WO2004108123A1

WO2004108123A1 - 腎疾患の予防剤および/または治療剤

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Publication number: WO2004108123A1
Application number: PCT/JP2004/007601
Authority: WO
Inventors: Seiichi Matsuo; Satoshi Suzuki
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 2003-06-02
Filing date: 2004-06-02
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2005-12-02
Also published as: JP2006225263A

Abstract

　本発明の目的は、急性腎不全といった腎疾患に対して有効な薬剤を提供する。上記目的は、ヒートショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、腎疾患の予防剤および／または治療剤により達成される。具体的には、本発明は、プレニルケトン系化合物である、6，10，14，18−テトラメチル−5，9，13，17−ナノデカテトラエン−2−オンを有効成分として含有する、腎疾患の予防剤および／または治療剤を提供する。

Description

明細書

腎疾患の予防剤および/または治療剤

技術分野

[0001] 本発明は、腎疾患の予防および/または治療に係り、より詳細には、急性腎不全の予防剤および/または治療剤に関する。

背景技術

[0002] 急性腎不全 (以下、単に「ARF」という。 )は、臨床的には大きな問題であり、かかる障害を患った患者の死亡率は、非常に高い (たとえば、非特許文献 1ないし 3)。現在の治療法は対症療法であり、その死亡率をほとんど改善できないのが現状である（たとえば、非特許文献 1および 4参照)。たとえば、急性腎不全の原因の一つである急性尿細管壊死は、現在でも致死率が高い疾患の一つとして知られている（40— 60% )。ただ、治療が奏功し、改善治癒に向力う症例もあるものの、永続的な腎機能障害を残すことも多い。

[0003] この ARFは、しばしば頻繁に多臓器不全と関連している。多臓器疾患の複雑性にくわえて、 ARFの存在により、死亡率を顕著に増大させている。腎性不全により誘発される虚血性再灌流（以下、単に「I/R」ということもある。）は、急性腎不全によって共通した病因である (たとえば、非特許文献 5参照)。 I/Rは、腎性灌流がショックを受けている間に低減する際に発症する。また、 I/Rは、大動脈または腎臓の血管手術における重大な合併症でもある (たとえば、非特許文献 6参照)。さらに、 I/R障害は、腎臓移植において避けることができないものであり、臓器の回収や保存中にも生じる。 I/R障害は、急性拒絶エピソードや後の移植片障害と非常に関連している (たとえば、非特許文献 7および 8参照)。これらの問題は、温阻血または冷阻血、その後の再灌流を受ける死体の腎臓移植においては、常に、観測される。かかる移植からの不満足な結果により、 marginal donor力もの臓器の使用を通じたドナープールの拡大を妨げる (たとえば、非特許文献 9参照)。したがって、障害により誘発される I/Rに晒される腎臓の損傷を低減させる努力は重要である。

[0004] I/R障害の病原学は複雑であるが、酸素フリーラジカルによる発作 (たとえば、非特許文献 10参照）と、その後に続く炎症応答は、考慮すべき重要な要因である (たとえば、非特許文献 7参照)。数多くの研究により、臓器の抗酸ィ匕状態はフリーラジカルにより誘発される障害に対する、主な内因性防御によって重要であることが示されている。 α—トコフエロール、ラザロイド (lazaroid)、プロブコール (probucol)およびスカベンジャースーパォキシドジスムターゼを含む種々の内因性抗酸化剤力腎臓の I/R障害を予防する旨の報告がされている（たとえば、非特許文献 1参照)。別の研究により、関与するであろう種々の炎症メディエーター、腫瘍壊死因子 α、細胞間接着因子 1、 Ρ—セレクチン、血小板活性因子、 Gro a、マクロファージ炎症タンパク質 2、 MCP 1、ミドカイン等が、確認されている。これらの分子を標的とする治療的予防において、実験動物においては腎性 I/R障害を減弱させることに成功した (たとえば、非特許文献 1および 3参照)。

[0005] 前述の多くの研究にもかかわらず、ヒトにおいて効果的であることが実証された治療法は皆無である。そして、虚血耐性の誘導に多くの関心が集まっている。これは、元来の防御機構に基づくものであるから、合理的な方策である。虚血耐性の概念は、準致死性ヒートショックまたは低レベルの虚血性障害力細胞および組織にぉヽて耐性を誘導し、その後に熱または虚血性障害に晒されるという前提に基づき確立された (たとえば、非特許文献 11参照)。この耐性の作用機序は十分に説明されていない力ヒートショックタンパク質 (以下、「Hsp」という。）がこの過程に重要な役割を演じていると考えられている。 Hspの発現を誘導する薬剤が精力的に研究された。しかしながら、 Hsp発現を誘導する数種の薬剤は知られているが、カゝかる薬剤は毒性がある、または有害な副作用を有することも知られている（たとえば、非特許文献 12ないし 14 参照)。したがって、腎臓にて Hspを効果的に誘導可能である非毒性の化合物を発見することは、治療上、重要な便益をもたらす。

[0006] ところで、ゲラニルゲラ-ルアセトン（以下、単に「GGA」 t 、う。）は、非環式ポリイソプレンの一種であり、 1984年以来、有害な反応を伴うことなぐ胃炎および胃潰瘍の治療のため、臨床的に利用されている抗潰瘍剤である。この GGAは、ラットに経口的に投与したとき、胃粘膜や小腸にて、 Hspフアミルーの過剰発現を誘導することが知られている（たとえば、非特許文献 15および 16参照)。最近、 GGAの臓器保護効果が、心臓 (たとえば、非特許文献 17参照)や、肝臓 (たとえば、非特許文献 18および 19 参照）にて観測されている。

