WO2004106539A1 - 細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法 - Google Patents

細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法 Download PDF

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WO2004106539A1
WO2004106539A1 PCT/JP2004/007808 JP2004007808W WO2004106539A1 WO 2004106539 A1 WO2004106539 A1 WO 2004106539A1 JP 2004007808 W JP2004007808 W JP 2004007808W WO 2004106539 A1 WO2004106539 A1 WO 2004106539A1
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seq
amino acid
test sample
acid sequence
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PCT/JP2004/007808
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French (fr)
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Kazuhisa Sekimizu
Kenji Kurokawa
Miki Matsuo
Kazuhisa Murakami
Norio Fukuhara
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Shionogi and Co Ltd
Genome Pharmaceuticals Institute Co Ltd
Original Assignee
Shionogi and Co Ltd
Genome Pharmaceuticals Institute Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material

Definitions

  • the present invention relates to a means for screening a bacterial growth inhibitor. More specifically, the present invention relates to a method for evaluating the growth inhibitory effect on bacteria, a method for screening a bacterial growth inhibitor, and a temperature-sensitive mutant of Staphylococcus aureus. Background art
  • Bacterial drug resistance is often attributed to the target or mode of action of the antimicrobial agent.
  • 6-lactam drugs have the basic skeleton.
  • 3-Lactam rings are cleaved to covalently inactivate and inactivate target benicillin-binding proteins, thereby exerting an antibacterial effect.
  • the mechanism of bacterial resistance to / 3-lactam drugs is known to decrease drug affinity due to mutations in the bencilin-binding protein and to inactivate the drug due to the production of / 3-lactam ring. Have been.
  • quinolone resistance is increased by mutation of DNA gyrase, which is an action target. Disclosure of the invention ADVANTAGE OF THE INVENTION
  • the new target for screening the antagonist or inhibitor which can suppress efficiently the proliferation of bacteria, such as Staphylococcus aureus, various gram positive bacteria, and gram negative bacteria, is provided.
  • the present invention provides a simple and rapid method for evaluating the growth inhibitory effect on bacteria such as various gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus and gram-negative bacteria, and a pharmacological evaluation of a bacterial growth inhibitor. And a method for evaluating a growth inhibitory effect on bacteria that at least achieves the following.
  • the present invention is also effective against various Gram-positive bacteria including Staphylococcus aureus and Gram-negative bacteria, and includes various Gram-positive bacteria including Staphylococcus aureus and Gram-negative bacteria.
  • various Gram-positive bacteria including Staphylococcus aureus and Gram-negative bacteria.
  • To efficiently screen for antagonists or inhibitors that can effectively suppress the growth of bacteria to screen for antagonists or inhibitors whose mechanism of action is different from that of existing antibacterial agents, etc.
  • a variety of gram-positive and gram-negative bacteria, including Staphylococcus aureus that can screen at least one of an anthony gonist or an inhibitor that is not easily affected by the drug resistance mechanism of drug-resistant bacteria And a method for screening a bacterial growth inhibitor.
  • the present invention is effective against various gram-positive bacteria including Staphylococcus aureus, and various bacteria such as Gram-negative bacteria, and is effective against various dram-positive bacteria including Staphylococcus aureus and Gram-negative bacteria.
  • An object of the present invention is to provide a temperature-sensitive strain of Staphylococcus aureus, which enables at least one of screening for antagonists or inhibitors that are not easily affected by the drug-resistant mechanism of the drug-resistant bacteria.
  • the gist of the present invention is: [1] A. and / or B. below in the presence of the test sample:
  • a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA054 4), a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293), and encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9
  • a screening method for a bacterial growth inhibitor which comprises selecting an angonist or an inhibitor based on the change between the above events and the kinetics of Z or B.
  • a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA0544), a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293), and a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 Comparing the expression level of at least one gene selected from the group consisting of (SA1511) with the expression level of the gene in the absence of the test sample; The screening method according to the above (2), wherein the test substance is selected based on a decrease in the expression level of the gene as an index.
  • a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA0544), a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293), and a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 Comparing the function of the polypeptide encoded by at least one gene selected from the group consisting of (SA1511) with the function of the polypeptide in the absence of the test sample; A screening method according to the above (2), wherein a test substance is selected using, as an index, a decrease in the function of the polypeptide.
  • an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 A temperature-sensitive mutant of Staphylococcus aureus, having a gene having a mutation in at least a part of at least one nucleotide sequence selected from the group consisting of:
  • a method for screening a bacterial growth inhibitor which comprises detecting a change in the presence or absence of a test substance using the temperature-sensitive mutant according to (6);
  • the test sample is selected based on the fact that a change occurs between the phenomenon that occurs when the test sample is brought into contact with the temperature-sensitive mutant strain and the phenomenon that occurs when the test sample is brought into contact with a wild-type strain.
  • a method for screening a bacterial growth inhibitor comprising:
  • [10] (1) a phenomenon that occurs when the temperature-sensitive mutant according to the above [6] is cultured at an optimal growth temperature of a wild-type bacterium that is a source of the temperature-sensitive mutant; Observing the difference between the temperature-sensitive mutant strain and the phenomenon that occurs when the strain is cultured at a temperature at which the growth of the temperature-sensitive mutant is affected.
  • a method for screening a bacterial growth inhibitor comprising selecting a candidate substance that causes cell growth inhibition and / or cell death by using, as an index, the fact that substantially the same phenomenon is detected.
  • One aspect of the present invention relates to the following A. and / or B. in the presence of a test sample:
  • a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA054 4), a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293), and encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 Evaluating the events occurring through at least one gene selected from the group consisting of the gene (SA1511), B. the kinetics of the polypeptide encoded by the gene or a fragment thereof. A method for evaluating the effect of a test substance on inhibiting the growth of bacteria.
  • the gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA0544; accession number: NP-3 7 7 798); the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6
  • a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (SA1253; accession number: NP-3757474); 2004/007808 number: NP-3 7 4 7 9 9) may be collectively referred to as “indicator gene”.
  • index gene examples include, for example, a gene (SA0544) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 5 And the gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 8 (SA1511).
  • a polypeptide encoded by the indicator gene specifically, for example, a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (SA 0 5 4 4), a polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293), a polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (SA1511) Is referred to as an “indicator polypeptide”.
  • anguist gonist or “inhibitor ichi” refers to the expression, function or physiological activity of the indicator gene or indicator polypeptide, the indicator gene or indicator polypeptide and other genes or genes thereof.
  • a compound capable of neutralizing, reducing or inhibiting the interaction with a product is a compound capable of neutralizing, reducing or inhibiting the interaction with a product.
  • the effect of a test substance on an event occurring through a gene essential for survival and / or the kinetics of a polypeptide can be evaluated.
  • bacteria particularly various gram-positive bacteria including Staphylococcus aureus
  • various Gram-positive bacteria including Staphylococcus aureus Bacteria that can efficiently inhibit the growth of Gram-negative bacteria, particularly various gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus, and Angonis or inhibitors that are useful as growth inhibitors for Gram-negative bacteria. Evaluation can be performed simply, quickly, and efficiently.
  • the term “temperature-sensitive mutant” refers to a low-temperature, for example, at 30 ° C., which is capable of growing in the same manner as the wild-type bacterium from which the above-mentioned temperature-sensitive mutant is derived, but has a higher temperature. For example, it is a mutant strain that cannot grow at 43 ° C unlike wild-type bacteria.
  • the temperature-sensitive mutant exhibits the same behavior as a wild-type bacterium at a normal growth temperature of a wild-type bacterium, but at a temperature higher than the growth temperature, inhibits the function of a growth-related enzyme, Increased function of protein expressed at high temperature, inhibition of metabolism of toxin expressed at high temperature, generation of abnormal folding or abnormal conformation of protein, inhibition of proofreading ability of the abnormal folding, performed at normal temperature Proliferation is inhibited or suppressed through various events such as inhibition of transcription, promotion of transcription performed at high temperature, increased occurrence of DNA replication errors, inhibition of the ability to repair DNA replication errors, and the like, Or cells that die.
  • (SA1511) may be collectively referred to as "indicator gene”.
  • the “index gene” specifically, for example, a gene (SAO544) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, or having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 5 Gene (SA1253), and a gene (SA1511) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 8.
  • a polypeptide encoded by the indicator gene specifically, for example, a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (SA0544), A polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293) and a polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (SA1511)
  • SA0544 a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • SA1293 A polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6
  • SA1511 polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9
  • the indicator gene may be a Staphylococcus aureus, for example, Staphylococcus aureus RN422 strain, a nitroso compound, for example, nitrosoguanidine, etc.
  • Staphylococcus aureus for example, Staphylococcus aureus RN422 strain
  • a nitroso compound for example, nitrosoguanidine
  • the indicator gene may be a variant of the indicator gene as long as it exerts a function on the growth of S. aureus.
  • Variants of such an indicator gene include, for example, a temperature-sensitive mutant strain of Staphylococcus aureus mutated in any one of SA0544, SA1293 and SA1511 (for example, TS11 24 shares, TS5815, SA12293, TS4310, TS2005, SA1511, TS4530, TS822, etc. ) Can be easily selected by performing a complementation test on the proliferative function.
  • the complementation test for the growth function is performed by introducing a variant of the indicator gene into the mutant strain by a conventional gene transfer method, and transforming the obtained transformant into a wild-type Staphylococcus aureus, which is temperature-sensitive.
  • Mutant strains can be obtained by culturing under conditions that prevent growth.
  • the variant of the indicator gene is selected as an indicator that the variant can be used in the present invention.
  • condition under which wild-type Staphylococcus aureus can grow and temperature-sensitive mutants cannot grow include, for example, LB medium [composition: 1% by weight of protein tributone, 0.5% by weight of yeast extract, ( pH 7.0)], and culturing at 43 ° C.
  • variant of the indicator gene refers to a variant in which a natural gene is spontaneously mutated in the natural world, and the encoded product exerts its original function.
  • variants include, for example, (b) at least one salt in the base sequence of the indicator gene; 2004/007808 Polypeptide having a nucleotide sequence having a mutation (substitution, deletion, insertion, addition, etc.) of a group, and encoding the growth function in the complementation test of the growth function
  • a nucleotide sequence having at least one substitution, deletion, addition or insertion of at least one nucleotide in the nucleotide sequence of (a), and the encoded polypeptide is capable of growing bacteria.
  • nucleic acid that can hybridize with an antisense strand of a nucleic acid comprising the nucleotide sequence of the indicator gene under stringent conditions, preferably under medium stringency conditions, more preferably under high stringency conditions.
  • nucleotide sequence of a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with the antisense strand of the nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of (a), and that the encoded polypeptide acts on bacterial growth.
  • the “at least one base” means one or several bases, that is, nucleotide residues. Such mutations are Alternatively, the gene may be artificially generated by a conventional site-specific mutagenesis method following a naturally occurring mutation in a natural gene.
  • the “stringent conditions” include 6 X S
  • the above-mentioned A Events generated via the indicator gene, and Z or B. Kinetics of at least one kind of the indicator polypeptide or a fragment thereof. , Are used.
  • Examples of the “A. events that occur via the indicator gene” include an increase or a decrease in the expression level of the gene, that is, an increase or decrease in the transcriptional activity of the indicator gene (DNA or mRNA) and an increase or decrease in the amount of the gene.
  • Examples of the “B. dynamics of at least one type of indicator polypeptide or a fragment thereof” include changes in the expression level of the indicator polypeptide, functions of the indicator polypeptide, such as enzyme activity and receptor binding ability.
  • the evaluation method of the present invention it is effective against bacteria, in particular, various Gram-positive bacteria including Staphylococcus aureus, and various Gram-positive bacteria including Staphylococcus aureus, Bacteria that can efficiently suppress the growth of Gram-negative bacteria, and are useful as growth inhibitors for bacteria, especially various Gram-positive bacteria including Staphylococcus aureus, and Gram-negative bacteria. Can be screened efficiently.
  • the method for screening a bacterial growth inhibitor of the present invention comprises the following A. and / or B. in the presence or absence of a test sample:
  • the screening method of the present invention provides a method for kinetics of a gene or a fragment thereof essential for the growth of Staphylococcus aureus, an event generated through the gene, and a kinetics of a polypeptide or a fragment thereof encoded by the gene.
  • the antagonist or the inhibitor selected by the screening method of the present invention is effective against Staphylococcus aureus, and is a growth inhibitor that can efficiently suppress the growth of Staphylococcus aureus. It has an excellent effect of being an agent.
  • the antibacterial agent obtained by the screening method of the present invention will also exerts an excellent growth inhibitory effect.
  • the gene used in the screening method of the present invention is different from the gene targeted by the existing antibacterial agent, the antibacterial agent obtained by the screening method of the present invention has a novel mechanism of action. And therefore also resistant bacteria Expected to have antibacterial activity.
  • the antagonist or inhibitor selected by the screening method of the present invention is preferably a substance that decreases the expression level of the indicator gene, a substance that decreases the expression level of the polypeptide encoded by the indicator gene, or It is a substance that reduces the function of the polypeptide encoded by the indicator gene.
  • Test samples that can be subjected to the screening method of the present invention include, for example, cell extracts such as organisms (eg, plants, animals, microorganisms), cell-free extracts of the organism, cell cultures of the organism, Examples include substances contained in samples such as tissue cultures, chemically synthesized compounds, biologically produced substances, and the like.
  • Examples of the test sample include an expression library such as a cDNA expression library, a peptide, a peptidomimetic, a hormone, another protein, a nucleic acid, a nucleic acid analog (eg, a peptide nucleic acid (PNA), etc.), a combinatorial chemistry, and the like.
  • a compound of the combinatorial library obtained by the above; an antisense nucleic acid of the indicator gene; a ribozyme specific to the indicator gene; RNAi specific to the indicator gene; an antibody to the indicator polypeptide; DNA abtamers for polypeptides and other compounds are also included.
  • the nucleic acid, the nucleic acid analog, the PNA, the antisense nucleic acid, the lipozyme, the RNAi and the antibody may be subjected to various modifications and derivatizations from the viewpoint of screening for a substance exhibiting better compatibility.
  • the target substance is selected from the substances contained in the test sample.
  • the test sample is subjected to an appropriate method, for example, various chemical chromatography, salting out, extraction of organic solvent, etc.
  • fractions obtained by subdividing the substances contained in the test sample by fractionation based on the identity or similarity of physical properties are obtained, and each of the fractions is again subjected to the screening method of the present invention; By selecting fractions exhibiting the desired action, antagonists or inhibitors can be selected. The fractionation and the screening method may be repeated as needed.
  • indices for selecting an anthropogonist or an incense as one of the indices for selecting an anthropogonist or an incense, A. an event generated through an indicator gene, and Z or
  • the screening method for evaluating the kinetics of A.
  • Gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA0544), gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293), and SEQ ID NO: 9
  • a screening method in which the expression level is compared with the expression level and the test substance is selected in the presence of the test sample using the decrease in the expression level of the gene as an index.
  • the expression level of the indicator gene can be measured, for example, by measuring transcriptional activity using a reporter gene, by quantitative analysis of an expression product by RT-PCR or Northern blotting, or the like.
  • a conventional quantifiable reporter gene can be operated downstream of the indicator gene.
  • the resulting construct can be directly or indirectly introduced into a host by an appropriate means, and the expression can be measured by quantifying the expression product of the reporter gene.
  • the repo overnight gene includes, for example, a / 3-galactosidase gene, a clonal ramphenicopropyl acetyltransferase gene, a luciferase gene and the like.
