WO2004081209A1 - 植物細胞壁形成を制御する遺伝子群 - Google Patents

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WO2004081209A1
WO2004081209A1 PCT/JP2004/002151 JP2004002151W WO2004081209A1 WO 2004081209 A1 WO2004081209 A1 WO 2004081209A1 JP 2004002151 W JP2004002151 W JP 2004002151W WO 2004081209 A1 WO2004081209 A1 WO 2004081209A1
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plant
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Takashi Hibino
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Oji Paper Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Definitions

  • the present invention relates to a gene that controls plant cell wall component biosynthesis and wood fiber cell morphogenesis, and use thereof.
  • Oji Paper is aiming for an afforestation area of 200,000 ha by 2010, and is conducting it in a wide area centering on the Pacific Rim, such as Oceania and Southeast Asia. This is nothing less than advancing the recycling of biomass (biomass recycling), which involves the industrial use and regeneration of biomass by conducting large-scale afforestation at the business level.
  • the quantity and quality of cell wall components (cellulose, hemicellulose and lignin), which are essential, can be varied. If the fiber morphology (elongation of wood fiber cells) can be freely changed, it is expected that the quantity and quality of woody biomass will be increased. It is expected that the use of raw materials as raw materials will expand, and it can be expected to replace fossil raw materials in various fields.
  • Non-Patent Document 1 a gene for a glycosyltransferase that is thought to catalyze the binding of [3-1,4] glucan, which is the basic skeleton of cellulose, was reported (for example, Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 3 microarray analysis of differences in vascular tissue development stages analyzed the genes specific to wood formation, especially the secondary wall synthesis of cell walls. Found (Non-Patent Document 3).
  • Patent Document 3 no significant progress has been made in research on the regulation of the overall mechanism of cellulose biosynthesis.
  • Patent Document 1 Special Table 2002-510961 [Non-Patent Document 1] GenomeBiol. 2002; 3 (12): REVIEWS1033.
  • Non-Patent Document 2 Burn et al. Plant Physiol. 129, 797-807, 2002.
  • Non-patent Document 3 J Hertzberg M, Aspeborg H, Schrader J, Andersson A, Erlandsson R, Blomqvist K, Bhalerao R, Uhlen M, Teeri TT, Lundeberg J, Sundberg B, Nilsson P, Sandberg G. A transcriptional roadmap to wood formation. Proc Natl Acad Sci US A. 2001 Dec; 98 (25): 14732 7. Epub 2001 Nov 27.
  • Non-Patent Document 4 Szyjanowicz PM, McKinnon I, Taylor NG, Gardiner J, Jarvis MC, Turner SR.
  • the irregular xylem 2 mutant is an allele of korrigan tha t affects the secondary cell wall of Arabidopsis thaliana.Plant J. 2004 Mar. ; 37 (5): 730-40.
  • Non-Patent Document 5 Nakazono M, Qiu F, Borsuk LA, Schnable PS.Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in spe cific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of Maize. Plant Cell. 2003 Mar; 15 (3): 583-96. Erratum in: Plant Cell. 2003 Apr; 15 (4): 1049.
  • Non-Patent Document 6 Israelsson M, Eriksson ME, Hertzberg M, Aspeborg H, Nilss on P, Moritz T. Changes in gene expression in the wood-forming tissue of transgenic hybrid aspen with increased secondary growth. Plant ol Biol. 2003 Jul ; 52 (4): 893-903.
  • Non-Patent Document 7 Gardiner JC, Taylor NG, Turner SR.Control of cellulose synthase complex localization in developing xylem.Plant Cell.2003 Aug; 15 (8): 1740-8.
  • Non-Patent Document 8 Moller R, McDonald AG, Walter C, Harris PJ.Cell differen tiation, secondary cell-wall formation and transformation of ca ⁇ ⁇ us tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 2003 Sep; 217 ( 5): 736-47Epub 2003 Jun 13.
  • Joshi CP Xylem-specific and tension stress-responsive ex press ion of cellulose synthase genes from aspen trees.Appl Biochem Biotechnol. 2003 Spring; 105-108: 17-25.
  • Patent Literature 10 Li L, Zhou Y, Cheng X, Sun J, Marita JM, Ralph J, Chian VL.Combinatorial modification of multiple lignin traits in trees throu gh multigene cotransformation.Proc Natl Acad Sci US A. 2003 Apr 15 ; 100 (8): 4939-44. Epub 2003 Mar 31.
  • Non-Patent Document 11 Lorenz WW, Dean JF.SAGE profiling and demonstration of differential gene expression along the axial developmental gradient or ⁇ ignifying xylem in loblolly pine (Pinus taeda) .Tree Physiol. 2002 Apr; 22 (5): 301 -Ten.
  • Non-Patent Document 1 2 Deraura T, Tashiro G, Horiguchi G, Kishimoto N, Kubo M, Matsuoka N, Minami A, Nagata—Hiwatashi M, Nakamura K, Okamura Y, Sassa N,
  • Non-Patent Document 13 Aharoni A, Keizer LC, Van Den Broeck HC, Blanco- Portales s R, Munoz- Blanco J, Bois G, Smit P, De Vos RC, 0 'Connell AP.Novel insig ht into vascular, stress, and auxin-dependent and— independent gene expression programs in strawberry, a non-climacteric fruit. Plant Physio ⁇ . 2002
  • Japan is scarce in resources and still depends on fossil resources such as oil and natural gas.
  • woody poma The key to that is the recycling of trees as a resource.
  • genomic science has begun on genomic science as a national project, with f-pine and deciduous pine and hardwood poplars in the United States, spruce and poplar in Canada, and poplar in Northern Europe.
  • genetic engineering-related basic technologies for major crops related to food production are ahead of the US and Europe.
  • Japan will be at least as good as other nations as a technological nation, and will be responsible for the production of circulating materials by utilizing woody pyomas on a global scale. The need to identify genes that control formation is very high.
  • the present invention provides a gene that controls plant cell wall component biosynthesis and wood fiber cell morphogenesis, a plasmid containing the same, and a plant cell, microorganism, or plant transformed with the plasmid. To provide the body.
  • the present inventors have carried out microarray analysis to extract genes that are specifically expressed in the material forming tissue for Yuri. As a result, they were broadly classified into genes with high expression, low genes, and genes with almost no change in expression in Eucalyptus timber compared to normal stems. Genes that are highly expressed or low in the expression of Eururi wood can be used to control cell wall component biosynthesis and wood fiber cell morphogenesis. In particular, genes that are highly expressed in eucalyptus wood are involved in cell wall component biosynthetic oocyte fiber cell morphogenesis, and promote cell wall component biosynthetic oocyte fiber cell morphogenesis. It can be used for
  • the gene group for controlling cell wall component biosynthesis and wood fiber cell morphogenesis obtained according to the present invention, and the technology for controlling them comprehensively, are one of the results of using these gene groups.
  • Various quantitative and qualitative changes, such as high cellulose, low ligyun, thick or thin cell walls, long or short fiber length, are expected depending on the characteristics of the new genetically modified eucalyptus varieties obtained. .
  • the present invention relates to genes that regulate plant cell wall component biosynthesis and wood fiber cell morphogenesis, and uses thereof, and provide the following [1] to [14].
  • [7] A promoter DNA of the DNA according to any one of [1] to [5].
  • [10] contains the promoter DNA of [7] or the vector of [9].
  • the present inventor has found a DNA whose expression increases or decreases in a tissue forming a material to which Yuriri is applied. It is known that cell wall component biosynthesis and oocyte fiber cell morphogenesis are performed in plant wood and wood tissue. (A review of wood is always described in specialized books on wood. However, regarding eucalyptus, a paper by Baba et al. (Mokuzai Gakkaishi 42, 795-798, 1996) describes detailed data on chemical and histological properties). The present invention, based on the above findings, provides a DNA whose expression increases or decreases during cell wall component biosynthesis and wood fiber cell morphogenesis of plants.
  • DNA of the present invention whose expression is increased or decreased during plant cell wall component biosynthesis and wood fiber cell morphogenesis can be used for control of plant cell wall component biosynthesis and wood fiber cell morphogenesis.
  • DNA whose expression is increased during cell wall component biosynthetic plant fiber cell morphogenesis of plants is involved in plant cell wall component biosynthetic plant fiber cell morphogenesis, It can be used to promote biosynthetic wood fiber cell morphogenesis.
  • DNA, whose expression decreases during plant cell wall component biosynthesis and wood fiber cell morphogenesis suppresses genes involved in cell wall component biosynthesis and wood fiber cell morphogenesis basically by some system. By doing so, it is possible that some tissues may be involved in controlling the time-specific expression. Therefore, it is considered that these can be utilized for promoting cell wall component biosynthesis and morphogenesis of wood fiber by artificially reducing them.
  • Controlling cell wall component biosynthesis and wood fiber cell morphogenesis in plants has various important implications in the fields of industry and agriculture.
  • plant cell wall components The improvement in the production of cellulose and hemicellulose will contribute to the supply of excellent fiber raw materials such as pulp and the like, and the improvement of the efficiency of digestion and absorption of useful agricultural and forage crops. It is.
  • the structural change of the polysaccharide, which is a cell wall component can lead to the production of raw material plants having new industrial value.
  • modification of the cell morphology is significant in terms of improving the fiber properties of fiber raw materials such as pulp.
  • the DNA of the present invention whose expression is increased or decreased during cell wall component biosynthesis and wood fiber cell morphogenesis of the plant, identifies cells and tissues in which cell wall component biosynthesis and wood fiber cell morphogenesis are performed. It can also be used as a specific marker for
  • the plant from which the DNA of the present invention is derived is not particularly limited, and examples thereof include useful agricultural crops (including forage crops) such as cereals, vegetables, and fruit trees, fiber raw material plants such as pulp, and ornamental plants such as houseplants.
  • useful agricultural crops including forage crops
  • ornamental plants such as houseplants.
  • the plant such as eucalyptus, mackerel, acacia, poplar, cedar, cypress, bamboo, yew, rice, corn, wheat, barley, rye, potato, tobacco, sugar beet, sugar cane, rapeseed, soybean, Sunflower, ivy, orange, grape, peach, pear, apple, tomato, Chinese cabbage, cabbage, radish, carrot, capochiya, kiuri, melon, parsley, orchid, chrysanthemum, lily, saffron, etc. can be exempl
  • Examples of the DNA of the present invention include a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 1731.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 862 is expressed during plant cell wall component biosynthesis and wood fiber cell morphogenesis Is DNA that rises.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 863 to: 1731 during plant cell wall component biosynthesis and wood fiber cell morphogenesis This is DNA whose expression is reduced.
  • Stringent hybridization conditions include: 0.1 in lxSSC solution. And a hybridization condition of stringency at 60 ° C. for one hour or the like. Under these conditions, SEQ ID NOS: 1-17
  • a DNA that hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence described in any of 31 above can be isolated.
  • DNA is extracted from a plant, a gene library is constructed, and screening is performed under the same conditions.
  • a 60-mer sequence (SEQ ID NOS: 1-173) is used for the extracted DNA. 1) can be used to easily obtain continuous neighboring sequences by using the TAIL-PCR method established by Liu et al. .
  • the present invention relates to the following: A protein having 50% or more homology with a protein consisting of an amino acid sequence encoded by a DNA hybridizing under stringent conditions with a DNA consisting of the nucleotide sequence of any one of 1 to 1731 DNA to provide.
  • DNA can be isolated by those skilled in the art by generally known methods. For example, hybridization technology (Sou thern, EM., J Mol Biol, 1975, 98, 503.) and polymerase chain reaction (PCR) technology (Saiki, RK. Et al., Science, 1985, 230, 1350 , Saiki, RK. Et al., Science 1988, 239, 487.).
  • Isolation of DNA having high homology to DNA that hybridizes under stringent conditions to DNA consisting of the described base sequence can be usually performed by those skilled in the art. In order to isolate such DNA, a hybridization reaction is preferably performed under stringent conditions.
  • Stringent hives in the present invention refer to the conditions of 6 M urea, 0.4% SDS, 0.5 X SSC or equivalent stringency hybridization conditions. Under conditions of higher stringency, for example, 6M urea, 0.4% SDS, and IX SSC, it is expected that more homologous DNA can be isolated.
  • the DNA isolated in this manner has a high amino acid level at the amino acid level from the DNA consisting of the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 1731 and the amino acid sequence encoded by the DNA hybridizing under stringent conditions. It is considered to have homology.
  • High homology refers to at least 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, and most preferably 98% or more of the entire amino acid sequence. % Or more sequence identity.
  • DNAs also include degenerate mutants of DNAs that hybridize under stringent conditions to DNAs consisting of the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 1731.
  • the DNA of the present invention includes an amino acid sequence encoded from a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 1731, or Amino acid sequence protein and more than 50% It includes DNA encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, added, and / or inserted in an amino acid sequence having homology.
  • Amino acid alterations in proteins are usually within 50 amino acids of all amino acids, preferably within 30 amino acids, more preferably within 10 amino acids, and even more preferably within 3 amino acids.
  • Amino acid modification can be performed using, for example, “Transformer Site-directed Mutagenesis KitJ” or “ExSite PCR-Based Site-directed Mutagenesis Kit” (manufactured by Clontech) for mutation substitution. In the case of deletion, the deletion can be performed using a “Quantum leap Nested Deletion Kit” (manufactured by Clontech).
  • the mutation may not be accompanied by mutation of an amino acid in the protein (degenerate mutation), and such a degenerate mutant DNA is also included in the present invention.
  • the DNA of the present invention is not particularly limited as long as it can encode the protein of the present invention, and includes genomic DNA, cDNA, chemically synthesized DNA, and the like.
  • the genomic DNA is, for example, a genomic DNA prepared according to the method described in the literature (Rogers and Bendich, Plant Mol. Biol., 1985, 5, 69.) as type III, and the nucleotide sequence of the DNA of the present invention (for example, Prepared by performing PCR (Saiki et al. Science, 1988, 239, 487.) using a primer prepared based on SEQ ID NO: 1 to 1731). Is possible.
  • cDNA the mRNA is transcribed from the plant by a conventional method (Maniatis et al.
  • Genomic DNA and cDNA can be prepared using standard methods. A library or a cDNA library was prepared, and this library was synthesized based on, for example, the nucleotide sequence of the DNA of the present invention (for example, the nucleotide sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 1731). It can also be prepared by screening using a probe. The nucleotide sequence of the obtained DNA can be easily determined by using, for example, “Sequencer Model373” (manufactured by Disha).
  • the present invention also provides a promoter DNA of the DNA of the present invention.
