WO2004058296A1

WO2004058296A1 - 椎間板変性治療剤

Info

Publication number: WO2004058296A1
Application number: PCT/JP2003/016580
Authority: WO
Inventors: Hirotaka Haro
Original assignee: Komori, Hiromichi
Priority date: 2002-12-25
Filing date: 2003-12-24
Publication date: 2004-07-15
Also published as: HK1085128A1; US20060171939A1; EP1593391B1; JP4512038B2; ES2427932T3; SI1593391T1; DK1593391T3; JPWO2004058296A1; EP1593391A4; US7935337B2; PT1593391E; CY1115135T1; AU2003292755A1; EP1593391A1

Abstract

椎間板変性を伴う疾患、特には椎間板ヘルニア、腰痛症、椎間板症および変形性脊椎症を治療するため、ヒト由来の蛋白質分解酵素を、椎間板変性に伴う疾患の患部に直接投与する薬剤を提供する。ヒト由来の蛋白質分解酵素としては、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７等が使用できる。

Description

椎間板変性治療剤技術分野

本発明は、ヒト由来の蛋白質分解酵素を有効成分として含有する椎間板変性に伴う疾患の治療剤に関する。この治療剤は、椎間板変性に伴う疾患の患部に直接投与され、例えば椎間板ヘルニア、腰痛症、椎間板症、変形性脊椎症の治療に有効であり、ヘル二ァの自然退縮を促進する。背景技術

脊椎体と脊椎体の間に存在する円盤状の軟骨体である椎間板は、内側の髄核とこれを取り囲む外側の線維輪から構成され、プロテオダリカン、ァグリカン、 Π 型コラーゲンなどの軟骨成分からなる。椎間板は、主に加齢と共に生じる椎間板中の水の含量の減少により弾力性が失われ、椎間板の軟骨成分の消失と線維,組織の増生が認められ、いわゆる内層の髄核と外層の線維輪の 2重構造が破綻する。これらの変化を椎間板変性とよぶ。この椎間板変性は加齢性変化であり、 2 0才から始まって、 7 0才までにはほぼ全ての椎間板組織で変性変化を認める。椎間板ヘルニアは変性髄核が脆弱した線維組織を破って脊柱管内に脱出して、神経根や馬尾を圧迫して疼痛や麻痺などを起こすものである。腰痛症は、骨代謝異常、外傷、腫瘍などの原因で起きるものもあるが、椎間板の退行変性に起因する場合が多い。

磁気共鳴画像法（magnetic resonance imaging: MR I ) は、椎間板変性を診断するために広く利用されている。レントゲンと異なり被爆もしないために、頻回の検査の施行が可能である。経時的に撮像を行うことにより、椎間板ヘルエアでは経時的に体積が減少する自然退縮機序が認められることがわかってきた。また、造影剤ガドリニウム一ジエチレントリアミンペンタ酢酸（G d—D T P A) を用いることで椎間板ヘルニア組織に造影効果が確認された場合には、ヘルユア内での血管増生が盛んであると判断でき、より自然退縮が起きることが期待できる。これにより、予後診断も可能となる。

手術により摘出されたヘルニア塊を免疫組織学的に検討すると、ヘルニア塊の軟骨基質の中に新生血管の増生と多数のマク口ファージを中心とした炎症性細胞の浸潤が認められる（Haro et al. , Spine 21(1996), 1647 - 1652)。また、浸潤してきたマクロファージゃ椎間板内の軟骨細胞がマトリックスメタ口プロテア一ゼ（Matrix raetalloproteinase： MMP) に属する MMP— 3と MMP— 7を強発現していることが確認された（Haro et al.， Spine 22(1997), 1098-1104 および Haro et al, J. Spinal. Disorders 12(1999)， 245-249)。 MMPは中性領域で主に作用する酵素で、関節内や椎間板組織では生理的に発現している。 MM P— 3と MMP— 7は軟骨組織の主成分であるプロテオダリカン、ァグリカンを基質としている。このため、椎間板ヘルニア内では MMP— 3と MMP— 7がへルユア組織の分解及ぴ退縮に重要な作用を有することが推測されている。