  • Examples of the host include Escherichia coli (Hs101 strain, Escherichia coli K-12 strain HB101, C600 strain, JM109 strain, etc.), yeasts (Saccharomyces mrs, cell bije, etc.) and the like.
  • Escherichia coli Hs101 strain, Escherichia coli K-12 strain HB101, C600 strain, JM109 strain, etc.
  • yeasts Sacharomyces mrs, cell bije, etc.
  • the above-described construct can be introduced into a host cell by, for example, ligating the construct to a conventional vector and introducing the construct into a host cell, or directly introducing the construct into a host cell.
  • the vector can be appropriately selected depending on the host cell to be used.
  • a pUC derivative for example, pUC19 or the like, a trade name: pBluescriptll [Stratagene (S tratagene), pBR322, pCR3, pCM VSP ORT, and the like; and phage vectors such as ⁇ II and ⁇ gt11.
  • yeast cell examples of the vector include pYSES2, pYEUra3, and the like.
  • examples include pAcSGHisNT-A.
  • examples include pKCR, pEFB ⁇ S, cDM8, pCEV4, and the like.
  • Examples of a method for introducing the above-mentioned construct into a host include a conventional gene transfer method represented by a calcium chloride method, an electroporation method, and the like.
  • the amount of the expression product of the reporter gene can be measured by means depending on the type of the reporter gene.
  • the expression product of a reporter gene is an enzyme
  • measurement of enzyme activity, measurement of the amount of decomposition products of the substrate of the enzyme, measurement of fluorescence intensity, and the like can be mentioned.
  • the indicator gene or a characteristic portion thereof is amplified using a primer pair that specifically amplifies the indicator gene or a characteristic portion thereof, and quantified by a conventional method. It is done by doing.
  • the “characteristic portion” means a portion of an indicator gene that is not substantially found in a sequence registered in a known database.
  • the primer pair can be designed with conventional primer design software or the like with reference to the base sequence of the indicator gene and a sequence registered in a known database.
  • the primer pair can be appropriately labeled with a labeling substance (fluorescent substance, radioactive substance, etc.) suitable for detection.
  • the chain length of the primer is not particularly limited, but is preferably, for example, preferably at least 15 contiguous nucleotides, more preferably 15 to 40 nucleotides, and even more preferably 17 to 30 nucleotides. .
  • the amount of the amplification product due to RT-PCR can be quantified via, for example, the fluorescence intensity based on ethidium bromide, the amount of a labeling substance, and the like.
  • a probe specific to the designed indicator gene is referred to by referring to the base sequence of the indicator gene and a sequence registered on a known database.
  • the probe can be labeled with a labeling substance (fluorescent substance, radioactive substance, etc.) suitable for detection.
  • the chain length of the probe is not particularly limited, but from the viewpoint of preventing non-specific hybridization, it is preferable that the
  • It is preferably 15 nucleotides, more preferably 18 nucleotides or more.
  • the test substance when the expression level of the indicator gene is decreased in the presence of the test substance compared to the absence of the test substance, the test substance inhibits bacterial growth. It is an indicator that it has an action as an agent.
  • a test sample that is not known to be capable of binding to the indicator polypeptide can be tested.
  • a test sample that is not known to be capable of binding to the indicator polypeptide
  • Such a test allows the binding of a ligand (known as a purified or partially purified product) prepared from a high-producing strain of Escherichia coli to a ligand known to bind to the indicator polypeptide in the presence of a test sample. Maintaining the same conditions as those described above, and examining whether or not the test sample inhibits the binding of the ligand to the indicator polypeptide; that is, at least one of the aforementioned “B. Or the dynamics of that fragment ”.
  • a ligand known as a purified or partially purified product
  • the screening method for evaluating the dynamics of B. includes:
  • the screening method of the second embodiment may be performed in combination with the first embodiment.
  • the screening may be performed prior to the step (A), and after the step (B), the identified screening gonist or inhibitor of the second embodiment may be subjected to the screening of the second embodiment.
  • a ding method may be performed.
  • the test sample can be selected by performing the resonance plasmon analysis or the like.
  • Appropriate detection means eg, optical detection (fluorescence, fluorescence polarization, etc.), combined with a mass spectrometer (matrix-assisted laser desorption / ionization, time-of-flight mass spectrometer: MALD I—T ⁇ F MS , Electrospray 'Ionization Mass Spectrometer: ESI-MS, etc.)
  • randomized peptides are displayed from phage and immobilized.
  • Phage display method in which screening is performed by affinity chromatography on activated receptors (for example, WO 9/17271, pamphlet, WO 9204107 pamphlet, U.S. Patent No. 5,223,409], combinatorial chemistry of peptides and compounds fixed on a chip [for example, US Pat. No. 5,143,854, International Publication No. 90, 150, 70 pamphlet, International Publication No.
  • the screening method according to the second aspect includes:
  • a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (SA0544), a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293), and a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 Comparing the expression level of the polypeptide encoded by at least one gene (indicator gene) selected from the group consisting of (SA1511) with the expression level of the polypeptide in the absence of the test sample
  • a screening method (Embodiment 2 ′), wherein a test substance is selected based on a decrease in the expression level of the polypeptide in the presence of the test sample;
  • a gene (SA0544) encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 At least one gene selected from the group consisting of the gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293) and the gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (SA1511)
  • SA1293 At least one gene selected from the group consisting of the gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (SA1293) and the gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (SA1511)
  • the expression level of the polypeptide can be measured by an immunochemical method using an antibody specific to the polypeptide, for example, a conventional Western blot method, a conventional ELISA method, or the like. .
  • the antibody may have any ability to specifically bind to the polypeptide.
  • the antibody is encoded by the indicator gene according to the method described in, for example, John E. Colligan, edited by Current Protocols Immunology, 1992, and the like. It can be easily prepared by immunizing a egret, a mouse or the like using the polypeptide or a part thereof.
  • the antibody may be an antibody modified by a known technique or a derivative of the antibody.
  • the antibody may be a fragment of the antibody obtained by treating the obtained antibody with beptidase or the like.
  • the antibody can be labeled with a conventional labeling substance (eg, a fluorescent substance, peroxidase, etc.).
  • the expression level of the polypeptide encoded by the indicator gene is reduced in the presence of the test substance as compared to the absence of the test substance. This serves as an indicator that the test substance has an action as a bacterial growth inhibitor.
  • an indicator gene is ligated to an appropriate vector, the obtained expression vector is introduced into a host suitable for expression of the indicator polypeptide, and the expression vector is suitable for expression of the indicator polypeptide.
  • the indicator polypeptide may be expressed, and the function of the obtained indicator polypeptide may be evaluated.
  • the vector and the host are the same as described above. Further, the introduction of the expression vector into the host can be performed by the above-described gene transfer method.
  • the indicator polypeptide may be expressed as a fusion protein with a His tag, GST, or the like.
  • the expressed indicator polypeptide is appropriately purified by a conventional protein purification method (eg, centrifugation, salting out, dialysis, ion exchange column chromatography, adsorption column chromatography, affinity chromatography, chromatofocusing, etc.). Can be done.
  • a conventional protein purification method eg, centrifugation, salting out, dialysis, ion exchange column chromatography, adsorption column chromatography, affinity chromatography, chromatofocusing, etc.
  • Functions of the indicator polypeptide include, for example, enzyme activity, ligand binding ability, and the like.
  • a bacterial infection or a disorder associated with a bacterial infection is determined based on a binding site between the indicator polypeptide and a ligand that binds to the indicator polypeptide, for example, an anthony gonist, an inhibitor, or the like. You can design an enemies or inhibitors to treat the disease.
  • the substances designed as described above can also be used as test substances in the screening method of the present invention. Therefore, the designing method of the antagonist or the inhibitor is also included in the present invention.
  • the method of designing an angry gonist or an inhibitor for treating a bacterial infection or a disorder or disease related to a bacterial infection of the present invention comprises the following steps (i) to (iiii):
  • step (ii) performing molecular modeling of both the binding site identified in step (i) and the structure of the polypeptide to obtain a molecular model, respectively. And (iii) modifying the angiogonist or the inhibitor based on the molecular model obtained in the step (ii), thereby improving the binding specificity or affinity for the polypeptide.
  • the design method of the present invention has one significant feature in that a binding site of an antagonist or inhibitor to at least one kind of the indicator polypeptide or a fragment thereof is used.
  • a binding site of an antagonist or inhibitor to at least one kind of the indicator polypeptide or a fragment thereof is used.
  • the use of such a binding site provides an excellent effect of being able to design a structure capable of exhibiting properties more suitable for bacterial infection or a disorder or disease associated with bacterial infection. .
  • the design method of the present invention performs molecular modeling of both the binding site and the structure of the indicator polypeptide, it has a property that is more suitable for bacterial infection or a disorder or disease related to bacterial infection. It has an excellent effect that it is possible to design a possible structure.
  • Examples of the bacterial infection include infections caused by Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, and the like.
  • disorders or diseases related to bacterial infections include, for example, bronchitis, pneumonia, pyelonephritis, urethritis, superficial purulent dermatitis, otitis media, and the like.
  • an evening gonist or inhibitor includes an angling gonist or inhibitor identified by the screening method of the present invention.
  • the anniversary gonist or inhibitory nucleus is based on the anniversary gonist, inhibitory iris, etc. identified by the screening method of the present invention, by the peptide mimetic production technology, combinatorial chemistry technology, or the like. It may be a derivative compound obtained by performing modification, derivatization and the like.
  • the binding site may be, for example, When the second strike or the inhibitor is a polypeptide, the binding affinity between the mutant gene or inhibitor produced by the conventional site-directed mutagenesis method and the marker gene or fragment thereof or the marker polypeptide or fragment thereof Sex, or by examining the binding affinity between the chimeric peptide produced from the anthony gonist or the inhibitor and the indicator gene or a fragment thereof or the indicator polypeptide or a fragment thereof. sell.
  • a mutant-type indicator polypeptide is prepared for the indicator polypeptide by a conventional site-specific mutagenesis method, and the obtained mutant-type indicator polypeptide is obtained.
  • the binding affinity between the peptide and the angiogonist or inhibitor is examined, and the interaction with the amino acid residue of the indicator polypeptide corresponding to the modified amino acid residue of the mutant indicator polypeptide for which no binding is detected (for example, Covalent bonds, ionic interactions, ion-dipole interactions, dipole-dipole interactions, hydrogen bonds, van der Waals forces, hydrophobic interactions, etc.)
  • the functional group can be determined.
  • Covalent bonds can be created, for example, by functional groups that are susceptible to alkylation, acylation, phosphorylation, etc.
  • I I Ionic interactions can occur between positively or negatively charged amino acid residues on a polypeptide and a functional group having an opposite charge to the residue
  • Ion-dipole interaction and dipole-dipole interaction are, for example, a dipole in which charge is biased due to a bond between a strong electronegativity atom and a weak electronegativity atom. Can occur if present
  • V. Van der Waals force can occur between two neutral molecules.
  • the hydrophobic interaction may occur between non-polar molecules or between non-polar sites of the molecule.
  • step (ii) molecular modeling is performed for each of the binding site and the indicator polypeptide.
  • the molecular modeling can be performed by, for example, nuclear magnetic resonance (NMR), for example, structural analysis by two-dimensional NMR, or structural analysis by X-ray diffraction.
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • X-ray diffraction X-ray diffraction
  • the antigen gonist or inhibitor and the indicator A complex is formed by mixing with the polypeptide, and the obtained complex is analyzed by NMR, or the complex is crystallized, and the obtained crystal is three-dimensionally analyzed by X-ray structure analysis. It is desirable to get the coordinates.
  • step (iii) based on the molecular model obtained in step (ii), the angiogonist or the inhibitor is modified, thereby improving the binding specificity or affinity for the polypeptide. .
  • step (ii) the modification of the antagonist or inhibitor is performed based on the molecular model obtained in the step (ii).
  • IC 5 for the indicator polypeptide can be designed to be 50 M or less, preferably 5 M or less, more preferably 0.5 M or less.
  • the therapeutic effect of the antagonist or inhibitor obtained by the designing method of the present invention on bacterial infections or disorders or diseases related to bacterial infections is, for example, the minimum inhibitory concentration against various gram-positive bacteria and gram-negative bacteria.
  • the present invention provides a polynucleotide comprising a base sequence of a gene selected from the group consisting of SA0544, SA1293 and SA1511, and a polynucleotide encoded by the base sequence. Also included is the use of the peptide as a nucleic acid associated with bacterial growth or the polypeptide for the manufacture of a medicament for treating or preventing a disease such as a bacterial infection.
  • the temperature-sensitive mutant of the present invention includes a gene (SA0544) coding for the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and the like. And a part of at least one kind of base sequence selected from the group consisting of the gene encoding the amino acid sequence (SA1253) and the gene encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 (SA1511). Having a gene with a mutation, yellow Temperature-sensitive mutants of Staphylococcus aureus.
  • the “mutation” in the description of the temperature-sensitive mutant strain of the present invention refers to a mutation that produces a product that cannot exert a function essential for bacterial growth at a high temperature, for example, at 43 ° C., at the amino acid level.
  • a high temperature for example, at 43 ° C.
  • a base that greatly alters the structure or active function.
  • the temperature-sensitive mutant strain used in the present invention is more specifically, for example, TS111 strain, TS5815 strain, TS2005 strain, TS4310 strain, TS4530 strain, TS8229 strain, etc., specifically, A nucleotide sequence (TS 1124 strain) in which a codon corresponding to serine at amino acid number 204 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (S AO 544) was replaced with a codon corresponding to leucine;
  • a nucleotide sequence (TS 5815 strain) in which a codon corresponding to glycine of amino acid number: 189 of the amino acid sequence of amino acid number: 189 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (S AO 544) was replaced with a codon corresponding to aspartic acid;
  • Temperature-sensitive mutants having a base sequence selected from the group consisting of You.
  • the above-mentioned temperature-sensitive mutant strain includes a strain having the above mutation produced by a genetic engineering technique, for example, an overlap extension method which is a site-directed mutagenesis method, or a strain having a naturally occurring mutation. Also includes strains.
  • the use of the temperature-sensitive mutant strain of the present invention allows screening for a bacterial growth inhibitor.
  • another aspect of the present invention provides a method for screening a bacterial growth inhibitor, which comprises detecting a change in the presence or absence of a test substance using the temperature-sensitive mutant of the present invention. (Aspect 3).
  • phenomena that occur when a test sample is brought into contact include, for example, cell death, cell growth inhibition, accumulation of biosynthetic intermediates of bacterial components, accumulation of metabolites And the like.
  • the contact between the temperature-sensitive mutant or the wild-type strain and the test sample is performed, for example, by subjecting the test sample to a medium suitable for culturing the temperature-sensitive mutant and the wild-type at an appropriate dilution. It can be carried out by adding and culturing a temperature-sensitive mutant or wild-type strain under conditions suitable for culture.
  • condition suitable for culturing include, for example, “illustrated microorganism experiment manual (Gihodo, PT / JP2004 / 007808
  • temperature-sensitive mutant strain refers to a mutant strain that exhibits or becomes temperature-sensitive due to a mutation in a wild strain (ie, a wild-type bacterium) that is the origin. .
