WO2004057003A2 - Verfahren zur herstellung von aminosäuren mittels transgener organismen - Google Patents

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WO2004057003A2
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    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing amino acids in transgenic organisms.
  • the invention further relates to nucleic acid constructs, vectors and transgenic organisms and their use.
  • amino acids form the basic structural unit of all proteins and are therefore essential for normal cell functions.
  • amino acid is known in the art.
  • the proteinogenic amino acids of which there are 20 types, serve as structural units for proteins in which they are linked to one another via peptide bonds, whereas the non-proteinogenic amino acids (of which hundreds are known) are usually not found in proteins [see Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 57-97 VCH: Weinheim (1985)].
  • the amino acids can be in the D or L configuration, although L-amino acids are usually the only type found in naturally occurring proteins.
  • Biosynthetic and degradation pathways of each of the 20 proteinogenic amino acids are well characterized in both prokaryotic and eukaryotic cells (see, for example, Stryer, L. Biochemistry, 3rd edition, pp. 578-590 (1988)).
  • the "essential" amino acids histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan and valine
  • the "essential” amino acids are transferred into the remaining 11 by simple biosynthetic routes
  • "Nonessential” amino acids alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, proline, serine and tyrosine
  • Higher animals have the ability to synthesize some of these amino acids, but the essential amino acids must be ingested in order for normal protein synthesis to take place.
  • Amino acids are used in many industries, including the food, feed, cosmetic, pharmaceutical and chemical industries.
  • L-glutamic acid is used in infusion solutions.
  • Amino acids such as D; L-methionine, L-lysine or L-threonine are used in the animal feed industry.
  • the essential amino acids valine, leucine, isoleucine, lysine, threonine, methionine, tyrosine, phenylalanine and tryptophan are of particular importance for the nutrition of humans and many farm animals.
  • lysine is not only an important amino acid for human nutrition, but also for monogastric animals such as poultry and pigs.
  • L-lysine is the limiting amino acid, that is, in order to enable optimal use of such plant food, it makes sense to supplement the food or the feed with L-lysine.
  • Glutamate is most often used as a taste additive (monosodium glutamate,
  • Seq MSG Seq MSG
  • Glycine, L-methionine and tryptophan are all used in the pharmaceutical industry.
  • Glutamine, valine, leucine, isoleucine, histidine, arginine, proline, serine and alanine are used in the pharmaceutical and cosmetic industries.
  • Threonine, tryptophan and D- / L-methionine are widespread feed additives [Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, pp. 466-502 in Rehm et al., (Ed.) Biotechnology Vol. 6 , Chapter 14a, VCH: Weinheim].
  • Amino acids are also suitable for the chemical industry as precursors for the synthesis of synthetic amino acids and proteins, such as N-acetylcysteine, S-carboxymethyl-L-cysteine, (S) -5-hydroxytryptophan and others, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol A2, pp. 57-97, VCH, Weinheim, 1985 are suitable substances.
  • a particularly suitable organism for this purpose is Corynebacterium glutamicum, which is used, for example, for the production of L-lysine or L-glutamic acid.
  • Other amino acids produced by fermentation are, for example, L-threonine, L-tryptophari, L-aspartic acid and L-phenylalanine.
  • Cysteine and glycine are both produced from serine, the former by condensation of homocysteine with serine, and the latter by transferring the side chain ß-carbon atom to tetrahedral hydrofolate, in a reaction catalyzed by serine transhydroxymethylase.
  • Phenylalanine and tyrosine are synthesized from the precursors of the glycolysis and pentose phosphate pathways, erythrose-4-phosphate and phosphoenolpyruvate in a 9-step biosynthetic pathway that differs only in the last two steps after the synthesis of prephenate. Tryptophan is also produced from these two starting molecules, but its synthesis takes place in an 11-step process.
  • Tyrosine can also be produced from phenylalanine in a reaction catalyzed by phenylalanine hydroxylase.
  • Alanine, valine and leucine are each biosynthetic products from pyruvate, the end product of glycolysis.
  • Aspartic acid is formed from oxaloacetate, an intermediate of the citric acid cycle.
  • Asparagine, methionine, threonine and lysine are each produced by converting aspartic acid.
  • Isoleucine is made from threonine.
  • histidine is formed from 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate, an activated sugar.
  • amino acids are produced by fermentation of strains of coryneform bacteria, in particular Corynebacterium giutamicum. Because of the great importance, work is constantly being carried out to improve the existing manufacturing processes. Process improvements can include fermentation-related measures, such as stirring and supply with oxygen, or the composition of the nutrient media, such as the sugar concentration during fermentation, or processing to produce the product, for example ion exchange chromatography, or the intrinsic performance of the microorganism itself. Bacteria from other genera such as Escherichia of Bacillus are also used for the production of amino acids.
  • EP-A-0 066 129 describes, by way of example, a process for the preparation of threonine with coryne bacteria. Appropriate processes have also been worked out for the production of methionine. In this way you get, for example, strains that are resistant to antimetabolites such. B.
  • methionine analogues ⁇ -methyl-methionine, ethionine, norleucine, N-acetylnorleucine, S-trifluoromethyl-homocysteine, 2-amino-5-heprenoitic acid, selenomethionine, methionine sulfoximine, methoxine, 1-aminocyclopentane carboxylic acid auxotrophic for regulatory-important metabolites and sulfur-containing fine chemicals, such as.
  • B. L-methionine Processes of this type developed for the production of methionine have the disadvantage that they have yields which are too low for economical use and are therefore not competitive with chemical synthesis. Zeh et al.
  • Amino acids the amount of which exceeds the cell's protein biosynthesis requirements, cannot be stored and are instead broken down, so that intermediates are provided for the main metabolic pathways of the cell [for an overview see Stryer, L, Biochemistry, 3rd ed. Chap. 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle”; S 495-516 (1988)].
  • the cell is able to convert unwanted amino acids into useful metabolic intermediates, the production of amino acids is complex in terms of energy, precursor molecules and the enzymes required for their synthesis.
  • amino acid biosynthesis is regulated by feedback inhibition, where the presence of a particular amino acid slows or stops its own production [for an overview of the feedback mechanism in amino acid biosynthetic pathways, see Stryer, L., Biochemistry, 3rd ed., Chap. 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", pp. 575-600 (1988)].
  • the output of a certain amino acid is therefore restricted by the amount of this amino acid in the cell.
  • Improvements in the fermentative production of fine chemicals usually correlate with improvements in material flows and yields. It is important to prevent or reduce intermediate or end product inhibitions of important synthetic enzymes. It is also advantageous to prevent or reduce outflows of the carbon flow into undesired products or side products.
  • L-methionine is important as a methyl group supplier for biosynthesis e.g. of choline, creatine, adrenaline, bases and the like RNS and DNA, histidine and for the methylation after formation of S-adenosylmethionine or as a sulfhydryl group supplier for the formation of cysts.
  • L-methionine also appears to have a positive impact on depression Improving the quality of food and feed is therefore an important task for the food and feed industry. This is necessary because, for example, amino acids in plants such as L-lysine and L-tryptophan are limiting for the supply of mammals.
  • a particularly balanced amino acid balance is particularly advantageous for the quality of food and feed, since a high excess of an amino acid such as L-lysine from a certain concentration in the food has no further positive effect on the utilization of the food, since other amino acids suddenly become limiting.
  • a further increase in quality is only possible by adding further amino acids that limit these conditions. In growing pigs, lysine is initially limiting. If the feed contains sufficient lysine, threonine becomes the limiting amino acid.
  • tryptophan is the next amino acid.
  • the order of the first three limiting amino acids is as follows: methionine, lysine and then threonine. This shows that these amino acids have an important function for optimal nutrition and must be present in a balanced ratio in the diet.
  • a targeted administration of the limiting amino acid in the form of synthetic products must therefore be carried out very carefully in order to avoid amino acid imbalances.
  • the addition of an essential amino acid stimulates protein digestion, which can cause deficiency in the second or third place limiting amino acid.
  • liver fatty acids were found, which could only be remedied after additional tryptophan.
  • the method for producing amino acids from L-methionine in transgenic organisms, the method being characterized in that the method comprises the following steps: a) introduction of a nucleic acid sequence which codes for a threonine-degrading protein and / or lysine-degrading protein, or b) introduction of a nucleic acid sequence which increases the threonine degradation and / or lysine degradation in the transgenic organisms and c) expression of one of (a) or (b) said nucleic acid sequence in the transgenic organism.
  • Threonine-degrading proteins are advantageous to understand proteins such as the threonine aldolase (EC 4.1.2.5) or the serine hydroxymethyltransferase (EC 2.1.2.1), which convert threonine to acetaldehyde and glycine, the threonine dehydrogenase, which forms NADH + H + threonine converts to L-2-amino-acetoacetate, or the threonine dehydratase, which converts threonine under NH 3 and elimination of water to oxobutyrates.
  • Threonine aldolase is advantageously used as the thronine-reducing activity in the process according to the invention.
  • the activity of the aforementioned proteins and / or the nucleic acid sequences coding for them can be increased in various ways.
  • the nucleic acid sequences are advantageously expressed in an organism and thus the activity in an organism is increased by the number of gene copies and / or the stability of the expressed mRNA is increased and / or the stability of the gene product is increased.
  • the regulation of the aforementioned nucleic acid sequences can be changed, so that the expression of the genes is increased. This can advantageously be achieved by heterogeneous regulatory sequences or by changing, for example, by mutating the existing natural regulatory sequences. Both advantageous methods can also be combined with one another.