非特許文献 1 : BONVENTRE JV, WEINBERG JM:Recent advances in the pathophysiology of ischemic acute renal failure.J Am Soc Nephrol 14: 2199—2210, 2003

非特許文献 2 : SINGRI N, AHYA SN, LEVIN ML:Acute renalfailure. JAMA 289: 747-751, 2003

非特許文献 3 : DE VRIESE AS: Prevention and treatment ofacute renal failure in sepsis. J Am Soc Nephrol 14:792-805, 2003

非特許文献 4 : RONCO C, BELLOMO R:Prevention of acute renalfailure in the critically ill. Nephron Clin Pract 93: C13-C20, 2003

非特許文献 5 : PADANILAM BJ, LEWINGTON AJ:Molecularmechanisms of cell death and regeneration in acute ischemic renal injury. Curr Opin NephrolHypertens 8: 15-19, 1999

非特許文献 6 : MYERS BD, MORAN SM:Hemodynamically mediatedacute renal failure. N Engl J Med 314: 97-105, 1986

非特許文献 7 : HALLORAN PF, BATIUK TD, GOES NB, CAMPBELL

P:Strategiesto improve the immunologic management of organ transplants.

ClinicalTransplantation 9: 227—236, 1995

非特許文献 8 : TROPPMANN C, GILLINGHAM KJ, BENEDETTI E, et

ahDelayedgraft function, acute rejection, and outcome after cadaver

renaltransplantation. The multivariate analysis. Transplantation 59: 962—968, 1995 非特許文献 9 : KOOTSTRA G:The asystolic,or non- heartbeating, donor.

Transplantation 63:917—921, 1997

非特許文献 10 : WEIGHT SC, BELL PR, NICHOLSON ML:Renal

ischaemia—― reperlusion injury. Br J Surg83: 162—170, 1996

非特許文献 11 : WEIGHT SC, BELL PR, NICHOLSON ML:Renal

ischaemia—― reperlusion injury. Br J Surg83: 162—170, 1996 非特許文献 12 : MORRIS SD, CUMMING DV, LATCHMAN DS, YELLON

DM : Specincinduction of the 70— kD heat stress proteins by the tyrosine

kinaseinhibitor herbimycin— A protects rat neonatal cardiomyocytes. A new pharmacological route to stressprotein expression? J Clin Invest 97: 706-712, 1996 非特許文献 13 : MAULIK N， ENGELMAN RM, WEI Z， et

al:Drug—inducedheat— shock preconditioning improves postischemicventricular recovery after cardiopulmonary bypass.し lrculation 92: 11381—11388,1995

非特許文献 14 : SUN L, CHANG J, KIRCHHOFF SR, KNOWLTON AA:Activationof HSF and selective increase in heat-shock proteins by acute dexamethasone treatment. American Journal of PhysiologyHeart and Circulatory Physiology 278: H1091-H1097, 2000

非特許文献 15 : HIRAKAWA T， ROKUTAN K， NIKAWA T， KISHI

K:Geranylgeranylacetoneinduces heat shock proteins in cultured guinea pig gastric mucosal cells andrat gastric mucosa. Gastroenterology 111: 345—357， 1996

非特許文献 16 : TSURUMA T， YAGIHASHI A, KOIDE S， et al:

Geranylgeranylacetoneinduces heat shock protein— 73 in rat small intestine.

Transplant Proc 31:572-573, 1999

非特許文献 17 : 0〇IE T， TA AHASHI N， SAI AWA T， et ahSingleoral dose of geranylgeranylacetone induces heat— shockprotein 72 and renders protection against ischemia/ reperfusion injury in ratheart. circulation 104: 1837—1843， 2001

非特許文献 18 : FUDABA Y， OHDAN H， TASHIRO H， et

al: Geranylgeranylacetone , a heat shock protein inducer, prevents primary graft nonfunctionin rat liver transplantation. Transplantation 72: 184—189， 2001

非特許文献 19 : ODA H， MIYAKE H， IWATA T， et

ahGeranylgeranylacetonesuppresses inflammatory responses and improves survival after massive hepatectomy in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery 6:464-72 discussion 47, 2002

発明の開示発明が解決しょうとする課題

[0007] 上記の如ぐ急性腎不全等の腎疾患に対しては、現在までのところ、有効な予防および/または治療剤がな、ため、力かる剤が切望されて、る。

[0008] そこで、本発明の目的は、上記事情に鑑み、腎疾患に有効な薬剤を提供する。

課題を解決するための手段

[0009] 本発明者らは鋭意検討した結果、特定の非環式ポリイソプレンィ匕合物が、腎臓にてヒートショックタンパク質を誘導し、腎疾患の予防および/または治療に有効であるという知見を得て、本発明を完成するに至った。

[0010] すなわち、本発明は、第一の態様によれば、ヒートショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、腎疾患の予防および Zまたは治療剤を提供する。

[0011] 本発明に係る腎疾患の予防および Zまたは治療剤の好まし、態様にぉ、て、前記ヒートショックタンパク質誘導剤力プレニルケトン系化合物である。

[0012] 本発明に係る腎疾患の予防および Zまたは治療剤の好ましい態様において、前記プレニルケトン系化合物が、

[0013] [化 1]