  • promoter DNA include a promoter DNA linked to a gene specifically expressed in the cell wall formation of a plant, particularly a tree, and Z or in the biosynthesis of cellulose obtained by the present invention.
  • promoter DNAJ refers to a DNA containing a specific base sequence required to initiate the synthesis (transcription) of mRNA whose DNA is type II, which includes not only naturally occurring DNA but also recombinant DNA. Includes DNA created by artificial modification operations such as
  • the promoter of the present invention can be produced and used as follows, for example.
  • DNA is extracted and purified from the target eucalyptus plant tissue.
  • various methods can be used, and a commercially available kit, for example, an IS0PLANT kit (manufactured by Nippon Gene) or the like can be used.
  • oligonucleotides are prepared from any two locations and used as a primer in a PCR method.
  • genomic DNA corresponding to the selected Yuri cDNA can be easily produced.
  • the upstream DNA of the gene is obtained by PCR using an oligonucleotide primer prepared based on the nucleotide sequence of the gene (Inverse-PCR, anchor PCR, TAIL-PCR (supervised by Isao Shimamoto et al.
  • Genomic DNA library is DNA extracted from Yuriri; in addition to various LDNA-derived vectors, cosmid vectors, TAC vectors (Liu et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 96). : P6535) and transformed into Escherichia coli.
  • Hybridization technology can be used to screen the genomic DNA library.
  • a sequence of a human cDNA that has been successfully isolated by the present inventors can be used.
  • the above genomic DNA library is screened to isolate a clone containing a DNA sequence homologous to the gene. Create a restriction enzyme cleavage map, determine the nucleotide sequence, etc., clarify the structure of the cloned DNA, and identify the sequence existing upstream of the gene.
  • This upstream sequence contains the TATA box sequence and is preferably at least several hundred bp to several kbp in size. This sequence is cut out with an appropriate restriction enzyme, and subcloned as necessary into another plasmid vector or the like.
  • the promoter activity of the above sequence can be analyzed as follows. For example, a vector containing a reporter gene such as ⁇ is used, and subcloning is performed so that the above sequence is ligated upstream of the reporter gene. p
  • Escherichia coli ⁇ -dalcuronidase is used as the reporter gene in the BI101 vector.
  • This gene product uses 5-bromo-4-chloro-3--Dg lucronic acid (X-glue) as a substrate, decomposes it, and produces indig otin, a blue precipitate. It is possible to monitor at the level.
  • X-glue 5-bromo-4-chloro-3--Dg lucronic acid
  • 4MUG 4-methyl-umbelliferyl- -D-glucronide
  • gene expression can be quantified by fluorescence generated by the action of the gene product.
  • a chloramphenicol acetyltransferase gene in addition to the GUS gene, a chloramphenicol acetyltransferase gene, a luciferase gene, a green fluorescein protein gene and the like can be used.
  • the chimeric gene construct prepared as described above can be introduced into a plant such as Arabidopsis thaliana via an agrobacterium to analyze its function.
  • a recombinant plasmid containing a chimeric gene is introduced into, for example, the MP90 strain of Agrobacterium ppmefaciens using the electroporation method, and the resulting transformant is subjected to, for example, Infects Arabidopsis thaliana plants by the Flora Dip method (supervised by Isao Shimamoto et al., “Experimental Protocol for Model Plants” (Plant Cell Science Separate Volume, Plant Cell Engineering Series 4) Shujunsha, April 1996).
  • Seeds obtained from the infected plants are sown on a medium containing a drug such as kanamycin based on the vector used to obtain a transformant or substance which has become drug-resistant by gene transfer.
  • the expression of the reporter GUS gene is analyzed using the transformation and the object.
  • the promoter of the present invention or an expression vector containing the same can be used as follows.
  • An expression vector is constructed by inserting a chimeric gene in which a gene of interest, for example, a gene involved in a certain osmotic stress response is linked downstream of the promoter of the present invention, into, for example, a ⁇ vector. This vector is introduced into, for example, a tobacco plant via an agrobacterium.
  • the gene of the present invention is expected to be expressed in roots under osmotic stress environment by the action of the promoter of the present invention, and to be able to grow even in salty or arid areas. In this case, since there is no phenomenon of expression in an unnecessary tissue such as the 35S promoter, it is expected that other unfavorable traits will not appear.
  • the gene that can be controlled by the promoter of the present invention is not limited to the specific gene described above.
  • the function of the promoter of the present invention can be modified by linking another expression control sequence to the promoter of the present invention.
  • expression control sequences include enhancer sequences, repressor sequences, insulator sequences, and the like.
  • the promoter of the present invention contains, as functional characteristics, several cis element sequences that regulate the expression of genes involved in cell wall biosynthesis in a stem-specific manner. It is.
  • a part of the promoter of the present invention can be inserted and linked to another promoter to modify the function of one of the promoters.
  • the present invention also provides a DNA for suppressing the expression of a DNA encoding a protein that controls plant cell wall component biosynthesis and wood fiber cell morphogenesis.
  • Preferred embodiments of the DNA for suppressing the expression of the endogenous gene include a DNA encoding an antisense RNA complementary to the transcription product of the DNA of the present invention, and a specific cleavage of the transcription product of the DNA of the present invention.
  • DNA encoding the protein or the like can be exemplified.
  • the “suppression of expression of an endogenous gene” includes suppression of transcription of a gene and suppression of translation into Z or a protein encoded by the gene. It also includes a complete cessation of expression of the gene as well as a
  • the action of the antisense nucleic acid to suppress the expression of the target gene has several factors as follows. In other words, inhibition of transcription initiation by triplex formation and formation of a hybrid with the site where an open loop structure was locally formed by RNA polymerase. Inhibition, transcription inhibition by hybrid formation with RNA, which is undergoing synthesis, splicing inhibition by hybridization at the junction of intron and exon, splicing inhibition by hybridization with spliceosome formation site, hybridization with raRNA Inhibits translocation from the nucleus to the cytoplasm, inhibits splicing by forming a hybrid with the capping site or poly (A) addition site, inhibits translation initiation by forming a hybrid with the translation initiation factor binding site, and binds with the ribosome binding site near the start codon Inhibition of translation by hybrid formation, inhibition of peptide chain elongation by hybrid formation with mRNA translation region--polysome binding site, and inhibition of gene expression by hybrid formation with interaction site between nucle
  • antisense nucleic acids suppress target gene expression by inhibiting various processes such as transcription, splicing and translation (Hirashima and Inoue, Shinsei Kagaku Kenkyusho 2 Nucleic acid IV gene replication and expression, Japan Biochemical Society, Tokyo Chemical Dojin, 1993, 319-347.)
  • the antisense sequence used in the present invention may suppress the expression of the target gene by any of the actions described above.
  • designing an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 'end of the mRNA of a gene is considered to be effective in inhibiting translation of the gene.
  • a sequence complementary to the coding region or the 3′-side untranslated region can also be used.
  • the DNA containing the antisense sequence of the sequence of the untranslated region as well as the translated region of the gene is also included in the antisense DNA used in the present invention.
  • the antisense DNA to be used is ligated downstream of an appropriate promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is ligated on the 3 ′ side.
  • the DNA thus prepared can be transformed into a desired plant by using a known method.
  • the sequence of the antisense DNA is preferably a sequence complementary to the endogenous gene of the transformed plant or a part thereof, but it is not completely complementary as long as gene expression can be effectively suppressed. You may.
  • the transcribed RNA has preferably 90% or more, and most preferably 95% or more complementarity to the target gene transcript. You.
  • the length of the antisense DNA is at least 15 bases, preferably at least 100 bases, and more preferably at least 500 bases. .
  • the length of commonly used antisense DNA is shorter than 5 kb, preferably shorter than 2.5 kb.
  • Ribozyme refers to an RNA molecule having catalytic activity. There are various types of ribozymes with various activities. Research focused on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made it possible to design ribozymes that cleave RNA in a site-specific manner.
  • Some ribozymes have a size of 400 nucleotides or more, such as Ml RNA contained in the double-I intron type RNase P, but the hammerhead type ⁇ the active domain of about 40 nucleotides called the hairpin type Others have the following (Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, Protein Nucleic Acid Enzyme, 1990, 35, 2191.).
  • the self-cleaving domain of the hammerhead ribozyme cleaves the 3 'side of C15 in the sequence G13U14C15, but its activity requires the formation of base pairs between U14 and A9, and A15 instead of C15
  • U15 can also be cleaved
  • a ribozyme whose substrate binding site is complementary to the RNA sequence near the target site, it is possible to create a restriction-enzymatic RNA-cleaving ribozyme that recognizes the sequence UC, UU or UA in the target RNA.
  • Hairpin ribozymes are also useful for the purpose of the present invention.
  • This ribozyme is found, for example, on the minus strand of satellite RNA of tobacco ring spot virus. (Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.). It has been shown that target-specific RNA-cleaving ribozymes can also be produced from hairpin ribozymes (Kikuchi, Y. & Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751., Hiroshi Kikuchi, Chemistry and Biology, 1992, 30, 112.).
  • the ribozyme designed to cleave the target is ligated to a promoter such as the cauliflower mosaic virus 35S promoter and a transcription termination sequence so that it can be transcribed in plant cells. At this time, if an extra sequence is added to the 5 'end or 3' end of the transcribed RNA, the lipozyme activity may be lost 1%.
  • another trimming ribozyme that acts in cis can be placed at the 5 'or 3 side of the lipozyme portion (Taira, K. et al.) , Protein Eng, 1990, 3, 733., Dzianott, AM.
  • RNAi RNA interference
  • Suppression of endogenous gene expression can also be performed by RNA interference (RNAi) using double-stranded RNA having a sequence identical or similar to the target gene sequence.
  • RNAi refers to the phenomenon in which the expression of a foreign gene and a target endogenous gene introduced into a cell is suppressed when a double-stranded RNA having a sequence identical or similar to the target gene sequence is introduced into cells. Point. Although the details of the mechanism of RNAi are not clear, it is thought that the target gene is degraded when the initially introduced double-stranded RNA is broken down into small pieces and serves as an indicator of the target gene in some way. I have.
  • R NAi is also known to be effective in plants (Chuang, CF.
  • RNAi in order to suppress the expression of DNA that encodes a protein that regulates plant cell wall component biosynthesis and wood fiber cell morphogenesis in a plant by RNAi, the sequence of SEQ ID NO: 1 to 1731 Any of the base sequences described in any of the above or a double-stranded RNA having a sequence similar thereto may be introduced into a target plant.
  • the gene used for RNAi need not be completely identical to the target gene, but at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more sequence identity. Having.
  • the identity of the sequence can be determined by the method described above.
  • Co-suppression of endogenous gene expression can also be achieved by co-suppression caused by transformation of DNA having a sequence identical or similar to the target gene sequence.
  • ⁇ Co-suppression '' is a phenomenon in which when a gene having the same or similar sequence as the target endogenous gene is introduced into a plant by transformation, the expression of both the introduced foreign gene and the target endogenous gene is suppressed. Point to. Although the details of the mechanism of co-suppression are not clear, it is believed that at least some of the mechanisms overlap with those of RNAi. Co-suppression is also observed in plants (Smyth, DR., Curr Biol, 1997, 7, R793., Martienssen, R., Curr Biol, 1996, 6, 810.).
  • the DNA or a DNA having a sequence similar thereto is required.
  • the vector may be transformed into a target plant using the vector DNA prepared so as to be able to express E. coli.
  • the gene used for co-suppression need not be exactly the same as the target gene, but it should have at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more sequences. Have identity.
  • the sequence identity can be determined by the above-described method.
  • the suppression of the expression of the endogenous gene in the present invention is achieved by encoding a protein having a dominant negative trait with respect to the protein encoded by the target gene. This can also be achieved by transforming the gene into a plant.
  • a “gene encoding a protein having a dominant negative trait” is a gene having a function of eliminating or reducing the activity of an endogenous wild-type protein inherent in a plant by expressing the gene. Refers to.
  • the present invention provides a recombinant vector containing the above DNA.
  • the vector of the present invention is not particularly limited as long as it contains a promoter sequence that can be transcribed in plant cells and a terminator sequence that includes a polyadduction site necessary for stabilizing the transcript.
  • a shuttle vector that can be amplified by both E. coli and Agrobacterium, such as ⁇ (Clontech).
  • a plant virus for example, a cauliflower mosaic virus can be used as a vector.
  • the vector of the present invention can be obtained, for example, by binding or inserting a promoter DNA of the present invention or a promoter DNA for constitutively or inducibly expressing a desired gene into a predetermined portion of the vector.
  • the method for inserting a promoter into a vector follows the method for inserting a normal gene into a vector.
  • An expression vector for gene expression can be obtained by operably connecting a desired gene to the promoter of the recombinant vector.
  • promoters for constitutive expression include a cauliflower mosaic virus 35S promoter (Odell et al., Nature, 1985, 313, 810.) and a rice actin promoter (Zhang et al., Plant Cell, 1991, 3, 1155.) and corn ubiquitin promoter (Cornejo et al., Plant Mol. Biol., 19993, 23, 567.). Promoters for inducible expression are known to be expressed by external factors such as infection or invasion of filamentous fungi, bacteria, and viruses, low temperature, high temperature, drying, irradiation with ultraviolet light, and spraying of specific compounds. Promoters and the like.
  • Such promoters include, for example, the rice chitinase gene expressed by infection or invasion of filamentous fungi, bacteria, and viruses. Promoter (Xu et al., Plant Mol. Biol., 1996, 30, 387.) and tobacco PR protein gene promoter (Ohshima et al., Plant Cell, 1990, 2, 9 5.) Rice rii p 19j gene promoter (Aguan et al., Mol.
  • Gen Genet., 1993, 240, 1. and the rice hsp80 and hsp72 gene promoters (Van Breusegem et al., Planta, 1994, 193, 57.), a promoter of the Arabidopsis “rabl6” gene induced by drought (Nundy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 1406). ), A promoter of the chalcone synthase gene of parsley induced by ultraviolet irradiation (Schulze-Lefert et al., EMB0 J., 1989, 8, 651.), a maize corn induced by anaerobic conditions.
  • the promoter of the inechinase gene and the promoter of the PR protein gene of tobacco are induced by specific compounds such as salicylic acid, and “rabl6” is induced by spraying the plant hormone abscisic acid.
  • the above-mentioned recombinant vector is introduced into cells together with a suitable selectable marker gene or a plasmid vector containing the selectable marker gene.
  • selectable marker genes used for this purpose include, for example, the hygromycin phosphotransferase gene, which is resistant to the antibiotic hygromycin, the neomycin phosphotransferase, which is flanked by kanamycin or gentamicin, and the herbicide phosphinothricin.