  • An advantageous embodiment of the method according to the invention is a method for producing amino acids advantageously of L-methionine in transgenic organisms, characterized in that the method comprises the following steps:
  • FIG. 1 shows the consensus of threonine aldolase, which can be used advantageously in the process according to the invention.
  • T24108 is a hypothetical protein R102.4b from Caenorhabditis elegans
  • Q87I10 is a putative L-allo-threonine aldolase from Vibrio parahaemolyticus
  • GLY1_YEAST a low-specificity L-threonine aldolase from Saccharomyces cerevisiae (Baker's yeast)
  • P1; T38302 is a possible threonine aldolase from Schizosaccharomyces pombe
  • P1; E75410 is an L-allo-threonine aldolase from Deinococcus radiodurans.
  • Q9VCK6 is called CG10184 protein and comes from Drosophila melanogaster (Fruit fly), Q885J1 is a low specificity threonine aldolase from Pseudomonas syringae.
  • P1; G83533 is a hypothetical protein PA0902 from Pseudomonas aeruginosa, Q83S08 is a putative aryl sulfatase from Shigella flexneri, P1; F64825 is an L-allo-threonine aldolase from Escherichia coli, as is P1; AF0608 from Salmonella enterica stemi.
  • Q87HF4 is an L-allo-threonine aldolase from Vibrio parahaemolyticus.
  • the following proteins are also L-allo-threonine aldolases: P1; E82418 (Vibrio cholerae), P1; T46877 (Aeromonas jandaei), Q9M835 (Arabidopsis thaliana; Mouse-ear cress), Q8RCY7 (Thermoanaerobacter tengcongensis), P1 ; C72215 (Thermotoga maritima), Q896G8 (Clostridium tetani), P1; C84060 (Bacillus halodurans.
  • Q89N26 is a BII4016 protein from Bradyrhizobium japonicum.
  • Q9X8S4 is an L-threonine aldolase with low specificity from Zymomonas84is, P1 allo-threonine aldolase from Halobacterium sp. NRC-1.
  • CAA02484 is sequence 33 from PCT application WO 94/25606. The sequence comes from Tolypocladium inflatum.
  • TOXG_COCCA is an alanine racemase TOXG from Cochliobolus carbonum (Bipolaris zeicola), P1; AF1474 comes from Listeria innocua and is an L-allo-threonine aldolase with low specificity.
  • Lysine-degrading proteins are to be understood advantageously as proteins such as lysine decarboxylase (EC 4.1.1.18), L-lysine 6-monooxygenase (EC 1.14.13.59), L-lysine 2-monooxygenase (EC 1.13.12.2), Lysine ketoglutarate reductase (EC 1.5.1.7) or the lysine 2,3-aminomutase (EC 5.4.3.2), the L-lysine to cadaverine, N6-hydroxy-L-lysine, 5-aminopentanamide, saccharopin or (3S) -3 , 6-aminohexanoate, lysine decarboxylase is advantageously used as the lysine-degrading activity, alone or in combination with a threonine-degrading activity, advantageously the threonine aldolase in the process according to the invention.
  • lysine decarboxylase EC 4.1.1.18
  • the activity of the aforementioned proteins and / or the nucleic acid sequences coding for them can be increased in various ways.
  • the nucleic acid sequences are advantageously expressed in an organism and thus the activity in an organism is increased by the number of gene copies and / or the stability of the expressed mRNA is increased and / or the stability of the gene product is increased.
  • the regulation of the aforementioned nucleic acid sequences can be changed, so that the expression of the genes zen be changed so that the expression of the genes is increased. This can advantageously be achieved by heterologous regulatory sequences or by modification, for example by mutating the existing natural regulatory sequences. Both advantageous methods can also be combined with one another.
  • An advantageous embodiment of the method according to the invention is a method for producing amino acids advantageously of L-methionine in transgenic organisms, characterized in that the method comprises the following steps:
  • FIG. 2 shows the consensus of the lysine-degrading protein, which can be used advantageously in the method according to the invention.
  • the amino acid sequences shown in Figure 2 are numbered (1st, 2nd, 3rd, etc.) and mean the following abbreviations of the proteins or their accession numbers:
  • Q871Q6 [2] is a hypothetical protein from Neurospa crassa.
  • Q815T3 [3] is a lysine decarboxylase from Bacillus cereus.
  • Q81XE4 [4] encodes a hypothetical protein from Bacillus anthracis, as does P1; D70033 [5] encodes a hypothetical protein from Bacillus subtiiis.
  • Q8H7U8 [6] is a putative lysine decarboxylase from Oryza sativa.
  • Q8L8B8 [7] codes for a hypothetical protein from Arabidopsis thaliana.
  • Q8XXM6 [8] is also a hypothetical protein from Ralstonia solanacearum.
  • the following proteins are also hypothetical proteins: Q88DF4 [9] (Pseudomonas putida), P1; A83031 [10] (Pseudomonas aeruginosa), Q8PAJ9 [11] (Xanthomonas campestris) and Q8PMA0 [12] (Xanthomonas axonopodis).
  • Q8NN34 codes for a predicted Rossmann fold nucleotide binding protein (1 segment) from Corynebacterium glutamicum.
  • P1; AI3438 [14] codes for a lysine decarboxylase from Brucella melitensis.
  • Q8G289 [15] codes for a hypothetical protein from Brucella suis, as does Q984W8 [16] (Rhizobium loti).
  • P1; B97490 [17] is a lysine decarboxylase from Agrobacterium tumefaciens.
  • P1; B83993 [18] encodes a lysine decarboxylase from Bacillus halodurans.
  • Q8A2T1 [19] is believed to be a putative lysine decarboxylase from Bacteroides thetaiotaomicron.
  • the following proteins code for hypothetical proteins: Q92R13 [20] (Rhizobium meliloti), Q8ETC2 [21] (Oceanobacilius iheyensis), Q8NXQ6 [22] (Staphylococcus aureus), Q8CTK0 [23] (Staphylococcus epidermidis78) and P1; (Rhodococcus fascians).
  • Q839D0 [25] codes for a protein of the Decarboxylase family from Enterococcus faecalis.
  • P1; D84035 [26] is a hypothetical protein from Bacillus halodurans.
  • Q8EZ03 [27] is a lysine decarboxylase from Leptospira interrogans.
  • Q89NP4 [28] is a hypothetical protein from Bradyrhizobium japonicum as well as Q8RFZ1 [29] (Fusobacterium nucleotum).
  • the numbers shown in the square brackets indicate the numbering shown in FIG. 2 and thus the sequence of the proteins.
  • the clone YJL055W which is advantageously used in the process according to the invention, bears the number 1.
  • the consensus sequence is reproduced in number 30.
  • the method is a method for producing amino acids advantageously of L-methionine in transgenic organisms, characterized in that the method comprises the following steps:
  • nucleic acid sequence encoding a lysine degrading protein containing the following consensus sequence
  • the process is characterized in that a nucleic acid sequence, which is selected from the group of the nucleic acid sequences, is introduced in the above-mentioned process step (a) i) a nucleic acid sequence with that in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13,
  • SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25;
  • nucleic acid sequence which, on the basis of the degenerate genetic code, by back-translation of the sequences in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 1 a derivative of the SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 shown nucleic acid sequence which codes for a polypeptide which at least
  • nucleic acid sequences are then expressed in a transgenic organism.
  • a further advantageous embodiment of the process for the production of amino acids advantageously of L-methionine in transgenic organisms is characterized in that in process step (a) or (b) mentioned above, nucleic acid sequences in combination with one another or in combination with other nucleic acid sequences can increase the synthesis of L-lysine and / or L-threonine in a transgenic organism.
  • nucleic acid sequences in combination with one another or in combination with other nucleic acid sequences can increase the synthesis of L-lysine and / or L-threonine in a transgenic organism.
  • genes that code for the central metabolism such as the utilization of sugars such as glucose within the glycolysis or the citrate cycle, this also includes genes that are involved in the synthesis of the amino acids based on aspartate.
  • SEQ ID NO: 1 a nucleic acid sequence with that in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 and / or SEQ ID NO: 25 sequence shown;
  • nucleic acid sequence which, owing to the degenerate genetic code, by back-translation of the sequences in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 and / or SEQ ID NO: 26 is obtained and
  • SEQ ID NO: 1 a derivative of the SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 and / or SEQ ID NO: 25 nucleic acid sequence shown which codes for a polypeptide which has at least 50% homology at the amino acid level to that in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 and / or SEQ ID NO: 26, without the biological activity of the polypeptides being significantly reduced is; and
  • the process is characterized in that one or more nucleic acid sequences, which are selected from the group, are introduced in process step (a) mentioned above the nucleic acid sequences
  • SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
  • SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8
  • SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10
  • a derivative of the nucleic acid sequence obtained by back-translating the SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 is obtained and which has at least 70% homology at the amino acid level with the aforementioned amino acid sequences, without the biological activity of the polypeptides being significantly reduced; is introduced and
  • nucleic acid sequences are then expressed in a transgenic organism.
  • the transgenic organism is advantageously cultivated and then harvested.
  • the transgenic organism is a microorganism such as a eukaryotic organism such as a fungus, an algae or a yeast or a prokaryotic organism such as a bacterium such as a bacterium of the genera Escherichia, Bacillus, Serratia, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Corynebacterium or Brevibacterium, it is cultivated in a solid or liquid medium known to the person skilled in the art and, depending on the organism, customary. After cultivation, the organisms are harvested if necessary.