で表される 6, 10, 14, 18—テトラメチルー 5, 9, 13, 17—ナノデカテトラェンー 2—オンである。

本発明に係る腎疾患の予防および Zまたは治療剤の好まし、態様にぉ、て、前記腎疾患は、急性腎不全である。

[0015] 本発明に係る腎疾患の予防および Zまたは治療剤の好ましい態様において、前記ヒートショックタンパク質力ヒートショックタンパク質 70である。

[0016] また、本発明は、第二の態様によれば、ヒートショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物を投与する工程を含む、腎疾患の予防および Zまたは治療方法を提供する。

[0017] 本発明に係る腎疾患の予防および Zまたは治療方法の好ましい態様において、前記ヒートショックタンパク質誘導剤力プレニルケトン系化合物である。

[0018] 本発明に係る腎疾患の予防および Zまたは治療方法の好まし、態様にぉ、て、前記プレニルケトン系化合物が、

[0019] [化 1]

[0020] 本発明に係る腎疾患の予防および Zまたは治療方法の好まし、態様にぉ、て、前記腎疾患は、急性腎不全である。

[0021] 本発明に係る腎疾患の予防および Zまたは治療方法の好ましい態様において、前記ヒートショックタンパク質がヒートショックタンパク質 70である。

[0022] さらに、本発明は、第三の態様によれば、ヒートショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、腎疾患の予防および Zまたは治療剤を製造するための、ヒートショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物の使用を提供する。

[0023] 本発明による前記使用の好ま、態様にぉ、て、前記ヒートショックタンパク質誘導剤力プレニルケトン系化合物である。

[0024] 本発明による前記使用の好ま、態様にぉ、て、前記プレニルケトン系化合物が、 [0025] [化 1]

[0026] 本発明による前記使用の好ましい態様において、前記腎疾患は、急性腎不全である。

[0027] 本発明による前記使用の好ま、態様にぉ、て、前記ヒートショックタンパク質がヒートショックタンパク質 70である。

発明の効果

[0028] 本発明によれば、本発明に係る化合物である 6, 10, 14, 18—テトラメチルー 5, 9, 13 , 17-ナノデカテトラェン -2-オンは、腎臓にてヒートショックタンパク質 70を誘導し、急性腎不全の予防および/または治療に対して有効である。発明を実施するための最良の形態

[0029] 以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施することができる。

[0030] 本発明は、腎疾患、特に急性腎不全といった腎疾患の治療に対して有効である、毒性のない予防剤および/または治療剤を提供するものである。以下、本発明を詳細に説明する。

[0031] 本発明にお、て有効成分である化合物は、式 (I)で表されるプレニルケトン系化合物である。

本発明に好適に用いられる化合物の化合物名は、 6, 10, 14, 18—テトラメチルー 5, 9 , 13, 17—ナノデカテトラェンー 2—オン (別名：ゲラニルゲラ-ルアセトン、一般名：テプレノン、以下、単に「GGA」ともいう。）である。本発明に用いる GGAは、その構造中に 4力所に二重結合を有しており、計 8種類の幾何異性体が存在するが、本発明においては特に限定されず、いずれか 1つの異性体でもよぐまた 2種以上の混合物であつてもよい。これらの中でも好ましい化合物としては、（5E, 9E, 13E)— 6, 10, 14, 18— テトラメチルー 5, 9, 13, 17—ノナデカテトラェンー 2—オン及び (5Z,

9E, 13E)— 6, 10, 14, 18—テトラメチルー 5, 9, 13, 17—ノナデカテトラェンー 2—オンを挙げることができる。

[0032] 本発明に用いる GGAは、公知の化合物であり、試薬、工業原料として入手することが可能である。 GGAの合成法としては、たとえば、特開昭 53-145922号公報に開示されて、る方法に従って合成することができる。

[0033] 本発明に係る腎疾患の予防剤および/または治療剤の有効成分である GGAは、塩を形成していてもよぐ力かる塩における好ましい具体例としては、ハロゲン化水素酸塩 (たとえば、フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩等)、無機酸塩 (たとえば、硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩等)有機力ルボン酸塩（たとえば、酢酸塩、トリフルォロ酢酸塩、シユウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クェン酸塩等）、有機スルホン酸塩 (たとえば、メタンスノレホン酸塩、トリフルォロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩等）、アミノ酸塩（たとえば、ァスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等）、四級ァミン塩、アルカリ金属塩 (たとえば、ナトリウム塩、力リウム塩等）、アルカリ土類金属塩 (たとえば、マグネシウム塩、カルシウム塩等)等があげられる。

[0034] 本発明に用いる有効成分である GGAまたはその塩は、無水物であってもよ、し、水和物を形成していてもよい。また、 GGAまたはその塩には結晶多形が存在することもあるが同様に限定されず、いずれかの結晶形が単一であってもよいし、結晶形混合物であってもよい。さらに、本発明に用いる GGAまたはその塩が生体内で分解されて生じる代謝物も本発明の特許請求の範囲に包含される。

[0035] 本発明に係る予防剤および/または治療剤は、 GGAをそのまま用いてもょヽし、または、公知の薬学的に許容できる担体等、たとえば、賦形剤 (具体的には、乳糖、白糖、でんぷん、マン-トールなど）、結合剤 (具体的には、ひ化澱粉、アラビアゴム、力ルポキシセルロース、ポリビュルピロリドンなど）、滑沢剤（具体的には、ステアリン酸マグネシゥム、タルクなど)、崩壊剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、 pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤等、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して慣用される方法により製剤化してもよい。また、必要に応じて、血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤、等の成分を配合してもよい。

