異種宿主レシピエントマウスにおいて抗原特異的なヒト IgM及び IgGの産生をするために調和して機能したものであると考えられる。

〔実施例 10〕ァロ抗原特異的なヒト T細胞の存在

本実施例は、異種宿主のリンパ組織中の Lin— CD24+CB細胞から分化したヒト T 細胞の、ァロ抗原特異的な機能を明らかにしたものである。

ヒト T細胞をレシピエントの脾臓から単離した後、ァロ抗原（alloantigen)特異的な CD4+T細胞株及び CD8+T細胞株を分化した。 CD4+T細胞株及ぴ CD8⁺T細胞株の両者を同種異型（allogenic) の標的細胞（target cells, TAK- LCL)と共培養し、同種異型標的細胞に対する細胞毒性を調べるために、⁵¹ Cr遊離アツセィを行った。さまざまな細胞数のエフェクター細胞（Effector cell) と、 1 X 10⁴個の "Cr 標識同種異型標的細胞を、丸底マイクロタイターゥエルにて 10%熱非働化ゥシ胎児血清を添加した 0. 2 mLの RPMI1640中で培養した。標的細胞は、メディウムのみのゥエル、及ぴメディウムに 1% Triton X - 100の入ったゥヱルにも添加し、それぞれの遊離量は、 "Crの自発的な遊離及び ⁵¹Crの最大遊離の値として後の計算で用いた。 5時間後上清 0. l mLをそれぞれのゥヱルから回収し、以下の計算式から特異的な⁵¹ Cr遊離量を求めた。

(特異的な⁵¹ Cr遊離量）（％) = (実測値（_Cpm)—自発遊離値 (cpm) ) / (最大遊離値 (cpm) _自発遊離値（_Cpm) ) X 100

HLA拘束を決定するために、標的細 ^を抗 HLA- A, B, C モノクローナル抗体 (w6/32) (ATCC)又は HLA - DRモノクローナル抗体（L243) (ATCC)と 30分間プレインキュペートし、その後、エフェクター T リンパ球で共培養した。それぞれの細胞毒性ァッセィは、少なくとも 2回行った。

KIN-LCLは、同種異型の標的細胞と、いずれの HLAタイプをも共有せず、陰性対照として用いた（図 1 2、 KIN- LCL、（X ) )。

また、エフェクター細胞と標的細胞の HLAタイプは以下のとおりである。 T cells isolated from recipient spleen, HLA - A24/33, B44/52, Cwl2/wl4, DRB1*1302/*15021, TAK-LCL, HLA-A24/26, B62/- , Cw4/w9, DRB1*0405/*0901, KIN-LCL, HLA-A01/30, B13/17, Cw6/-, DRB1*0701/*0701.

結果を図 1 2に示す。図 1 2 A~Cは、 3つの CD4⁺T細胞株それぞれの、刺激細胞濃度（Effector/Target ratio)依存的な細胞毒性（％ Cytotoxicity)を示す。ヒト CD4+T細胞株による細胞毒性は、標的細胞として用いた同種異型 LCL (TAK-LCL)に対して細胞毒性を示した（図 1 2、 none, (命））。異種環境で産生されたヒト T 細胞の MHC拘束を調べるために、抗 HLAクラス I抗体（anti- HLA class I) 及び抗 HLA- DR抗体（anti- HLA - DR)を用いて、ヒト T細胞による細胞毒性の阻害アツセィを行った。その結果、細胞毒性は HLA- DR抗体（図 1 2、 anti- HLA- DR、（▲) ) によって阻害されたが、 HLAクラス Iモノクローナル抗体（図 1 2、anti-HLA- class I、 (■) ) では阻害されなかった。このことは、細胞毒性は HLAクラス IIで拘束されることを示している。

図 1 2 D〜Fは、 3つの CD8⁺T細胞株それぞれの、刺激細胞濃度依存的な細胞毒性を示す。 CD8+Tによる細胞毒性は、 HLAクラス Iモノクローナル抗体によって阻害されたが、 HLA- DR抗体では阻害されなかった。このことは、通常の環境下で産生した CD8+CTLによって介されるのと同様に、異種環境下で産生した CD8+T細胞によって介される細胞毒性は、 HLAクラス I抗体によって拘束されることを示している。産業上の利用可能性

本発明により、新生児免疫不全動物を用いたヒト由来免疫担当細胞の製造方法を提供することができる。本発明の新生児免疫不全動物は、その体内にヒト由来の免疫系を構築することができるため、リンパ系組織の機能解析及び B細胞を用いたヒト由来抗体の作製に有用である。

Claims

請求の範囲ヒト由来造血前駆細胞又は成熟造血細胞が移植された幼若な免疫不全哺乳動物（ヒトを除く）であって、当該ヒト由来の免疫担当細胞、及び/又は当該免疫担当細胞由来の生理活性物質を産生することができる前記動物。