  • wild strains include Staphylococcus aureus strains, such as RN4220, Cowan, V8, Newman, L12, Reynolds, JL022, N31, RN8 846, S RM 551, S RM 56 3, RS 15 87, 2.09 P, JC-1, ATC C 25 92 3, SM I THNCTC 83 32, RN 2677 RN 45 1, RN 29 06, MW 2, COL, 25
  • Staphylococcus aureus strains such as RN4220, Cowan, V8, Newman, L12, Reynolds, JL022, N31, RN8 846, S RM 551, S RM 56 3, RS 15 87, 2.09 P, JC-1, ATC C 25 92 3, SM I THNCTC 83 32, RN 2677 RN 45 1, RN 29 06, MW 2, COL, 25
  • E. coli strains e.g., K12, BL21, ⁇ 101, J ⁇ 109, ⁇ 66, DH10, CFT073, 0157, MV11 84, B, ML, KU 640 1, ATC C 26, AT CC 259 22 and the like.
  • the cells are brought into contact with the test sample by, for example, a medium containing the test sample, specifically, L-broth (tryptone: 1% by weight, yeast extract: 0.5% by weight, Sodium chloride: 0.5% by weight, pH 7.0), Staphylococcus medium 110 (yeast extract: 0.25% by weight, peptone: 1% by weight, gelatin: 3% by weight, lactose: 0.
  • L-broth tryptone: 1% by weight
  • yeast extract 0.5% by weight
  • Sodium chloride 0.5% by weight
  • Staphylococcus medium 110 yeast extract: 0.25% by weight
  • peptone 1% by weight
  • gelatin 3% by weight
  • lactose 0.
  • lactose bouillon (meat extract: 0.3% by weight, leptone: 0.5% by weight, lactose: 0.5% by weight H6.9), clinical thioglycolate medium (triptone: 1.7) %
  • Soapton 0.3% by weight
  • Glucose 0.6% by weight
  • Sodium chloride 0.25% by weight
  • Sodium thiodalicholate 0.05% by weight
  • L-cystine 0.025% by weight
  • sodium sulfite 0.01% by weight
  • agar 0.07% by weight pH 7.0
  • Muller Hinton medium (beef) Extract: 30% by weight, casein hydrolyzate: 1.75% by weight, soluble starch: 0.15% by weight, agar: 1.7% by weight, pH 7.3)
  • tetrathionate liquid medium peptone: 0) 25% by weight
  • casein peptone 0.25% by weight
  • sodium desoxycholate 0.1% by weight
  • sodium thiosulfate
  • a comparison between a phenomenon that occurs when the test sample is brought into contact with the wild-type strain and a phenomenon that occurs when the test sample is brought into contact with the temperature-sensitive mutant strain includes, for example, visual observation, HPLC analysis of lysates, LCZMS analysis of lysates, and confocal microscopy can be used.
  • step (2) a phenomenon in which cell growth inhibition is compared Inhibition of cell growth is determined by the incorporation of 3 H-thymidine into DNA, BrdU incorporation into DNA, changes in the absorbance of the culture during culture, viable cell count, presence or absence of bacterial colonies, etc. , Can be evaluated.
  • cell death the incorporation of 3 H- thymidine into DNA, uptake of B r dU into DNA, cell morphology, viable cell counts, colonies one forming ability such as indicators, can be evaluated.
  • the evaluation of the growth of cells is performed, for example, by culturing the Staphylococcus aureus in an appropriate medium, growing the cells,
  • Single cell is, the time when the state of the logarithmic growth phase, for example, 2 hours after the initiation of culture, as a parameter one for DN A synthesis and cell proliferation, 3 H- thymidine, 5-bromo - 2, over de O carboxymethyl ⁇ lysine (BrdU), etc., and culture for an appropriate time (for example, 30 minutes).
  • the ability of the test sample to inhibit the growth of Staphylococcus aureus may be determined by the method of “Evaluating the growth of Staphylococcus aureus” in the method of culturing the Staphylococcus aureus. This can be performed by using a medium containing the test sample. As a control, culture using a medium containing no test sample may be performed. Further, the growth inhibitory ability can be determined, for example, in the presence and absence of a test sample based on the method described in Dreuse et al. [Drews, Mikrobio 1. Praktik urn, Berlin, 1976]. By measuring bacterial growth in
  • cell death refers to, for example, a method in which a fixed amount of cells measured using an absorbance or the like as an index is mixed with an agar medium, or inoculated on an agar medium, and cultured at an appropriate temperature, and the resulting colony is formed. It can be measured by counting the number or observing the presence or absence of colonies.
  • the bacterium can be evaluated, for example, by culturing the bacterium in the presence of a test sample, for example, for 5 hours, for example, by measuring cell death by the method described above.
  • screening method of the present invention includes the following screening method:
  • the steps (1) and (2) can be performed in the same manner as in the screening method of the second embodiment.
  • Steps (3) and (4) can be performed in the same manner as in the screening method of the first aspect.
  • a method for screening a bacterial growth inhibitor which comprises selecting a candidate substance that causes cell growth inhibition and / or cell death by using, as an index, the fact that substantially the same phenomenon is detected as an index. included.
  • the term "temperature at which a wild-type bacterium which is the origin of a temperature-sensitive mutant can grow and at which the growth of the temperature-sensitive mutant is affected” is, specifically, 37 to 45. Preferably, it is 40 to 45 ° C, particularly preferably 43 ° C.
  • the “optimal growth temperature of wild-type bacteria” differs depending on the type of wild-type bacteria. In some cases, it means, for example, 30 ° C.
  • the temperature-sensitive mutant strain is used at a high temperature, for example, 37.
  • the similarity between the phenomenon that occurs when cultured at C or 43 ° C and the phenomenon that occurs when wild-type bacteria are cultured in the presence of the test substance is an indicator.
  • “Phenomenon” in such a screening method includes morphological change of bacteria> accumulation of biosynthetic intermediates of substrates and cell components, accumulation of metabolites, and the like.
  • the screening method for a growth inhibitor targeting an essential gene of Staphylococcus aureus of the present invention it is effective against various gram-positive bacteria including Staphylococcus aureus, negative bacteria, and especially resistant bacteria, An excellent effect of efficiently screening antagonists or inhibitors that can efficiently suppress the growth of these bacteria can be obtained. Further, according to the method for designing an bacterial agonist or an inhibitor for treating a bacterial infection or a disorder or disease related to a bacterial infection of the present invention, the disorder related to a bacterial infection or a bacterial infection is provided. Alternatively, an excellent effect is obtained in that an antagonist or inhibitor that can act more effectively and efficiently on a disease can be obtained efficiently.
  • an angiogonist or an inhibitor capable of efficiently suppressing the growth of bacteria such as Staphylococcus aureus and various gram-positive bacteria and gram-negative bacteria. It can be a new target for cleaning and can be used to control bacterial growth. Furthermore, the temperature-sensitive strain of Staphylococcus aureus of the present invention is effective against various Gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus, negative bacteria, and above all, resistant bacteria. An excellent effect of efficiently screening antagonists or inhibitors that can be suppressed efficiently can be obtained. The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. Is not limited in any way.
  • Staphylococcus aureus RN 4220 strain was added to an LB liquid medium [Composition: 1% by weight of noct tryptone, 0.5% by weight of yeast extract, 1% by weight of sodium chloride, 0.4% of ethyl methane sulfate (PH 7 0)], and LB agar medium [Composition: 1% by weight of pactotripton, 0.5% by weight of yeast extract, 1% by weight of sodium chloride, 0.4% by weight of ethyl methanesulfate] 1. 5% by weight agar (pH 7.0)] and cultured at 30 ° C. Subsequently, the resulting colonies were inoculated on the LB agar medium by the Rebrica method to prepare two replica plates.
  • One of the replica plates was incubated overnight at 30 ° C and the other was incubated overnight at 43 ° C.
  • Genomic DNA was isolated from Staphylococcus aureus strain RN4220 by a conventional method.
  • the obtained genomic DNA is partially digested with a restriction enzyme such as Sspl, Eco RV, or desoxyliponuclease I, and the obtained digested DNA fragment is then integrated into a vector plasmid pSR515f: Genomic DNA plasmid 2004/007808 A library was obtained.
  • a restriction enzyme such as Sspl, Eco RV, or desoxyliponuclease I
  • the obtained genomic DNA plasmid library was introduced into the mutant obtained in Example 1 by the electoporation method, and the obtained transformant was transformed into an LB agar medium containing chloramphenicol [Composition: 1 Weight percent of pacto-lipton, 0.5 weight percent of yeast extract, 1 weight percent of sodium chloride, 1.5 weight percent of agar ( ⁇ 7.0)]. Thereafter, the plate medium was maintained at 43, and the transformant was cultured.
  • plasmid DNA was extracted from the colony formed in step 43 on the plate medium. Then, the insert fragment derived from the genomic DNA was analyzed.
  • the nucleotide sequences at both ends of the insert fragment derived from genome DN ⁇ ⁇ ⁇ were determined.
  • the determined nucleotide sequence was compared with the nucleotide sequence of Staphylococcus aureus N315 strain, for which the nucleotide sequence of the whole genome DNA had already been determined by a genome project. It is considered that the nucleotide sequence of the genomic DNA of the N315 strain is substantially homologous to the nucleotide sequence of the genomic DNA of the RN422 strain. Therefore, based on the results of the comparison, the entire nucleotide sequence of the insert fragment derived from the genomic DNA of the RN4220 strain was estimated.
  • Transformants that can grow at 43 ° C as a result of introducing a genomic DNA plasmid library into a temperature-sensitive mutant strain can usually be isolated from multiple strains.Therefore, plasmids that can analyze the base sequence of the inserted fragment are also available. There are multiple. Genes found in common in multiple inserts by analysis are considered to be genes that complement the high-temperature sensitivity of the mutant strain.
  • each gene is amplified by PCR using the genomic DNA of the RN4220 strain as a template, and the resulting fragments are analyzed. Each was incorporated into another plasmid to construct a recombinant plasmid containing a single gene, which was obtained in Example 1 above.
  • a complementation test was performed by introducing the recombinant plasmid into the temperature-sensitive mutant strain thus obtained and evaluating complementation of its growth ability at 43 ° C.
  • LB medium composition: 1% by weight bactotryptone, 0.5% by weight yeast extract, (pH 7.0)
  • a gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 a gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 5, and a gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 8
  • SEQ ID NOs: 3, 6, and 9 The amino acid sequences of the polypeptide encoded by the gene are shown in SEQ ID NOs: 3, 6, and 9, respectively.
  • a S. aureus temperature-sensitive strain is cultured as a test sample in an LB medium containing the compounds of the compound library at 30 ° C or 37 ° C.
  • Staphylococcus aureus RN422 strain is cultured under the above conditions.
  • test sample After culture, cell growth inhibition is evaluated by absorbance or presence or absence of bacterial colonies. As a result, if the presence of the test sample inhibited the growth of the temperature-sensitive strain more strongly than the RN422 strain, or the growth of the temperature-sensitive strain was higher at 37 ° C than at 30 ° C. If is more strongly inhibited, the test sample is selected as an antagonist or inhibitor.
  • the temperature-sensitive mutant can be grown at a temperature at which a wild-type bacterium that causes the temperature-sensitive mutant can grow and at which the growth of the temperature-sensitive mutant is affected (for example, 37 to 43 ° C). Incubate at each temperature in the range of) and 30 ° C.
  • the temperature sensitive variation 2004/007808 The wild type strain corresponding to the heterologous strain is cultured at the above temperature, or the temperature sensitive mutant strain is cultured at 30 ° C. in an LB medium in the presence or absence of various concentrations of a test substance.
  • wild-type bacteria that are the origin of the temperature-sensitive mutant can grow and are cultured at a temperature at which the growth of the temperature-sensitive mutant is affected.
  • the morphological changes of the temperature-sensitive strains the amount of components contained in the cell extract, and the changes in their composition ratio.
  • the cell morphology changes and the cell extraction when cultured in the presence of the test substance. Investigate changes in the amount of components contained in the product, its composition ratio, etc.
  • test substance is selected as an indicator or inhibitor of the temperature-sensitive mutated indicator gene or the polypeptide encoded thereby.
  • the present invention it is possible to use a novel gene essential for bacterial growth and a product thereof as a target for screening an antibacterial compound, and as a result, it has a different basic skeleton and a different mechanism of action from existing antibacterial drugs, It has become possible to find new antibacterial drugs that do not cross resistance.

