WO2004058842A1 - Procede de fabrication d’un vecteur de molecules actives applicables dans le domaine de la diffusion de principes actifs et vecteur obtenu - Google Patents

Procede de fabrication d’un vecteur de molecules actives applicables dans le domaine de la diffusion de principes actifs et vecteur obtenu Download PDF

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WO2004058842A1
WO2004058842A1 PCT/FR2003/050204 FR0350204W WO2004058842A1 WO 2004058842 A1 WO2004058842 A1 WO 2004058842A1 FR 0350204 W FR0350204 W FR 0350204W WO 2004058842 A1 WO2004058842 A1 WO 2004058842A1
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    • A61P37/08—Antiallergic agents

Definitions

  • the present invention relates to a process for manufacturing a vector of active molecules, applicable in the biomedical field for the diffusion of active principles.
  • Such a vector is applicable to the diffusion of active principles in the human, animal and plant fields.
  • the invention also covers the biomedical vector resulting from this process.
  • certain active ingredients are metabolized prematurely before having reached their target.
  • certain molecules can exhibit sufficient therapeutic activity, these molecules must be grafted onto vectors.
  • Mention may be made, as active molecules of interest to the present invention and given by way of examples of fatty acids, antioxidants, hormones, vitamin compounds, drugs or neurotransmitters.
  • Such active molecules, presented by a vector have bacteriostatic, anti-allergenic, anti-parasitic, anti-predator or antifungal, immunomodulating or anti-inflammatory activities.
  • a small molecule diffuses quickly but it is rapidly metabolized while the same grafted molecule will have a longer lifespan because it will not be metabolized as quickly.
  • the diffusion of an active molecule grafted on a suitable vector increases which makes it possible to migrate the active ingredient closer to the place of action before it is metabolized, and with a strong action.
  • the goal is therefore to be able to use vectors with their grafted molecules, large enough in size in order to obtain high efficiency but to graft them onto vectors which also provide them with high diff usability.
  • Another important parameter is the capacity for the vector to receive these active molecules by grafting.
  • the present invention also provides a method for producing a vector of active molecules in the form of a polymer which does not require any inert support.
  • This same vector can also trap heavy metals and compounds having a metal attached to a protein inducing immune responses such as bovine serum albumin.
  • Diamines are used for this, which are polymerized in the presence of a crosslinking agent.
  • the polyamines are poly (L-ornithine-R), poly (putrescine-R), poly (cadaverine-R), poly (L-carnosine-R), poly (sper idine- R) or poly (sperm-R) or a mixture of these.
  • -R represents the polymerizing agent reduced with sodium borohydride.
  • crosslinking agents used are chosen from formaldehyde, glyoxal, malondialdehyde although of a very high cost price, or glutaraldehyde.
  • Another agent is 1,1,3,3 -tetra ethoxypropane.
  • the polymerization process used consists in dissolving the diamine in a basic solution, above pH 8.0 and in adding glutaraldehyde.
  • -G represents glutaraldehyde reduced to sodium borohydride.
  • Such polymers are also very advantageous since it is possible to generate three-dimensional polymers.
  • the present invention therefore aims to determine a process for generating polymers, bi or better three-dimensional, from a diamine but which work at neutral pH or close to this value of 7.0.
  • the numerous advantages of the product according to the present invention will be revealed on reading the description which follows.
  • the process consists in using a diamine L-ornithine and in polymerizing it in the presence of a compound of the family of dialdehydes, more particularly glutaraldehyde to obtain a homopolyamine, poly (L-ornithine-6).
  • This monomer comprises four carbons and two NH 2 groups.
  • the two NH 2 groups must in fact be separated by at least four carbons. It is noted that tests with molecules having three carbons are not satisfactory because there is no possible polymerization.
  • L-ornithine it is possible to produce not only a linear homopolymer but also a 3D homopolymer by means of a crosslinker so as to form a network.
  • the omopolyamine L-ornithine-6 thus produced is new and particularly inventive in its function as a vector of active molecules, more particularly in its three-dimensional form.
  • the process for producing the omopolyamine L-ornithine-G according to the present invention consists in mixing.
  • - L-ornithine for example 10 g in 25 ml of water with adjustment to a pH between 6.5 and 7.5, more particularly 7.0.
  • the reaction which occurs is a polycondensation reaction with formation of imines.
  • a linear polymer is obtained which can be used by passing through a dialysis system.
  • crosslinking of this polymer is ensured by adding to the medium a crosslinking agent such as polyethylene imine.
  • the addition is carried out in proportions of 1 ml per 10 g of ornithine, in this case.
  • the polymer obtained is in the form of a three-dimensional polymer.
  • this medium is heated to further reduce the time of polymerization of the omopolymer which becomes almost instantaneous.
  • the beads thus formed are simply held mechanically on a filter and then dried under heated ventilation to remove the water on the one hand and to finalize the crosslinking on the other hand.
  • beads are then degreased and then treated at least once with soda, for example in 200 ml of 1M soda at 80 ° C for two hours.
  • This step allows the protons to be removed otherwise hydrogen formation and mechanical bursting of the beads would occur, making them unsuitable for easy handling.
  • This step can be repeated at least once.
  • beads of homopolymer L-ornithine-6 capable of serving as a vector of active molecules, with high efficiency. It is also noted that it is possible to choose according to the degree of crosslinking the size of the vector and therefore the diff usability.
  • Omopolyamine poly (L-ornithine- &) obtained by the process according to the present invention, on which fatty acids are grafted, is also tested from the point of view of toxicity and basic tests have shown non-toxicity. These tests consist in administering to male rats solutions of poly (L-ornithine-6) grafted with fatty acids at 1 mg / ml at a dose of 0.5 ml / day. There is a significant increase in weight over the next 150 days. The curves have been shown in the appendix in FIGS. 1 and 2.
  • L-citrulline which is placed in the presence of 3 ml of 3M acetate, 1 ml of water and 3 ml of 5% glutaraldehyde.
  • the polymer weight values reached after lyophilization are 23.2 mg of poly (ornithine-G) and 7.2 mg of poly (citrulline-, respectively)
  • the poly (ornithine-G) on which fatty acids are grafted by amide bond was evaluated from the point of view of its biological activity in experimental animal models of chronic conditions.
  • this polymer grafted with fatty acids in a concentration of 4 to 5 10 "5 moles showed a biological activity by significant reduction of the crisis (equivalent to an attack of multiple sclerosis).