  • acetyltransferase gene There is a certain acetyltransferase gene.
  • the present invention also provides a transformed cell into which the vector of the present invention has been introduced.
  • the cells into which the vector of the present invention is introduced are no particular restrictions on the cells into which the vector of the present invention is introduced.
  • peach Plant cells such as pear, apple, tomato, Chinese cabbage, cabbage, radish, carrot, kabochiya, kiyuri, melon, parsley, orchid, chrysanthemum, lily, saffron, etc. Trees such as cypress, bamboo, and ichi are desirable.
  • the plant cells of the present invention include cells in a plant as well as cultured cells. Also includes protoplasts, shoot primordia, multiple shoots and hairy roots.
  • Various techniques can be used to introduce the expression vector into host plant cells. These techniques include methods for transforming plant cells with T-DNA using agrobacterium 'tumefaciens or agrobacterium rhizogenes as a transforming factor.
  • direct introduction into protoplasts electroporation method in which protoplasts are subjected to electric pulse treatment to introduce DNA into plant cells, fusion method of ribosomes with protoplasts, microinjection method, polyethylene glycol, etc.
  • the particle gun method and the like.
  • the target gene can be introduced into a plant by using a plant virus as a vector.
  • Available plant viruses include, for example, cauliflower mosaic virus. That is, first, the virus genome is inserted into an E. coli-derived vector or the like to prepare a recombinant, and then these target genes are inserted into the virus genome.
  • These target genes can be introduced into a plant by excision of the virus genome thus modified from the recombinant with a restriction enzyme and inoculating the plant (Hohn et al. (1982), Molecular). Biology of Plant Tumors (Academic Press New York) pp549, U.S. Pat. No. 4,407,956).
  • the method of introducing a vector into a plant cell or plant is not limited to these, but includes other possibilities.
  • a simple plasmid such as a pUC derivative can be used.
  • Gene of interest Depending on the method by which the DNA is introduced into the plant cells, other DNA sequences may be required. For example, when using a Ti or Ri plasmid for transformation of plant cells, the sequence at least on the right end of the T-DNA region of Ti However, it must be connected so that it is adjacent to the gene to be introduced.
  • Agrobacterium is used for transformation, the gene to be introduced must be cloned into a special plasmid, ie, an intermediate vector or a binary vector. Intermediate vectors are not replicated in Agrobacterium.
  • the intermediate vector is transferred into Agrobacterium by a helper plasmid or electroporation. Since the intermediate vector has a region homologous to the sequence of T-DNA, it is incorporated into the Ti or Ri plasmid of Agrobacterium by homologous recombination. Agrobacterium used as a host must contain the vir region. Usually, Ti or Ri plasmids contain a vir region, which allows T-DNA to be transferred to plant cells.
  • a binary vector can be replicated and maintained in Agrobacterium, so that when it is incorporated into Agrobacterium by a plasmid or electroporation, the vir region of the host By the action, the DNA on the binary vector can be transferred to the plant cells.
  • the intermediate vector or the binary vector thus obtained, and microorganisms containing the intermediate vector or the binary vector, such as Escherichia coli bacterium, are also an object of the present invention.
  • the present invention also provides a transformed plant regenerated from the above transformed plant cell, a transformed m3 ⁇ 4 object that is a progeny or a clone of the transformed object, and a propagation material of the transformed plant.
  • Such a transformed plant is a useful transformed body with altered cell wall components and cell morphogenesis.
  • the modification of the cell wall component in the present invention is not particularly limited, and various modifications such as high cellulose, low rigoon, thick or thin cell wall, long fiber length, and short fiber length are available. And qualitative changes. Examples of the modification of cell morphology include, but are not limited to, changes in cell elongation and changes in cell size (quantitative change in volume).
  • the transformed m3 ⁇ 4 body in the present invention is useful as a plant having new value, for example, an increase in plant growth due to an increase in cell wall synthesis, a change in fiber cell morphology, and an increase in useful components of agricultural crops. It is also useful as a plant with new value by developing new materials by controlling cell wall synthesis, increasing the digestion and absorption efficiency of forage crops, and changing fiber cell morphology.
  • the “transformed plant” is a plant having the above-mentioned transformed plant cell, and includes, for example, a transformed object regenerated from the above-mentioned transformed cell.
  • the method of regenerating an individual from transformed plant cells differs depending on the type of plant cells. For example, in rice, the method of Fujimura et al. (Fujiraura et al., Plant Tissue Culture Lett., 2, 74, 1995), and in corn, The method of Shillito et al. (Shillito et al., Bio / Technology, 7, 581, 1989), the method of potato, the method of Visser et al. (Visser et al., Theor. Appl.
  • the present invention has a gene that is specifically expressed in the formation of a cell wall of a plant, particularly a tree and / or specifically in the biosynthesis of cellulose, or a homolog thereof, or a promoter region linked to these genes.
  • An expression vector is introduced into a host cell to obtain a transformed cell, a transformed plant is regenerated from the transformed cell, and the resulting transformed plant is obtained from the plant seed. Includes the process of producing plants.
  • Transformation The process of obtaining plant seeds from an object includes, for example, transformation, rooting the object It refers to the process of harvesting from a medium, transplanting it into a pot filled with water-containing soil, growing it at a constant temperature, forming flowers, and finally forming seeds.
  • the step of producing a plant from seeds includes, for example, transformation; when the seeds formed on the object have matured, they are isolated, sown on watery soil, and grown under a constant temperature and illuminance. This refers to the process of producing a plant.
  • the presence of the introduced foreign DNA or nucleic acid in the transformed plant should be confirmed by the known PCR method or Southern hybridization method, or by analyzing the nucleotide sequence of the nucleic acid in the plant. Can be.
  • extraction of DNA or nucleic acid from the transformed m3 ⁇ 4 body can be carried out according to the known method of J. Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989).
  • an amplification reaction is performed using the nucleic acid extracted from the regenerated plant as described above as a type III.
  • the amplification reaction can also be carried out in a reaction mixture obtained by using, as a primer, a synthesized oligonucleotide having a base sequence appropriately selected according to the base sequence of the DNA of the present invention.
  • DNA denaturation, annealing, and extension reactions are repeated several tens of times to obtain an amplification product of a DNA fragment containing the DNA sequence of the present invention.
  • the reaction solution containing the amplification product is subjected to, for example, agarose electrophoresis, various amplified DNA fragments are fractionated, and it is possible to confirm that the DNA fragments correspond to the DNA of the present invention. .
  • progeny can be obtained from the plant by sexual or asexual reproduction.
  • a propagation material eg, seeds, fruits, cuttings, tubers, tubers, strains, calli, protoplasts, etc.
  • idanishi resources are used in large quantities as raw materials and fuel (energy) in industrial production.
  • energy energy
  • burning woody biomass directly is a routine practice in developing countries, but it is necessary to convert it into a more accessible form (alcohol: ethyl alcohol). It is thought that effective response is possible.
  • ethanol is produced by alcoholic fermentation from molasses derived from sugarcane juice in Brazil and other countries, and is used as automobile fuel.In the United States and the EU, the starch of sweet potato corn is hydrolyzed once.
  • glucose is obtained from the obtained lignocellulose as a raw material by an acid hydrolysis or enzymatic decomposition (cellulase) step, and then ethanol is fermented by alcohol fermentation. It can be produced in large quantities, and the basic technology of such a process has already been established. Furthermore, technology for producing biodegradable plastic (polylactic acid) from glucose as a raw material has already been established, and practical use on an industrial production scale is progressing using starches such as potatoes. In the future, however, it is expected that biomass derived from trees will become the mainstream in the future, replacing cereals as food.
  • lignin Although it is necessary to overcome technical issues in practical application in the future, applications such as plastics and adhesives are expected.
  • lignin is chemically decomposed in the pulp manufacturing process of the paper industry and contained in waste liquor (called black liquor). After extracting necessary chemicals from the waste liquor, In other words, it already depends on woody biomass for part of the fuel.
  • FIG. 1 is a photograph showing the expression intensity of the main gene group in the material for Yururi.
  • the two types of mRNAs extracted from the Yuri-Ryori material and the normal material were labeled with two types of fluorescent dyes (cy3 and cy5), respectively, and used as probes in oligo microarray analysis and hybridization.
  • the image obtained by scanning the fluorescence intensity is Analyzed using Kuchi-Zetta's analysis software (Luminator Ver. 1.0), all the repeated experiments were integrated with a statistical reliability of 99.9%, and the main gene groups in the materials used for Yururi Represents the relative intensity of expression.
  • + (red) indicates that the expression was significantly increased
  • + (green) indicates that the expression was significantly reduced
  • + (blue) indicates that the expression was not changed.
  • the eucalyptus tissues to be extracted include the stem hypertrophic growth area (secondary wall thickening zone; tissues rich in cambium), leaves and roots, genes from various situations, such as slope stimulation, stress application by salt solution exposure, etc. Expression is assumed.
  • the basic extraction method is the method described by Hiono et al. (Japanese Patent Application No. 6-219187). In the following, as an example, a method for extracting RNA using a root of Yurikari as a material by hydroponics will be described in detail.
  • the solvent extraction of the ground sample was repeated using a methanol solution containing dithiothreitol (1 mg / ml) until no color was observed in the supernatant (about three times). After completion of the extraction, the sample was freeze-dried. The lyophilized sample was mixed with 25 ml of a pH 9 CHES buffer (20 mg of dithiothreitol, lOraM vanadyl liponucleoside compound solution was added just before use) and incubated at 65 ° C for 30 minutes. After completion of the incubation, a 5 M sodium chloride solution and a 10% CTAB solution were added to the sample solution.
  • a pH 9 CHES buffer (20 mg of dithiothreitol, lOraM vanadyl liponucleoside compound solution was added just before use
  • the concentration of sodium chloride in the sample solution after the addition was 1.4 M, and the concentration of CTAB was 1% (w / v).
  • RNA Isolation Systemlll & IV kit (Cat. # Z5300 & Z5310, manufactured by Promega USA) was used. As a result, from 610 g of total RNA, 1.3 g was obtained from the stress-treated sample, and 1.8 g of mRNA was obtained from the control sample.
  • a clone was randomly selected from the Eucalyptus phagemid cDNA library derived from each tissue, the plasmid was purified, and after enzymatic reaction using Amersham's Dye Terminator-Sequence Kit, the salt was purified using the company's large-scale high-speed sequencer. Acquisition of base sequence data was performed.
  • Table 1 shows the final size of the database.
  • Example 2 Extraction of a gene that is specifically expressed in a timber-forming wood-forming tissue (1) Preparation of Eucalyptus trunk-specific oligo microarray
  • the eucalyptus oligo microarray prepared in this way contains 8,400 oligo DNAs, and can cover most of the genes that are expressed in the stem of the Eucalyptus tree.
  • Cellulose biosynthesis which is a major component of the cell wall composition, is known to cause tissue formation in which the cellulose content in the cell wall increases approximately twice by external gradient stimulation, especially in hardwoods.
  • genomics analysis By performing the above-mentioned genomics analysis on various tissues, a series of responsibilities that are particularly responsible for cellulose biosynthesis during cell wall formation It is possible to catch a gene as a whole.
  • microarray analysis using EST data, it is also possible to capture the expression differences of each constituent gene.
  • the above-mentioned specific phenomena caused by the external gradient stimulus have long been known as pulling materials.
  • the hardwood lumber is a special secondary xylem that is formed when the trunk senses a change in the direction of gravity when subjected to an external gradient stimulus.
  • the cell wall component increases cellulose and decreases lignin and hemicellulose.
  • the distribution density of the conduit is reduced to half that of the normal material, and the microfibril inclination in the cell wall shifts almost parallel to the cell major axis direction. Further, the fiber length was increased by about 20%.
  • Clone lines as materials. At this time, a normal planting material was used. As for the lumber, a peculiar tissue is formed in the upper part of the trunk by artificially pulling and tilting the straight growing trunk to about 45 degrees.
  • the mRNA was purified using the PolyATract rnRNA Isolation System manufactured by Promega, from the total concealment obtained from the normal individual and the addressing material.
  • the two types of mRA thus obtained were labeled with two types of fluorescent dyes (cy3 and cy5), respectively, and used as probes in oligo microarray analysis to perform hybridization (FIG. 1). Including signs The method of hybridization was based on the analysis protocol presented by Agilent Technologies.
  • genes that are highly expressed in eucalyptus wood are considered to be involved in cell wall component biosynthesis and wood fiber cell morphogenesis. Specifically, it is thought to be directly involved in the expression of characteristics such as high cellulose and low lignin, which are characteristic of the wood.
  • the use of the DNA of the present invention artificially controls woody biomass production in trees, and in particular, varies the quantity and quality of cell wall components (cellulose 'hemicellulose. Lignin), which is essential.