  • amino acids can then be further processed directly in food or feed or for other applications, for example in accordance with the disclosures made in EP-B-0 533 039 or EP-A-0 615 693, to which express reference is made here, or further in customary fashion be further purified via extraction and precipitation or crystallization or via ion exchangers or combinations of these methods.
  • Products of these different work-ups are amino acids or amino acid compositions which still contain portions of the fermentation broth and cells in different amounts, advantageously in the range from 0 to 100% by weight, preferably from 1 to 80% by weight, particularly preferably between 5 and 50% by weight .-%, very particularly preferably between 5 and 40 wt .-%.
  • the organism is a plant whose amino acid content is advantageously changed by the nucleic acid sequence introduced.
  • This is important for plant breeders, since for example for monogastric animals the nutritional value of plants is limited by some essential amino acids such as lysine or methionine. Threonine also plays an important role in this context.
  • This transgenic plant produced in this way is, after the introduction of the nucleic acid or nucleic acid combination used in the method according to the invention, on or in a nutrient medium or else in solid culture, e.g. grown in an earth culture and then harvested. The plants can then be used directly as food or feed or can be processed further.
  • amino acids can be further purified in the usual way by extraction, crystallization and / or precipitation or by ion exchangers or combinations of these methods.
  • Products of these different work-ups are amino acids or amino acid compositions which still contain proportions of the plant in different amounts, advantageously in the range from 0 to 100% by weight, preferably from 20 to 80% by weight, particularly preferably between 50 and 90% by weight , very particularly preferably contain between 80 and 99% by weight.
  • the plants are advantageously used directly without further processing.
  • the organism is a microorganism such as bacteria of the genera Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia, Serratia, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, or Bacillus.
  • Microorganisms of the genera Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia or Bacillus are preferably used. These microorganisms are advantageously used in a fermentative process.
  • SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 and / or SEQ ID NO: 25
  • the nucleic acid sequences which differ from the sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 or their derivatives express and / or mutate further genes.
  • At least one further gene of the biosynthetic pathway of L-lysine, L-threonine and / or L-methionine is also expressed in the organisms such as plants or microorganisms and / or genes are expressed, the regulation of which has been changed.
  • the regulation of the natural genes can also have advantageously been changed so that the gene and / or its gene product is no longer subject to the control cycles present in organisms. This leads to an increased synthesis of the desired amino acids, since, for example, feedback regulations are no longer or no longer present to the extent.
  • Amino acids such as L-lysine, L-threonine and / or L-methionine, preferably L-methionine, are advantageously produced in the process according to the invention.
  • organisms are therefore advantageously attracted to bacteria of the genera Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus or Escherichia or plants in which at least one nucleic acid or one of the genes coding for proteins selected from the group of gene products consisting of at the same time the aspartate kinase (lysC), the aspartate semialdehyde dehydrogenase (asd), the dihydrodipicolinate synthase, the dihydrodipicolinate reductase, the tetrahydrodipicolinate succinyl transferase, the N-succinyl-L-diaminopimelinic acid-glutaminic acid-glutamine acid Desuccinylase, the diaminopimelate epimerase, the diaminopimelate decarboxylase, the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gap), the 3-phosphoglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogen
  • organisms are used in the method in which at least one of the aforementioned genes or one of the aforementioned nucleic acids is mutated at the same time, so that the corresponding proteins, to a lesser extent or not at all, compared to the non-mutated proteins Metabolic metabolites are influenced in their activity and that in particular the production of the amino acids according to the invention is not impaired or so that their specific see enzymatic activity is increased.
  • regulation of the enzyme activity is at least 10%, advantageously at least 20, 30 or 40%, particularly advantageous by at least 50, 60 or 70% less than that of the starting organism, that is to say that its enzymatic activity is influenced by metabolic metabolites and thus by them to understand the increased activity of the enzyme in relation to the starting organism.
  • Increasing the enzymatic activity is understood to mean an enzymatic activity which is increased by at least 10%, advantageously at least 20, 30 or 40%, particularly advantageously by at least 50, 60 or 70%, compared to the starting organism. This leads to increased productivity of the desired amino acid or amino acids.
  • organisms are used in the method in which at least one of the genes coding for an enzymatic activity is selected from among homoserine kinase (thrB), threonine dehydratase (ilvA) and threonine synthase (thrC) , the meso-diaminopimelate D-dehydrogenase (ddh), the phosphoenolpyruvate carboxykinase (pck), the giucose-6-phosphate-6!
  • somerase pgi
  • the pyruvate oxidase poxB
  • the dihydrodipicolinate synthase dapA
  • the dihydrodipicolinate reductase dapB
  • the diaminopicolinate decarboxylase lysA
  • organisms are used in the method in which at least one of the aforementioned nucleic acids or the aforementioned genes is mutated at the same time in such a way that the enzymatic activity of the corresponding protein is partially reduced or completely blocked.
  • a reduction in the enzymatic activity is to be understood as an enzymatic activity which is reduced by at least 10%, advantageously at least 20, 30 or 40%, particularly advantageously by at least 50, 60 or 70%, compared to the starting organism.
  • Enzymes can be influenced in their activity in such a way that the reaction rate is reduced or increased, or the affinity for the substrate is changed (reduced or increased).
  • Microorganisms of the genera Corynebacterium or Brevibacterium or plants are preferably used in the process according to the invention.
  • Chemically pure amino acids or amino acid compositions can also be prepared using the methods described above.
  • the amino acids or the amino acid compositions are isolated from the organism, such as the microorganisms or the plants or the culture medium in or on which the organisms were grown, or from the organism and the culture medium in a known manner.
  • This chemically pure amino acid Ren or amino acid compositions are advantageous for applications in the food industry, the cosmetics industry or the pharmaceutical industry.
  • Amino acids such as methionine, lysine or mixtures thereof, preferably methionine, are advantageously produced by the process according to the invention.
  • the abovementioned amino acids can be increased by at least a factor of 3, preferably at least by a factor of 5, particularly preferably at least by a factor of 10, very particularly preferably by at least a factor of 50, compared to the wiid type of the organisms. It has a particularly advantageous effect on the amino acid productivity in the process according to the invention if a combination of genes is used which code for a threonine aldolase or threonine aldolase-like protein or a lysine decarboxylase or a lysine decarboxylase-like protein.
  • the amino acids produced in the organisms used in the method can be increased in two ways by the method according to the invention.
  • the pool of free amino acids and / or the proportion of the amino acids produced by the process in the proteins can advantageously be increased.
  • the pool of free amino acids in the transgenic organisms is advantageously increased by the method according to the invention.
  • the amino acids are enriched in the medium.
  • all eukaryotic or prokaryotic organisms which are able to synthesize methionine and / or lysine are suitable for the method according to the invention.
  • the organisms used in the process are advantageously microorganisms such as bacteria, fungi, yeast or algae or plants such as dicotyledone or monocotyledonous plants such as plants of the families Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassica- ceae, Cactaceae, Cucurbitaciaceae, Euphor , Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaceae, Pa-paveraceae, Rosaceae, Salicaceae, Solanaceae, Arecaceae, Bromeliaceae, Cyperaceae, Irida- ceae, Liliaceae, Orchidaceae, Gentianaceae, Labiaceae, Magnoliaceaeea, Magnoliaceaeea , Polygonaceae, Violace
  • transgenic microorganisms such as fungi such as the genus Claviceps or Aspergillus or gram-positive bacteria such as the genera Bacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Brevibacterium, Rhodococcus, Nocardia, Caseobacter or Arthrobacter or gram-negative bacteria such as the genus Escherichia or are advantageous Salmonella or yeasts like the genera Rhodotorula, Hansenula or Candida.
  • goose is particularly advantageously selected from the group of the genera and species consisting of Hansenula anomala, Candida utilis, Claviceps purpurea, Bacillus circulans, Bacillus subtilis, Bacillus sp., Brevibacterium albidum, Brevibacterium album,
  • Brevibacterium cerinum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium glutamigenes, ketoglutamicum Brevibacterium iodinum, Brevibacterium lactofermentum Brevibacterium, Brevibacterium linens, Brevibacterium roseum, Brevibacterium saccharolyticum, sp Brevibacterium., Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum ( Micrococcus glutamicum), Corynebacterium melassecola , Corynebacterium sp. or Escherichia coli specifically Escherichia coli K12 and its strains described.
  • Transgenic plants selected from the group of useful plants are advantageously used in the method according to the invention.
  • nucleic acid sequence (s) used in the process for the production of amino acids in transgenic organisms advantageously come from a eukaryote (for the invention, the plural is intended to include the singular and vice versa), but can also be selected from a prokaryote, such as bacteria, from the genera Brevibacterium , Escherichia, Salmonella, Bacillus, Corynebacterium, Serratia, Klebsiella or Enterobacter.
  • the Nukieinkladsequenzen derived from a plant such as a plant selected from the families Acera- ceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Salicaceae, Solanaceae, Arecaceae, Bromeliaceae, Cyperaceae, Iridaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Gentia- naceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae, Carifolaceae, Rubjaceae, Scrophularia- ceae, Caryophyllaceae, Ericaceae, Polygonaceae, Violaceae oreaeaeeaeaeaeaeaeaeaeaeaeaeaeae
  • sequences particularly advantageously come from yeasts such as the genera Pichia, Torulopsis, Hansenula, Schizosaccharomyces, Candida, Rhodotorula or Sac- charomyces, very particularly advantageous from the yeast of the Saccharomycetaceae family, such as the advantageous genus Saccharomyces and the particularly advantageous genus and type Saccharomyces cerevisiae.
