WO2004106502A1

WO2004106502A1 - 間葉系幹細胞

Info

Publication number: WO2004106502A1
Application number: PCT/JP2004/007735
Authority: WO
Inventors: Shinichi Nishikawa; Takumi Era
Original assignee: Riken
Priority date: 2003-05-28
Filing date: 2004-05-28
Publication date: 2004-12-09
Also published as: US20070053885A1; JPWO2004106502A1; EP1627913A1; EP1627913A4

Abstract

　本発明の技術的課題は、インビトロで分化した多能性幹細胞から、早期の分化段階にある間葉系幹細胞を得ることである。本発明は、ａ）多能性幹細胞を培養する段階、ｂ）ストロマ細胞様形態の細胞の出現を確認する段階、およびｃ）ＰＤＧＦＲα陽性かつＦＬＫ１陰性の細胞を選別し分離する段階、により、間葉系幹細胞を得る。

Description

明細書間葉系幹細胞技術分野

本発明は、インビトロにおいて多能性幹細胞から分ィ匕させた間葉系幹細胞、およびそのような細胞の調製方法に関する。背景技術

現代社会では、糖尿病や虚血性心疾患、 J 血管障害を始めとする動脈硬化性疾患などの生活習慣病を患う人が急増している。生活習慣病の危険因子の一つに、 ' 肥満症、:特に内臓脂肪の蓄積がある。脂肪組織は、体内のエネルギバランスの • ' · 変化や脂肪細胞自身の形態変化に対応してホルモンやサイ.:トカインを始め：とする. • 種々め生理活性物質を分泌する、全身の糖 ·脂質代謝にとづて極めて重要な組織 , であることが最近明らかにされた _Q そのため、聘肪胞の分化に関して積極的に , 解析がなされてきたが、そのほとんどは脂肪前駆細胞株である 3 T 3 L 1細胞な ' どの培養細胞株を用いる分ィ匕の終末段階の解析であり、 '早期の分ィ匕過程に関する解析 ίま進んでヽない (Francine M. Gr ego ire, experimental biology and ■'. medicine 226; 997 - 1002, 2001、および Christy R'.、J. , et al.， Genes and ,. development 3; 1323-1335, 1989) 。

骨芽細胞は、骨細胞へ分化する前の前駆細胞の総称であり'、骨原性の未分ィ匕間葉系幹細胞から分化した、骨形成能を有する単核細胞である（Shinich Harada, et al.， Nature 423; 349-355, 2003) 。未分化の間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化の調節機構は不明であるが、骨誘導因子（BMP ) が関与する可能性がある。

胚性幹細胞（Embryonic stem cell, E S細胞）は、初期胚に存在する分化多能性を有する細胞であり、他の胚盤胞中に注入されると生殖細胞をも含む種々の細胞に分ィ匕し得る。最も研究が進んでいるマウスの胚性幹細胞は、発生 3 . 5日の胞胚内の内部細胞塊より樹立された多能性と自己複製能を持つ細胞である。この細胞は、通常の培養培地に血清と白血病阻害因子（leukemia inhibitory factor : L I F ) と呼ばれる増殖因子を加えるだけで、未分化の状態を保持させつつ、増殖を維持させることが可能である。マウス胚性幹細胞は、発生 3 . 5日目の胞胚に注入し、その胞胚を母体に戻すことによって、インビボで再びすベての組織細胞に分化することができ、キメラマウスやノックアウトマウスの作成に利用されている。また、近年、胚性幹細胞をインビトロで操作して、様々な成熟組織細胞へ分ィ匕させることが可能になっている。このような、胚性幹細胞の持つ分化多能性と簡単な操作性から、将来の医療において、細胞を用いる移植治療の材料としての利用が期待されている。

胚性幹細胞を強制的にインビトロで分化させた場合、成熟細胞が出現することは本発明者や他のグル一プの研究で明らかとなった（例えば、 Shinichi ■ . Nishikawa, et al .·, development 125； 1747-1757,. 199.8 ·; -TOFU Nakano, et al .， Science 265; 1098-1101, 1994 ; Takumi Era, et al.. . Blood 95; 870 878, ^: : - : 2.000 ·参照).。現在、胚性幹細胞は様々な分化段階に'ある幹細胞を経て完全な成 . '熟細胞に至ると考えちれているが、その分ィ匕過程には未だ不明な点が多い。胚性 . 幹細胞から脂肪細胞への分化に関しては、.胚様体（EaibT Md tod ) を形成させ '― た後、 '効率的に:分化させる方法が報告されている（ . i)ani, et al . , Journal . , of Cell Science 110 ; 1279-1285, 1997) 。 Naoki Nakayama, et al . Journar • of: Cell Science 116; 2015-2028, 2003 には、軟骨細胞への分化が記載されている。発明の開示. ·

本発明は、インビトロで分ィ匕した多能性幹細胞から、分化の早期段階にある間葉系幹細胞を得ることを目的とする。

本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、胚性幹細胞をインビトロで培養すると、間葉系幹細胞が分化の早期段階で出現し、この細胞集団が 2種類の特別な細胞表面マ一カー、即ち、血小板由来増殖因子（Platelet-derived growth factor receptor α : P D G F R a: ) および胎児肝キナーゼ 1 (fetal liver kinase- 1： F L K 1 ) を、ある一定の様式で発現していることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。

本発明は、インビトロにおいて多能性幹細胞から分化させた間葉系幹細胞を提供する。この細胞は、ストロマ細胞様形態であり、 PDGFRひ陽性かつ FLK 1陰性あり、 Me sp 2を発現しない。この細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞および /または軟骨細胞への分化能を有し得る。

本発明は、以下の段階を含む間葉系幹細胞の調製方法を提供する。

a)多能性幹細胞を培養する段階、 ·

. b) ストロマ細胞様形態の細胞の出現を確認する段階、および . c) PDGFRひ陽性かつ FLK1陰性の細胞を選別し分離する段階。

本方法の段階 a)では、多能性幹細胞を間葉系幹細胞に分化させる処理を施して • 'もよい。' ^; '

：本発明はさら,にぐ '上記の方法で得られる間葉系幹細胞を、：脂肪細胞、骨芽細胞、.. ' ま、おは軟骨細胞に '分化させる方法、およびこれちの方法で得られる脂肪細胞、骨■· '芽細胞おび軟骨細胞を提供ずる。 ■ ^;： ' . . · . . · . '