  • the morphology (elongation of wood fiber cells) can be freely changed. In other words, it is anticipated that the quantity of woody biomass will increase and the qualitative improvements will be made. As a result, the future use of energy and utilization as industrial raw materials is expected to expand. Can be expected to be replaced by

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Description

明細書 植物細胞壁形成を制御する遺伝子群 技術分野
本発明は、 植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成を制御する遺伝 子、 並びにその利用に関する。 背景技術
世界の木材消費量は毎年増加傾向にあり、 用途別にみると、 薪炭用材の消費が 過半数を占め、 開発途上地域では今でも増加傾向を示している。 製材、 製紙用の 木材チップなどの産業用材も、 先進地域の消費量は若干の減少に転じたものの、 開発途上国地域における消費量は増加している。 先進地域では文明の発達ととも に、 森林の農地への転用や資材としての利用等により森林を大きく減少させてき たが、 最近植林活動によってわずかながら増加している。 し力 し、 開発途上地域 では、 かっては先進国の商業伐採により、 近年は人口増加にともなって、 生活燃 料や農地の需要が拡大し、 世界全体における森林面積が急激に減少しつづけてい る。 こうしたことから、 二酸ィ匕炭素固定ィ匕能の低下による地球温暖ィヒなどの問題 が挙げられるようにもなつてきた。 これらの問題を解決しつつ、 近年、 産業的に 製材、 製紙用木材チップの安定供給などを目指した植林事業が世界各地で盛んに 行われている。
人類は長い間森林資源 （木質バイオマス） を、 製紙、 建築、 飼料、 燃料等の多 岐にわたる産業分野で利用してきた。 木質バイオマスを利用した産業は、 将来的 にも、 持続的利用可能な資源を活用できるとして地球環境問題改善の観点から再 認識されており、 現行の化石資源に替わるカーボンソースの利用による循環型産 業として期待されている。 具体的事例を示すと、 我が国の製紙会社では、 原料で ある木質バイオマスの持続的かつ安定的確保達成のため、 ユーカリ、 アカシア等 の熱帯早生樹を中心とした植林事業を精力的に進めている。 その植林事業規模の 例として、 王子製紙では 2010年度までに 20万 h aの植林面積を目指し、 ォセァ ユア、 東南アジアなどの環太平洋を中心に広い地域で行っている。 このことは、 事業レベルでの大規模植林を行うことによるバイオマスの工業利用、 再生という 循環型の物質生産 (バイオマスのリサイクル) を他の産業分野に先駆けて進めて いることに他ならない。
さらに、 このような植林事業の進展にあわせ、 樹木における木質バイオマス生 産を人為的に制御することで、 その本質である細胞壁成分 （セルロース ·へミセ ルロース ' リグニン） の量並びに質を可変すること、 さらに繊維形態 （木繊維細 胞の伸長） を自由に可変することが可能となれば、 木質バイオマスの量的な増大 並びに質的な改良が見込まれ、 これによつて将来のエネルギー利用や工業原料と しての活用における用途の拡張が見込まれ、 様々な分野で現在の化石原料に置き 換わることが期待できる。
細胞壁やこれを主に構成するセルロースは、 植物の形態維持に重要な役割を果 たしている。 しかしながら、 セルロースの生合成機構については、 世界中で長い 研究期間を費やされており、 また、 ゲノムレベルでの樹木解析研究 （非特許文献 1 ) がなされているにもかかわらず、 その詳細は依然として不明である。 最近、 ヮタゃシロイヌナズナにおいて、 セルロースの基本骨格である ]3 - 1, 4グルカンの 結合を触媒すると考えられるグリコシルトランスフヱラーゼの遺伝子が報告され た （例えば、 非特許文献 2 ) 。 また、 ポプラを用いて維管束組織の発達段階差の マイクロアレイにより、 木材の形成、 特に細胞壁の 2次壁合成に特有な遗伝子を 解析した結果、 その中には機知のセルロース合成酵素等が見出された (非特許文 献 3 ) 。 しかしながら、 これまでのところ、 セルロース生合成機構全体の調節等 に関する研究は大きな進展が認められない （特許文献 1 ) 。
〔特許文献 1〕 特表 2002- 510961 〔非特許文献 1〕 GenomeBiol. 2002；3 (12) :REVIEWS1033.
〔非特許文献 2〕 Burn et al. Plant Physiol. 129, 797 - 807， 2002.
〔非特許文献 3 J Hertzberg M， Aspeborg H， Schrader J, Andersson A， Erlands son R， Blomqvist K， Bhalerao R， Uhlen M， Teeri TT， Lundeberg J, Sundberg B， Nilsson P， Sandberg G. A transcriptional roadmap to wood formation. Pr oc Natl Acad Sci U S A. 2001 Dec ;98 (25) : 14732 7. Epub 2001 Nov 27.
〔非特許文献 4〕 Szyjanowicz PM， McKinnon I， Taylor NG, Gardiner J, Jarvis MC， Turner SR. The irregular xylem 2 mutant is an allele of korrigan tha t affects the secondary cell wall of Arabidopsis thaliana. Plant J. 2004 Mar ; 37 (5) : 730—40.
〔非特許文献 5〕 Nakazono M， Qiu F, Borsuk LA, Schnable PS. Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in spe cific plant cell types : identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell. 2003 Mar; 15 (3) : 583-96. Erratum in: Plant Cell. 2003 Apr; 15 (4) : 1049.
〔非特許文献 6〕 Israelsson M， Eriksson ME, Hertzberg M， Aspeborg H， Nilss on P， Moritz T. Changes in gene expression in the wood-forming tissue of transgenic hybrid aspen with increased secondary growth. Plant ol Biol. 2003 Jul ;52 (4) :893—903.
〔非特許文献 7〕 Gardiner JC, Taylor NG, Turner SR. Control of cellulose s ynthase complex localization in developing xylem. Plant Cell. 2003 Aug; 15 (8) : 1740-8.
〔非特許文献 8〕 Moller R， McDonald AG, Walter C, Harris PJ. Cell differen tiation, secondary cell-wall formation and transformation of ca丄丄 us tissu e of Pinus radiata D. Don. Planta. 2003 Sep ;217 (5) : 736- 47· Epub 2003 Jun 13. 〔非特奸文献 9〕 Joshi CP. Xylem - specif ic and tension stress-responsive ex press ion of cellulose synthase genes from aspen trees. Appl Biochem Biote chnol. 2003 Spring; 105-108： 17-25.
特許文献 1 0〕 Li L, Zhou Y, Cheng X， Sun J, Marita JM, Ralph J, Chian g VL. Combinatorial modification of multiple lignin traits in trees throu gh multigene cotransformation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Apr 15 ; 100 (8) : 4939-44. Epub 2003 Mar 31.
〔非特許文献 1 1〕 Lorenz WW, Dean JF. SAGE profiling and demonstration of differential gene expression along the axial developmental gradient or 丄 ignifying xylem in loblolly pine (Pinus taeda) . Tree Physiol. 2002 Apr； 22 (5) : 301-10.
〔非特許文献 1 2 ] Deraura T, Tashiro G, Horiguchi G, Kishimoto N, Kubo M， Matsuoka N, Minami A, Nagata— Hiwatashi M, Nakamura K， Okamura Y, Sassa N,
Suzuki S, Yazaki J, Kikuchi S, Fukuda H. Visualization by comprehensive microarray analysis of gene expression programs during transdifferentiati on of mesophyll cells into xylem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 No v 26 ; 99 (24) : 15794-9. Epub 2002 Nov 18.
〔非特許文献 1 3〕 Aharoni A, Keizer LC, Van Den Broeck HC, Blanco- Portale s R, Munoz- Blanco J, Bois G, Smit P, De Vos RC, 0' Connell AP. Novel insig ht into vascular, stress, and auxin-dependent and— independent gene expres sion programs in strawberry, a non-climacteric fruit. Plant Physio丄. 2002
Jul ; 129 (3) : 1019 - 31. 発明の開示
日本は、 資源に乏しく現行においても石油、 天然ガスなどの化石資源に依存し ている。 今、 新しい技術を持ってこの現状を変えていくためには、 木質パイォマ スとしての樹木のリサイクル活用こそが、 その切り札となる。 海外諸国において は、 過去の林業に対する取り組み方に違いがあるものの、 樹木バイオマスの有効 活用に関する技術確立は、 今世紀初頭における重要課題と位置づけられている。 実際、 米国では f葉樹のマツ、 広葉樹のポプラ、 カナダでは同じく トウヒ、 ポプ ラが、 北欧ではポプラがその対象樹種として、 国家プロジェクトとしてゲノム科 学的な解析により研究を開始している。 昨今、 食糧生産にかかる主要な作物種の 遺伝子組換え関連の基盤技術については、 欧米に先行されてしまっていることは 周知である。 これを教訓として、 日本がかっての技術立国たるべく少なくとも諸 外国と肩を並べ、 地球規模での木質パイォマス活用による循環型物質生産を担う ためにも、 植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成を制御する遺伝子 を同定する必要性は非常に高い。
本発明は、 上記現状に鑑み、 植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形 成を制御する遺伝子、 並びにこれらを含むプラスミド、 ならびに、 そのプラスミ ドにより形質転換されてなる植物細胞、 微生物もしくは植物体を提供することに ある。
本発明者は、 鋭意研究を重ねた結果、 本課題を解決するためには、 ゲノム科学 的なアプローチによる、 木質バイオマス形成を制御する遺伝子群の取得と、 発 現 ·機能に関する包括的な解析を行うべきとの結論にいたった。 すなわち、 特定 の組織、 とりわけ細胞壁形成が活発であることや、 セルロースを特異的生合成す るような時期において、 目的の遺伝子群を網羅的に取得、 解析する方法を用いる ことが望ましいとの結論にいたった。 さらに、 遺伝子工学技術を使用した改良遺 伝子の人為的発現制御によって、 人類が利用する上で有用な特性を植物に与える 為には、 新しい特性が適当な植物組織で選択的に発現される、 様々な組織に特異 的な遺伝子群の同定が必要であるとの結論にいたった。
本研究の遂行に当たり、 ユーカリにおける解析リソースの整備を行い、 具体的 には各種遺伝子ライプラリー、 榭幹部、 葉部、 根部の各組織毎に ESTデータべ一 スを作製した。 これに加え、 モデル植物として世界中で広く活用されているシロ ィヌナズナについても、 遺伝子ライブラリーや細胞壁生合成に関わる突然変異体 を保有しており、 また、 これらの原因遺伝子については既に解析済みである。
本発明者は、 作製したユー力リ ESTデータベースを用いて、 マイクロアレイ解 析によるユー力リあて材形成組織において特異的に発現する遺伝子の抽出を行つ た。 その結果、 通常の樹幹と比較して、 ユーカリあて材において優位に発現が高 い遺伝子群、 低い遺伝子群、 ほぼ発現に変化を認めない遺伝子群に大別された。 ユー力リあて材において優位に発現が高い遺伝子群おょぴ低い遺伝子群は、 細胞 壁成分生合成およぴ木繊維細胞形態形成の制御に利用できると考えられる。 特に、 ユーカリあて材において優位に発現が高い遺伝子群については、 細胞壁成分生合 成おょぴ木繊維細胞形態形成に関与しており、 細胞壁成分生合成おょぴ木繊維細 胞形態形成の促進に利用できると考えられる。
本発明によつて得られた細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成を制御す る遺伝子群、 並びにそれらを統括的に制御する技術については、 その 1つの成果 として、 これらの遺伝子群を用いて得られた遺伝子組換えユーカリ新品種の特性 による、 高セルロース、 低リグユン、 細胞壁の厚いもの、 薄いもの、 繊維長の長 いもの、 短いもの等様々な量的かつ質的な変化が期待される。
即ち、 本発明は、 植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成を制御す る遺伝子、 並びにその利用に関し、 以下の 〔1〕 〜 〔1 4〕 を提供するものであ る。
〔1〕 以下の （a ) または （b ) に記載の植物の細胞壁成分生合成およぴ木繊 維細胞形態形成時において発現が上昇する DNA。
( a ) 配列番号： 1〜 8 6 2のいずれかに記載の塩基配列からなる DNAとス トリンジェントな条件下でハイブリダイズする DNA0
( b ) ( a ) に記載の DNAからコードされるアミノ酸配列からなるタンパク 質と 50%以上の相同性を有するタンパク質をコードする DNA。 〔2〕 植物のあて材形成組織において発現が上昇する、 〔1〕 に記載の DNA。 〔3〕 以下の ) または （b) に記載の植物の細胞壁成分生合成おょぴ木繊 維細胞形態形成時にお!/、て発現が減少する DNA。
(a) 配列番号： 863〜 1731のいずれかに記載の塩基配列からなる D NAとストリンジヱントな条件下でハイブリダイズする DNA。
(b) (a) に記載の DNAからコードされるアミノ酸配列からなるタンパク 質と 50%以上の相同性を有するタンパク質をコードする DNA。
〔4〕 植物のあて材形成組織において発現が減少する、 〔3〕 に記載の DNA。 〔5〕 植物がユーカリである、 〔1〕 〜 〔4〕 のいずれかに記載の DNA。
〔6〕 〔1〕 〜 〔5〕 のいずれかに記載の DNAからコードされるアミノ酸配列 において、 1または複数の塩基が置換、 欠失、 付加、 および/または挿入 されたァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA。
〔7〕 〔1〕 〜 〔5〕 のいずれかに記載の DNAのプロモーター DNA。
〔8〕 以下の （a) 〜 （e) のいずれかに記載の DNA。
