WO2004076472A1

WO2004076472A1 - 新規なグアノシン誘導体及びその用途

Info

Publication number: WO2004076472A1
Application number: PCT/JP2004/002068
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Sugiyama; Yan Xu; Reiko Ikeda
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2003-02-28
Filing date: 2004-02-23
Publication date: 2004-09-10
Also published as: US20060235219A1; JP2004262791A; US7550581B2; EP1604995A1; JP3936300B2; EP1604995A4

Description

明細書新規なグアノシン誘導体及びその用途技術分野

本発明は、例えば、 Z型 DNAを安定化するための試薬等として有用な新規なグアノシン誘導体と、これを用いた Z型 DN Aの安定化方法に関する。背景技術

Z型 DN Aは約 3 0年前に発見された左巻きの DN A構造を有するヌクレオチドであるが、その生物学的な役割は未だ不明である。その理由は、溶液中で安定に左巻きを取らせることが、研究用に用いる 6— 2 0量体程度の長さでは難しいためにある。従って、 Z型 DNAを研究するためには Z型 DNAを安定化するモノマ一ュニッ卜の開発が必要である。

本発明者らは、先にデォキシ型の 8—メチルグアノシン ( M e G ) によって、 Z型 D N Aが安定化されることを見出し-, 文献等により報告している（例えば、先行技術文献 1参照。）。また、このデォキシ型の 8—メチルグアノシンを用いてこれまで種々の研究を行ってきた（例えば、先行技術文献 1、先行技術文献 2、先行技術文献 3 , 先行技術文献 4等参照。 ) 。

この 8—メチルデォキシグアノシンの使用により、これまで極めて困難であつた Z型 D N Aの安定化が取り敢えず可能になった。しかしながら、未だ充分と言うまでには到っておらず、 Z型 DNAをより効果的に安定化するモノマ一ュニットを探索する、更なる検討が待たれている現状にある。本願の発明に関連する先行技術文献としては次のものがあり、これは参照して本明細書中に取り込まれる。

1. Suiyama, H.； Kawai , K.； Matsunaga, A,； Fuj imoto, K.； Sai to, I.； Robinson, H.； Wang, A. H. -J. , " Synt es i s, Structure and Thermodynamic Properties of 8- Methylguanine - Containing Oligonucleotides Z-DNA under Physiological Salt Conditions,; Nucleic Acids Res. , 1996, 24, 1272.

Kawai,K.； Saito.I.； Sugiyama, H. Conformat i on Dependent

Photochemistry of 5-Halouracil -Containing DNA: S t er eospee i f i c V a -Hydroxylation of Deoxyr ibose in Z - form DNA. ； J. Am. Chem. So 1999, 121, 1391-1392.

Kawai, K.； Sa'i t o, I .； Kawasliima, E. ; I sh ι do, Y.； Sugiyama, H. , " Intras tr and 2' β - Hydrogen Abstraction of 5' -Adj acent Deoxy guanos ine by Deoxyur idin-5-yl in Z form DNA. "； Tetrahedron Letters 1999, 40, 2589-2592. ·

Oyoshi, T.； Kawai, K.； Sugiyama H. , "Efficient C2' a -Hydroxylat ion of Deoxyr ibose in Protein-Induced Z-Form DNA. ； J. Am. Chem. Soc. , 2003,

125, 1526-1531. 発明の開示

本発明は、上記した如き現状に鑑みなされたもので、 Z型 DNAをより効果的に安定化し得る.新規なモノマ一ュニットと、該モノマ一ュニットをオリ fヌクレォチドに組み込むための試薬、並びに該試薬を用いた Z型 DN Aの安定化方法を提供することを目的とする。

(式中、 R¹はァシル基を表し、 ' R²は低級アルキル基を表し、 R³はトリ置換シリルォキシ基又はテトラヒドロピラニルォキシ基を表し、 R ⁴はシァノエチル基又はァリル基を表す。）で示されるグアノシン誘導体に関する。

