WO2004096194A2 - PREVENCIÓN DE UNA INFECCIÓN POR HIV-1 MEDIANTE LA INHIBICIÓN DE LA REORGANIZACIÓN Y/O LA ALTERACIÓN DE LOS CONTENIDOS DE LOS DOMINIOS CON BALSAS DE LA MEMBRANA CELULAR, MEDIADAS POR Rho - Google Patents

PREVENCIÓN DE UNA INFECCIÓN POR HIV-1 MEDIANTE LA INHIBICIÓN DE LA REORGANIZACIÓN Y/O LA ALTERACIÓN DE LOS CONTENIDOS DE LOS DOMINIOS CON BALSAS DE LA MEMBRANA CELULAR, MEDIADAS POR Rho Download PDF

Info

Publication number
WO2004096194A2
WO2004096194A2 PCT/ES2004/000188 ES2004000188W WO2004096194A2 WO 2004096194 A2 WO2004096194 A2 WO 2004096194A2 ES 2004000188 W ES2004000188 W ES 2004000188W WO 2004096194 A2 WO2004096194 A2 WO 2004096194A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hiv
inhibitor
infection
rafts
raft
Prior art date
Application number
PCT/ES2004/000188
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2004096194A3 (es
WO2004096194A9 (es
Inventor
Mario Mellado
José Miguel RODRIGUEZ FRADE
Carlos Martinez Alonso
Santos Manes
Gustavo Del Real
Original Assignee
Consejo Superior De Investigaciones Cientificas
Pharmacia Spain, S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior De Investigaciones Cientificas, Pharmacia Spain, S.A. filed Critical Consejo Superior De Investigaciones Cientificas
Priority to MXPA05011714A priority Critical patent/MXPA05011714A/es
Priority to EP04730557A priority patent/EP1618874A2/en
Priority to CA002522089A priority patent/CA2522089A1/en
Priority to BRPI0409822-6A priority patent/BRPI0409822A/pt
Priority to US10/581,903 priority patent/US20070082942A1/en
Publication of WO2004096194A2 publication Critical patent/WO2004096194A2/es
Publication of WO2004096194A9 publication Critical patent/WO2004096194A9/es
Publication of WO2004096194A3 publication Critical patent/WO2004096194A3/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/401—Proline; Derivatives thereof, e.g. captopril
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV

Definitions

  • the plasma membrane is a specialized structure that channels and integrates the information that flows continuously between a cell and its environment.
  • the plasma cell membrane is also the first barrier against an infection caused by intracellular pathogens.
  • the last decade has highlighted the heterogeneity of the phases that make up the plasma membrane.
  • the accumulated evidence indicates that specialized lipid domains, called rafts, play fundamental roles in the regulation of a set of cellular processes, ranging from signal transduction to the entry of infections with intracellular pathogens (Simons, K and Toomre, D (2000) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1.31-39; Brown, D. and London, E. (2000) J. Biol.
  • Homogeneous bilayers formed from purified phospholipids or sphingolipids exhibit an abrupt, temperature-dependent transition between the gel phase and the disordered phase, which occurs at a characteristic melting temperature (T m ) (from English, "melting _ temper ature”).
  • T m characteristic melting temperature
  • Sphingolipids contain long acyl chains ene Strongly saturated, which confer a much higher T m than those of glycerophospholipids, which are rich in curved and unsaturated acyl chains. Therefore, the glycerolipid bilayers are in a very fluid phase I d and their lipids have high rotational mobility and lateral mobility.
  • membranes enriched with Sphingolipids are highly ordered, with their lipids densely packed and with greatly reduced mobility in the bilayer plane.
  • raft hypothesis states that the separation of discrete liquid-ordered phase and disordered liquid phase domains take place in membranes containing sufficient amounts of sphingolipids and sterols, such as the plasma cell membrane.
  • sphingolipids and sterols such as the plasma cell membrane.
  • Raft domains participate in these physiological actions primarily through the spatial and temporal regulation of the protein-protein interactions required to carry out these processes.
  • the rafts act as devices that control the protein-protein interactions in the membranes (Fig. 2).
  • a given raft can contain only a low number of proteins. Therefore, an important stage in initiating these processes is the ability of the individual small rafts to aggregate into larger rafts. This coalescence process takes the associated machinery components in the raft to another, larger platform, where the encounter between two previously separated proteins in the raft can take place.
  • These larger rafts may be more stable than domains with smaller rafts, the raft proteins may induce stabilization of the underlying actin cytoskeleton (Oliferenko, S. (1999) J. Cell. Biol. 146, 843-854; Villalba, M.
  • Retroviruses 17, 1009-1019) and in vivo (Khanna, K. et al. (2002) J. Clin. Invest. 109, 205-211) , indicating that the dynamics of the rafts can dramatically influence the efficiency of virus entry.
  • HIV-1 CCR.5 and CXCR4 co-receptors have been reported to co-purify in the DRM fraction after ligand aggregation or that induced by gpl20 (Manes, S. et al. (2001) Semin Immunol. 13,147-157; Gómez Mounton, C. et al., (2001) Proc. Nati. Acad. Sci.
  • IMM-1 intercellular adhesion molecules
  • the beta-chemokine ligands have been shown to prevent HIV-1 from fusing with the cell (Dragic, et al. (1996) Nature, 381, 667-673).
  • a complex of gpl20 and soluble CD4 has also been shown to specifically interact with CCR-5 and inhibit binding of the natural ligands of CCR-5, MlP-lalfa and MlP-lbela (Wu et al. (1996) Na ⁇ ure, 384, 179-183, Trkola et al. (1996) Naure, 384, 184-187).
  • the raft domain inhibitory agent dissociates the raft domains. In another preferred embodiment, the raft domain inhibiting agent inhibits the formation of raft domains.
  • composition of the present invention further comprises compounds that decrease the levels of cellular isoprenoids or that inhibit protein isoprenylation or that inhibit Rho-A acivity, compounds that possess antiviral acivity, modulators of the activity of chemokine receptors, agents that Glycosphingolipid levels decrease and agenites decrease cholesterol level.
  • the present invention also relates to pharmaceutical compositions containing these compounds and to a method of using the present composition for the prevention and treatment of AIDS and a viral infection by HIV.
  • One aspect of the present invention provides a method of bringing a patient suffering from an HIV infection, comprising administering to the patient a pharmaceutically acceptable composition comprising a pharmaceutically effective amount of a geranyl-geranyl pyrophosphate reducing agent or other agents that inhibit the geranylgeranilization of Rho-GTPases.
  • One aspect of the present invention provides a method of irradiating a patient suffering from an HIV infection, comprising administering to the patient a pharmaceutically acceptable composition comprising a pharmaceutically effective amount of an antiviral agent and a pyranophosphate reducing agent of geranyl-geranyl or other agents that inhibit the geranylgeranilization of Rho-GTPases.
  • An aspect of the present invention provides a method of treating a patient suffering from HIV infection, comprising administering to the patient a pharmaceutically acceptable composition comprising a pharmaceutically affective amount of a known agent that decreases protein isoprenylation, a pharmaceutically effective amount. of a modulator of chemokine receptor activity, and a pharmaceutically effective amount of a known agent that lowers glycosphingolipid levels.
  • Figure 1 depicted the membrane rafts, enriched with GPI-proieins, anchored in the outer sheet of the bilayer, and enriched in acylated proieins anchored in the inner sheet.
  • Figure 8 shows that esalins inhibit the lateral association of CD4 and CXCR4, induced by gpl20, preventing Rho activation.
  • B cells
  • Rho or Rae loial value was analyzed in parallel in crude cell expirations as a conyrol of the protein load.
  • Western blots from three independent experiments were quantified by densitometry and the values were normalized using Rho in crude cell extracloses as charge control. The points corresponding to the data are represented with respect to the mean values of the cells not exposed to the virus (time 0) for each case.
  • the present invention also relates to a treatment, which comprises administering to a patient in need of such treatment a pharmacological composition that inhibits the targeting of human immunodeficiency (HIV) in the target cells and is of value in the prevention of infection by HIV, in the infection of HIV infection, and in the prevention and / or infection of the acquired acquired immunodeficiency syndrome (AIDS).
  • the composition of the present invention further comprises compounds that inhibit protein isoprenylation by decreasing isoprenoid cell deposits, and / or preventing activation of Rho-GTPases.
  • composition of the present invention further comprises compounds possessing antiviral activity (such as HIV protease inhibitors, non-nucleoside reverse transcription inhibitors, nucleoside / nucleotide reverse transcription inhibitors, CCR5 antagonists), integrase inhibitors, and RNaseH inhibitors, which are modulators of the activity of chemokine receptors, agents that decrease glycosphingolipid levels, and agents that decrease isoprenylation of proieins.
  • antiviral activity such as HIV protease inhibitors, non-nucleoside reverse transcription inhibitors, nucleoside / nucleotide reverse transcription inhibitors, CCR5 antagonists
  • integrase inhibitors integrase inhibitors
  • RNaseH inhibitors which are modulators of the activity of chemokine receptors, agents that decrease glycosphingolipid levels, and agents that decrease isoprenylation of proieins.
  • the present invention also relates to pharmaceutical compositions containing these compounds and to a method of using the present composition
  • chemokine modulators and more particularly CCR5 modulators, are described in US Patent 6,432,981.
  • Other modulators of the activity of chemokine receptors are described in US Pat. 6,441,001.
  • antiviral agents examples include HTV proase inhibitors, non-nucleoside reverse transcriplase inhibitors, nucleoside / nucleoid reverse transcription inhibitors, CCR5 anlagonisies, fat inhibitors and RNAsaH inhibitors.
  • the known antiviral agents are mainly purine and pyrimidine derivatives, nucleosides and nucleotides.
  • the present invention is not limited to known antiviral agents. The present invention contemplates the use of other antiviral agents as they become known.
  • Bisagni U.S. 6,451,822 describes 3- (amino- or aminoalkyl) pyrodinone derivatives that also inhibit reverse transcription of the Human Immunodeficiency Virus (HIV). These pyrimidinone and pyridinone derivatives are suitable, but not limited to, as the antiviral agent of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the rate of GlcCer formation under physiological conditions may depend on the UDP-glucose level of the tissue, which in turn depends on the glucose level in a particular tissue (Zador, IZ et al. (1993), J. Clin. Inves ⁇ . 91, 797-803).
  • In vitro assays based on endogenous ceramide produce lower synin rates than mixtures containing added ceramide, suggesting that tissue ceramide levels are normally also rate limiting (Brekeri, A. et al. (1972 ) Brain Res. 36, 183-193).
  • the GSL level has been found to control various cellular functions, such as growth, differentiation, and adhesion between cells or enire cells and matrix proieins, binding of microorganisms, and pathways to cells, including HIV binding, and cell meiasis tumorous.
  • the GlcCer precursor, ceramide can produce differentiation or inhibition of cell growth (Bielawska, A. et al. (1992) FEBS Let ⁇ ers, 307, 211-214). It is likely that all GSLs undergo cabolic hydrolysis, so any blockage in GlcCerinase would ultimately lead to aging of GSLs and profound changes in the functioning of a cell or organism.
  • a GlcCeriniase inhibitor the
  • CD4, CXCR4 and CR5 are receptors that are implicated in the entry of HIV into cells. Wild-type receivers are incorporated into raft domains.
  • An embodiment of the present invention provides modified, lamellar receptors that retain HIV binding activity, the receptors are not located in raft domains, and / or said receptors do not promote aggregation of the rafts. Such mutants are generated by mutation of natural receptors using standard genetic engineering procedures (Molecular Cloning: A labor atory manual (1989). J. Sambrook, E.F. Fri ⁇ sch, T. mania ⁇ is, Eds. Cold Spring Harbor Laboraory Press).
  • CD4-LDL is an artificial receptor for HIV-1, located in raft-free domains, to which viras binds with the same affinity as to natural CD4 receiver. CD4-LDL receptor does not mediate HIV-1 uptake in cells
  • the membrane cofactory proiein (CD46) is a basoial proiein that is not endocyosed.
  • Liquid formulations include suspensions, solutions, syrups, and elixirs. These formulations can be used as filler agents in hard or soft capsules and typically comprise an excipient, for example, water, eyanol, polyethylene glycol, propylene glycol, melilcellulose, or a suitable oil, and one or more emulsifying agents and / or agents promoting the supension. Liquid formulations They can also be prepared by reconstituting a solid, for example, an envelope.
  • the compounds of the invention can also be administered directly to the bloodstream, muscle, or an internal organ.
  • Suitable means of parenteral administration include the intravenous, intraarterial, intraperioneal, intraocal, intravenous, intraurethral, intrasternal, intracranial, intramuscular, and subcutaneous routes.
  • Suitable devices for parenteral administration include needle injectors (including microneedles), needleless injectors, and infusion techniques. Parerel formulations are typically aqueous solutions that may contain excipients such as salts, carbohydrates, and lathering agents.
  • Formulations for parenteral administration can be formulated to be immediate release and / or modified.
  • Modified release formulations include delayed, prolonged, pulsed, conirolated, directed and programmed release.
  • the compounds of the invention can be administered in the form of a solid, semi-solid, or lixo-optic liquid for administration in an implanted depol form that provides for the modified release of the compound.
  • examples of such formulations include the drug coated devices and the PGLA microspheres.
  • the drug product Before use in a dry powder or suspension formulation, the drug product is micronized to a size suitable for inhalation delivery (typically less than 5 micrometers). This can be accomplished by any suitable method of hydriding, such as spiral jet milling, fluid bed jet milling, supercritical fluid processing, to form nanoparticles, alpha pressure homogenization, or spray drying.
  • a suitable method of hydriding such as spiral jet milling, fluid bed jet milling, supercritical fluid processing, to form nanoparticles, alpha pressure homogenization, or spray drying.
  • Suitable oral flavorings such as men ⁇ ol and levomen ⁇ ol, or oral sweeteners such as saccharin or saccharin sodium, may be added to those inventive formulations intended for an inhaled / intranasal administration.
  • Formulations intended for inhaled / intranasal administration can be formulated to be immediate release and / or modified, using, for example, poly (DL) -lactic-coglycolic acid (PGLA).
  • Modified release formulations include delayed, pulsed, controlled, directed and programmed release.
  • the hit of the invention comprises two or more independent pharmaceutical compositions, of which at least one contains a protein isoprenylation inhibitor or one of its pharmaceutically acceptable salts, and means for keeping said compositions separately, such as a container, a jar with divisions, or metal foil packaging with divisions.
  • a container such as a container, a jar with divisions, or metal foil packaging with divisions.
  • An example of such a hit is the familiar blister pack used for the packaging of tablets, capsules and similar formulations.
  • the total daily dose of protein isoprenylation inhibitor is typically in the range of 1 mg to 10,000 mg, lal as a dose of 10 mg to 1,000 mg, for example, from 25 mg to 500 mg, depending of course on the mode of administration, the age, condition and weight of the patient, and will in any case be at the discretion of the physician.
  • the total daily dose can be administered in single or divided doses.
  • agents that can be used to increase the exposure of a patient to a compound of the present invention are those agents capable of acting as inhibitors of at least one of the isoforms of cyclochrome P450 enzymes (CYP459).
  • CYP450 isoforms that can be advantageously inhibited include, but are not limited to, CYP1A2, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, and CYP3A4.
  • Suitable agents that can be used to inhibit CYP3A4 include, but are not limited to, ritonavir, saquinavir, or ketoconazole.
  • NNRTI NNRTI
  • NRTIs and a PI one or more NRTIs and a CCR5 antagonist
  • a PI a PI and an NNRTI
  • additional reasoning that strongly encourages or recommends the use of a combination of a compound of the invention and another therapeutic agent, such as in the tram of diseases or spies that are a direct result of the underlying or underlying disease or state, or that indirectly accompany it.
  • HCV Hepatitis C virus
  • HBV Hepatitis B virus
  • HBV Human Papillomavirus
  • a proiein isoprenylation inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or derivative thereof, along with CCR1 antagonists such as BX-471; an agonysia of ⁇ -adrenoceptors such as salmelerol; a corticosteroid agonist such as fluticasone propionate; an LTD4 antagonist such as montelukast; a muscarinic antagonist such as thiopyropium bromide; a PDE4 inhibitor such as colimilast or roflumilasl; a COX-2 inhibitor, such as celecoxib, valdecoxib, or rofecoxib; an ot-2-delta ligand such as gabapenlin or pregabalin; a beta iler inferferon as REBIF; a TNF- ⁇ receptor modulator such as a TNF- ⁇ inhibitor (eg, adalimumab), an H
  • CCR1 antagonists such as BX-471
  • the invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a protein isoprenylation inhibitor, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate or derivative thereof, and one or more additional therapeutic agents.
  • PBMCs purified on Ficoll-Hypaque gradients were activated for 2 days with fiiohema ⁇ oglu ⁇ inina (PHA; 1 ⁇ g / ml) and IL-2 (50 ng / ml), and were enra ⁇ aron (48 h, 37 ° C) with lovas ⁇ a ⁇ ina or lovas ⁇ a ⁇ ina + mevalonalo.
  • Iriad PBMCs were incubated with stock viral preparations of NL4-3 or BaL (1 or 10 ng p24 / 10 6 cells, 3 hr, 37 ° C).
  • mice 10 weeks old, with a non-secretory phenotype, were reconstituted by ip injection of 50 x 10 6 human PBMC.
  • mice that had levels Comparable serum human immunoglobulins, test for reconstitution with human cells, received lovastatin (ip: 5 mg / kg) one injection every three days, beginning one week prior to immune sensitization with NL-4-3 HTV
  • HEK 293T cells co-transfected with pNL4,3.Luc.RE and with cDNA encoding HIV-I AD AO VSV coatings, were treated with lovasiain or lovaslaline + mevalonaium.
  • Viral stock preparations were collected after 48 h and were titrated by measuring luciferase activity after transduction of HE4293 T cells expressing CD4. Values were normalized with respect to luciferase activity measured in extracts from reserve producer cells.
  • Gpl20-induced patch formation Unstimulated PBMC cells seeded in ICAM-1 / Fc coated chambers (R&D Systems) were incubated (30 min, 12 ° C) with recombinant gpl20 (X4 virus adapted to a T cell line, isolated sample IIB; Iniracel) in PBS / 0.2% bovine serum albumin, followed by rabbit anli-gpl20 antibody and rabbit-anii-Cy2-Ab (Jackson
  • lovastatin-induced reduction in HIV-1 pseudotyped viral production is unlikely to be due to differential Gag processing and synysis, since the HIV-1 and VSV pseudotypes share the same viral genome.
  • lovasiain increased the LTR-directed promoter activity of HTV-1 (Fig. 6), suggesting that the drug is capable of regulating the activity of nuclear factors involved in HIV transcription.
  • lovastain has pleiolropic effects on HIV-1 replication, because the drug is capable of promoting virus replication by increasing transcription of the viral genome, and has anti-HIV-1 effects that inhibit enrylation and the output of the viras in the target cell.
  • Both lovasiain-induced pro-HIV-1 and anli-HIV-1 effects were mediated through the mevalonaio strain, since they were reversed by co-incubating the cells with L-mevalonalo (Fig. 6A-C ).
  • Inhibition of the mevalonate pathway decreases cholesterol biosynthesis, but also decreases the cellular deposits of GGPP and FPP, both of which are involved in post-translational modification of proteins.
  • the Applicant has found that inhibition of HTV-1 entry into permissive cells, induced by lovaslaline, was reversed by the co-addition of GGPP, but not FPP or choles ⁇ erol (Fig. 7A). This suggests that lovasiain inhibits HIV-1 infection by blocking protein geranylgeranylation rather than preventing farnesylation or decreasing cholesterol biosynlesis.
  • Enzyme for R5 pseudoiphyidal virus was inhibited by cell wrapping with a geranylgeranyl transferase inhibitor, but not by a farnesyl transferase inhibitor.
  • Fig. 7B These drugs did not affect the entrapment of pseudoipipic lines with VSV (non-mosquito).
  • Esiains are used in the HAART-associated lipodysyrophy era. Based on the above in vitro results, the potential use of stains for in vivo treatment of HIV patients was studied.
  • the irradiation with esiaines in a short period of time induced a clear decrease in serum viral RNA loads in all patients (Table I).
  • the interruption of the traia with es ⁇ a ⁇ inas produced a regrowth in the viral load (Table I).
  • the data suggests that esiatins are capable of inhibiting HIV-1 replication in individuals suffering from chronic infection, and supports the use of statins as antireviral agents.
  • G. del follow ⁇ ng publications are hereby incorporated in their entirety and for al! purposes.
  • G. del following publications are hereby incorporated in their entirety and for all purposes-
  • G. del following publications are hereby incorporated in their entirety and for all purposes:
  • G. del following publications are hereby incorporated in their entirety and for all purposes .
  • G. of the following publications are hereby incorporated in entirety and for ali Their purposes: G. of the A. & S. Manes, Speci ⁇ c SHP-2 parrtlionlng m raft domai triggers mt gr ⁇ -medrated s gnaimg via Rho activa / ton, J. Cell Biol. 157, 277-290, 2002.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

El presente invento se refiere en general a la prevención o retraso de una infección retroviral mediante el uso de agentes que previenen la agregación de receptores retrovirales asociados con los dominios con balsas de las membranas celulares. El presente invento se refiere más concretamente a la prevención o tratamiento de una infección por HIV-1 mediante el uso de agentes que inhiben la activación de Rho-A, actuando sobre la actividad de GTPasa o sobre la isoprenilación de proteínas. El presente invento se refiere también a la prevención o retraso de una infección por HIV-1 mediante el desplazamiento de los receptores para citoquinas de los dominios con balsas de las membranas celulares.