  • the nucleic acid sequences with the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 13 and / or SEQ ID NO: 15 used in the method according to the invention code for a threonine aldolase.
  • This aldolase (SEQ ID NO: 1) shows the highest homology to the GLY1 protein of A. gossypii [Eremothecium ashbii, Eremothecium gossypii] (EMBL database. Accession No. AJ005442, CAA06545.1, GENSEQ_PROT: AAY25338, identity at amino acid level to SEQ ID NO: 1 in 76%).
  • threonine aldolases which originate from rice, soybean, and wheat and which were disclosed in US 2002123118 A1.
  • homologies to a variety of nucleic acids can be found.
  • yeasts such as Candida albicans (EMBL database. Accession No. AF009967, AAB64198.1, identity at the amino acid level to SEQ ID NO: 1 of 56%), from Schizosaccharomyces pombe (EMBL database. Accession No. Z99163, CAB 16235.1, identity at amino acid level to SEQ ID NO: 1 of 49%), or of bacteria such as Aeromonas jandaei (EMBL database. Accession no.
  • AF169478 AAD47837.1, identity at amino acid level to SEQ ID NO: 1 of 41%)
  • Pseudomonas aeruginosa EMBL database. Accession No. AF011922, AAC46016.1,, identity at amino acid level to SEQ ID NO: 1 of 38%)
  • Vibrio cholerae EMBL database. Accession No. AE004405, AAF96663.1, identity at amino acid level to SEQ ID NO: 1 of 38%)
  • Escherichia coli EBL database. Accession No. AB005050, BAA20882.1, identity at the amino acid level to SEQ ID NO: 1 of 38%)
  • Deinococcus radiodurans EMBL database. Accession No.
  • nucleic acid sequences and proteins encoded by them which originate from yeasts of the genera Candida, Hansenula, Rhodotorula, Schizosaccharomyces or Saccharomyces, are advantageously used.
  • the aldolase advantageously used in the process according to the invention shows a high degree of homology to those under SEQ ID NO: 3 (identity at amino acid level to SEQ ID NO: 1 of 35%), SEQ ID NO: 4 (identity at amino acid level to SEQ ID NO: 1 from 35%), SEQ ID NO: 5 (identity at amino acid level to SEQ ID NO: 1 of 27%), SEQ ID NO: 6 (identity at amino acid level to SEQ ID NO: 1 of 43%), SEQ ID NO: 7 (identity at amino acid level to SEQ ID NO: 1 of 39%), SEQ ID NO: 8 (identity at amino acid level to SEQ ID NO: 1 of 32%), SEQ ID NO: 9 (identity at amino acid level to SEQ ID NO: 1 of 35%) or SEQ ID NO: 10 (identity at amino acid level to SEQ ID NO: 1 of 36%) called sequences, which originate from soy (SEQ ID NO: 3-5), rice (SEQ ID NO: 6 and 7) or from Canola (SEQ
  • Nucleic acid sequences which differ from the amino acid sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 can advantageously be used in the method , SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10.
  • nucleic acid sequences used in the method according to the invention with the sequence SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 and their derivatives code for one Lysine decarboxylase or for a lysine decarboxylase-like protein.
  • PIR AI3438, identity at amino acid level to SEQ ID NO: 11 of 43%), Bacillus subtilis (EMBL database. Accession No. PIR: D70033, identity at amino acid level to SEQ ID NO: 11 of 36%), rhizobium loti or Rhisobium meliloti (EMBL database. Accession No. STREMB Q984W8 or
  • STREMB Q92R13 identity at amino acid level to SEQ ID NO: 11 of 39% and 36%, Bacillus halodurans. (EMBL database. Accession No. PIR: B83993, identity at amino acid level to SEQ ID NO: 11 of 37%), Agrobacterium tumefaciens (EMBL database. Accession No. PIR: AI2707 or PIR: B97490, identity at the amino acid level to SEQ ID NO: 11 of 41% in each case, Staphylococcus aureus (EMBL database. Accession No.
  • nucleic acid sequences and proteins encoded by them are used in the method according to the invention, which are derived from yeasts of the genera Candida, Hansenula, Rhodotorula, Schizosaccharomyces or Saccharomyces.
  • the lysine decarboxylase advantageously used in the method according to the invention shows a high homology to those under SEQ ID NO: 21 (identity at amino acid level to SEQ ID NO: 11 of 42%), SEQ ID NO: 23 (identity at amino acid level to SEQ ID NO: 11 of 43%) or SEQ ID NO: 25 (identity at amino acid level to SEQ ID NO: 11 of 37%), which come from rapeseed, rice and maize.
  • Nucleic acid sequences which are derived from the amino acid sequences SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 and can advantageously be used in the method have lysine decarboxylase activity.
  • Nucleic acid sequences which are advantageous for the method according to the invention and which code for polypeptides with threonine aldolase activity or lysine decarboxylase activity can be determined from generally accessible databases.
  • general gene databases are to be mentioned here, such as the EMBL database (Stoesser G. et al., Nucleic Acids Res 2001, Vol. 29, 17-21), the GenBank database (Benson DA et al., Nucleic Acids Res 2000, vol. 28, 15-18), or the PIR database (Barker WC et al., Nucleic Acids Res. 1999, vol. 27, 39-43).
  • organism-specific gene databases can be used to determine advantageous sequences, e.g. advantageous for yeast, the SGD database (Cherry JM et al., Nucleic Acids Res. 1998, Vol. 26, 73-80) or the MI PS database (Mewes HW et al., Nucleic Acids Res. 1999, Vol. 27 , 44-48), the GenProtEC database for E. coli
  • nucleic acid sequences are incorporated into a nucleic acid construct and / or a vector.
  • nucleic acid sequences of biosynthesis genes of the amino acid produced in the process, which are introduced together into the organism can advantageously be present in the nucleic acid construct or in the vector.
  • additional sequences can also be introduced into the organisms directly or via other separate nucleic acid constructs or vectors.
  • Genes are advantageous for threonine aldolases or lysine decarboxylase encode, introduced alone or in combination in an organism advantageously a microorganism or a plant.
  • nucleic acid sequences used in the method according to the invention are isolated nucleic acid sequences which code for polypeptides with threonine aldolase activity or lysine decarboxylase activity.
  • nucleic acids are to be understood as DNA or RNA sequences which can be single or double-stranded or which can optionally have synthetic, non-natural or modified nucleotide bases which can be incorporated into DNA or RNA.
  • expression means the transcription and / or translation of a codogenic gene section or gene.
  • the resulting product is a protein.
  • the products also include functional RNAs such as Ribozymes. Expression can be systemic or local, e.g. restricted to certain cell types, tissues or organs.
  • the expression products of the nucleic acids used in the method according to the invention e.g. the codogenic gene segments (ORFs) and their regulatory elements can be identified by their function. These include, for example, functions in the areas of metabolism, energy, transcription, protein synthesis, protein processing, cellular transport and transport mechanisms, cellular communication and signal transduction, cell rescue, cell defense and cell virulence, regulation of the cellular environment and interaction of the cell with its environment, cell fate, transposable elements, viral proteins and plasmid proteins, cellular organizational control, subcellular localization, regulation of protein activity, proteins with binding function or cofactor requirement and transport facilitation. Genes with the same function are combined into so-called functional gene families.
  • the biological activity of the nucleic acids used in the method according to the invention allows different amino acids to be produced or their production to be improved and / or increased.
  • the organism used for the method according to the invention for example a microorganism or a plant, mixtures of the different amino acids can be produced.
  • L-lysine and / or L-methionine is advantageously produced as an amino acid or amino acid mixture in the process according to the invention.
  • L-methionine is particularly preferably produced in the process.
  • transgenic organisms if they are plants, also include plant cells, tissues and organs such as roots, shoots, stems, seeds, flowers, To understand tuber or leaf or whole plants that are grown for the production of amino acids.
  • Cultivation means, for example, the cultivation of the transgenic plant cells, tissues or organs on or in a nutrient medium or the whole plant on or in a substrate, for example in hydroponics, potting compost or on a field soil.
  • Donor and recipient plants can thus belong to the same family, genus, species, variety or line, with increasing homology between the nucleic acids to be integrated and corresponding parts of the genome of the recipient plant. The same applies to microorganisms as donor and recipient organisms.
  • These sequences are cloned individually or in combination into expression constructs. These expression constructs enable optimal synthesis of the amino acids produced in the process according to the invention.
  • this method further comprises the step of obtaining the amino acid (s) or the amino acid mixture from the culture and / or the organism.
  • the cell thus produced is advantageously a cell of a plant or a microorganism as described above as advantageous.
  • transgenic organism such as a plant or a transgenic microorganism in the sense of the invention is understood to mean that the nucleic acids used in the method are not in their natural place in the genome of an organism; the nucleic acids can be expressed homologously or heterologously.
  • transgene also means that the nucleic acids according to the invention are in their natural place in the genome of an organism, that however, the sequence was changed compared to the natural sequence and / or the regulatory sequences of the natural sequences were changed.
  • Transgenic is preferably understood to mean the expression of the nucleic acids used in the method according to the invention at a non-natural location in the genome, that is to say a homologous or preferably heterologous expression of the nucleic acids is present.