：' ：: 図面の簡単な説明： ' . :. : ： : . ： .: ノ

.'. 図 1 R.Aにる分化誘導後の PDGFR の発現の経過を示す。: ,

' 図 2 A C 脂肪細胞への分化誘導後の PDGFRひの発現の経過を示す。， '. 図 3;A— C PDGF Ha陽性および陰性細胞の、脂肪細胞への分化を示す。 ' 図 4 RA (-) 4日目の PDGFR 陽性 FLK 1陰性細胞は、脂肪細胞へ分化しないことを示す。

図 5 RA (一） 4曰目および RA ( + ) 9曰目の P'DGFRcd易性 FLK1陰性細胞の、マーカ一遺伝子発現パターンを示す。

図 6 R A添カロの時期による脂肪細胞分ィ匕効率を比較したグラフである。

図 7 9日目に選別分離した P D G F R «陽性 F L K 1陰性細胞の自己複製能を示す。

図 8 30回継代した PDGFRa;陽性 FLK 1陰性細胞が脂肪細胞への分ィ匕能を有することを示す。

図 9 PDGFRひ陽性および陰性細胞の、骨芽細胞および軟骨細胞への分ィ匕を 2004/007735

4 示す。

図 10 PDGFRa陽性 FLK IP貪性細胞のクローニング過程を図解する。図 11 クローン細胞株の全細胞が PDGFRひ陽性であることを示す。

図 12 PD GFRひ陽性 F L K 1陰性細胞が、脂肪細胞と骨芽細胞の両方に分化することを示す。発明を実施するための最良の形態

本明細書において、「間葉系細胞」とは、骨芽細胞、軟骨細胞、 '筋芽細胞、.脂 - 肪細胞、ストロマ細胞、腱細胞などの、間葉系組織を形成する細胞およびそれらに分化し得る間葉系幹細胞を意味する。胚発生中に生じる間葉系細胞、動物個体中にある間葉系細胞、ィンビトロまたはィンビボで多能性幹細胞から分ィ匕して生

'. : 13る間葉系細胞は、全て「間蕖系細胞」の用語に包含される o , ·. : ' ··..·'. . ' ■' 本明細書にお.いでく「間葉系幹細胞」 .とは、 1またはそれ以上の間葉系細胞に: 分化する能力と自己複製能を有する間葉系細胞を意味する'。 ^:間葉系幹細胞は、ヰ胚葉系細胞と同様に、骨芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、 .脂肪細胞、ストロマ細胞、腱細胞などに分化できる多分化能を有する。多分化能と自己複製能力を有する中. 系細胞が、.発生の進行に伴ってその能力を喪失するのに対して、： '間葉系幹細胞は、発生段階を経た後、成体内に長く存在することが知られている。 ^;·そのため、 '：. 間葉系幹細胞は、.'細胞移植治療に有用であると期待されいる:。' ..

.本明細書において、「インビトロ」とは、反応や培養が胚を含む生体外で実施されることを意味する。インビトロで細胞を培養および/または分ィ匕させる際には、細胞の成育に適するあらゆる培地、試薬及び容器を使用し得る。また、本明細書における「インビボ」は、反応や培養が胚を含む生体内で実施されること、またはある現象が生体内で起こることを意味する。

本明細書において、「多能性幹細胞」とは、外胚葉、中胚葉および内胚葉系幹細胞から選ばれる少なくとも 2つに分化する能力を有する自己複製可能な幹細胞を意味し、これには、胚性幹細胞（embryonic stem cell:胚性幹細胞）、胚性生殖細胞 (embryonic germ cell: EG細胞）、胚性癌細胞（embryonal carcinoma cell: E C細胞）、多能性成体前駆細胞（multipotent adult 4007735

5

progenitor cells: MAP細胞）、成体多能性幹細胞（adult pluripotent stem cell: APS細胞）、骨髄幹細胞などが含まれる。ヒト、サル、マウス、ラヅト、ハムス夕一、ゥサギ、モルモット、ゥシ、ブ夕、ィヌ、ゥマ、ネコ、ャギ、ヒヅジを含む哺乳類、鳥類、爬虫類などの多様な動物に由来する多能性幹細胞を使用し得るが、通常は哺乳類に由来するものである。

本明細書において、「胚性幹細胞」は、初期胚に存在する分化多能性を有する細胞であって、他の胚盤胞中に注入されると生殖細胞をも含む種々の細胞に分ィ匕し得る細胞を意味する。本発明では、胞胚内の内部細胞塊より新たに樹立した胚 • 性幹細胞を使用してよく、あるいは既に樹立された細胞系統を使用してもよい。

本発明の間葉系幹細胞は、ストロマ細胞様形態を有する。ストロマ細胞は、星

• 状形や紡錘形の扁平な細胞であり、核が比較的大きぐ、核小体も 'はらきりしてい , る。.ズト:ロマ細胞の形態は線維芽細胞とよく似てるが、線維芽細胞よりも細胞 · ·.. '質が大きぐ、やや丸みを帯びており、典型的には、図 (左図） 'のよ：う,な形態 _である (Kodaj HA:¾ti_:al. J. Cell. Physiol; .1982; 112, .89 & 5参照)'。： . . . . P D G,F¾ は、膜貫通型受容体であ、細胞内部分に.チ'ひシンキナ^ "ゼ活性を有する '（Soriano P. , Development 124; 2691—2700, 4997)。そのリガンド • · 'は血小板由来増殖因子である。. PDGFRひを欠損じたマウス.は、'体節および血管形成分化に異常をぎたす d FLK1は、 PDGF.R'crど同様に、.細胞内部分に • .チロ'シンキナ^ "ゼ活性を有する膜貫通型受容体である' (Shalaby, Cell 89;

981-990, 1997)。そのリガンドは血管内皮成長因子（vascular endothelial： . growth factor： VEGF) である。 F L K 1を欠損したマウスは、血液および - 血管内皮細胞の分化に異常をきたし、胎生致死である。 · '

本明細書において、ある分子について「陽性である」'は、細胞が当該分子を発現していることを意味し、「陰性である」は、発現していないことを意味する。細胞がある分子を発現しているか否かは、後述の F ACS等により判定できる。本発明の間葉系幹細胞は、 PPARァ 1、 PPARァ 2、アジポネクチン、 U CP 1などの脂肪細胞マ一力一として知られている遺伝子を発現せず、また Me sp2、 DLL Is Liml、 Sox 4、メソジェニンなどの中胚葉マ一力一、および 0 t X 1および 0 t X 2などの神経細胞マーカーも発現しない（実施例 6 6 参照）。このことは、本発明の間葉系幹細胞が、中胚葉系幹細胞よりも分ィ匕が進んでおり、かつ既知の脂肪前駆細胞である 3 T3L 1細胞よりも早期の分化段階にあることを意味している。