Description

PREVENCIÓN DE UNA INFECCIÓN POR HIV-1 MEDIANTE LA INHIBICIÓN DE LA REORGANIZACIÓN Y/O LA ALTERACIÓN DEL CONTENIDO DE LOS DOMINIOS CON BALSAS DE LA MEMBRANA CELULAR, MEDIADAS POR R o
PRIORIDAD
Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de EE.UU., serie 60/466.429, presentada el 30 de Abril de 2.003
CAMPO TÉCNICO
El presente invento se refiere en general a la prevención o retraso de una infección retroviral mediante la administración de agentes que previenen la agregación de receptores retrovirales asociada con los dominios con balsas (del inglés, "raft domains") de las membranas celulares. El presente invento se refiere más concretamente a la prevención o tratamiento de una infección por HTV-1 mediante el uso de agentes que inhiben la activación de Rho-A actuando sobre la actividad de GTPasa o sobre la isoprenilación de proteínas. El presente invento se refiere también a la prevención o retraso de una infección por HIV-1 mediante el desplazamiento de los receptores para citoquinas de los dominios con balsas de las membranas celulares. Más en particular, el presente invento se refiere al uso de inhibidores de la isoprenilación de proteínas en el tratamiento de una infección por HIV, tal como el HIV-1, y de infecciones retrovirales genéticamente relacionadas (y del síndrome de inmunodeficiencia adquirida resultante, SIDA).
ANTECEDENTES
La información que se proporciona a continuación no se admite que constituya la técnica anterior del presente invento, pero se proporciona para ayudar al lector a su comprensión.
La membrana plasmática es una estructura especializada que canaliza e integra la información que fluye de manera continua entre una célula y su entorno. La membrana plasmática celular constituye también la primera barrera frente a una infección producida por patógenos intracelulares. De manera contraria a la consideración de la membrana plasmática como una estructura fosfolipídica homogénea cargada con proteínas, la última década ha puesto de relieve la heterogeneidad de las fases que conforman la membrana plasmática. En particular, la evidencia acumulada indica que dominios lipidíeos especializados, denominados balsas, desempeñan papeles fundamentales en la regulación de un conjunto de procesos celulares, que van desde la transducción de señales hasta las entradas de infecciones con patógenos intracelulares (Simons, K y Toomre, D (2000) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1.31-39; Brown, D. y London, E. (2000) J. Biol. Chem. 275, 17221-17224; Manes, S. y col. (2001) Semin. Immunol. 13, 147-157; Mellado, M. y col. (2001) Annu. Rev. Immunol. 19, 397-421). La evidencia actual apoya la idea de un papel principal de la estructura de los dominios con balsas en la regulación de las diferente interacciones entre los componentes de la membrana. Además, la evidencia apoya la idea de un papel para los dominios con balsas en la infectividad y propagación de patógenos, incluyendo de manera particular los virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) (Manes, S. y col. (2003) Nat. Rev. Immunol. 3, 557- 568).
La organización de los lípidos en una membrana está en gran medida determinada por la fase de la bicapa. Las diferentes fases de las membranas lipídicas representan estados físicos que difieren en el empaquetamiento, el grado de orden y la movilidad de los lípidos constituyentes (Brown, D. y London. E. (1998) J. Membr. Biol. 164, 101-114; Rietveld, A. y Simons, K. (1998) Biochim. Biophys. Acta 1376, 467-479; Brown, D. (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 10517-10518. Las dos fases extremas son la fase líquido-cristalina de gel cuasi sólida (Ic) y la fase líquida desordenada (Id). Las bicapas homogéneas formadas a partir de fosfolípidos o esfingolípidos purificados, exhiben una transición brusca, dependiente de la temperatura entre la fase de gel y la fase desordenada, que se produce a una temperatura de fusión característica (Tm) (del inglés, "melting _ temper ature"). Esta separación de fases en la membrana es consecuencia de la capacidad de empaquetamiento diferencial de los esfingolípidos y los fosfolípidos. Los esfingolípidos contienen largas cadenas de acilo enormemente saturadas, que confieren una Tm mucho más alta que las que poseen los glicerofosfolípidos, que son ricas en cadenas de acilo insaturadas y curvadas. Por lo tanto, las bicapas glicerolipídicas se encuentran en una fase Id muy fluida y sus lípidos presentan una movilidad rotacional y una movilidad lateral altas. Por el contrario, las membranas enriquecidas con esfingolípidos están muy ordenadas, teniendo sus lípidos densamente empaquetados y con una movilidad fuertemente reducida en el plano de la bicapa.
En presencia de colesterol, las bicapas lipídicas también pueden adoptar una tercera fase intermedia denominada fase liquida-ordenada (I0). Cuando está presente en una bicapa, el colesterol tiende a ocupar los espacios situados entre las cadenas hidrocarbonadas saturadas de los lípidos (Smaby, J.. y col., (1996) Biochemistry 35, 5696-5704). Alineándose con los fosfolípidos y esfingolípidos, la presencia de colesterol en las membranas aumenta el orden de las cadenas hidrocarbonadas pero, lo que es más importante, disminuye la formación de las fases de gel (Bittman, R. (1997) Subcell. Biochem. 28, 145-171). Por consiguiente, la fase I0 se caracteriza por una sustancial movilidad lateral y rotacional de los lípidos. Estudios sobre modelos de membranas apoyan la idea de que las fases I0 e Ic podrían coexistir en las membranas biológicas. En estas bicapas artificiales, el colesterol se reparte preferencialmente con lípidos de alta Tm en el interior de los dominios de membranas I0, mientras que se separa de los dominios de fase Ic enriquecidos en lípidos de baja Tm (Sanharam, M. y Thompson, T. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88, 8686-8690; Ahmed, S. y col., (1997) Biochemistry 36, 10944- 10953. De acuerdo con esto, en bicapas lipídicas complejas, tales como la membrana plasmática, se piensa que el colesterol se asocia con lípidos que contienen cadenas hidrocarbonadas saturadas en el interior de dominios con balsas de las membranas (Ge, M. y col. (1999) Biophys. J. 77, 925-933). Los dominios con balsas pueden por lo tanto definirse como membranas en la fase I0, o en un estado con propiedades similares, resultantes del empaquetamiento lateral preferencial de lípidos de alta Tm y de colesterol en la hoja externa de la bicapa.
La hipótesis de las balsas expone que la separación de dominios discretos de fases liquidas-ordenadas y de fases líquidas desordenadas tienen lugar en membranas que contienen cantidades suficientes de esfingolípidos y esteróles, tales como la membrana celular plasmática. Aunque estudios realizados en membranas celulares apoyan este concepto, la existencia de balsas, sin embargo, no ha sido aún demostrada de manera concluyente en membranas celulares. No obstante, algunas estrategias sugieren con fuerza que las membranas celulares no contienen balsas. Estos métodos incluyen la insolubilidad en detergentes dependiente del contenido en colesterol y la co-localización de proteínas y lípidos agregados independientemente en parches sobre la superficie celular (Brown, D. y London, E. supra), la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) entre proteínas ancladas a glicosilfosfatidil-inositol (GPI) (del inglés, "GlycosylPhosphatidyl Inositol") (Varma, R. y Mayor, S. (1998) Nature 394, 798-
801; Kenworthy, A. y col., (2000) Mot. Biol. Cell. 11, 1645-1655), seguimiento de partículas individuales (Fraile, A. y col., (2000) J. Cell. Biol. 48, 997-1007), y microscopía de moléculas individuales (Schütz, G. Kada, G. Pastushenko, V. y Schindler,
H. (2000) EMBO J. 19, 892-901). Las estimaciones del tamaño de las balsas varía desde unos cuantos nanómetros a micrómetros (Varma, R. y Mayor, S. supra; Kenworthy, A. y col., supra; Pralle, A. y col., supra; Schütz, G. y col., supra). Esto sugiere que las balsas de las células probablemente son más complejas que las de las membranas de los modelos.
Una estrategia bioquímica frecuentemente utilizada para identificar dominios con balsas en membranas celulares es la purificación de membranas resistentes a detergentes (DRM) en gradientes de densidad de flotación. Este método se basa en la insolubilidad relativa de las bicapas lipídicas de fase lo en detergentes no iónicos tales como Tritón X-100 a bajas temperaturas (Brown, D. y London E. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 240, 1-7). Esta propiedad se ha demostrado en sistemas de membranas artificiales bifásicas lo/Id, en los que la insolubilidad en detergente se correlaciona con el contenido de la fase lo de la membrana (Dietrich, C. y col. (2001) Biophys. J. 80, 1417-1428). Estudios realizados en membranas artificiales indican también que algunos de los lípidos abundantes en las DRM, tales como el colesterol, en realidad se requieren para mantener y/o asociar los dominios lo (Dietrich, C, y col. supra). Además de su composición específica en lípidos, las DRM están enriquecidas en varias clases de proteínas (Simons, K. y Toomre, D.) (Fig. 1). Las proteínas ancladas a GPI constituyen una de las principales clases de proteínas asociadas a balsas, unidas a la hoja exoplásmica de la membrana plasmática a través de un resto de fosfatidil-inositol. Las cadenas de acilo y alquilo de GPI generalmente están saturadas de acuerdo con su afinidad por membranas lo y por asociaciones de balsas (Dietrich, C. y col. (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 10642-10647). Las proteínas citoplásmicas doblemente aciladas son otra clase importante de proteínas asociadas a DRM. Incluyen miembros específicos de la familia de las src-quinasas y determinados tipos de subunidades Gα de GTPasas heterotriméricas. Se piensa que estas proteínas se anclan a través de sus cadenas de acilo, muy probablemente de ácido palmítico saturado (Resh, M. (1999) Biochim. Biophys.
Acta 1451, 1-16; Liang, X. y col. (2001) J. Biol. Chem. 276, 30987-30994). Por el contrario, tanto las proteínas que se extienden por la membrana como las proteínas premiadas son difíciles de acomodar en un entorno ordenado. Realmente, las DRM tienen una cantidad relativamente escasa de proteínas de transmembrana y contienen niveles muy bajos de proteínas premiadas (Melkonian, K. y col. (1999) J. Biol. Chem. 274, 3910- 3917). No obstante, algunas proteínas de transmembrana están también enriquecidas en las DRM. La palmitoilación contribuye a que algunas proteínas de transmembrana se dirijan a las DRM (Melkonian, K. y col. (1999) supra), aunque no todas las proteínas de transmembrana palmitoiladas se encuentran en DRM. Además, la secuencia del dominio de extensión por la membrana puede afectar al reparto de las DRM (Persch, A. y col. (1995) J. Cell Sci. 108, 1033-1041; Scheiffele, P. y col., (1997) EMBO J: 16, 5501- 5508). Sin embargo, las mutaciones en dominios citoplásmicos puede también afectar a la asociación de proteínas de transmembrana con las DRM (Polyak, M. y col. (1998) J. Immunol. 161, 3242-3248), incluso cuando las CYTOPLSMIC TAILS colas citoplásmicas probablemente no interaccionan directamente con la bicapa lipídica. Una posibilidad para explicar estas observaciones es que esos imitantes citoplásmicos no son capaces de interaccionar con sus parejas de unión, que dirigen y/o anclan las proteínas de transmembrana naturales en las balsas lipídicas (Brückner, K. y col. (1999) Neuron 22, 511-524; Oliferenko, S. y col., (1999) J. Cell. Biol. 146, 843-854; Machleidt, T. y col. (2000) J. Cell. Biol. 148, 17-28).
Las DRM representan agregaciones de membranas post-lisis y por lo tanto es difícil hacer comparaciones cuantitativas entre las DRM y las balsas naturales (London, E. y Brown, D. (2000) Biochim. Bipohys. Acta 1508 182-195). Como se ha comentado anteriormente, se han utilizado nuevas estrategias técnicas diferentes para analizar la estructura y la dinámica de las balsas en células vivas y/o fijadas. El seguimiento de partículas individuales utilizando anticuerpos conjugados con oro coloidal demostró que el gangliósido GM1 y la proteína asociada a las balsas, Thy-1) estaban confinados transitoriamente a zonas del interior de la mebrana plasmática (Sheets, E. y col. (1997) Biochemistry 36, 12449-12458). Recientemente, la medida del movimiento lateral de moléculas individuales, ya sean lípidos (Schütz, G. y col., (2000) EMBO J. 19, 892-901) o proteínas (Pralle, A. (2000) J. Cell Biol. 48, 997-1007) asociados o no a las balsas, demostró el confinamiento de marcadores específicos en membranas liquidas-ordenadas situadas en la superficie de células vivas. El reparto de las moléculas dentro y fuera de las balsas en estos estudios fue muy dinámico, pero por lo menos algunas proteínas de las balsas residieron en el interior de las balsas durante varios minutos.
Mientras que las zonas de confinamiento detectadas mediante seguimiento de moléculas individuales coinciden en experimentos independientes, los análisis de FRET de marcadores de balsas proporcionan por el contrario resultados controvertidos. En realidad, las medidas de proximidad entre proteínas ancladas a GPI indicaron en algunos casos que los marcadores asociados a balsas están concentrados en microdominios de la membrana plasmática de una manera sensible a colesterol (Varma, Y. y Mayor, S. (1998) Nature 394, 798-801; De Angelis, D. y col., (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95, 12312-12316). En otros estudios, sin embargo la FRET detectada entre proteínas ancladas a GPI y el glicoesfingolípido GM1 se correlacionó con la densidad en superficie del marcador de balsas (Kenworthy, A. y col. (2000) Mol. Biol. Cell 11, 1645-1655), un hallazgo que no concuerda con la agregación en microdominios. Por lo tanto, aunque algunos marcadores de balsas podrían encontrarse en una proximidad de submicrómetros en la membrana, no están confinados en balsas estabilizadas. Las discrepancias no se han resuelto todavía. Una estrategia ampliamente utilizada para TO PROBÉ la presencia de balsas en células vivas es la manipulación de los niveles de lípidos que forman las balsas. En algunos casos esta estrategia se utiliza como una "estrategia funcional" para demostrar la implicación de las balsas en una función celular particular. El agotamiento de colesterol es un método perfectamente documentado para romper la estructura de los dominios con balsas (Simons, K. y Toomre, D. (2000) supra). Fármacos de unión a esteróles, toxinas o detergentes son capaces de secuestrar al colesterol. Las ciclodextrinas se utilizan a menudo para rebajar los niveles de colesterol drásticamente o, si están formando un complejo con el colesterol, para introducir el colesterol en exceso en el interior de las membranas celulares (Keller, P. y Simons K. (1998) J. Cell. Biol., 140, 1357-1367). De todas maneras, el tratamiento con ciclodextrinas debe realizarse por espacios cortos de tiempo ya que el fármaco afecta tanto a la membrana plasmática como a los orgánulos intracelulares conectados a ella cuando se aplican durante varias horas a las células (Hansen, G y col., (2000) J. Biol. Chem. 275, 5136-5142; Grimmer, S. y col.,
(2000) Mol. Biol. Cell. 11, 4205-4216).
Rebajar los niveles de esfmgolípidos en la membrana plasmática mediante tratamiento de las células con inhibidores de la biosíntesis de esfingolípidos o mediante su degradación con esfingolielinasa bacteriana, también rompe la asociación con DRM de varios marcadores de balsas (Scheiffele, P. y col., (1997) supra; Hanada, K. y col. (1995) J. Biol. Chem. 270, 6254-6260). De manera notable, las DRM pueden incluso formarse en ausencia de glicoesfingolípidos. Esto se demostró utilizando una línea células deficiente en síntesis de glicoesfingolípidos (Ostermeyer, A. y col., (1999) J. Biol. Chem. 274, 34459-34466). Es interesante destacar que estas células produjeron cantidades aumentadas de esfingomielina posiblemente para compensar la disminución de lípidos que prefieren las balsas o para mantener ordenados los dominios con balsas de las membranas. En conjunto, las alteraciones en el estado de los esfingolípidos de las células no son predecibles como sucede con el colesterol. La evidencia anteriormente comentada dibuja la membrana plasmática como un equilibrio dinámico entre dominios en las fases ordenadas de balsas y en las fases desordenadas de no balsas. Sin embargo, el uso de detergentes distintos de Tritón X-100 ha sugerido que las células de mamífero pueden tener diferentes subtipos de balsas en la superficie. Esta intrigante posibilidad proviene de la observación originaria de Madore y colaboradores (Madore, N. y col. (1999) EMBO J. 18, 6917-6926) que mostraron que dos proteínas de las células neuronales, ancladas a glicofosfatidil-inositol, Thy-1 y una proteína prión, podía asignarse a membranas extraídas de modo diferente, con Tritón X-100 y con Brij 96. Asimismo, en células epiteliales se ha descrito la presencia de dos subtipos de balsas basándose en la insolubilidad diferencial en detergentes; las balsas insolubles en Lubrol (pero solubles en Tritón X-100) y las balsas insolubles en Tritón X-100 (Roper, K. y col. (2000) Nat. Cell. Biol. 2, 582-592). Aunque la integridad de los dos subtipos de balsas propuestas es dependiente de colesterol, por ahora se desconoce la dependencia potencial de distintas especies de esfingolípidos que tienen estos dominios. Sin embargo, en los linfocitos T se han identificado dos subtipos diferentes de balsas basándose en la composición en glicoesfingolípidos. Estudiando la polarización de células T inducida por un quimioatractor, Gómez-Mounton y colaboradores (Gómez-Mounton, C. y col., (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 9642- 9647) encontraron que proteínas de membrana, tales como el receptor de quimioquina CXCR4 o el receptor de plasminógeno, se repartían de manera específica en balsas enriquecidas en GM3 mientras que otras proteínas, tales como las moléculas de adhesión intercelular ICAM-1 o CD44, se repartían mayoritariamente en balsas enriquecidas en GM1. Las balsas enriquecidas en GM1 y las balsas enriquecidas en GM3 son iguales de sensibles a la extracción de colesterol pero también igual de resistentes a la extracción con diferentes detergentes. Es importante indicar que las células usan la segregación de proteínas hacia diferentes subtipos de balsas para dirigir a proteínas específicas hacia localizaciones de la membrana espacialmente restringidas. En verdad, una alta densidad de balsas enriquecidas con proteínas-priones se encuentran en el cuerpo celular, mientras que las balsas que contienen Thy-1 se encuentran mayormente en las neuritas (Madore, N. y col., (1999) EMBO J. 18, 6917-6926); las balsas insolubles en lubrol, de células epiteliales, están asociadas selectivamente a las microvellosidades, pero permanecen separadas de las balsas planares, insolubles en Tritón (Roper, K. y col., (2000) Nat. Cell. Biol., 2, 582-592); por último, las balsas enriquecidas en GM3 transportan proteínas específicas de membrana y proteínas de citoesqueleto hasta el borde conductor de linfocitos migratorios, mientras que las balsas basadas en GM1 portan receptores de adhesión célula-célula para el urópodo, en la parte posterior de células T. Aunque se propuso que las balsas eran una señal de separación en la red del trans-Golgi para organizar las proteínas y lípidos en superficies celulares específicas de células epiteliales y neuronales polarizadas (Simons, K. y Toomre, D. (2000), supra; Rodriguez-Boulan, E. y González, A. (1999) Trends Cell Biol. 9,291-294), se ha hecho de cada vez más evidente que las balsas lipídicas ejercen una influencia multifacetada sobre diferentes procesos celulares que incluyen la proliferación (Inokuchi, J. y col. (2000) Glycoconj. J. 17, 239-245), apoptosis (Grassme, H. y col., (2001) J. Biol. Chem. 276, 20589-20596), migración (Manes, S. y col., (1999) EMBO J., 18, 6211-6220; Khanna, K. y col., (2002) J. Clin. Invest, 109, 205-211), adhesión (Krauss, K. y Altevogt, P. (1999) J. Biol. Chem. 274, 36921-36927; Lacalle, R. y col., (2002) J. Cell Biol. 157, 277-289), e infección por patógenos (van der Goot, F. y Harder, T. (2002) Semin. Immunol. 13, 89-97), entre otros (para una revisión más general, véanse Simons, K. y Toomre, D. (2000) supra; Brown, D. y London, E. (2000) J. Biol. Chem. 275, 17221-17224; Manes, S. y col., (2003) Nat. rev. Immunol. supra). Los dominios con balsas participan en estas acciones fisiológicas principalmente mediante la regulación espacial y temporal de las interacciones proteína-proteína requeridas para llevar a cabo estos procesos. Ciertamente, una importante característica general de las balsas parece que es la de estabilización de múltiples interacciones débiles que se producen después de un estímulo (Simons, K. y Toomre, D. (2000), supra). Esta propiedad, junto con la elevada movilidad de las unidades de las balsas en el plano de la membrana, puede facilitar la interacción (o aumentar la eficiencia) entre diferentes parejas de transducción de señales, como se ha revisado en lo que antecede, entre diferentes receptores celulares implicados en la entrada de patógenos o de toxinas.
Pueden contemplarse varias posibilidades en las que las balsas actúan como dispositivos que controlan las interacciones proteína-proteína en las membranas (Fig. 2). Considerando el tamaño más pequeño de las balsas, una determinada balsa puede contener solamente un número bajo de proteínas. Por lo tanto, una etapa importante en la iniciación de estos procesos es la capacidad de las pequeñas balsas individuales para agregarse en balsas más grandes. Este proceso de coalescencia lleva a los componentes de la maquinaria asociados en la balsa a otra plataforma de mayor tamaño, en donde puede tener lugar el encuentro entre dos proteínas anteriormente separadas en la balsa. Estas balsas más grandes pueden ser más estables que los dominios con balsas más pequeñas, las proteínas de la balsa pueden inducir la estabilización del citoesqueleto de actina subyacente (Oliferenko, S. (1999) J. Cell. Biol. 146, 843-854; Villalba, M. y col., (2001), J. Cell. Biol., 155, 331-338), lo cual podría además multiplicar las fuerzas de atracción y promover la asociación de complejos funcionales que inducirían una respuesta coordinada (Lacalle, R. y col. (2002) supra). Es importante señalar que las agregaciones de proteínas asociadas en las balsas permanecen separadas de las asociaciones de proteínas de membrana no asociadas a las balsas, cuando ambos tipos de proteína son inducidos artificialmente a que se junten (Harder, T. y col., (1998) J. Cell Biol., 141, 929-942). Por lo tanto, la segregación espacial de las proteínas del interior de membranas con diferente separación de las fase puede prevenir interacciones ebtre componentes de las balsas y componentes que no son de las balsas. Además, las proteínas asociadas a las balsas pueden separarse en diferentes subtipos de balsas que contienen grupos específicos de proteínas. Como se ha comentado anteriormente, la coalescencia de las balsas parece tener lugar sólo entre el mismo subtipo de balsa, por lo tanto, las interacciones proteína-proteína en la membrana plasmática pueden controlarse no sólo mediante la separación espacial de los componentes entre balsas y no balsas, sino también mediante el reparto de cada componente en subtipos de balsas específicos. Las balsas también pueden controlar interacciones entre proteínas secuestrando un elemento particular de la membrana, residiendo inicialmente en una región menos ordenada de la membrana, dentro de un dominio con balsas preexistente. Esto podría tener lugar arrastrando a una proteína hacia el interior de las balsas, mediante interacciones mediadas por proteínas, o cambiando su afinidad por las fases líquidas- ordenadas. La oligomerización es un factor bien documentado que aumenta la afinidad de un componente de la membrana por las balsas (Harder, T. y col. (1998) J. Cell Biol. 141, 929-942). La monitorización de las balsas en células vivas sugiere que al menos algunos componentes de las balsas están en equilibrio dinámico con membranas sin balsas. Por consiguiente, para todo elemento de las balsas existe un coeficiente de reparto que determina la fracción del marcador de las balsas que reside dentro o fuera de las balsas. El intercambio de componentes de las balsas con regiones circundantes sin balsas probablemente se restringiría a los límites entre los dominios de membrana. Al igual que la relación del área superficial con respecto a la circunferencia depende del tamaño de la balsa, las cinéticas de intercambio dependerán también del tamaño de la balsa. Por lo tanto, la oligomerización de una proteína de membrana que tiene un intercambio alto entre regiones de membrana con balsas y sin balsas, puede estabilizar la asociación de estas proteínas dentro de dominios con balsas-ordenados de la membrana. De manera alternativa, las balsas pueden formarse de novo alrededor de proteínas de transmembraba oligomerizadas, una vez que son lo suficientemente estables para residir en estos dominios ordenados.
La entrada de virus con cubierta puede dividirse en tres etapas: la unión del virus al receptor(es) de superficie celular específico, el cambio conformacional en la proteína de fusión viral, y la reacción de fusión propiamente dicha de las membranas celulares del virus y del hospedador. La proteína gpl60 de la cubierta (Env) (del inglés, "Enyelopé") del HPV-1 es una proteína integral de membrana de tipo I que media en la unión del virus y en la fusión de las membranas. Sintetizada en forma de un único precursor polipeptídico que forma trímeros, Env se escinde para generar dos subunidades asociadas no covalentemente, gpl20 y gp41. La subunidad gpl20 se une al receptor principal de superficie celular, específico para HIV-1, CD4 (Maddon, P. y col. (1986)