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Abstract

L'objet de l'invention est un procédé de fabrication d'un vecteur de molécules actives applicable dans le domaine biomédical, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - diluer un monomère ayant au moins deux groupements NH2 séparés par au moins 5 quatre carbones dans l'eau, - ajuster le pH à une valeur comprise entre 6,5 et 7,5. - ajouter du glutaraldéhyde, OHC-(CH2)3-COH, et - attendre la réaction de polycondensation et la formation d' imines, et - récupérer le poly(monomère- G) obtenu. Le monomère est choisi parmi la L-ornithine, Ici L-lysine ou la L-citruline. L'invention couvre aussi le vecteur biomédical obtenu et l'utilisation en tant que vecteur de molécules actives telles que des acides gras, des antioxydants, des composés vitaminés ou des neurotransmetteurs pour disposer d'activités bactériostatiques, anti-allergisantes, anti-parasitaires, anti-prédateurs ou anti­ fongiques, anti-inflammatoires ou immunomodulantes.

Description

PROCEDE DE FABRICATION D'UN VECTEUR DE MOLECULES ACTIVES
APPLICABLE DANS LE DOMAINE DE LA DIFFUSION DE PRINCIPES
ACTIFS ET VECTEUR OBTENU
La présente invention concerne un procédé de fabrication d'un vecteur de molécules actives, applicable dans le domaine biomédical pour la diffusion de principes actifs.
Un tel vecteur est applicable à la diffusion de principes actifs dans les domaines humain, animal et végétal.
L'invention couvre aussi le vecteur biomédical issu de ce procédé. Dans le domaine du traitement du corps humain ou du traitement des végétaux par exemple, on sait que certains principes actifs sont métabolisés prématurément avant d'avoir atteint leur cible. Aussi afin que certaines molécules puissent présenter une activité thérapeutique suffisante, il faut greffer ces molécules sur des vecteurs. On peut citer comme molécules actives intéressant la présente invention et données à titre d'exemples des acides gras, des antioxydants, des hormones, des composés vitaminés, des médicaments ou des neurotransmetteurs. De telles molécules actives, présentées par un vecteur disposent d'activités bactériostatiques, anti-allergisantes, anti-parasitaires, anti-prédateurs ou antifongiques, immunomodulantes ou anti-inflammatoires.
Une molécule de petite taille diffuse rapidement mais elle est rapidement métabolisée tandis que la même molécule greffée aura une durée de vie plus longue car elle ne sera pas aussi rapidement métabolisée. La diffusion d'une molécule active greffée sur un vecteur adapté augmente ce qui permet de faire migrer le principe actif plus proche du lieu d'action avant qu'il ne soit métabolisé, et avec une forte action.
Le but est donc de pouvoir utiliser des vecteurs avec leurs molécules greffées, suffisamment importants en taille afin d'obtenir une forte efficacité mais de les greffer sur des vecteurs qui leur assurent aussi une forte diff usibilité.
Il est un autre paramètre important c'est la capacité pour le vecteur de recevoir par greffage ces molécules actives.
C'est l'objet de la présente invention de permettre la réalisation d'un vecteur du type polymère qui assure ce rôle de support de molécule active avec une forte diff usibilité. Plus particulièrement, en modifiant le taux de polymérisation, on peut ajuster cette diff usibilité.
La présente invention propose aussi un procédé permettant de réaliser un vecteur de molécules actives sous forme d'un polymère ne nécessitant aucun support inerte.
Ce même vecteur peut aussi piéger les métaux lourds et les composés ayant un métal accroché à une protéine inductrice de réponses immunes comme le sérum albumine bovine.
On connaît des techniques notamment décrites dans la demande de brevet PCT/FR99/00103 permettant d'obtenir des polymères à partir d'aminés.
On recourt pour cela à des diamines que l'on polymérise en présence d'un agent réticulant.