また、本発明は、上記グアノシン誘導体を含んでなる、 Z型 D N Aを安定化するための試薬に関する。

更に、本発明は、上記グアノシン誘導体を用いることを特徴とする、 Z型 D N Aの安定化方法に関する。

更にまた、本発明は、上記グアノシン誘導体を用いることを特徴とする、 8位に低級アルキル基を有するグアノシンのオリゴヌクレオチドへの導入方法に関する。

また、本発明は、 8位に低級アルキル基を有するグアノシンを導入してなるォリゴヌクレオチドに関する。

即ち、本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、グアノシンの 8位にメチル基を導入した 8 一メチルグアノシンが、前記 8—メチルデォキシグアノシン ( M e G ) に比べ、数倍強力に Z型 D N Aを安定化することを見出し本発明を完成するに到った。図面の簡単な説明

第 1図は、実施例 3で得られた.. 本発明に係る 3種のオリゴヌクレオチドについての円二色性分光 ( C D ) スぺクトルである。発明を実施するための最良の形態

上記一般式 [ 1 ] において、 R ¹で表されるァシル基としては、ァミノ基の修飾基としてこの分野で通常使用されているァシル基であればどのようなものでもよいが、例えば、イソプチリル基、ベンゾィル基、 4 一 ( t 一プチル) ベンゾィル基等、嵩高いァシル基が好ましいものとして挙げられる。

また、 R ²で表される低級アルキル基としては、例えば、メチル基、ェチル基、 n—プロピル基、イソプロピル基、 n—ブチル基、 s —ブチル基、 t 一ブチル基等、炭素数 1 ~ 4の低級アルキル基が好ましいものとして挙げられるが、合成のし易さ等の点から、メチル基が特に好ましい。上記一般式 [ 1 ] において、 R³で表されるトリ置換シリルォキシ基としては、例えば、 t一プチルジメチルシリルォキシ基、トリイソプロピルシリルォキシ基、トリフエニルシリルォキシ基等、嵩高いトリ置換シリルォキシ基が好ましいものとして挙げられる。

上記一般式 [ 1 ] で示される本発明のグアノシン誘導体は、 Z型 DNAを安定化するモノマーュニッ卜として極めて有用である。

即ち、上記一般式 [ 1 ] で示される本発明のグアノシン誘導体を用いることにより、 Z型 D N Aを強力に安定化することが出来る。

より詳しくは、本発明のグアノシン誘導体を用いて、 DNA固相合成法により、 8位に低級アルキル基を有するグアノシンを DN Aへ導入することにより、 Z型 DN Aを安定化させることが出来る。

因みに、一般式 [ 1 ] において、 R ¹がイソプチリル基であり、 R ²がメチル基であり、 R ³が t—プチルジメチルシリルォキシ基であり、 R ⁴がシァノエチル基である本発明のグアノシン誘導体を用いて、 8一メチルグアノシンを各種オリゴヌクレオチドに導入したものは、同様の手法で 8ーメチルデォキシグアノシンを各種ォリゴヌクレオチドに導入したものと比べて、 B - Z転位中点が著しく低下し、数倍〜数十倍も安定化効果があることが判った。

本発明のグアノシン誘導体の製造法を一般式 [ 1 ] において、 R¹がイソプチリル基であり、 R²がメチル基であり、 R ³が t—プチルジメチルシリルォキシ基であり、 R⁴がシァノエチル基であるグアノシン誘導体の場合を例にして、反応スキームで示すと以下のようになる。

上記反応スキーム中、

a) の工程は、ピリジン中、トリメチルシリルクロライド.，次いで、無水イソ酪酸を作用させる。

b ) の工程は、水溶媒中、 H₂S '〇₄、 F e S 0₄、 t —プチルハイド口パーォキサイドを作用させる。 '

. c ) の工程はピリジン中、ジメトキシトリチルクロライド . トリェチルアミン、 4ージメチルアミノピリジンを作用させる。

d ) の工程は, ジクロロメタン中、イミダゾールと 2 '— t 一プチルジメチルシリルクロライドを作用させる。

e ) の工程は、ジクロロメタン中、 N， N—ジイソプロピルァミンと 2—シァノエチル N， N—ジイソプロピルフォスフォロアミダイトを作用させる。

なお、詳細は、後記実施.例の項参照。 .