本発明者らは、以前に、胚性幹細胞をコラーゲン IV上で培養し分化を誘導した場合、 PDGFRひ陽性 FLK1陰性細胞が誘導後 3曰目から出現し、 4曰目で最大になること、およびこれらの細胞は中胚葉系幹細胞を含むことを開示した . (特願 20.02— 332232) 。本発明の間葉系幹細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞および Zまたは軟骨細胞などの間葉系細胞への分化能を有する点で、上記め細胞と異なる（例えば、実施例 4参照）。また、上記の細胞は'、 Mesp2、 DL Ll、 Liml、 Sox4、メソジェニンなどの中胚葉マーカ一を発現するが、本発明の間葉系幹細胞は発現しない。他の各種マ一カー遺伝子の発現様式におい , ても,、本発明め:間葉系幹細胞は、上記の細胞と異なる, (実施例 5参照)':: ₀；'これら: ' . の相違に加えて、本発明の細胞は、ストロマ細胞様形態を有する,ことを特徴.とす. .中胚葉マ一力遺伝子の発現の有無を調べることにより、'本発明の細胞と特願. ： 2002-332232'の細胞を区別することができる。 ^:中胚葉マカ遺伝子 V , で,あ.る Me s:p の発現の有無を調べるだけでよいが、''好ましく ^:は 'さちに L'i nilおよび/'またば.メジェニンの発現の有無も調べる M6 s- 2； Li ml ' .およびメ'ソジェニンほ、'各々、 Saga, Y. et al . , Genes Dev. 11： 1827-39,

1997; Tsang T. E. et al. , Developmental Biology 223: 77-90，.2000および Yoon, J. et al., Genes Dev. 14: 3204-3214, 2000に記載されている。

本発明の間葉系幹細胞は、哺乳動物に移植するために、あるいは、哺乳動物に移植するための細胞を得るために使用できる。移植はヒトを含むいかなる哺乳動物に対しても行うことができる。

本発明の間葉系幹細胞の調製方法において、本発明による多能性幹細胞の培養の具体的な操作は、当該技術分野で常套の操作及び条件に従って行うことができる。例えば、中辻憲夫編：実験医学別冊'ポストゲノム時代の実験講座 4 「幹細胞 ·クローン研究プロトコール」、羊土社（2001年）、 Hogan, G. ら編：マウス胚の操作： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY(1994)、 Robertson, E. J. 編：奇形ガンおよび胚性幹細胞、 A Practical Approach, IRL Press Oxford, UK (1987)などの記載を参酌して適宜に決定することができる。

代表的な継代操作と培養条件を胚性幹細胞を例に説明すると、以下のとおりで 5 ある。即ち、ディヅシュをゼラチンでコートし、そのディッシュに 10， 00.0 個/ cm²の濃度で胚性幹細胞を播種し、 37 C、 5%C0₂のインキュベータ —内で培養する。翌日 1度培地を交換し、 2日目でコンフレントになったら、リン酸緩衝塩水で 1〜2回リンスし、その後十分量の 0.2.5% (W/V) ドリ'プシン一EDTAを、細胞層を覆うように添加して約 5分間放置する。トリプシン- 10 液を除去し、適量の胚性幹細胞培養用培地を添加し、ピペッティングによりディ ' ヅシュから分離ざせる。この細胞懸濁液から、'通常遠心分離により細胞を沈殿さ , - せる。上清を除去後、沈殿した細胞を胚性幹細胞培養用培地に再懸濁し、再び.1 ' ' ： ^; ·'■： ,'· ^: 0 '， :0,0.0:個/ c m'²の濃度で、ゼラチンコトしだディヅシ:: に播種し;-培養：する ' . '

15 . 多能性幹細胞を未分化状態で維持するには、多能性幹細胞維持用培地を使用す . ：る ό ··例えば'、：胚性幹細胞維持用培地は、通常、細胞培養用の最小培地に血清、 · へ：. LI F, L グルダミン、...2—メルカプトェ夕ソ一ル等を添加したものであり、 . 組成の」例を挙げると、 85%KNOCKOUT D— M環'、..15 % F B Sヽ . 10 ⁴·:Μ 2:— M,E、 :2mM L—グルタミン、 0.1'mM NE:AA、 1000 20 U/,ml-LIFである。：:. ： ' ：：

' 多能性幹細胞を分化させるためには、上記の多能性幹細胞維持用培地かち LI Fを除いた、多能性幹細胞分ィ匕用培地で多能性幹細胞を培養する。'組成の一例を挙げると、 90%ctMEM、 10%FBS、 5x 10— ⁵ M 2— ME、 2mM L一グル夕ミンである。多能性幹細胞分ィ匕用培地で多能性幹細胞を培養すると、 25 多能性幹細胞は未分化状態から脱して様々な細胞への分化を開始する。本明細書において培養日数に言及する場合は、多能性幹細胞分ィ匕用培地で培養した日数を意 B木 "る。

多能性幹細胞維持用培地および分化用培地には、抗生物質などの培養に有用な他の物質を添加することができ、培地の各成分に代えて、同等の機能を有する代 7735

8 替物を使用してもよい。また、培地の各成分は、各々適する方法で滅菌して使用する。

本発明の間葉系幹細胞の調製方法は、ストロマ細胞の出現を確認する段階を含む。本発明では、「ストロマ細胞の出現」は、ストロマ細胞様形態の細胞が細胞全体の 1%以上、好ましくは 5%以上、最も好ましくは 10%以上を占めることを意味する。未分ィ匕状態を維持しない通常の培養条件では、培養 5日目あたりでストロマ細胞様形態の細胞が出現し始める。細胞の形態は、般的な光学顕微鏡、位相差顕微鏡、'位相差倒立顕微鏡などにより観察できる。' . ' ' ' ： . また、 · 本発明の間葉系幹細胞の調製方法は、選別分離した細胞の一部を取り、 Mesp2、 L imlおよびメソジヱニンからなる群から選択される少なくとも • 1つの中胚葉マ一力遺伝子を発現がないことを確認する段階、をさらに含んで' ：ノも''よい。胚葉マ力遺伝子の発現の有無は RT P CR法ソザン ^口 . • ' ；ヅト法、： DNAチップを使用する方法、酵素免疫測定法:（E.:L: I Z':A および抗体染色法など、当分野で一般的ないかなる方法で確認てもよい。通常'、 ' RT' ' 法で確認するのが好ましい。