また、野生型マゥスの椎間板を蛋白分解性のマク口ファージと共培養した場合には、 MM P— 3欠損型マゥスの椎間板とマクロファージとの共培養の場合に比ベて椎間板重量の減少が大きかった。また、野生型マウスおよび MMP— 3欠損マウスを用いた実験によって、 MMP— 3がマクロファージを椎間板内に走化させる作用のある（MMP— 3がマクロファージに対する走化性因子として働く）ことも確認されている（Haro et al.， J. Clin. Invest. 105(2) (2000)， 133- 141)。

MMP— 7は炎症性サイト力インである TNF—ひを誘導し、その TNF— a が椎間板細胞における MMP— 3の産生を促進することも報告されている (Haro et al. , J. Clin. Invest. 105(2) (2000)， 143 - 150)。しかし、ヒトの椎間板ヘルニアで発現している MMP— 3、 MMP— 7等のヒト由来の蛋白質分解酵素を治療剤として使用する試みは全くなされていない。

椎間板ヘルユアの外科治療は、ヘル-ァ塊を外科的に摘出して神経の除圧をは力ることが広く行われている。し力し、本疾患が青年層や中年層に多く、スポーッ選手にも比較的多く認められることから、手術治療ではなく非侵襲的な治療が求められている。

すでに、米国やヨーロッパでは、植物から抽出したキモノ、。パイン等の酵素を椎間板ヘルニア中に注入する治療が行われているが、免疫反応や神経毒性などが報告されている。また、ヘルニア患部にキモパパインを注入した場合は、蛋白分解により生じたヘルニア腔が時間経過により回復することが報告されているが、これは軟骨マトリックスではなく、線維性の結合組織が造生してくるためであると考えられている。ィヌの椎間板内にキモパパインを注入した場合の組織学的観察によれば、髄核中心が線維軟骨組織に置換されていたことが報告されている (Kudo et al. , J. Vet. Med. Sci. 1993, Apr, 55 (2) 211-5)。また、本発明者の実験によれば、ィヌの椎間板ヘルニアにキモパパインを注入した例では、軟骨のマトリッタスが髄核部と線維輪全体にわたって分解され、残存した軟骨細胞は大幅に減少しており大きく損傷されていた。このようにキモパパインによりヘルユアを溶解した場合は、椎間板の再生能が無くなるか低下すると考えられる。軟骨細胞はマトリックス中に浮遊した状態で機能を保持するため、マトリックスは椎間板再生に不可欠のものである。このような公知の事実および本発明者が確認した事実を勘案した場合、ヘルニア患部に蛋白分解酵素を直接投与し、変性髄核を除去する従来の方法では、軟骨細胞が椎間板再生機能を保持するために必要なマトリックスを保持することが困難であると思われた。発明の開示

驚くべきことにヒト由来の蛋白分解酵素である MM P類をヘルユア中に注入した場合には、椎間板ヘルニアを退縮させるが、正常の軟骨細胞には損傷を与えないことが見出された。すなわち、椎間板再生機能を保ったまま椎間板ヘルニアを溶解することができたのである。軟骨細胞が機能を維持するにはマトリックスが不可欠である。したがって、本発明はヒト由来の蛋白分解酵素である MM P類をヘルニア中に注入することにより、正常軟骨細胞を温存しながらヘルニアを選択的に退縮させるという画期的な知見に基づくものである。この発明によって、これまでのキモパパインによる正常軟骨の損傷と言う弊害の可能性のない全く新しレ、ヘル二ァ治療が可能となる。

本発明は、ヒトの椎間板ヘルニアの自然退縮に関与していると考えられるヒト由来の蛋白質分解酵素を有効成分とし、変性した椎間板に直接投与される椎間板変性に伴う疾患の治療剤を治療剤を提供するものである。また、ヒト由来の蛋白質分解酵素を変性した椎間板に直接投与する椎間板変性に伴う疾患の治療方法を提供するものである。本発明の治療剤によって治療される疾患は、椎間板の変性に伴う疾患であり、例えば、椎間板ヘルニア、腰痛症、椎間板症、変形性脊椎症が挙げられる。