[0036] 本発明に係る予防剤および/または治療剤の製剤化の剤形としては、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、凍結乾燥剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローシヨン剤等が挙げられる。

[0037] また、本発明においては、 GGAの投与形態は、特に限定されないが、経口的に投与することが好ましい。 GGAは、商品名「セルベックス」（エーザィ株式会社製）として人手することができる。

[0038] 本発明に係る GGA含有予防剤および/または治療剤は、哺乳類 (例：ヒト、マウス、ラット、モルモット、ゥサギ、ィヌ、ゥマ、サル等）の腎疾患の予防および/または治療に有用で、特に、ヒトの腎疾患の治療および/または予防に有用である。

[0039] 本発明に係る GGA含有予防剤および/または治療剤の投与量は、症状、年齢、体重などの条件により適宜選択されるが、成人一日あたり、 20一 2000 mg、好ましくは 50 一 1000 mg、さらに好ましくは 100— 500 mgである。

[0040] 本発明に係る GGAィ匕合物が有効な疾患は腎疾患であり、急性腎不全、急性尿細管壊死、慢性腎不全、尿細管間質障害、急性腎炎、慢性腎炎、ネフローゼ、腎機能障害などが挙げられるが、特に、急性腎不全に対して有効である。

[0041] 本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。本発明の記載に基づき、種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に包含される。

[0042] 実施例

(実験動物）

中部科学資材 (株) (名古屋巿、日本)から購入した、雄性 Spraugue- Dawleyラットを使用し、餌を十分に与えた。実験動物に対する取り扱いは、すべて「名古屋大学医学部動物実験指針」を遵守した。

(実験試料）

GGA (商品名「セルベックス」、エーザィ株式会社製)を、 5 %アラビアゴム溶液と、 0.008 %のトコフエロールを用いてェマルジヨンとして調整した。なお、同用量の溶媒をプラセボとした。なお、図面中では、プラセボを vehicle (ビヒクル）として表示することもめる。

(統計的解析）

全ての数値は、平均士 SEMの値で表示する。ヒートショックタンパク質 70 (以下、単に「Hsp70」という。）の連続的変化は、二方向性 ANOVA (平方偏差の相互分析）とそれに続く Tukey試験により解析した。 Hspの相対的密度、血中尿素窒素および血清クレアチンのレベル、 TUNELおよび ED-1陽性細胞の数は、 Student t-testにより解祈した。尿細管障害と尿細管円柱形成の評価は、 Mann-Whitne s U testにより対比した。有意な差は、 0.05以下の P値として定義した。

[0043] ビボでの Hsp70の発現の解析

腎臓において、 Hsp70を誘導させるための最適投与量を求めるために、種々の量の

GGAを、前述の実験試料としてのラットに投与した (体重 kgあたり、 0, 200,

400, 800 mgの GGA)。 GGAおよびビヒクル投与 24時間後にて、腹膜注射によりペントバルビタール (50 mg I kg)を用いた麻酔により殺した。直後に、腎臓を切除し、ゥェスタンプロット法により解析した。なお、図 1は、本発明に用いた、インビボ (A)およびインビトロ (B)の実験手順を示す。

[0044] Hsp70の発現の時間経過を検討するために、 GGA (400 mg / kg)の 1回の投与後、 12, 24, 48時間後に腎臓を回収した。また、 48時間後の腎臓を回収するに先立ち、 GGA(400 mg I kg)の投与直後と、投与 24時間の 2回の経口投与を実行した後にも、 Hsp70の発現を検討した。一部の腎臓をウェスタンプロット解析の用に供し、他の部分の腎臓は、免疫染色にために、 OCTィ匕合物（Miles, Elkhart, IN USA)を用いて凍結させた。なお、 GGA投与群とプラセボ群とは、各 6匹のラットを用いた。

[0045] 図 2は、 GGA経口投与 24時間後における、ラットでの Hsp70の発現に対する GGA

投与量の効果の結果を示す図である。図 2 (A)に示す結果から、 400

mg I kgの GGAを投与したラットにおいて Hsp70の発現が有意に増大し、 800 mg / kgの GGAを投与しても、 Hsp70の発現は顕著には増大しなかったことが分かる。この結果から、ラットの腎臓において Hsp70を誘導するための GGAの最適投与量は、 400 mg I kgであり、以下の実験では、この投与量にて行うこととした。

[0046] 図 2 (B)および (C)は、本発明により得られた尿細管の組織図を示し、図 2 (B)は、プラセボ投与後、図 2 (C)は、 400 mg I kgの GGA投与後の組織図を示す。正常なラットの腎臓における尿細管上皮細胞では、実際に、 Hsp70の発現が観測されていることが分かる。図 2 (D)は、コントロールとしてのビヒクルを投与したプラセボ投与と、 GGA投与 24時間後に、他のヒートショックタンパク質（たとえば、 Hsp90, Hsp60, Hsp32)の発現の解析結果を示す図である。図 2 (D)に示す結果から、ビヒクル投与と GGA投与との間には、前記他のヒートショックタンパク質の発現には有意の差は観測されなかったことが分かる。