： ··.本発明の間葉系幹細胞の調製方法において細胞の選別 '分離めために使甩する抗体は、.ポリク.口'一ナル抗体またはモノクローナル抗体であるが、後述の F A: C . Sで使用する場合、モノクロ一ナル抗体が好ましい。そのような抗体はく実施例 - に記載の方法を参照して.当業者が作成することができ 'るが、:,：市販のもの.を使甩してもよい。抗 PDGFRひモノクローナル抗体（品番 5,58774:)および抗 F LK1モノクローナル抗体（品番 555308) は BD Pharmingenから販売されており、容易に入手できる。 · '

' 本発明の間葉系幹細胞の調製方法において、各細胞表面マーカーを指標に細胞を選別し、分離する際には、蛍光活性化セルソ一夕一（FACS) を使用できる。 FACSは、通常、フローサイトメ一夕一、レーザ一発生装置、光学系、データ処理装置および細胞分取装置を備えている。 FACSの機能は、蛍光標識細胞の自動分離および、蛍光強度のコンピューターによる分析である。 FACSにより、特定物質で蛍光標識した細胞に、細い流路の途中でレーザ一光を照射し、散乱光 (前方散乱光や側方散乱光）や蛍光のシグナル情報を個々の細胞ごとに測定し、その結果を、例えば度数分布として表示し、特定のシグナル情報を発する細胞を分取することができる。 F ACSの装置は Becton- Dickinson等から市販されており、製造者の指示に従って当業者が操作することが可能である。

本発明における細胞の選別方法について、抗体を使用する方法を詳述したが、 5 各細胞表面マ一カーの mRN Aの存在を指標にして選別することも可能である。

本発明の間葉系幹細胞の調製方法の段階 a) では、多能性幹細胞の分化を促進させる処理を施してもよい。様々な間葉系細胞への分化処理を施すと、分化の途中で目的の間葉系幹細胞が出現する。当分野で既知のいかなる方法で分化させてもよい。例えば、胚性幹細胞の場合、 90% MEM、 10%FBS、 5x1.0.0 — ⁵ M 2— ME、 2mM L—グルタミンを含む胚性幹細胞分ィ匕用培地を使用し 'てくコラゲン IVコトディッシュ上で胚性幹細胞を培養じ、培養 ·2日目から • .: . .4日目まで'： trans -レチノィ:ン酸を培養培地に添加し、ィ'.ンキュ ^:. .トする。効 . ： ': ''".:'■. ·:率は低いが' ラ一ゲン I:'V —トディッシ iまたはゼラ 'チコ―トディヅジュ'

^多能性幹細胞を培養するだけでも、目的の細胞が出現ずる。 ·>； ' ··5 . 本発明の方法では、多能性幹細胞の分ィ匕を促進させる処理として、多能性幹細.

-' ·胞を脂肪細胞に分化させる処理を採用してもよい。本発朋では、多能性幹細胞を · 完全に脂肪細胞に分化させる必要はなく、目的の間葉系幹細胞は:分化処理の途中；で出現する。当 '分野で既知のいかなる方法で分化させてもよいが、 "'典型的には、 '' Developmental Cell 4;； 119-129, 2003に記載された · Jun Nakae?ちの方法に従0 . つて分化させる。例えば、胚性幹細胞の場合、 90%.αΜΕΜ; 10%FBS、

5x10,— ⁵. Μ 2 -ME. 2 mM L一グル夕ミンを含む胚性幹細胞分ィ匕用培地を使用して、コラーゲン IVコートディッシュ上で多能性幹細胞を培養し、培養 2日目から 4日目まで trans-レチノィン酸、場合により 5日目からインシユリン、 7日目ないし 1.1日目からインシュリン、デクサメタゾン、 IBMXおよび5 トログリ夕ゾンを培養培地に添カ卩し、インキュべ一トする。また、 Dani,

Journal of Cell Science 110; 1279-1285に記載のように、胚様体を形成させた後に分化させてもよい。

あるいは、本発明の方法では、多能性幹細胞を間葉系幹細胞の分化を促進させる処理として、多能性幹細胞を骨芽細胞に分化させる処理を採用してもよい。本発明では、多能性幹細胞を完全に骨芽細胞に分ィ匕させる必要はなく、目的の間葉系幹細胞は分ィ匕処理の途中で出現する。当分野で既知のいかなる方法で分化させてもよいが、例えば、胚性幹細胞の場合、 90%aMEM、 10%FBS、 5x 10— ⁵ M 2— ME、 2mM L—グルタミンを含む胚性幹細胞分ィ匕用培地を使用して、ゼラチンコートディッシュ上で多能性幹細胞を培養し、培養 2日目から、 BMP— 4、ァスコルビン酸一 2—リン酸、デクサメタゾンおよび ?—グリセ口リン酸塩を培養培地に添加し、ィンキュベ一トする。あるいは、..胚様体を形成させて長期間培養し、骨芽細胞が出現してくるのを待 όてもよい. (Methods - Enzymol. 365:· 251-268, 2003 )₀

あるいは、本発明の方法では、多能性幹細胞の分ィ匕を促進させる処理として、

^: ' '多能性幹細胞を軟骨細胞に分化させる処理を採用しでもよい。 '本発明では、多能' ' .· 性幹細胞を完全に軟骨細胞に分ィ匕させる必要はなぐ、目的の間葉系幹細胞ば分化' ：処理の途中で出現する。'当'分野で既知のいかなる方法で分化させてもよが、.例 ' ：えば、.:,胚性幹細胞の場合； 90%αΜΕΜ, 1 G%F.B S、 ' 2mM L—タル夕ミンを含む胚性幹細胞分化用培地を使用して、培養 2:日目から:、 .デクサメ夕ゾン, ノを培養培地に添加し、 'イジキュペートする。 . .;:.. .' ：；

. ..' 本発明の間葉系幹細胞の調製方法では、培養培地に trans- Wチ 'ィ' 酸を添加' することにより'、 '本発明者らが以前に開示した中胚葉系幹細胞を含む PDGFR

·':'· 陽性 F.MC.1陰性細胞 (特願 2002-3.322 '3.2 の±}現を抑える:こどができる (実施例 .1参照） o -.. .