これまでの研究によって椎間板ヘルニアの退縮に関与していると考えられる物質としては、上記した MM P— 3および MM P— 7が挙げられている。また、 M MP— 8、 MM P - 1 3、 MT 1—MMP (MM P— 1 4 ) およびァグリカネ一ス（aggrecanase) も同様の作用を有すると考えられる。 M M P — 3 (E. C. 3. 4. 24. 17)は、 stromelysin-1 または transin とも呼ばれ、フイブロネクチン、ラミニン、プロテオダリカン、各種コラーゲンなどを分解する。 MM P— 7 (E. C. 3. 4. 24. 33)は、 matrilysinまたは PUMPとも呼ばれ、タイプ IVおよびタィプ Xコラーゲン、エラスチン、フィプロネクチン、ゼラチン、ラミニン、プロテオグリカンなどを分解する。 MM P _ 8 (E. C. 3. 4. 24. 34)は、 collagenase - 2 または neutrophil collagenaseとも呼ばれ、タイプ Iコラーゲンをタイプ IIやタイプ IIIよりも優先的に分解する。 MM P— 1 3は、 collagenase- 3 とも呼ばれ、タイプ II コラーゲンに対して特異性が高い。 M T 1—MM P (membrane type - 1 matrix metalloproteinase)は、 MM P— 1 4とも呼ばれ、プロ MM P— 2およびプロ MM P— 1 3を活性化する。ァグリカネースは、 AD AM— T S (a disintegrin and metalloproteinase-thrombospondin)ファリ一に属し、軟骨ァグリカンを分解する。

これらの蛋白質分解酵素は、近年リコンビナント法によって製造され、供給されるようになった。本発明者は、これらの蛋白質分解酵素を椎間板変性に伴う疾患、特にはヘルニアへの注入療法に使用してその有効性を確認した。さらに、これらのヒト由来の蛋白質分解酵素がキモパパインのもつ軟骨細胞を損傷させる可能性のないことを確認して本発明を完成した。図面の簡単な説明

図 1は、椎間板ヘルニア検体を MM P— 3、 MM P— 7、その混合物、ポジテイブコントロールとしてのキモパパイン、およびコントロール（DMEM培地）と培養した場合の重量変化を示す図である。

図 2は、椎間板ヘルニア検体を MM P— 3、 MM P— 7、その混合物、ポジテイブコントロールとしてのキモパパインと培養して得られた組織標本を、サフラニン Oで染色した結果を示す図である。

図 3は、ゥサギの椎間板に MM P— 3、 MM P— 7、ポジティブコントロールとしてのキモパパイン、およびコントロールとしての生理食塩水（N S ) を注入し、 1週間後に屠殺して作成した椎体標本をサフラニン Oで染色した結果を示す図である。

図 4は、ヘルニアを自然発症したミニチュアダックスフンドから摘出した、へルユアの組織標本（へマトキシリンェォジン染色）の顕微鏡写真を示す図である。図 5は、ヘルニアを自然発症しているビーグル犬の椎間板に X線透視下で MM P— 7を注入する図である。

図 6は、ヘルニアを自然発症しているビーグル犬の椎間板に MM P— 7を注入する前（Pre) と注入後（Post) の MR I (脂質強調画像 T 1 ) である。

図 7は、ヘルニアを自然発症しているビーグル犬の椎間板に MM P - 7を注入する前（Pre) と注入後（Post) の MR I (水分強調画像 T 2 ) である。

図 8は、ヘルニアを自然発症しているビーグル犬の椎間板に MM P— 3を注入する前（Pre) と注入後（Post) の MR I (水分強調画像 T 2 ) である。

図 9は、ヘルニアを自然発症しているビーグル犬の椎間板に MM P— 7およびコントロールとしての生理食塩水を注入し、 1週間後に屠殺して作成した椎体標本をカツトした状態を示す図である。

図 1 0は、ヘルユアを自然発症しているビーグル犬の椎間板に MM P— 7およぴコント口ールとしての生理食塩水を注入し、 1週間後に屠殺して作成した椎体標本をサフラニン Oで染色した結果を、 MM P— 7注入と生理食塩水注入について示す図である。