Cell 47, 333-348). Aunque la unión a CD4 es un prerrequisito para la entrada del HIV-1, la unión del virus per se es insuficiente para mediar la infección viral. Se ha observado que algunos miembros de la familia de receptores de quimioquinas actúan como co- receptores necesarios para la entrada del HIV-1 (Berger, E. y col., (1999) Annu. Rev.
Immunol. 17, 657-700). La interacción inicial con CD4 promueve cambios conformacionales en gpl20, lo cual da lugar a regiones crípticas de la glicoproteína viral por interacción adicional con un miembro de la familia de receptores de quimioquinas. Este segundo evento de unión conduce a la fusión de la membrana del hospedador y de la membrana viral mediante un proceso mediado por gp41 (Berger, E. y col., (1999) Annu Rev. Immunol., 17, 657-700; Doms, R. y Trono, D. (2000) Genes Dev. 14, 2677-2688). La utilización de los receptores de quimioquinas varía dependiendo de la cepa viral y es el determinante principal del tropismo viral. Las cepas más principales de HIV-1 usan el receptor CCR5 de quimioquinas junto con el receptor CD4 para la entrada del virus (denominadas cepas R5 del virus). En algunos individuos, los virus evolucionan de manera que usan un receptor relacionado, CXCR4, ya sea en lugar del receptor CCR5 (cepas X4 del virus) o además del receptor CCR5 (cepas R5X4).
Aunque el descubrimiento de los receptores de quimioquinas como receptores esenciales para la entrada del HIV ha proporcionado un gran poder explicativo para el entendimiento del tropismo y de la patogénesis virales, todavía faltan algunas piezas cruciales del puzzle. Ciertamente, algunas moléculas de superficie celular modulan la susceptibilidad a una infección por HIV-1, incluso aunque esas moléculas no interaccionen directamente con la Env viral. Por ejemplo, el entrecruzamiento de CD26, CD28 o CD44 aumenta la permisividad de las células frente al HIV-1, mientras que CD38 disminuye la susceptibilidad a la infección (Callebaut, C. y col., (1993) Science 275, 2045-2050; Dukes, C. y col. (1995) J. Virol. 69, 4000-4005; Savarino, A. y col., (1999) FASEB J. 13, 2265-2276). Es possibles que estas moléculas modulen la entrada de HIV-1 de manera indirecta regulando la densidad de los receptores virales. Además, la fusión entre la membrana viral y la membrana de las células hospedadoras es un proceso cooperativo que requiere la suma de múltiples complejos de co-receptores CD4-gpl20. En la actualidad se estima que cuatro de cada seis receptores CCR5 (Kuhmann, S y col., (2000) J. Virol. 74, 71305-7015) multiplican las moléculas de CD4 (Layne S. y col.,
(1990) (Nature 346, 277-279), y que tres de cada seis trímeros de Env son necesarios para formar un poro de fusión. Parece por lo tanto, que la infección por HTV-1 depende de múltiples interacciones intermoleculares sobre la superficie celular; CD4 unido a gpl20 debe encontrar el co-receptor apropiado sobre la superficie celular y, por lo tanto, diferentes complejos de co-receptores CD4-gpl20 deben agregarse para llevar a cabo la fusión de las membranas viral-celular. La consecuencia lógica es que moléculas de la superficie celular del hospedador o rutas de señalización que promueven o previenen estos eventos de agregaciones, impactarían en la tasa y en la eficiencia de la entrada del virus. En este sentido, la remodelación de actina mediada por GTPasas de Rho puede desempeñar un papel central en estos eventos de agregación. En verdad, la unión de HIV- 1 a la superficie celular desencadena la activación específica de Rho-A, un evento crucial para la entrada del virus.
Informes recientes sugieren que los dominios de balsas pueden actuar como una estructura en la que tienen lugar estas asociaciones laterales. En primer lugar, estudios fisicoquímicos han demostrado la interacción directa de gpl20 con glicoesfingolípidos definidos (Harause J. y col. (1991) Science, 253, 320-323; Yahi, N. y col. (1992) J. Virol. 66 4848-4854; Hammache, D. y col. (1998) J. Biol Chem, 273, 7967-7971; Hammache, D. y col., (1999) J. Virol. 73, 5244-5248), sugiriendo que algunas etapas de la entrada del virus tienen lugar en los dominios de balsas. Además, la inhibición de la síntesis de glicoesfingolípidos (Hug, IP. y col. (2000) J. Virol. 74, 6377- 6385) y los anticuerpos anti-glicoesfingolípidos (Harouse, J. y col., (1991) Science 253, 320-323) previenen la infección in vitro por HIV-I, indicando que la interacción de gpl20 con glicoesfingolípidos es importante para la infección del virus. En segundo lugar, el tratamiento de las células con fármacos que secuestran el colesterol, y que rompen las membranas lo, inhibe la infección por HIV-I in vitro (Manes, S. y col. (2000) EMBO Rep. 1, 190-196; Liao, Z. y col. (2001) AIDS Res. Hum. Retroviruses 17, 1009-1019) e in vivo (Khanna, K. y col. (2002) J. Clin. Invest. 109, 205-211), indicando que la dinámica de las balsas puede influir de modo espectacular sobre la eficiencia de la entrada del virus. En tercer lugar, el direccionamiento de CD4 hacia una fracción de membrana sin balsas impide la entrada de HIV-1, aunque este muíante de CD4 se une a la Env viral con la misma afinidad que el CD4 de tipo salvaje (del Real, G. y col., (2002)
J. Exp. Med., supra).
Esta evidencia indica con fuerza que la entrada del virus tiene lugar debido al reparto de receptores para HIV dentro de la misma fase de membrana. En este sentido, mientras que la asociación de CD4 con las balsas está perfectamente establecida (Xavier, R. y col., (1998) Immunity 8, 723-732), el reparto de receptores de quimioquinas en las balsas es un asunto a debatir. Se ha informado que los co-receptores CCR.5 y CXCR4 de HIV-1 se co-purifican en la fracción de DRM después de la agregación de ligandos o de la inducida por gpl20 (Manes, S. y col. (2001) Semin. Immunol. 13,147- 157; Gómez Mounton, C. y col., (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 98, 9642-9647; Manes, S. y col., (1999) EMBO 1, 18, 6211-6220, Manes S. y col (2000) EMBO Rep, 1, 190-196; Sorice, M. y col., (2001) FEBS Letters 506, 55-60). Además, CCR5 y CXCR4 señalan las balsas (Mellado M. y col., (2001) supra) y están constitutivamente asociadas con otras proteínas de las balsas tales como CD4 (Xiao, X. y col. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96, 7496-7501). De manera importante, la co-localización de CXCR4 con CD4 tiene lugar en el subtipo de balsa enriquecida con GM3 (Gómez-Mounton, C. y col., (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 9642- 9647; Sorice, M y col. (2001) FEBS Letters 506, 55-60). Por último, la inhibición de la síntesis de glicoesfingolípidos reduce los niveles de CCR5 en la membrana celular (Hug, IP. y col. (2000) J. Virol. 74, 6377- 6385), sugiriendo que la asociación temprana de CCR5 con las balsas es necesaria para el transporte correcto del receptor.
Aunque varias evidencias funcionales sugieren que el HIV-1 explota los dominios de membrana con balsas del hospedador como portales de entrada, el mecanismo exacto que subyace en este proceso está siendo sólo elucidado. Los dominios con balsas del hospedador pueden ser usados por el virus para regular espacial y temporalmente la interacción entre gpl20, Cd4 y el co-receptor CXCR4 o CCR5 (Manes, S. y col, EMBO Rep., 1, 190-196; del Real, G. y col., (2002) supra) (Fig. 3). Según este modelo, la unión del virus a CD4 en las balsas induce la difusión y la coalescencia laterales de los complejos gpl20/CD4 con las balsas que contienen los co-receptores CXCR4 o CCR5, proceso conducido por el citoesqueleto de actina. La evidencia más importante que apoya este modelo es la incapacidad para obtener el co-receptor CD4- gpl20 ni en células que expresan el muíante CD4 no en balsas, ni en células con el colesíerol agotado, en las que la difusión lateral de las balsas está gravemente alterada.
De manera adicional, algunos lípidos que están enriquecidos en las balsas pueden ser necesarios para poner en marcha las asociaciones supramoleculares y cambios conformacionales masivos en la Env viral requerida para la formación del complejo de fusión (Hug, IP. y col. (2000) J. Virol. 74, 6377-6385). Este modelo puede explicar la función de CD44 y CD28 en la co-estimulación del HIV, ya que la activación de estas moléculas asociadas a las balsas media en la reorganización de las balsas de lípidos en las células vivas (Oliferenko S. y col., (1999) J. Cell Biol. 146, 843-854; Viola, A. y col.,
(1999) Science 283, 680-682). Es importante destacar que otros virus tales como el virus Ebola, también usan las balsas de los hospedadores como portales de entrada (Bavari, S. y col. (2002) J. Exp. Med. 195, 593-602; revisiones en van der Goot, F. y Harder, T. (2001) Semin. Immunol. 13, 89-97). Es por lo tanto bastante teníador especular que la agregación de los dominios con balsas puede constituir un mecanismo bastante general para la entrada utilizada por distintos patógenos intracelulares. Durante varios años, los virólogos han observado que la composición lipídica de las membranas de la cubierta de diversos virus, incluyendo algunos retrovirus, es disíinía de la de la membrana plasmática del hospedador del que derivan, lo que sugiere que los virus se han ensamblado en microdominios de la membrana (Aloia, R y col. (1992), Vol. 6, Wiley-Liss, Nueva York). La cubierta del HTV, al igual que todas las membranas biológicas, esíá constituida por proteínas incrustadas en la bicapa lipídica.
Esta bicapa presenta sin embargo una relación en moles de colesterol/fosfolípidos sorprendentemente elevada (>1,00). También hay un enriquecimiento en esfingolípidos en la membrana viral, pareciéndose por ello a la composición de los dominios de membrana con balsas (Aloia, R. y col. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90, 5181- 5185). Ya que los genes de las enzimas que metabolizan los lípidos no esíán preseníes en el genoma de los reírovirus, la bicapa lipídica de la cubierta del HIV deriva necesariamente de la membrana lipídica de la célula hospedadora.
Observaciones recientes han proporcionado la evidencia adicional de que los viriones nuevos del HIV emergen de la célula hospedadora mieníras envuelven los alrededores de los dominios con balsas (Nguyen, D. y Hildreth, J. (2000) J. Virol. 74,
3264-3272). La formación de viriones nuevos en las balsas de lípidos conduce a la exclusión de la CD-45-fosfaíasa, abundante en membranas celulares, de la cubierta de HIV-1, mientras que otras moléculas asociadas a las balsas, incluyendo las proteínas Thy-
1 y CD59 de anclaje a GPI, las moléculas de adhesión intercelular (ICAM-1, -2 y -3)
(Gómez-Mouton C. y col, (2001) Proc. Naíl. Acad. Sci. USA 98, 9642-9647), las iníegrinas LFA-1 y VL-4 (Brown, D. y London E. (2000) J- Biol. Chem. supra), y el gangliósido GM1, presentan niveles enriquecidos en la partícula viral. La incorporación de partículas del hospedador en la partícula viral puede tener varias consecuencias sobre la infección y la patogenicidad de los virus, desencadenando la activación de ruías de señalización en las células recién infectadas, tras la fusión de las membranas viral y celular (Fivaz, M y col. (1999) Trends Cell Biol. 9, 212-213; Liao, Z. y col., (2000) AIDS Res. Hum. Retrovir. 16, 355-366). La incorporación de otras glicoproteínas de la membrana de hospedador, tales como la clase II de HLA-DR, que suponen el 4,4% de la proteína total de la partícula viral, es utilizada probablemente por el virus para producir la desregulación de la respuesta inmune celular y humoral contra HIV-1 (Henderson, L. y col., (1987) J. Virol., 61, 629-632). Además de la incorporación de proteínas del hospedador asociadas a las balsas, en la cubierta viral, se ha descrito el reparto de proteínas estructurales del HIV-I dentro de las membranas con balsas del hospedador, durante el ensamblaje de las nuevas partículas virales. En particular, las proteínas Gag y Env de HIV-1 se han detectado en dominios con balsas (Nguyen, D. y Hildreth, J. (2000) J. Virol. 74, 3264-3272: Rousso, I. y col. (2000) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97, 13523-13525). La proteína Gag de fflV-1 se sintetiza en forma de una poliproteína precursora, Pr55Gag, que se compone de matriz (MA), cápside (CA), nucleocápside (CN) y dominios p6, así como de los péptidos espaciadores p2 y pl (Frankel. A y Young, J. (1998) Annu. Rev. Biochem. 67, 1-25). Se ha informado que la asociación de Pr55Gag se inicia con la unión del dominio MA a la membrana plasmática. Esía eíapa de unión implica, direcía o indirectamente, al menos varios dominios repartidos por toda la proíeína MA. La especificidad de unión a la membrana plasmática la confiere el dominio M, que está constituido por una combinación de un resto N-terminal de mirisíoilo y por una agregación de residuos con carga positiva que actúan de manera sinergística (Frankel, A. y Young, J. (1998) Annu. Rev. Biochem. 67, 1-25). La muíación del residuo N-íerminal de Gly, que sirve como sitio de modificación del ácido mirísíico, alteró la unión de Gag a la membrana y bloqueó el ensamblaje del virus (Freed, E. y col. (1994) J. Virol. 68, 5311-5320). Aunque la acilación es una modificación frecuente en proteínas asociadas a las balsas, la mirisíoilación MA no es un factor importante para dirigir a la Pr55Gag hacia las balsas. Estudios realizados con mutantes de Pr55Gag sugieren que la asociación profusa de Gag con las balsas tiene lugar después de interacciones de Gag unida a membrana-Gag. El espaciador p2 y la Pr55Gag se requieren para la oligomerización de Gag (Accola, M. y col., (2000) J. Virol. 74, 5395-5402) y, por consiguiente, mutantes por deleción de Pr55 Gag, que caren de p2, mostraron una asociación defectuosa a las balsas (Ono, A. y Freed, E. (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 13925-13930). Es importante señalar que una porción de la proteína Gag íoíal presente en las células infecíadas, esíá presente en dominios densos similares a los dominios con balsas, denominados lanchas (del inglés, "barges") (Lindwasser, O y Rosh M. (2001) J. Virol., 75, 7913-7924). Las lanchas son probablemente el resultado de una agregación extensiva de Gag mediada por los dominios NC y p6. Se ha propuesto que los oligómeros de Gag pueden presentar una afinidad más fuerte por las balsas debido a un número aumeníado de sitios de unión por complejo, o a una conformación alterada inducida por la interacción Gag-Gag. Los oligómeros de Gag pueden por otra parte esíabilizar las agregaciones de balsas dando lugar a las grandes y densas estructuras de lanchas observadas.
La agregación de Pr55Gag induce la formación de una yema en la membrana y la posterior liberación de las partículas virales (Fig. 4). Durante la formación de la yema, las glicoproteínas de la Env viral se incorporan a las nuevas partículas virales, una función que también realiza el dominio MA de Pr55Gag. La cola citoplásmica de Env contiene dos residuos, que son dianas putativas para la modificación por palmitoilación. La retirada de estos aminoácidos parece no afectar ni a la expresión de la cubierta, ni al transporte de las proteínas, ni a la interacción Env-Gag (Yang, C. y col. (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92, 9871-9875). Sin embargo, oíros esíudios han mostrado la acilación de Env, que se ha demoslrado que es crítica para un direccionamienío eficiente hacia la membrana y para la formación de virus infecciosos. Por lo lanío, el dominio ciíoplásmico de gpl60 dirige a la proteína de la cubierta hacia las balsas de lípidos, incluso en ausencia de Gag (Rousso, I. y col. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97, 13523-13525). Se destaca que las balsas están concentradas en los sitios de contacto célula-célula de las células T; por lo tanto, el direccionamiento de la proíeína Env hacia las balsas del hospedador puede faciliíar la íransmisión célula a célula del HIV-1
La evidencia sugiere que las balsas pueden esíar implicadas en el ensamblaje y liberación del HIV-1. La importancia funcional de las balsas en la formación de las yemas de los viriones inmaduros de HIV-1 se desíaca ya que el agoíamienío del colesíerol disminuye la producción de partículas de HIV-1 en las células infecíadas (Ono, A. y Freed, E. (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 13925-13930; Maziere. J. y col., (1994) Biomed. Pharmacolher. 48, 63-63). Las balsas pueden actuar en este proceso como plataformas para la oligomerización de Gag en la membrana plasmática (Ono, A. y Freed, E. (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 13925-13920; Lindwasser, O. y Rosh. M (2001) J. Virol. 75, 7913-7924), que a su vez reuniría la Env viral necesaria para formar nuevas partículas infecciosas. De manera adicional, la formación de las yemas virales puede depender de componentes específicos de las balsas del hospedador, íanto lípidos como proteínas, que regulan la liberación de los viriones (Vogt, V. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97 12945-12947). Esto puede explicar el hecho de que el agoíamienlo de colesíerol disminuye notablemente la producción de partículas de HIV-1, aunque este íraíamienlo no aféela a la síntesis de proteínas Gag o Env, ni a los procesamientos ni/o a la expresión en la superficie celular.
Además de las proteínas estructurales del HIV-1, la proteína reguiadora Nef se asocia también con los dominios de balsas (Wang, J.-K. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97, 394-399). Este importante factor de virulencia en la patogénesis viral se ha informado que utiliza las balsas del hospedador para activar inmunológicamente a las células T, en relación con la activación a íravés de los receptores CD3 y CD28 (Wang, J.- K. (2000) Proc. Naíl. Acad. Sci. USA 97, 394-399). Durante la infección, las células se activan y se polarizan, y las balsas, que normalmente están dispersas, tienden a coalescer junto con las proteínas unidas a GPI y con proteínas de señalización intracelular asociadas. La coalescencia de las balsas inducida por Nef concentra de esta manera a los mediadores de la activación de las células T, incluyendo Lck, Fyn y LAT (Lanzavecchia, A. y col. (1999) Cell 98, 1-4) y dando como resulíado la iniciación de las cascadas de señalización, que promueve la secreción de IL-2 y la estimulación de la acíividad íranscripcional de HIV-1 (Doms, R. y Trono, D. (2000) Genes Dev. 14, 2677-2688). En resumen, el HTV utiliza los dominios con balsas para concentrar las proteínas virales Env y Gag, que constituyen solamente una pequeña fracción de las proteínas íoíales de la célula hospedadora, en el interior de áreas relativamente pequeñas; esta etapa de concentración probablemente es crítica para otras interacciones proteína- proíeína virales, conduciendo al ensamblaje, producción de yemas y maduración de las nuevas partículas virales. No obstante, las balsas del hospedador probablemente no se utilizan sólo como dispositivos de concenlración, sino íambién para regular la actividad íranscripcional del genoma viral. Además, el HIV no es capaz de ensamblarse ni de formar yemas correctamente en células murinas, lo que sugiere que estas células, o bien carecen de un factor celular necesario para la formación de las yemas, o bien contienen un factor que inhibe este proceso (Mariani, R. y col. (2000) J. Virol. 74, 3859-3970). No es prudente especular que un inductor o inhibidor de este tipo pueda confinarse o excluirse de manera selectiva de estos dominios con balsas.
Las quimioquinas son citoquinas quimioíácíicas que son liberadas por una amplia variedad de células para alraer a macrófagos, células T, eosinófilos, basófilos y neuírófilos hacia sitios de inflamación (revisiones de Schall, (1991) Cytokine, 3, 165-183 y de Murphy, (1994) Rev. Immunol. 12, 593-633). Existen dos clases de quimioquinas, C-X-C(alfa) y C-C(beta), dependiendo de si las dos primeras cisternas están separadas por un único aminoácido (C-X-C) o son adyacentes (C-C). Las alfa-quimioquinas, íales como la inlerleuquina-8 (IL-8), la proteína-2 activadora de neutrófilos (NAP-2) y la proteína de actividad estimuladora del crecimiento de melanomas (MGSA) son quimiotácticas principalmente para neuírófilos, mientras que las beta-quimioquinas, tales como RANTES, MlP-lalfa, MlP-lbeta, la proíeína-1 quimioláctica de monociíos (MCP- 1), MCP-2, MCP-3 y la eoíaxina son quimioíáclicas para macrófagos, células T, eosinófilos y basófilos (Deng y col. (1996) Narure 381, 661-666).
Las quimioquinas se unen específicamente a receptores de superficie celular pertenecientes a la familia de siete proteínas de dominios de íransmembrana, acopladas a proteína G (revisiones de Horuk, (1994) Trends Pharm. Sci., 15, 159-165) denominadas "receptores de quimioquinas". Al unirse a sus ligandos análogos, los receptores de quimioquinas transducen señales iníracelulares a íravés de las proteínas G íriméricas asociadas, produciendo un rápido aumento en la conceníración de calcio iníracelular. Existen al menos dieciséis receptores de quimioquinas humanas que se unen a beía-quimioquinas o responden a ellas, con el siguiente paírón característico:
: CCR-1 ("CKR-l", C-CK -r) [MlP-lalpha, MlP-ibeta, CP- characteristic patter : CCR-1 (-CKR-r, "CC-CKR-1") [MlP-lalpha, MΪP-lbeta. MCP-1 r ~*" ^"vιuv ι un, vvilil Ul JUIÍUWIÜU characteristic pattern: CCR-1 ("CKR-1".
Figure imgf000020_0001
characteristic pattern: CCR-1 ("CKR-1", CC-CKR-
• '-)» [MulPm-uliaMlptihja, vv MjllilP U-lICbe ÍUtaJl,U MVVCiπPi -3 characteristic pattern: CCR-1 C'CKR-1", CC-CKR-
• 1 -- [ vM.iϊPu-nlmalipiihoa, vv MitlllP U-llCbe lυtai l.'U MCIIlPSi-1 characteristic pattern: CCR-1 ("CKR-r, 'CC-CKR. 1") *• [ »M'~lP'"-lnalιmph,oa, vv MiLluP u-ilcbe lυtait.u MCiriP!'-3 characteristic pattern: CCR-1 ("CKR-1", •CC-CKR
— 1") .. [MHlP.u-uliaulpiihua, w Mm.lliP m-lbe ιυtajι.υ MCιιtP!_;-3 characteristic paltern: CCR-1 ("CKR-1", CC-CKR 1 - -"-)v. [M..lP. -UlIal1pUhOa, w MiuliP u-licbe tutaií,u MwCiπPiζ-3 characteristic pattern: CCR-1 ("CKR-r
y el antígeno Duffy de grupos sanguíneos [RANTES, MCP-1] (Chaudhun, y col. (1994). J. Biol Chem, 269, 7835-7838). Las β-quimioquinas incluyen eoíaxina, MIP ("proíeína inflamatoria de macrófagos", MCP ("proíeína quimioatractora de monocitos" y RANTES (del inglés, "Regulation-upon-Activation, Normal T Expressed and Secretee?'' )("regulación después de la activación, expresada y secreíadas en células T normales"). El virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1), un reírovirus, es el agente etiológico de una enfermedad compleja que incluye la destrucción progresiva del sistema inmune (síndrome de inmunodeficiencia adquirida, SIDA) y de la degeneración del sistema nervioso central y periférico. Este virus en trabajos previos era conocido como LAV, HTLV-III o ARV. A pesar del uso de las medidas profilácticas disponibles, la infección por
HΓV-1 constituye una pandemia en crecimiento, en particular en los países menos desarrollados, para la que falía un tratamiento adecuado. El régimen terapéutico más común, la terapia antirreíroviral altamente activa (HAART) (del inglés, "Highly Active Antiretroviral Therapy") ha mejorado la calidad de vida de muchos individuos infectados por HIV-1. Sin embargo es un traíamienío pesado, con grandes efecíos secundarios, y puede dar como resultado la aparición de virus resistentes a fármacos. Uno de los objetivos de la investigación sobre el HIV-1 consiste en comprender la interacción entre el virus y la célula hospedadora durante en ciclo replicaíivo del HIV, para bloquear las interacciones clave eníre las proteínas virales y las del hospedador, y prevenir la propagación del virus sin los inconvenientes del HAART. Los esfuerzos se han concentrado en los procesos de entrada y de gemación del HIV-1, que requieren la formación de grandes agregaciones entre proteínas virales y proteínas de la célula hospedadora (Manes, S. y col (2003) Nat. Rev. Immunol. 3, 557-568). Los resultados sugieren que la entrada y salida del HIV-1 de la célula hospedadora requieren la reordenación del citoesqueleto de actina y unos niveles de colesterol adecuados en las membranas del hospedador y en las membranas virales.
(Manes, S, et al (2000) EMBO Rep. 1 : 190-196; Nguyen, D., and J. Hildreth. (2000) J. Virol.
(Manes, S. et al (2000) EMBO Rep. 1 : 190- 196; Nguyen. D., and J. Hildreth. (2000) J. Virol. (Manes, S. et al (2000) EMBO Rep. 1 : 1 0-196; Nguyen, D., and J. Hildreth. (2000) J. Virol. (Manes, S. et al (2000) EMBO Rep. 1 : 190- 196; Nguyen, D., and J. Hildreth. (2000) J. Virol. (Manes, S, et al (2000) EMBO Rep. 1 : 190- 196; Nguyen, D., and J. Hildreth. (2000) J. Virol.
(Manes, S. et al (2000) EMBO . R»" 1 1 QΛ ^Λ. : ._ rs
Aún no se ha encontrado un medio de ataque específico a estos facíores del hospedador para evilar la propagación del HIV-1 con una toxicidad mínima.
Se ha demosírado que algunos compuestos inhiben la replicación del HIV, incluyendo la proíeína CD4 soluble y sus derivados sinléíicos (Smith y col. (1987) Science 238, 1704-1707), sulfato de dextrano, colorantes íales como el Amarillo Directo 50, Azul de Evans y determinados azocoloraníes (Paíeníe de EE.UU. n.° 5.468.469). Alguno de estos agentes anlivirales se ha visto que actúan bloqueando la unión de gpl20, la proteína de cubierta del HIV a su diana, a la glicoproteína CD4 de la célula. La enírada de HIV-1 en la célula diana requiere al receptor CD4 de superficie celular y cofacíores adicionales de la célula hospedadora. La fusina se ha identificado como un cofacíor requerido para la infección con un virus adapíado a crecer con células C transformadas, aunque la fusina no promueve la enírada de virus macrofagotrópicos que se cree que son las cepas patógenas clave del HIV in vivo. Recientemeníe se ha reconocido que para su enírada eficieníe en las células diana, el virus de la inmunodeficiencia humana requiere un receptor de quimioquinas, muy probablemeníe CCR-5 o CXCR4, así como el receptor principal CD4 (Levy, N.(14 de