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Abstract

細菌の増殖抑制手段を提供すること。本発明により、被験試料存在下での配列番号:3、6及び9から選ばれた少なくとも1種のアミノ酸配列をコードする遺伝子を介して生じる事象又はそれによりコードされたポリペプチド若しくはその断片の動態、該遺伝子の変異を有する温度感受性変異株に基づくスクリーニング方法が提供される。

Description

明細書 細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法
技術分野
本発明は、 細菌の増殖抑制剤のスクリーニングのための手段に関する。 より詳 しくは、 細菌に対する増殖抑制効果の評価方法、 細菌の増殖抑制剤のスクリー二 ング方法並びに黄色ブドウ球菌の温度感受性変異株に関する。 背景技術
近年、 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、 バンコマイシン耐性ブドウ球菌等の院 内感染を引き起こす黄色ブドウ球菌等に代表されるように、 薬剤に対して、 耐性 能を獲得する細菌の出現が注目されている 〔Ap f a l t e r P. , W i e n Me d. Wo c h e n s c h r. 1 53, 144 - 147 (200 3) ；チ （Ch i CY. ) , J. N i c r o b i o l . I mmu n o 1. I n f e e t. , 37， 16— 23 (2004) 〕 。
細菌の薬剤耐性は、 抗菌薬の作用標的、 あるいは作用機作に由来する塲合が多 い。 例えば、 ；6—ラクタム薬はその基本骨格で.ある ]3—ラクタム環が開裂して標 的であるべニシリン結合タンパク質に共有結合して不活化することにより、 抗菌 作用を発揮している。 この場合、 細菌の /3—ラクタム薬耐性機構としてべニシリ ン結合タンパク質の変異よる薬剤親和性の低下、 /3—ラクタム環を開裂する /3— ラク夕マーゼ産生による薬剤の不活化などが知られている。 同様に、 キノロン耐 性においても作用標的である DN Aジャィレースの変異による耐性化が知られて いる。 発明の開示 本発明によれば、 黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、 グラム陰 性菌等の細菌の増殖を、 効率よく抑制しうるアンタゴニスト又はインヒビターを スクリーニングするための新しい標的が提供される。
本発明は、 黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、 グラム陰性菌等 の細菌に対する増殖抑制効果を簡便、 迅速に評価すること、 細菌増殖抑制剤の薬 理評価を行なうこと等のいずれかを少なくとも達成する、 細菌に対する増殖抑制 効果の評価方法を提供することに関する。
また、 本発明は、 黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、 グラム陰 性菌等の細菌に対して、 有効であり、 黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム 陽性菌、 グラム陰性菌等の細菌の増殖を、 効率よく抑制しうるアン夕ゴニスト又 はインヒビターを、 効率よくスクリーニングすること、 作用機序が既存の抗菌薬 等とは異なるアン夕ゴニスト又はインヒビ夕一をスクリーニングすること、 既存 の薬剤耐性細菌の薬剤耐性メカニズムの影響をうけにくいアン夕ゴニスト又はィ ンヒビ夕一をスクリ一二ングすること等の少なくとも 1つが可能な、 黄色ブドゥ 球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、 グラム陰性菌等の細菌の増殖抑制剤のス クリ一二ング方法を提供することに関する。
さらに、 本発明は、 黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、 グラム 陰性菌等の細菌に対して、 有効であり、 黄色ブドウ球菌をはじめとする各種ダラ ム陽性菌、 グラム陰性菌等の細菌の増殖を、 効率よく抑制しうるアン夕ゴニスト 又はインヒビタ一を、 効率よくスクリーニングすること、 作用機序が既存の抗菌 薬等とは異なるアン夕ゴニスト又はインヒビ夕一をスクリーニングすること、 既 存の薬剤耐性細菌の薬剤耐性メカニズムの影響をうけにくいアンタゴニスト又は インヒビターをスクリーニングすること等の少なくとも 1つを行なうことを可能 にする、 黄色ブドウ球菌の温度感受性株を提供することを目的とする。 本発明の要旨は、 〔1〕 被験試料存在下における下記 A. 及び/又は B. ：
A. 配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA054 4) 、 配列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA129 3) 及び配列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA 1 51 1) からなる群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子を介して生じる事象、
B . 該遺伝子によりコードされたポリペプチド若しくはその断片の動態、 を評価することを特徴とする、 被験物質による細菌の増殖抑制効果の評価方法、 〔2〕 被験試料の存在下及び非存在下において、 下記 A. 及び/又は B. ：
A. 配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA0544) 、 配列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA 1293) 及び 配列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコ一ドする遺伝子 （SA15 1 1) から なる群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子を介して生じる事象、
B . 該遺伝子によりコードされたポリペプチド若しくはその断片の動態、 を評価し、 それにより、 被験試料の存在下における A. の事象及び Z又は B. の 動態と被験物質の非存在下における A. の事象及び Z又は B. の動態との間の変 化に基づき、 アン夕ゴニスト又はインヒビターを選別することを特徴とする、 細 菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法、
〔 3〕 被験試料の存在下における
配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA0544) 、 配 列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA 1293) 及び配 列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （S A 151 1) からな る群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子の発現量と、 該被験試料の非存在下に おける該遺伝子の発現量とを比較し、 該被験試料の存在下において、 該遺伝子の 発現量が減少することを指標として被験物質を選別する、 前記 〔2〕 記載のスク リーニング方法、
〔4〕 被験試料の存在下における 配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （§A0544) 、 配 列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA 1293) 及び配 列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA151 1) からな る群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子によりコードされたポリぺプチドの発 現量と、 該被験試料の非存在下における該ポリペプチドの発現量とを比較し、 該 被験試料の存在下において、 該ポリペプチドの発現量が減少することを指標とし て被験物質を選別する、 前記 〔2〕 記載のスクリーニング方法、
〔 5〕 被験試料の存在下における
配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA0544) 、 配 列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA 1293) 及び配 列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA151 1) からな る群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子によりコードされたポリぺプチドの機 能と、 被験試料非存在下における該ポリペプチドの機能とを比較し、 該被験試料 の存在下において、 該ポリぺプチドの機能が低下することを指標として被験物質 を選別する、 前記 〔2〕 記載のスクリーニング方法、
〔6〕 配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA054 4) 、 配列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA 1 29 3) 及び配列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA151 1) からなる群より選ばれた少なくとも 1種の塩基配列の一部に変異を有する遺 伝子を有する、 黄色ブドウ球菌の温度感受性変異株、
〔7〕 前記 〔6〕 記載の温度感受性変異株を用いて、 被験物質の存在下及び非 存在下における変化を検出することを特徴とする、 細菌の増殖抑制剤のスクリー ニング方法、
〔8〕 （1) 前記 〔6〕 記載の温度感受性変異株及び野生株それぞれに、 被験 試料を接触させるステップ、 及び
(2) 野生株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象と、 前記 〔6〕 記載の 温度感受性変異株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象とを比較するステ ップ、
を含み、 温度感受性変異株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象と、 野生 株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象との間で変化を生じることを指標 として被験試料を選別する、 前記 〔7〕 記載の細菌の増殖抑制剤のスクリーニン グ方法、
〔9〕 (1) 配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA 0544) 、 配列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA1 293) 及び配列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA1 51 1) からなる群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子によりコードされたポ リペプチド又はその断片と、 被験試料を接触させ、 混合物を得るステップ、
(2) 前記ステップ （1) で得られた混合物において、 該ポリペプチド又はその 断片と結合する被験試料の有無を検出し、 それにより、 該ポリペプチド又はその 断片と結合する被験試料を細菌の増殖抑制剤の候補物質として得るステップ、
(3) 前記ステップ （2) で得られた候補物質と、 SA0544、 S A 1293 及び SA151 1からなる群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子を保持する細 胞とを接触させるステップ、 及び
(4) 前記 （3) で得られた細胞における細胞増殖阻害及び Z又は細胞死の有無 を検出し、 それにより、 細胞増殖阻害及び Z又は細胞死を引き起こすことを指標 として候補物質を選別するステップ、
を含む、 細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法、 並びに
〔10〕 （1) 前記 〔6〕 記載の温度感受性変異株を、 該温度感受性変異株の 起源となる野生型の細菌の生育至適温度下で培養した場合に生じる現象と、 該野 生型の細菌は生育でき、 かつ該温度感受性変異株の生育が影響を受ける温度下に 培養した場合に生じる現象との間の差を観察するステップ、
(2) 該温度感受性変異株を、 該生育至適温度下に、 被験試料非存在下で培養し JP2004/007808 た場合に生じる現象と、 該生育至適温度下に、 被験試料存在下で培養した場合に 生じる現象との間の差を観察するステップ、
(3) 該野生型の細菌を、 被験試料非存在下で培養した場合に生じる現象と、 被 験試料存在下で培養した場合に生じる現象との間の差を観察するステップ、 及び
(4) 前記ステップ （1) で得られた結果と （2) で得られた結果との間又は前 記ステップ （1) で得られた結果と （3) で得られた結果との間で比較し、 実質 的に同一の現象が検出されることを指標として、 細胞増殖阻害及び/または細胞 死を引き起こす候補物質を選別することを特徴とする、 細菌の増殖抑制剤のスク リーニング方法、
に関する。 発明を実施するための最良の形態
本発明の 1つの側面は、 被験試料存在下における下記 A. 及び/又は B. ：
A. 配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA054 4) 、 配列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA129 3) 及び配列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA1 51 1) からなる群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子を介して生じる事象、 B . 該遺伝子によりコ一ドされたポリぺプチド若しくはその断片の動態、 を評価することを特徴とする、 被験物質による細菌の増殖抑制効果の評価 方法に関する。
なお、 本明細書において、 前記配列番号： 3に示されるアミノ酸配列を コードする遺伝子 （SA 0 544 ; ァクセッション番号： NP— 3 7 3 7 9 8) 、 配列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （S A 1 2 9 3 ; ァクセッション番号： NP— 3 74 5 7 4) 、 配列番号： 9に 示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （S A 1 5 1 1 ; ァクセッショ 2004/007808 ン番号： N P— 3 7 4 7 9 9 ) を、 「指標遺伝子」 と総称する場合もある。 前記 「指標遺伝子」 としては、 具体的には、 例えば、 配列番号： 1又は 2に示される塩基配列を有する遺伝子 （S A 0 5 4 4 ) 、 配列番号： 4又 は 5に示される塩基配列を有する遺伝子 （S A 1 2 9 3 ) 、 配列番号： 7 又は 8に示される塩基配列を有する遺伝子 （S A 1 5 1 1 ) 等が挙げられ る。
また、 本明細書においては、 前記指標遺伝子の産物のうち、 該指標遺伝 子によりコードされるポリペプチド、 具体的には、 例えば、 配列番号： 3 に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド （S A 0 5 4 4 ) 、 配列 番号 ： 6に示されるアミノ酸配列を含有するポリべプチド （ S A 1 2 9 3 ) 、 配列番号： 9に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド （S A 1 5 1 1 ) を、 「指標ポリペプチド」 という。
さらに、 本明細書において、 「アン夕ゴニスト」 又は 「インヒビ夕一」 とは、 前記指標遺伝子又は指標ポリペプチドの発現、 機能若しくは生理活 性、 前記指標遺伝子又は指標ポリベプチドと他の遺伝子又はその遺伝子産 物との相互作用等を、 中和、 低減又は阻害しうる化合物をいう。
本発明の評価方法によれば、 生存に必須の遺伝子を介して生じる事象及 び/又はポリぺプチドの動態に対する被験物質の作用が評価できる。
したがって、 本発明の評価方法によれば、 細菌、 特に、 黄色ブドウ球菌 をはじめとする各種グラム陽性菌、 グラム陰性菌に対して、 有効であり、 黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、 グラム陰性菌の増殖を、 効率よく抑制しうる、 細菌、 特に黄色ブドウ球菌をはじめとする各種ダラ ム陽性菌、 グラム陰性菌の増殖抑制剤として有用なアン夕ゴニス卜又はィ ンヒビ夕一を、 簡便、 かつ迅速に、 効率よく評価することができる。
本明細書において、 「温度感受性変異株」 とは、 低温、 例えば、 3 0 °Cでは前 記温度感受性変異株の起源となる野生型の細菌と同様増殖できるが >高温、 例え ば、 4 3 °Cでは野生型細菌とは異なり、 増殖できないような変異株をいう。 また、 前記温度感受性変異株は、 野生型の細菌の通常の生育温度では、 該野生型の細菌 と同様の挙動を示すが、 前記生育温度より高い温度では、 増殖に関連する酵素の 機能阻害、 高温下に発現するタンパク質の機能増大、 高温下で発現する毒素の代 謝阻害、 タンパク質の異常なフォールディング若しくは異常な立体構造の発生、 該異常なフォールディングの校正能の阻害、 通常の温度で行なわれる転写の阻害、 高温で行なわれる転写の促進、 D NA複製エラーの発生の増大、 D NA複製エラ 一の修復能の阻害等の種々の事象又は該事象を介して、 増殖が阻害若しくは抑制 され、 又は死にいたる細胞等が含まれる。
なお、 本明細書において、
( a ) 配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （S A 0 5 4 4 ) 、 配列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （S A 1 2 9 3 ) 、 配列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子
( S A 1 5 1 1 ) を、 「指標遺伝子」 と総称する場合もある。 前記 「指標 遺伝子」 としては、 具体的には、 例えば、 配列番号： 1又は 2に示される 塩基配列を有する遺伝子 （S A O 5 4 4 ) 、 配列番号： 4又は 5に示され る塩基配列を有する遺伝子 （S A 1 2 9 3 ) 、 配列番号： 7又は 8に示さ れる塩基配列を有する遺伝子 （S A 1 5 1 1 ) 等が挙げられる。
また、 前記指標遺伝子の産物のうち、 該指標遺伝子によりコードされる ポリペプチド、 具体的には、 例えば、 配列番号： 3に示されるアミノ酸配 列を含有するポリペプチド （S A 0 5 4 4 ) 、 配列番号： 6に示されるァ ミノ酸配列を含有するポリペプチド （S A 1 2 9 3 ) 、 配列番号： 9に示 されるアミノ酸配列を含有するポリべプチド （S A 1 5 1 1 ) を、 「指標 ポリペプチド」 という。
前記指標遺伝子は、 黄色ブドウ球菌、 例えば、 黄色ブドウ球菌 R N 4 2 2 0株を、 ニトロソ化合物、 例えば、 ニトロソグァ二ジン等、 ェチルメタ ンサルフェート等で処理し、 3 0 で生育し、 43°Cで生育しない細菌を 選別することにより得られる温度感受性変異株のうち、 当該指標遺伝子に 温度感受性変異を持つ株の 43 °Cでの増殖機能を相補する増殖機能を相補 する遺伝子である。
前記指標遺伝子は、 黄色ブドウ球菌の増殖に対して機能を発揮するもの であれば、 該指標遺伝子のバリアントであってもよい。 かかる指標遺伝子 のバリアントは、 例えば、 前記 S A 0 544、 S A 1 2 9 3及び S A 1 5 1 1のいずれかが変異した黄色ブドウ球菌の温度感受性変異株 （例えば、 SA 0 544について、 TS 1 1 24株、 T S 5 8 1 5株、 SA 1 2 9 3 について、 T S 43 1 0株、 TS 20 0 5株、 SA 1 5 1 1について、 T S 4 5 3 0株、 T S 8 2 2 9株等） を用いて、 増殖機能の相補性試験を行 なうことにより、 容易に選別されうる。