図 1 1は、ヘルニアを自然発症しているビーグル犬の椎間板に MM P— 7を注入し、 1週間後に屠殺して作成した椎体標本をサフラエン Oで染色した結果を示す図である。

図 1 2は、ヘルニアを自然発症しているビーダル犬の椎間板にコントロールとしての生理食塩水を注入し、 1週間後に屠殺して作成した椎体の組織標本をサフラニン Oで染色した結果を示す図である。

図 1 3は、 MM P— 7によるプロテオダリカンの分解を試験したウェスタンブロット法の結果を示す図である。

図 1 4は、ィヌの椎間板ヘルニアにキモパパインを注射して、注射後 1週間に屠殺して作成した病理標本をサフラニン〇で染色した結果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明は、 1または複数のヒト由来の蛋白質分解酵素を有効成分として含有し、椎間板変性に伴う疾患の患部に直接投与される椎間板変性に伴う疾患の治療剤である。特には椎間板ヘルニア、腰痛症、椎間板症、変形性脊椎症の治療剤である。有効成分とする蛋白質分解酵素は細胞外マトリックス分解酵素であり、例えば、

MM P— 3、 MMP— 7、 MMP— 8、 MMP— 1 3、 MT 1 -MM P (MM P

- 1 4 ) およぴァグリカネース（aggrecanase)である。

本発明の椎間板変性に伴う疾患の治療剤は、例えばヘルニア患部に直接投与される。また、本発明の治療剤の投与方法としては、ヘルニア近傍の椎間板内に投与する場合も含まれる。例えば椎間板穿刺でレントゲン透視下に経皮的に穿刺針を進め、椎間板内に穿刺する。そこから、脱出椎間板ヘルニア方向に内筒を進めて脱出したヘルニアに選択的に穿刺して、本発明の薬剤を注入する。または硬膜外腔注射により投与することができる。本発明の治療剤をこのように投与することによってヘルニアの自然退縮を促進させることができる。

本明の椎間板変性に伴う疾患の治療剤の使用に際しては、神経症状で神経根症や馬尾症、脊髄症などの神経症状を有し、磁気共鳴画像法（MR I ) により神経圧迫の状態および椎間板変性、例えばヘルニアの部位並びに程度を確認するという診断が必要である。また、椎間板造影検査により、治療を行う部位のヘル二ァ塊を造影して椎間板ヘルニアの部位並びに程度を正確に判断することが重要である。

従って、本発明の一態様は、椎間板変性例えばヘルユアの疑いがある患者に対して MR Iと椎間板造影検査を実施し、患者に椎間板変性例えばヘルニアが認められた場合には、その病態に応じて本発明のヒト由来の蛋白質分解酵素をヘル二ァ患部に直接投与して、ヘルニア組織の自然退縮を促進する椎間板ヘルニアの治療方法である。

本発明の椎間板変性に伴う疾患の治療剤の投与量は、椎間板変性例えばヘル- ァの程度、患者の状態、蛋白質分解酵素の種類等により異なる。本発明の椎間板変性に伴う疾患の治療剤は、患部に直接投与され、その投与量は通常 1回当たり約 1 g〜l 0 O mg、好ましくは 1 0 0 g〜l mg の範囲である。投与回数は、 1回から数回が望ましいが、退縮の度合いを見てさらに多くすることができる。実施例

本発明を下記の実施例によつて具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例 1 ヒト椎間板ヘルニア手術検体を用いた器官培養実験

手術時に摘出した腰椎椎間板ヘルニア検体（4 °Cにて保存）を、細かく切断し、湿重量を測定し、 1検体を 6 0〜8 0 μ gとなるように配分して、 9 6ゥエル (well)プレート内に入れた。ついで以下の試料溶液を加え、 3 7 °Cにおいて C O インキュベーター内で 24時間培養した。

(1) コントロール/ DMEM培地 200 μΐ

(2) ヒトリコンビナント MMP— 3 (45kDa)

(3) ヒトリコンビナント MMP— 7 ( 19 kDa) 20 μ g/ 200 μ 1 (4) ヒトリコンビナント MMP— 3 1 0 μ + ヒトリコンビナント MMP