Noviembre de 1966) Engl. J. Med. 335(20), 1528-1530). El cofacíor principal para la enírada mediada por las glicoproteínas de la cubierta de las principales cepas macrofagotrópicas de HIV-1 es CCR5, un receptor para las β -quimioquinas RANTES, MlP-lalfa y MlP-lbeía (Deng, y col (1996) Naíure, 381, 661-666). El HIV se une a la molécula CD4 sobre las células a través de una región de su proteína de cubierta gpl20. Se piensa que el sitio de unión a CD4 en la gpl20 del HIV interacciona con la molécula de CD4 dispuesía sobre la superficie celular y experimenía cambios conformacionales que la permiten unirse a oíro receptor de superficie celular, íal como CCR5 y/o CXCR-4. Esto lleva a la cubierta viral más cerca de la superficie celular y permite la interacción eníre la gp41 dispuesía sobre la cubierta viral y un dominio de fusión dispuesto sobre la superficie celular, la fusión con la membrana celular y la enírada del núcleo del virus en la célula. Se ha demosírado que los ligandos de las beía-quimioquina evilan que el HIV-1 se fusione con la célula (Dragic, y col. (1996) Nature, 381, 667-673). También se ha demosírado que un complejo de gpl20 y CD4 soluble iníeracciona de manera específica con CCR-5 e inhibe la unión de los ligandos naturales de CCR-5, MlP-lalfa y MlP-lbela (Wu y col. (1996) Naíure, 384, 179-183, Trkola y col. (1996) Naíure, 384, 184-187).
Los seres humanos que son homocigoíos para receptores CCR-5 muíanles que no sirven como co-recepíores para el HF -1 in vitro, se manifiesían inusualmente resistentes a la infección por HIV-1 y no resulían inmunocomprometidos por la presencia de esta variante genética (Nature (1996) 382, 722-725). La ausencia de CCR-5 parece conferir una protección sustancial frente a una infección por HIV-1 (Naíure (1996) 382, 668-669). Oíros receptores de quimioquinas pueden ser usados por algunas cepas del HIV-1 o pueden ser favorecidos por vías de transmisión no sexuales. Aunque la mayoría de las muestras clínicas aisladas de HIV-1 y estudiadas hasta la fecha utilizan CCR-5 o fusina, algunas pueden utilizar las dos así como los CCR-2B y CCR-3 relacionados, como co-receptores (Nature Medicine, (1996) 2(11), 1240-1243). No obstante, los fármacos que se dirigen a receptores de quimioquinas pueden no ser indebidamente comprometidos por la diversidad genética del HPV-l (Zhang y col., (1996) Nature 383, 768). Por consiguiente, un agente que bloqueara los receptores de quimioquinas en seres humanos que poseen receptores de quimioquinas normales, prevendrían la infección en individuos sanos y frenarían o pararían la progresión del virus en pacieníes infectados. Cenlrándose en la respuesía inmunocelular del hospedador frente a la infección por HIV, se proporcionarían tratamientos mejores para todos los subtipos de HTV. Estos resultados indican que la inhibición de los receptores de quimioquinas representa un método viable para la prevención o traíamienío de una infección por HIV y para la prevención o tralamienío del SIDA.
Se sabe que la eoíaxina, RANTES, MlP-lalfa, MlP-lbeía, MCP-1 y MCP- 3 se unen a receptores de quimioquinas. Como se ha indicado anteriormente, los inhibidores de la replicación del HIV-1, preseníes en sobrenadantes de células T CD8+, han sido caracterizados como las beía-quimioquinas RANTES, MlP-lalfa y MlP-lbeía. La mayor parte de la evidencia anteriormente resumida indica que la enírada del HIV requiere la participación activa de CD4, co-receptores, y oíros posibles participantes tales como glicoesfigolípidos, que a su vez pueden inducir la agregación de las balsas lipídicas en una manera dependiente del citoesqueleío de actina. Las Rho- GTPasas (una familia de 20 proteínas de mamíferos) son interruptores moleculares que controlan una amplia variedad de rulas eucarioías de íransducción de señales. Se conocen principalmente por su papel cenlral en la regulación del citoesqueleto de actina, pero su capacidad para influir sobre la polaridad celular, la dinámica de los microtúbulos, las rutas de transporte a través de membrana, y la actividad de factores de transcripción, puede ser igualmente importante. Las Rho-GTPasas controlan procesos celulares complejos creando ciclos entre un estado conformacional "activo" unido a GTP y un estado "inactivo" unido a GDP. La hidrólisis de GTP a GDP regula la interconversión. En el esíado (GTP) activo "on" las GTPasas reconocen proteínas diana y generan una respuesía hasía que la hidrólisis de GTP vuelve al esíado inactivo "off. La íransducción de señales mediada por Rho-GTPasas es íoíalmeníe dependiente de la premiación C- íerminal. Las íres Rho-GTPasas principales (Rho, Rae, y Cdc42) son geranilgeraniladas poslraduccionalmenle, una reacción catalizada por la enzima geranil-transferasa. La isoprenilación de Rho-GTPasas permite la unión a membranas, la localización subcelular y el transporte intracelular de estas proteínas.
Debido a que la isoprenilación se requiere para su función, se ha propuesto que la Rho-GTPasas sean dianas de fármacos que previenen o reducen la síntesis de isoprenoides. Las estaíinas son inhibidores potentes de la 3-hidroxi-3-meíilgluíaril- coenzimaA (HMG-CoA)-reducatasa y se utilizan para tratar la hipercolesterolemia con escasos efectos secundarios. La HMG-CoA-reductasa es la enzima que transfiere la
HMG-CoA al ácido L-mevalónico, la etapa limitante de la velocidad en la biosíntesis del coleslerol. El ácido L-mevalónico es un precursor de la biosíníesis de coleslerol y de la generación de isoprenoides que modifican posíraduccionalmenle proteínas celulares específicas. Inhibiendo la síntesis de ácido L-mevalónico, las eslaíinas íambién previenen la síntesis de oíros intermediarios isoprenoides de la raía biosiníéíica del coleslerol, que incluyen pirofosfaío de farnesilo (FPP) y pirofosfato de geranilgeranilo (GGPP). De hecho, las estatinas inducen cambios en el citoesqueleto de actina y en el ensamblaje de complejos de adhesión focales inhibiendo la isoprenilación de RhoA y Racl. Las Rho- GTPasas, que deben estar premiadas en su extremo C-terminal para que actúen, son interruptores moleculares que crean un ciclo entre los estados GTP-unido (activo) y GDP -unido (inactivo) para controlar la remodelación del citoesqueleto de actina en respuesla a estímulos (Etienne-Manneville, S. y A. Hall (2002) Naíure 420, 629-635). Dirigiéndose a la HMG-CoA, las esíaíinas bloquean la síntesis de colesíerol, pero íambién afecían al reordenamienlo del ciíoesqueleío de acíina inhibiendo las Rho- GTPasas (Koch, G. y col. (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther. 283, 901-909).
Por consiguiente, se necesiían medios que inhiban la capacidad del HIV y de otros virus para explotar las estructuras de los dominios con balsas presentes en células humanas y de otros animales como medio para entrar en las células y propagar partículas virales adicionales.
Oíros objetivos y veníajas resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción.
SUMARIO DEL INVENTO
El presente invento proporciona composiciones farmacéuticas que inhiben la enírada del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) en células eucarioías. Un aspecto del presente invento proporciona composiciones farmacológicas que inhiben la producción de viriones del HIV en las células infecíadas por HIV. Un aspecto del presente invento proporciona composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto que reduce los depósitos celulares de intermediarios isoprenoides y/o inhibe la isoprenilación de proteínas y/o la actividad de la Rho-GTPasa.
En particular, el presente invento se refiere al uso de un inhibidor de la isoprenilación de proteínas o de una de sus sales, solvaíos o derivados farmacéuticamente acepíables, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por
HIV, de una infección por un reírovirus genéticamente relacionado con el HIV, o del
SIDA.
En oíro aspecto, el presente invento abarca, el uso de un inhibidor de isoprenilación de proteínas o de una de sus sales o solvalos farmacéuticamente acepíables, en la fabricación de un medicamento para el íraíamienío de una infección por
HrV, de una infección por un reírovirus genéticamente relacionado con el HIV, o del
SIDA.
Se tendrá en cuenía que el inhibidor de la isoprenilación de proteínas puede ser un inhibidor de la geranilgeranilpirofosfaío-siníelasa, geranilgeranil-íransferasa o un inhibidor de la activación de Rho. Por ello, los inhibidores preferidos son estaíinas y sus análogos, que incluyen pero que no se limiía a ellos, lovasíaíina, simvasíaíina, pravasíatina, mevastatina, aíorvasíaíina y fluvasíalina.
Opcionalmeníe, el inhibidor de la isoprenilación de proteínas puede esíar mezclado con un vehículo, aglutinante, agente de relleno, diluyenle o excipiente farmacéuticamente aceptables, o cualquiera de sus combinaciones.
En o ra realización del invento, el inhibidor de la isoprenilación de proteínas se adminisíra en combinación con uno o más agentes terapéuticos diferentes, seleccionados eníre el grupo que comprende un inhibidor de la proíeasa de HIV, un inhibidor de la íranscripíasa inversa no nucleosídico, un inhibidor de la transcriptasa inversa nucleosídico/nucleotídico, un aníagonisía de CCR5, un inhibidor de la iníegrasa, un inhibidor de RNasaH, un agente inhibidor de los dominios con balsas, un agente que disminuye los niveles de colesíerol, un agente que disminuye la premiación de proteínas, un inhibidor de la Rho-AGTPasa, y un agente que disminuye los niveles de glicoesfingolípidos. Ejemplos de agentes que disminuyen los niveles de glicoesfingolípidos incluyen D-í-3 ',4'-elilendioxi- 1 -fenil-2-palmiíoilamino-3 -pirrolidino- 1 -propanol, D-í-4'- hidroxi- 1 -fenü-2-palmiíoilamino-3-pirrolidino- 1 -propanol, 1 -fenil-2-palmiíoilamino-3 - pirrolidino-1 -propanol, y sus sales y sus mezclas farmacéuticamente acepíables.
En una realización preferida el agente inhibidor de los dominios con balsas disocia los dominios con balsas. En oíra realización preferida, el agente inhibidor de los dominios con balsas inhibe la formación de los dominios con balsas.
En una realización alternativa, el agente modulador de los receptores de quimioquinas inhibe la formación de los dominios de membrana con balsas y/o los disocia.
En otra realización más, el inhibidor de Rho-A GTPasa puede ser una eslaíina o uno de sus análogos, que incluyen, pero no se limitan a ellos, lovasíaíina, simvasíaíina, pravasíaíina, mevasíalina, aíorvaslaíina y fluvasíaíina.
Se apreciará que la combinación de uno o más de los agentes puede administrarse de modo independiente secuencial o simultáneo.
Se apreciará también que uno o más de los agentes puede ir mezclado con un vehículo, aglutinante, agente de relleno, diluyente o excipiente farmacéuticamente acepíables, o cualquiera de sus combinaciones.
En oíro aspecto, el presente invento reside en un inhibidor de isoprenilación de proíeínas o de una de sus sales, solvaíos o derivados farmacéuticamente aceptables, para usar en el tratamiento de una infección por HIV, de una infección por un reírovirus genéticamente relacionado con el HIV, o del SIDA.
Oíro aspecto más del presente invento proporciona una monoíerapia para íraíar un ser humano infecíado con HIV administrando a dicho ser humano una composición que contiene una cantidad farmacéuticamente efectiva de un compuesto que disminuye los depósitos celulares de intermediarios isoprenoides y/o inhibe la isoprelinación de proíeínas y/o inhibe la acíividad de Rho-GTPasa.
En particular, el presente invento proporciona un método para íraíar a un mamífero que padece una infección por HIV, una infección por un reírovirus genéticamente relacionado con el HIV, o SIDA, que comprende íraíar a dicho mamífero con una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes capaces de inhibir la isoprenilación de proteínas, o de una de sus sales, solvaíos, o derivados farmacéuticamente acepíables. El presente invento esíá dirigido a una terapia combinada que comprende administrar a un paciente que necesita dicha terapia una composición farmacológica que inhibe la enírada del virus de la inmunodeficiencia humana (HPV) en las células diana y tiene valor en la prevención de una infección por HIV, en el tratamiento de una infección por HIV, y en la prevención y/o tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida
(SIDA) resultante. La composición del presente invento comprende además compuestos que disminuyen los niveles de isoprenoides celulares o que inhiben la isoprenilación de proteínas o que inhiben la acíividad de Rho-A, compuestos que poseen acíividad aníiviral, moduladores de la acíividad de los recepíores de quimioquinas, ageníes que disminuyen los niveles de glicoesfingolípidos y ageníes que disminuyen el nivel de colesíerol. El presente invento se refiere lambién a composiciones farmacéuticas que contienen esíos compuestos y a un método de uso de la presente composición para la prevención y traíamienío del SIDA y de una infección viral por HIV.
Un aspecto del presente invento proporciona que moduladores de la acíividad de los recepíores de quimioquinas son ageníes que actúan de manera específica para romper la organización de los dominios con balsas. Esta rotura incluye acciones que inhiben la formación de balsas y acciones que disocian las balsas formadas con anterioridad.
Un aspecto del presente invento proporciona varianíes muíanles sin balsas de receptores para HIV-1. Estos mutantes sin balsas son variantes de receptores para HIV, que se construyen por ingeniería genética, tales como CD4, CXCR4, CCR5, u otro receptor implicado en el proceso de infección por HIV.
Un aspecto del presente invento proporciona péptidos construidos por ingeniería genética que tienen como objetivo los dominios con balsas e inhibe la fusión del viras HIV a la membrana.
Un aspecto del presente invenío inhibe el direccionamienío del HIV hacia los dominios de balsas. Se proporcionan receptores mulantes para el HIV en los que la interacción de la unión virus-receptor tiene lugar con normalidad, pero el receptor unido al HIV no se agrega en los dominios de balsas. Debido a ello la dimerización del receptor, un prerequisito para la enírada del virus en la célula, no puede tener lugar. Un aspecto del presente invento proporciona recepíores imitantes sin balsas para el HIV, siendo dichos receptores mulantes CD4, CXCR4, CCR5, o cualquier otro receptor implicado en la entrada del HIV en las células.
Un aspecto del presente invento proporciona un método para traíar a un pacieníe que padece una infección por HIV, que comprende adminisírar al paciente una composición farmacéuíicameníe acepíable que comprende una cantidad farmacéuíicameníe efectiva de un agente reductor de pirofosfaío de geranil-geranilo u oíros ageníes que inhiben la geranilgeranilización de Rho-GTPasas.
Un aspecto del presente invento proporciona un método para íraíar a un paciente que padece una infección por HIV, que comprende adminisírar al pacieníe una composición farmacéuíicameníe acepíable que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un ageníe anliviral y un ageníe reductor de pirofosfaío de geranil-geranilo u otros agentes que inhiben la geranilgeranilización de Rho-GTPasas.
Un aspecto del presente invento proporciona un método para tratar a un paciente que padece una infección por HTV, que comprende administrar al paciente una composición farmacéuticamente aceptable que comprende una cantidad farmacéuíicameníe efectiva de un ageníe aníiviral, una cantidad farmacéuticamente efectiva de un agente que disminuye la isoprenilación de proteínas, una cantidad farmacéuticamente efectiva de un modulador de la acíividad de los recepíores de quimioquinas, y una cantidad farmacéuíicameníe efectiva de un ageníe que disminuye los niveles de glicoesfingolípidos.
Un aspecto del presente invento proporciona un método para tratar a un paciente que padece una infección por HIV, que comprende administrar al paciente una composición farmacéuticamente aceptable que comprende una cantidad farmacéuticamente afectiva de un agente conocido que disminuye la isoprenilación de proteínas, una cantidad farmacéuticamente efectiva de un modulador de la actividad los receptores de quimioquinas, y una cantidad farmacéuticamente efectiva de un ageníe conocido que disminuye los niveles de glicoesfingolípidos.
Un aspecto del presente invento proporciona medios para íraíar a un pacieníe que padece una infección producida por el virus Ébola, que comprende adminisírar a dicho paciente una composición farmacológica que inhibe la entrada del virus Ébola en las células diana y que tiene valor en la prevención de una infección producida por el viras Ebola, el íraíamienío de la infección producida por el viras Ébola, y la prevención y/o el traíamienío del síndrome de inmunodeficiencia adquirida resultante. La composición del presente invento comprende además compuestos que poseen actividad aníiviral, que son moduladores de la acíividad de los recepíores de quimioquinas, ageníes que disminuyen los niveles de glicoesfingolípidos y ageníes que disminuyen la isoprenilación de proíeínas. El presente invento se refiere íambién a composiciones farmacéuticas que contienen esíos compuestos y a un método de uso de la presente composición para la prevención y tratamiento de una infección viral producida por el viras Ébola y de sus secuelas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Incluidas en los dibujos se encuentran las siguientes figuras:
La Figura 1 represenía las balsas de las membranas, enriquecidas con GPI- proíeínas, ancladas en la hoja externa de la bicapa, y enriquecidas en proíeínas aciladas ancladas en la hoja interna.
La Figura 2 mueslra balsas de la membrana a modo de dispositivos que controlan las interacciones proteína-proteína en la superficie celular.
La Figura 3 muesíra las interacciones entre proteínas que permiten la entrada del HIV en las balsas. La Figura 4 muestra el ensamblaje de partículas nuevas de HIV-1 que tiene lugar en las balsas.
La Figura 5 ilustra que las estaíinas inhiben in vitro e in vivo la infección de PBMC humanas, producida por HIV-1. A, Infección de PBMC humanas activadas con PHA, no íraíadas (D), íraíadas con lovasíaíina (D), o íraíadas con lovasíaíina + mevalonaío (D), producida por cepas X4 o R5 del viras HIV-1. Los daíos corresponden a la media + SD de punios íriplicados (n=3). B. PBMC aisladas de voluntarios humanos íratados con vehículo o tratados con pravastaíina, se expusieron a dos dosis de la cepa BaL de HIV-1. Los daíos corresponden al cociente eníre los niveles de p24 antes del tralamienlo y después del tratamiento, en PBMC procedentes de cada uno de los individuos, expresado en forma de porcentaje (**p<0,05). C-D, Ratones SCID reconstituidos con PBMC humanas, se trataron con lovastaíina durante dos semanas antes de la infección con HIV-1; se determinó la carga viral (C) y el cociente (D) CD4/CD5 humanos en cada uno de los animales una semana después de la infección. Se muesíra uno de los dos experimentos representativos (**p<0,05). E. Ratones SCID tratados con lovastaíina se reconstituyeron con PBMC teñidas con CelϊTracker y se estudió el mareaje de las células peritoneales a los tiempos indicados; los números muestran el porcentaje de las células marcadas.
La Figura 6 muestra que las Estaíinas inhiben la enírada y la salida del
HIV-1. A. Se realizaron infecciones de una sola ronda en células MT2-CCR5 no íraíadas, íraíadas con lovasíaíina y íraíadas con lovastatina + mevalonaío, utilizando un viras NL4-3 defectivo en la replicación y seudotipificado con las cubiertas de HIV-lAda o VSV-G. La infección de las células se normalizó usando las células no traíadas como 100%. B. La producción de viras se midió mediante íiíulación de las existencias de virus producidas en células HEK-293T íransfecíadas con un viras NL4-3, defectivo en la replicación igual que en el apartado A), no traíadas, íraíadas con lovasíaíina y íratadas con lovastaíina + mevalonaío. Las RLU se calcularon después de la normalización con la acíividad de luciferasa procedeníe de exíracíos de las células producidas en las existencias. C. Se analizó la expresión génica dirigida por LTR en células de Jurkaí transfecíadas con pLTR-luc, pcDNA-taí y renilla sin promotor para la normalización, no íraíadas, íraíadas con lovasíaíina y íraíadas con lovastatina + mevalonato. Todos los dalos corresponden a la media ± SD de punios duplicados (n=3). La Figura 7 ilusíra que los efectos de las eslaíinas son revertidos por adición de GGPP. A. Se realizaron experimentos de una sola ronda infección utilizando el virus NL4-3 defectivo en la replicación igual que en la Figura 2A, en células MT2- CCR5 tratadas con lovastatina o con lovastaíina más los compuestos indicados. La infección de las células se normalizó considerando las células no traíadas como el 100%. Los datos corresponden a la media + SD de puntos duplicados (n=4). B. Infecciones de una sola ronda realizadas con el viras HIV-lA seudotipificado, en células MT2-CCR5 íraíadas con lovasíalina, GGTI-286 (un inhibidor de la geranil-transferasa) o FTI-277 (un inhibidor de la farnesil-íransferasa). Los valores de RLU son la media ± SD de puntos duplicados (n=3). C. Niveles de colesterol libre o esterificado en células MT2-CCR5 no íraíadas, íraíadas con lovasíalina y íratadas con lovastatina + mevalonato. Se muestra uno de los dos experimentos representativos. D. Expresión génica dirigida por LTR en células MT2-CCR5 traíadas con lovastaíina, lovastaíina más los compuestos indicados, o con GGTI-286 o FTI-277. Los daíos corresponden a la media ± SD de punios duplicados
(n=3).
La Figura 8 muesíra que las esíalinas inhiben la asociación lateral de CD4 y CXCR4, inducida por gpl20, previniendo la activación de Rho. A. Células PBMC no íraíadas, íraíadas con lovasíaíina y íraíadas con lovasíaíina + mevalonaío, se incubaron con gpl20IIIB y fueron traíadas con un anticuerpo aníi-gpl20. Después de fijadas, las células se íiñeron con aníi-CXCR4 y se analizaron por microscopía confocal. Dos células represeníaíivas se muestran para cada uno de los casos (n=25). Barra, 2 μm. B. Células
MT2-CCR5 privadas de suero, se incubaron con HIV-1 y los Usados celulares se ensayaron para determinar Rho o Rae. El valor de Rho o Rae loíal se analizó en paralelo en exíracíos celulares en crudo como un conírol de la carga de la proíeína. Se muesíra uno de los tres experimentos. C. Se determinó la Rho activa en células no traíadas, traíadas con lovasíaíina y íraladas con lovasíalina + GGPP, igual que en el caso anterior. Las íransferencias Western de tres experimentos independientes se cuantificaron por densitometría y los valores se normalizaron usando Rho en extraclos celulares en crudo como control de la carga. Los puntos correspondientes a los datos se representan con respecto a los valores medios de las células no expuestas al virus (tiempo 0) para cada uno de los casos. D. Infecciones de una sola ronda de células MT2-CCR5 transfectadas con Rho de tipo salvaje o con Rho-N19 muíante utilizando un viras HIV-lAda seudotipificado y defectivo en la replicación. E. Células HeLa-CD4 transfecíadas con Rae de tipo salvaje, Rho de tipo salvaje, Rac-N17 o Rho-N19, se mezclaron con células BSC40 que expresan gpl60 de HIV, y se midieron los eventos de fusión celular. D, E, los datos corresponden a la media ± SD de puntos duplicados (n=3).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
El presente invento se refiere al uso de un inhibidor de la isoprenilación de proteínas o de una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables, en la fabricación de un medicamento para el traíamienío de una infección por HTV, de una infección por un reíroviras genéticamente relacionado con el HIV, o del SIDA. El inhibidor de la isoprenilación de proíeínas puede ser un inhibidor de la geranilgeranilpirofosfaío-siníeíasa, geranilgeranil-transferasa o un inhibidor de la acíivación de Rho. Este inhibidor puede ser una esíaíina o uno de sus análogos, tal como lovasíalina, simvasíalina, pravastatina, mevaslaíina, alorvastatina y fluvastaíina.
El présenle invento también se refiere a un tratamiento, que comprende administrar a un paciente que necesita ese traíamienío una composición farmacológica que inhibe la enírada del viras de la inmunodeficiencia humana (HIV) en las células diana y íiene valor en la prevención de una infección por HIV, en el íraíamienío de una infección por HIV, y en la prevención y/o íraíamienío del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) resultante. La composición del presente invento comprende además compuestos que inhiben la isoprenilación de proteínas disminuyendo los depósitos celulares de isoprenoides, y/o previniendo la activación de Rho-GTPasas.
El presente invento se refiere a una terapia combinada que comprende administrar a un paciente que necesita dicha terapia una composición farmacológica que inhibe la entrada del viras de la inmunodeficiencia humana (HIV) en las células diana y tiene valor en la prevención de una infección por HTV, en el tratamiento de una infección por HIV, y en la prevención y/o tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) resultante. La composición del presente invento comprende además compuestos que poseen actividad antiviral (tales como los inhibidores de proteasa del HIV, inhibidores de la íranscripíasa inversa no nucleosídicos, inhibidores de la íranscripíasa inversa nucleosídicos/nucleotídicos, antagonistas de CCR5), inhibidores de la integrasa, e inhibidores de RNasaH, que son moduladores de la acíividad de los recepíores de quimioquinas, ageníes que disminuyen los niveles de glicoesfingolípidos y agentes que disminuyen la isoprenilación de proíeínas. El presente invento se refiere íambién a composiciones farmacéuticas que contienen esíos compuestos y a un método de uso de la presente composición para la prevención y tratamiento del SIDA y de una infección viral por HIV. En la íécnica se conocen íerapias combinadas para la prevención o íraíamienío de una infección por HIV. Por ejemplo, 1 Patente de EE.UU. 6.432.981 describe una terapia combinada que comprende un ageníe aníiviral, un agente que disminuye el nivel de coleslerol, y un modulador de la acíividad de los recepíores de la quimioquina.