本発明はさらに、本発明の間葉系幹細胞を、脂肪細胞に分化させる処理を含む、脂肪細胞の調製方法を提供する。該処理は、例えば、実施例に記載のように、 9 0%ひ MEM、 10%FBS 2 mM L—グル夕ミツを含む胚性幹細胞分化用培地に、 5〃g/m.lのインシュリン、のデクサメタゾン、 5Q0 Mの 3—イソブチル一 1—メチルキサンチンおよび 1 Mのトログリタゾンを添加した培地中、コラーゲン IVコートディヅシュ上で間葉系幹細胞を培養することを含む。脂肪細胞は、オイル■レツドを使用する細胞染色により確認できる。

本発明はさらに、本発明の間葉系幹細胞を、骨芽細胞に分化させる処理を含む、骨芽細胞の調製方法を提供する。該処理は、例えば、実施例に記載のように、 9 0 %ひ ME M、 1 0 % F B S 2 mM L—グルタミンを含む胚性幹細胞分ィ匕用培地に、 1 O n g/m lの: B MP— 4、 5 0〃Mのァスコルビン酸一 2—リン酸、 0 . 1 /Mのデクサメ夕ゾン、 1 0 mMの/?—グリセロリン酸塩を添加した培地中、ゼラチンコートディ'ヅシュ上で間葉系幹細胞を培養することを含む。骨芽細胞は、ァリザリン ·レツドを使用する細胞染色により確認できる。

本発明はさらに、本発明の間葉系幹細胞を、軟骨細胞に分化させる処理を含む、軟骨細胞の調製方法を提供する。該処理は、例えば、胚性幹細胞の場合、 9 0 % a M E M、 . 1 0 % F B S、 2 mM L一グル夕ミンを含む胚性幹細胞分ィ匕用培地に 0 . のデクサメタゾンを添加した培地中で、間葉系幹細胞を培養するこ ' とを含む。軟骨細胞は、アルシアン■ブル一を使用する細胞染色により確認でき o '

• 本発明はきらに、:.:本発明の間葉系幹細胞 :脂肪細胞、骨芽細胞およびまおま.：軟骨細胞を晡乳動物に移植することを含む、哺乳動物の障害の処置方法を提供す 'あ'。例えぱ、 .変形性膝関節症などの軟骨が壊されるよ:ゔな病気の治療のめに、. . 本発明の間葉系幹細胞から.大量の軟骨細胞を分化させぺ..関節内へこの軟骨細胞を移植することができる。また、例えば、心筋梗塞の治療に.おいて、本発明の間葉

.系幹細胞を静脈注射 s 心筋再生を促すことができる。'本発明の処置方法は、ヒトを含むいかなる哺乳動物に対しても行うことができる。 · " · ··■"■ · ' 'へ . ：

.. 本発明はまた本発明の間葉系幹細胞、脂肪細胞、 '骨芽細胞および Zまたは軟骨細胞を使用する、薬剤のスクリーニング方法を提供する。.例えば、骨粗鬆症の. 治療用薬剤の開発のために、候補物質を添加した培地中で本発明の間葉系幹細胞を培養し、これらの細胞を骨芽細胞に分ィ匕させる物質をスクリーニングする。

以下、実施例により本発明の詳細を説明するが、これは本発明の 1つの実施態様にすぎず、いかなる意味においても本発明を限定するものではない。実施例

胚性幹細胞から分化した間葉系幹細胞の調製

参考例 1 . 胚性幹細胞の維持

a . 材料胚性幹細胞の維持には、表 1の試薬および器具を使用した

： '胚性幹紬胞維持用培組成は、 85 % K N ΟΌ K 0 ϋ:Τ· DH Ε Μ ί 5 % F B: S ^ 10- '⁴ Μ· 2 ΜΕヽ 2mM L—グルタミン、 0。 lmM EA A、 O O Ο ϋ/iiil L PP. であった。胚性幹細胞ぼ、:マウス 129 v系統由来め CCEfc性幹細胞を使用した（Robertson, Ε.' et' al.' Naturae .323, ： 445-448, 1986) o ' ^: ' -. 方法 ^: 、ぺ ' ' ::·. 、' · ： :：.:…' ^;

6 cmディッシュをゼラチンでコートした。このデッシュに 2x 10⁵の C CE庇性幹細胞を播種じた。翌日、 1度培地を交換した。 ' 2 '日： gでゴンフレントになったら、トリプシンを使用して細胞をディッシュから分離させ、再び 2x 1 0⁵の濃度で、ゼラチンコートされたディヅシュに播種した。培養ほ、 37°C、 5%C0₂のインキュベーター内で行った。参考例 2. 胚性幹細胞の分化

a. 材料

胚性幹細胞の分化には、表 2の試薬および器具を使用した。表 2

胚性幹細胞分化用培地の組成は、 90 %ひ ME M、 1: 0 % F,B'S, 5 x 1 Ό:一 5 Μ 2.— ME、 2mM L—グルタミン、であった。 '

b. 方法.. -

B.I 0 COAT.コラーゲン IVコート 10 cmディヅシュに 3x10³ の CC E胚性幹細胞を播種した。 5日目および 7日目に、胚性幹細胞分化用培地を用いて培地を交換した。

脂肪細胞への誘導は、 2— M Eを含まなレ、胚性幹細胞分ィ匕用培地に表 3の試薬を添加することにより行った。培養は、コラーゲン IVでコートした培養プレート上で行った。

骨芽細胞への誘導は、 2— MEを含まない胚性幹細胞分化用培地に表 4の試薬を添加する.ことにより行た。培養は、ゼラチンでコ一小した培養プレート上で了つ.た。 . 表 4；

敎骨細胞の誘導は、 · 2— MEを含まない胚性幹細胞分化用培地に、 lM Mのデクサ夕ゾンを添加することにより行った。：.. : ' ·：: ：、参考例 a.. 体の作製：. ：： .: . , .. ' .· .