(5) ヒトリコンビナント MMP— 3 20 Atg+ ヒトリコンビナント MMP

(6) キモパパイン 1、 5、 10、 50、 100、 500 pkt (picoKatal)/ 2 0 0 μ ϊ

ヒトリコンビナント ΜΜΡ— 3 (CHEMIC0N社）およびヒトリコンビナント Μ MP- 7 (CHEMIC0N社）は 4 °Cで DMEM培地に溶解した。キモパパインはポジティブコントローノレであり、キモパパイン（ICN Biomedicals) を IraM の ED TA， 0.067mM のメルカプトエタノール、 5. 5 raM のシスティン塩酸塩を含む液に溶かし、 25°C、 pH6.2で 30分インキュベートし活性化して DMEM 培地に添加した。

得られた培養物の湿重量を測定し、統計学的計算をした。その結果を図 1に示す。図 1から明らかなように、 MMP— 3、 MMP— 7を使用する場合おょぴ両者を併用する場合は、コントロールに比して湿重量が有意に減少する。

ついで、検体を 4%パラホルムアルデヒドに入れ、組織標本を作成し、これをサフラニン O染色した結果を図 2に示す。その結果、 MMP— 3、 MMP— 7またはキモパパインを加えて器官培養したものは、コントロールと比較して優位に染色性の低下（ヘルニアの退縮）を示した。

実施例 2 ゥサギ椎間板への注入実験

日本白色ゥサギ（3〜4kg) を以下の手順で処理し、薬剤の椎間板内注入による効果を検定した。

1. ケタミン塩酸塩 0. 5〜； L. Oral/kg を皮下注射することにより、前投薬処理をした。

2. 体を固定し、耳の静脈に 23 Gトンボ針でラインを取りテープで固定（ライン確保）した。ペントバルビタールナトリウムを生理食塩水で半分の濃度に薄め

(0. 5 mg/ral)、 0. 5-1.0 ml/kg をワンショットで注射し静脈麻酔した。その後は適宜 1 ml ずつを注射する。バリ力ンで体毛を刈り、半側臥位に固定した（後側方アプローチ)。

3. ドレービング、電気メス（エアトーム）セットを用い、皮を切り、皮下を展開して、椎体、肋骨から筋肉を剥離し椎間板を露出した。

4. 椎間板に直接的に次の薬剤を注入した。

(1) ヒトリコンビナント MMP— 3 10 / g/l 00 μΐ および 40 zg,

100 μ 1 (Microcon YM-3で濃縮したもの）

(2) ヒトリコンビナント MMP— 7 10 ixgZl 00 μΐおよび 40 / gZ 100 1 (Microcon YM-3で濃縮したもの）

(3) キモパパイン lkptおよび 5kpt

(Ira の EDTA、 0.067mMのメルカプトエタノール、 5. 5mMのシスティン塩酸塩を含む液に溶かして 25°C、 pH 6.2で 30分ィンキュベートして活性化して使用した）

(4) コント口ール：生理食塩水 (N S： normal saline)

薬剤は 100 μΐ を椎間板内に注入した。濃度の異なる薬剤を 2個所の椎間板に、生理食塩水のみを 1個所の椎間板に投与し、マーキング用ワイヤーを椎体に埋め込んだ。

5. ナイロン針で各層を閉じ、ゥサギをケージ内でフリーにした。

6. 注射 1週後、ケタミン塩酸塩 3 ml を注射し、ライン確保した後、耳静脈に 23Gトンボ針を固定し、ペントバルビタールナトリウム（lmgZral) 3ml を投与（全量で 5〜 7ml) した。

7. 椎体を一まとめにして（en bloc) 摘出し、 4 %ホルマリン溶液で固定して、組織標本を作成した。 8. 組織標本を脱パラフィンし、 1 %酢酸水溶液に溶かした 0. 03 %ファーストグリーンで 5分間染色した。ついで、 1%酢酸水溶液で洗浄後、 0. 25%サフラニン Oで 7分間染色した。

その結果を図 3に示す。コントロールと比較して MMP— 3、 MMP— 7およびキモパパイン注入群は有意に染色性が低下した。また、 MM P— 3注入群は椎間板狭小化が認められた。