[0047] 図 3は、ラットへの 400 mg / kgの GGA投与後の Hsp70発現の経時変化を示す図である。図 3の上図に示す結果から、 400 mg I kgの GGA1回経口投与後では、 12 時間後に Hsp70発現が増大し、 24時間後にピークに達した後、 48時間後に減少した。一方、ビヒクル投与後では、 Hsp70発現には時間依存性は観測されな力つた。

[0048] さらに、 GGA (400 mg I kg) の 2回経口投与（ 0時間と 24時間）、 48時間後にも、 Hsp70発現を研究した。その結果、 Hsp70発現のピークレベルは、 1回投与の 24時間後に誘導される発現レベルと同等であり、このことは、 Hsp70発現の高レベルが 2 回の経口投与 48時間後でさえも維持されることを示唆している。

[0049] I/R研究のための実験プロトコ一ノレ

GGA投与群のラット (n = 9)では、腎臓切除前の 24時間と、切除直前 1時間前に、 GGA (400 mg/ kg)を経口的に投与した。コントロールラット（_n = 9)では、ビヒクルを同体積の量を与えた。ペントバルビタールナトリウム (50 mg I体重 kg)の腹膜注射により、ラットを麻酔させ、体重温度を電気パッドの温度 (37 °C)に維持した。双方の腎臓を、中線切開により表出し、 25 mmの微細動脈瘤クランプにより、 30分間、両側腎動静脈をクリッピングして虚血を誘発させた。クランプ除去後、筋肉および皮膚を、別々に縫合した。 I/R損傷 24時間後にラットを殺し、血および腎臓サンプルを、研究のために収集した。

[0050] 組織学および免疫組織化学

腎臓の一部分を、 4 %パラホルムアルデヒドにて固定し、ノラフィン中に浸漬させ、 4 μ m²の小片に切除した。これらの小片を過ヨウ素酸シッフ試薬 (PAS)にて染色した。

[0051] 一方、腎臓の他の部分は、 OCTィ匕合物を用いて凍結した。 2 μ m厚の小片をァセトン中にて固定した。文献記載の方法により（SHIMIZU H, MARUYAMA

¾, YUZAWA et al:Anti— monocyte chemoattractant protein— 1 gene therapy at tenuates renal injury induced by protein-overload proteinuria. J Am Soc Nephrol 14: 1496-1505, 2003)、免疫染色を行った。本実験に用いた一次抗体は、 Hsp70に対するモノクロ ~~ナノレ抗体 (Stress Gen Biotechnologies Corp. , Victoria, B.し. Canadaノと、 ED- 1 (抗ラットマクロファージ /モノサイト、 Serotec, Raleigh, NC)であった。二次抗体は、ャギ抗マウス IgG抗体のフルォレセイン結合体（Zymed laboratories, San Francisco, CA)であつ 7こ。

[0052] 組織学と免疫組織化学の形態学的解析

尿細管間質損傷を評価するため、腎小片を、前記文献 (SHIMIZU H, MARUYAMA b, YUZAWA Y, et al:Anti— monocyte chemoattractant protein— 1 gene therapy attenuates renal injury induced by protein-overload proteinuria. J Am Soc Nephrol 14: 1496-1505, 2003)に記載された方法を若干修正した方法により、半定量化法を用いて評価した。すなわち、尿細管円柱形成および尿細管損傷 (拡張および変性）の重傷度は、腎髄質外帯部の重ならない 16の視野を 200倍にして、後述する基準により点数ィ匕した。つまり、 0点:正常、 1点：関連する領域の 30 %以下の障害、 2点：関連する領域の 30— 70 %の障害、 3点：関連する領域の 70 %以上の障害、である。間質マクロファージ浸潤は、腎髄質外帯部の重ならない 16の視野を 400倍にして、 ED-1陽性細胞の数を計算することにより評価した。形態的解析は、 2人の観察者により、ツァイス顕微鏡（Oberkochen Germany)を用いて、互いに隠しながら実行した。

[0053] 図 4は、本発明にて行った PAS染色の結果を反映させた組織図を示す。ビヒクル処理したラットからの腎臓小片を PAS染色させた結果から、主に、腎髄質外帯部において損傷しており、 GGA処理により当該損傷が減弱されていることが判明した（図 4 ( A)— (D)参照)。

[0054] 次に、尿細管拡張および変性 (空胞変化、刷子縁の欠失、尿細管上皮細胞の脱落、尿細管細胞核の凝縮)を含む、尿細管損傷の重傷度と、尿細管形成の評価を行つた。図 4 (E)—（F)は、ビヒクルおよび GGAを投与した場合の本発明における組織学の形態学的解析の結果を示す。 GGAによる前処理を行うことにより、尿細管損傷（ 1.7士 0.1対 0.9士 0.2, P < 0.01)と尿細管形成（1.7士 0.1対 0.9

士 0.2, Pく 0.01)の双方において、有意な良好の結果が得られた（図 4 (E)および (F )参照)。また、図 4Gに示す結果から、 ED-1染色により検出されたマクロファージの数は、 GGA投与により有意に抑制されたことが分力つた (15.3士 0.9対 7.5士 0.7, P く 0.01)。

[0055] このプロセスへのアポトーシスの寄与を研究するために、後述する TUNELアツセィを行った。図 5は、ラットの腎髄質外帯部に対するビヒクル処理および GGA処理における TUNELアツセィの結果を示す図である。ビヒクル処理ラットでは、 TUNEL陽性細胞は、主に腎髄質外帯部に局在化していた (図 5 (A)参照)。他方で、図 5 (B)および (C)に示す結果力も明らかなように、 GGA処理により、腎髄質外帯部の TUNEL陽性細胞の数は、有意に減少した (40.2 ± 4.9対 18.2 ± 2.6, P < 0.01)