当業者に周知の方法で各分子の細胞外部分を認識するモソク Θ ナル抗体'を作' 成した。具体的には、以下のように行った。マウス PDGFR の細胞外部分の cDNAを、 PCRを用いて増幅させ、この DNA配列をヒト I.gG 1の F c部分の DNA配列と結合させて融合 cDNAを作成した。この. cDNAを COS 1 細胞に導入し、培養上清中の融合タンパク質を、 Protein Aカラムを用いて回収した。回収したタンパク質でラットを免疫した。免疫終了後、脾臓を回収し、脾臓細胞を骨髄腫細胞株 X 63. Ag 8と融合させてハイプリドーマ細胞を作成した。目的の抗体を得るために、ハイプリドーマ細胞の培養上清中に含有される抗体の中から、融合蛋白および PDGFR を発現している Ba lb/c— 3T3 細胞に反応する抗体を選別し、そのハイプリドーマ細胞のクローンを同定した。 TJP2004/007735

15

この方法により、 PDGFR を特異的に認識するモノク口ナール抗体を得たほぼ同様の方法で抗マウス F L K 1モノクローナル抗体を作成した。参考例 4.抗体染色と FACS Vantageによる細胞の選別

a. 試薬の作成

表 5の試薬を使用した。表 5

脱イオン水 900mlに対して 100mlの 1 Oxハングス緩衝液と 10gの BSA (最終濃度 1%) を加えてよく撹拌した。 BSAが溶解したち； 0.2 / ： mのフィル夕一を用いて濾過滅菌した。 '' ' b. ^法.. ： .

抗 P D G F Rひ抗体をビォチンで、抗 F L K 1抗体をフイコエリスリン.で（両方とも Molecular probe より購入した）でそれぞれ標識し、以下の染色に使用した。分化 9日目の細胞を細胞分離緩衝液で分離した後、マウス血清を 10〃1 /細胞 10⁶個で加え、氷上で 20分間ィンキュぺ一十した。.次に、 10 Ong ないし.500 n gの各抗体を添加し、氷上で 20.分間ィキュぺ一トした。 20 分後、 1%BS Aハンクス緩衝液で細胞を 1回洗浄した。ストレブトァビジン一ァロピコシァニン（Allopycocyanine) (AP C； Bee ton- Dickinson) を含む 5 00 1の 1%BS Aハンクス緩衝液に細胞を再懸濁し、水上で 20分間インキュペートした。最後に 1%BSAハンクス緩衝液で 2回洗浄し、細胞 10⁶個につき 1 mlの 1 %B S Aハンクス緩衝液に溶解し、細胞選別に使用した。

FACS Vantage (Bee ton- Dickinson j および FacsAria (Becton- Dickinson)の使用方法は、付属のガイドブックに準じた。 FACS Vantageの場合、ノズルの振動の頻度は 26000程度、レベルは 3 V、 drop delayは約 12— 14で行った。 0773S

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実施例 1. D G FR 陽性 F L K 1陰性細胞の出現時期

10— ⁷ Mの R Aを含む胚性幹細胞分化用培地で、 C C E胚性幹細胞を培養し、卩00 1 0：の発現の経過を八〇3で調べた。 PDGFRひ陽性細胞は培養 4 日目には殆ど確認されず、 5日目から出現し、 9日目に最大になった（図 1) 。実施例 2. 卩00 110：陽性？1^ 1陰性細胞の分離 - CCE胚性幹細胞を培養し、図 2 Aのように脂肪細胞への分ィ匕処理を施した。即ぢ、胚性幹細胞分ィ匕用培地に培養 2日目から 4日目まで RA、 .11日目から 'ィ' ンシュリン、デクサメタゾン、 IBMXおよびトログリ夕ゾンを添加した培地で CCE胚性幹細胞を培養し、脂肪細胞への分ィ匕を誘導した。 PDGFRひおよび FLK 1の.発現を FACSにより経時的に調べた。分化誘導後: 8:日目. · 9日目あ, たりから、 PDGFR 陽性 F L K 1陰性細胞が出現した（図, 2B ,。 F A C S; に,より培養 9日目に P D G F Rひ陽性 FLK1陰性細胞を分離し、：ごの細胞の形" 態を位相差顕微鏡で観察した。図 2C (右）のように、' この細胞の形態は、骨髄由来の間葉系細胞であるストロマ細胞に極めて類似していた'。さら;にこの細胞の培養を続け、，聘肪染色を旗,したところ、脂肪細胞の出現が確認された . (Oiレ Red . による脂肪染色像：左）。 ' ^; 実施例 3. PDGFR 隖性 FLK 1陰性細胞の脂肪細胞への分化能

実施例 2と同様に、 C C E胚性幹細胞を培養し、図 '2 Aのよう'に脂肪細胞への分ィ匕処理を施した。培養 9日目に FacsVantage を用いて P D G Rひ陽性 F L K1陰性の細胞を選別分離した。これらの細胞を選別分離後 7·日間培養し、 Oil Redによる脂肪染色を施した。その結果、 PDGFR 陽性 FLK1陰性の分画の細胞は、高い効率で脂肪細胞に分化することが判明した（図 3A) 。これらの細胞は、脂肪細胞特異的物質であるトリグリセリドを大量に有していた（図 3 B) 。また、 RT—： PCR法により、選別分離後 3日間および 7日間培養した細胞の脂肪特異的マ一力一の発現を調べ、選別分離後 7日間培養した細胞が脂肪特異的マ一力一であるアジポネクチンと P PRァを発現していることを確認した (図 3C)。これらの細胞は、培地にデキサメタゾンおよびインシュリンを添加して培養すると、より効率よく脂肪細胞に分ィ匕した。同様に、 PDGFRひ陰性 FLK1陰性細胞を選別分離し、 7日間培養し、 Oil Redによる脂肪染色、トリグリセリド測定および RT— PCRを行った。図 3A— Cから明らかなように、 PD GFR P貪性細胞からは脂肪細胞は出現しなかった。

. 実施例 4. 培養 4日目の PDGFRa陽性細胞は脂肪細胞への分ィ匕能を有さない . R Aを含まない胚性幹細胞分ィ匕用培地で C CE胚性幹細胞を培養し、'培養 4日目に FacsVantageを用いて P DGFRひ陽性 F LK 1陽性細胞、' および P DGF. Ra陽性 FLK 1陰性細胞を選別分離した。これらの細胞を、脂肪細胞への分化誘導条件下でさらに 14日間'' (培養 23日目まで）培養した後、脂肪染色した。 ■ · .' その結果、雨細胞.とも脂肪細胞への分化能は極めて低い.ことが判明した . (図 4 ： '実施例 5. 培養' 4,曰目の: PDGFRひ陽性 FLK1陰性細胞ど培養 9:曰目の P'D GFRo:陽性 F.'LKl陰性細胞との遺伝子発現の相違' ... ... '.. '

■ ' ^: - R Aを含まな',い胚性幹細胞分ィ匕用培地で C C E胚性幹細胞を培養し、培養 4日 .：- 目に FacsVahtageを用いて:： PD.GFRo:陽性 FLK1'陰性細胞を選別,分離した。