El presente invento proporciona un avance en la técnica apuntando a la membrana celular y en concreto los dominios de balsas presentes en ella, para prevenir la entrada y/o la gemación de los viriones de HIV. El presente invento proporciona también un avance apuntando a la entrada y a la gemación del HIV, regulando la agregación de los dominios de balsas. Una realización del presente invenío proporciona una dosis efectiva de un compuesto farmacéuíicameníe acepíable que inhibe la síntesis de los esfingoglicolípidos. Una realización del presente invenío proporciona una dosis efectiva de un inhibidor de la actividad de los recepíores de quimioquinas. Una realización del presente invenío proporciona una dosis efectiva de un compuesto que baja los niveles de colesíerol. Una realización del presente invenío proporciona una dosis efectiva de un inhibidor de la isoprenilación de proteínas. Una realización más del presente invenío proporciona una dosis efectiva de un compuesto aníiviral.
Ageníe inhibidor de recepíores de quimioquinas. La utilidad de los compuesíos según el presente invento como inhibidores de la acíividad de recepíores de quimioquinas puede demostrarse mediante la metodología conocida en la técnica, tal como el ensayo de unión a quimioquinas descrito por Van Riper y col., J. Exp. Med., 177, 851-856 (1993) que puede adaptarse fácilmente para medir la unión a CCR-5, y el ensayo de unión de CCR-3 se encueníra descrito por Daugheríy y col. J. Exp. Med., 183, 2349-2354 (1996). Las líneas celulares encargadas de expresar el receptor de interés incluyen las que expresan el receptor en la naturaleza, tales como EOL-3 o THP-1, o una células construida por ingeniería genética para expresar un receptor recombinante, tal como una línea de células T linfobláslicas de Jurkaí íransfecíada con CCR5.
La utilidad de los compuesíos según el presente invento como inhibidores de la diseminación de la infección del HIV en las células puede demostrarse por medio de metodología conocida en la técnica, tal como el ensayo de cuantificación de HIV descriío por Nunberg y col, (1991) J. Virology, 65(9),4887-4892.
En particular, los moduladores de quimioquinas, y más en particular los moduladores de CCR5, se encueníran descriíos en la Patente de EE.UU 6.432.981. Oíros moduladores de la acíividad de recepíores de quimioquinas se encueníran descriíos en la Patente de EE.UU. 6.441.001.
Inhibidores de 3-hidroxi-3-meíil-gluíaril-coenzima A-reducíasa / ageníes que disminuyen los niveles de colesíerol e isoprenoides. Los fármacos esíaíinas (véase Keri y col., documento U.S. 6.444.452) actualmente son los fármacos más terapéuticamente efectivos para disminuir el nivel de LDL en el torrente sanguíneo de un paciente en riesgo de padecer una enfermedad cardiovascular. Esta clase de fármacos incluye, inter alia, compactina, lovasíaíina, simvasíaíina, pravasíatina, mevasíaíina, aíorvaslaíina y fluvastatina. Los mecanismos de acción de los fármacos estalinas se han elucidado con cierto detalle. Alteran la síníesis de colesíerol y de otros esteróles en el hígado uniéndose competitivamente a la 3-hidroxi-3-meíil-glutaril-coenzima A-reductasa (HMG-CoA- reducíasa). La HMG-CoA-reducíasa cataliza la conversión del HMG-CoA en ácido L- mevalónico, que es la eíapa que determina la velocidad en la biosíníesis de colesíerol. A consecuencia de ello, su inhibición conduce a una disminución en la velocidad de formación de colesíerol en el hígado. Daíos clínicos y experimeníales recientes indican sin embargo que los beneficios globales del íralamienío con esíaíinas puede exceder sus propiedades de disminución de los niveles de colesíerol. Estos efecíos adicionales se basan en la capacidad de las esíalinas para inhibir la síníesis de iníermediarios isoprenoides en la raía biosinléíica del colesíerol. La célula utiliza esíos iníermediarios isoprenoides para la modificación postraduccional de diferentes proíeínas celulares, que incluyen la GTPasas de tamaño pequeño de la superfamilia Rho y Ras. Por consiguiente, la inhibición de la HMG-CoA-reducíasa mediada por eslaíinas conduce a una disminución lanío en la velocidad de formación del coleslerol en el hígado, como en la isoprenilación de proteínas. Ya que el anclaje a membrana y la activación de las Rho- GTPasas es dependiente de una modificación producida por isoprenoides, las estatinas pueden también prevenir la función de la Rho-GTPasa.
La Pravastatina es el nombre medicinal común del compuesto químico, ácido [lS-[lalfa(beta*.della*)2 alfa,6alfa,8beta(R*)8alfa]]l,2,6,7,8,8,a-hexahidro- beta,delta, 6-trihidroxi-2-metil-l-oxobutoxi)l-naftalén-heptanoico (Regisíro de CAS, n.° 81093-370). La Pravastatina exhibe una importante ventaja terapéutica sobre otras estatinas. Una cantidad farmacéuticamente efectiva de Pravastaíina inhibe selectivamente la síntesis de colesterol en el hígado e intestino delgado pero conserva la síntesis de colesíerol en las células periféricas sustancialmente no afectadas (Koga T. y col. (1990) Biochim. Biophys. Acta. 1045, 115-120). Esta selectividad parece ser debida, en parte, a la presencia de un grupo hidroxilo en la posición C-6 del núcleo de hexahidronaftaleno. La posición C-6 eslá ocupada por un átomo de hidrógeno en la compactina y por un grupo metilo en la lovasíaíina. La Pravasíalina es menos capaz de pasar a través de las membranas lipófilas de las células periféricas que los otros congéneres más lipófilos (Serajuddin y col., (1991) J. Pharm. Sci., 80, 830-834). Esta movilidad limitada de la pravasíatina se piensa que es la responsable de su acción más localizada en hígado e intestino.
La composición farmacéutica del presente invenío preferiblemeníe incluye al menos una esíaíina como agente que disminuye los niveles de colesíerol y/o como inhibidor de la isoprenilación de proteínas y/o como inhibidor de la Rho-GTPasa. Sin embargo, el ageníe que disminuye/o que inhibe los niveles de colesíerol, o de isoprenoides o de Rho-GTPasa de la composición farmacéutica del invenío no se limiía a una esíaíina.
Ageníes antivirales. Se define que un ageníe aníiviral es cualquier susíancia que inhibe la acíividad biológica de una DNA-polimerasa viral, la íranscripción del genoma viral, RNA-polimerasa, íranscripíasa inversa, helicasa, primasa, iníegrasa, o que inhibe la íraducción y la maduración de proteínas virales, la formación (desarrollo) de proteínas reguladoras virales, o de proteínas estructurales virales, y proteínas similares. También se incluyen en esta relación los inhibidores de proteasas virales. Preferiblemeníe, un ageníe antiviral inhibe la acíividad, o actividades, biológica de reírovirus. Muy preferiblemeníe, el agente aníiviral inhibe la actividad, o actividades, biológica del HIV. Ejemplos de ageníes antivirales adecuados incluyen inhibidores de la proíeasa de HTV, inhibidores no nucleosídicos de la íranscriplasa inversa, inhibidores nucleosídicos/nucleoíídicos de la íranscripíasa inversa, anlagonisías de CCR5, inhibidores de iníegrasa e inhibidores de RNAsaH. En relación con su esíracíura química, los agentes aníivirales conocidos son principalmente derivados de purina y pirimidina, nucleósidos y nucleótidos. El presente invento no esíá limiíado a los ageníes aníivirales conocidos. El presente invento contempla el uso de oíros ageníes aníivirales a medida que vayan siendo conocidos. Sin limiíación, enlre los nucleósido y nucleólidos aníivirales se incluyen: aciclovir: 9-[(2-hidroxieíoxi)meíil]-9H-guanina, valacyclovir: ésíer de L-valilo de aciclovir, penciclovir: 9-[4-hidroxi-3(hidroximeíil)-buí-l-il]guanina famciclovir: éster diaceíílico de penciclovir, ganciclovir: 9-(l,3-dihidroxi-2-propoximeíil)guanina, idoxiuridina: 2'-desoxi-5 -yodouridinaa, floxuridina: 2'-desoxi-5-fluoridina, sorivudina: lbeía-Darabinofuιanosfl-E-5^ írifluridina: 5-lrifluoromeíil-2'-desoxiuridina, vidarabina: 9beta-D-robofuranosiladenina, zidovudina (AZT): 3'-azido-3'-desoxiíimidina, didanosina: 2',3'-didesoxisnosina zalciíabina: 2', 3'-didesoxiciíidina, cyíarabina: 4-amino-l-D-arabinofuranosilo-2(lH)-pirimi-dinona didesoxiadenosina: 2',3'-didesoxiadenosina, y edoxudina:2'-desoxi-5-eíiluridina.
Un ageníe aníiviral puede utilizarse en forma de su sal de adición de ácido terapéuticamente útil, si su esíracíura química permiíe la preparación de una sal de adición de ácido. De manera similar, el ageníe antiviral puede utilizarse en forma de su sal terapéuticamente adecuada, p. ej., una sal de meíal, una sal de amonio o sales formadas con bases orgánicas, cuando su esíracíura química es adecuada para la preparación de esas sales. Derivados nucleosídicos o nucleoíídicos adecuados como el ageníe aníiviral del presente invento esíán descritos en la Patente de EE.UU. 6.456.851, de la que todos sus contenidos se incorporan aquí como referencia. Una realización preferida de la composición farmacéutica del presente invento comprende un nucleósido, preferiblemente zidovudina como agente antiviral. Inhibidores de proteasas: La replicación del HIV implica la síníesis de una larga cadena polipeplídica que contiene muchas proíeínas. Esíos precursores de las proíeínas, denominados Gag y Gag-Pol, deben ser escindidos por una proíeasa específica de HIV en 9 punios específicos con el fin de producir las proíeínas funcionales. El precursor gag en su momento dará lugar a proteínas estructurales y el precursor pol dará lugar a enzimas tales como la transcripíasa inversa, iníegrasa y proíeasa. La proíeasa del HIV no se encueníra en células de mamíferos. La proteasa del HIV es una asparíil- proíeasa y es única porque puede escindir entre fenilalanina y tirosina o prolina, reacción no catalizada por enzimas humanas. Los inhibidores específicos para la proíeasa de HIV bloquean la escisión de Gag y Pol, interfiriendo de este modo con la producción de nuevas partículas virales. Cualquier inhibidor de la proteasa de HTV, farmacológicamente acepíable, es adecuado para el presente invenío. Derivados de piridiminona v piridinona. Se sabe que algunos derivados de pirimidinona y piridinona inhiben la transcripíasa inversa de HIV. En concreto, los derivados de l-[(2-hidroxieloxi)meíil]-6-(fenilíio)timina (HEPT) son muy conocidos por sus propiedades inhibitorias de la transcripíasa inversa del HIVI. La solicitud de Patente europea, documento EP-O 462 800 (Merck and Company Inc.) describe piridinonas sustiíuidas en la posición 3 con un grupo arilo o un grupo heíerocíclico, unido al anillo de piridinona a íravés de una cadena. Dolle y col. describen 4-aril-íio-piridinonas (1995, J.
Med. Chem. 38, 4679-4686), y en la correspondiente solicitud de Patente PCT, documento WO 97/05 113). Bisagni (documento U.S. 6.451.822) describe derivados de 3-(amino- o aminoalquil) pirodinona que también inhiben la transcripíasa inversa del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV). Estos derivados de pirimidinona y piridinona son adecuados, pero sin que se esté limitado a ellos, como el agente antiviral de la composición farmacéutica del presente invento.
Agente que disminuye los niveles de glicoesfingolípidos. Un agente que disminuye los niveles de glicoesfingolípidos es cualquier compuesto cuya acción biológica da como resulíado cantidades más bajas de glicoesfingolípidos celulares. Cientos de glicoesfingolípidos (GSL) derivan de la glucosilceramida (GlcCer), que se forma mediante reacción enzimálica a partir de ceramida y UDP-glucosa. La enzima implicada en la formación de GlcCer es la UDP-glucosa:N-acilesfingosina glucosilíransferasa (GlcCer-sinteíasa). La velocidad de formación de GlcCer en condiciones fisiológicas puede depender del nivel de UDP-glucosa del tejido, que a su vez depende del nivel de glucosa en un tejido particular (Zador, I. Z. y col. (1993), J. Clin. Invesí. 91, 797-803). Ensayos in vitro basados en la ceramida endógena producen velocidades de síníesis más bajas que las mezclas que contienen ceramida añadida, lo que sugiere que los niveles de ceramida en los tejidos normalmente son íambién limitadores de la velocidad (Brekeri, A. y col. (1972) Brain Res. 36, 183-193).
Se ha enconírado que el nivel de GSL conírola diversas funciones celulares, íales como el crecimiento, diferenciación y adhesión entre células o eníre células y proíeínas de matrices, unión de microorganismos y viras a las células, incluyendo la unión del HIV, y meíásíasis de células tumorales. Además, el precursor de la GlcCer, la ceramida, puede producir diferenciación o inhibición del crecimiento celular (Bielawska, A. y col. (1992) FEBS Letíers, 307, 211-214). Es probable que todos los GSL experimenten una hidrólisis caíabólica, por lo que cualquier bloqueo en la GlcCer- siníeíasa conduciría en último término al agoíamienío de los GSL y a cambios profundos en el funcionamiento de una célula u organismo. Un inhibidor de la GlcCer-siníeíasa, el
PDMP (lR-fenol-2R-decanoilamino-3-morfolino-l-propanol), previamente identificado en forma del D-íreo isómero (Inokuchi, J. y col, (1987) J. Lipid Res. 28, 565-571), se ha enconírado que produce diversos cambios químicos y fisiológicos en células y en animales (Radin, N.S. y col., (1993) NeuroProtocols, A Companion to Methods in Neurosciences, S.K. Fisher y col., Ed., (Academic Press, San Diego) 3, 145-155, y Radin, N.S. y col., (1993) Advances in Lipid Research; Sphingolipids in Signaling. Parte B., R.M. Bell y col, Ed (Academic Press, San Diego) 28:183-213). Se ha descubierto que compuestos con grupos acilo grasos de cadena más larga son susíancialmeníe más efectivos (Abe, A. y col, (1992) J. Biochem 111, 191-196).
Shayman y col. (Patente de EE.UU. 6.255.336) describen compuesíos amino similares a la ceramida que inhiben la formación de glucosil-ceramida (GlcCer) inhibiendo la enzima GlcCer-siníelasa y disminuyendo de esíe modo el nivel de glicoesfingolípidos. En particular, describen el D-t-3',4'-eíilendioxi-l-fenil-2- palmiíoilamino-3-pirrolidino-l -propanol y el D-í-4'-hidroxi-l-fenil-2-palmiíoilamino-3- pirrolidino-1 -propanol y sus sales farmacéuíicameníe acepíables. Shayman y col., (Paíeníe de EE.UU. 6.051.598) describe el uso de l-fenil-2-palmiíoilamino-3-pirrolidino- 1 -propanol y sus sales farmacéuíicameníe aceptables.
Muíanles de recepíores para HPV-1 preseníes en dominios sin balsas. CD4, CXCR4 y CR5 son recepíores que esíán implicados en la enlrada del HIV en las células. Los recepíores de tipo salvaje se incorporan en dominios con balsas. Una realización del presente invenío proporciona recepíores modificados, muíados de manera lal que conservan la actividad de unión al HIV, los recepíores no se localizan en dominios con balsas y/o dichos recepíores no promueven la agregación de las balsas. Esíos mulantes se generan mediante mutación de los receptores naturales utilizando procedimientos estándar de ingeniería genética (Molecular Cloning: A labor atory manual (1989). J. Sambrook, E.F. Friísch, T. maniaíis, Eds. Cold Spring Harbor Laboraíory Press).
Como ejemplo, el CD4-LDL es un receptor artificial para HIV-1, localizado en dominios sin balsas, al que el viras se une con la misma afinidad que al recepíor CD4 naíural. El receptor CD4-LDL no media en la enírada del HIV-1 en células
CD4-negaíivas, y acíúa como un receptor trampa en linfocitos CD4-posiíivos (del Real y col. (2002) J. Exp. Med. 196, 193-301). El receptor CD4-LDL se generó mediante clonación del dominio CD4 extracelular en el plásmido pcDNA3,lA digerido con HindIII/Kpnl (Invilrogen) por PCR utilizando 5'-
GCCAAGCTTATGAACCGGGGAGTC-3* [SEQ ID NO: 1] y 5'-
AGAGGTACCCATTGGCTGCACCGG-3' [SEQ ID NO: 2] para producir el pCD4exí.
Los dominios de transmembrana y yuxíamembrana del receptor de lipoproíeínas de baja densidad (LDL-R) se rescataron del plásmido pLGFP-GT46 utilizando 5'- GCAACGGTACCGCTCTGTCCATTG-3' [SEQ ID NO: 3] y 5'- CTACTCGAGGTTCTTAAGCCGCCA-3' [SEQ ID NO: 4], y se clonaron en el plásmido pCD4exl abierto con Kpnl/EcoRI. Como consecuencia de ello, la quimera CD4-LDL contiene la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio exíracelular del receptor CD4 naíural, seguida de la secuencia sintética: GTALSIVLPIVLLVFLCLGVFLLWKNWRLKN [SEQ ID NO: 5]. La proleína artificial, pLGFP-GT46, contiene la secuencia señal de la lacíasa-florizin-hidrolasa de conejo, la GFP, un sitio de consenso de N-glicosilación, el dominio de íransmembrana del receptor LDL-humano generado por PCR [5'-
CTGTACAAGCTTAACGGATCCAAGCTTCAGCGGCCGCACCAAGCTCTGGGCG A-3' [SEQ ID NO: 6] (cebador directo) y 5'-
CTTGTACAGGTTCTTAAGCCGCCAGTTCTT-3* [SEQ ID NO: 7] (cebador inverso), y la cola ciíoplásmica de CD46 (Maisner y col. (1997)). La proíeína cofacíor de membrana (CD46) es una proíeína basolaíeral que no esíá endociíosada.
Inhibidores de fusión dirigidos a las balsas. La fusión eníre la membrana del hospedador y la membrana del viras es el resulíado de un cambio conformacional en la gp41 viral, que da como resulíado la formación de una hélice enrollada en espiral. La formación de un paqueíe de seis hélices puede ser inhibida mediante al adición de pépíidos tomando como base el dominio helicoidal carboxi-íerminal de gp41. Esos pépíidos se unen al enrollamiento en espiral de íres cadena en el extremo amino terminal de gp41, bloqueando la formación del paquete de seis hélices. Esíos péplidos incluyen: T-20 (YTSLΪHSL1EESQNQQEKNEQELLELD WASLWNWF) [SEQ. ID. NO: 8]
DP-207 (MERDREIN\ΥTSLIHSL1EESQNQQEKNEQELLELD WASLWNVVF) [SEQ. ID. NO: 9],
DP-208 (LTEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF) [SEQ. ID. NO: 10],
DP-209 (HSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF) [SEQ. ID. NO: 11 ],
DP-210 (LΪHSLIEESQNQQEK EQELLELDKWASLWNWF) [SEQ. ID. NO: 12].
DP-211 (TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWAS W WF) [SEQ. ID. NO: 13], and
DP-213 ( IHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASL) [SEQ. ID. NO: 14]
(Wild et al. (1994) Proc Nati Acad Sci USA 91: 9770-9774; Kilby et al. (1998) Nat. Med. 4: 1302-1307).
Una realización del presente invento proporciona pépíidos modificados basados en gp41 tales que se conceníren en los dominios con balsas, iníroduciendo una secuencia de consenso unida a GPI en sus extremos C-terminales. El Solicitante en trabajos previos ha demostrado que el GPI orienta eficazmente a los péptidos de anclaje hacia la hoja externa de los dominios con balsas (del Real y col. (2002) J. Exp. Med. 196, 293-301). Como se muesíra en la Figura 8A, la fusión del HIV-1 se impide con el pépíido:
YTS 1HSL1EESQNQQEK EQELLELDKWASLWNWFYDPRPSSGHS YALIPIPLAV1T YTSL1HSLIEESQNQQEKNEQELL resulíaníe de la fusión de T20 y de la secuencia de unión unida a GPI, procedeníe del aníígeno asociado a la función leucociíaria-3 (LFA-3; Seed, B. 1987. An LFA-3 cDNA encodes a phospholipid-linked membrane protein homologous to its receptor CD2. Nature 329, 840-842). La señal de consenso-GPI, derivada de LFA-3 es una secuencia de aminoácidos preferida del presente invento. Sin embargo, la señal-GPI de las quimeras del invento no se limita a LF A-3.
Inhibidores de proteasa dirigidos a las balsas. La proteasa activa de HIV-1 tiene una estructura homodimérica en la que las subunidades están conectadas por una interfase de lámina β formada por los segmeníos de los aminoácidos N-íerminal y C- íer inal. Péptidos cortos derivados de esíos segmentos son capaces de inhibir la actividad de la proíeasa. Estos péptidos incluyen: i
• ISYEL [SEQ. ID. NO: 16]. YEL [SEQ. iühibit the rotease activity. These peptides include ISYEL [SEQ. ID. NO. 16]. YEL [SEQ. ¡Tíhibit the protease activity These peptides include ISYEL [SEQ. ID. NO: 16]. YEL [SEQ.
Una realización del presente invento proporciona péptidos modificados derivados de la proteasa de HIV, de manera tal que dichos péptidos se conceníren en los dominios con balsas, introduciendo una secuencia de consenso de doble palmitoilación en sus extremos N-terminales. Se ha observado que esía señal dirige a las proleínas ciíosólicas hacia la hoja interna de los dominios con balsas (Lacalle y col., (2002) J. Cell. Biol. 157, 277-289). Como se muesíra en la Fig. 8B, la producción de partículas virales Luc-Ada esíá drásticamente disminuida en células que expresan el péptido MGCGCSSHPEDDISYEL [SEQ ID NO: 21], que corresponde a la fusión de los 12 aminoácidos procedentes del dominio único Lck y del péptido ISYEL [SEQ ID NO: 16] de la proteasa de HIV-1, utilizando técnicas convencionales de ingeniería genética. Asimismo, el procesamiento de Gag disminuye enormemente en células que expresan este pépíido quimera. La señal de consenso de palmiíoilación derivada de Lck es una secuencia de aminoácidos preferida del presente invento. No obstante, la señal de doble acilación de las quimeras del invenío no se limitan a Lck.
La frase "farmacéuticamente aceptables" se utiliza aquí para hacer referencia a los compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance de un juicio médico ponderado, son adecuados para utilizar en contacto con tejidos de seres humanos y animales, sin que presenten una toxicidad, irritación o respuesta alérgica excesivas, u otro problema o complicación, compensados con una proporción razonable de beneficio/riesgo.
Según aquí se utiliza, la expresión "sales farmacéuticamente aceptables" incluye las sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables (derivados entre los que se incluyen complejos, formas polimórfϊcas, profármacos y compuestos marcados isotópicamente, así como sus sales, solvatos y sus sales solvatos), y sus isómeros, de los compuestos descritos. En una realización más, los compuestos del invenío incluyen eslatinas y sus sales y solvaíos farmacéuticamente aceptables. Debe entenderse que los compuesíos del invento anteriormente mencionados incluyen sus formas polimórfϊcas y sus isómeros.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos del invento incluyen sus sales de adición de ácido y sus sales básicas.
Las sales de adición de ácido adecuadas se forman a partir de ácidos que forman sales no tóxicas. Como ejemplos se incluyen las sales acetato, aspartato, benzoato, besilato, bicarbonato, bisulfaío, borato, bromuro, camsilaío, carbonato, cloruro, citrato, edisilato, esilato, formiato, fumaralo, glucepaío, gloconaío, glucoronaío, hexafluorofosfato, hibenzato, hidrobromuro, hidrocloruro, hidroyoduro, yoduro, isetionato, lactato, malaío, maleaío, malonato, mesilato, metilsulfato, naftilaío, 2- napsilato, nicotinato, nitrato, orotato, oxalaío, palmiíalo, pamoato, fosfato/hidrógenofosfaío/dihidrógenofosfaío, sacaraío, esíearaío, succinato, sulfato, íarírato, tosilato y írifluoroacetalo. Las sales básicas adecuadas se forman a partir de bases que forman sales no tóxicas. Como ejemplos se incluyen las sales de aluminio, arginina, benzatina, calcio, colina, dietilamina, diola ina, glicina, Usina, magnesio, meglumina, olamina, potasio, sodio, íromeíamina y zinc.
También pueden formarse semisales de ácidos y bases, por ejemplo, las sales semisulfato y semicálcicas.
Para una revisión de sales adecuadas, véase Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, por Síahl y Wermulh (Wiley-VCH, Weinheim, Alemania, 2002).
Las sales farmacéuticamente acepíables del presente invenío pueden preparase a partir del compuesto de origen que contiene un resto básico o ácido, mediante métodos químicos convencionales. Generalmente, estas sales pueden prepararse haciendo reaccionar las formas de ácido libre o de base de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o del ácido apropiados, en agua o en un disolveníe orgánico o en una mezcla de ambos; generalmente se prefieren medios no acuosos como éter, acétalo de etilo, etanol, isopropanol o acetoniírilo. Las listas de sales adecuadas se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a Edición, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, pág. 1418, cuya descripción se incorpora aquí como referencia. La composición farmacéutica del invento puede administrarse en forma de productos cristalinos o amorfos. Estos producios pueden obtenerse, por ejemplo, en forma de rellenos sólidos, polvos, o películas, mediante métodos tales como precipitación, cristalización, liofilización, secado por pulverización o secado por evaporación. El secado por microondas o radiofrecuencia puede utilizarse para este fin.
Pueden administrarse solas o en combinación con uno o más de otros compuestos del invento, o en combinación con uno o más de otros fármacos (o en alguna de sus combinaciones). Generalmente, pueden administrarse como una formulación en asociación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptable. El término "excipientes" se usa aquí para describir cualquier componente distinto del compuesío(s) del invenío. La elección del excipiente dependerá en gran medida de factores tales como el modo particular de adminisíración, el efecto del excipiente sobre la solubilidad y esíabilidad, y la naíuraleza de la forma de dosificación.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el suministro de los compuestos del invento y los métodos para su preparación resultarán evidentes para los expertos en la íécnica. Estes composiciones y los métodos para su preparación pueden encontrarse, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Edición, (Mack Publishing Company, 1995).
Los compuesíos del invento pueden administrarse por vía oral. La adminislración oral puede implicar la deglución, de modo que el compuesto enlra en el íracío gasíroiníeslinal, o pueden utilizarse la adminisíración bucal o sublingual mediante las cuales el compuesto eníra en el torrente sanguíneo direcíameníe desde la boca.
Las formulaciones adecuadas para adminisíración oral incluyen formulaciones sólidas íales como comprimidos, cápsulas que contienen partículas, líquidos, o polvos, pastillas para chupar (incluyendo las rellenas de líquido) chicles, multiparlículas y nanopartículas, geles, disoluciones sólidas, liposomas, películas (incluyendo mucoadhesivas), óvulos, pulverizadores y formulaciones líquidas.