血中尿素窒素（BUN)と血清クレアチンの測定ビボ実験の終了後、血液を大動脈から回収し、血清を収集した。 BUNレベルおよび血清クレアチン（以下、「_s- Cr」という。）レベルを、ダイァオート UNまたはダイァオートクレアキット（Daiya Shiyaku, Tokyo, Japan)用いて測定した。

[0056] ラットの近位尿細管細胞の分離と培養

ラットの近位尿細管上皮細胞（以下、単に「R-TECs」という。）を、 Spraugue- Dawleyラットから得た腎臓から分離し、 SHIMIZU H, MARUYAMA S, YUZAWA Y, et al:Anti— monocyte chemoattractant protein— 1 gene therapy attenuates renal injury induced by protein-overload proteinuria. J Am Soc Nephrol 14: 149b— 1505, 2003に記載した方法を若干修正させて、 10 %の胎仔血清 (FBS)とホルモンとを含有する K1 培地（224.25 ml Ham's F12, 226.25 ml DEME, 12.5 ml HEPES)にて培養した。 R-TECsは、強いアルカリホスファターゼ反応性を示し、近位尿細管のマーカーである、サイトケラチン（Labsystems, Helsinki, Finland)の抗体により確認された。コンフルエンス（1 X 10⁷ 1 10- cm dish )に達した後、 R- TECsを FBSで洗浄した。

[0057] 図 6は、腎性虚血性再灌流を患って!/、るラットにお、て、ビヒクル処理および GGA 処理による、 BUNおよび s-Crのレベルへの影響を示す図である。図 6に示す結果から、腎性虚血性再灌流を患っているラットは、 BUNおよび s-Crのレベルが顕著に上昇した。 GGAによる前処理により、前記上昇は有意に抑制された（BUN： 56.0士 10.8 対 22.2 ± 2.2, P < 0.01, s-Cr： 1.1 ± 0.2対 0.6 ± 0.1, P < 0.05)。

[0058] インビトロ実験設計

第一に、 GGAによる Hsp70の誘導を、 R-TECsにて検討した。 GGAおよびビヒクルは、 IKEYAMA S, KUSUMOTO K, MIYAKE H, et al:A non-toxic heat shock protein 70 inducer, geranylgeranylacetone, suppresses apoptosis of cultured rat hepatocytes caused by hydrogen peroxide and ethanol. J Hepatol 35: 53—り 1, 2001に記載したよつに調製した。 R-TECsのコンフルェントな第一培養を、 0.1 %の FBS添カ卩したフエノールレッドの存在しないハンクス液中の、連続濃度の GGA (0, 0.1, 1, 10, 100 /z M)またはビヒクルにて、 37 °Cで 2時間インキュベーションし、 Hsp70の発現をウェスタンブロットにより調べた。 10 Mの GGAまたはビヒクルの投与後、 Hsp70発現の時間経過も同時に検討した。 [0059] 次に、 GGAの細胞保護効果を検討した。 GGA ( 10 μ Μ)またはビヒクルによる

R-TECsの前処理を 2時間行い、次いで、さらに 0.5 mMの過酸化水素による 2時間のインキュベーションを行った。インキュベーション終了後、細胞死を TUNNELアツセィにより解析した。

[0060] ウェスタンブロット解析

SHIMIZU H, MARUYAMA S, YUZAWA Y, et al:Anti- monocyte chemoattractant protein- 1 gene therapy attenuates renal injury induced oy protein-overload proteinuria. J Am Soc Nephrol 14: 1496-1505, 2003に記載した方法を若干修正させた方法で、ウェスタンプロット解析を実行した。すなわち、全腎臓調製物または培養細胞を、 RIPAバッファーを用いてホモジナイズさせた。タンパク質の 50 mgを、 10 % SDS-PAGEにて電気泳動により分離し、電気泳動的に PVDF膜（ImmobilonPsq; Millipore, Bedford, USA)に転写した。電気泳動後、無脂肪ミルクによりブロックし、前記 PVDF膜を抗体とともにインキュベートさせた。用いた一次抗体は、 Hsp70, Hsp90, Hsp60および Hsp32に対する抗体であった (Stress Gen Biotechnologies Corp. , Victoria, B.C. , Canada)。二次抗体は、ャギ F(ab')抗マウス Ig's、 HRP結合体、ャギ F(ab')抗マウス Ig's、 HRP結合体（Biosource international, Camarillo, USA)であつた。タンパク質は ECLキット（Amersham, Little Chalfont, UK )を用いて検出し、 NIHイメージソフトウェアを用いて定量ィ匕した。

[0061] 培養させた腎上皮細胞である R-TECsを利用して、 GGAの効果を研究した。図 7は、本発明に用いた R-TECsにおいて、種々の濃度のビヒクル処理および GGA処理による誘導される Hsp70発現の結果を示す図である。図 7に示すウェスタンプロット解析の結果から、 10 /z Mの GGA力 Hsp70発現を有意に増大させることが判明した。一方、図 7 (A)と（C)に示す結果から、 10 Mの GGA処理の結果は、 100 Mの GGAによるインキュベーション後に観測された結果とは異なった。また、図 7 (B)および (D) の結果が示すように、 Hsp70発現の時間経過解析から、 10 /z Mの GGA処理は、 R-TECsにおける Hsp70発現のタンパク質レベルを一時的に増大させ、 1時間から 2 時間後をピークとし、その後、 8時間後にタンパク質レベルが急速に減少することが実証された。図 7 (E)に示す結果から明らかなように、 GGA投与によっても、他のヒートショックタンパク質、具体的には、 Hsp90, Hsp60および Hsp32の発現には影響を及ぼさな力つたことが判明した。