  • transgenic plants are, for example, the following plants, selected from the families Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaeeaea, Salacaceae, Solacaceae Cyperaceae, Iridaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Gentianaceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae, Carifolaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Caryophyllaceae, Ericaceae, Polygonaceae, Violaceae, Juncaceaeaeaeaea family of a family of Poaceaaceae Fabaceae, Papaveraceae, Rosaceae, So
  • Further advantageous preferred plants are useful plants advantageously selected from the group of the genus peanut, rapeseed, canola, sunflower, safflower (safflower), olive, sesame, hazelnut, almond, avocado, bay leaf, pumpkin, flax, soybean, pistachio nuts, borage , Corn, wheat, rye, oats, millet, tritical, rice, barley, cassava, potato, sugar beet, eggplant, alfaalfa and perennial grasses and forage crops, oil palm, vegetables (cabbage vegetables, root vegetables, bulbous vegetables, legumes, fruit vegetables, onion vegetables, Leafy and stem vegetables), buckwheat, Jerusalem artichoke, field bean, sweet peas, lentil, bush bean, lupine, clover and alfalfa.
  • transgenic plant used according to the invention also refers to the progeny of a transgenic plant, for example the Tp, T 2 -, T 3 - and subsequent plant generations or the BC-p, BC 2 -, BC 3 - and subsequent plant generations.
  • the transgenic plants according to the invention can thus be grown and crossed with themselves or other individuals in order to obtain further transgenic plants according to the invention.
  • Transgenic plants can also be obtained by vegetative propagation of transgenic plant cells.
  • the present invention also relates to transgenic plant material which can be derived from a population of transgenic plants according to the invention.
  • Transgenic plants which contain the amino acids synthesized in the process according to the invention can be marketed directly without isolating the synthesized compounds.
  • plants in the process according to the invention are all parts of plants, plant organs such as To understand leaf, stem, root, tubers or seeds or the entire plant.
  • the semen comprises all parts of the semen such as the seminal shell, epidermal and sperm cells, endosperm or embyro tissue.
  • the amino acids produced in the process according to the invention or the advantageously produced amino acid L-methionine can also be isolated from the plants in the form of their free amino acids or bound in proteins.
  • Amino acids produced by this method can be harvested by harvesting the organisms either from the culture in which they grow or from the field. This can be done by pressing, grinding and / or extraction, salt precipitation and / or ion exchange chromatography of the plant parts, preferably the plant seeds, fruit, bulbs etc.
  • amino acids produced in the process are isolated.
  • the amino acids obtained in this way can then be further purified, if desired, mixed with other active ingredients) such as vitamins, amino acids, carbohydrates, antibiotics, etc. and formulated if necessary.
  • a further embodiment according to the invention is the use of the amino acids produced in the process or of the transgenic organisms in feed, food, cosmetics or pharmaceuticals.
  • the nucleic acids used in the method can either be integrated into the plastid genome or preferably into the genome of the host cell.
  • Transient expression is also possible and can be used advantageously. Production by, for example, a viral infection with recombinant virus is also possible in principle, the expression of the gene or the genes advantageously being increased.
  • the integration can be random or by recombination such that the native gene is replaced by the inserted copy, thereby modulating the production of the desired compound by the cell, or by using a gene in trans so that the The gene is functionally linked to a functional expression unit which contains at least one sequence ensuring expression of a gene and at least one sequence ensuring polyadenylation of a functionally transcribed gene.
  • the nucleic acids are advantageously brought into the plants via multi-expression cassettes or constructs for the multiparallel expression of genes.
  • the nucleic acid sequence is introduced into the plant in a simple expression cassette or a simple construct, that is to say without any other nucleic acid sequences.
  • Heterologous nucleic acid sequences are preferably introduced.
  • cloning vectors in plants and in plant transformation such as those published in and cited in: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Chapter 6/7, pp. 71-119 ( 1993); FF White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, ed .: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, ed .: Kung and R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev.
  • nucleic acids can be used for the genetic engineering modification of a broad spectrum of plants, so that this becomes a better or more efficient producer of the amino acids produced in the process according to the invention.
  • This improved production or efficiency of the production of the amino acids or products derived therefrom, such as modified proteins, can be brought about by the direct effect of the manipulation or an indirect effect of this manipulation.
  • the expression of the gene naturally present in the organisms can also be increased, for example by changing the regulation of the gene, or the stability of the mRNA or the gene product, ie the aldolase or the carboxylase, can be increased.
  • the use of different divergent, i.e. Different sequences at the DNA sequence level can be advantageous, or the use of promoters for gene expression, which enables a different temporal gene expression.
  • the yield, production and / or efficiency of the production of amino acids in the host organism can be increased.
  • sulfur-containing compounds which contain at least one sulfur atom covalently bonded can be produced in the process according to the invention.
  • examples of such compounds include methionine, homocysteine, S-adenosylmethionine, cysteine, advantageously methionine and S-adenosylmethionine.
  • L-methionine also include the corresponding salts, such as, for example, B. methionine hydrochloride or methionine sulfate.
  • methionine or threonine should also include the terms L-methionine or L-threonine. Proteins are also included, in which the methionine produced in the process is bound.
  • the isolated nucleic acid molecules used in the method according to the invention code for proteins or parts thereof, the proteins or the individual protein or parts thereof containing an amino acid sequence which is sufficiently homologous to an amino acid sequence of the sequence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 26, so that the protein or part thereof maintains threonine aldolase or lysine decarboxylase activity.
  • the protein or the part thereof which is encoded by the nucleic acid molecule has its essential enzymatic or biological activity and the ability to participate in the metabolism of amino acids in plants or microorganisms or in general in plant or
  • the protein encoded by the nucleic acid molecules is at least about 30%, 35%, 40%, 45% or 50%, preferably at least about 60%, and more preferably at least about 70%, 80% or 90%, and most preferably at least about 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more homologous to an amino acid sequence of the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the protein is preferably a full-length protein which is essentially homologous in part to a total amino acid sequence of the SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 26 (that of the SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 is due to the open reading frame shown).
  • nucleic acid sequences used are derived from the amino acid sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 from.
  • the proteins encoded by these derived nucleic acid molecules are at least about 70% or 75%, preferably at least about 80% or 85%, more preferably at least about 90%, 91%, 92% or 94% and most preferably at least about 95% , 96%, 97%, 98%, 99% or more homologous to the amino acid sequences encoded by them or an amino acid sequence of the sequence SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10.
  • homology or homologous, identity or identical is to be understood.
  • the essential enzymatic or biological activity of the enzymes used is to be understood as compared to those by the sequences with SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 or those of the sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 derived sequences and their derivatives encoded proteins / enzymes in comparison still at least one enzymatic or biological activity of at least 10% , preferably 20%, particularly preferably 30% and very particularly 40%, and thus can participate in the metabolism of amino acids in a plant or microorganism cell, or in the transport of molecules across membranes, advantageously meaning the amino acids methionine or lysine.
  • Nucleic acids which can be used in the method advantageously come from yeasts such as the Saccharomycetaceae family such as the advantageous genus Saccharomyces or yeast genera such as Candida, Hansenula, Rhodotorula or Schizosaccharomyces and the particularly advantageous genus and species Saccharomyces cerevisiae.
  • yeasts such as the Saccharomycetaceae family such as the advantageous genus Saccharomyces or yeast genera such as Candida, Hansenula, Rhodotorula or Schizosaccharomyces and the particularly advantageous genus and species Saccharomyces cerevisiae.
  • isolated nucleotide sequences can be used in the method according to the invention, which code for putative aldolases or decarboxylases and which bind to a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 or in another advantageous embodiment to a sequence that differs from the sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10, hybridize, for example hybridize under stringent conditions.
  • the hybridization should advantageously be carried out with fragments of a length of at least 200 bp, advantageously at least 400 bp, preferably at least 600 bp, particularly preferably of at least 800 bp, very particularly preferably of at least 1000 bp. In a particularly preferred embodiment, the hybridization should be carried out with the entire nucleic acid sequence.
  • the codogenic gene segment is advantageously subjected to amplification and ligation in a known manner.
  • the procedure is preferably based on the protocol of the Pfu-DNA polymerase or a Pfu / Taq-DNA polymerase mixture.
  • the primers are chosen based on the sequence to be amplified.
  • the primers should expediently be chosen such that the amplificate comprises the entire codogenic sequence from the start to the stop codon.
  • the amplificate is expediently analyzed. For example, the analysis can be carried out after gel electrophoretic separation with regard to quality and quantity.
  • the amplificate can then be cleaned according to a standard protocol (eg Qiagen).
  • Suitable cloning vectors are generally known to the person skilled in the art. These include, in particular, vectors that can be replicated in bacterial systems, in particular vectors that ensure efficient cloning in E. coli and enable the stable transformation of plants.
  • vectors that can be replicated in bacterial systems
  • vectors that ensure efficient cloning in E. coli and enable the stable transformation of plants.
  • various binary and co-integrated vector systems suitable for T-DNA-mediated transformation are to be mentioned.
  • Such vector systems are generally characterized in that they contain at least the vir genes required for the Agrobacterium-mediated transformation and the sequences which limit the T-DNA (T-DNA border).
  • These vector systems preferably also comprise further cis-regulatory regions such as promoters and terminators and / or selection markers with which appropriately transformed organisms can be identified.
  • binary systems are based on at least two vectors, one of which is vir genes, but no T-DNA and a second T-DNA, but none carries vir gene.
  • these binary vectors include vectors from the pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen series. Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV and pCAMBIA are preferably used according to the invention.
  • the vectors can first be linearized with restriction endonuclease (s) and then modified enzymatically in a suitable manner. The vector is then cleaned and an aliquot for the toilet nation used. During the cloning, the enzymatically cut and, if necessary, purified amplificate is cloned with similarly prepared vector fragments using ligase.