Las formulaciones líquidas incluyen suspensiones, disoluciones, jarabes y elixires. Esías formulaciones pueden utilizarse como ageníes de relleno en cápsulas duras o blandas y típicamente comprenden un excipiente, por ejemplo, agua, eíanol, polielilenglicol, propilenglicol, melilcelulosa, o un aceite adecuado, y uno o más agentes emulsionantes y/o ageníes favorecedores de la supensión. Las formulaciones líquidas lambién pueden preparase mediante la reconstitución de un sólido, por ejemplo, de un sobre.
Los compuesíos del invenío también pueden utilizarse en formas de dosificación de disolución rápida y desintegración rápida íales como las descriías en Expert Opinión in Therapeutic Patents, 11(6), 981-986, de Liang y Chen (2001).
Para las formas de dosificación en comprimidos, dependiendo de la dosis, el fármaco puede constituir desde el 1% en peso hasta 80% en peso de la forma de dosificación, más típicamente, desde 5% en peso hasta 60% en peso de la forma de dosificación. Además del fármaco, los comprimidos generalmente contienen un disgregante. Ejemplos de disgregantes incluyen glicolato de sodio y almidón, carboxirneíilcelulosa sódica, carboximetilcelulosa calcica, croscarmelosa sódica, crospovidona, polivinilpirrolidina, metilcelulosa, celulosa microcristalina, hidroxipropilcelulosa sustiluida con un alquilo inferior, almidón, almidón pregelaíinizado y alginalo sódico. Generalmente, el disgregante comprenderá desde 1% en peso hasía 25% en peso, preferiblemeníe desde 5% en peso hasía 20% en peso de la forma de dosificación.
Los aglutinantes generalmente se utilizan para impartir cualidades cohesivas a una formulación de comprimidos. Aglutinantes adecuados incluyen celulosa microcrisíalina, gelatina, azúcares, polielilenglicol, gomas naíurales y sintéticas, polivinilpirrolidona, almidón pregelaíinizado, hidroxipropilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa. Los comprimidos íambién pueden contener diluyeníes, íales como lactosa (en forma monohidraío, monohidralo secada por pulverización, anhidra y formas similares), maniíol, xiliíol, dextrosa, sacarosa, sorbitol, celulosa microcrisíalina, almidón y fosfato calcico dibásico dihidraíado. Los comprimidos íambién pueden incluir de manera opcional ageníes íensioacíivos, íales como laurilsulfaío sódico y polisorbato 80, y deslizantes íales como dióxido de silicio y íalco. Cuando esíán presentes, los ageníes íensioacíivos pueden constituir desde el 0,2% en peso hasta el 5% en peso del comprimido, y los deslizantes pueden constituir desde el 0,2% en peso hasta el 1% en peso del comprimido. Los comprimidos contienen íambién lubricantes tales como eslearaío de magnesio, esíearaío de calcio, eslearaío de zinc, esíearilfumarato sódico, y mezclas de estearato de magnesio con laurilsulfato sódico. Los lubricantes generalmente constituyen desde el 0,25% en peso hasla el 10% en peso del comprimido, preferiblemente desde el
0,5% en peso hasía el 3% en peso del comprimido.
Oíros componentes posibles incluyen aníioxidanles, colorantes, saborizantes, conservantes, y agentes enmascaradores del sabor. Las mezclas para la preparación de comprimidos pueden comprimirse direcíameníe o por medio de rodillos para formar los comprimidos. Las mezclas para la preparación de comprimidos, o porciones de las mezclas, pueden de manera alternativa someterse a una granulación por vía húmeda, granulación por vía seca, o granulación de un material fundido, a una congelación de un material fundido, o a una extrusión, antes de la formación de los comprimidos. La formulación final puede comprender una o más capas y puede estar recubierta o no recubierta; puede incluso ir encapsulada.
La formulación de comprimidos se traía en "Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Vol 7", de H. Lieberman y L. Lachman, Marcel Dekker, N.Y., N. Y. 1980 (ISBN 0-8247-6918-X) Las formulaciones sólidas para administración oral pueden formularse para que sean de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, prolongada, pulsada, controlada, dirigida y programada.
Formulaciones de liberación modificada adecuadas para los fines del invento se encuentran escritas en la patente de EE.UU. n.° 6.106.864. Los detalles de otras tecnologías de liberación adecuadas tales como dispersiones de alta energía y partículas osmóticas y recubiertas se pueden encontrar en Verma y col., (2001) Pharmaceutical Technology On-line, 25(2), 1-14. El uso de goma de mascar para conseguir una liberación controlada se encuentra descrito en el documento WO 00/35298.
Los compuesíos del invento lambién pueden administrarse directamente al torrente circulatorio, al músculo, o a un órgano interno. Medios adecuados de administración parenteral incluyen las vías iníravenosas, iníraarterial, iníraperiíoneal, iníraíecal, iníraveníricular, inírauretral, intraesternal, intracraneal, intramuscular, y subcutánea. Los dispositivos adecuados para una administración parenteral incluyen inyectores de aguja (incluyendo microagujas), inyectores sin aguja y técnicas de infusión. Las formulaciones parenlerales son típicamente disoluciones acuosas que pueden contener excipientes tales como sales, carbohidratos y agentes lampón
(preferiblemeníe a un pH de 3 a 9), pero en el caso de algunas aplicaciones, las disoluciones pueden formularse de modo más adecuado en forma de una disolución esterilizada no acuosa o en una forma seca para ser utilizada junto con un vehículo adecuado tal como agua esterilizada y libre de pirógenos.
La preparación de formulaciones parenterales en condiciones estériles, por ejemplo, por liofilización, puede llevarse a cabo fácilmente utilizando técnicas farmacéuticas estándar muy conocidas por los expertos en la íécnica. La solubilidad de los compuesíos del invenío utilizados en la preparación de disoluciones pareníerales puede aumentarse mediante el uso de técnicas de formulación apropiadas, tales como la incorporación de agentes potenciadores de la solubilidad.
Las formulaciones para la adminisíración pareníeral pueden formularse para que sean de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, prolongada, pulsada, conírolada, dirigida y programada. De esíe modo los compuesíos del invento pueden administrarse en forma de un sólido, semisólido, o líquido lixoírópico para adminisíración en una forma depol implantada que proporciona la liberación modificada del compuesto. Ejemplos de esías formulaciones incluyen los dispositivos revestidos de fármaco y las microesferas de PGLA.
Los compuestos del invento pueden íambién administrarse por vía tópica en la piel o mucosas, esto es por vía dérmica o íransdérmica. Las formulaciones típicas para este fin incluyen geles, hidrogeles, lociones, disoluciones, cremas, ungüentos, polvos sueltos, vendajes, espumas, películas, parches dérmicos, láminas, implantes, esponjas, fibras, apositos y microemulsiones. También pueden utilizarse liposomas. Los vehículos típicos incluyen alcohol, agua, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, glicerina, polietinelglicol y propinelglicol. Pueden incorporarse ageníes potenciadores de la peneíración, véase por ejemplo, J. Pharm. Sci, (Octubre 1999) 88(10), 955-958 de Finnin y Morgan. Oíros medios de administración tópica incluyen el suministro por elecíroporación, ioníoforesis, fonoforesis, sonoforesis, y inyección con microagujas o sin agujas (p. ej., Powderjecí™, Bioject™, ele.)
Las formulaciones para adminisíración tópica pueden formularse para que sean de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, prolongada, pulsada, controlada, dirigida y programada.
Los compuestos del invenío también pueden administrarse por vía iníranasal o mediante inhalación, típicamente en forma de un polvo seco (ya sea sólo, en forma de una mezcla, por ejemplo, en una mezcla seca con lacíosa, o en forma de partículas de componentes mezclados, por ejemplo, mezclados con fosfolípidos, íales como fosfalidilcolina) con un inhalador de polvo seco o en forma de aerosol con un recipiente presurizado, bomba, pulverizador, atomizador (preferiblemente un atomizador que utiliza compuestos electrodinámicos para producir una niebla fina), o un nebulizador, con o sin el uso de un propelente adecuado, íal como 1,1,1,2-íetrafluoroetano o
1,1, 1,2,3, 3,3-hepíafluoropropano. Para uso iníranasal, el polvo puede incluir un ageníe bioadhesivo, por ejemplo, quiíosán o ciclodextrina.
El recipiente presurizado, bomba, pulverizador, atomizador o nebulizador, contiene una disolución o suspensión del compuesto que comprende, por ejemplo, eíanol (opcionalmeníe, eíanol acuoso) o un ageníe alternativo adecuado para dispersar, solubilizar, o prolongar la liberación del compuesto, el propelenle(s) en forma de disolvente y un íensioacíivo opcional, lal como írioleaío de sorbiíán, ácido oleico o un ácido oligoláctico.
Antes de su utilización en una formulación en forma de polvo seco o suspensión, el producto del fármaco se microniza hasía alcanzar un íamaño adecuado para su suminisíro por inhalación (típicamente menor que 5 micrómeíros). Esto puede conseguirse mediante cualquier método de íriíurado apropiado, íal como molido de chorro espiral, molido de chorro en lecho fluido, procesamiento de fluidos supercrííicos, para formar nanoparíículas, una homogeneización a alfa presión o secado por pulverización.
Las cápsulas (fabricadas, por ejemplo, con gelatina o HPMC), envases blísíer y cartuchos para usar en un inhalador o insuflador, pueden formularse de manera que contengan una mezcla pulverizada del compuesío del invenío, una base pulverizada adecuada íal como lacíosa o almidón y un modificador de la funcionalidad, lal como leucina, maniíol o estearaío de magnesio. La lacíosa puede ser anhidra o esíar en forma de monohidraío, preferiblemente esto último. Otros excipientes adecuados incluyen dextrano, glucosa, maltosa, sorbiíol, xiliíol, fructosa, sacarosa y trealosa.
Una formulación de una disolución adecuada para usar en un atomizador utilizando compuestos electrodinámicos para producir una niebla fina puede contener desde 1 microgramo hasta 20 miligramos del compuesío del invenío por dispensación, y el volumen de dispensación puede variar desde 1 microlitro hasla 100 microliíros. Una formulación típica puede comprender un compuesto del invenío, propilenglicol, agua esterilizada, eíanol y cloruro sódico. Disolventes alternativos que pueden utilizarse en lugar del propilenglicol incluyen glicerol y polietilenglicol.
Aromatizantes adecuados íales como meníol y levomeníol, o edulcorantes íales como sacarina o sacarina sódica, pueden añadirse a aquellas formulaciones del invenío destinadas a una adminisíración inhalada/inlranasal.
Las formulaciones destinadas a una adminisíración inhalada/iníranasal pueden formularse para que sean de liberación inmediata y/o modificada, usando, por ejemplo, ácido poli(DL)-láctico-coglicólico (PGLA). Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación relardada, prolongada, pulsada, controlada, dirigida y programada.
En el caso de inhaladores de polvo seco y aerosoles, la unidad de dosificación se determina por medio de una válvula que libera una cantidad medida. Las unidades de acuerdo con el invento se disíribuyen íípicameníe para adminisírar una unidad medida o "puff que contiene desde 1 microgramo hasía 10 miligramos del compuesío del invento. La dosis diaria íolal típicamente esíará en el intervalo de 1 microgramo a 200 miligramos que pueden administrarse en una sola dosis o, más usualmeníe, en dosis divididas a lo largo del día.
Los compuesíos abarcados por el invenío pueden administrase por vía recial o vaginal, por ejemplo, en forma de supositorios, óvulos vaginales o enemas. La manteca de cacao es una base tradicional para supositorios, pero pueden utilizarse distintas alternativas como apropiadas. Las formulaciones destinadas a una administración rectal/vaginal pueden formularse para que sean de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, prolongada, pulsada, controlada, dirigida y programada. Los compuestos incluidos en el invento también pueden administrase directamente en ojo u oído, típicamente en forma de gotas de una suspensión micronizada o de una disolución en disolución salina isotónica, de pH ajustado y esterilizada. Otras formulaciones adecuadas para la administración ocular y aural incluyen ungüentos, implantes biodegradables (p. ej., esponjas de gel absorbibles, colágeno) e implantes no biodegradables (p. ej., silicona), láminas, lentillas y sistemas de partículas o vesículas, íales como niosomas o liposomas. Un polímero íal como poli(ácido acrílico), poli(alcohol vinílico), ácido hialurónico, un polímero celulósico, por ejemplo, hidroxipropilmeíilcelulosa, hidroxielilcelulosa, o metilcelulosa, o un polímero de heieropolisacáridos, por ejemplo, goma gelán, reticulados, puede incorporarse junio con un conservante tal como cloruro de benzalconio. Estas formulaciones también pueden suministrarse por iontoforesis.
Las formulaciones destinadas a una administración ocular/aural pueden formularse para que sean de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, prolongada, pulsada, controlada, dirigida y programada.
Los inhibidores de isoprenilación de proteínas del invento pueden mezclarse con entidades macromoleculares solubles, tales como ciclodextrina y sus derivados adecuados o polímeros que contienen polietilenglicol, con el fin de mejorar su solubilidad, velocidad de disolución, enmascaramiento del sabor, biodisponibilidad y/o estabilidad, para usar en los modos de administración anteriormente mencionados.
Los complejos de fármaco-ciclodextrina, por ejemplo, generalmente se encuentra que son útiles para la mayoría de las formas de dosificación y vías de administración. Pueden utilizarse complejos de inclusión y complejos de no inclusión. Como alternativa a una formación directa de complejos con el fármaco, la ciclodextrina puede utilizarse como adiíivo auxiliar, es decir, como vehículo, diluyente, o solubilizante.
Las ciclodextrinas más comúnmente utilizadas para estos fines son las ciclodextrinas α, beta y gamma, de las que pueden encontrarse ejemplos en las solicitudes de Paíenle
Internacional, documentos WO 91/11172, WO 94/02518 y WO 98/55148.
En la medida en que puede ser conveniente adminisírar un inhibidor de isoprenilación de proteínas en combinación con olro ageníe terapéutico, por ejemplo, con el fin de tratar una enfermedad o esíado particular, está incluido en el alcance del presente invento que dos o más composiciones farmacéuticas, de las que al menos una contenga un inhibidor de isoprenilación de proteínas, puedan mezclarse convenientemente en forma de un kit adecuado para la coadministración de las composiciones.
Así, el hit del invento comprende dos o más composiciones farmacéuticas independientes, de las cuales al menos una contiene un inhibidor de isoprenilación de proteínas o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y medios para conservar dichas composiciones por separado, tales como un recipiente, un frasco con divisiones, o un empaquetamiento en lámina metálica con divisiones. Un ejemplo de un hit de este tipo es el envase blíster familiar utilizado para el envasado de comprimidos, cápsulas y formulaciones similares.
El kit del invento es particularmente adecuado para administrar formas de dosificación diferentes, por ejemplo, oral y pareníeral, para administrar las composiciones individuales a intervalos de dosificación diferentes, o para titular las composiciones individuales una frente a otra. Para ayudar al cumplimiento terapéutico, el kit incluye típicamente pautas para la administración y puede ir provisto de una de las denominadas ayudas para la memoria.
Para la administración a pacientes humanos, que tienen un peso desde aproximadamente 65 kg hasía 70 kg, la dosis diaria total del inhibidor de isoprenilación de proteínas esíá íípicameníe en el intervalo de 1 mg a 10.000 mg, lal como una dosis de 10 mg a 1.000 mg, por ejemplo, de 25 mg a 500 mg, dependiendo por supuesto del modo de administración, de la edad, estado y peso del paciente, y estará en cualquier caso a criterio final del médico. La dosis diaria total puede administrarse en dosis únicas o divididas.
Por consiguiente, en otro aspecto el invento proporciona una composición farmacéutica que incluye un inhibidor de isoprenilación de proteínas o una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables, junto con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente acepíables. Los inhibidores de isoprenilación de proteínas y sus sales, solvaíos y derivados farmacéuticamente aceptables, pueden administrarse solos o como parte de un traíamienío combinado. Por ello, incluidas en el alcance del invenío existen realizaciones que comprenden la coadminisíración de composiciones que contiene, además de un compuesío del invenío, uno o más ageníes íerapéulicos adicionales. Estos regímenes de múltiples fármacos, usualmente denominados íraíamienío combinado, puede utilizarse en el tratamiento y prevención de una infección producida por el virus de la inmunodeficiencia humana, HIV. El uso de un íraíamienío combinado de esíe tipo es especialmente pertinente en relación con el tratamiento y prevención de la infección y multiplicación del viras de la inmunodeficiencia humana, HIV, y de retrovirus paíogénicos emparentados, en un pacieníe que necesila el tralamienlo o en un paciente que esíá en riesgo de convertirse en ese paciente. La capacidad de esos patógenos retrovirales para evolucionar en un período de tiempo relativamente corto hacia cepas resisíenles a cualquier monoíerapia que haya sido administrada a dicho pacieníe es muy conocida en la literatura. Un traíamienío recomendado para el HIV es un fraíamienlo combinado de fármacos denominado Terapia retroviral sumamente activa, o HAART (del inglés, "Highly Active Anti-Retroviral Therapy"). La HAART mezcla tres o más fármacos contra HIV. Así, los métodos de tratamiento y las composiciones farmacéuticas del presente invento pueden utilizar un inhibidor de la isoprenilación de proteínas en forma de monoterapia, pero dichos méíodos y composiciones pueden íambién utilizarse en forma de una terapia combinada en la que uno o más inhibidores de la isoprenilación de proíeínas se coadminisíran en combinación con uno o más agentes íerapéulicos adicionales tales como los que aquí se describen con detalle en lo que antecede y en lo que viene a continuación. En una realización más del invento, las combinaciones del presente invenío incluyen el íraíamienío con un inhibidor de isoprenilación de proíeínas, o con una de sus sales, solvaíos o derivados farmacéuíicameníe acepíables, y uno o más ageníes íerapéuíicos adicionales seleccionados eníre los siguieníes: inhibidores de la proleasa de HIV, que incluyen, pero no se limitan a ellos, indinavir, riíonavir, saquinavir, nelfinavir, lopinavir, amprenavir, aíazanavir, íipranavir, AG1859 y TMV114; inhibidores no nucleosídicos de la íranscripíasa inversa (NNRTI) (del inglés, "Non-Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors"), que incluyen, pero no se limiían a ellos, neviparina, delavirdina, capravirina, efavirenz, GW-8248, GW-5634 y TMC125; inhibidores nucleosídicos/nucleotídicos de la íranscripíasa inversa que incluyen, pero no se limiían a ellos, zidovudina, didanosina, zalciíabina, esíavudina, lamivudina, abacavir, adefovir, dipivoxil, íenofovir y emíricilabina; antagonistas de CCR5, que incluyen, pero no se limiían a ellos, N-{(lS)-3-[3-(3-isopropil-5-meíil-4H-l,2,4-íriazol-4-il)-exo-8- azabaciclo[3.2.1]ocí-8-il]l-fenilpropil}-4,4,-difluorociclohexanocarboxamida o una de sus sales, solvaíos o derivados farmacéuíicameníe acepíables, l-endo-{8-[(3S)-3-
(aceíilamino)-3-(3-fluorofenil) propil]-8-azabiciclo[3.2.1]ocí-3-il}-2-meíil-l,4,6,7- íelrahidro-5H-imidazol[4,5-c]piridina-5-carboxilalo de metilo o una de sus sales, solvaíos o derivados farmacéuticamente acepíables; l-endo-{8-[(3S)-3-(acelilamino)-3-(3- fluorofenil)propil]-8-azabiciclo[3.2.1]ocí-3-il}-2-meíil-4,5,6,7-íeírahidro-lH- imidazol[4,5-c]piridina-5-carboxilato de etilo o una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables; Sch-D, ONO-4128, GW-873140, AMD-887 y CMPD- 167; inhibidores de integrasa, que incluyen pero no se limiían a ellos, L-870.810; inhibidores de la enlrada (p. ej., fusión), que incluyen pero no se limitan a ellos, enfuviritida; otros agentes que inhiben la interacción de gpl20 con CD4, que incluyen pero no se limitan a ellos, BMS806 y BMS-488043; e inhibidores de la RNasaH.
También se incluyen en el alcance del presente invento, combinaciones de un inhibidor de isoprenilación de proteínas, o una de sus sales, solvatos, o derivados farmacéuticamente aceptables, junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales, seleccionados de manera independiente entre el grupo constituido por, p. ej., hidroxiurea; inmunomoduladores tales como factores de crecimiento estimuladores de colonias de granulocitos-macrófagos (p. ej., sargramostin), y disíinías formas de iníerferón o de derivados de iníerferón; oíros agonistas/antagonistas de recepíores de quimioquinas, teles como antagonistas de CXCR4 (p. ej., AMD-070 y AMD-3100); moduladores de recepíores de íaquiquininas (p. ej., antagonistas de NK1) y disíinlas formas de inlerferón o de derivados de iníerferón; inhibidores de la íranscripción viral y de la replicación del RNA viral; agentes que influyen, en particular regulan por disminución, la expresión de recepíores CCR5; quimioquinas que inducen la inlernalización de recepíores CCR5 íales como MlP-lα, MlP-lβ, RANTES y sus derivados; y oíros ageníes que inhiben infecciones virales o que mejoran el esíado o la respuesía de individuos infectados por HIV a íravés de diferentes mecanismos. Ageníes que influyen (en concreto, regulan por disminución) la expresión de receptores CCR5 incluyen inmunosupresores tales como inhibidores de calcineurina
(p. ej., tacroümus y ciclosporín A); esteroides; agentes que interfieren con la producción o señalización de ciíoquinas, íales como inhibidores de las quinasas de Janus (JAK) (p. ej, inhibidores de JAK-3, que incluyen 3-{(3R, 4R)-4-metil-3-[metil-(7H-pirrolo[2,3,- d]pirimidin-l-il}-3-oxo-propioniírilo) y sus sales solvalos o derivados farmacéuticamente aceptables; anticuerpos contra citoquinas (p. ej., anticuerpos que inhiben al receptor de la interleuquina-2 (IL-2), incluyendo basiliximab y daclizumab); y agentes que interfieren con la activación celular o con los ciclos celulares, tales como la rapamicina. También están incluidas en el alcance del presente invento, combinaciones de un inhibidor de isoprenilación de proteínas, o una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables, junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales que frenan la velocidad del metabolismo de los compuesíos del invento, produciendo con ello una exposición incrementada en los pacientes. Aumentar la exposición de esta manera se conoce como reforzar. Esto tiene el beneficio de aumentar la eficacia del compuesto del invento o de disminuir la dosis requerida hasta alcanzar la misma eficacia que con una dosis sin reforzar. El metabolismo de los compuestos del invento incluye procesos oxidativos llevados a cabo por enzimas P450 (CYP450), concretamente CYP3A4, y conjugación por acción de UDP glucoronosil-transferasa y enzimas de sulfatación. Así, entre los agentes que pueden utilizarse para aumenta la exposición de un paciente a un compuesto del presente invento se encuentran aquellos agentes capaces de actuar como inhibidores de la menos una de las isoformas de las enzimas del ciíocromo P450 (CYP459). Las isoformas de CYP450 que pueden ser inhibidas ventajosamente incluyen, pero no se limitan a ellas, CYP1A2, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 y CYP3A4. Los agentes adecuados que pueden utilizarse para inhibir CYP3A4 incluyen, pero no se limitan a ellos, ritonavir, saquinavir o ketoconazol.
Un experto en la íécnica apreciará que un íraíamienío combinado de fármacos, según se ha descrito aquí en lo que antecede, puede comprender dos o más compuestos que tienen el mecanismo de acción igual o diferente. Así, sólo a modo de ilustración, una combinación puede comprender un compuesto del invento y: uno o más
NNRTI; uno o más NRTI y un PI; uno o más NRTI y un antagonista de CCR5; un PI; un PI y un NNRTI; y así sucesivamente. Además del requerimiento de una eficacia terapéutica, que puede necesitar el uso de agentes terapéuticos además de los inhibidores de isoprenilación de proteínas, pueden existir razonamientos adicionales que empujen o recomienden enormemente el uso de una combinación de un compuesto del invento y de otro agente terapéutico, tal como en el traíamienío de enfermedades o esíados que son resulíado directo de la enfermedad o estado básico o subyacente, o que indirecíamente lo acompañan. Por ejemplo, puede ser necesario, o al menos conveniente, íraíar infecciones producida por el
Virus de la Hepatitis C (HCV), Virus de la Hepatitis B (HBV), Papilomavirus Humano