なお、上記 b) の工程はグアノシンの 8位のメチル化の工程であるが、ここでは、 .Tetrahedron 30, 2677-2682 (1974)に記載の方法を採用しているが、グアノシンの 8位のアルキル化は、メチル化を含め、下の方法によっても可能である。即ち、リポースの水酸基を例えば t —プチルジメチルシリル基等で保護した後、リチウムジイソプロピルアミン（LDA) で 8位をリチォ化し、次いで、これを適当なアルキルハラィドと反応させれば選択的にアルキル基が導入できる。従つて、他のアルキル基を導入する場合はこの方法で行えばよい [Chem.Pharm.Bull· ， 72 - 79 (1987)参照。 ] 。勿論、メチル基を導入する場合もこちらの方法で行つてもよい。

本発明のグアノシン誘導体を用いて、 8位に低級アルキル基を有するグアノシンをオリゴヌクレオチドへ組み込む方法としては、市販の D N A合成機を使用した D N Aオリゴマーの固相合成法が挙げられる。操作手順等はそれぞれの D N A 合成機に添付されているプロトコ一ルに従つでこれを行うことで足りる。なお、特願 2 0 0 3— 0 5 2 8 1 7明細書に記載された内容を、本明細書にすベて取り込む。実施例

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。実施例 1 8—メチル— N—イソプチリル一 5 '— O—ジメトキシトリチルー 2 ' 一 t一プチルジメチルシリル一グアノシン一 ( 2一シァノェチル一 N， N—ジィソプロピルフォスフォロアミダイト (化合物 ) (一般式 [ 1 ] において、 R ¹がイソプチリル基、 R ²がメチル基、 R ³が t 一プチルジメチルシリルォキシ基、 R

⁴がシァノエチル基であるグアノシン誘導体）の合成

( 1 ) N—イソプチリル—グアノシン（化合物丄）の合成

グアノシン（ 7 g , 2 5 mm o 1 ) を、ピリジンで 3回乾燥させ、ピリジン

( 1 0 mL ) 中で、 1 7. 5 m L ( 1 2 5 mm o 1 ) のトリメチルシリルクロライドを加えて、 2時間撹拌した後、 2 1 mL ( 1 2 5 mm o 1 ) の無水イソ酪酸を加えて室温で 4時間撹拌反応させた。反応後、氷冷しながら、水（ 3 5m L) を加えて 1 5分間撹拌した後、 2 9 %アンモニア永 ( 3 5 mL ) を加えて 1 0分間撹拌した。減圧濃縮して溶媒を溜去した後、 2 0 0 mLのジクロロメタンで抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ一（展開溶媒：メタノール/ジクロロメタン = 2/8) で精製し、化合物丄を 3. 6 g得た（収率 3 9 %) 。

得られた化合物のスペクトルデータを以下に示す。

JH NM R (500 MHz, D SO-de) δ 8.24 (s, 1Η, H- 8), 5.80 (m， 1H， 1'), 4. 42 (m， 1H, 2')， 3.88 (m 4')， 4.08 (m, 1H, 3'), 3.33 (m, 2H, 5'), 2.77 ( m, 1H， isobutyryl CH )， 1.12 (d， 6H, J = 7Hz, 2 CH₃) p pm。