  • a certain nucleic acid construct or vector or plasmid construct can have one or more codogenic gene segments. The codogenic gene segments in these constructs are preferably functionally linked to regulatory sequences.
  • the regulatory sequences include, in particular, plant sequences such as the promoters and terminators described above.
  • the constructs can advantageously be stably propagated in microorganisms, in particular Escherichia coli and Agrobacterium tumefaciens, under selective conditions and enable transfer of heterologous DNA into plants or other microorganisms.
  • the constructs are based on binary vectors (overview of binary vectors in Hellens et al., 2000).
  • prokaryotic regulatory sequences such as the origin of repication and selection markers, for multiplication in microorganisms such as Escherichia coli and Agrobacterium tumefaciens
  • Agrobacterium T-DNA sequences for the transfer of DNA into plant genomes.
  • the right border sequence which comprises approximately 25 base pairs.
  • the vector constructs according to the invention usually contain T-DNA sequences from both the right and the left boundary region, which contain useful recognition sites for site-specific enzymes, which in turn are encoded by part of the vir genes.
  • Suitable host organisms are known to the person skilled in the art. Advantageous organisms are further described in "this application above.
  • bacterial hosts some of which have already been mentioned above in the context of donor microorganisms, such as microorganisms such as fungi such as the genus Claviceps or Aspergillus or gram-positive bacteria such as the genera Bacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Brevibacterium, Rhodococcus, Nocardia, Casebacter or Arthrobacter or Gram-negative bacteria such as the genera Escherichia, Flavobacterium or Salmonella or yeasts such as the genera Rhodotorula, Hansenula or Candida Group of the genera Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia, Bacillus, Rhodotorula, Hansenula, Candida, Claviceps or Flavobacterium
  • goose are particularly advantageously selected from the group of genera and species consisting of Hansenula anomala, Candida utilis, Claviceps purpurea, microorganisms bacil lus circulans, Bac
  • Escherichia coli specifically Escherichia coli K12 and its strains described.
  • Further advantageous preferred plants are useful plants advantageously selected from the group of the peanut, rapeseed, canola, sunflower, safflower (safflower), olive, sesame, hazelnut, almond, avocado, laurel, pumpkin, flax, soy, pistachio, borage, maize , Wheat, rye, oats, millet, triticale, rice, barley, cassava, potato, sugar beet, beet, eggplant and perennial grasses and forage crops, oil palm, vegetables (cabbage vegetables, root vegetables, tuber vegetables, legumes vegetables, fruit vegetables, onion vegetables, leafy and stem vegetables ), Buckwheat, Jerusalem artichoke, field bean, sweet peas, lentil,, alfaalfa, bush bean, lupine, clover and alfalfa.
  • nucleic acids used in the method according to the invention into a plant
  • an intermediate host for example a bacterium.
  • the transformation into E. coli has proven to be expedient here, which can be carried out in a manner known per se, for example by means of heat shock or electroporation.
  • the transformed E. coli colonies can thus be examined with regard to the cloning efficiency. This can be done with the help of a PCR. Both the identity and the integrity of the plasmid construct can be checked using a defined number of colonies by subjecting an aliquot of the colonies to said PCR.
  • Universal primers derived from vector sequences are generally used for this, the forward primer being arranged upstream from the start ATG and the reverse primer downstream from the stop codon of the codogenic gene segment.
  • the amplificates are separated electrophoretically and evaluated in terms of quantity and quality. If a fragment of the appropriate size is detected, the result is positive.
  • the possibly checked plasmid constructs are then used for the transformation of the plants. For this it may first be necessary to obtain the constructs from the intermediate host.
  • the constructs can be obtained as plasmids from bacterial hosts based on conventional plasmid isolation. Numerous methods for transforming plants are known.
  • the T-DNA-mediated transformation has proven to be particularly useful. For this it is first necessary to transform suitable vehicles, in particular agrobacteria, with the codogenic gene segment or the corresponding plasmid construct. This can be done in a manner known per se. Therefore, a distinction must be made between the formation of co-integrated vectors on the one hand and the transformation with binary vectors.
  • the vector constructs comprising the codogenic gene section do not have any T-DNA sequences, but the co-integrated vectors are formed in the agrobacteria by homologous recombination of the vector construct with T-DNA.
  • the T-DNA is present in the agrobacteria in the form of Ti or Ri plasmids in which the oncogenes have been expediently replaced by exogenous DNA. If binary vectors are used, they can be transferred to agrobacteria by bacterial conjugation or direct transfer. These agrobacteria expediently already contain the vector which carries the vir genes (often referred to as helper Ti (Ri) plasmid).
  • one or more markers can also advantageously be used, by means of which the selection of transformed agrobacteria and transformed plant cells is possible.
  • markers include, for example, those which confer resistance to chloramphenicol, kanamycin, the aminoglycoside G418, hygromycin and the like.
  • the plasmid constructs on one or both sides of the codogenic gene section be flanked by T-DNA. This is particularly useful when bacteria of the species Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes are used for the transformation.
  • a preferred method according to the invention is the transformation using Agrobacterium tumefaciens. But biolistic methods can also be advantageous for introducing the. Sequences are used in the method according to the invention, and introduction by means of PEG is also possible.
  • the transformed agrobacteria can be cultivated in a manner known per se and are thus ready for an appropriate transformation of the plants.
  • the plants or plant parts to be transformed are grown or provided in a conventional manner.
  • the transformed agrobacteria are then allowed to act on the plants or plant parts until a sufficient transformation rate is reached.
  • the agrobacteria can act on the plants or parts of plants in different ways. For example, a culture of morphogenic plant cells or tissues can be used.
  • the bacteria are usually eliminated by antibiotics and the regeneration of plant tissue is induced.
  • suitable plant hormones are used to promote the development of shoots after initial callus formation.
  • An advantageous transformation method is the transformation in planta. For this, you can, for example, let the agrobacteria act on plant seeds or inoculate plant meristems with agrobacteria. According to the invention, it has proven particularly expedient to allow a suspension of transformed agrobacteria to act on the entire plant or at least on the flowering plants. This is then further grown until seeds of the treated plant are obtained. (Clough and Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743).
  • the plant material obtained from the transformation is generally subjected to selective conditions so that transformed plants can be distinguished from non-transformed plants.
  • the seeds obtained in the manner described above can be applied again and, after growing, subjected to a suitable spray selection.
  • Another possibility is to grow the seeds, if necessary after sterilization, on agar plates using a suitable selection agent so that only the transformed seeds can grow into plants.
  • the nucleic acid sequences coding for threonine aldolase and / or lysine decarboxylase used in the method according to the invention are advantageously functionally linked with one or more regulatory signals in order to increase gene expression.
  • These regulatory sequences are intended to enable targeted expression of the genes and protein expression.
  • the host organism transgenic organism, for example plant or microorganism
  • this can mean, for example, that the gene is only expressed and / or overexpressed after induction, or that it is immediately expressed and / or overexpressed.
  • these regulatory sequences are sequences to which inducers or repressors bind and thus regulate the expression of the nucleic acid.
  • the natural regulation of these sequences may still be present in front of the actual structural genes and may have been genetically modified so that the natural regulation has been switched off and the expression of the genes increased.
  • the gene construct can also advantageously contain one or more so-called “enhancer sequences” functionally linked to the promoter, which enable an increased expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences, such as further regulatory elements or terminators, can also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences.
  • nucleic acid construct or the nucleic acid constructs can be expressed together in the host organism.
  • the nucleic acid construct or the nucleic acid constructs can be inserted in one or more vectors and freely present in the cell or else inserted in the genome, advantageously.
  • integration into the plastid genome or, preferably, into the cell genome may have taken place. It is advantageous for the insertion of further genes in the host genome if the genes to be expressed are present together in one gene construct.
  • Regulatory sequences are generally arranged upstream (5 '), within and / or downstream (3') with respect to a specific nucleic acid or a specific codogenic gene segment. In particular, they control the transcription and / or translation as well as the transcript stability of the codogenic gene section, possibly in interaction with other cell-specific functional systems such as the protein protein biosynthesis apparatus of the cell.
  • Regulatory sequences include, in particular, upstream (5 ') sequences which relate in particular to the regulation of transcription initiation, such as promoters, and downstream (3') sequences which primarily relate to the regulation of transcription termination, such as polyadenylation signals.
  • all promoters can be used which can stimulate the transcription of genes in organisms such as microorganisms, plants or non-human animals.
  • Suitable promoters which are functional in these organisms are generally known. They can be constitutive or inducible promoters. Suitable promoters can enable development-specific and / or tissue-specific expression in multicellular eukaryotes. For example, leaf, root, flower, seed, guard cell or fruit-specific promoters can advantageously be used in plants.
  • the regulatory sequences or factors can preferably have a positive influence on the gene expression of the introduced genes and thereby increase it.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or "enhancers".
  • an increase in translation is also possible, for example by Translational enhancer sequences are introduced or the stability of the RNA is improved.
  • a further embodiment of the invention is one or more nucleic acid constructs which contain one or more nucleic acid sequences which are identified by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 are defined and for those in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 26.
  • nucleic acid constructs which contain one or more nucleic acid sequences which differ from the sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10.
  • the polypeptides mentioned advantageously have a threonine aldolase activity. The same applies to their homologs, derivatives or analogs which are functionally linked to one or more regulation signals, advantageously to increase gene expression.