[0062] TUNELアツセィ

TUNEL法 (terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)— mediated dUTP nick-end labeling)を用いて、インシチュアポトーシス検出キット（Takara, Shiga, Japan)にて染色することにより、パラフィン浸漬腎臓小片（ 4 m厚）と 4 %パラホルムアルデヒドに固定した R-TECsとにおいて、アポトーシス細胞の数を求めた。腎髄質外帯部のアポトーシス細胞の数は、 16の重ならない視野を 400倍にして、全体の 1000の尿細管細胞に対して発現させて、その数を数えた。

[0063] 酸ィ匕的ストレスによる尿細管損傷を研究するため、 R-TECsを、 0.5 mM過酸化水素を含有する培地において培養した。図 8は、本発明にて行われた TUNEL法により得られた陽性であった細胞数を比較した図である。なお、図中の矢印は陽性細胞を示す。図 8に示す結果から、 TUNEL陽性細胞の数は、ビヒクル処理した R-TECsでは有意な数であった。他方、 GGAで前処理すると、 TUNEL陽性細胞の数は有意に減少した（66.3 ± 10.4対 7.0 ± 3.3, P < 0.01)。

産業上の利用可能性

[0064] 本発明によれば、 GGAを投与することにより腎臓にてヒートショックタンパク質を誘導し、腎疾患、特に、急性腎不全の予防および/または治療に有効であり、 GGAを有効成分として含有する、腎疾患の予防および/または治療剤が提供される。

図面の簡単な説明

[0065] [図 1]図 1は、本発明に用いた、インビボ (A)およびインビトロ（B)の実験手順を示す。

(A)は、手術の 24時間と 1時間前に、 GGA(400 mg I kg)とビヒクルを経口投与したラットの実験手順を示す。双方の腎臓は、 30分間の虚血状態に陥り、 24時間後に死亡した。（B)は、 R-TECsを GGA (10 M)とビヒクルで 2時間処理し、次いで、 0.5 mMの過酸化水素で 2時間インキュベーションした。インキュベーション終了後、細胞を固定し、 TUNELアツセィを実行した。

[図 2]図 2は、 GGA経口投与 24時間後における、ラットでの Hsp70の発現に対する GGA投与量の効果の結果を示す図である。 (A)は、経口的な GGA投与 24時間後の、用量依存的な Hsp70発現を、ウェスタンブロット法により解析した結果である。 Hsp70発現は、 GGA(400 mg I kg)を与えたラットでは顕著に増大した力 800 mg / kgの用量では、さらに増大しなかった。なお、ビヒクル処理のラットに対する P値は、 0.05以下であった（ Pく 0.05 ) ₀ (Bおよび C)は、免疫組織化学的研究の結果を示し、正常なラットの腎臓では (B)、尿細管上皮細胞において、 Hsp70発現の実質的なレベルが観測された。 GGAの経口投与により、腎髄質外帯部の腎尿細管細胞にて、特に、 Hsp70発現のレベルが上昇した（（C)参照）。（D)は、ウェスタンブロット法により、他の Hspタンパク質の発現も検討した結果を示す。 GGA(400 mg I kg)投与 24時間後、腎臓では、 Hsp90, Hsp60および Hsp32の発現は誘導されなかった。オープン力ラムはビヒクル投与の結果であり、影付きカラムは GGA投与の結果である。

[図 3]図 3は、ラットへの 400 mg I kgの GGA投与後の Hsp70発現の経時変化を示す図である。経口的な単一の GGA (400 mg / kg)投与、 12、 24、および 48時間後において、 Hsp70発現のレベルを調査した。 12時間後まで Hsp70の発現は上昇し、 24 時間後にピークを向かえ、 48時間後には減少した。ビヒクル投与群における Hsp70 発現のレベルは、時間に依存した変化は観測されなかった。また、 GGA(400mg / kg )の 2回の経口投与後（0時間と 24時間）、 48時間後の Hsp70発現のレベルを調查した。 Hsp70発現のレベルピークは、単一経口投与 24時間後に誘導されるピークレベルに匹敵した。オープンカラムはビヒクル投与の結果を示し、影付きカラムは GGA投与の結果を示す。ビヒクル処理ラットに対する P値は、 0.05以下であった (P < 0.05)。

[図 4]図 4は、本発明にて行った PAS染色の結果を反映させた組織図を示す。ビヒクル処理ラットからの小片（(A)および (C) )から、尿細管円柱形成、尿細管拡張および尿細管変性 (空胞編か、刷子縁の欠失、尿細管上皮膚細胞の脱落、尿細管細胞核の凝縮)が、主に腎髄質外帯部にて発生した。 GGA処理したラットの腎臓力（(B)および (D) )、中程度の尿細管損傷のみが観測された。 GGAにより前処理により、上記の全ての変化が減弱した（（B)および (D)参照)。（A)および (B)は、 PAS染色された腎臓小片の低倍率（100倍)の写真であり、（C)および (D)の結果は、 PAS染色された腎臓小片の高倍率 (400倍)の写真である。尿細管損傷および尿細管円柱形成を評価するために、腎臓小片は、半定量ィ匕評価法を用いて解析した。 GGA処理により、有意な良好なスコアが得られた（(E)および (F)参照)。また、 ED-1陽性細胞 (マクロファージ)の数は、 GGA投与により有意に抑制された ( (G)参照)。