前記増殖機能の相補性試験は、 慣用の遺伝子導入方法で、 前記変異株に、 前記指標遺伝子のバリアントを導入し、 得られた形質転換体を、 野生型の 黄色ブドウ球菌は生育し、 温度感受性変異株は生育できない条件下に培養 することにより行なわれうる。 ここで、 前記形質転換体が生育した場合、 当該指標遺伝子のバリアントが、 本発明に用いられうるものであることの 指標として選別する。
前記 「野生型の黄色ブドウ球菌は生育し、 温度感受性変異株は生育でき ない条件」 としては、 例えば、 L B培地 〔組成： 1重量％ パク ト 卜リブ トン、 0. 5重量％ 酵母エキス、 （pH 7. 0) 〕 中、 43°Cで培養す ること等が挙げられる。
前記指標遺伝子のバリアントとは、 自然界において、 天然の遺伝子が自 然発生的に変異を起こして生じるものであり、 コードされる産物が、 本来 の機能を発揮する程度のバリアントをいう。 かかるバリアントとしては、 例えば、 （b) 前記指標遺伝子の塩基配列において、 少なくとも 1つの塩 2004/007808 基の変異 （置換、 欠失、 挿入、 付加等） を有する塩基配列を有し、 かつコ ードされるポリペプチドが、 前記増殖機能の相補性試験において、 増殖機 能を相捕するものである塩基配列、 すなわち、 前記 （a) の塩基配列にお いて、 少なくとも 1塩基の置換、 欠失、 付加又は挿入を有する塩基配列で あり、 かつコードされたポリべプチドが細菌の増殖に作用するものである 塩基配列、
(c) 前記指標遺伝子の塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリ ンジェントな条件、 好ましくは、 中ストリンジエンシーの条件、 より好ま しくは、 高ストリンジエンシーな条件下にハイプリダイズしうる核酸の塩 基配列を有し、 かつコードされるポリペプチドが、 前記増殖機能の相補性 試験において、 増殖機能を相補するものである塩基配列、 すなわち、 前記
(a) の塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条 件でハイブリダィズする核酸の塩基配列であり、 かつコ一ドされたポリべ プチドが細菌の増殖に作用するものである塩基配列を有する遺伝子、
(d) 前記指標遺伝子の塩基配列に対し、 H i g g i n s らによる C 1 u s t a 1 W法によるマルチプルアラインメント （例えば、 G a p p e n a 1 t y 5、 F i x e d G a p e n a l t y 1 0 w i n d o w s s i z e 5、 F l o a t i n g G a p 1 0)により適切にァラ ィメントした場合、 少なくとも 7 0 %、 好ましくは、 9 0 %以上、 より好 ましくは、 9 5 %以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、 かつコード されるポリペプチドが、 前記増殖機能の相補性試験において、 増殖機能を 相補するものである塩基配列、 すなわち、 前記 （a) の塩基配列と少なく とも 7 0 %の配列同一性を有する塩基配列であり、 かつコードされたポリ ぺプチドが細菌の増殖に作用するものである塩基配列等が挙げられる。 本明細書において、 前記 「少なくとも 1塩基」 とは、 1若しくは数個の 塩基、 すなわち、 ヌクレオチド残基を意味する。 かかる変異は、 自然界に おいて、 天然の遺伝子に自然発生的に生じる変異に倣い、 慣用の部位特異 的変異導入法により、 人為的に生じさせたものであってもよい。
本明細書において、 前記 「ストリンジェントな条件」 としては、 6 X S
5 C ( 1 X S S Cの組成： 0. 1 5M N a C l、 0. 0 1 5 M クェン 酸ナトリウム、 ρΗ 7. 0) と 0. 5 % S D Sと 5 Xデンハルトと 1 0 0 g/m 1 変性斬片化サケ精子 DNAと 5 0 % ホルムアミ ドを含む 溶液中、 プローブとともに 42 °Cでー晚保温し、 低イオン強度、 例えば、 2 X S S C、 よりストリンジエンシーには、 0. 1 X S S C等の条件及び Z又はより高温、 3 7°C以上、 ストリンジェントには、 4 2°C以上、 より ストリンジエンシーには、 5 0 以上、 より一層ストリンジエンドには、
6 0 °C以上等の条件下での洗浄を行なう条件が挙げられる。
本発明の評価方法においては、 細菌に対する増殖抑制効果を評価するた めの指標として、 前記 A. 指標遺伝子を介して生じる事象、 及び Z又は B. 指標ポリペプチドの少なくとも 1種若しくはその断片の動態、 が用いられる。
前記 「A. 指標遺伝子を介して生じる事象」 としては、 遺伝子の発現 量、 すなわち、 指標遺伝子 （DNA、 mRNA) の転写活性の増減、 遺伝 子量の増減等が挙げられる。
また、 前記 「B. 指標ポリペプチドの少なくとも 1種若しくはその断片 の動態」 としては、 指標ポリペプチドの発現量の変化、 指標ポリペプチド の機能、 例えば、 酵素活性、 レセプター結合能等が挙げられる。
本発明の評価方法によれば、 細菌、 特に、 黄色ブドウ球菌をはじめとす る各種グラム陽性菌、 グラム陰性菌に対して、 有効であり、 黄色ブドウ球 菌をはじめとする各種グラム陽性菌、 グラム陰性菌の増殖を、 効率よく抑 制しうる、 細菌、 特に黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、 グラム陰性菌の増殖抑制剤として有用なアン夕ゴニスト又はインヒビ夕一 を、 効率よくスクリーニングすることもできる。
本発明の細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法は、 1つの実施態様で は、 被験試料の存在下若しくは非存在下において、 下記 A . 及び/又は B . ：
A . 配列番号： 2に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （S A 0 5 4 4 ) 、
配列番号： 4に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （S A 1 2 9 3 ) 、 及び
配列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （S A 1 5 1 1 ) 、
からなる群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子を介して生じる事象、 B . 該遺伝子によりコードされたポリペプチド若しくはその断片の動態、 を評価し、 アン夕ゴニスト又はインヒビ夕一を選別することを 1つの大き な特徴とする。
本発明のスクリ一ニング方法は、 黄色ブドウ球菌の増殖に必須の遺伝子 若しくはその断片の動態と、 該遺伝子を介して生じる事象と、 該遺伝子に よりコードされたポリべプチド若しくはその断片の動態とのいずれかを評 価するため、 本発明のスクリーニング方法により選別されるアンタゴニス ト又はインヒビターは、 黄色ブドウ球菌に対して、 有効であり、 黄色ブド ゥ球菌の増殖を、 効率よく抑制しうる増殖抑制剤であるという優れた効果 を発揮する。 さらに、 前記遺伝子のホモログが、 他のグラム陽性菌、 さら にはグラム陰性菌にも存在する場合には、 本発明のスクリ一二ング方法で 得られる抗菌剤は、 それらの菌種に対しても優れた増殖抑制効果を発揮す る。 また、 本発明のスクリーニング方法に用いられる遺伝子が、 既存抗菌 剤の標的となっている遺伝子とは異なるため、 本発明のスクリ一ニング方 法で得られる抗菌剤は、 新規の作用機序を持ち、 したがって、 耐性菌にも 抗菌活性を持つことが期待される。
本発明のスクリーニング方法により選別されるアンタゴニスト又はイン ヒビターは、 好ましくは、 前記指標遺伝子の発現量を減少させる物質、 前 記指標遺伝子によりコードされたポリぺプチドの発現量を減少させる物質、 又は前記指標遺伝子によりコードされたポリべプチドの機能を低下させる 物質である。
本発明のスクリーニング方法に供しうる被験試料としては、 例えば、 生 物 （例えば、 植物、 動物、 微生物） 等の細胞抽出物、 該生物の無細胞抽出 物、 該生物の細胞培養物、 該生物の組織培養物等の試料中に含まれた物質、 化学的に合成された化合物、 生物学的に産生された物質等が挙げられる。 前記被験試料には、 例えば、 c D N A発現ライブラリ一等の発現ライブ ラリー、 ペプチド、 ペプチドミメテイツクス、 ホルモン、 他のタンパク質、 核酸、 核酸アナログ 〔例えば、 ペプチド核酸 （P N A ) 等〕 、 コンビナト リァルケミストリーにより得られたコンビナトリアルライブラリーの化合 物、 前記指標遺伝子のアンチセンス核酸、 前記指標遺伝子に特異的なリボ ザィム、 前記指標遺伝子に特異的な R N A i、 前記指標ポリペプチドに対 する抗体、 前記指標ポリペプチドに対する D N Aアブタマ一、 他の化合物 等も包含される。 さらに、 前記核酸、 核酸アナログ、 P N A、 アンチセン ス核酸、 リポザィム、 R N A i及び抗体は、 より優れた適合性を呈する物 質をスクリーニングする観点から、 種々の修飾、 誘導体化等を行なっても よい。
また、 例えば、 被験試料として、 細胞抽出物、 無細胞抽出物、 細胞培養 物、 組織培養物等のように、 複数の物質の混合物を用いる場合、 被験試料 に含まれる物質の中から、 目的の作用を呈するアンタゴニスト又はインヒ ビターをさらに選別するために、 被験試料を適切な方法、 例えば、 各種ク 口マトグラフィー、 塩析、 有機溶媒抽出等による物質の化学的性質及びノ 又は物理的性質の同一性若しくは類似性に基づく分画等により、 被験試料 中に含まれる物質を細分化させた画分を得、 再度、 該画分のそれぞれを本 発明のスクリーニング方法に供し、 目的の作用を呈する画分を選別するこ とにより、 アンタゴニスト又はインヒビ夕一を選別することができる。 な お、 前記分画とスクリーニング方法とは、 必要に応じて繰り返し行なって もよい。
本発明のスクリーニング方法においては、 アン夕ゴニスト又はィンヒビ 夕一を選別するための指標の 1つとして、 A . 指標遺伝子を介して生じる 事象、 及び Z又は
B . 指標ポリペプチドの少なくとも 1種若しくはその断片の動態、 を評価する。
前記 A . の動態を評価するスクリーニング方法 （態様 1 ) としては、 1 つの側面では、
被験試料の存在下における
配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコ一ドする遺伝子 （S A 0 5 4 4 ) 、 配 列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （S A 1 2 9 3 ) 及び配 列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （S A 1 5 1 1 ) からな る群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子 （指標遺伝子） の発現量と、 該被験試 料の非存在下における該遺伝子の発現量とを比較し、 該被験試料の存在下におい て、 該遺伝子の発現量が減少することを指標として被験物質を選別する、 スクリ 一二ング方法が挙げられる。
前記スクリーニング方法において、 指標遺伝子の発現量は、 例えば、 レ ポー夕一遺伝子を用いた転写活性の測定、 R T— P C R若しくはノーザン プロット法による発現産物の定量解析等により測定されうる。
レポーター遺伝子を用いて、 前記指標遺伝子の発現量を測定する場合、 前記指標遺伝子の下流に、 慣用の定量可能なレポーター遺伝子を作動可能 に連結させ、 得られた構築物を、 適切な手段により直接的又は間接的に、 宿主に導入し、 前記レポーター遺伝子の発現産物を定量することにより測 定されうる。
前記レポ一夕一遺伝子としては、 例えば、 /3—ガラクトシダーゼ遺伝子、 ク口ラムフエニコ一ルァ乇チルトランスフェラーゼ遺伝子、 ルシフェラ一 ゼ遺伝子等が挙げられる。
前記宿主としては、 大腸菌 （E s c h e r i c h i a C o l i K— 1 2系統の HB 1 0 1株、 C 6 0 0株、 J M 1 0 9株等） 、 酵母 （サッ力 口ミセス ，セルビジェ等） 等が挙げられる
前記構築物の宿主細胞への導入は、 例えば、 該構築物を、 慣用のベクタ —に連結して、 宿主細胞に導入すること、 該構築物を直接的に宿主細胞に 導入すること等により行なわれうる。
前記ベクターは、 用いられる宿主細胞に応じて適宜選択することができ、 例えば、 大腸菌を宿主細胞とする場合、 pUC誘導体 （例えば、 pUC l 9等） 、 商品名 ： p B l u e s c r i p t l l 〔ストラタジーン （S t r a t a g e n e ) 社製〕 、 p B R 3 2 2、 p CR 3、 p CM V S P ORT などのプラスミドベクタ一 ； λ ΖΑΡ I I、 λ g t 1 1などのファージべ クタ一が挙げられる。 宿主細胞が酵母細胞の場合、 ベクターとしては、 p YE S 2、 p YEU r a 3等が挙げられる。 宿主細胞が昆虫細胞の場合、 pA c S GH i s NT— A等が挙げられる。 宿主が動物の場合、 p KC R、 p E F B〇 S、 c DM8、 p C E V 4などが挙げられる。
前記構築物の宿主への導入方法としては、 例えば、 塩化カルシウム法、 エレク トロポレーシヨン法等に代表される慣用の遺伝子導入方法等が挙げ られる。
レポーター遺伝子の発現産物量は、 該レポーター遺伝子の種類に応じた 手段により測定されうる。 例えば、 レポ一ター遺伝子の発現産物が酵素で ある場合、 酵素活性を測定すること、 酵素の基質の分解産物等の生成量を 測定すること、 蛍光強度等を介して測定すること等が挙げられる。
m R N Aを測定する R T— P C Rの場合、 前記指標遺伝子又はその特徴 的な部分を特異的に増幅するプライマ—対を用い、 前記指標遺伝子又はそ の特徴的部分を増幅し、 慣用の手法により定量することにより行なわれう る。
なお、 前記 「特徴的な部分」 とは、 公知のデータベースに登録された配 列には実質的に見出されない指標遺伝子の部分を意味する。
前記プライマ一対は、 前記指標遺伝子の塩基配列と公知データベースに 登録された配列とを参照して、 慣用のプライマ一デザィン用ソフトウェア 等によりデザインされうる。 前記プライマー対は、 適宜、 検出に適した標 識物質 （蛍光物質、 放射性物質等） により標識されうる。 プライマーの鎖 長は、 特に限定されないが、 例えば、 好ましくは、 連続した少なくとも 1 5ヌクレオチド、 さらに好ましくは、 1 5〜4 0ヌクレオチド、 より好ま しくは、 1 7〜 3 0ヌクレオチドであることが望ましい。
R T— P C Rによる増幅産物の量は、 例えば、 ェチジゥムブロマイ ドに 基づく蛍光強度、 標識物質の量等を介して定量されうる。
ノーザンプロット法の場合、 前記プライマー対の場合と同様に、 前記指 標遺伝子の塩基配列と公知デ一夕ベースに登録された配列とを参照してデ ザインされた指標遺伝子に特異的なプローブを用いて行なわれうる。 前記 プローブは、 検出に適した標識物質 （蛍光物質、 放射性物質等） により標 識されうる。 プローブの鎖長は、 特に限定されないが、 非特異的なハイブ リダィゼ—シヨンを防止する観点から、 好ましくは、 連続した少なくとも
1 5ヌクレオチド、 より好ましくは、 連続した 1 8ヌクレオチド以上であ ることが望ましい。
ノーザンブロット法による指標遺伝子の m R N A量の測定は、 ハイプリ 4 007808 ダイズしたプローブに由来する標識物質の量を介して、 定量されうる。
前 3スクリ一二ング方法においては、 被験物質の存在下の場合において、 被験物質非存在下の場合に比べ、 指標遺伝子の発現量が減少していた場合、 当該被験物質が、 細菌の増殖抑制剤としての作用を有することの指標とな る。
本発明のスクリーニング方法によれば、 例えば、 前記指標ポリペプチド に結合できることが知られていない被験試料を試験することができる。 か かる試験は、 被験試料の存在下、 大腸菌の高産生株より調製した （精製又 は部分精製品） を、 該指標ポリペプチドに結合することが知られているリ ガンドの結合を可能にする条件と同様の条件下に維持し、 該被験試料が、 該指標ポリべプチドへの前記リガンドの結合を阻害するか否かを調べるこ と、 すなわち、 前記 「B . 指標ポリペプチドの少なくとも 1種若しくはそ の断片の動態」 を評価する。
前記 B . の動態を評価するスクリーニング方法 （態様 2 ) としては、
( 1 ) 前記指標ポリペプチド又はその断片と、 被験試料とを接触させ、 混 合物を得るステップ、 及び
( 2 ) 前記ステップ （ 1 ) で得られた混合物において、 該ポリペプチド又 はその断片と結合する被験試料の有無を検出するステップ、
を含む方法が挙げられる。 なお、 かかる態様 2のスクリーニング方法は、 前記態様 1と組み合わせて行なってもよい。 また、 態様 1のスクリーニン グ方法と組み合わせる場合、 ステップ （A ) に先立って行なってもよく、 ステップ （B ) の後、 同定されたアン夕ゴニスト又はインヒビ夕一につい て、 態様 2のスクリ一二ング方法を行なってもよい。
態様 2の方法において、 被験試料は、 前記共鳴プラズモン解析等を行な うことにより選別されうる。
また、 共鳴プラズモン相互作用解析の場合、 例えば、 ① 被験試料又は指標ポリペプチドを固定化したチップに、 対応して、 指 標ポリペプチド又は被験試料を含有した溶液を、 一定の流速で、 送液する ステップ；及び
② 適切な検出手段 〔例えば、 光学的検出 （蛍光度、 蛍光偏向度など） 、 質量分析計との組み合わせ （マトリックス支援レーザー脱離イオン化一飛 行時間型質量分析計： MALD I— T〇F MS、 エレク トロスプレー ' イオン化質量分析計： E S I — MS等） 〕 により相互作用を検出するステ ップ；
を行なえばよい。 ここで、 被験試料と指標ポリペプチドとからなる複合体 の形成を示すセンサ一グラムが呈示された場合、 被験試料と指標ポリぺプ チドとが結合することの指標となる。
また、 本発明のスクリーニング方法においては、 被験試料存在下での指 標遺伝子若しくはその断片又は指標ポリぺプチド若しくはその断片の動態 の評価の際、 ランダム化されたぺプチドをファージからディスプレイし、 固定化受容体に対するァフィ二ティークロマトグラフィ一によりスクリー ニングを行なうファージディスプレイ法 〔例えば、 国際公開第 9 1 / 1 7 2 7 1号パンフレツト、 国際公開第 9 2 0 1 04 7号パンフレツ ト、 米 国特許第 5， 2 2 3 , 40 9号明細書等〕 、 チップ上に固定されたべプチ ド、 化合物等のコンビナトリアルケミストリ一 〔例えば、 米国特許第 5， 1 43， 8 54号明細書、 国際公開第 9 0ノ 1 5 0 7 0号パンフレッ ト、 国際公開第 9 2ノ 1 0 0 9 2号パンフレット等〕 、 ペプチドライブラリ一 の合成及びスクリーニング 〔例えば、 クレ一マー 〔K r ame r， Me t h o d s M o 1. B i o l . , 8 7、 2 5— 3 9， （ 1 9 9 8) 等〕 クラスター化アミノ酸べプチドライブラリーを用いるぺプチド-抗体相互 作用のフィンガ一プリント解析 〔例えば、 クレーマー （K r ame r ) 、 Mo l . I mmu n o l . ， 3 2、 4 5 9— 46 5、 ( 1 9 9 5 ) 〕 、 ぺ プチドミメティックコンビナトリアルライブラリーの作製及ぴ利用 〔例え ば、 ォストレッシュ （〇 s t r e s h) 、 Me t h o d s i n E n z ymo 1 o g y , 2 6 7、 2 2 0 - 2 3 6 ( 1 9 9 6 ) ； ドスナー （D o s n e r) 、 B i o o r g. Me d. C h e m. , 4、 7 0 9— 7 1 5 ( 1 9 9 6 ) ； ニ一リー （B e e l e y) 、 T r e n d s B i o t e c h n. , 1 2、 2 1 3 - 2 1 6 ( 1 9 94) ； アル—ォバイディ （ a 1 — Ob e i d i ) 、 M o 1. B i o t e c h n. , 2 0 5— 2 2 3、 9 ( 1 9 9 8) ； ウイリー （W i l e y；) 、 Me d. R e s .