Dans ces procédés connus, les polyamines sont la poly(L-ornithine-R), la poly(putréscine-R), la poly(cadavérine-R), la poly(L-carnosine-R), la poly(sper idine-R) ou la poly(spermine-R) ou encore un mélange de celles-ci. -R représente l'agent polymérisant réduit au borohydrure de sodium.
Les agents de réticulation utilisés sont choisis parmi le formaldéhyde, le glyoxal, le malondialdéhyde bien que d'un prix de revient très élevé, ou le glutaraldehyde. Un autre agent est le 1,1,3,3 -tétra éthoxypropane.
Le procédé de polymérisation utilisé consiste en une dissolution de la diamine dans une solution basique, au-delà de pH 8,0 et en un ajout de glutaraldehyde.
La réduction des doubles liaisons est obtenue également par une solution de boro ydrure de sodium, suivie d'une série de dialyses.
On obtient ainsi un rendement de polymérisation classé dans l'ordre suivant : poly(putréscine-6) > poly(cadavérine-G) > poly(L-ornithine-G) > poly(spermidine-
G) > poly(L-carnosine-G).
Dans ces composés , -G représente le glutaraldehyde réduit au borohydrure de sodium.
Si l'on connaît bien les couplages des aminés réalisés au moyen du glutaraldehyde on ne connaît pas de polymères réalisés avec le glutaraldehyde.
Le problème soulevé par ces polymères lorsqu'ils sont utilisés pour le traitement de fluides, est la nécessité de travailler en milieu fortement alcalin au-delà de pH 8,0. La poly(putréscine-£) et, la poly(L-carnosine-G) ne peuvent être polymérisées à des pH inférieurs à 8,0.
De tels polymères sont également très intéressants car il est possible de générer des polymères tridimensionnels.
Pour réaliser un vecteur biomédical, il n'est pas concevable de travailler à un pH autre que proche du neutre à 7,0, celui du corps humain en l'occurrence. Il en est de même également pour le règne végétal dans la plupart des cas.
La présente invention vise donc à déterminer un procédé permettant de générer des polymères, bi ou mieux tridimensionnels, à partir d'une diamine mais qui travaillent à pH neutre ou proche de cette valeur de 7,0. Les avantages nombreux du produit selon la présente invention seront révélés à la lecture de la description qui va suivre.
Ce procédé est maintenant décrit en détail suivant un mode de réalisation particulier, non limitatif. Le procédé consiste à recourir à une diamine la L-ornithine et à la polymériser en présence d'un composé de la famille des dialdéhydes, plus particulièrement le glutaraldehyde pour obtenir une homopolyamine, la poly(L-ornithine-6).
On peut réaliser le même procédé avec d'autres diamines, même si les rendements sont plus faibles car dans le domaine du biomédical, les quantités nécessaires sont plus faibles. On peut citer ainsi la D ou L-citrulline et la L- lysine.
La description de ce premier mode de réalisation préférentiel se limite à la L- ornithine. Ce monomère comprend quatre carbones et deux groupes NH2. Il faut en effet que les deux groupes NH2 soient séparés par au moins quatre carbones. On note que des essais avec des molécules ayant trois carbones ne donnent pas satisfaction car il n'y a pas de polymérisation possible.
Dans ce cas de la L-ornithine, il est possible de réaliser non seulement un homopolymere linéaire mais aussi un homopolymere en 3D moyennant un réticulant pour former ainsi un réseau.
L' omopolyamine L-ornithine-6 ainsi réalisée est nouvelle et particulièrement inventive dans sa fonction de vecteur de molécules actives, plus particulièrement sous sa forme tridimensionnelle. Le procédé de réalisation de l' omopolyamine L-ornithine-G selon la présente invention consiste à mélanger '.
- la L-ornithine par exemple 10g dans 25 ml d'eau avec ajustement à un pH compris entre 6,5 et 7,5, plus particulièrement 7,0.
NH2-(CH2)3-CH(NH2)-COOH, - du glutaraldehyde, 20 ml à 50%.
OHC-(CH2)3-COH.
La réaction qui se produit est une réaction de polycondensation avec formation d' imines. On obtient un polymère linéaire qui peut être utilisé moyennant le passage à travers un système de dialyse.