(2) 8—メチルー N—イソプチリル一グアノシン (化合物 ) の合成

( 1 ) で得られた化合物丄（ 1 g， 2. 6 mm o 1 ) と F e S〇₄ ' 7 H₂0 (6. 7 g , 24. Immo l ) を含む H₂S 0₄ ( 1 N) 溶液 1 6 0 mLに 7 0 % t一ブチルハイドロパ一ォキサイド（9. 5 mm o 1 ) を含む 1 0 0 mL水溶液を 5分間で滴下し、 0°Cで 1時間反応後、 KOH飽和水溶液で中和した。遠心分離により得られた上澄み液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ一（展開溶媒：メタノール/ジクロロメタン = 1/9) で精製し、化合物！_ を 0. 4 g得た（収率 4 1 %) 。

得られた化合物のスぺクトルデータを以下に示す。

Ή NMR (500 MHz, DMSO-de) o 5.81 (m, 1H， )， 4.32 (m, 1H, 2')， 3.86 (m 4')， 4.12 (m， 1H, 3'), 3.29 (m, 2H, 5')' 2.78 ( m, 1H, isobutyryl CH ), 2.47 (s、 3H、 - 8 C H 3 ) 1.11 (d, 6H， J = 7Hz, 2C H ₃) p p m。

(3) 8—メチル _N—ィソプチリル一 5 '— O—ジメトキシトリチル一グアノシン（化合物）の合成

( 2 ) で得られた化合物 ( 5 0 0 m g、 2. 4 mm o 1 ) を、ピリジンで 3 回乾燥させ、ピリジン（ 1 5mL) 中で、 7 0 0mg ( 3. 7 mm o 1 ) のジメトキシトリチルクロライド（DMT r C l ) 、 0. 3 mL ( 2. I mmo l ) のトリェチルアミン、 4. 2 m g (0. 0 3 5 mm o 1 ) の 4一ジメチルアミノピリジンを加えて室温で一晩撹拌反応させた。反応後、反応液に 5 %の N aHCO ₃水溶液（ 5 0m l ) を氷冷しながら加えた後、 6 0 mLのジクロロメタンで抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：メタノール/ジクロロメタン = 3/9 7 ) で精製して化合物 Aを 0. 5 g得た（収率 6 0 %) 。

得られた化合物のスぺクトルデ一夕を以下に示す。

^XH NMR (500 MHz, DMS0-d₆) δ 5.81 (m, 1Η, Γ), 4.32 (m, 1H, 2')， 3.86 (m 4'), 4.12 (m, 1H, 3')， 3.29 (m, 2H, 5')， 2.78 ( m， 1H, isobutyryl CH )' 2.47 (s、 3H、一 8 CH₃) 1.11 (d, 6H, J = 7Hz, 2CH₃) p pm。

(4) 8 —メチル— N—イソプチリル一 5 '— O—ジメトキシトリチル一 2 ' — t 一プチルジメチルシリル一グアノシン (化合物 J_) の合成

( 3 ) で得られた化合物！ _ ( 1 g、 1. 4 mm o 1 ) とイミダゾ一ル ( 2 3 8 g , 3. 5 mm o 1 ) を含むジクロロメタン溶液 2 5 mLに 2 '— t 一ブチルジメチルシリルクロライド ( 2 5 2 m g) を加えて 2 0 °Cで 1 6時間撹拌反応させた。反応後、反応液に 1 0 %N a H C O ₃水溶液 3 0 m 1 を加えた後、 4 0 mLのジクロ口メタンで抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー (展開溶媒：へキサン/酢酸ェチル = 5 /1 ) で精製して化合物 Aを 0. 3 g得た (収率 3 0 %) 。得られた化合物のスぺクトルデータを以下に示す。