実施例 3 ィヌ椎間板ヘルエアへの注入実験

ィヌ特にビーグル犬などは高率に椎間板ヘルエアに罹患し、重症の場合は両下肢麻痺等の症状を呈する。ィヌのヘルニアの組織像は、ヒトのヘルニアの組織像と非常に類似している。ヘルニアに罹患し下肢麻痺を起こしたミニチュアダックスフンド 7才、 6. 35 kg の第 1〜第 2腰椎椎間板ヘルニアを外科的に摘出した組織を標本とし、へマトキシリンェォジン染色し、顕微鏡写真に撮影した結果を図 4として示す。この組織標本は、ィヌのヘルニアがヒトのヘルニアモデルとして非常に適切であることを示している。

椎間板ヘルニアを自然発症したビーグル犬の椎間板ヘルニアに薬剤を注入してその効果を次のように検討した。ヒトリコンビナント MMP— 7の試験には 7才、体重 12. 75 kg のビーグル犬を、ヒトリコンビナント MMP _ 3の試験には 7 才、体重 14.4kg のビーグル犬を用いた。薬剤の注入前に椎間板の MR Iを撮影して、正常な椎間板高位、変性している高位、ヘルユアを認める高位を確認した。

MMP— 7の投与：ビーグル犬の第 1 2胸椎（T 1 2) と第 13胸椎（T 1 3) の間の椎間板に20 _§ 200 //1、第 1 3胸椎（T 13) と第 1腰椎（L

1) の間の椎間板および第 1腰椎 (L 1) と第 2腰椎（L 2) の間の椎間板に 1 0 zgZl 00 / l 注入した。コントロールとして、第 2腰椎（L2) と第 3腰椎（ L 3 ) の間の椎間板に生理食塩水を 200 1注入した。

MMP— 3の投与：ビーグル犬の第 1 1胸椎（T 1 1) と第 12胸椎（T 1

2) の間の椎間板に 1 O g/l 00 1、第 1 2胸椎（T 1 2) と第 1 3胸椎 (T l 3) の間の椎間板に20 _§/200 1、第 1 3胸椎（T 1 3) と第 1腰椎（L 1) の間の椎間板に 1 0 gZl 0 0 βΐ 注入した。第 1 0胸椎（Τ 1 0) と第 1 1胸椎（T 1 1) の間の椎間板にコントロールとして生理食塩水を 2 00 μΐ注入した。

薬剤の椎間板内への注入はレントゲン透視下に脊椎針 (Spinal Needle)を用いて行った（図 5)。シリンジはッベルクリン用（全量 lml) を用いた。注入後 1 週間後に再度 MR Iを測定した。注入前と注入後の椎間板の MR Iを図 6〜8に示した。

図 6は MMP— 7を用いた場合の結果を示す MR Iの T 1強調画像であり、図 7は MMP - 7を用いた場合の結果を示す MR Iの T 2強調画像である。 T 1強調画像はヘルユア実質を見るのに有効であり、 T 2強調画像は軟骨組織である椎間板の分解をみるのに有効である。注入前の T 1 2と T 1 3の間に観察されたへルユアは、注入後の画像において明瞭な退縮をしている。図 8は、 MMP— 3.を用いた場合の結果を示す水分強調画像（T 2) であり、薬剤投与によるヘルニアの退縮が観察される。

ついで、 MMP— 7を投与したビーグル犬を屠殺し、注入した椎間板を含む脊椎ュニットを一まとめにして摘出し、 4 %パラホルムアルデヒド溶液で固定して脱灰操作を行ってから、組織標本を作成した（図 9)。詳しくは、 4%パラホルムアルデヒド溶液で固定した後、 1 OraM PBS で洗浄、エタノールおよびクロ口ホルムにて脱脂を行う。次いで、脱灰液（Plank Rychlo method: Wako, Japan) を用いて脱灰操作を行った。脱灰が十分なことを確認し、パラフィン包埋を行い、組織標本を作成した。

その組織標本を脱パラフィン後、 1 %酢酸水溶液に溶かした 0. 0 3 %ファーストグリーンで 5分間染色した。ついで、 1%酢酸水溶液で洗浄後、 0. 2 5% サフラニン Oで 7分間染色した。