Afin d'obtenir directement un polymère en 3D, selon le procédé de la présente invention, on assure une réticulation de ce polymère en ajoutant au milieu un réticulant tel du polyéthylène imine. L'ajout est effectué dans des proportions de 1 ml pour 10 g d'ornithine, dans le cas présent.
Le polymère obtenu se présente bien sous la forme d'un polymère tridimensionnel.
Pour réaliser des perles de l' omopolymere obtenu et le rendre encore plus aisément manipulable, on l'introduit dans un milieu organique hydrophobe pour obtenir un effet biphasique. De plus, avantageusement ce milieu est chauffé pour diminuer encore le temps de la polymérisation de l' omopolymere qui devient quasi instantanée.
Pour collecter les perles ainsi formées, on les retient tout simplement mécaniquement sur un filtre puis on les sèche sous ventilation chauffante pour éliminer l'eau d'une part et pour finaliser la réticulation d'autre part.
Ces billes sont ensuite dégraissées puis traitées au moins une fois à la soude par exemple dans 200 ml de soude à 1M à 80°C pendant deux heures.
Cette étape permet de retirer les protons sinon il se produirait une formation d'hydrogène et un éclatement mécanique des perles, les rendant impropres à une manipulation aisée.
Cette étape peut être renouvelée au moins un fois.
On peut ainsi éviter de consommer inutilement du borohydrure de sodium puisque les perles sont ensuite placées dans une solution de soude à 1M en présence de lg/l de borohydrure de sodium pour réduire les doubles liaisons des imines formées. Les perles obtenues sont rincées sur eau et sur acide chlorhydrique à 0,001M pour neutraliser les éventuelles traces alcalines puis rincées abondamment sur eau.
On obtient alors des perles d'homopolymère L-ornithine-6 susceptibles de servir de vecteur de molécules actives, avec une forte efficacité. On constate aussi qu'il est possible de choisir en fonction du degré de réticulation la taille du vecteur et donc la diff usibilité.
Comme exemple de molécules de petites taille susceptibles d'être greffées sur la poly(ornithine-G), on peut citer les exemples suivants :
Figure imgf000007_0001
L' omopolyamine poly(L-ornithine-&) obtenue par le procédé selon la présente invention, sur laquelle sont greffés des acides gras, est également testée du point de vue de la toxicité et des tests de base ont montré une non toxicité. Ces tests consistent à administrer à des rats mâles des solutions de poly(L- ornithine-6) greffée avec des acides gras à 1 mg/ml à la dose de 0,5 ml/j. On constate une augmentation significative du poids au cours des 150 jours qui suivent. On a représenté les courbes en annexe sur les figures 1 et 2. Si l'on compare avec la L-citrulline ou la L-lysine, on constate que lors de la polymérisation, le rendement est beaucoup moins élevé, mais on obtient une polymérisation en poly(citrulline-£) et en poly(lysine-6) avec possibilité de réaliser un polymère tridimensionnel. Dans un test comparatif, on dispose de 100 mg de L-ornithine et de 100 mg de D,
L-citrulline que l'on place en présence de 3 ml d'acétate 3M, 1 ml d'eau et 3 ml de glutaraldehyde à 5%.
Les valeurs du poids de polymères, atteintes après lyophilisation sont respectivement de 23,2 mg de poly(ornithine-G) et de 7,2 mg de poly(citrulline-
6).
Ceci est essentiellement dû au groupement CONH2 qui diminue la disponibilité pour la polymérisation du groupement NH2.
La poly(ornithine-G) sur laquelle sont greffés des acides gras par liaison amide a été évaluée du point de vue de son activité biologique dans des modèles animaux expérimentaux d'affections chroniques.
Sur le modèle d'encéphalite expérimentale, ce polymère greffé avec des acides gras en concentration de 4 à 5 10"5 moles a montré une activité biologique par diminution importante de la crise ( équivalente à une poussée de sclérose en plaques).