:H NMR (500 MHz, DMS0-d₆) δ 7.20-7.39 (m， 9H, ph) , 6.89 (d， 4H， J = 8.5Hz. ph), 4.96 (m, 1H, Γ), 4.16 (m， 1H. 3'), 3.74 (s， 6H, 2C H₃), 3. 18 (m, 2H， 5' ), 3.02 (m, III 6'), 2.77 (m, 1H， isobutyryl CH)， 2.14 (m， 1 H， 2'), 2.05 (m， 2H, 2' ' and 4')， 1.88 (s, 3H, -8CH₃)， 1.62 (ra， 1H, 6' '), 1.10 (d, 6H, J = 7Hz, 2C H₃) p pm。

( 5 ) 8 —メチルー N—イソプチリル一 5 '— O—ジメトキシトリチル一 2 '— t 一プチルジメチルシリル一グアノシン一 ( 2 —シァノエチル一 N, N—ジイソプ口ピルフォスフォロアミダイト（化合物の合成

( 4 ) で得られた化合物 J_ ( 3 0 0 m g， 0. 4mmo 1 ) をゴムシールドポトルに入れ、密封した後乾燥ァセトニトリル 3 mLを加え、針を通じて減圧しァセトニトリルを蒸発させ水を共沸させた。乾燥ジクロロメタン 3 mLをシリンジで注入し、乾燥 N， N—ジイソプロピルアミン（ 0. 4 5 mL、 0. 6 mm o 1 ) と 2—シァノエチルー N， N—ジイソプロピルフォスフォロアミダイト（0. 2 5mL、 1 mm o 1 ) を加えて室温でー晚撹拌反応させた。反応後、反応液に 1 0 % N a H C 0₃水溶液 1 0m l を加えた後、 2 OmLのジクロロメタンで抽出し、有機層を N a ₂S〇₄で乾燥させ、シリカゲルカラムクロマトダフィー（展開溶媒：へキサン/ァセトン/トリェチルァミン =4 9/4 9/2) で精製して化合物を 240 mg得た（収率 6 0 %) 。

得られた化合物のスぺクトルデータを以下に示す。

E S I MS (m/e) C₅₂H₇₅N₇。₉P S i として：計算値（M + H) 1 0 0 0. 5。実測値 1 0 0 0. 8。（P E S C I EX AP I 1 6 5を用いて測定）実施例 2 D N Aオリゴマーの固相合成

実施例 1で得られた化合物 ( 2 0 0 m g , 0. 2 mm o 1 ) をゴムシ一ルドポ卜ルに入れ、乾燥ァセトニトリル 2 mLを加え減圧して蒸発させた後、 0. 3 mLの乾燥ァセトニトリを加えて溶解し、 OL I GO 1 0 0 0 DNA合成機 (べックマン社製) に取り付け、オリゴヌクレオチド d (C GCM e r G C G) 、 d (CM e r GCACM e r G C G ) 及び d ( C M e r G C A T M e r G T G) を DNA合成機に添付されたプロトコ一ルに従って合成した。

合成したオリゴヌクレオチドの組成と濃度は.. 酵素分解によってモノヌクレオシドに加水分解することによつて確認した。

なお、上記オリゴヌクレオチドの式中、 Me r Gは 8一メチルグアノシンを表す。実施例 3 円二色性分光実験（Circular Dichroism Experiments)

実施例 2で得られた 3種のオリゴヌクレオチドについて、円二色性スぺクトル解析を円二色性分光計 A V I V MOD E L 6 2 D S/2 0 2 CD s p e c t r o p h o t ome t e r (ァビブ社製）を用いて測定した。オリゴヌクレオチド（濃度： 0. 1 5mMベ一ス濃度、 5 mM 力コジル酸ナトリウム緩衝液、 pH 7. 0 ) の CD (円二色性分光）スペクトルは種々の N a C 1濃度において 1 c mの長さセルを使用して測定した。結果を第 1図に示す。第 1図の（ a ) は、オリゴヌクレオチド 5 '— C G CM e r GC G— 3 'についての C Dスペクトルの結果を、（b) は、オリゴヌクレオチド 5 '— C M e r G C A CM e r G C G— 3 'についての CDスぺクトルの結果を、（ c )'は、 .オリゴヌクレオチド 5 '— CM e r GCATMe r GT G— 3 'についての CDスペクトルの結果をそれぞれ示す。