(a) 〔1〕 〜 〔5〕 のいずれかに記載の DNAの転写産物と相補的なアンチ センス RNAをコードする DNA。
(b) 〔1〕 〜 〔5〕 のいずれかに記載の DNAの転写産物を特異的に開裂す るリボザィム活性を有する RNAをコードする D皿。
(c) RNAi効果により、 〔1〕 〜 〔5〕 のいずれかに記載の DNAの発現を 抑制する RNAをコードする DNA。
(d) 共抑制効果により、 〔1〕 〜 〔5〕 のいずれかに記載の DNAの発現を 抑制する RNAをコードする DNA。
(e) 〔1〕 〜 〔5〕 のいずれかに記载の DNAの転写産物に対してドミナン トネガティブな形質を有するタンパク質をコードする DNA。 〔9〕 〔1〕 〜 〔6〕 、 または 〔8〕 に記載の DNAを有する組換えベクター。
〔10〕 〔7〕 に記載のプロモーター DNA、 または 〔9〕 に記載のベクターを含 むプラスミドを保持する微生物。
〔1 1〕 〔9〕 に記載のベクターが導入された形質転 物細胞。
〔1 2〕 〔1 1〕 に記载の形質転換植物細胞から再分化した形質転換植物体。 〔1 3〕 〔1 2〕 に記載の形質転 m«物体の子孫またはクローンである、 形質 転雖物体。
〔1 4〕 〔1 2〕 または 〔1 3〕 に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
本発明者は、 ユー力リのあて材形成組織において発現が増減する DNAを見出し た。 植物のあて材形成,組織では、 細胞壁成分生合成おょぴ木繊維細胞形態形成が 行われていることが知られている （あて材の総説は、 木材関連の専門書には必ず 記載されているが、 ユーカリについては、 馬場らの論文 （Mokuzai Gakkaishi 42, 795-798, 1996) が化学的 ·組織学的性質に対する詳細なデータを記述している） 。 本発明は、 以上の知見に基づき、 植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態 形成時において発現が増減する DNAを提供するものである。
本発明における植物の細胞壁成分生合成および木繊維細胞形態形成時において 発現が増減する DNAは、 植物の細胞壁成分生合成と木繊維細胞形態形成の制御に 利用できると考えられる。 また、 特に、 植物の細胞壁成分生合成おょぴ木繊維細 胞形態形成時において発現が上昇する DNAは、 植物の細胞壁成分生合成おょぴ木 繊維細胞形態形成に関与しており、 細胞壁成分生合成おょぴ木繊維細胞形態形成 の促進に利用できると考えられる。 一方、 植物の細胞壁成分生合成および木繊維 細胞形態形成時において発現が減少する DNAは、 細胞壁成分生合成おょぴ木繊維 細胞形態形成に関わる遺伝子を、 基本的には何らかのシステムによつて抑制する ことで、 組織あるレ、は時期特異的発現の制御に関わる可能性が考えられる。 従つ て、 これらを人為的に減少に向かわせることにより、 細胞壁成分生合成およぴ木 繊維細胞形態形成の促進に利用できると考えられる。
植物において細胞壁成分生合成と木繊維細胞形態形成を制御することは、 工業 や農業の分野において、 様々な重要な意義を有する。 例えば、 植物の細胞璧成分 の改変は、 セルロース ·へミセルロース含量を高めることによるパルプ等の優良 繊維原材料供給や、 有用な農作物および飼料作物の消化吸収効率の向上などをも たらし、 経済性や収益性の点で有意義である。 また、 細胞壁成分である多糖の構 造変化により、 新たな産業的価値を有する原材料植物の作出をもたらすことも可 能である。 さらに細胞形態の改変は、 パルプ等繊維原材料の繊維特性の向上など の点で有意義である。
また、 本発明の植物の細胞壁成分生合成およぴ木繊維細胞形態形成時において 発現が増減する DNAは、 細胞壁成分生合成おょぴ木繊維細胞形態形成が行われて いる細胞や組織を同定するための特異的マーカーとしても利用できる。
本発明の DNAの由来する植物としては、 特に制限はなく、 例えば、 穀類、 野菜、 果樹等の有用農作物 （飼料作物を含む） 、 パルプ等の繊維原材料植物、 観葉植物 等の鑑賞用植物等が挙げられる。 該植物としては特に制限はなく、 ユーカリ、 マ ッ、 アカシア、 ポプラ、 スギ、 ヒノキ、 タケ、 ィチイ、 イネ、 トウモロコシ、 コ ムギ、 ォォムギ、 ライムギ、 ジャガイモ、 タバコ、 サトウダイコン、 サトウキビ、 ナタネ、 ダイズ、 ヒマヮリ、 ヮタ、 オレンジ、 ブドウ、 モモ、 ナシ、 リンゴ、 ト マト、 ハクサイ、 キャベツ、 ダイコン、 ニンジン、 カポチヤ、 キユウリ、 メロン、 パセリ、 ラン、 キク、 ユリ、 サフラン等を例示することができる。
本発明の DNAとしては、 例えば、 配列番号： 1〜 1 7 3 1のいずれかに記載の 塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズする DNAが挙 げられる。 このうち配列番号： 1〜 8 6 2のいずれかに記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズする DNAは、 植物の細胞壁成分 生合成およぴ木繊維細胞形態形成時において発現が上昇する DNAである。 また、 配列番号： 8 6 3〜： 1 7 3 1のいずれかに記載の塩基配列からなる DNAとストリ ンジェントな条件でハイプリダイズする DNAは、 植物の細胞壁成分生合成および 木繊維細胞形態形成時にぉレヽて発現が減少する DNAである。
ストリンジェントなハイプリダイゼーション条件としては、 0. lxSSC溶液中に て、 60°C、 一晚放置の条件またはこれと同等のストリンジヱンシ一のハイブリダ ィゼーション条件が挙げられる。 このような条件において、 配列番号： 1〜1 7
3 1のいずれかに記载の塩基配列からなる DNAとハイプリダイズする DNAが単離 できる。
具体的には、 植物より、 DNAを抽出し、 遺伝子ライブラリーを構築し、 同様の 条件によりスクリーニングを行うか、 もしくは、 抽出した DNAに対して、 60mer の配列 （配列番号： 1〜 1 7 3 1のいずれかに記載の塩基配列） より、 任意の 20 mer程度の配列をプライマーに用いて、 劉らによつて確立された TAIL- PCR法によ り、 連続する近傍配列を容易に取得できる。
また、 本発明は、 配列番号： ：！〜 1 7 3 1のいずれかに記載の塩基配列からな る DNAとストリンジェントな条件でハイプリダイズする DNAからコードされるァ ミノ酸配列からなるタンパク質と 50%以上の相同性を有するタンパク質をコード する DNAも提供する。 このような DNAは、 当業者においては、 一般的に公知の方 法により単離することが可能である。 例えば、 ハイブリダィゼーシヨン技術 (Sou thern, EM. , J Mol Biol, 1975, 98, 503. ) やポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 技術 (Saiki, RK. et al. , Science, 1985, 230, 1350.、 Saiki, RK. et al. , Scienc e 1988, 239, 487. ) を利用する方法が挙げられる。 すなわち、 配列番号： 1〜1 7 3 1のいずれかに記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハ イブリダィズする DNAもしくはその一部をプローブとして、 また、 配列番号： 1 〜 1 7 3 1のいずれかに記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件 でハイプリダイズする DNAに特異的にハイプリダイズするオリゴヌクレオチドを プライマーとして、 植物から配列番号： 1〜 1 7 3 1のいずれかに記載の塩基配 列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイプリダイズする DNAと高い相同 性を有する DNAを単離することは、 当業者にとって通常行い得ることである。 このような DNAを単離するためには、 好ましくはストリンジヱントな条件下で ハイブリダイゼーション反応を行う。 本発明においてストリンジェントなハイブ リダイゼーション条件とは、 6M尿素、 0. 4% SDS、 0. 5 X SSCの条件またはこれと 同等のストリンジエンシーのハイブリダィゼーション条件を指す。 よりストリン ジエンシーの高い条件、 例えば、 6M尿素、 0. 4% SDS、 0. I X SSCの条件下では、 より相同性の高い DNAを単離できると期待される。 こうして単離された DNAは、 アミノ酸レベルにおいて、 配列番号： 1〜 1 7 3 1のいずれかに記載の塩基配列 からなる DNAとストリンジェントな条件でハイプリダイズする DNAからコードさ れるアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。 高い相同性とは、 ァミノ 酸配列全体で少なくとも 50%以上、 好ましくは 70%以上、 より好ましくは 80% 以上、 さらに好ましくは 90%以上、 さらにより好ましくは 95%以上、 最も好まし くは 98%以上の配列の同一性を指す。 このような DNAには、 配列番号： 1〜： 1 7 3 1のいずれかに記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイ ブリダイズする DNAの縮重変異体も含まれる。
ァミノ酸配列や塩基配列の同一性は、 カーリンぉよぴアルチュールによるァノレ ゴリズム BLAST (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990, 87， 2264-2268·、 Karl in, S. & Altschul, SF. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993, 90, 5873. ) を用い て決定できる。 BLASTのァルゴリズムに基づ 、た BLASTNや BLASTXと呼ばれるプ ログラムが開発されている （Altschul, SF. et al.， J Mol Biol, 1990， 215, 40 3. ) 。 BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、 パラメータ一は、 例えば scor e= 100、 wordlength= 12とする。 また、 BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する 場合は、 パラメータ一は、 例えば score=50、 wordlength=3とする。 BLASTと Ga pped BLASTプログラムを用いる場合は、 各プログラムのデフォルトパラメーター を用いる。 これらの解析方法の具体的な手法は公知である （http :〃 . ncbi. nlm. nih. gov/) 。
また、 本発明の DNAには、 配列番号： 1〜 1 7 3 1のいずれかに記載の塩基配 列からなる DNAとストリンジヱントな条件でハイブリダイズする DNAからコード されるァミノ酸配列、 または、 該ァミノ酸配列からなるタンパク質と 50%以上の 相同性を有するアミノ酸配列において 1または複数のァミノ酸が置換、 欠失、 付 カロ、 および/または挿入されたァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DN Aが含まれる。
上記の DNAを調製するために、 当業者によく知られた方法としては、 例えば、 D NAに対し、 site-directed mutagenesis法 (Kramer, W. & Fritz, HJ. , Methods Enzymol, 1987, 154, 350. ) により変異を導入する方法が挙げられる。
タンパク質におけるアミノ酸の改変は、 通常、 全アミノ酸の 50アミノ酸以内で あり、 好ましくは 30アミノ酸以内であり、 さらに好ましくは 10アミノ酸以内で あり、 さらに好ましくは 3アミノ酸以内である。 アミノ酸の改変は、 例えば、 変 異ゃ置換であれば 「Transformer Site-directed Mutagenesis KitJ や 「ExSite P CR - Based Site-directed Mutagenesis Kit」 （Clontech社製） を用いて行うこと が可能であり、 また、 欠失であれば 「Quantum leap Nested Deletion Kit」 （Clo ntech社製） などを用いて行うことが可能である。
また、 塩基配列が変異していても、 その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異 を伴わない場合 （縮重変異） があり、 このような縮重変異 DNAも本発明に含まれ る。
本発明の DNAは、 本発明のタンパク質をコードし得るものであれば特に制限は なく、 ゲノム DNA、 cDNA、 化学合成 DNAなどが含まれる。 ゲノム DNAは、 例えば、 文献 (Rogers and Bendich, Plant Mol. Biol. , 1985, 5， 69. ) 記載の方法に従 つて調製したゲノム DNAを铸型として、 本発明の DNAの塩基配列 （例えば、 配列 番号： 1〜 1 7 3 1のいずれかに記載の塩基配列） を基に作製したプライマーを 用いて PCR (Saiki et al. Science, 1988， 239, 487. ) を行うことにより調製す ることが可能である。 また、 cDNAであれば、 常法 (Maniatis et al. Molecular Cloning Cold Spring harbor Laboratry Press; により植物 ら mRNAを言周 し、 逆転写反応を行い、 上記と同様のプライマーを用いて PCRを行うことにより調製 することが可能である。 また、 ゲノム DNAや cDNAは、 常法によりゲノム DNAライ ブラリーまたは cDNAライブラリーを作製し、 このライブラリーに対し、 例えば本 発明の DNAの塩基配列 （例えば、 配列番号： 1〜 1 7 3 1のいずれかに記載の塩 基配列) を基に合成したプローブを用いてスクリーニングすることによつても調 製することが可能である。 なお、 得られた DNAの塩基配列は、 例えば 「シークェ ンサー Model373」 (皿社製) を利用することにより容易に決定することが可能 " toる。
また、 本発明は、 本発明の DNAのプロモーター DNAを提供する。 このようなプ 口モーター DNAとしては、 本発明によって得られた植物、 特に樹木の細胞壁形成 において特異的におよび Zまたはセルロース生合成時において特異的に発現する 遺伝子に連なるプロモーター DNAが挙げられる。 ここで、 「プロモーター DNAJ と は、 DNAを錶型とした mRNAの合成 （転写） の開始に必要な特定塩基配列を含む DN Aを意味し、 これには自然界に存在する DNAの他、 組換えなどの人工的な改変操 作により作成された DNAが含まれる。
本発明のプロモーターは、 例えば、 以下のようにして製造し、 利用することが できる。 目的とするユーカリ植物の組織より DNAを抽出し精製する。 DNAの調製 に際しては、 各種の方法を用いることができ、 市販のキット、 例えば、 IS0PLANT キット （二ツボンジーン社製） などを用いることが可能である。
得られた DNAを材料として、 本発明者が既に単離に成功しているユーカリ cDNA の塩基配列を基に、 任意の 2箇所よりオリゴヌクレオチドを作製し、 これをブラ イマ一に用いた PCR法により、 選んだユー力リ cDNAに対応するゲノム DNAを簡単 に製造することが可能である。 該遺伝子の上流域 DNAは、 該遺伝子の塩基配列を 基に作成したォリゴヌクレオチドプライマ一を利用する PCR法 (Inverse-PCR法 やアンカー PCR法 · TAIL-PCR法 (島本功ら監修、 「新版植物の PCR実験プロトコ ール」 (植物細胞工学別冊、 植物細胞工学シリーズ 7 ) 秀潤社 1997年 7月発行) 、 あるいは該遺伝子の DNA酉 S列をプローブに用いるハイブリダィゼ一ション法によ り、 単離することが可能である。 ユー力リの DNAには、 ゲノム DNAライブラリ一を利用することも可能である。 ゲノム DNAライプラリ一は、 ユー力リから抽出した DNAを； L DNA由来の各種べク ターの他、 コスミ ドベクター、 TACベクター (Liuら (1999) 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol96 ： p6535) などのクローニングベクターに揷入し、 大腸菌を形質 転換して得られる。