R e v. ， 1 3、 3 2 7 - 3 84 ( 1 9 9 3 ) ； ボーム （B o hm) 、 J . C omp u t . A i d e d M o 1. D e s . ， 1 0、 2 6 5 一 2 7 2 ( 1 9 9 6 ) ；及びフルビー （H r u b y) 、 B i o p o l ym e r s、 43、 2 1 9 - 26 6 ( 1 9 9 7) 等〕 等を行なってもよい。 なお、 ファージディスプレイの方法で、 指標ポリペプチド又はその断片 に結合する短いぺプチドを同定し、 次に同定されたぺプチドをプローブに してインヒビターをスクリーニングする方法も含まれる。
また、 前記態様 2のスクリーニング方法は、 別の側面では、
被験試料の存在下における
配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA0544) 、 配 列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA 1293) 及び配 列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA151 1) からな る群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子 （指標遺伝子） によりコードされたポ リペプチドの'発現量と、 該被験試料の非存在下における該ポリペプチドの発現量 とを比較し、 該被験試料の存在下において、 該ポリペプチドの発現量が減少する ことを指標として被験物質を選別する、 スクリーニング方法 （態様 2' ) ； 被験試料の存在下における
配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA0544) 、 配 列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA 1293) 及び配 列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA151 1) からな る群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子によりコードされたポリぺプチドの機 能と、 被験試料非存在下における該ポリペプチドの機能とを比較し、 該被験試料 の存在下において、 該ポリペプチドの機能が低下することを指標として被験物質 を選別する、 スクリーニング方法 （態様 2' ' ) が挙げられる。
前記態様 2' のスクリーニング方法において、 ポリペプチドの発現量は、 該ポ リペプチドに特異的な抗体を用いた免疫化学的方法、 例えば、 慣用のウェスタン ブロット法、 慣用の EL I S A法等により測定されうる。
前記抗体は、 ポリペプチドに特異的に結合する能力を有するものであればよい。 前記抗体は、 例えば、 ジョン E. コリガン （J o hn E. C o l i g a n ) 編集、 カレント プロトコルズ イン ィムノロジー （C u r r e n t P r o t o c o l s i n Immuno l ogy) 、 1992等に記載の方法 にしたがい、 前記指標遺伝子によりコードされるポリペプチド又はその一部を用 いてゥサギやマウス等を免疫することにより、 容易に作製され得る。 また、 前記 抗体は、 公知技術により修飾された抗体や抗体の誘導体であってもよい。 さらに、 前記抗体は、 得られた抗体をべプチダ一ゼ等により処理することにより得られる 抗体の断片であってもよい。 前記抗体は、 慣用の標識物質 （例えば、 蛍光物質、 ペルォキシダーゼ等) により標識されうる。
前記態様 2' のスクリーニング方法においては、 被験物質の存在下の場合にお いて、 被験物質非存在下の場合に比べ、 指標遺伝子によりコードされるポリぺプ チドの発現量が減少していた場合、 当該被験物質が、 細菌の増殖抑制剤としての 作用を有することの指標となる。
態様 2' ' のスクリーニング方法では、 例えば、 指標遺伝子を適切なベクター に連結し、 得られた発現ベクターを指標ポリペプチドの発現に適した宿主に導入 し、 該指標ポリぺプチドの発現に適した条件下に該宿主を培養することにより、 指標ポリペプチドを発現させ、 得られた指標ポリペプチドについて、 機能を評価 すればよい。
前記ベクター及び宿主は、 前記と同様である。 また、 宿主への発現ベクターの 導入は、 前記遺伝子導入方法により行なわれうる。
なお、 前記指標ポリペプチドは、 H i sタグ、 G S T等との融合タンパク質と して発現させてもよい。
発現した指標ポリペプチドは、 慣用のタンパク質精製方法 （例えば、 遠心分離、 塩析、 透析、 イオン交換カラムクロマトグラフィー、 吸着カラムクロマトグラフ ィ一、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー、 クロマトフォーカシング等） により 適宜精製されうる。
指標ポリペプチドの機能は、 例えば、 酵素活性、 リガンドの結合能等が挙げら れる。
また、 本発明によれば、 前記指標ポリペプチドと、 該指標ポリペプチド に結合するリガンド、 例えば、 アン夕ゴニスト、 インヒビター等との結合 部位に基づき、 細菌感染症又は細菌感染症に関連する障害若しくは疾患を 治療するためのアン夕ゴニスト又はインヒビターをデザィンすることがで きる。 上記のようにデザインされた物質も本発明のスクリーニング方法に おける被験物質として用いることができる。 したがって、 前記アンタゴニ スト又はインヒビタ一のデザィン方法も本発明に含まれる。
本発明の細菌感染症又は細菌感染症に関連する障害若しくは疾患を治療 するためのアン夕ゴニスト又はインヒビ夕一のデザィン方法は、 下記ステ ップ （ i ) 〜 （ i i i ) ：
( i ) 前記指標ポリぺプチドの少なくとも 1種又はその断片へのアン夕ゴ ニスト又はィンヒビ夕一の結合部位を同定するステップ、
( i i ) 前記ステップ （ i ) で同定された結合部位と、 該ポリペプチドの 構造との両方の分子モデリングを行ない、 それぞれ、 分子モデルを得るス テツプ、 及び （ i i i ) 前記ステップ （ i i ) で得られた分子モデルに基 づき、 該アン夕ゴニスト又は該インヒビターを改変し、 それにより、 該ポ リベプチドに対する結合特異性又は親和性を改良するステップ
を含む方法である。
本発明のデザイン方法は、 前記指標ポリペプチドの少なくとも 1種又は その断片へのアンタゴニスト又はインヒビターの結合部位が用いられるこ とに 1つの大きな特徴がある。 かかる結合部位を用いるため、 細菌感染症 又は細菌感染症に関連する障害若しくは疾患に対してより適合する性質を 発揮しうる構造をデザィンすることが可能になるという優れた効果を'発揮 する。 .
また、 本発明のデザイン方法は、 前記結合部位と指標ポリペプチドの構 造との両方の分子モデリングを行なうため、 細菌感染症又は細菌感染症に 関連する障害若しくは疾患に対してより適合する性質を発揮しうる構造を デザィンすることが可能になるという優れた効果を発揮する。
前記細菌感染症としては、 例えば、 黄色ブドウ球菌、 肺炎球菌、 大腸菌、 インフルエンザ菌等による感染症等が挙げられる。
細菌感染症に関連する障害若しくは疾患としては、 例えば、 気管支炎、 肺炎、 腎盂腎炎、 尿道炎、 浅在性化膿性皮膚疾患、 中耳炎等が挙げられる。 前記ステップ （ i ) において、 「アン夕ゴニスト又はインヒビター」 に は、 本発明のスクリ一二ング方法により同定されたアン夕ゴニスト又はィ ンヒビターが包含される。 また、 前記アン夕ゴニスト又はインヒビ夕一は、 本発明のスクリ一二ング方法により同定されたアン夕ゴニスト、 インヒビ 夕一等を基に、 前記ペプチドミメティックス作製技術、 コンビナトリアル ケミストリ一技術等により、 修飾、 誘導体化等を行ない得られた誘導体化 合物であってもよい。
前記ステップ （ i ) において、 前記結合部位は、 例えば、 前記アン夕ゴ 二スト又はインヒビターが、 ポリペプチドの場合、 慣用の部位特異的変異 導入方法により作製した変異型アン夕ゴニスト又はインヒビ夕一と、 前記 指標遺伝子若しくはその断片又は指標ポリペプチド若しくはその断片との 結合親和性を調べること、 あるいは、 前記アン夕ゴニスト又はインヒビ夕 一から作製されたキメラべプチドと、 前記指標遺伝子若しくはその断片又 は指標ポリべプチド若しくはその断片との結合親和性を調べることにより 決定されうる。
前記アンタゴニスト又はインヒビ夕一が、 ポリペプチドを除く化合物で ある場合、 指標ポリペプチドについて、 慣用の部位特異的変異導入方法に より変異型指標ポリべプチドを作製し、 得られた変異型指標ポリべプチド と、 前記アン夕ゴニスト又はインヒビターとの結合親和性を調べ、 結合が 検出されない変異型指標ポリべプチドの改変アミノ酸残基に対応する指標 ポリペプチドのアミノ酸残基に対して相互作用 （例えば、 共有結合、 ィォ ン性相互作用、 イオン—双極子間相互作用、 双極子一双極子間相互作用、 水素結合、 ファンデルワールス力、 疎水性相互作用等） を生じる前記アン タゴニスト又はインヒビター内の官能基を決定することができる。
なお、 前記相互作用を生じる官能基を決定するための指標の例として、
I . 共有結合は、 例えば、 アルキル化、 ァシル化、 リン酸化などを受け やすい官能基により生じうる
I I . イオン性相互作用は、 ポリペプチド上の正に荷電したアミノ酸残基 又は負に荷電したアミノ酸残基と、 かかる残基とは反対の電荷を有する官 能基との間で生じうる
I I I . イオン一双極子間相互作用及び双極子一双極子間相互作用は、 例 えば、 強い電気陰性度の原子と弱い電気陰性度の原子との結合により電荷 の片寄りが生じた双極子が存在する場合に生じうる
IV. 水素結合は、 例えば、 N H—、 〇H—などと、 非共有電子対を有す る電気陰性基との間で生じうる
V. ファンデルワールス力は、 2つの中性な分子の間に生じうる。 前記 疎水性相互作用は、 非極性分子間、 分子の非極性部位間で生じうる が挙げられる。
なお、 かかる結合部位の同定においては、 例えば、 慣用のソフトウェア を用いた構造シミュレ一ション等をさらに行なってもよい。
ついで、 ステップ （ i i ) において、 前記結合部位と、 前記指標ポリべ プチドのそれぞれについて、 分子モデリングを行なう。
前記分子モデリングは、 例えば、 核磁気共鳴 （NMR) 、 例えば、 二次 元 NMR等による構造解析、 X線回折による構造解析等により行なわれう る。
前記分子モデリングにおいて、 細菌感染症又は細菌感染症に関連する障 害若しくは疾患に対してより適合する性質を発揮しうる構造をデザィンす る観点から、 好ましくは、 前記アン夕ゴニスト又はインヒビターと指標ポ リペプチドとを混合して、 複合体を形成させ、 得られた複合体について、 前記 NMRによる解析を行なうこと、 又は該複合体を結晶化し、 得られた 結晶について、 X線構造解析により、 3次元座標を得ることが望ましい。 ついで、 ステップ （ i i i ) において、 前記ステップ （ i i ) で得られ た分子モデルに基づき、 アン夕ゴニスト又はインヒビ夕一を改変し、 それ により、 該ポリぺプチドに対する結合特異性又は親和性を改良する。
前記ステップ （ i i i ) において、 アンタゴニスト又はインヒビ夕一の 改変は、 前記ステップ （ i i ) で得られた分子モデルに基づき、
1 ) アン夕ゴニスト又はインヒビターの官能基と指標ポリぺプチドとの 間の結合力を分子力場計算により算出し、 より強い結合力を発揮しうる官 能基と置換すること又は修飾基を導入すること、
2) アンタゴニスト又はインヒビ夕一の官能基と指標ポリべプチドとの 間の相互作用について、 より強い相互作用を発揮しうる官能基と置換する こと又は修飾基を導入すること、
3 ) 溶媒分子等もさらに考慮し、 分子動力学法を用いて自由エネルギー を求め、 安定して相互作用しうる化合物へ誘導すること、
等により行なわれうる。
本発明のデザイン方法によれば、 例えば、 指標ポリペプチドに対する I C 5。が 5 0 M以下、 好ましくは、 5 M以下、 より好ましくは、 0 . 5 M以下となるアン夕ゴニスト又はインヒビターを設計することが可能に なる。
本発明のデザィン方法により得られたアンタゴニスト又はインヒビター について、 細菌感染症又は細菌感染症に関連する障害若しくは疾患に対す る治療効果は、 例えば、 種々のグラム陽性菌、 グラム陰性菌に対する最小 発育阻止濃度の測定、 全身感染、 肺炎、 尿路感染等の感染モデル動物を用 いた治療効果の測定、 各種動物における体内動態の測定等により評価され 得る。
また、 本発明には、 前記 S A 0 5 4 4、 S A 1 2 9 3及び S A 1 5 1 1 からなる群より選ばれた遺伝子の塩基配列を有し、 かつ該塩基配列により コードされたポリぺプチドが、 細菌の増殖に関連する核酸又は該ポリぺプ チドの、 細菌感染症等の疾患の治療又は予防のための医薬の製造のための 使用も含まれる。
さらに、 本発明の 1 つの側面は、 前記温度感受性変異株に関する。 本発 明の温度感受性変異株は、 具体的には、 配列番号： 3に示されるアミノ酸 配列をコ一ド.する遺伝子 （S A 0 5 4 4 ) 、 配列番号： 6に示されるアミ ノ酸配列をコードする遺伝子 （S A 1 2 9 3 ) 及び配列番号： 9に示され るアミノ酸配列をコードする遺伝子 （S A 1 5 1 1 ) からなる群より選ば れた少なくとも 1種の塩基配列の一部に変異を有する遺伝子を有する、 黄 色ブドウ球菌の温度感受性変異株が挙げられる。
本発明の温度感受性変異株に関する記載における 「変異」 とは、 高温、 例えば、 4 3°Cにおいて、 菌の増殖に必須の機能を発揮することができな い産物を生じる変異をいい、 アミノ酸レベルで大きく構造、 活性機能を変 性させるような塩基の置換、 欠失、 付加又は挿入をいう。
本発明に用いられる温度感受性変異株は、 より具体的には、 例えば、 TS 1 1 24株、 TS 5815株、 TS 2005株、 TS 4310株、 TS4530株、 TS 8229株等、 具体的には、 配列番号： 3のアミノ酸配列 （S AO 544) のアミノ酸番号： 204のセリンに対応するコドンがロイシンに対応するコドン に置換された塩基配列 （TS 1 124株） 、
配列番号： 3のアミノ酸配列 （S AO 544) のアミノ酸番号： 189のグリシ ンに対応するコドンがァスパラギン酸に対応するコドンに置換された塩基配列 (TS 5815株） 、
配列番号： 6のアミノ酸配列 （S A 1 2 9 3 ) のアミノ酸番号： 1 0 0の グルタミン酸に対応するコドンがリジンに対応するコドンに置換された塩 基配列 （T S 2 00 5株） 、
配列番号： 6のアミノ酸配列 （S A 1 2 9 3 ) のアミノ酸番号： 9 3のグ リシンに対応するコドンがアルギニンに対応するコドンに置換された塩基 配列 （T S 43 1 0株） 、
配列番号： 9のアミノ酸配列 （S A 1 5 1 1 ) のアミノ酸番号： 7 5のフ ェニルァラニンに対応するコドンがロイシンに対応するコドンに置換され た塩基配列 （T S 45 30株） ； 及び
配列番号： 9のアミノ酸配列のアミノ酸番号： 6のグリシンに対応するコ ドンがァスパラギン酸に対応するコドンに置換された塩基配列 （T S 8 2 2 9株）
からなる群より選ばれた塩基配列を有する、 温度感受性変異株が挙げられ る。
また、 上記の温度感受性変異株には、 遺伝子工学的手法、 例えば、 部位特異的 変異導入法であるオーバーラップェクステンション法等で作製された上記変異を 持つ株、 天然に生じる上記変異を持つ株も含まれる。
なお、 本発明においては、 本発明の温度感受性変異株を用いることにより、 細 菌の増殖 ¾1制剤をスクリーニングすることができる。
したがって、 本発明の他の側面は、 本発明の温度感受性変異株を用いて、 被験 物質の存在下及び非存在下における変化を検出することを特徴とする、 細菌の増 殖抑制剤のスクリーニング方法 （態様 3 ) に関する。
本発明の態様 3のスクリ一二ング方法は、
( 1 ) 前記温度感受性変異株及び野生株それぞれに、 被験試料を接触させるステ ップ、 及び
( 2 ) 野生株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象と、 前記温度感受性変 異株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象とを比較するステップ、 を含み、 温度感受性変異株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象と、 野生 株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象との間で変化が生じることを指標 として被験試料を選別する、 細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法が挙げられ る。
本発明の態様 3のスクリーニング方法において、 「被験試料を接触させた場合 に生じる現象」 としては、 例えば、 細胞死、 細胞増殖抑制、 菌体成分の生合成中 間体の蓄積、 代謝産物の蓄積等が挙げられる。
前記ステップ （1 ) において、 温度感受性変異株又は野生株と、 被験試料との 接触は、 例えば、 温度感受性変異株及び野生株の培養に適した培地に、 適切な希 釈率で、 被験試料を添加し、 培養に適した条件下に温度感受性変異株又は野生株 を培養することにより行なわれうる。
前記 「培養に適した条件」 は、 例えば、 「図解微生物実験マニュアル （技報堂、 P T/JP2004/007808
1992年） 」 等に記載の培養条件に準じ、 適宜設定されうる。
また、 本明細書において、 「温度感受性変異株」 とは、 起源となる野生株 （す なわち、 野生型の細菌） における変異により、 温度感受性を示す、 又はしめすよ うになつた変異株をいう。
野生型の細菌を意味する。
野生株としては、 例えば、 黄色ブドウ球菌株、 例えば、 RN 42 2 0、 C owa n、 V 8、 N e wm a n、 L 1 2、 R e y n o l d s , J L 0 2 2、 N 3 1 5、 RN 8 846、 S RM 5 5 1、 S RM 5 6 3、 R S 1 5 8 7、 2.0 9 P、 J C一 1、 ATC C 2 5 9 2 3 , SM I THNCTC 8 3 2 5、 RN 2 6 7 7 RN 45 1、 RN 2 9 0 6、 MW 2、 COL、 2 5
2、 47 6、 大腸菌株、 例えば、 K 1 2、 B L 2 1、 ΗΒ 1 0 1、 J Μ 1 0 9、 Μ 6 6、 DH 1 0、 C FT 0 7 3、 01 5 7、 MV 1 1 84、 B、 ML、 KU 640 1、 ATC C 2 6、 AT C C 2 5 9 2 2等が挙げられる。 前記ステップ （ 1 ) において、 細胞と、 被験試料との接触は、 例えば、 被験試料を含有した培地、 具体的には、 L一 b r o t h (トリプトン ： 1 重量％、 酵母エキス ： 0. 5重量％、 塩化ナトリウム ： 0. 5重量％ p H 7. 0 ) 、 スタフイロコッカス培地 1 1 0 (酵母エキス ： 0. 2 5重 量％、 ペプトン ： 1重量％， ゼラチン ： 3重量％、 乳糖： 0. 2重量％、 マンニット ： 1重量％、 塩化ナトリウム ： 7. 5重量％、 リン酸水素二力 リウム ： 0. 5重量％、 脱脂寒天： 1. 5重量％ pH 7. 0) 、 卜リブ トソィ寒天培地 （トリプトン ： 1. 5重量％、 ソィペプトン ： 0. 5重 量％、 塩化ナトリウム ： 0. 5重量％、 寒天 ： 1. 5重量％ p H 7.