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de fabrication d'un vecteur de molécules actives applicable dans le domaine biomédical, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
- diluer un monomère ayant au moins deux groupements NH2 séparés par au moins quatre carbones dans l'eau,
- ajuster le pH à une valeur comprise entre 6,5 et 7,5.
- ajouter du glutaraldehyde, OHC-(CH2)3-COH, et
- attendre la réaction de polycondensation et la formation d' imines, et
- récupérer le poly(monomère-ô) obtenu.
2. Procédé de fabrication d'un vecteur de molécules actives applicable dans le domaine biomédical, caractérisé en ce que le monomère est la L-ornithine, la L-lysine ou la L-citruline pour obtenir la formation de la poly(L-ornithine-S), poly(L-lysine-£), poly(L-citruline-&),
3. Procédé de fabrication d'un vecteur de molécules applicable dans le domaine biomédical selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le polymère obtenu est linéaire.
4. Procédé de fabrication d'un vecteur de molécules applicable dans le domaine biomédical selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on ajoute un réticulant pour obtenir un réseau de ρoly(L-ornithine-6), poly(L-lysine- G), ρoly(L-citruline-ê) en 3D.
5. Procédé de fabrication d'un vecteur de molécules applicable dans le domaine biomédical selon la revendication 4, caractérisé en ce que le réticulant est le polyéthylène imine.
6. Procédé de fabrication d'un vecteur de molécules applicable dans le domaine biomédical selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que l'on disperse l' homopolymere obtenu dans un milieu organique hydrophobe pour obtenir un effet biphasique pour réaliser des perles de poly(L-ornithine-G), de poly(L-lysine-G) ou de poly(L-citruline-G).
7. Procédé de fabrication d'un vecteur de molécules applicable dans le domaine biomédical selon la revendication 6, caractérisé en ce que, pour collecter les perles ainsi formées, on les retient mécaniquement sur un filtre puis on les sèche sous ventilation chauffante.
8. Procédé de fabrication d'un vecteur de molécules applicable dans le domaine biomédical selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que l'on procède à un chauffage du milieu organique hydrophobe utilisé.
9. Procédé de fabrication d'un vecteur de molécules applicable dans le domaine du traitement de l'eau selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, pour réduire les doubles liaisons des imines et obtenir des aminés, on procède aux opérations suivantes : - dégraissage du polymère obtenu en sortie de réaction de condensation,
- traitement au moins une fois à la soude, et
- mise en présence de ce polymère en présence de borohydrure de sodium.
10. Vecteur de molécules applicable dans le domaine biomédical, caractérisé en ce qu'il comprend de la poly(ornithine-6), de la poly(L-lysine-ô) ou de la poly(L-citruline-G) sur laquelle sont greffées des molécules actives telles que des acides gras, des antioxydants, des composés vitaminés, des hormones, des médicaments ou des neurotransmetteurs pour disposer d'activités bactériostatiques, anti-allergisantes, anti-parasitaires, anti-prédateurs, anti - fongiques, anti-inflammatoires ou immunomodulantes.
11. Utilisation du vecteur de la revendication 10, obtenu suivant le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il est utilisé pour recevoir des acides gras, des antioxydants, des composés vitaminés ou des neurotransmetteurs pour disposer d'activités bactériostatiques, anti- allergisantes, anti-parasitaires, anti-prédateurs, anti-fongiques, antiinflammatoires ou immunomodulantes.
PCT/FR2003/050204 2002-12-24 2003-12-23 Procede de fabrication d’un vecteur de molecules actives applicables dans le domaine de la diffusion de principes actifs et vecteur obtenu WO2004058842A1 (fr)

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