ゲノム DNAライブラリ一のスクリ一ユングには、 ハイブリダイゼ一ンョン技術 を用いることができる。 プローブには、 本発明者が既に単離に成功しているュ一 カリ cDNAの配列を用いることができる。 このプローブを用いて上記のゲノム DNA ライブラリーをスクリーニングして、 該遺伝子と相同な DNA配列が含まれるクロ 一ンを単離する。 制限酵素切断地図の作成や、 塩基配列の決定などを行い、 クロ ーン化された DNAの構造を明らかにし、 該遺伝子の上流に存在する配列を特定す る。 この上流配列は TATAボックス配列を含み、 少なくとも数百 bpから数 kbpの 大きさのものであることが望ましい。 この配列を適当な制限酵素によって切り出 し、 必要に応じて他のプラスミドベクター等にサブクローニングする。
上記の配列のプロモーター活性については、 以下のようにして解析することが 可能である。 例えば、 ρΒΙΙΟΙなどレポーター遺伝子を含むベクターを用い、 その レポーター遺伝子の上流に上記の配列を連結するようにサブクローニングする。 p
BI101ベクターにはレポーター遺伝子として、 大腸菌の βダルクロニダーゼ （GU S) が使用されている。 この遺伝子産物は基質として 5-bromo - 4 - chloro-3 - - D-g lucronic acid (X- glue) を用いると、 これを分解して青色の沈澱物である indig otinを生ずるため、 遺伝子発現を組織レベルでモニターすることが可能である。 また、 基質として 4-methyl - umbelliferyl- - D - glucronide (4MUG) を用いると、 遺伝子産物の働きによって生じる蛍光によつて遺伝子発現を定量することが可能 である。 なお、 レポ一ター遗伝子としては、 GUS遺伝子の他にクロラムフエニコ ール ァセチルトランスフェラーゼ遺伝子や、 ルシフェラーゼ遺伝子、 グリーンフ ルォロセィンプロティン遺伝子なども利用が可能である。 上記のようにして作成されたキメラ遺伝子構築物は、 例えば、 ァグロパクテリ ゥムを介してシロイヌナズナなどの植物に導入してその機能を解析することが可 能である。 ρΒΙΙΟΙをベクターとして用いた場合は、 キメラ遺伝子を含む組換えプ ラスミドを、 例えば、 ァグロパクテリゥム · ッメファシエンスの MP90株にエレク トロポレーシヨン法を用いて導入し、 得られた形質転換菌を、 例えば、 フローラ ルディップ法 （島本功ら監修、 「モデル植物の実験プロトコール」 （植物細胞ェ 学別冊、 植物細胞工学シリーズ 4 ) 秀潤社 1996年 4月発行） によりシロイヌナズ ナ植物体に感染させる。 感染処理した植物より得られた種子を、 用いたベクター に基づいてカナマイシンなどの薬剤を含む培地に播種し、 遺伝子導入により薬剤 耐性となった形質転,物体を得る。 この形質転,物体を用いてレポーター GUS 遺伝子の発現について解析する。 本発明のプロモーターまたはそれを含む発現べ クタ一は、 以下のようにして利用することが可能である。 本発明のプロモーター の下流に目的の遺伝子、 例えば、 ある種の浸透圧ストレス応答に関わる遺伝子を 連結したキメラ遺伝子を、 例えば、 ρΒΙΙΟΙベクターに揷入し発現ベクターを構築 する。 このベクターをァグロパクテリゥムを介して、 例えば、 タバコ植物体に導 入する。 得られた形質転換植物においては、 本発明のプロモーターの働きにより、 該遺伝子が浸透圧ストレス環境下の根に発現し、 塩害や乾燥地域であっても生育 が可能となるものと期待される。 この場合、 35Sプロモーターのように不要な組 織においても発現する現象がないため、 他の好ましくない形質が現れないことが 期待される。
本発明のプロモーターで制御可能な遺伝子としては、 上述した特定の遺伝子に 限定されない。 また、 本発明のプロモーターに他の発現制御配列を連結して本発 明のプロモーターの機能を改変することも可能である。 このような発現制御配列 としては、 ェンハンサー配列やレプレッサー配列、 インスレーター配列などが挙 げられる。 本発明のプロモーターには、 機能特性として、 樹幹特異的ならぴに細 胞壁生合成にかかる遺伝子の発現を制御する幾つかのシスエレメント配列が含ま れる。 本発明のプロモーターに含まれるシスエレメント配列の利用を目的として、 他のプロモーターに本発明のプロモーターの一部を挿入連結し、 そのプロモータ 一の機能を改変することも可能である。
また、 本発明は、 植物の細胞壁成分生合成並びに木繊維細胞形態形成を制御す ' るタンパク質をコードする DNAの発現を抑制するための DNAを提供する。 内在性 遺伝子の発現を抑制するための DNAの好ましい態様としては、 本発明の DNAの転 写産物と相補的なアンチセンス RNAをコードする DNA、 本発明の DNAの転写産物 を特異的に開裂するリボザィム活性を有する RNAをコードする DNA、 RNAi効果ま たは共抑制効果により、 本発明の DNAの発現を抑制する R Aをコードする DNA、 本発明の DNAの転写産物に対してドミナントネガティブな形質を有するタンパク 質をコードする DNA等を例示することができる。 上記 「内在性遺伝子の発現抑 制」 には、 遺伝子の転写の抑制、 および Zまたは該遺伝子からコードされるタン パク質への翻訳の抑制が含まれる。 また、 該遺伝子の発現の完全な停止のみなら ず発現の減少も含まれる。
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、 アンチセン ス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。 植物細胞におけるァ ンチセンス効果は、 電気穿孔法で導入したアンチセンス RNAが植物においてアン チセンス効果を発揮することをエッカーらが示したことで初めて実証された （Eck er, JR. & Davis, RW. , Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83， 5372. ) 。 その後、 タパコゃペチュニアにおいてもアンチセンス RNAの発現により標的遺伝子の発現 が低下した例が報告されており （van der Krol AR. et al. , Nature, 1988, 333, 866. ) 、 現在では、 アンチセンス技術は植物における遗伝子発現を抑制させる手 段として確立している。
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、 以下のような 複数の要因が存在する。 すなわち、 三重鎖形成による転写開始阻害、 RNAポリメ ラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイプリッド形成に よる転写阻害、 合成の進みつつある RNAとのハイプリッド形成による転写阻害、 イントロンとェキソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシン グ阻害、 スプライソソーム形成部位とのハイプリッド形成によるスプライシング 阻害、 raRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、 キヤッピン グ部位やポリ（A)付加部位とのハイプリッド形成によるスプライシング阻害、 翻訳 開始因子結合部位とのハイプリッド形成による翻訳開始阻害、 開始コドン近傍の リボソーム結合部位とのハイプリッド形成による翻訳阻害、 mRNAの翻訳領域ゃポ リソーム結合部位とのハイプリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、 および核 酸とタンパク質との相互作用部位とのハイプリッド形成による遺伝子発現阻害な どである。 このようにアンチセンス核酸は、 転写、 スプライシングまたは翻訳な ど様々な過程を阻害することで、 標的遺伝子の発現を抑制する （平島および井上， 新生化学実験講座 2核酸 IV遺伝子の複製と発現， 日本生化学会編， 東京化学同 人， 1993, 319-347. ) 。
本発明で用いられるアンチセンス配列は、 上記のいずれの作用により標的遺伝 子の発現を抑制してもよい。 一つの態様としては、 遺伝子の mRNAの 5'端近傍の 非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、 遺伝子の翻訳阻害に効果 的と考えられる。 また、 コード領域もしくは 3'側の非翻訳領域に相補的な配列も 使用することができる。 このように、 遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の 配列のァンチセンス配列を含む DNAも、 本発明で利用されるァンチセンス DNAに 含まれる。 使用されるアンチセンス DNAは、 適当なプロモーターの下流に連結さ れ、 好ましくは 3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。 このようにし て調製された DNA は、 公知の方法を用いることで、 所望の植物へ形質転換できる。 アンチセンス DNAの配列は、 形質転換される植物が持つ内在性遺伝子またはその 一部と相補的な配列であることが好ましいが、 遺伝子の発現を有効に抑制できる 限りにおいて、 完全に相補的でなくてもよい。 転写された RNAは、 標的遺伝子の 転写産物に対して好ましくは 90%以上、 最も好ましくは 95%以上の相補性を有す る。 アンチセンス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、 アン. チセンス DNAの長さは少なくとも 15塩基以上であり、 好ましくは 100塩基以上で あり、 さらに好ましくは 500塩基以上である。 通常用いられるアンチセンス DNA の長さは 5kbよりも短く、 好ましくは 2. 5kbよりも短い。
また、 内在性遺伝子の発現の抑制は、 リポザィム、 またはリボザィムをコード する DNAを利用して行うことも可能である。 リボザィムとは触媒活性を有する RN A分子のことを指す。 リボザィムには種々の活性を有するものが存在するが、 中 でも RNAを切断する酵素としてのリボザィムに焦点を当てた研究により、 RNAを 部位特異的に切断するリボザィムの設計が可能となった。 リボザィムには、 ダル ープ Iイントロン型ゃ RNase Pに含まれる Ml RNAのように 400ヌクレオチド以上 の大きさのものもあるが、 ハンマーへッド型ゃヘアピン型と呼ばれる 40ヌクレオ チド程度の活性ドメインを有するものもある （小泉誠および大塚栄子， 蛋白質核 酸酵素， 1990, 35, 2191. ) 。
例えば、 ハンマーヘッド型リボザィムの自己切断ドメインは、 G13U14C15とい う配列の C15の 3'側を切断するが、 その活性には U14と A9との塩基対形成が重 要とされ、 C15の代わりに A15または U15でも切断され得ることが示されている (Koizumi, M. et al.， FEBS Lett, 1988, 228, 228. ) 。 基質結合部位が標的部 位近傍の RNA配列と相補的なリボザィムを設計すれば、 標的 RNA中の UC、 UUまた は UAという配列を認識する制限酵素的な RNA切断リボザィムを作出することがで きる （Koizumi, M. et al. , FEBS Lett, 1988, 239, 285·、 小泉誠および大塚栄 子， 蛋白質核酸酵素， 1990， 35, 2191.、 Koizumi, M. et al. , Nucl Acids Res, 1989， 17, 7059. ) 。 例えば、 植物の細胞壁成分生合成並びに木繊維細胞形態形成 を制御するタンパク質をコードする DNAのコード領域中には、 標的となり得る部 位が複数存在する。
また、 ヘアピン型リボザィムも本発明の目的に有用である。 このリボザィムは、 例えばタバコリングスポットウィルスのサテライト RNAのマイナス鎖に見出され る （Buzayan, JM. , Nature, 1986， 323, 349. ) 。 ヘアピン型リボザィムからも、 標的特異的な RNA切断リボザィムを作出できることが示されている （Kikuchi, Y. & Sasaki, N. , Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.、 菊池洋， 化学と生物， 1992, 30, 112. ) 。
標的を切断できるように設計されたリボザィムは、 植物細胞中で転写されるよ うに、 カリフラワーモザィクウイ スの 35Sプロモーターなどのプロモーターお よぴ転写終結配列に連結される。 このとき、 転写された RNAの 5'端や 3'端に余分 な配列が付カ卩されていると、 リポザィムの活 1"生が失われることがあるが、 こうい つた場合は、 転写されたリボザィムを含む RNAからリボザィム部分だけを正確に 切り出すために、 リポザィム部分の 5'側や 3，側にシスに働く別のトリミングリボ ザィムを配置させることも可能である （Taira, K. et al. , Protein Eng, 1990， 3， 733.、 Dzianott, AM. & Bujarski, JJ.， Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86, 4823.、 Grosshans, CA. & Cech, TR. , Nucl Acids Res, 1991, 19, 3875.、 Tair a, K. et al. , Nucl Acids Res, 1991, 19, 5125. ) 。 また、 このような構成単位 をタンデムに並べ、 標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにすることで、 より効果を高めることもできる （Yuyama, N. et al. , Biochem Biophys Res Coram un, 1992, 186, 1271. ) 。 このように、 リボザィムを用いて本発明における標的 遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、 該遺伝子の発現を抑制することが できる。
内在性遺伝子の発現の抑制は、 さらに、 標的遺伝子配列と同一もしくは類似し た配列を有する二本鎖 RNAを用いた RNA干渉 （RNA interferance； RNAi) によつ ても行うことができる。 RNAiとは、 標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列 を有する二重鎮 RNAを細胞内に導入すると、 導入した外来遺伝子および標的内在 性遗伝子の発現がレ、ずれも抑制される現象のことを指す。 RNAiの機構の詳細は明 らかではないが、 最初に導入した二本鎖 RNAが小片に分解され、 何らかの形で標 的遺伝子の指標となることにより、 標的遺伝子が分解されると考えられている。 R NAiは植物においても効果を奏することが知られている （Chuang, CF. & Meyerow itz, EM. , Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97, 4985. ) 。 例えば、 植物体におけ る植物の細胞壁成分生合成並びに木繊維細胞形態形成を制御するタンパク質をコ 一ドする DNAの発現を RNAiにより抑制するためには、 配列番号： 1〜 1 7 3 1の いずれかに記載の塩基配列、 または、 これらと類似した配列を有する二本鎖 RNA を目的の植物へ導入すればよい。 RNAiに用いる遺伝子は、 標的遺伝子と完全に同 一である必要はないが、 少なくとも 70%以上、 好ましくは 80%以上、 さらに好ま しくは 90%以上、 最も好ましくは 95%以上の配列の同一性を有する。 また、 配列 の同一性は上述した手法により決定できる。
内在性遺伝子の発現の抑制は、 標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を 有する DNAの形質転換によって起こる共抑制によっても達成できる。 「共抑制」 とは、 植物に標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形 質転換により導入すると、 導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現が いずれも抑制される現象のことを指す。 共抑制の機構の詳細は明らかではないが、 少なくともその機構の一部は RNAiの機構と重複していると考えられている。 共抑 制も植物において観察される (Smyth, DR. , Curr Biol, 1997, 7, R793.、 Martie nssen, R. , Curr Biol, 1996, 6, 810. ) 。 例えば、 植物体における細胞壁成分生 合成並びに木繊維細胞形態形成を制御するタンパク質をコードする DNAが共抑制 された植物体を得るためには、 該 DNA、 または、 これらと類似した配列を有する D NA を発現できるように作製したべクター DNA を目的の植物へ形質転換すればよい。 共抑制に用いる遺伝子は、 標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、 少なく とも 70%以上、 好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以上、 最も好まし くは 95%以上の配列の同一性を有する。 また、 配列の同一性は上述した手法によ り決定できる。