その切片の写真（マクロ図）を図 1 0に示した。 MMP— 7注入後とあるのは、 MM P— 7を 200 1注入した部位（第 1 2胸椎と第 1 3胸椎間）の切片であり、生食注入後とあるのは、生理食塩水を注入した第 2腰椎と第 3腰椎の間の切片である。その切片をさらに詳細に示したものが、図 11および図 12である。図 1 1は MMP— 7を注入したものであり、その左上隅には図 10の下段と同じマクロ図が示されている。中段はマクロ図を 2倍に拡大したものであり、下段は 2倍拡大図の一部をさらに 10倍に拡大したものである。図 12は、生理食塩水を注入したものであり、その左上隅がマクロ図、中段が 2倍拡大図、下段がその 10倍拡大図である。図 10、図 11および図 12を比較すると、 MMP— 7を注入した場合には、生理食塩水の場合と比較して、染色性が著しく低下している。これは MM P— 7の注入によって髄核内の構造が破綻したことを示している。これに対し、生理食塩水の場合の髄核構造の乱れは、注入個所のみであり、染色性は維持されている。このことから、軟骨基質の破壊は認められない。

さらに、 MMP— 7を注入した図 1 1では、 MMP— 7が注入された髄核は分解されたマトリックスとなっているが、その他の髄核部や線維輪には正常の軟骨細胞が温存されている。したがって、正常な軟骨細胞が軟骨マトリックスを産生して椎間板を再生する機能を保持していると結論される。

実施例 4 ィヌ椎間板ヘル二了を用いた分子生物学的検討

実施例 3と同様に、椎間板ヘルニアを自然発症している、ビーグル犬（ 7才、体重 14. Okg) の第 2頸椎（C2) と第 3頸椎（C 3) の間の椎間板に MMP 一 7を 20 μ_§/200 μ1、第 3頸椎 (C 3) と第 4類椎（C4) の間の椎間板に生理食塩水 200 μΐ を注入した。注入 1週間後に椎間板からタンパク抽出を行い、ヒト成人軟骨のプロテオダリカン抗体を用いて、椎間板内軟骨の分解についてウェスタンブロッテイングによる分子生物学的検討を行った。ヒト成人軟骨のプロテオグリカン抗体はィヌの交差が確認されており、コアタンパクとケラタン硫酸側鎖を認識することが確認されている。

ビーグル犬を屠殺したのち、できるだけ早く脊椎ユニットを摘出し氷中にて保存する。次に目的とする部位の椎間板組織を、他の組織が混入しないように注意してメスなどを用いて分離する。採取した組織を 1 Ocm ディシュに入れ、 RIPA( Radio Imuno Precipitation Assay) 緩衝液 4 ml にプロティナーゼ阻害剤の凝剤 ( Roche: proteinase inhibitor cocktail tablets) 1個を溶力した溶液を加えてデイシュ内で破砕する。 R I P A緩衝液の組成は 1 5 OmM NaCl、 1 %Triton- 100、 0. 5 %デォキシコール酸ナトリウムおよび 0. 1 %SDS を含む 5 OmM トリス塩酸緩衝液 (pH8.0) である。 4°Cにて、一晩撹拌した後、デイシュ内の溶液を採取して、 4°C、 300 Or_Pm、 5分遠心する。その上清を、抽出タンパクとして実験に用いた。

ビーグル犬の椎間板からのタンパクの他、膝関節周囲の骨腫瘍の摘出手術の際に得られたヒトの正常膝軟骨から抽出したタンパクをポジティブコントロールとして用いた。

各タンパクの抽出液をプロティンァッセ一にて濃度を調整した上で、 Laeramli Sample Buffer を加え、 95°C、 3分間ボイルし、 12%ゲル（第一化学、 PAG ミニゲル）を用いて、 SDS-PAGE を行った（80V、 180分）。続いて、ニトロセルロース膜に転写した（0. 1A、 45分）。これに Chemicon(Temecula，CA，USA) 社製のヒト成人軟骨プロテオダリカン抗体を反応させ、ついで ECL kit (Ammersham Pharmacia Biotech, UK) によって発色させた。その結果を図 13 に示した。図中 Mは分子量マーカーであり、 PCはヒトの正常な膝軟骨から抽出したタンパクを用いたポジティブコントロールであり、 C 2/3は1^1 ？ー7を注入した椎間板から抽出したタンパクであり、 C 3 Z4は生理食塩水を注入した椎間板から抽出したタンパクであり、 C 5/6は無処理の椎間板（第 5頸椎と第 6 頸椎の間）から抽出したタンパクである。