また、 10—⁷Mの R Aを含む胚性幹細胞分化用培地で C C E胚性幹細胞を培鮝' し、培養 9日目に FacsVantage を用いて P D G F Rひ陽性 F L K 1:陰性細胞お.よび PDGFR 陰性 FLK 1陰性細胞を選別分離した。これらの細胞に 'ついて、 ■ 中胚葉細胞マ力一として知られている遺伝子の発現を RT—PCRにより調べた（図 5)。 RA (-) 4日目の細胞は Limlなどの中胚葉細胞マーカーを発現しているのに対し、 RA ( + ) 9日目の細胞では中胚葉細胞マ一カーの発現が見られなかった（図 5) 。このことは、培養 9日目の PDGFRa陽性 FLK1 陰性細胞は、培養 4日目のひ陽性 FLK 1陰性細胞とは異なる細胞であることを示す。実施例 6. PDGFRひ陽性 FLK 1陰性細胞は脂肪細胞マ一力一を発現しない実施例 2と同様に、 CCE胚性幹細胞を培養し、図 2 Aのように脂肪細胞への分化処理を施した。培養 9日目に FacsVantageを用いて P D G F Rひ陽性 F L K 1陰性の細胞を選別分離した。これらの細胞の遺伝子発現を R T— P C Rにより調べた。図 5のように、脂肪細胞マーカ一を発現しておらず、さらに神経細胞マ一力一も発現していなかった。細胞形態（実施例 2参照）とこの遺伝子発現のパターンより、この細胞は、脂肪細胞以前の分化段階にあることが明らかになつた。実施例 7. 培養 2、. 3日目の RA添加は、 PDGFRa陽性 FLK1陰性細胞を · ,効率よく分化させる ' ' ：

胚性幹細胞分化用培地で C C E胚性幹細胞を培養し、図 6に示す様々な時期に

RAを添カロし、培養 9日目に FacsVantageを用いて PDGFRひ陽性- F LK 1陰 ...'·■ '性細胞を選別分離し.た。 ^の細胞を脂肪細胞分化誘導条件で.' 9 間培養し、細胞' の中性脂肪量を測定した。胚性幹細胞の分化を誘導し始めて、' 2.日-目、. 3+日目、 • ^r 4 ·日':目に R A.を添加す:ると、最も効率よく P D G FR '陽性' L'K'.l陰性細胞が出現した（図 6) '。他の時期に. R Aを添加してもこの細胞への分化誘導は起こつ；" た'が、'.効率が 2.·日目な 'いし 4:日目に添加した場合に比較し悪かつお。 " ： ·

:· · ' 実施例 8.· .PD GFH α陽性 F LK 1陰性細胞の自己複製能

：；実施例 2と同様に、 C G E.胚性幹細胞を培養し、図のよ.うに脂肪細胞への. . 分化処理を施した。'培養 9日目に FacsVantageを用いて PD G.F Rひ陽性 F L .

K1陰性の細胞を選別分離した。これらの細胞を、：2— MEを含まな:い胚性幹細胞分化用培地中で 30回継代.し、細胞数を計測した。.図.7に示すように、継代を 30回行っても増殖力は低下せず、逆に、上昇した。継代数 20回および 30回の細胞を脂肪細胞分化用培地で培養した。この細胞を Oil Redにより脂肪染色したところ、図 8から明らかなように、多数の細胞が脂肪細胞に分化した。従つて、この細胞は、分化能を維持したままで自己複製する能力をもっていることが示唆された。実施例 9. P D G F R 陽性 F L K 1陰性細胞の骨芽細胞への分化能 P T/JP2004/007735

19 実施例 2と同様に、 CCE胚性幹細胞を培養し、図 2 Aのように脂肪細胞への分化処理を施した。培養 9日目に FacsVantageを用いて PD GFRひ陽性 F L K 1陰性の細胞を選別分離した。これらの細胞を参考例 2に記載の骨芽細胞分化誘導条件で 16日間培養し（即ち、 25日間培養）、細胞を回収し、 R T— P C Rを行った。これらの細胞は、骨芽細胞特異的分子を発現していた（図 9左上）。また、この培養 25日目の細胞、およびさらに培養を続けた 42日目の細胞を骨芽細胞特異的染色剤であるァリザリン ·レツドで染色した（図 9左下）。大部分の細胞が染色され、 PDGERひ陽性 FLK 1陰性細胞が骨芽細胞に分ィ匕したことが裏付けられた。' - 実施例 10. PDGFRひ陽性 FLK1陰性細胞の軟骨細胞への分化能 ^: - ^実施例, 2·と同様に.、. C C E,胚性幹細胞を培養し、図 2 のよう'.に.脂肪細胞への:;

, '分化她理を施し:た。'培養.9 に FacsVantage ·を用いて; B GFRa陽性 F L ^! K1 P創注の細胞を選別分離した。これらの細胞を参考例 2Ϊに記載の軟骨細胞分化 ·: 誘導条件で.21:日間培養し（即ち、 30日間培養） , 細胞を回収し、 RT-PC：' ；, Rを行った。 "'これらの細胞は、軟骨細胞特異的分子を発現していた'（図 9右上）

.また、. この培養 30日目の細胞を軟骨細胞特異的染色剤であるアルシアン.。プ '—で染色した（図 9右下）。大部分の細胞が染色され、 ΡΠΌΤΙΙ 陽性 FLK 1.陰性細胞が軟骨細胞に'分化たことが裏付けられた。実施例 11. PDOF R 陽性 FLK 1陰性細胞の多分化能 '- ： '

実施例 2と同様に、 CCE胚性幹細胞を培養し、図 2 Aのように脂肪細胞への. 分化処理を施した。培養 9日目に FacsVantageを用いて PD GFRひ陽性 F L · •K1陰性の細胞を選別分離した。これらの細胞を 20回継代培養した。次に 0..