さらに、 本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、 標的遺伝子がコードす るタンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコード する遺伝子を、 植物へ形質転換することによつても達成することができる。 「ド ミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードする遺伝子」 とは、 該遺 伝子を発現させることによって、 植物体が本来持つ内在性の野生型タンパク質の 活性を消失もしくは低下させる機能を有する遺伝子のことを指す。
また、 本発明は、 上記 DNAを含む組換えベクターを提供する。 本発明のベクタ 一としては、 植物細胞で転写可能なプロモーター配列と転写産物の安定化に必要 なポリアデュレーシヨン部位を含むターミネータ一配列を含んでいれば特に制限 されず、 例えば、 pUC誘導体などの大腸菌で増幅可能なベクター、 ρΒΙΙΟΙ (クロ ンテック社） などのように大腸菌とァグロパクテリゥムの双方で増幅可能なシャ トルベクターなどが挙げられる。 また、 植物ウィルス、 例えば、 カリフラワーモ ザイクウィルスをベクターとして利用することもできる。
本発明のベクターは、 例えば、 ベクターの所定の部分に本発明のプロモーター D NAや所望の遺伝子を恒常的または誘導的に発現させるためのプロモータ一 DNAを 結合あるいは挿入して得ることができる。 なお、 プロモーターをベクターに揷入 する方法は、 通常の遺伝子をベクターに挿入する方法に従う。 この組換えべクタ 一のプロモーターに所望の遺伝子を機能的に接続することで遺伝子発現用の発現 ベクターを得ることができる。
恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、 例えば、 カリフラワーモザ イクウィルスの 35Sプロモーター （Odell et al. , Nature, 1985, 313, 810. ) 、 イネのァクチンプロモーター （Zhang et al.， Plant Cell, 1991, 3， 1155. ) 、 トウモロコシのュビキチンプロモーター （Cornejo et al. , Plant Mol. Biol. , 1 993， 23, 567. ) などが挙げられる。 また、 誘導的に発現させるためのプロモータ 一としては、 例えば糸状菌 .細菌 · ウィルスの感染や侵入、 低温、 高温、 乾燥、 紫外線の照射、 特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られて いるプロモーターなどが挙げられる。 このようなプロモーターとしては、 例えば、 糸状菌 ·細菌 · ウィルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子の プロモーター （Xu et al. , Plant Mol. Biol. , 1996, 30， 387. ) やタバコの PR タンパク質遺伝子のプロモーター (Ohshima et al. , Plant Cell, 1990, 2, 9 5. ) 、 低温によって誘導されるイネの riip19j 遺伝子のプロモーター (Aguan et al. , Mol. Gen Genet. , 1993, 240, 1. ) 、 高温によって誘導されるイネの 「hsp8 0」 遺伝子と 「hsp72」 遺伝子のプロモーター (Van Breusegem et al. , Planta, 1 994， 193, 57. ) 、 乾燥によって誘導されるシロイヌナズナの 「rabl6」 遺伝子の プロモーター （Nundy et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 1406. ) 、 紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモータ 一 （Schulze- Lefert et al. , EMB0 J. , 1989, 8, 651. ) 、 嫌気的条件で誘導され るトウモロコシのァノレコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター （Walker et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 6624. ) などが挙げられる。 また、 ィネキチナーゼ遺伝子のプ口モーターとタバコの PRタンパク質遺伝子のプロモー ターはサリチル酸などの特定の化合物によって、 「rabl6」 は植物ホルモンのアブ シジン酸の散布によっても誘導される。
また、 本発明の DNA の導入により形質転換した細胞を効率的に選択するために、 上記組み換えベクターは、 適当な選抜マーカー遺伝子を含む、 もしくは選抜マー カー遺伝子を含むプラスミ ドベクターと共に細胞へ導入するのが好ましい。 この 目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、 例えば抗生物質ハイグロマイシンに耐性 であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、 カナマイシンまたは ゲンタマイシンに面 ·性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、 およぴ除 草剤ホスフイノスリシンに耐性であるァセチルトランスフエラーゼ遺伝子等が挙 げら る。
また、 本発明は、 本発明のベクターが導入された形質転 物細胞を提供する。 本発明のベクターが導入される細胞としては特に制限はなく、 例えば、 イネ、 ト ゥモロコシ、 コムギ、 ォォムギ、 ライムギ、 ジャガイモ、 タバコ、 サトウダイコ ン、 サトウキビ、 ナタネ、 ダイズ、 ヒマヮリ、 ヮタ、 オレンジ、 プドウ、 モモ、 ナシ、 リンゴ、 トマト、 ハクサイ、 キャベツ、 ダイコン、 ニンジン、 カボチヤ、 キユウリ、 メロン、 パセリ、 ラン、 キク、 ユリ、 サフラン、 などの植物の細胞が 挙げられるが、 ユーカリ、 マツ、 ァカシャ、 ポプラ、 スギ、 ヒノキ、 タケ、 イチ ィなどの榭木が望ましい。 また、 本発明の植物細胞には、 培養細胞の他、 植物体 中の細胞も含まれる。 また、 プロトプラスト、 苗条原基、 多芽体、 毛状根も含ま れる。
上記発現べクタ一を宿主植物細胞中に導入するために、 さまざまな手法を用い ることができる。 これらの手法には、 形質転換因子としてァグロパクテリゥム ' ッメファシェンス ( grobac terium tumefaciens)または、 ァグロパクテリゥム ' リ ゾゲネス Uigrobacterium rhizogene ) を用いた T- DNAによる植物細胞の形質転 換方法のほかに、 プロトプラストへの直接導入（プロトプラストに電気パルス処理 して DNAを植物細胞へ導入するエレクトロポレーシヨン法や、 リボソームなどと プロトプラストとの融合法、 マイクロインジヱクシヨン法、 ポリエチレングリコ ール法など）、 パーティクルガン法などが挙げられる。
また、 植物ウィルスをベクターとして利用することによって、 目的遺伝子を植 物体に導入することができる。 利用可能な植物ウィルスとしては、 例えば、 カリ フラワーモザイクウィルスが挙げられる。 すなわち、 まず、 ウィルスゲノムを大 腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、 ウィルスのゲノム中 に、 これらの目的遺伝子を揷入する。 このようにして修飾されたウィルスゲノム を制限酵素によって該組換え体から切り出し、 植物体に接種することによって、 これらの目的遺伝子を植物体に導入することができる （Hohnら （1982) 、 Molecu lar Biology of Plant Tumors (Academic Press New York) pp549、 米因特許第 4, 407, 956号明細書) 。植物細胞や植物体へのベクター導入の手法は、 これらの みに限定されず、 その他の可能性も含まれる。
プロトプラストへの直接導入では、 必要とされるベクターに制限はない。 例え ば、 pUC誘導体のような単純なプラスミドを用いることができる。 目的の遺伝子 を植物細胞に導入する方法によっては、 他の DNA配列が必要になることもある。 例えば、 Tiまたは Riプラスミドを植物細胞の形質転換に用レ、る場合には、 Tiお ょぴ Riプラスミ ドの T-DNA領域の少なくとも右の端の配列、 大抵は両側の端の配 列を、 導入されるべき遗伝子の隣接領域となるように接続しなければならない。 ァグロバクテリウム属菌を形質転換に用いる場合には、 導入すべき遺伝子を、 特別のプラスミド、 すなわち中間ベクターまたはバイナリーベクターの中にク口 一-ングする必要がある。 中間ベクターはァグロパクテリゥム属菌の中では複製 されない。 中間ベクターは、 ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーショ ンによってァグロバクテリウム属菌の中に移行される。 中間ベクターは、 T- DNA の配列と相同な領域をもっため、 相同的組換えによって、 ァグロパクテリゥム属 菌の Tiまたは Riプラスミド中に取り込まれる。 宿主として使われるァグロパク テリゥム属菌には、 vir領域が含まれている必要がある。 通常 Tiまたは Riプラ スミドに vir領域が含まれており、 その働きにより、 T-DNAを植物細胞に移行さ せることができる。
一方、 バイナリーベクターはァグロパクテリゥム属菌の中で複製、 維持され得 るので、 へ^ ^パープラスミドあるいはエレクトロポレーシヨン法によってァグロ パクテリゥム属菌中に取り込まれると、 宿主の vir領域の働きによって、 バイナ リ一ベクター上の丁一 DNAを植物細胞に移行させることができる。
なお、 このようにして得られた中間ベクターまたはバイナリーベクター、 及ぴ これを含む大腸菌ゃァグロパクテリゥム属菌等の微生物も本発明の対象である。 また、 本発明は、 上記の形質転換植物細胞から再分化した形質転換植物体、 該 形質転 物体の子孫またはクローンである形質転 m¾物体、 および該形質転換 植物体の繁殖材料を提供する。 このような形質転換植物体は、 細胞壁成分や細胞 形態形成が改変された有用な形質転 m¾物体である。 本発明における細胞壁成分 の改変としては、 特に制限されるものではなく、 例えば、 高セルロース、 低リグ ユン、 細胞壁の厚いもの、 薄いもの、 繊維長の長いもの、 短いもの等様々な量的 かつ質的な変化が挙げられる。 また、 細胞形態の改変としては、 細胞伸長の変化、 細胞の大きさの変化 (体積の量的変化） などが例示できるが、 これらに限定され るものではない。
本発明における形質転 m¾物体は、 例えば、 細胞壁合成量増大による植物の成 長量の増加、 繊維細胞形態の変化、 農作物の有用成分の増加などの新たな価値を 有する植物として有用である。 また、 細胞壁合成制御による新素材の開発、 飼料 作物の消化吸収効率の増加、 繊維細胞形態の変化などの新たな価値を有する植物 として有用である。
本発明において 「形質転換植物体」 とは、 上述した形質転換植物細胞を有する 植物体であり、 例えば、 上記形質転換細胞から再生された形質転 »物体がこれ に含まれる。 形質転換された植物細胞から個体を再生する方法は植物細胞の種類 により異なるが、 例えばイネでは Fujimuraら (Fujiraura et al. , Plant Tissue Culture Lett.， 2, 74, 1995) の方法、 トウモロコシでは、 Shillitoら （Shillito et al. , Bio/Technology, 7, 581, 1989) の方法、 ジャガイモでは、 Visserら (Visser et al. , Theor. Appl. Genet. , 78, 589, 1989) の方法、 シロイヌナズ ナでは Akamaらの方法 （Akama et al. , Plant Cell Rep. , 12, 7, 1992) ユー力 リでは土肥らの方法 （特願平 11 - 127025) が挙げられる。 これらの方法により作 出された形質転,物体またはその繁殖媒体 （例えば種子、 塊茎、 切穂など） 力、 ら得た形質転 物体は本発明の対象である。
本発明は、 植物、 特に樹木の細胞壁形成において特異的におよび/またはセル ロース生合成時において特異的に発現する遺伝子、 或いはこれらの相同体、 或い はこれらの遺伝子に連なるプロモータ一領域を有する発現べクタ一を宿主細胞に 導入して形質転換細胞を得て、 該形質転換細胞から形質転換植物体を再生し、 得 られた形質転換植物体力、ら植物種子を得て、 該植物種子から植物体を生産するェ 程を含む。
形質転 物体から植物種子を得る工程とは、 例えば、 形質転,物体を発根 培地から採取し、 水を含んだ土を入れたポットに移植し、 一定温度下で生育させ て、 花を形成させ、 最終的に種子を形成させる工程を指す。 また、 種子から植物 体を生産する工程とは、 例えば、 形質転; 物体上で形成された種子が成熟した ところで、 単離して、 水を含んだ土に播種し、 一定温度、 照度下で生育させるこ とにより、 植物体を生産する工程をいう。
なお、 形質転換植物体中の導入された外来 DNAまたは核酸の存在は、 公知の PC R法やサザンハイプリダイゼーシヨン法によって、 または植物体中の核酸の塩基 配列を解析することによって確認することができる。 この場合、 形質転 m¾物体 からの DNAまたは核酸の抽出は、 公知の J. Sambrookらの方法 （Molecular Clonin g, 第 2版， Cold SpringHarbor laboratory Press, 1989) に準じて実施すること ができる。
植物体中に存在する本発明の DNAを、 PCR法を用いて解析する場合には、 上記 のように再生植物体から抽出した核酸を铸型として増幅反応を行う。 また、 本癸 明の DNAの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌ クレオチドをプライマーとして用い、 これらを混合させた反応液中において増幅 反応を行うこともできる。 増幅反応においては、 DNAの変性、 アニーリング、 伸 張反応を数十回繰り返すと、 本発明の DNA配列を含む DNA断片の増幅生成物を得 ることができる。 増幅生成物を含む反応液を、 例えばァガロース電気泳動にかけ ると、 増幅された各種の DNA断片が分画されて、 その DNA断片が本発明の DNAに 対応することを確認することが可能である。
ー且、 染色体内に本発明の DNAが導入された形質転 ,物体が得られれば、 該 植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。 また、 該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料 （例えば種子、 果実、 切穂、 塊茎、 塊根、 株、 カルス、 プロトプラスト等） を得て、 それらを基に該植物体を 量産することも可能である。
本発明における形質転■物体をクローン植林により大規模に育成することに よって、 セルロースを核にしたバイオマスの安定的供給が可能となる。 現在、 ィ匕 石資源は工業生産において、 原材料や燃科 (エネルギー) として大量に使われて いる。 特にエネルギー代替については、 木質バイオマスを直接燃焼する （薪利 用） ことが発展途上国で日常的に行われているが、 これをさらに利用しやすい形 態 （アルコール：エチルアルコール） に変換することにより有効な対応が可能で あると考えられる。 実際、 ェタノ一ルはブラジルなどでサトウキビの絞り汁等に 由来する廃糖蜜からアルコール発酵により生産され、 自動車燃料として用いられ ており、 アメリカ、 EUにおいてもサッマイモゃトウモロコシのデンプンをいった ん加水分解させプドウ糖にしてからアルコール発酵を行つている事例が増えてい る。 アメリカでは 1999年 8月、 「2010年までにバイオマスのエネルギー活用を 一次エネルギー全体の 10%に高める」 と発表し、 その目的のひとつが、 バイオマ スから精製したエタノールをガソリンに混ぜて使う方法である。 具体的事例とし ては、 トウモロコシを原料とする gasohol (ガソリンへのエタノールのブレンド 割合が 10%) というエタノール燃料であり、 コーンベルト地帯を中心とする 20 州で使用され、 米国の自動車燃料全体の約 1 %を占めており、 砂糖キビの採れる 特定の州ではガソリンの 40%のシェアを占めており、 ァメリカ国内自動車全メー カーが gasoholを燃料として保証し、 具体的にはゼネラルモーター社ゃクライス ラー社はこの利用を推奨している。 EUでは 2010年に 1990年レベルの 8 %の温室 効果ガス削減をめざし、 再生可能エネルギーのシヱァを全エネルギーの 12%にす る計画が進行しており、 自動車代替燃料については、 2005年までに化石燃料の