[図 5]図 5は、ラットの腎髄質外帯部に対するビヒクル処理および GGA処理における TUNELアツセィの結果を示す図である。なお、図 5中の矢印は、 TUNEL陽性細胞を示す。ビヒクル処理ラットにおいて、 TUNEL陽性細胞は、主に腎髄質外帯部において局在化している（(A)参照)。 GGA投与ラットにおいて、アポトーシス細胞数はほとんど観測されなカゝつた（（B)参照)。 TUNEL陽性細胞の数は、全体で 1000の尿細管細胞に対して発現させた（（C)参照)。 GGAにより、尿細管のアポトーシス細胞死は有意に抑制された（P〈 0.01)。

[図 6]図 6は、腎性虚血性再灌流を患っているラットにおいて、ビヒクル処理および GGA処理による、 BUNおよび s-Crのレベルへの影響を示す図である。腎性 I/Rを患つていたラットは、 BUNおよび血清背クレアチンのレベルにて、有意な上昇を示した。 GGAによる前処理により、上記上昇は有意に抑制された。

[図 7]図 7は、本発明に用いた R-TECsにおいて、種々の濃度のビヒクル処理および GGA処理による誘導される Hsp70発現の結果を示す図である。ウェスタンブロット解祈により、 10 /z Mの GGAが Hsp70発現を有意に上昇させることを示している。その結果は、 100 /z Mの GGAによるインキュベーション後に観測された結果とは相違した（図 7 (A)および（C)参照）。 Hsp70発現の経時変化から、 10 /z Mの GGAにより、 R-TECsにおける Hsp70のタンパク質レベルは一時的には上昇し、 1から 2時間でピークに達し、次いで、 8時間後には急速に減少した（図 7 (B)および図 7 (D)参照)。他の Hsp (Hsp90, Hsp60および Hsp32)の発現は、 GGA投与により影響を受けなかつた (図 7 (E)参照)。

[図 8]図 8は、本発明にて行われた TUNEL法により得られた陽性であった細胞数を比較した図である。 R-TECsを、 0.5 mM過酸化水素を含有する培地にてインキュベーシヨンさせた。 TUNEL陽性細胞の数は、ビヒクル処理の R-TECsでは有意に観測された（(A)参照)。 GGA前処理により、 TUNEL陽性細胞の数は有意に減少した（（B)参照)。その差異は、統計的に有意であった（(C)参照、 Pく 0.01 )。

Claims

請求の範囲

[1] ヒートショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、腎疾患の予防剤および Zまたは治療剤。

[2] 前記ヒートショックタンパク質誘導剤が、プレニルケトン系化合物である、請求項 1に記載の腎疾患の予防剤および Zまたは治療剤。

[3] 前記プレニルケトン系化合物が、

[化 1]

で表される 6, 10, 14, 18—テトラメチルー 5, 9, 13, 17—ナノデカテトラェンー 2—オンである、請求項 2に記載の腎疾患の予防剤および Zまたは治療剤。

[4] 前記腎疾患は、急性腎不全である、請求項 1ないし 3のうち何れか一項に記載の腎疾患の予防剤および Zまたは治療剤。

[5] 前記ヒートショックタンパク質がヒートショックタンパク質 70である、請求項 1ないし 4のうち何れか一項に記載の腎疾患の予防剤および Zまたは治療剤。

[6] ヒートショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物を投与するェ程を含む、腎疾患の予防方法および Zまたは治療方法。

[7] 前記ヒートショックタンパク質誘導剤が、プレニルケトン系化合物である、請求項 6に記載の腎疾患の予防方法および Zまたは治療方法。

[8] 前記プレニルケトン系化合物が、

[化 1]

で表される 6, 10, 14, 18—テトラメチルー 5, 9, 13, 17—ナノデカテトラェンー 2—オンである、請求項 7に記載の腎疾患の予防方法および Zまたは治療方法。

[9] 前記腎疾患は、急性腎不全である、請求項 6な、し 8のうち何れか一項に記載の腎疾患の予防方法および Zまたは治療方法。

[10] 前記ヒートショックタンパク質がヒートショックタンパク質 70である、請求項 6ないし 9 のうち何れか一項に記載の腎疾患の予防方法および Zまたは治療方法。

[11] ヒートショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、腎疾患の予防剤および Zまたは治療剤を製造するための、ヒートショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物の使用。

[12] 前記ヒートショックタンパク質誘導剤が、プレニルケトン系化合物である、請求項 11 に記載の使用。

[13] 前記プレニルケトン系化合物が、

[化 1]

で表される 6, 10, 14, 18—テトラメチルー 5, 9, 13, 17—ナノデカテトラェンー 2—オンである、請求項 12に記載の使用。

[14] 前記腎疾患は、急性腎不全である、請求項 11ないし 13のうち何れか一項に記載の使用。

[15] 前記ヒートショックタンパク質カ^ートショックタンパク質 70である、請求項 11ないし 14のうち何れか一項に記載の使用。