2 請求項 1記載の幼若な免疫不全哺乳動物（ヒトを除く）を飼育してなる免疫不全哺乳動物又はその子孫。

3 幼若な免疫不全哺乳動物が、新生児免疫不全哺乳動物又は胎児免疫不全哺乳動物である請求項 1又は 2記載の動物又はその子孫。

4 造血前駆細胞が骨髄由来、臍帯血由来又は末梢血由来の細胞である請求項 1記載の動物又は請求項 2若しくは 3記載の動物若しくはその子孫。

5 免疫担当細胞が、 B細胞、 T細胞、樹状細胞、 NK細胞及び NKT細胞からなる群から選ばれる少なくとも 1つである請求項 1記載の動物又は請求項 2 若しくは 3記載の動物若しくはその子孫。

6 生理活性物質がサイトカイン及び/又は免疫グロプリンである請求項 1記載の動物又は請求項 2若しくは 3記載の動物若しくはその子孫。

7 免疫グロブリンが、 IgG、 IgM、 IgA、 IgD及ぴ IgEからなる群から選択されるいずれかのものである請求項 6記載の動物又はその子孫。

8 免疫不全哺乳動物が免疫不全マウスである請求項 1記載の動物又は請求項

2若しくは 3記載の動物若しくはその子孫。

9 ヒト由来造血前駆細胞又は成熟造血細胞を幼若な免疫不全哺轧動物（ヒトを除く）に移植することを特徴とする、当該ヒト由来の免疫担当細胞、及び/又は当該免疫担当細胞由来の生理活性物質を産生することができる動物又はその子孫の作製方法。

1 0 幼若な免疫不全哺乳動物が、新生児免疫不全哺乳動物又は胎児免疫不全哺乳動物である請求項 9記載の方法。

造血前駆細胞が骨髄由来、臍帯血由来又は末梢血由来の細胞である請求項 9記載の方法。免疫担当細胞が、 B細胞、 T細胞、樹状細胞、 NK細胞及ぴ NKT細胞からなる群から選ばれる少なくとも 1つである請求項 9記載の方法。

生理活性物質がサイトカイン及び/又は免疫グロプリンである請求項 9 記載の方法。

免疫グロブリンが、 IgG、 I_gM、 IgA、 IgD及び IgEからなる群から選択されるいずれかのものである請求項 1 3記載の動物又はその子孫。

免疫不全哺乳動物が免疫不全マウスである請求項 9記載の方法。

請求項 1記載の動物又は請求項 2〜 8のいずれか 1項に記載の動物若しくはその子孫から免疫担当細胞を回収し、当該免疫担当細胞を抗原又は刺激物質の存在下で培養し、得られる培養物からヒト由来抗体を採取することを特徴とする前記抗体の製造方法。

免疫担当細胞が、 B細胞、 T細胞、樹状細胞、 NK細胞及び NKT細胞からなる群から選ばれる少なくとも 1つである請求項 1 6記載の方法。

請求項 1記載の動物又は請求項 2〜 8のいずれか 1項に記載の動物若しくはその子孫を抗原又は刺激物質で免疫し、得られる免疫動物から当該ヒト由来抗体を採取することを特徴とする前記抗体の製造方法。

抗体の採取源が血漿又は血清である請求項 1 8記載の方法。

請求項 1記載の動物又は請求項 2〜 8のいずれか 1項に記載の動物若しくはその子孫に、細菌、ウィルス、腫瘍細胞及ぴ腫瘍抗原ペプチドからなる群から選択されるいずれかのものが投与された疾患モデル動物又はその子孫。

疾患が感染症である請求項 2 0記載の動物又はその子孫。

被験物質を、請求項 1記載の動物、又は請求項 2〜 8、 2 0及ぴ 2 1のいずれか 1項に記載の動物若しくはその子孫に投与して、被験物質の有効性を評価することを特徴とする、免疫関連医薬のスクリーニング方法。免疫関連医薬がワクチンである請求項 2 2記載の方法。

請求項 1記載の動物又は請求項 2〜 8のいずれか 1項に記載の動物若しくはその子孫から免疫担当細胞を回収することを特徴とする前記免疫担当細胞の製造方法。

請求項 1記載の動物又は請求項 2〜 8のいずれか 1項に記載の動物若しくはその子孫から回収された免疫担当細胞。

請求項 2 5記載の免疫担当細胞を含むワクチン。

請求項 2 0記載の動物又はその子孫から免疫担当細胞を回収することを特徴とする前記免疫担当細胞の製造方法。

請求項 2 0記載の動物又はその子孫から回収された免疫担当細胞。

請求項 2 8記載の免疫担当細胞を含むワクチン。

請求項 1記載の動物又は請求項 2〜 8のいずれか 1項に記載の動物若しくはその子孫から回収されたヒト由来抗体。

請求項 2 5又は 2 8記載の免疫担当細胞を抗原又は刺激物質の存在下で培養した培養物から採取されたヒト由来抗体。

請求項 2 0記載の動物又はその子孫から回収されたヒト由来抗体。

請求項 3 2記載のヒト由来抗体を含むワクチン。