3細胞/ゥエルとなるように平底の 96—ゥエルプレートに播種し、胚性幹細胞分ィ匕用培地で培養した。細胞が増殖してコンフレントになったら、随時、培養スケ一ルを上げた。最終的に 10 cmのディヅシュで培養可能な量にまでに増殖させ、クローン細胞株を保存した。クローン細胞株を 28クローン樹立した（図 1 0)。これらの各クローン細胞株は、すべて PDGFR 陽性であった（図 1 4007735

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1) 。なお、選別分離後の細胞を直接クロ一ニングしょうと数回試みたが、機械での選別分離作業の際に細胞へのダメージが大きいためか、成功しなかった。これらのクローン細胞株のうち、 10クローンを脂肪細胞および骨芽細胞への分化条件下で培養した。それぞれ脂肪細胞染色および骨芽細胞染色を行った（図 12)。 50%のクローン細胞株は、脂肪細胞のみに分ィ匕した。 30%のクローン細胞株は、脂肪細胞と骨芽細胞の両方に分化した。 10%のクローン細胞株は、骨芽細胞のみに分化した。 ' 以上のように、本発明のストロマ細胞様形態の PDGFR«P易性 FLK 1'陰性細胞は、多分化能と自己複製能力の両方を兼ね備えていることから、この細胞が '間葉系幹細胞であることが明ちかとなつた。 ' 産業上の利用 ¾可能性::. . ·

. 本発明め間葉系幹細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞などの間葉系細胞べの分化能を有する。本発明の間葉系幹細胞およびそれから分化した細胞は、:これらを標的とする薬物の開発に使用できる。例えば、脂肪細胞は、'糖尿病や高脂血症の処置用薬物の開発に有用である。また、これらめ細胞ばぐホル乇'ンゃ生理活' :生物質等の産生細胞どしでも利用でき、脂肪組織を用いる乳房形成などの、.形成 - .' 外科治療や細胞移植治療への応用も可能である。現在、脂肪細胞に効率よ.く分ィ匕する細胞株として 3T3L 1細胞株が知られているが、本発明の間葉系幹細胞は、 '既に脂肪マーカ一遺伝子を発現している 3 T3L 1細胞よりも早期の分化段階にあること、そしてガン化し'た細胞株ではないこと、などの利点を有する。また、骨芽細胞は、例えば、骨粗鬆症の処置および/または予防用の薬剤のスクリー二ングに使用し得る。骨芽細胞や軟骨細胞を実験動物に移植することにより、再生. 医療の基盤的研究を行うこともできる。

Claims

l 請求の範囲

：おいて多能性幹細胞から分化させた間葉系幹細胞であって、 P D G FRひ陽性かつ F L K 1陰性であり、 M e s p 2を発現しない細胞。

2. さらに L imlおよび Zまたはメソジェニンを発現しない、請求項 1に記載の間葉系幹細胞。

3. ストロマ細胞様形態である、請求項 1または請求項 2に記載の間葉系幹細胞 c

4'. 多能性幹細胞が哺乳動物由来である、請求項 1ない 3めいずれかに記載の間葉系幹細胞。

.

5,多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項 :1ないし ·4:の:.いずれかに記載の間葉系幹細胞。

6-. 哺乳動物に移植する:ための、請求項 1ないし 5.のいずおかに記載の間葉系幹: 穩。. .. · ；' '

7. 哺乳動物に移植する,ための細胞を得るために使用する、請求項 1ないし' 6のいずれかに記載の間葉系幹細胞。

8. a) 多能性幹細胞を培養する段階、 ·'

b) ストロマ細胞様形態の細胞の出現を確認する段階、および

c ) PDGFRa陽性かつ F L K 1陰性の細胞を選別し分離する段階ヽ

を含む、請求項 1ないし 7のいずれかに記載の間葉系幹細胞の調製方法。

9. d) c) で選別分離した細胞の一部を取り、 Me sp2、 L imlおよびメソジェニンからなる群から選択される少なくとも 1つの中胚葉マ一力一遺伝子の発現がないことを確認する段階、をさらに含む、請求項 8に記載の方法。

10. 段階 c) を培養 5日目以降に実施する、請求項 8または請求項 9に記載の方法。

11. 段階 c) において、抗 PDGFRひ抗体および/ま'たは抗 FLK 1抗体を使用する、請求項 8ないし請求項 10のいずれかに記載の方法。

12. 段階 c.) において、： F ACSにより細胞を選別し分離する、請求項' 8ないし請求項 11のいずれかに記載の方法。

13. 段階 a) において、多能性幹細胞の分化を促進きせる処理を施す、請求項 8ないし請求項 12のいずれかに記載の方法。

14.該処理がコラーゲン I Vでコ一トした培養プレート上で多能性幹細胞を培養することを含む、請求項 13に記載の方法。

15. 該処理が、培養培地に trans—レチノィン酸、インシ;！リン; 'デグサメ夕.ゾン、 I BMXおよびトログリ夕ゾンから選択される少なぐと'も 1つの物質を添加することを含む、請求項 13または請求項 14に記載の方法。 ·. ·

16. 物質が t r ans-レチノィン酸である、請求項 15に記載の方法。

17. 請求項 1ないし請求項 7のいずれかに記載の間葉系幹細胞を脂肪細胞に分化させる処理を含む、脂肪細胞の調製方法。

18. 該処理がコラーゲン I Vでコ一トした培養プレート上で間葉系幹細胞を培養することを含む、請求項 17に記載の方法。

19. 培養培地に t ran s—レチノイン酸、インシュリン、デクサメタゾン、 IBMXおよびトログリ夕ゾンから選択される少なくとも 1つの物質を添加することを含む、請求項 17または請求項 18に記載の方法。

20. 請求項 1ないし請求項 7のいずれかに記載の間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させる処理を含む、骨芽細胞の調製方法。

21. 該処理がゼラチンでコートした培養プレート上で間葉系幹細胞を培養することを含む、請求項 20に記載の方法。

22. 培養培地に BMP— 4、ァスコルビン酸一 2—リン酸塩'、デクサメタゾン、 —タリお口ひ'.ン酸塩から選択される少なくとも 1つの物質を.添加.する 'ことを含 · む、'請求項 20または請求項 21に記載の方法。

23. 請求項 1ないし請求項 7のいずれかに記載の間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させる処理を含む、軟骨細胞の調製方法。：

24. 培養培地にデクサメタゾンを添加することを含む、 '請求項 23に記載の方

·..'法。 .

25. 請求項 8ないし請求項 16のいずれかに記載の方法で得られる間葉系幹細胞。 -. ■ ... ：. . . .

• 26. 請求項 17ないし請求項 19のいずれかに記載の方法で得られる脂肪細胞。 27. 請求項 20ないし請求項 22のいずれかに記載の方法で得られる骨芽細胞。 28. 請求項 23または請求項 24に記載の方法で得られる軟骨細胞。

2 9 . 請求項 1ないし請求項 7、および請求項 2 5ないし請求項 2 8のいずれかに記載の細胞を哺乳動物に移植することを含む、哺乳動物の障害の処置方法。

3 0 . 請求項 1ないし請求項 7、および請求項 2 5ないし請求項 2 8のいずれかに記載の細胞を使用する、薬剤のスクリーニング方法。