  • promoters such as the cos, tac, rha, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, lacl q " 'T7 , T5, T3, gal, trc, ara, SP6, ⁇ -P R or ⁇ -P L promoter, which are advantageously used in Gram-negative bacteria Gram-positive promoters amy, dnaK, xylS and SP02, in the yeast or fungal promoters ADC1, MF ⁇ , AC, P-60, UASH, MCB, PHO, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH or in the plant promoters CaMV / 35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294, US 5,352,605], PRP1 [Ward et al., Plant.
  • promoters such as the cos, tac, rha, trp, tet, trp-t
  • inducible promoters are also advantageous, such as those in EP-A-0 388 186 (benzylsulfonamide-inducible), Plant J. 2, 1992: 397-404 (Gatz et al., Tetracycline-inducible), EP-A- 0 335 528 (abzisic acid-inducible) or WO 93/21334 (ethanol- or cyclohexenol-inducible) described promoters.
  • Other suitable plant promoters are the promoter of cytosolic FBPase or the ST-LSI promoter of the potato (Stockhaus et al., EMBO J.
  • the phosphoribosylpyrophosphatamidotransferase promoter from Glycine max (Genbank accession number U87999) or the node-specific promoter described in EP-A-0249676.
  • Particularly advantageous promoters are promoters which enable expression in specific tissues or show preferential expression in certain tissues.
  • Seed-specific promoters such as the USP promoter according to the embodiment, but also other promoters such as the LeB4, DC3, SAD1, phaseolin or napin promoter are also advantageous.
  • promoters are seed-specific promoters which can be used for monocot or dicot plants and in US 5,608,152 (napin promoter from rapeseed), WO 98/45461 (oleosin promoter from Arabidopsis), US 5,504,200 (phaseolin promoter from Phaseolus vulgaris) ), WO 91/13980 (Bce4 promoter from Brassica), from Baeumiein et al., Plant J., 2, 2, 1992: 233-239 (LeB4 promoter from a legume), these promoters being suitable for dicotyledons.
  • promoters are suitable, for example, for monocotyledons lpt-2 or lpt-1 promoter from barley (WO 95/15389 and WO 95/23230), hordein promoter from barley, the ubiquitin promoter from maize and others, in WO 99 / 16890 described suitable promoters.
  • the encoded biosynthetic genes can advantageously be expressed in plants in a constitutive and / or seed-, fruit- or tuber-specific manner. In a further advantageous embodiment, however, they can also be expressed inducibly, so that they are specifically induced and thus expressed in a desired growth phase of the plant.
  • seed-specific promoters can be used, or those promoters that are active in the embryo and / or in the endosperm. In principle, seed-specific promoters can be isolated from both dicotolydonous and monocotolydonous plants.
  • WO95 / 23230 seed-specific promoters from rice, maize and the like.
  • Wheat [WO 99/16890], Amy32b, Amy 6-6 and Aleurain [US 5,677,474], Bce4 (rapeseed) [US 5,530,149], glycinin (soybean) [EP 571 741], phosphoenol pyruvate carboxylase
  • Plant gene expression can also be facilitated via a chemically inducible promoter (see an overview in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108).
  • Chemically inducible promoters are particularly suitable if it is desired that the gene expression be carried out in a time-specific manner. Examples of such promoters are a saiicylic acid-inducible promoter (WO 95/19443), a tetracycline-inducible promoter (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) and an ethanoi-inducible promoter.
  • each of the nucleic acids used in the process which code for the aldolases and / or decarboxylases, should preferably be different under the control of its own Promotors are expressed because repeating sequence motifs can lead to instability of the T-DNA or to recombination events or to silencing.
  • the expression cassette is advantageously constructed in such a way that a promoter is followed by a suitable interface for inserting the nucleic acid to be expressed, advantageously in a polylinker, and optionally a terminator behind the polylinker.
  • This sequence is repeated several times, preferably three, four or five times, so that up to five genes are combined in one construct and can thus be introduced into the transgenic plant for expression.
  • the sequence is advantageously repeated up to three times.
  • the nucleic acid sequences are inserted for expression via the suitable interface, for example in the polylinker behind the promoter.
  • Each nucleic acid sequence advantageously has its own promoter and possibly its own terminator. However, it is also possible to insert several nucleic acid sequences behind a promoter and possibly in front of a terminator.
  • the insertion point or the sequence of the inserted nucleic acids in the expression cassette is not of critical importance, ie a nucleic acid sequence can be inserted in the first or last position in the cassette without the expression being significantly influenced thereby.
  • Different promoters such as the USP, the LegB4, the DC3 promoter or the parsley ubiquitin promoter and different terminators can advantageously be used in the expression cassette.
  • nucleic acid sequence that can be expressed in combination with the sequences used in the method and / or the aforementioned biosynthesis genes is the sequence for an ATP / ADP translocator as described in WO 01/20009. This ATP / ADP translocator leads to an increase in the synthesis of the essential amino acids lysine and / or methionine, advantageously of methionine.
  • the transcription of the introduced genes should advantageously be terminated by suitable terminators at the 3 'end of the introduced biosynthesis genes (behind the stop codon).
  • suitable terminators at the 3 'end of the introduced biosynthesis genes (behind the stop codon).
  • the promoters different terminator sequences should be used for each gene.
  • the gene construct can also comprise further genes which are to be introduced into the organisms. It is possible and advantageous to incorporate regulatory genes, such as genes for inducers, repressors or enzymes, which intervene in the regulation of one or more genes of a biosynthetic pathway due to their enzyme activity. gene and express it. These genes can be heterologous or homologous in origin. Furthermore, further biosynthesis genes can advantageously be contained in the nucleic acid construct or gene construct, or these genes can lie on a further or more further nucleic acid constructs. Genes of amino acid metabolism, glycolysis, tricarboxylic acid metabolism or their combinations are advantageously used as biosynthetic genes.
  • polypeptides or enzymes can be cloned in combination with other genes in the nucleic acid constructs or vectors and used to transform microorganisms or plants using e.g. Agrobacterium can be used.
  • the regulatory sequences or factors can preferably have a positive influence on the gene expression of the introduced genes and thereby increase it.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or "enhancers".
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the mRNA or by inserting a translation enhancer sequence.
  • the expression cassettes can be used directly for introduction into the plant or else can be introduced into a vector.
  • vectors contain the nucleic acid used in the method, which code for threonine aldolase and / or lysine decarboxylase proteins, or a nucleic acid construct which contains the nucleic acid used alone or in combination with other genes such as the biosynthetic genes of the amino acid metabolism contains.
  • vector refers to a nucleic acid molecule that can transport another nucleic acid to which it is attached.
  • plasmid which stands for a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated.
  • viral vector is a viral vector, whereby additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • vectors can replicate autonomously in a host cell into which they have been introduced (eg bacterial vectors with a bacterial origin of replication). Other preferred vectors are advantageously integrated into the genome of a host cell when introduced into the host cell and thereby replicated together with the host genome. In addition, certain vectors can control the expression of genes to which they are operably linked. These vectors are referred to here as "expression vectors". As mentioned above, they can replicate autonomously or be integrated into the host genome. Expression vectors suitable for recombinant DNA techniques are usually in the form of plasmids. In the present description, "plasmid” and “vector” can be used interchangeably since the plasmid is the most frequently used vector form.
  • vector is also intended to include other vectors known to the person skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, TMV, transposons, IS elements, phasmids, phagemids, cosmids, linear or circular DNA.
  • the recombinant expression vectors advantageously used in the method comprise the nucleic acids according to the invention or the nucleic acid construct according to the invention in a form which is suitable for the expression of the nucleic acids used in a host cell, which means that the recombinant expression vectors are selected on the basis of the expression sequences host cells to be used, which is operably linked to the nucleic acid sequence to be expressed.
  • "operably linked” means that the nucleotide sequence of interest is linked to the regulatory sequence (s) such that the. Expression of the nucleotide sequence is possible and they are bound to one another so that both sequences fulfill the predicted function ascribed to the sequence (e.g.
  • regulatory sequence is intended to include promoters, enhancers and other expression control elements (e.g. polyadenylation signals). These regulatory sequences are e.g. described in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), or see: Gruber and Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, ed .: Glick and Thompson, Chapter 7, 89-108, including the references therein.
  • Regulatory sequences include those that control the constitutive expression of a nucleotide sequence in many host cell types and those that control the direct expression of the nucleotide sequence only in certain host cells under certain conditions.
  • the person skilled in the art knows that the design of the expression vector can depend on factors such as the selection of the host cell to be transformed, the extent of expression of the desired protein, etc.
  • the recombinant expression vectors used can be designed specifically for the expression of nucleic acid sequences used in the method in prokaryotic or eukaryotic cells. This is advantageous since intermediate steps of vector construction are often carried out in microorganisms for the sake of simplicity.
  • the amino acid, lysine decarboxylase and / or threonine aldoalse genes can be found in bacterial cells, insect cells (using baculovirus expression vectors), yeast and other fungal cells [see Romanos, MA, et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488; van den Hondel, CAMJJ, et al.
  • Proteins in prokaryotes are usually expressed using vectors which contain constitutive or inducible promoters which control the expression of fusion or non-fusion proteins.
  • Typical fusion expression vectors include pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, DB, and Johnson, KS (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), in which Glutathion-S Transferase (GST), maltose E-binding protein or protein A is fused to the recombinant target protein.
  • GST Glutathion-S Transferase
  • Suitable inducible non-fusion E. coli expression vectors include pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69: 301-315) and pET 11d [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89].
  • Target gene expression from the pTrc vector is based on transcription by host RNA polymerase from a hybrid trp-lac fusion promoter.