HPV), infecciones oportunistas (que incluyen infecciones bacterianas y fúngicas), neoplasmas y oíros esíados que se producen como resullado del esíado inmunocomprometido del paciente que está siendo tratado. Otros agentes terapéuticos pueden utilizarse con los compuesíos del invento, p. ej., con el fin de proporcionar imnunoeslimulación o para tratar el dolor y la inflamación que acompañan la infección inicial y fundamental del HIV. Por consiguiente, los agentes terapéuticos para utilizar en combinación con los compuesíos de la fórmula (I) y con sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables, incluyen también interferones, interferones tratados con polietilenglicol (p. ej., peg-iníerferón alfa-2a y peg-iníerferón alfa-2b), lamivudina, ribavirina y emíriciíabina, para el tratamiento de hepatitis; compuestos antifúngicos tales como fluconazol, itraconazol y voriconazol; compuestos antibacterianos tales como azitromicina y clariíromicina; interferones, daunorrabicina, doxorrabicina y pacliíaxel para el íraíamienío del sarcoma de Kaposi relacionado con el SIDA; y cidofovir, fomivirsen, foscarnel, ganciclovir y valcyte para el tratamiento de la retinitis producida por citomegalo viras (CMV). Otras combinaciones para usar conforme al invenío incluyen combinaciones de un inhibidor de isoprenilación de proíeínas, o una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticameníe aceptables, junto con antagonistas de CCR1, íales como BX-471; un agonisía de β-adrenocepíores íal como salmelerol; un agonista de corticosíeroides tal como propionato de fluticasona; un antagonista de LTD4 tal como montelukast; un antagonista muscarínico tal como bromuro de tioíropium; un inhibidor de PDE4 tal como colimilast o roflumilasl; un inhibidor de COX-2, tal como celecoxib, valdecoxib o rofecoxib; un ligando de ot-2-delta íal como gabapenlín o pregabalín; un inlerferón beta íal como REBIF; un modulador de receptores de TNF íal como un inhibidor de TNF-α ( . ej., adalimumab), un inhibidor de la HMG-CoA-reducíasaíal como una esíaíina (p. ej., aíorvaesíatina), o un inmunosupresor, íal como ciclosporina o un macrólido íal como íacrolimus. En las combinaciones anteriormente descriías, el inhibidor de isoprenilación de proíeínas, o una de sus sales, solvaíos o derivados farmacéuticamente aceptables, y otro agente(s) terapéutico, puede administrarse, con respecto a las formas de dosificación, o bien por separado o bien al mismo tiempo uno en relación con el otro, y con respecto a su tiempo de administración pueden administrarse simultáneamente o en orden secuencial. Así, la administración de uno de los ageníes componeníes puede ser antes, al mismo tiempo, o después de la administración del otro agente(s) componente.
Por consiguiente, en un aspecto más el invento proporciona una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de isoprenilación de proteínas, o una de sus sales, solvatos o derivados farmacéuticamente aceptables, y uno o más agentes terapéuticos adicionales.
Se tendrá en cuenta que todas las referencias aquí incluidas al traíamienío incluyen íraíamienío curativo, paliativo y profiláctico.
La composición farmacéutica del invenío puede ser íambién adecuada para terapia génica de células diana del HIV. Además de a primates, tales como los seres humanos, oíros mamíferos diversos pueden ser íraíados conforme al método del presente invento. Por ejemplo, los mamíferos que incluyen, pero no se limitan a ellos, vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, cobayas, ratas u otros animales bovinos, ovinos, equinos, felinos, roedores o especies murinas, pueden ser traíados. No obstante el método también puede practicarse en otras especies.
EJEMPLOS
Como se ha ilusírado anteriormente, las estaíinas inhiben una infección de ratones SCID injertados con células mononucleares de sangre periférica humana, adulias, (PBMC; SCID.hu-PBMC), un modelo in vivo de una infección aguda por HIV. Los resulíados ilustran lambién que las esíaíinas inhiben la enlrada de viras, y la salida de las células diana, aíacando la geranilación de Rho. Sorprendentemente, la adminisíración oral de esíatina durante un mes disminuye el número de copias del RNA del HIV-1 en individuos que padecen una infección crónica por HIV-1 y que no esíán recibiendo
HAART (Tabla 1).
Tabla I. Parámetros clínicos de pacientes infectados con HTV-1 y tratados con estatuías
Figure imgf000056_0001
Estos datos proporcionan la evidencia que apoya el principio del uso de esíaíinas como ageníes terapéuticos anli-reíro virales. MATERIALES Y MÉTODOS
Infección por HIV-1. Se llevaron a cabo infecciones de una sola ronda con un pNL4-3.Luc.R-E, defectivo en replicación, seudoíipificado con las cubiertas del
HIV-I D O del viras de la estomatitis vesicular (VSV) (Manes, S. y col. (2000) EMBO Rep, 1, 190-196). Células MT2-CCR5 (obsequio de J. Alcamí, Inst. Salud Carlos II,
Madrid, España) se íraíaron con lovasíalina 10 μM (48 h, 37°C) sola o mezclada con L- mevalonato (200 μM, pirofostado de geranilgeranilo (GGPP, 5 μM) pirofosfato de farnesilo (FPP, 5 μM) o colesterol (5 μM, todo ello procedente de Sigma), o con GGRT-
286 (10 μM) o FTI-277 (10 μM, ambos procedentes de Calbiochem) antes de íransducirlas con los sobrenadaníes virales (multiplicidad de infección 0,1; 2 h, 37°C). La infecíividad de determinó pasadas 24 h midiendo la acíividad de luciferasa (Manes, S. y col. EMBO Rep. 1, 190-196, del Real G. y col., (2002). J. Exp. Med 196, 293-301). Experimentos similares se llevaron a cabo utilizando células MT2-CCR5 que expresan Rho de tipo salvaje, marcado de GFP, Rae de tipo salvaje, o los muíaníes Rho-N19 o Ra- N17 (obsequio de F.Sánchez-Madrid, Hospiíal de la Princesa, Madrid, España. Los ensayos de fusión célula-célula inducidos por gpl60 fueron según los descritos (Manes, S. y col. (2000) EMBO Rep, 1, 190-196).
PBMC purificadas en gradientes de Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences) se activaron durante 2 días con fiíohemaíogluíinina (PHA; 1 μg/ml) e IL-2 (50 ng/ml), y se íraíaron (48 h, 37°C) con lovasíaíina o lovasíaíina + mevalonalo. Las PBMC íraíadas se incubaron con preparaciones virales de reserva de NL4-3 o BaL (1 ó 10 ng de anlígeno p24/106 células, 3 h, 37°C). Diariamente se recogieron sobrenadaníes libres de células procedentes de las células cultivadas (0,5 x 106/ml) y se ensayaron con respecto a la presencia del aníígeno p24 (Coulíer). Para la infección ex vivo, células PBMC se purificaron procedentes de donantes informados íraíados con pravasíaíina (40 mg/día, 14 días, oral) antes y después del íraíamienío. Ambas muesíras se infecíaron simultáneamente con dos dosis infecciosas de preparaciones de reserva de HIV-1. Después de lavadas, las células se sembraron en placa con PHA e IL-2, y se midió p24 a los 4 y 5 días después de la infección (Coulter). Modelo murino de SCDI-hu-PBMC. Ratones CB.17 SCID/SCID, de 8-
10 semanas de edad, de fenotipo no secretor, se reconstituyeron mediante una inyección i. p. de 50 x 106 PBMC humanas. Una semana más íarde, los ratones que tenían niveles séricos comparables de inmunoglobulinas humanas, prueba de la reconstitución con células humanas, recibieron lovastatina (i.p.: 5 mg/kg) una inyección cada tres días, comenzando una semana antes de la sensibilización inmunológica con NL-4-3 de HTV
(i.p.; 100 TCDI 50/ml) hasía ser sacrificados. Se midió el número de copias de RNA de HIV-1 en plasma (Amplicor HIV-1 Monitor Assay, Roche Molecular Systems) una semana después de la infección. Dos semanas después de la sensibilización inmunológica con el viras, células perifonéales (10 ) procedentes de los ratones sacrificados se incubaron con 2 x 106 PBMC humanas activadas con PHA, en presencia de IL-2 y se determino p24 después de 2 semanas de co-culíivo. Las células perifonéales íambién se analizaron por FACS (EPICS Eliíe, Coulíer) utilizando un anticuerpo (Ab) aníi-CD5 marcado con FITC y un anticuerpo anti-CD4 unido a ficoeritrina (Pharmingen). Ratones no tratados, o ratones traíados con lovasíaíina se reconstituyeron con PBMC teñidas con Cell Tracker Green CMFDA (Molecular Probes). A los 3 y 7 días después de la reconstiíución, se obluvieron células perifonéales procedentes de dos raíones, se reunieron, y se analizaron por FACS.
Titulación de la producción viral. Células HEK 293T, co-transfecíadas con pNL4,3.Luc.R.E. y con cDNA que codifica las cubiertas de HIV-IADA O VSV, se trataron con lovasíaíina o con lovaslalina + mevalonaío. Se recogieron preparaciones virales de reserva pasadas 48 h y se titularon midiendo la actividad de luciferasa después de la íransducción de células T HEK293 que expresan CD4. Los valores se normalizaron con respecto a la actividad de luciferasa medida en extractos de las células productoras de reserva.
Expresión génica dirigida por LTR. Células de Jurkat íransfecíadas con pLTR-luc (Schwartz, O. y col. (1990) Gene 88:197-205), con pcDNA-lat y con el plásmido que porta la luciferasa de renilla, careníe de promoíor, se íraíaron pasadas 4 h de la íransfección, con inhibidores y melaboliíos en las conceníraciones indicadas (véase la sección correspondiente a las infecciones por HIV-1). Se calcularon las unidades relativas de lucifarasa (RLU) en forma del cociente entre la acíividad en luciérnaga y la acíividad en renilla pasadas 48 h. Determinación de la masa de colesterol celular. El contenido en colesterol de las células MT2-CCR5, no íratadas, tratadas con lovastatina o tratadas con lovastaíina + mevalonaío, se analizó en un cromalógrafo de gases de Hewlett-Packard (Chropack, Middelburg. Países Bajos) según la manera descrita (Llaverías, G. y col.
(2002) Eur. J. Pharmacol. 451, 11-17). La masa del ésíer de coleslerilo se calculó restando el colesterol libre del contenido íoíal de colesterol.
Formación de parches inducida por gpl20. Células PBMC no estimuladas, sembradas en cámaras recubiertas con ICAM-1/Fc (R&D Systems) se incubaron (30 min, 12°C) con gpl20 recombinante (virus X4 adaptado a una línea de células T, muesíra aislada IIB; Iníracel) en PBS/albúmina de suero bovino al 0,2%,, seguido de anticuerpo anli-gpl20 de conejo y Cy2-Ab aníi-conejo (Jackson
IπrmunoResearch). Las células se fijaron con paraformaldehído al 3,7% en PBS en hielo, y después se incubaron por orden con anticuerpo anti-CXCR4 biotinilado (FAB1272; R&D Systems) y Cy3-eslrepíavidina. Por último, las células se montaron en medio de Vectashield (Vector Laboratories) y se visualizaron por microscopía confocal con láser (Leica).
Ensayo de activación de Rho y Rae. Células MT2-CCR5 (3 x 106) íraíadas con lovastatina sola o mezclada con GGPP, se sometieron a privación (3 h), y después se incubaron con preparaciones de reserva de HIV-1. A los tiempos indicados, las células se lavaron con PBS enfriado en hielo y se prepararon Usados utilizando hits de ensayos de activación de Rho o Rae (Upstate Biotechnology). Rho unida a GTP se precipitó con bolitas de agarosa unidas a RBD, y GTP-Rac se precipitó con bolitas de agarosa unidas a PBD. Rho activada o Rae activada se midieron en los sedimentos mediante transferencia Western con anticuerpos específicos, utilizando extractos celulares en crudo para la normalización. Se llevó a cabo una densitometría usando un programa NHI Image.
Tratamiento con lovastatina de pacientes infectados con HIV-1. Seis pacientes informados, infectados con HIV-1, en una etapa Al de la enfermedad, que no habían recibido HAART, se trataron con lovastaíina (40 g/día, oral) durante un mes. Se midieron el número de copias en plasma del RNA de HIV, los recuentos de linfocitos T CD4 circulantes, y los niveles de colesterol plasmáticos, antes e inmediatamente después del traíamienío, así como a los tres meses de haber finalizado el tratamiento con lovastaíina, utilizando técnicas clínicas esíándar. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las estatinas inhiben la infección por HTV-1 in vitro e in vivo
Se ha sugerido que las estatinas pueden tener efectos anti-HIV-l (Maziere, J. y col. (1994) Biomed.Pharmacoíher, 48:63-67). Células PBMC humanas, activadas con PHA, preíraladas durante 48 h con lovasíalina 10 μM, se expusieron a las cepas X4(NL4-3) o R5(BaL) de HIV-1; no se observaron efectos ciíoíóxicos a esía dosis (no mostrado). La lovasíaíina inhibió la repliación de HIV-1, según se indica por la reducida producción de aníígeno p24 en los cultivos infectados con X4 y R5 (Fig. 5A). Esíe efecto se revertió mediante una co-incubación de las células con L-mevalonaío, el produelo de la HMG-CoA-reducíasa.
Para analizar el efecto anti-HIV-1 inducido por la estatina, la susceptibilidad a una infección por el viras R5 que presentaban células PBMC procedentes de voluntarios humanos tratados con pravastatina, se comparó antes y después del tratamiento con estaíina. La infecíividad de PNBM procedentes de individuos íraíados con el vehículo no se afectó de manera significaíiva a dos dosis de HΓV-1 diferentes (Fig. 5B; p=0,812 para 1 ng de p24/106 células; p=0,218 para 10 ng de ρ24/106 células, prueba de Wilcoxon Signed-Rank de dos colas). La infecíividad se redujo drásíicameníe en las PBMC procedentes de voluníarios íraíados con esíaíinas (p=0,032 para ambas dosis del viras, prueba de Wilcoxon Signed-Rank de dos colas). El bloqueo de la replicación de HIV-1 producido por esíaíinas se midió en ratones SCID injertados con PBMC humanas (SCID-hu-PBMC), un modelo de infección por HΓV-1 in vivo (del Real, G. y col. (1998) AIDS 12, 865-872), inyecíando lovasíalina antes de la sensibilización inmunológica con NL4-3 de HIV-1. La carga viral media se redujo significativamente en ratones íraíados con lovasíalina (p=0,028, prueba de Mann- Withney de dos colas) comparada con la de los animales tratados con vehículo (Fig. 5 C). El RNA viral fue indetectable en el plasma de 4 de los 10 ratones tratados con lovastaíina; un co-culíivo de células perifonéales procedeníes de dos de esíos ratones, con PBMC humanas activadas por PHA, no rescató virus. Una semana después de la infección, los ratones SCDI-hu-PBMC íraíados con lovasíaíina mostraron recuentos más altos de células T CD4" que los controles; el cociente medio CD47CD5' fue del 51% en los ratones traíados con lovasíaíina y del 28% en los ratones íraíados con vehículo (Fig. 5D), indicando una pérdida específica de células CD4" en los coníroles (p=0,048, prueba de Mann-Whiíney de dos colas). Para determinar si las esíaíinas afectaba a la viabilidad o proliferación de dos poblaciones específicas de células humanas infectadas, ratones SCID se reconstituyeron con células humanas activadas con PHA y traíadas con lovasíatina igual que en el caso anterior. No se encontró diferencia en el número de células marcadas ni en la intensidad del mareaje (Fig. 5), lo que sugiere que el tratamiento con lovastatina no es deletéreo para PBMC injertadas.
Las estatinas afectan al ciclo replicativo de HIV-1, reduciendo la geranilgeranilación Una infección de una sola ronda con una variante NL4-3 de HIV-1, defectiva en la replicación, moslró que la lovasíaíina inhibía la enírada de variantes seudoíipificadas con R5 (Fig. 6A) o X4 (no mosírado), pero no la de virus seudolipificados con la cubierta de VSV (Fig. 6A). El íraíamienío con lovasíaíina lambién redujo la producción viral seudoíipificada con HIV-1-X4, pero no la de los virus seudoíipificados con VSV-G-, en células T HEK293 íransfecíadas con DNA de NL4- 3.Luc defectivo en replicación (Fig. 6B). No es probable que la reducción específica inducida por lovastatina en la producción viral seudotipificada con HIV-1 sea debida a un procesamiento y síníesis diferenciales de Gag, ya que los seudotipos de HIV-1 y de VSV comparten el mismo genoma vírico. No obstante, la lovasíaíina aumentó la actividad promotora dirigida por LTR de HTV-1 (Fig. 6), lo que sugiere que el fármaco es capaz de regular al actividad de factores nucleares implicados en la transcripción de HIV. Estos resultados indican que la lovastaíina tiene efecíos pleiolrópicos sobre la replicación del HIV-1, debido a que el fármaco es capaz de promover la replicación del virus aumentando la transcripción del genoma viral, y tiene efectos anti-HIV-1 que inhiben la enírada y la salida del viras en la célula diana. Ambos efectos pro-HIV-1 y anli-HIV-1 inducidos por la lovasíaíina, estuvieron mediados a íravés de la raía del mevalonaío, ya que fueron revertidos medíanle la co-incubación de las células con L-mevalonalo (Fig. 6A-C).
La inhibición de la ruta del mevalonato disminuye la biosíntesis de colesterol, pero disminuye también los depósitos celulares de GGPP y FPP, ambos implicados en la modificación postraduccional de las proteínas. El solicitante ha descubierto que la inhibición de la entrada de HTV-1 en células permisivas, inducida por lovaslalina, era revertida mediante la co-adición de GGPP, pero no de FPP ni de colesíerol (Fig. 7A). Esto sugiere que la lovasíaíina inhibe la infección por HIV-1 bloqueando la geranilgeranilación de las proteínas en lugar de previniendo la farnesilación o disminuyendo la biosínlesis de colesíerol. La enírada del virus seudoíipificado con R5 fue inhibida mediante el Iralamienlo de las células con un inhibidor de geranilgeranil-íransferasa, pero no por un inhibidor de la farnesil-transferasa
(Fig. 7B); esíos fármacos no afecíaron la enlrada de viras seudoíipificados con VSV (no mosírado). La medida del contenido del colesíerol celular indicó la existencia de niveles de colesíerol comparables en células íraíadas y no íraladas con lovasíaíina; el fármaco sin embargo redujo drásticamente la masa de ésíeres de colesíerilo (Fig. 7C), probablemeníe debido a una inhibición concomitante de la acil-CoA:colesterol acilíransferasa (Kam, N. y col. ,(1990) Biochem J. 272:427-433). Aunque no puede excluirse que el colesterol esterificado represente un papel en la infección por HIV-1, el descubrimiento de que el GGPP revierte la inhibición de la enírada del viras inducida por lovasíalina, sugiere que los efecíos de la lovastatina están mediados principalmente por la alteración de la geranilgeranilación de las proteínas. La suplementación con GGPP, pero no con FPP ni con colesterol libre, íambién revertió el aumento en la íranscripción dirigida por LTR e inducida por lovasíaíina (Fig. 7 D). El Iralamienlo de células con un inhibidor de la geranilgeranil-transferasa aumentó también la transcripción del HIV (Fig. 7D), lo que sugiere la existencia de una mecanismo molecular general para la mediación de lovastatina sobre los efectos pro-HIV-1 y anti-HTV-1.
Las estatinas inhiben la agregación de receptores inducida por HIV-1, impidiendo la activación de Rho Para identificar la proteína(s) isoprenilada implicada en los efectos anti-
HIV-1 inducidos por estatinas, se estudió el mecanismo mediante el cual la lovastaíina inhibe la enírada del virus. Se analizó la formación de complejos moleculares de orden superior de gpl20 con los recepíores CD4 y CXCR4 de HTV-l. Células PBMC íraíadas y no íraíadas con lovasíaíina, se incubaron por orden con gpl20πB, Ab aníi-gpl20 y Ab aníi-CXCR4. Las células íraíadas con lovasíaíina preseníaron parches de gpl20 de menor íamaño que las células no íraíadas (Fig 8A); los parches se co-localizaron con CD4 en ambos caso (no mosírado). Aunque la lovastaíina no afectó a la unión de gpl20 a CD4, la co-localización eníre gpl20 y CXCR4 se redujo de manera drástica en los cultivos traíados con lovasíaíina (Fig. 8A), lo que sugiere que la lovasíaíina inhibe la agregación de recepíores inducida por gpl20. El íamaño de los parches y la co-localización de gpl20-CXCR4 fueron restiluídos en las células íraíadas con lovasíaíina medianíe adición de mevalonaío (Fig. 8A), pero no mediante adición de coleíerol (no mosírado).
La geranilgeranilación es necesaria para la modificación lipídica posíraduccional de varias proíeínas ancladas en la hoja inferna de la membrana, que incluyen las Rho-GTPasas (Kock, G. u col. (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther. 283, 901-
909). Además, la unión de gpl20 a las células diana modifica la masa molecular de Rho y aumenía la expresión de Cdc42 (Cicala, C. y col, (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99, 9380-9385). La incubación de las células diana con HIV-1 produjo la activación de Rho, pero no de Rae (Fig. 8B) ni de Cdc42 (no mostrado). La incubación de las células con lovastaíina antes de la exposición al viras, inhibió la activación de Rho inducida por HIV-1, la cual revertió cuando las células se co-incubaron con GGPP (Fig. 8C), lo que indica que la lobasíalina impidió la activación de Rho inducida por HPV-1 mediante un mecanismo dependiente de la geranilgeranilación. La activación de Rho inducida por el viras se requiere para la enírada del virus, ya que la infección por HIV-1 pseudoíipificado con R5 se redujo en células que expresan el muíante RhoN19 dominante-negativo (Fig. 8D); la expresión de RhoN19 impidió íambién específicamente la fusión de la cubierta de HIV-1 con la membrana de las células diana en un ensayo de fusión célula-célula (Fig. 8E). Los resulíados sugieren que la lovasíaíina inhibe la enlrada de HIV-1 en las células diana, al menos en parte, impidiendo la activación de Rho. La inhibición de Rho se ha asociado con un aumento en la íranscripción de HIV-1 (Wang. L. y col., (2000) J. Immunol. 164: 5369-5374), lo que sugiere que los efecíos pro-HIV-1 y aníi-HIV-1 inducidos por lovasíaíina pueden estar mediados por Rho.
Las estatinas disminuyen el número de copias del RNA de HIV-1 en plasma en individuos que padecen una infección crónica
Las esíaíinas se usan en el íraíamienío de la lipodisírofia asociada a HAART. Tomando como base los anteriores resultados in vitro, se estudió el uso potencial de las estaíinas para un tratamiento in vivo de pacientes con HIV. En un esíudio preliminar realizado para probar la idea, seis pacientes infecíados con HIV-1 en fase Al, no íraíados con HAART, que habían preseníado una carga viral estable durante al menos seis meses (Tabla 1) se íraíaron con lovasíaíina durante un mes como única terapia. El íraíamienío con esíaíinas en un plazo de tiempo corto indujo una clara disminución en las cargas de RNA viral en suero en todos los pacientes (Tabla I). La interrupción del traíamiento con esíaíinas produjo un rebrote en la carga viral (Tabla I). Los dalos sugieren que las esíatinas son capaces de inhibir la replicación de HIV-1 en individuos que padecen una infección crónica, y apoya el uso de las estatinas como agentes anti- relrovirales.
Las eslatinas pueden tener varias células diana en el sistema inmunológico (Romano, M. y col. (2000) Lab. Invest. 80, 1095-1100); Kwak, B. y col, (2000) Nat. Med. 6, 1399-1402). El solicitante ha demostrado que la inhibición de la entrada de HTV- 1 y de la producción de viriones inducidas por estalinas, así como el aumento en la íranscripción viral, esíán mediados a través de la inhibición de la raía meíabólica del mevalonaío. La enírada de HIV-1 y la gemación son procesos cooperativos que requieren la co-agregación de proíeínas en la superficie de la célula hospedadora: de CD4 y de los co-receptores de quimioquinas para la entrada, de Gag y de gpl60 para la gemación (Manes, S. y col. Nat. Rev. IMMUNOL., 3, 557-568). Se ha sugerido que esíos procesos esíán mediados por la asociación de las proíeínas con las balsas lipídicas (Manes, S. y col. (2000) EMBO Rep. 1, 190-196); Nguyen, D. y J. Hildreíh (2000) J. Virol. 74, 3264- 3272; Ono, A y E. Freed (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98, 13925-13930; del Real, G. y col. (2002) J. Exp. Med. 196, 293-301; Wang, J.-K. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97, 394-399); Lindwasser, O. y Resh, M. (2001) J. Virol., 75, 7913-7924; Manes, S. y col. (2001) Semin. Immunol. 13, 147-157), y dirigidos por el ciíoesqueleío de acíina (Iyegar, S. y col. (1998) J. Virol. 72, 5251-525; Viard, M. y col. (2002) J. Virol. 76, 11584-11595; Síeffens, C, y T. Hope (2003) J. Virol. 77, 4985-4991). La agregación de las balsas conlleva una reorganización del ciíoesqueleío de acíina, para el cual algunos informes implicas a Rho como efecíor principal (Manes, S. y col (2003) Trend Immunol. 24, 320-326). Las esíaíinas son capaces de inhibir la infección por HIV-1, en pare disminuyendo la geranilgeranilación de Rho, esencial para la localización y función de Rho, que incluyen la reorganización del ciíoesqueleío requerida para la enírada y salida de virus. En resumen, se proporciona la evidencia de que las esíatinas impiden la infección por HIV-1 en células de cultivos primarios, en modelos animales, y en individuos que padecen una infección crónica. Se ha puesto de manifiesto que, a nivel celular, las estatinas inhiben la entrada y la gemación de los viras, impidiendo la geranilgeranilación de Rho, necesaria para la infección por HIV-1. Partiendo de la capacidad de las esíaíinas para reducir la carga viral en individuos infecíados por HIV-1, se sugiere que esos compuesíos presentan efectos anti-relrovirales directos y pudieran ser fármacos apropiados para un íraíamienío más accesible de la pandemia del SIDA.
INCORPORACIÓN A MODO DE REFERENCIA
Todas las publicaciones y soliciíudes de Patentes citadas en esía memoria descriptiva, quedan aquí incorporadas a modo de referencia como si cada publicación individual o cada solicitud de Patente estuvieran indicadas de modo específico e individual para ser incorporadas como referencia. Más concretamente, las siguientes publicaciones se incorporan por ello en su totalidad y para todo fin:
1 . G. del followíng publications are hereby incorporated in their entirety and for al! purposes. G. del following publications are hereby incorporated in their entirety and for all purposes- G. del following publications are hereby incorporated in their entirety and for all purposes: G. del following publications are hereby incorporated in their entirety and for all purposes. G. del following publications are hereby incorporated in their entirety and for ali purposes: G. del A. & S. Manes, Speciβc SHP-2 parrtlionlng m raft domai triggers mt gríπ-medrated s gnaimg vía Rho activa/ton, J. Cell Biol. 157, 277-290, 2002.
Todos los contenidos y la descripción en su íoíalidad de la solicitud, Número 21910/001 , del Expediente del Apoderado, en tramiíación j unto con la preseníe, y íiíulada "Method To Screen For Chemokine Agonists And Antagonists" se incorporan de modo específico como referencia y para iodo fin. DECLARACIÓN DE UTILIDAD INDUSTRIAL
Con el fin de cumplir con el Tratado de Cooperación de Patentes, el presente invenío declara una uíilidad indusírial. El presente invenío proporciona medios para diagnosticar y tratar a seres humanos y a otros animales afeclados con una enfermedad o esíado mediado por procesos de señales a íravés de recepíores de quimioquinas.