また、塩濃度を変化させ、 CDスぺク小.ルを測定して B— Z転移の中点の N a C 1濃度を求めた。結果を表 1に示す、また、比較のため、 8—メチルグアノシン（Me r G) の代りに 8—メチルデォキシグアノシン (M e G) が導入されたオリゴヌクレオチドについて同様に測定した結果も表 1に併せて示す。

'なお、表 1中、 M e Gは 8ーメチルデォキシグアノシンを表し-, Me r Gは 8 一メチルグァソシンを表す。

実験 1 d、し " し y 2.6 M 実験 2 d(CGCMeGCG) 30 mM 実験 3 d(CGCMerGCG) <5 mM 実験 4 d(CGCGTGCG)/d(CMeGCACMeGCG) 800 mM 実験 5 d(CGCGTGCG)/d(CMerGCACMerGGG) 50 mM 実験 6 d(CMeGCATMeGTG)/d(GCGTACAG) 2450 mM 実験 7 d(GMerGGATMerGTG)/d(GCGTACAC) 200 mM 表 1から明らかなように、各種ォリゴヌクレオチドに 8—メチルグアノシンを組み込むことにより、何れの場合も、転移中点が著しく低下し、非常に低い塩濃度でも Z型 DNAを安定化することが判る。その理由としては、グアノシンの 8 位にメチル基を導入すると、. その塩基が s y nの配向をとり易くなり、更に、糖の 2 '位に水酸基を導久することにより親水性が高まり、糖のパッカリングが C 3 ' e n d oコンホメーシヨンをとることによって更に安定化するためであると考えられる。産業上の利用可能性

本発明は、 Z型 DNAをより効果的に安定化し得る新規なモノマーュニッ卜である 8—メチルグアノシンと、これをオリゴヌクレオチドに組み込むための試薬である一般式 [ 1 ] で示されるグアノシン誘導体と、これを用いた Z型 DNAの安定化方法を提供するものであり、本発明に係るグアノシンの 8位にメチル基を導入した 8—メチルグアノシンは、従前から知られている 8—メチルデォキシグァノシン（Me G) に比べ、数倍強力に Z型 DN Aを安定化することが出来るので、 Z型 D N Aを研究する上で画期的なツールとなることが予想される。

Claims

求の範囲

下記一般式 [.1 ]

(式中、 R¹はァシル基を表し、 R ²は低級アルキル基を表し、 R ³はトリ置換シリルォキシ基又はテトラヒドロビラ二ルォキシ基を表し、 R⁴はシァノェチル基又はァリル基を表す。また、 DMT rはジメトキシトリチル基を表す。）で示されるグアノシン誘導体。

2. —般式 [ 1 ] において、 R²がメチル基である請求の範囲第 1項に記載のグァノシン誘導体： "

3. —般式 [ 1 ] において、 R ¹がイソブチリル基であり、. R²がメチル基であり、 R ³が tーブチルジメチルシリルォキシ基であり、 R ⁴がシァノエチル基である請求の範囲第 1項に記載のグアノシン誘導体。

4. 請求の範囲第 1項〜第 3項の何れかに記載のグアノシン誘導体を含んでなる、 ' Z型 D N Aを安定化するための試薬。

5. 請求の範囲第 1項〜第 3項の何れかに記載のグアノシン誘導体を用いることを特徴とする、 Z型 D N Aの安定化方法。

6. 請求の範囲第 1項〜第 3項の何れかに記載のグアノシン誘導体を用いることを特徴とする、 8位に低級アルキル基を有するグアノシンのオリゴヌクレオチドへの導入方法。

7. 8位に低級アルキル基を有するグアノシンを導入してなるオリゴヌクレオチド。