5 %をバイオ燃料 （生物資源由来の燃料） で代替するという目標を設定している。 EUのエネルギー利用計画をみると、 太陽電池 （貢献度 1 %) 、 風力発電 （同 1 9%) 、 バイオマス *コージエネ （同 80%) となっており、 バイオマスに大きな 期待が寄せられている。 また、 2015年にはエネルギー用のバイオ作物の栽培が、 土地の最大利用面積を占める見込みとなっている。 しかしながら、 一方では食料 増産の観点から、 今後穀類やィモ類を大量に工業原料向けに消費することには限 界がある。 従って、 本発明により例えば、 セルロース含量が高いユーカリを大量 に育成できれば、 これから得られるリグノセルロースを原料に、 酸加水分解ある いは酵素分解 (セルラーゼ) 工程によりグルコースを得、 次いでアルコール発酵 によりェタノールを大量に生産することが可能であり、 このような工程の基礎技 術は既に確立されている。 さらに、 グルコースを原料に生分解性プラスチック (ポリ乳酸） を生産する技術は既に確立されており、 ィモ類のデンプンを用いて 工業生産規模での実用化が進展している。 し力、しながら、 将来的には食糧である 穀類に替わり、 樹木由来のバイオマスが主流になることが予想される。 尚、 リグ ニンについても、 実用化に関しては今後技術的な課題を克服する必要があるもの の、 プラスチックや接着剤などの用途が見込まれている。 また、 エネルギーの観 点から述べると、 リグニンは製紙産業のパルプ製造工程で化学的に分解され廃液 (黒液と呼ばれる） 中に含まれるが、 廃液中より必要な薬品を抽出した後に、 ェ 場内の燃料として活用しており、 別の言い方をすると既に燃料の一部を木質バイ ォマスに依存していることに他ならない。
本発明において木質バイオマスを安定的にかつ大規模に育成し、 植林による循 環を行うことによって、 従来の原料としての活用に加え、 バイオマス変換による 石油代替エネルギー、 さらにはセルロースあるいはへミセルロースから新規なプ ラスチックを創出する （こちらも技術的には可能） ことも充分考えられる。 さら に、 木質バイオマスの普及は、 エネルギーセキュリティや環境問題の解決策にな ると同時に、 農林業を始め新たな産業の開発や就労機会の創出にもつながる。 図面の簡単な説明
図 1は、 ユー力リのあて材における主要遺伝子群の発現強度を示す写真である。 ユー力リあて材、 および通常材より抽出した 2種の mR Aを各々 2種の蛍光色素 (cy3. cy5) により標識し、 オリゴマイクロアレイ解析におけるプローブとして用 レ、、 ハイプリダイゼーシヨンを行い、 蛍光強度をスキャンして得られた画像を、 口ゼッタ社製の解析ソフトウエア （Luminator Ver. 1. 0)にて解析し、 反復実験す ベてを統計的信頼度 99. 9%にて統合し、 ユー力リのあて材における主要遺伝子群 の発現相対強度を表した。 写真中、 + (赤）は発現上昇が有意に認められるもの、 + (緑）は発現減少が有意に認められるもの、 + (青）は発現に変化が認められない ものを示す。 発明を実施するための最良の形態
以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明は以下の実施例に 限定されるものではない。 なお、 実験手法に関しては、 特に記載のない限り、 「クローユングとシークェンス」 （渡辺格監修、 杉浦昌弘編集、 農村文化社 (198 9年） ) や、 （"Molecular Cloning (Sambrookら（1989) , Cold Spring Harbor Lab oratory Press) 」 などの実験書に従った。
(実施例 1 ) ユー力リ ESTデータベースの作製
( 1 ) ユーカリからの RNA抽出
抽出の対象となるユーカリ組織については、 幹の肥大成長部 （2次壁肥厚帯； 形成層に富む組織） 、 葉、 根とし、 傾斜刺激、 塩溶液暴露によるストレス付与等 様々な状況からの遺伝子発現を想定している。 抽出の基本的な方法は、 日尾野ら の方法 （特願平 6—219187) に記載の方法である。 下記にはその実施例として、 水耕栽培によるユー力リの根を材料に用いた RNAの抽出方法を詳細に説明する。
2ヶ月間生育したユーカリ （Eucalyptus camaldulensis) 幼植物体を水耕培養 槽に移植した。 水耕栽培は Hoagland-Arnonらの培養液を用いて行った。 水耕培養 液の組成は、 5. OmM KN03、 3. OmM Ca (N03) 2、 2. OmM NH4H2P04、 2. OmM MgS04、 47 M M H3B03、 9. 0 μ Μ MnCl2、 36 FeS04、 ^Λ μ Μ. ZnS04、 0. 16 Μ CuS04、 75nM (NH 4) 6Mo7024であり、 脱塩水を用いて調製し、 p Hは毎日 0. 1Mの NaOHあるいは K0Hで 6. 0に調整した。 更に、 1週間毎に培養液すベてを交換した。 ストレス処理を行 う場合は、 この培養液に栽培 1日目以降 4日目まで最終濃度が順次 50, 100, 200, 3 OOmMになるように NaClを添加した培養液をストレス処理区、 NaCl無添加培養液 をコントロールとした。 4日目に根 10 gを小片にし、 液体窒素中で摩砕した。 こ れを 50ml遠心チューブ （NUNC社製） に移し、 ガラスビーズを 10g加えた後、 ホ モジナイザーで 5分間摩砕した。 これにジチオスレィトール ( 1 mg/ml) を含むメ タノール溶液を用いて上清に着色が認められなくなるまで ( 3回程度) 摩碎試料 の溶媒抽出を繰り返した。 抽出終了後、 試料を凍結乾燥させた。 この凍結乾燥試 料を 25mlの p H 9 ΙΟΟηιΜ CHES緩衝液 （使用直前に 20ミリグラムのジチォスレ ィトール、 lOraMバナジルリポヌクレオシド化合物溶液を添加) と混合し 65°Cで 3 0分間保温した。 保温終了後の試料溶液中に、 5 M塩化ナトリウム溶液及び 10%CT AB溶液を添加した。 この際、 添加後の試料溶液中における塩ィ匕ナトリウム濃度は 1. 4M、 CTAB濃度は 1 % (w/v) となるようにした。 試料溶液をよく混合した後 6 5°Cで 10分間保温した後、 等量のクロ口ホルム：イソアミルアルコール （= 2 4 : 1 ) 溶液を添加し、 緩やかに、 かつ充分に混合した。 混合後、 遠心操作によ り上清を回収した。 上清に対し、 55%容のイソプロパノールを添加し、 1時間氷冷 した。 遠心操作により沈殿を得、 これを水に溶解させた後、 フエノール抽出を行 つた。 フエノール抽出後の上清に 10%容の 3 M酢酸ナトリゥム溶液おょぴ 60%容の イソプロパノールを添加し、 よく混合した後、 遠心操作により沈殿を回収した。 沈殿を滅菌水にて溶解した後、 終濃度 3Mとなるように 12M塩ィ匕リチウム溶液を 添加し、 よく混合した後、 1時間氷冷した。 遠心操作により R A沈殿を回収し、 洗浄、 乾燥を経て、 最終的に水 100 /z Lに溶解させ、 totalR NA画分を得た。 こ の結果、 ス トレス処理区の根、 コントロールの根から、 それぞれ 610 μ gの全 RNA を得ることが出来た。 全 R N A画分からの mRNAの精製は PolyATtract mRNA Isol at ion Systemlll &IVキット (Cat. # Z5300& Z5310 プロメガ社製 USA) を用い た。 この結果、 610 gの totalRNAからス トレス処理区サンプルからは 1. 3 g、 コント口ールサンプルからは 1. 8 gの mRNAを得た。
( 2 ) cDNAライプラリーの構築 ( 1 ) で示した方法により得られた各種組織、 状況由来のユー力リ mRNAを、 ク ロンテック社の Smart cDNA library construction kitを用いて cDNAを合成し、 最終的にファージミ ドライブラリーとした。 こうして作成されたゲノム DNAライ ブラリーは、 各々が 1 X 106pfu 以上の独立のクローンからなるものであった。 尚 ライブラリーの増幅は作製した一部に対して行い、 クローンの解析には増幅をか けずに供した。
( 3 ) cDNAクローンの解読とデータベース構築
各組織由来のユーカリファージミド cDNAライブラリーより、 クローンをランダ ムに選抜し、 プラスミ ドを精製後、 アマシャム社のダイターミネータ一シークェ ンスキットによる酵素反応を経て、 同社の大規模高速シーケンサーを用いて、 塩 基配列データの取得を行つた。
データ解析は、 プラスミ ド由来の既知配列を削除した後、 解析ソフトウェアに より、 クラスタリング操作により相同配列の抽出を行った。 その後、 遺伝子情報 データベースの 1つである米国 . GenBank の全データベースとの比較検索により おおよその機能予測 （ァノテーシヨン） をおこなった。
最終的なデータベースの規模については表 1の通りである。
表 1
Figure imgf000034_0001
(実施例 2 ) ユー力リあて材形成組織において特異的に発現する遺伝子の抽出 ( 1 ) ユーカリ樹幹特異的オリゴマイクロアレイの作製
表 1に示すユー力リ ESTデータベースより、 0JI001ならびに 0JI005よりクラ スター内の重複配列を除いた全配列を対象に、 ユー力リオリゴマイクロアレイの 作製を行った。 なお、 実際の作製は、 アジレントテクノロジ一社 （日本国内代理 店は、 横河アナリティカルシステムズ） に委託した。 詳細については下記ホーム ヘーンに 述 5·れている。 http ://www. chem. agi丄 ent. com/ cag/ country/ JP/ produc ts/PCol494. htm
このようにして作製したユーカリオリゴマイクロアレイは、 8400個のオリゴ DN Aを収録しており、 ユー力リ樹幹部で発現を認める遺伝子の大部分を網羅可能で あ
( 2 ) マイクロアレイ解析によるユーカリあて材形成組織において特異的に発現 する遺伝子の抽出
細胞壁構成の主要成分であるセルロース生合成については、 特に広葉樹におい て、 外的な傾斜刺激により、 細胞壁中のセルロース含量が約 2倍に増加する組織 形成を行うことが知られており、 このような組織に対し、 上述のゲノム科学的解 析を行うことで、 細胞壁形成時において、 特にセルロース生合成を担う一連の遺 伝子を総括的に捉えることが可能となる。 加えて、 ESTデータを用いたマイクロ ァレイ解析による遺伝子発現解析を組み合わせることにより、 各構成遺伝子の発 現差を捉えることも可能である。
上述の外的傾斜刺激による特異的現象については、 古くから引っ張りあて材と して知られる。 広葉樹のあて材とは、 外的傾斜刺激を受けた場合、 樹幹が重力方 向の変化を感知し形成される特殊な二次木部である。 これを通常材と比較すると、 細胞壁成分については、 セルロースが増大し、 リグニン、 へミセルロースが減少 する。 また、 形態的観察では、 導管分布密度が通常材の半分に減少、 細胞壁中の ミクロフィプリル傾角が細胞長軸方向に対しほぼ並行には移行する。 さらに繊維 長は約 2 0 %の増加が認められた。 詳細は不明であるが、 傾斜に対し、 既に伸長 成長の終わった幹を重力に対して正しい位置に戻そうとする成長応力が発生して いるものと考えられている。 傾斜を継続していくとやがては、 主幹に代わって枝 の 1つが新たに垂直に伸長、 肥大成長を行う。 しかしながら、 傾斜に対して起き あがろうとする期間には、 傾斜上部の組織に、 セルロース含量が極めて高くなる 組織が形成され、 樹幹断面を観察すると、 視覚的にも通常の材組織とは異なる半 透明状の組織が容易に認められる。 あて材の総説は、 木材関連の専門書には必ず 記載されているが、 ユーカリについては、 馬場らの論文 （Mokuzai Gakkaishi 42, 795-798, 1996) が化学的 ·組織学的性質に対する詳細なデータを記述している。 本発明者は、 実施例 1に示した RNA抽出方法に従って、 ユーカリ、 カマルドレ ンシス種のクローン系統 （CPT1) を材料に全 R Aを抽出した。 この際、 通常の植 物体おょぴあて材を用いた。 あて材は、 通直に生育している樹幹を人為的に約 45 度に引っ張り傾斜させることによって、 樹幹上部に特異的な組織が形成される。 通常個体とあて材から得られた全匿から、 プロメガ社製の PolyATract rnRNA Is olation Systemにより、 mR Aを精製した。 このようにして得られた 2種の mR A を各々 2種の蛍光色素 （cy3. cy5) により標識し、 オリゴマイクロアレイ解析にお けるプローブとして用い、 ハイプリダイゼーシヨンを行った （図 1 ) 。 標識を含 むハイプリダイゼーションの方法はアジレントテクノロジーより提示の解析プ口 トコルに従った。
その結果、 通常の樹幹と比較して、 ユーカリあて材において優位に発現が高い 遺伝子群、 低い遺伝子群、 ほぼ発現に変化を認めない遺伝子群に大別された。 特 に、 ユーカリあて材において優位に発現が高い遺伝子群については、 細胞壁成分 生合成およぴ木繊維細胞形態形成に関与していると考えられる。 具体的には、 あ て材に特徴的である、 高セルロース、 低リグニン量といった形質の発現に直接的 に関与していると考えられる。 産業上の利用の可能性
本発明の DNAを利用することにより、 樹木における木質バイォマス生産を人為 的に制御し、 特にはその本質である細胞壁成分 （セルロース 'へミセルロース . リグニン） の量並びに質を可変すること、 さらに繊維形態 （木繊維細胞の伸長） を自由に可変することが可能となった。 即ち、 木質バイオマスの量的な増大並ぴ に質的な改良が見込まれ、 これによつて将来のエネルギー利用や工業原料として の活用における用途の拡張が見込まれ、 様々な分野で現在の化石原料に置き換わ ることが期待できる。

Claims

請求の範囲
1. 以下の （a) または （b) に記载の植物の細胞壁成分生合成おょぴ木繊維 細胞形態形成時において発現が上昇する DNA。
(a) 配列番号： 1〜 862のいずれかに記載の塩基配列からなる DNAとスト リンジェントな条件下でハイブリダイズする DNA。
(b) (a) に記載の DNAからコードされるァミノ酸配列からなるタンパク質 と 50%以上の相同性を有するタンパク質をコードする DNA。
2. 植物のあて材形成組織において発現が上昇する、 請求項 1に記載の DNA。
3. 以下の （a) または （b) に記載の植物の細胞壁成分生合成おょぴ木繊維 細胞形態形成時にぉレヽて発現が減少する DNA。
(a) 配列番号： 863〜 1731のいずれかに記載の塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件下でハイプリダイズする DNA。
(b) (a) に記載の DNAからコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質 と 50%以上の相同性を有するタンパク質をコードする DNA。
4. 植物のあて材形成組織において発現が減少する、 請求項 3に記載の DNA。
5. 植物がユーカリである、 請求項 1〜4のいずれかに記載の DNA。
6. 請求項 1〜 5のいずれかに記載の DNAからコードされるァミノ酸配列にお いて、 1または複数の塩基が置換、 欠失、 付加、 および Zまたは揷入された ァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA。
7. 請求項 1〜 5のいずれかに記載の DNAのプロモーター DNA。
8. 以下の (a) 〜 (e) のいずれかに記載の DNA。
( a ) 請求項 1〜5のいずれかに記載の DNAの転写産物と相捕的なアンチセン ス RNAをコードする DNA。
(b) 請求項 1〜5のいずれかに記載の DNAの転写産物を特異的に開裂するリ ボザィム活性を有する RNAをコードする DNA。 ( c ) RNAi効果により、 請求項 1〜5のいずれかに記載の DNAの発現を抑制 する RNAをコードする DNA。
( d ) 共抑制効果により、 請求項 1〜5のいずれかに記載の DNAの発現を抑制 する RNAをコードする DNAo
( e ) 請求項 1〜 5のいずれかに記載の DNAの転写産物に対してドミナントネ ガティブな形質を有するタンパク質をコードする D Ao
請求項 1〜6、 または 8に記載の DNAを有する組換えベクター。
. 請求項 7に記載のプロモーター DNA、 または請求項 9に記載のベクターを 含むプラスミドを保持する微生物。
. 請求項 9に記載のベクターが導入された形質転 物細胞。
. 請求項 1 1に記載の形質転換植物細胞から再分化した形質転換植物体。. 請求項 1 2に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、 形質 転嫌物体。
. 請求項 1 2または 1 3に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
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