Claims

REIVINDICACIONES
1. El uso de un inhibidor de la isoprenilación de proteínas o de una de sus sales, solvaíos o derivados farmacéuticamente acepíables, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por HIV, de una infección por un retrovirus genéticamente relacionado con el HIV, o del SIDA.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que el inhibidor de la isoprenilación de proteínas es un inhibidor de la geranilgeranilpirofosfato-siníeíasa.
3. El uso según la reivindicación 1, en el que el inhibidor de la isoprenilación de proíeínas es un inhibidor de la geranilgeranil-íransferasa.
4. El uso según la reivindicación 1, en el que el inhibidor de la isoprenilación de proteínas es un inhibidor de la activación de Rho.
5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, en el que el inhibidor es una esíaíina o uno de sus análogos.
6. El uso según la reivindicación 5, en el que la eslaíina se selecciona eníre el grupo que comprende lovasíaíina, simvasíaíina, pravaslaíina, mevasíaíina, aíorvasíaíina y fluvasíaíina.
7. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en el que el inhibidor de la isoprenilación de proíeínas esíá mezclado con un vehículo, aglutinante, agente de relleno, diluyeníe o excipiente farmacéuíicameníe acepíables, o cualquiera de sus combinaciones.
8. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, en el que el inhibidor de la isoprenilación de proíeínas se adminisíra en combinación con uno o más agentes terapéuticos diferentes, seleccionados entre el grapo que comprende un inhibidor de la proteasa de HIV, un inhibidor de la íranscripíasa inversa no nucleosídico, un inhibidor de la íranscripíasa inversa nucleosídico/nucleoíídico, un aníagonisía de CCR5, un inhibidor de la integrasa, un inhibidor de RNasaH, un agente inhibidor de los dominios con balsas, un agente que disminuye los niveles de colesterol, un agente que disminuye la premiación de proteínas, un inhibidor de la Rho-A GTPasa, y un ageníe que disminuye los niveles de glicoesfingolípidos.
9. El uso según la reivindicación 8, en el que dicho agente que disminuye los niveles de glicoesfingolípidos es un compuesto seleccionado eníre el grupo constituido por:
D-t-3 ',4'-eíilendioxi- 1 -fenil-2-palmiíoilamino-3 -pirrolidino- 1 -propanol, D-í-4'-hidroxi- 1 -fenil-2-palmitoilamino-3 -pirrolidino- 1 -propanol, 1 -fenil-2-palmiíoilamino-3 -pirrolidino- 1 -propanol, y sus sales y sus mezclas farmacéuticamente acepíables.
10. El uso según la reivindicación 8 ó 9, en el que dicho ageníe inhibidor de los dominios con balsas disocia los dominios con balsas.
11. El uso según la reivindicación 8 ó 9, en el que dicho agente inhibidor de los dominios con balsas inhibe la formación de dominios con balsas.
12. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 8 a 11, en el que dicho ageníe modulador de los recepíores de quimioquinas inhibe la formación de los dominios de membrana con balsas y/o los disocia.
13. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 8 a 11, en el que dicho inhibidor de Rho-A GTPasa es una esíaíina.
14. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 8 a 13, en el que la combinación comprende la adminisíración independieníe, secuencial o simultánea de uno o más de los ageníes.
15. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 8 a 14, en el que el uno o más agentes está mezclado con un vehículo, aglutinante, agente de relleno, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables, o cualquiera de sus combinaciones.
16. Un inhibidor de la isoprenilación de proteínas o una de sus sales, solvaíos o derivados farmacéuticamente acepíables, para usar en el íraíamienío de una infección por HIV, de una infección por un relrovirus genéíicameníe relacionado con el HIV, O del SIDA.
17. Un método de traíamienío de un mamífero que padece una infección por HIV, una infección por un reírovirus genéticamente relacionado con el HIV, o SIDA, que comprende traíar a dicho mamífero con una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes capaces de inhibir la isoprenilación de proíeínas, o de t a de sus sales, solvaíos, o derivados farmacéuíicameníe acepíables.
18. El método de la reivindicación 9, que comprende además adminisírar al paciente una cantidad farmacéuticamente efectiva de al menos un agente seleccionado eníre el grupo consíiluido por un ageníe aníiviral, un ageníe modulador de los recepíores de quimioquinas, un ageníe inhibidor de los dominios con balsas, un ageníe que disminuye los niveles de colesíerol, un ageníe que disminuye la premiación de proteínas, un inhibidor de la Rho-A GTPasa, y un agente que disminuye los niveles de glicoesfingolípidos.
19. El método de la reivindicación 17 o de la reivindicación 18, en el que el uno o más ageníes se mezcla con un vehículo, aglutinante, ageníe de relleno, diluyenle o excipiente farmacéuticamente aceptables, o cualquiera de sus combinaciones.
20. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que dicho agente antiviral es una sal de adición seleccionada entre el grapo constituido por una sal de adición de ácido, una sal de adición de metal, una sal amónica, y una sal formada con una base orgánica.
21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el que dicho agente que disminuye los niveles de glicoesfingolípidos es un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por:
D-í-3 ',4'-elilendioxi- 1 -fenil-2-palmiíoilamino-3 -pirrolidino- 1 -propanol, D-í-4'-hidroxi- 1 -fenil-2-palmitoilamino-3 -pirrolidino- 1 -propanol,
1 -fenil-2-palmiíoilamino-3 -pirrolidino- 1 -propanol, y sus sales y sus mezclas farmacéuíicameníe acepíables.
22. El méíodo de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, en el que dicho ageníe aníiviral es un compuesío seleccionado eníre el grupo constituido por nucleósidos, nucleótidos, inhibidores de proíeasas, pirimidinonas y piridinonas.
23. El méíodo de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, en el que dicho ageníe inhibidor de los dominios con balsas disocia los dominios con balsas.
24. El méíodo de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, en el que dicho ageníe inhibidor de los dominios con balsas inhibe la formación de los dominios con balsas.
25. El méíodo de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, en el que dicho ageníe modulador de los receptores de quimioquinas inhibe la formación de los dominios de membrana con balsas y/o los disocia.
26. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25, en el que dicho inhibidor de Rho-A GTPasa es una esíaíina.
27. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 26, en el que el méíodo comprende además la administración independiente, secuencial o simulíánea de uno o más de los ageníes.
28. Un método de traíamienío de un mamífero que padece una infección por HIV, una infección por un reíroviras genéticamente relacionado con el HIV, o SIDA, previniendo la acumulación de recepíores para HIV en los dominios con balsas, que comprende proporcionar un recepíor para ciíoquinas muíante, dirigido a dominios sin balsas.
29. El méíodo según la reivindicación 28, en el que dicho recepíor muíante une a HIV pero éste no eníra en los dominios con balsas.
PCT/ES2004/000188 2003-04-30 2004-04-30 PREVENCIÓN DE UNA INFECCIÓN POR HIV-1 MEDIANTE LA INHIBICIÓN DE LA REORGANIZACIÓN Y/O LA ALTERACIÓN DE LOS CONTENIDOS DE LOS DOMINIOS CON BALSAS DE LA MEMBRANA CELULAR, MEDIADAS POR Rho WO2004096194A2 (es)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MXPA05011714A MXPA05011714A (es) 2003-04-30 2004-04-30 Prevencion de una infeccion por hiv-1 mediante la inhibicion de la reorganizacion y/o la alteracion del contenido de los dominios con balsas de la membrana celular, mediadas por rho.
EP04730557A EP1618874A2 (en) 2003-04-30 2004-04-30 Prevention of hiv-1 infection by inhibition of rho-mediated reorganisation and/or content alteration of cell membrane raft domains
CA002522089A CA2522089A1 (en) 2003-04-30 2004-04-30 Prevention of hiv-1 infection by inhibition of rho-mediated reorganization and/or content alteration of cell membrane raft domains
BRPI0409822-6A BRPI0409822A (pt) 2003-04-30 2004-04-30 inibidor de isoprenilação de proteìna ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou derivado do mesmo, respectivo uso e métodos de tratamento de mamìfero
US10/581,903 US20070082942A1 (en) 2003-04-30 2004-04-30 Prevention of hiv-1 infection by inhibition of rho-mediated reorganization and/or content alteration of cell membrane raft

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US46642903P 2003-04-30 2003-04-30
US60/466,429 2003-04-30

Publications (3)

Publication Number Publication Date
WO2004096194A2 true WO2004096194A2 (es) 2004-11-11
WO2004096194A9 WO2004096194A9 (es) 2005-01-20
WO2004096194A3 WO2004096194A3 (es) 2005-05-06

Family

ID=33418378

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2004/000188 WO2004096194A2 (es) 2003-04-30 2004-04-30 PREVENCIÓN DE UNA INFECCIÓN POR HIV-1 MEDIANTE LA INHIBICIÓN DE LA REORGANIZACIÓN Y/O LA ALTERACIÓN DE LOS CONTENIDOS DE LOS DOMINIOS CON BALSAS DE LA MEMBRANA CELULAR, MEDIADAS POR Rho

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20070082942A1 (es)
EP (1) EP1618874A2 (es)
BR (1) BRPI0409822A (es)
CA (1) CA2522089A1 (es)
MX (1) MXPA05011714A (es)
WO (1) WO2004096194A2 (es)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5804545B2 (ja) * 2009-11-25 2015-11-04 学校法人 創価大学 胚様体分化制御剤
EP3200826B1 (en) * 2014-09-30 2021-04-21 Vecht-lifshitz, Susan Eve Pharmaceutical compositions for treating ebola virus disease

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993024660A1 (en) * 1992-05-29 1993-12-09 The Regents Of The University Of California Method for inhibition of viral morphogenesis
WO2000002558A1 (fr) * 1998-07-08 2000-01-20 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques (S.C.R.A.S.) Utilisation d'inhibiteurs de prenyltransferases pour preparer un medicament destine a traiter les pathologies qui resultent de la fixation membranaire de la proteine g heterotrimerique
WO2000047196A2 (en) * 1999-02-11 2000-08-17 Hollis-Eden Pharmaceuticals, Inc. Use of statins for treating viral infections
US20020142940A1 (en) * 2000-10-17 2002-10-03 Graham Barney Scott Method of inhibiting viral infection using HMG-COA reductase inhibitors and isoprenylation inhibitors
WO2003039477A2 (en) * 2001-11-07 2003-05-15 U.S. Army Medical Research Institute Of Infections Diseases Department Of The Army Generation of virus-like particles and demonstration of lipid rafts as sites of filovirus entry and budding

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993024660A1 (en) * 1992-05-29 1993-12-09 The Regents Of The University Of California Method for inhibition of viral morphogenesis
WO2000002558A1 (fr) * 1998-07-08 2000-01-20 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques (S.C.R.A.S.) Utilisation d'inhibiteurs de prenyltransferases pour preparer un medicament destine a traiter les pathologies qui resultent de la fixation membranaire de la proteine g heterotrimerique
WO2000047196A2 (en) * 1999-02-11 2000-08-17 Hollis-Eden Pharmaceuticals, Inc. Use of statins for treating viral infections
US20020142940A1 (en) * 2000-10-17 2002-10-03 Graham Barney Scott Method of inhibiting viral infection using HMG-COA reductase inhibitors and isoprenylation inhibitors
WO2003039477A2 (en) * 2001-11-07 2003-05-15 U.S. Army Medical Research Institute Of Infections Diseases Department Of The Army Generation of virus-like particles and demonstration of lipid rafts as sites of filovirus entry and budding

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARGYRIS E G ET AL: "Human Immunodeficiency Virus Type 1 Enters Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells by a Mechanism Involving Cell Surface Proteoglycans Independent of Lipid Rafts" JOURNAL OF VIROLOGY 2003 UNITED STATES, vol. 77, no. 22, 2003, pages 12140-12151, XP008036228 ISSN: 0022-538X *
DATABASE BIOSIS [Online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; diciembre 2002 (2002-12), NALBONE GILLES ET AL: "[Pleiotropic effects of statins: Implications in the treatment of cardiovascular diseases.]" XP002298999 Database accession no. PREV200300146776 & M-S (MEDECINE SCIENCES), vol. 18, no. 12, diciembre 2002 (2002-12), pages 1257-1265, ISSN: 0767-0974 *
DEL REAL G ET AL: "Statins inhibit HIV-1 infection by down-regulating Rho activity" JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE 16 AUG 2004 UNITED STATES, vol. 200, no. 4, 16 agosto 2004 (2004-08-16), pages 541-547, XP008036231 ISSN: 0022-1007 *
GOWER T L ET AL: "Antiviral activity of lovastatin against respiratory syncytial virus in vivo and in vitro" ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, (APR 2001) VOL. 45, NO. 4, PP. 1231-1237. PUBLISHER: AMER SOC MICROBIOLOGY, 1752 N ST NW, WASHINGTON, DC 20036-2904 USA. ISSN: 0066-4804., abril 2001 (2001-04), XP008036221 *
MANES SANTOS ET AL: "Membrane raft microdomains mediate lateral assemblies required for HIV-1 infection" EMBO REPORTS, vol. 1, no. 2, agosto 2000 (2000-08), pages 190-196, XP008036256 ISSN: 1469-221X cited in the application *
MAZIERE J C ET AL: "LOVASTATIN INHIBITS HIV-1 EXPRESSION IN H9 HUMAN T LYMPHOCYTES CULTURED IN CHOLESTEROL-POOR MEDIUM" BIOMEDICINE AND PHARMACOTHERAPY, ELSEVIER, PARIS, FR, vol. 48, no. 2, 1994, pages 63-67, XP000965739 ISSN: 0753-3322 cited in the application *
See also references of EP1618874A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004096194A3 (es) 2005-05-06
MXPA05011714A (es) 2006-04-27
US20070082942A1 (en) 2007-04-12
BRPI0409822A (pt) 2006-05-09
EP1618874A2 (en) 2006-01-25
CA2522089A1 (en) 2004-11-11
WO2004096194A9 (es) 2005-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Clercq New anti‐HIV agents and targets
De Clercq HIV-chemotherapy and-prophylaxis: new drugs, leads and approaches
Pereira et al. Anti-HIV drug development-an overview
WO2006077427A2 (en) Antiviral drug combinations
US20030229105A1 (en) Treatment of autoimmune disorders
Shah et al. Recent updates for designing CCR5 antagonists as anti-retroviral agents
US20090253665A1 (en) Method of treatment of disease using an adenosine a1 receptor antagonist and an aldosterone inhibitor
US9682994B2 (en) Inhibitors of retroviral replication
US20160008339A1 (en) Psoralen derivatives for preventing or treating heart failure or cardiac hypertrophy
WO2004096194A2 (es) PREVENCIÓN DE UNA INFECCIÓN POR HIV-1 MEDIANTE LA INHIBICIÓN DE LA REORGANIZACIÓN Y/O LA ALTERACIÓN DE LOS CONTENIDOS DE LOS DOMINIOS CON BALSAS DE LA MEMBRANA CELULAR, MEDIADAS POR Rho
Provencher et al. Antiviral drugs that target cellular proteins may play major roles in combating HIV resistance
US20040162298A1 (en) Method of treating HIV infection by preventing interaction of CD4 and gp120
WO1997037661A1 (fr) Medicament de prevention et de traitement des infections virales
US20230100235A1 (en) Anticancer agent composition
US20160159778A1 (en) Novel ureido derivatives of naphthalenesulfonic acids
JP2022544803A (ja) 筋肉消耗及び他の状態の治療及び予防に好適な化合物
Patel et al. Recent patents and emerging therapeutics for HIV infections: a focus on protease inhibitors
WO2020112935A1 (en) Methods of treating disease with dichlorphenamide
CA2881967C (en) Inhibitors of protein phosphatase-1 and uses thereof
US20240082235A1 (en) Method for treating or inhibiting cytomegalovirus infection using small molecules targeting protein phosphatase 1
Uckun et al. Therapeutic innovations against HIV
US20220071955A1 (en) Methods of Treatment, Prevention and Diagnosis
US20230127965A1 (en) Methods for treating, ameliorating, or preventing viral infections
JP2018508518A (ja) Ｈｉｖ感染の処置のための方法及び医薬組成物
KR20000053123A (ko) (4ｒ,5ｓ,6ｓ,7ｒ)-헥사히드로-1-[5-(3-아미노인다졸)메틸]-3-부틸-5,6-디히드록시-4,7-비스[페닐메틸]-2ｈ-1,3-디아제핀-2-온,이의 제조 방법 및 ｈｉｖ 프로테아제 억제제로서의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
COP Corrected version of pamphlet

Free format text: PAGES 66-69, CLAIMS, REPLACED BY NEW PAGES 66-69; PAGES 2/9 AND 5/9-9/9, DRAWINGS, REPLACED BY NEW PAGES 2/9 AND 5/9-9/9; DUE TO LATE TRANSMITTAL BY THE RECEIVING OFFICE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004730557

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2522089

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006505606

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: PA/a/2005/011714

Country of ref document: MX

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004730557

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI0409822

Country of ref document: BR

DPEN Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007082942

Country of ref document: US

Ref document number: 10581903

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2004730557

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10581903

Country of ref document: US