3 ) 、 乳糖ブイョン （肉エキス ： 0. 3重量％、 ぺプトン ： 0. 5重量％、 乳糖： 0. 5重量％ H 6. 9) 、 臨床用チォグリコレート培地 （トリ プトン ： 1 · 7重量％、 ソィぺプトン ： 0. 3重量％、 ブドウ糖： 0. 6 重量％、 塩化ナトリウム ： 0. 2 5重量％、 チォダリコル酸ナトリウム ： 0. 0 5重量％、 L—シスチン ： 0. 0 2 5重量％、 亜硫酸ナトリウム ： 0. 0 1重量％、 寒天： 0. 0 7重量％ p H 7. 0) 、 ミュラーヒント ン培地 （牛肉抽出液： 30重量％、 カゼィン水解物： 1. 7 5重量％、 可 溶性デンプン： 0. 1 5重量％、 寒天： 1. 7重量％ pH 7. 3) 、 テ トラチォネート液体培地 （ペプトン ： 0. 2 5重量％、 カゼインぺプト ン ： 0. 2 5重量％、 デソキシコール酸ナトリウム ： 0. 1重量％、 チォ 硫酸ナトリウム ： 3重量％、 炭酸カルシウム ： 1重量％ pH 8. 4) 、 マンニット食塩培地 （肉エキス ： 0· 2 5重量％、 ペプトン ： 1重量％、 マンニット ： 1重量％、 塩化ナトリウム ： 7. 5重量％、 フエノ一ルレツ ド ： 0. 0 0 2 5重量％、 寒天： 1. 5重量％ p H 7. 4) 、 P EAァザ ィ ド培地 （肉エキス ： 0. 5重量％、 トリプトン： 1. 5重量％， 塩化ナ トリウム ： 0. 5重量％、 フエニルエタノール： 0. 1 5重量％、 窒化ナ トリウム ： 0. 0 1重量％、 寒天： 1. 5重量％ pH 7. 4) 、 YC C 液体培地 （酵母エキス ： 0. 5重量％、 ペプトン： 1. 5重量％、 ブドウ 糖： 0. 4 5重量％、 リン酸ニ力リウム ： 0. 2重量％、 亜硫酸ナトリウ ム ： 0. 0 2重量％ p H 7. 2 ) 、 トリプトソイブィョン培地 （トリプ トン ： 1. 7重量％、 ソィペプトン： 0. 3重量％、 ブドウ糖： 0. 2 5 重量％、 塩化ナトリウム ： 0. 5重量％、 リン酸ニ力リウム ： 0. 2 5重 量％ H 7. 3) 等中、 適当な温度で培養することにより行なわれうる。 前記培地中における被験試料の含有量は、 適切な連続希釈率となるよう に設定されうる。
前記ステップ （2) において、 野生株に該被験試料を接触させた場合に生じる 現象と、 前記温度感受性変異株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象との 比較は、 例えば、 肉眼観察、 溶菌液の HP LC分析、 溶菌液の LCZMS分析、 共焦点顕微鏡観察等により行なわれうる。
前記ステップ （2) において、 現象として、 細胞増殖阻害を比較する場 合、 細胞増殖阻害は、 DNAへの 3H—チミジンの取り込み、 DNAへの B r dUの取り込み、 培養中における培養物の吸光度の変化、 生菌数カウ ント、 菌集落の有無等を指標として、 評価されうる。
また、 細胞死は、 DNAへの 3H—チミジンの取り込み、 DNAへの B r dUの取り込み、 細胞の形態、 生菌数カウント、 コロニ一形成能等を指 標として、 評価されうる。
具体的には、 細胞、 特に、 黄色ブドウ球菌の増殖の評価は、 例えば、 一 該黄色ブドウ球菌を適切な培地中で培養して、 増殖させ、
一 細胞が、 対数増殖期の状態になった時点、 例えば、 培養開始 2時間後、 DN A合成及び細胞増殖に対するパラメータ一として、 3H—チミジン、 5—ブロモ— 2， ーデォキシゥリジン （B r dU) 等の DNA前駆体を添 加し、 適切な時間 （例えば、 3 0分） 培養し、
一 その後、 培養物から培地成分を除去し、 その後、 菌体を洗浄し、
一 得られた菌体について、 該黄色ブドウ球菌の DNAに取り込まれた 3 H—チミジン、 B r dU等の DNA前駆体の量を測定する
ことにより行なわれうる。 前記 3H—チミジンは、 得られた菌体を溶解さ せ、 得られた溶解物について、 シンチレーシヨンカウンタ一等を用いて、 放射活性を計測することにより評価されうる。 また、 前記 B r dUの量は、 該 B r dUに対するモノクロナール抗体 （抗 B r dU抗体） を用いて検出 され得、 酵素、 蛍光物質等の標識物質で標識された 2次抗体を介して測定 されうる。 抗 B r d U抗体と 2次抗体との免疫反応は、 用いられた標識物 質に応じて、 分光測光法、 蛍光測定法等により定量化される。 また、 細胞、 特に、 黄色ブドウ球菌の増殖の評価は、 慣用の方法、 例えば、 濁度の変化、 コロニー形成、 生菌数カウント等で行われてもよい。
黄色ブドウ球菌に対する被験試料の増殖阻害能は、 前記 「黄色ブドウ球 菌の増殖の評価」 を行なう方法において、 該黄色ブドウ球菌の培養に際し て、 被験試料を含有した培地を用いることにより行なわれうる。 なお、 対 照として、 被験試料を含有しない培地を用いた培養を行なえばよい。 また、 前記増殖阻害能は、 例えば、 ドリユーズら 〔D r ew s、 M i k r o b i o 1. P r a k t i k urn, B e r l i n, 1 9 7 6〕 に記載の方法等に 基づき、 被験試料存在下及び非存在下における細菌の増殖を測定すること により、 評価されうる。
前記 「細胞死」 は、 例えば、 吸光度等を指標にして測定した一定量の細 胞を、 寒天培地と混ぜ合わせ、 又は寒天培地上に植菌し、 適当な温度で培 養し、 生じたコロニー数をカウントすること、 あるいはコロニーの有無を 観察することによって測定することができる。 被験試料存在下に、 細菌を、 例えば、 5時間培養後、 例えば、 上記の方法で細胞死を測定することによ つて、 評価されうる。
また、 本発明のスクリーニング方法には、 下記スクリーニング方法：
(1) 配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA054 4) 、 配列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA 1 29 3) 及び配列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA1 51 1 ) からなる群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子によりコードされたポリぺ プチド又はその断片と、 被験試料を接触させ、 混合物を得るステップ、
(2) 前記ステップ （1) で得られた混合物において、 該ポリペプチド又はその 断片と結合する被験試料の有無を検出し、 それにより、 該ポリペプチド又はその 断片と結合する被験試料を細菌の増殖抑制剤の候補物質として得るステップ、
(3) 前記ステップ （2) で得られた候補物質と、 SA0544、 S A 1293 及び SAl 511からなる群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子を保持する細 胞とを接触させるステップ、 及び
(4) 前記 （3) で得られた細胞における細胞増殖阻害及び/又は細胞死の有無 を検出し、 それにより、 細胞増殖阻害及び Z又は細胞死を引き起こすことを指標 として候補物質を選別するステツプ、
を含む、 細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法も含まれる。
前記ステップ （ 1) 及び （2) は、 前記態様 2のスクリーニング方法と 同様に行なわれうる。
また、 前記ステップ （3) 及び （4) は、 前記態様 1のスクリーニング 方法と同様に行なわれうる。
また、 本発明のスクリーニング方法には、
(1) 本発明の温度感受性変異株を、 該温度感受性変異株の起源となる野生型の 細菌の生育至適温度下で培養した場合に生じる現象と、 該野生型の細菌は生育で き、 かつ該温度感受性変異株の生育が影響を受ける温度下に培養した場合に生じ る現象との間の差を観察するステップ、
(2) 該温度感受性変異株を、 該生育至適温度下に、 被験試料非存在下で培養し た場合に生じる現象と、 該生育至適温度下に、 被験試料存在下で培養した場合に 生じる現象との間の差を観察するステップ、
(3) 該野生型の細菌を、 被験試料非存在下で培養した場合に生じる現象と、 被 験試料存在下で培養した場合に生じる現象との間の差を観察するステップ、 及び
(4) 前記ステップ （1) で得られた結果と （2) で得られた結果との間又は前 記ステップ （1) で得られた結果と （3) で得られた結果との間で比較し、 実質 的に同一の現象が検出されることを指標として、 細胞増殖阻害及び または細胞 死を引き起こす候補物質を選別することを特徴とする、 細菌の増殖抑制剤のスク リ一ニング方法も含まれる。
なお、 本明細書において、 「温度感受性変異株の起源となる野生型の細菌は生 育でき、 かつ温度感受性変異株の生育が影響を受ける温度」 は、 具体的には、 3 7 〜45 でぁり、 好ましくは、 40〜45°Cであり、 特に好ましくは、 4 3°Cである。
また、 「野生型の細菌の生育至適温度」 は、 野生型の細菌により異なる 場合もあるが、 例えば、 3 0 °C等をいう。
かかるスクリーニング方法では、 前記温度感受性変異株を、 高温、例え ば、 3 7。C又は 4 3 °Cで培養した場合に生じる現象と、 野生型の細菌を被 験物質存在下に培養した場合に生じる現象との間の類似性が指標となる。 かかるスクリーニング方法における 「現象」 としては、 菌の形態変化 >基 質、菌体成分の生合成中間体の蓄積、代謝産物の蓄積等が挙げられる。
本発明の黄色ブドウ球菌の必須遺伝子を標的にした増殖抑制剤のスクリ —ニング方法によれば、 黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、 陰性菌、 なかんずく耐性菌に対して有効であり、 これらの菌の増殖を、 効 率よく抑制しうるアンタゴニスト又はインヒビターを、 効率よくスクリー ニングすることができるという優れた効果を奏する。 また、 本発明の細菌 感染症又は細菌感染症に関連する障害又は疾患を治療するためのアン夕ゴ ニスト又はインヒビ夕一のデザィン方法によれば、 細菌感染症又は細菌感 染症に関連する障害若しくは疾患に対してより有効に、 効率よく作用しう るアンタゴニスト又はインヒビターを、 効率よく、 得ることができるとい う優れた効果を奏する。 また、 本発明の細菌の増殖に関連する核酸によれ ば、 黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽性菌、 グラム陰性菌等の 細菌の増殖を、 効率よく抑制しうるアン夕ゴニスト又はインヒビターをス クリ一ニングするための新しい標的とすることができ、 細菌の増殖の抑制 に利用できるという優れた効果を奏する。 さらに、 本発明の黄色ブドウ球 菌の温度感受性株によれば、 黄色ブドウ球菌をはじめとする各種グラム陽 性菌、 陰性菌、 なかんずく耐性菌に対して有効であり、 これらの菌の増殖 を、 効率よく抑制しうるアンタゴニスト又はインヒビ夕一を、 効率よくス クリーニングすることができるという優れた効果を奏する。 下記実施例により、 本発明をより詳細に説明するが、 本発明は、 かかる実施例 により何ら限定されるものではない。 なお、 特に断りのない限り、 反応条件、 操 作等について、 用いた試薬に添付の説明書、 モレキュラークローニング ァ ラ ボラトリ一マニュアル 〔ザンブルーク （S amb r o ok) ら、 Mo l e c u l a r C l on i ng A L ab o r a t o r y Manu a l , 3 r d e d i t i on, (2001) ] 等の記載が参照されうる。 実施例 1
黄色ブドウ球菌 RN 42 2 0株を、 L B液体培地 〔組成： 1重量％ ノ' ク ト トリプトン、 0. 5重量％ 酵母エキス、 1重量％ 塩化ナトリウム、 0. 4 % ェチルメタンサルフェート （PH 7. 0) 〕 を用いて変異処 理し、 L B寒天培地 〔組成： 1重量％ パクトトリプトン、 0 · 5重量％ 酵母エキス、 1重量％ 塩化ナトリウム、 0. 4重量％ ェチルメタンサ ルフエ一ト 1. 5重量％ 寒天 （pH 7. 0) 〕 に塗布し、 3 0°Cで 培養した。 ついで、 生じたコロニーについて、 前記 L B寒天培地に、 レブ リカ法で播種し、 2枚のレプリカプレートを作製した。
前記レプリカプレートの一方を 3 0 °Cで一夜ィンキュペートし、 他方を 43 で一夜ィンキュペートした。
その結果、 43ででのインキュベーションでは、 生育せず、 3 0 での インキュベーションで生育したコロニーを、 温度感受性変異株として得た。 実施例 2
黄色ブドウ球菌 RN 42 2 0株から、 慣用の方法で、 ゲノム DN Aを単 離した。
得られたゲノム DN Aを、 S s p l、 E c o RV等の制限酵素又はデォ キシリポヌクレアーゼ Iで部分消化し、 ついで、 得られた消化 DNA断片 を、 ベクタープラスミド p S R 5 1 5 f: 組込み、 ゲノム D N Aプラスミ ド 2004/007808 ライブラリーを得た。
得られたゲノム DNAプラスミ ドライブラリーを、 エレクト口ポレーシ ヨン法で、 前記実施例 1で得られた変異株に導入し、 得られた形質転換体 を、 クロラムフエ二コール含有 L B寒天培地 〔組成： 1重量％ パクトト リプトン、 0. 5重量％ 酵母エキス、 1重量％ 塩化ナトリウム、 1. 5重量％ 寒天 （ΡΗ 7 · 0) 〕 に塗布した。 その後、 前記平板培地を、 43 で維持し、 形質転換体を培養した。
24時間培養後、 前記平板培地上、 43でで形成されたコロニーからプ ラスミ ド DNAを抽出した。 その後、 ゲノム DNAに由来する挿入断片の 解析を行なった。
ゲノム DN Αに由来する挿入断片の両端の塩基配列を決定した。 ついで、 決定された塩基配列と、 すでにゲノムプロジヱクトにより全ゲノム DN A の塩基配列が決定されている黄色ブドウ球菌 N 3 1 5株の塩基配列とを比 較した。 前記 N 3 1 5株のゲノム DN Aの塩基配列は、 前記 RN 42 2 0 株のゲノム DN Aの塩基配列とほぼ相同であると考えられている。 そこで、 前記比較の結果に基づき、 RN 42 2 0株のゲノム DNA由来の挿入断片 の全塩基配列を推定した。
ゲノム D N Aプラスミ ドライブラリーを温度感受性変異株に導入した結 果 43°Cで増殖できるようになった形質転換体は、 通常、 複数株分離でき るので、 挿入断片の塩基配列を解析できるプラスミ ドも複数ある。 解析す ることにより複数の挿入断片中に共通して見出された遺伝子は、 前記変異 株の高温感受性を相補する遺伝子であると考えられる
なお、 挿入断片中に 2種以上の遺伝子が共通して見出された場合、 RN 42 2 0株のゲノム DN Aをテンプレートにしてそれぞれの遺伝子を P C R法により増幅し、 得られた各断片をそれぞれ別のプラスミ ドに組込み、 単一の遺伝子を含有した組換えプラスミ ドを構築し、 前記実施例 1で得ら れた温度感受性変異株に該組換えプラスミドを導入して、 4 3 °Cにおける 増殖能の相補を評価することにより、 相補性試験を行なった。
前記相補性試験において、 培地として、 L B培地 〔組成： 1重量％ バ クトトリプトン、 0 . 5重量％ 酵母エキス、 （p H 7 . 0 ) 〕 を用いた。 その結果、 配列番号： 1又は 2に示される塩基配列を有する遺伝子、 配 列番号： 4又は 5に示される塩基配列を有する遺伝子及び配列番号： 7又 は 8に示される塩基配列を有する遺伝子のそれぞれが、 黄色ブドウ球菌の 増殖に機能を果たす遺伝子 （生存に必須の遺伝子） として得られた。 また、 前記遺伝子によりコードされるポリペプチドのァミノ酸配列を、 それぞれ、 配列番号： 3、 6及び 9に示す。 実施例 3
細胞増殖阻害を評価する場合、 被験試料として、 化合物ライブラリーの 化合物を含有した L B培地中、 3 0 °C又は 3 7 °Cで、 黄色ブドウ球菌温度 感受性株を培養する。 また、 対照として、 前記条件下で黄色ブドウ球菌 R N 4 2 2 0株を培養する。