40 kDaから l O O kDaまでのバンドは G 1ドメインを含むコアタンパクとケラタン硫酸側鎖を示している。バンドが単一でないのは、臨床検体であるために、生理的酵素などによるプロテオグリ力ンの分解度によっていくつかの分解産物が存在することを表している。ヒトの正常な膝軟骨から抽出したタンパクを用いたポジティブコントロール（PC) の場合は、様々な MMPゃァグリカネースなどのプロテオグリ力ン分解酵素が存在するため、プロテオグリ力ンの分解産物が検出された。生理食塩水注入の場合（C 3 / 4 ) および無処理の場合 (C 5 / 6 ) でも、プロテオグリカンの分解物が検出された。これらと比較して、 MM P一 7注入の場合はプロテオグリカンの分解産物の量は明らかに減少している。これは、 MM P— 7が椎間板ヘルニア内のプロテオダリカンを分解した結果である。

手術で除去されたヘルニア検体を用いた器官培養実験（実施例 1 ) により、 M M P— 3および MM P - 7がヘルニアを分解することが明らかとなった。また、ゥサギ椎間板への注入実験（実施例 2 )、ビーグル犬の自然発症ヘルニアへの注入実験（実施例 3 ) およびィヌ椎間板ヘルニアを用いた分子生物学的検討（実施例 4 ) により、 MM P— 3および MM P— 7の椎間板内注入により椎間板および椎間板ヘルニアのマトリックス分解が起きることが明らかとなった。これらの事実から、 MMP— 3および MM P— 7が椎間板ヘルニア治療に有効であることが確認された。

参考例

ィヌの椎間板ヘルニアにキモパパインを注射して注射後 1週間で屠殺し、実施例 3と同様に病理標本を作製し染色した。これを図 1 4に示す。この場合には、軟骨のマトリッタスが髄核部と線維輪全体にわたって分解され、残存した軟骨細胞も非常に少ない。したがって、キモパパインをヘルニア患部に注入した場合には、正常な軟骨細胞が損傷を受けるため、椎間板再生能は本宪明の MM P— 7の注入と比較して、明らかに椎間板再生能が低いと結論される。産業上の利用可能性

MMP— 3および MM P— 7のような、ヒト由来の蛋白質分解酵素を椎間板変性に伴う疾患の患部に直接投与する本発明の椎間板変性に伴う疾患の治療剤によつて、その疾患を速やかに治療することができる。その疾患は、例えば椎間板へルユア、腰痛症、椎間板症、変形性脊椎症である。ヒト由来の蛋白質分解酵素は、これまで臨床応用されたキモパパインのような植物由来の酵素と比べて、ァナフィラキシ一などの重篤な免疫反応の発症がなく、しかも正常な軟骨細胞を損傷しない点で極めて優れている。

Claims

請求の範囲

1. 1または複数のヒト由来の蛋白質分解酵素を有効成分として含有し、椎間板変性に伴う疾患の患部に直接投与されることを特徴とする椎間板変性に伴う疾患の治療剤。

2. 椎間板変性に伴う疾患が、ヘルニア、腰痛症、椎間板症または変形性脊椎症である請求項 1記載の治療剤。

3. ヒト由来の蛋白質分解酵素が細胞外マトリックス分解酵素である請求項 1または 2記載の治療剤。

4. MMP— 3、 MMP— 7、 MMP— 8、 MMP_ 1 3、 MT 1— MMPおよびァグリカネース（aggrecanase)からなる群から選択される 1または複数の細胞外マトリックス分解酵素を有効成分として含有する請求項 1〜 3のいずれかに記載の治療剤。