培養後、 吸光度若しくは菌集落の有無によって細胞増殖阻害を評価する。 その結果、 被験試料の存在により、 R N 4 2 2 0株よりも温度感受性株 の増殖がより強く阻害された場合、 あるいは 3 0 °Cよりも 3 7 °Cの方が温 度感受性株の増殖がより強く阻害された場合、 該被験試料が、 アンタゴニ スト又はィンヒビターとして選別される。 実施例 4
温度感受性変異株を、 L B培地中、 温度感受性変異株の起源となる野生型の細 菌は生育でき、 かつ該温度感受性変異株の生育が影響を受ける温度 （例えば、 3 7〜4 3 °C) の範囲の各温度および 3 0 Cで培養する。 また、前記温度感受性変 2004/007808 異株に対応する野生株を前記温度で、 あるいは前記温度感受性変異株を 3 0 °Cで、 各種濃度の被験物質存在下あるいは非存在下で L B培地中で培養する。
培養後、 得られた温度感受性変異株及び野生株それぞれの細胞の形態を観察す る。 また、 得られた温度感受性変異株及び野生株それぞれから、 同じ細胞数単位 の細胞抽出物を調製し、 得られた細胞抽出物について、 二次元電気泳動、 H P L C等により、 該細胞抽出物中に含まれる成分量、 その組成比等を解析する。
次に、 3 0 °Cで培養した時と比較して、 温度感受性変異株の起源となる野生型 の細菌は生育でき、 かつ該温度感受性変異株の生育が影響を受ける温度で培養し た時の温度感受性株の形態変化、 細胞抽出物中に含まれる成分量、その組成比等 の変化を調べる。 さらに、 該温度感受性株あるいは温度感受性変異株の起源とな る野生株を被験物質非存在下で培養した時と比較して、 被験物質存在下で培養し た時の細胞の形態変化、 細胞抽出物中に含まれる成分量、 その組成比等の変化を 調べる。
その結果、 両変化が実質的に同一の場合、 該被験物質が、 温度感受性変異した 指標遺伝子もしくはそれによりコードされるポリペプチドのアン夕ゴニスト又は インヒビ夕一として選別される。 産業上の利用可能性
本発明により、細菌の増殖に必須の新規遺伝子及びその産物を標的として抗菌 化合物のスクリーニングに利用することが可能になり、その結果、既存抗菌薬と は異なる基本骨格と異なる作用機作を持ち、 耐性が交叉しない新規抗菌藥を見出 すことが可能となった。

Claims

請求の範囲
1. 被験試料存在下における下記 Α· 及び/又は Β. ：
Α. 配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA054 4) 、 配列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコ一ドする遺伝子 （SA129 3) 及び配列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコ一ドする遺伝子 （SA 1 51 1) からなる群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子を介して生じる事象、 Β. 該遺伝子によりコードされたポリぺプチド若しくはその断片の動態、 を評価することを特徴とする、 被験物質による細菌の増殖抑制効果の評価方法。
2. 被験試料の存在下及び非存在下において、 下記 Α. 及び/又は Β. ：
Α. 配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA0544) 、 配列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA 1293) 及び 配列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA151 1) から なる群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子を介して生じる事象、
Β . 該遺伝子によりコードされたポリぺプチド若しくはその断片の動態、 を評価し、 それにより、 被験試料の存在下における Α. の事象及び Ζ又は Β. の 動態と被験物質の非存在下における Α. の事象及び 又は Β. の動態との間の変 化に基づき、 アンタゴニスト又はインヒビ夕一を選別することを特徴とする、 細 菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法。
3. 被験試料の存在下における
配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA0544) 、 配 列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA 1293) 及び配 列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA151 1) からな る群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子の発現量と、 該被験試料の非存在下に おける該遺伝子の発現量とを比較し、 該被験試料の存在下において、 該遺伝子の 発現量が減少することを指標として被験物質を選別する、 請求項 2記載のスクリ 一二ング方法。
4. 被験試料の存在下における
配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA0544) 、 配 列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA 1293) 及び配 列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA151 1) からな る群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子によりコードされたポリベプチドの発 現量と、 該被験試料の非存在下における該ポリペプチドの発現量とを比較し、 該 被験試料の存在下において、 該ポリペプチドの発現量が減少することを指標とし て被験物質を選別する、 請求項 2記載のスクリ一ニング方法。
5. 被験試料の存在下における
配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA0544) 、 配 列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA 1293) 及び配 列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA 151 1) からな る群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子によりコードされたポリぺプチドの機 能と、 被験試料非存在下における該ポリペプチドの機能とを比較し、 該被験試料 の存在下において、 該ポリぺプチドの機能が低下することを指標として被験物質 を選別する、 請求項 2記載のスクリーニング方法。
6. 配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA054 4) 、 配列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA 1 29 3) 及び配列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA151 1) からなる群より選ばれた少なくとも 1種の塩基配列の一部に変異を有する遺 伝子を有する、 黄色ブドウ球菌の温度感受性変異株。
7. 請求項 6記載の温度感受性変異株を用いて、 被験物質の存在下及び非存在 下における変化を検出することを特徴とする、 細菌の増殖抑制剤のスクリーニン グ方法。
8. (1) 請求項 6記載の温度感受性変異株及び野生株それぞれに、 被験試料 を接触させるステップ、 及び
(2) 野生株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象と、 請求項 6記載の温 度感受性変異株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象とを比較するステツ プ、
を含み、 温度感受性変異株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象と、 野生 株に該被験試料を接触させた場合に生じる現象との間で変化を生じることを指標 として被験試料を選別する、 請求項 7記載の細菌の増殖抑制剤のスクリ一二ング 方法。
9. (1) 配列番号： 3に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA0 544) 、 配列番号： 6に示されるアミノ酸配列をコ一ドする遺伝子 （SA12 93) 及び配列番号： 9に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子 （SA1 5 1 1) からなる群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子によりコードされたポリ ペプチド又はその断片と、 被験試料を接触させ、 混合物を得るステップ、
(2) 前記ステップ （1) で得られた混合物において、 該ポリペプチド又はその 断片と結合する被験試料の有無を検出し、 それにより、 該ポリペプチド又はその 断片と結合する被験試料を細菌の増殖抑制剤の候補物質として得るステップ、
(3) 前記ステップ （2) で得られた候補物質と、 SA0544、 SAl 293 及び SAl 5 1 1からなる群より選ばれた少なくとも 1種の遺伝子を保持する細 胞とを接触させるステップ、 及び
(4) 前記 （3) で得られた細胞における細胞増殖阻害及び/又は細胞死の有無 を検出し、 それにより、 細胞増殖阻害及び 又は細胞死を引き起こすことを指標 として候補物質を選別するステツプ、
を含む、 細菌の増殖抑制剤のスクリーニング方法。
10. (1) 請求項 6記載の温度感受性変異株を、 該温度感受性変異株の起源 となる野生型の細菌の生育至適温度下で培養した場合に生じる現象と、 該野生型 の細菌は生育でき、 かつ該温度感受性変異株の生育が影響を受ける温度下に培養 した場合に生じる現象との間の差を観察するステップ、
(2) 該温度感受性変異株を、 該生育至適温度下に、 被験試料非存在下で培養し た場合に生じる現象と、 該生育至適温度下に、 被験試料存在下で培養した場合に 生じる現象との間の差を観察するステップ、
(3) 該野生型の細菌を、 被験試料非存在下で培養した場合に生じる現象と、 被 験試料存在下で培養した場合に生じる現象との間の差を観察するステップ、 及び
(4) 前記ステップ （1) で得られた結果と （2) で得られた結果との間又は前 記ステップ （1) で得られた結果と （3) で得られた結果との間で比較し、 実質 的に同一の現象が検出されることを指標として、 細胞増殖阻害及び Zまたは細胞 死を引き起こす候補物質を選別することを特徴とする、 細菌の増殖抑制剤のスク リーニング方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018076714A (ja) * 2016-11-10 2018-05-17 大阪瓦斯株式会社 石油増進回収用栄養剤

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001309793A (ja) * 2000-02-25 2001-11-06 Kazuhisa Sekimizu 病原微生物の温度感受性突然変異株の分離方法並びにそれを用いた抗菌剤検索方法
WO2002090548A1 (fr) * 2001-04-26 2002-11-14 Genome Pharmaceuticals Institute Co., Ltd. Methode exploitant l'affinite de la proteine d'adna pour l'atp pour purifier une proteine d'adna initiant la replication d'un adn chromosomique d'une bacterie pathogene, methode d'evaluation d'une activite antibacterienne, et methode utilisant l'affinite de la proteine d'adna pour l'atp pour cribler un compose ayant une act

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001309793A (ja) * 2000-02-25 2001-11-06 Kazuhisa Sekimizu 病原微生物の温度感受性突然変異株の分離方法並びにそれを用いた抗菌剤検索方法
WO2002090548A1 (fr) * 2001-04-26 2002-11-14 Genome Pharmaceuticals Institute Co., Ltd. Methode exploitant l'affinite de la proteine d'adna pour l'atp pour purifier une proteine d'adna initiant la replication d'un adn chromosomique d'une bacterie pathogene, methode d'evaluation d'une activite antibacterienne, et methode utilisant l'affinite de la proteine d'adna pour l'atp pour cribler un compose ayant une act

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
INOUE R, ET AL: "Genetic identification of two distinct DNA polymerase, DnaE and PolC, that are essential for chromosmal DNA replication in Staphylococcus aureus", MOL. GENET. GENOMICS, vol. 266, no. 4, 2001, pages 564 - 571, XP002205974 *
KAITO C, ET AL: "Isolation and characterization of temperature-sensitive mutants of the Staphylococcus aureus dnaC gene", FEMS MICROBIOL. LETT., vol. 210, no. 1, 2002, pages 157 - 164, XP002980545 *
KURODA M, ET AL: "Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus", LANCET, vol. 357, no. 9264, 2001, pages 1225 - 1240, XP002229662 *
MATSUO M, ET AL: "Isolation and mutation site determination of the temperature-sensitive murB mutants of Staphylococcus aureus", FEMS MICROBIOL. LETT., vol. 222, no. 1, May 2003 (2003-05-01), pages 107 - 113, XP002980544 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018076714A (ja) * 2016-11-10 2018-05-17 大阪瓦斯株式会社 石油増進回収用栄養剤

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