  • the target gene expression from the pET 11d vector is based on the transcription from a T7-gn10-lac fusion promoter, which is mediated by a co-expressed viral RNA polymerase (T7 gn1). This viral polymerase is provided by the BL21 (DE3) or HMS174 (DE3) host strains from a resident ⁇ -prophage which harbors a T7 gn1 gene under the transcriptional control of the lacUV 5 promoter.
  • vectors suitable in prokaryotic organisms are known to the person skilled in the art, these vectors are, for example, in E. coli pLG338, pACYC184, the pBR series, such as pBR322, the pUC series, such as pUC18 or pUC19, the M113mp series, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-III 113 -B1, ⁇ gt11 or pBdCI, in Streptomyces plJ101, plJ364, plJ702 or plJ361, in Bacillus pUB110, pC194 or pBD2Aium, in Cory777.
  • the expression vector is a yeast expression vector.
  • yeast expression vectors for expression in the yeast S. cerevisiae include pYeDesaturased (Baldari et al. (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123) and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
  • Vectors and methods for constructing vectors suitable for use in other fungi, such as filamentous fungi include those described in detail in: van den Hondel, CAMJJ, & Punt, PJ [(1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, JF Peberdy et al., eds., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge; or in: More Gene Manipulations in Fungi; JW Bennet & LL Lasure, ed., Pp. 396-428: Academic Press: San Diego]
  • Other suitable yeast vectors are, for example, 2ocM, pAG-1, YEp ⁇ , YEp13 or pEMBLYe23.
  • Examples of other vectors in mushrooms are pALS1, plL2 or pBB116 or in plants pLGV23, pGHIac + , pBIN19, pAK2004 or pDH51.
  • the nucleic acid sequences can be expressed in insect cells using Baculovirus expression vectors.
  • Baculovirus vectors available for expression of proteins in cultured insect cells include the pAc series (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol .. 3: 2156-2165) and the pVL- Series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
  • nucleic acid sequences in unicellular plant cells such as algae
  • unicellular plant cells such as algae
  • plant cells from higher plants eg spermatophytes, such as crops
  • plant expression vectors include those described in detail in: Becker, D., Kempper, E., Schell, J., and Masterson, R. [(1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximally to the left border ", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197] and Bevan, MW [(1984)” Binary Agrobacterium vectors for plant transformation ", Nucl. Acids Res.
  • a plant expression cassette preferably contains regulatory sequences which can control the gene expression in plant cells and are operably linked so that each sequence can fulfill its function, such as termination of the transcription, for example polyadenylation signals.
  • Preferred polyadenylation signals are those derived from Agrobacterium tumefaciens T-DNA, such as gene 3 of the ti plasmid pTiACH ⁇ (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835ff.) Known as octopine synthase or functional equivalents thereof, but also all other terminators which are functionally active in plants are suitable.
  • a plant expression cassette preferably contains other functionally linked sequences, such as translation enhancers, for example that.
  • Overdrive sequence containing the 5 'untranslated tobacco mosaic virus leader sequence that increases the protein / RNA ratio (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-8711).
  • the nucleic acid sequences For expression in plants, the nucleic acid sequences, as described above, must be operably linked to a suitable promoter which carries out gene expression in a timely, cell- or tissue-specific manner.
  • a suitable promoter which carries out gene expression in a timely, cell- or tissue-specific manner.
  • Useful promoters are constitutive promoters (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), such as those derived from plant viruses, such as 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (see also US 5352605 and WO 84/02913), 34S FMV (Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443), the parsley ubiquitin promoter or plant promoters such as that in US 4,962,028 described the small subunit of the Rubisco.
  • Plant gene expression can also be facilitated as described above using a chemically inducible promoter (see an overview in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108).
  • Chemically inducible promoters are particularly suitable if it is desired that the gene expression be carried out in a time-specific manner. Examples of such promoters are a salicylic acid-inducible promoter (WO 95/19443), a tetracycline inducible promoter (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) and an ethanol inducible promoter.
  • Promoters that react to biotic or abiotic stress conditions are also suitable promoters, for example the pathogen-induced PRP1 gene promoter (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), the heat-inducible hsp80 promoter Tomato (US
  • Suitable promoters are the Napingen promoter from rapeseed (US 5,608,152), the USP promoter from Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67), the oleosin promoter from Arabidopsis ( WO 98/45461), the Phaseolin promoter from Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), the Bce4 promoter from Brassica (WO 91/13980), the arc5 promoter from the bean, the DcG3 promoter from the carrot or the legumin B4 promoter (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9) and promoters which bring about the seed-specific expression in monocot plants, such as maize, barley
  • Advantageous seed-specific promoters are the sucrose binding protein promoter (WO 00/26388), the phaseolin promoter and the napin promoter.
  • Suitable notable promoters are the lpt2 or lpt1 gene promoter from barley (WO 95/15389 and WO 95/23230) or those described in WO 99/16890 (promoters from the barley hordein gene, the rice glutelin gene , the rice oryzin gene, the rice prolamin gene, the wheat gliadin gene, wheat glutelin gene, the corn zein gene, the oat glutelin gene, the sorghum-casirin gene, the Rye secalin gene).
  • the multiparallel expression of the nucleic acids used in the method alone or in combination with other genes or nucleic acids may be desired.
  • Such expression cassettes can be introduced via a simultaneous transformation of several individual expression constructs or preferably by combining several expression cassettes on one construct.
  • Several vectors, each with several expression cassettes, can be transformed and transferred to the host cell.
  • Promoters which bring about plastid-specific expression are also particularly suitable. Suitable promoters, such as the viral RNA polymerase promoter, are described in WO 95/16783 and WO 97/06250, and the clpP promoter from Arabidopsis, described in WO 99/46394.
  • plant promoters of actin or ubiquitin genes such as, for example, the Actin1 promoter from rice, are used.
  • Another example of constitutive plant promoters are the V-ATPase promoters from sugar beet (WO 01/14572).
  • Examples of synthetic constitutive promoters are the super promoter (WO 95/14098) and promoters derived from G boxes (WO 94/12015). Furthermore, chemically inducible promoters can also be used under certain circumstances, compare EP-A 388186, EP-A 335528, WO 97/06268. Leaf-specific promoters as described in DE-A 19644478 or light-regulated promoters such as the petE promoter from pea are also available for the expression of genes in plants.
  • the poly-A addition sequence from the ocs gene or nos gene from Agrobacterium tumefaciens should be mentioned in particular.
  • Other regulatory sequences which may be expedient also include sequences which control the transport and / or the localization of the expression products (targeting).
  • the signal peptide or transit peptide coding sequences known per se should be mentioned here.
  • sequences encoding plastid transit peptides it is possible to direct the expression product into the plastids of a plant cell.
  • recipient plants as described above, particular preference is given to plants which can be transformed in a suitable manner. These include mono- and dicotelydone plants.
  • agricultural crops such as cereals and grasses, for example Triticum spp., Zea mays, Hordeum vulgare, oats, Seeale cereale, Oryza sativa, Pennisetum glaueum, Sorghum bicolor, Triticale, Agrostis spp., Cenchrus ciliaris, Dactylis lomerinacea, Festuca spp., Medica-go spp. and Saccharum spp., legumes and oil fruits, e.g.
  • Brassica juncea Brassica napus, Brassica napus, Glyeine max, Araehis hypogaea, Gossypium hirsutum, Cieer arietinum, Helianthus annuus, Lens culinaris, Linum usitatissimum, Sinapis alba, Trifolium repens and Vicia narbonensis, vegetables and fruits, e.g. Bananas, grapes, Lycopersicon esculentum, asparagus, cabbage, watermelons, kiwis, Solanum tuberosum, Beta vulgaris, cassava and chicory, trees, e.g.
  • the present invention relates to transgenic plants of the genus Arabidopsis, e.g. Arabidopsis thaliana and the genus Oryza.
  • Vector DNA can be introduced into prokaryotic or eukaryotic cells using conventional transformation or transfection techniques.
  • transformation and “transfection”, conjugation and transduction, as used here, are intended to mean a large number of methods known in the prior art for introducing foreign nucleic acid (for example DNA) into a host cell, including calcium phosphate or calcium chloride coprecipitation, DEAE Dextran-mediated transfection, PEG-mediated transfection, lipofection, natural competence, chemically mediated transfer, electroporation or particle bombardment.
  • Suitable methods for transforming or transfecting host cells, including plant cells, can be found in Sambrook et al.
  • nucleic acid molecule or sequence
  • nucleic acid can also refer to the untranslated sequence located at the 3 'and 5' ends of the coding gene region: at least 500, preferably 200, particularly preferably 100 nucleotides of the sequence upstream of the 5 'end of the coding region and at least 100, preferably 50, particularly preferably 20 nucleotides of the sequence downstream of the 3' end of the coding gene region. Only the coding region is advantageously used for cloning and expression. An "isolated" nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules that are present in the natural source of the nucleic acid.
  • an "isolated" nucleic acid preferably does not have any sequences that naturally flank the nucleic acid in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid originates (e.g. sequences located at the 5 'and 3' ends of the nucleic acid).
  • the isolated nucleic acid molecule used in the method according to the invention can contain, for example, less than about 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb or 0.1 kb of nucleotide sequences which naturally contain the nucleic acid molecule in the flank the genomic DNA of the cell from which the nucleic acid originates.
  • nucleic acid molecules used in the method for example a nucleic acid molecule with a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 or a part thereof, can be isolated using standard molecular biological techniques and the sequence information provided here.
  • a comparison algorithm can also be used, for example, to identify a homologous sequence or homologous, conserved sequence regions at the DNA or amino acid level. These can be used as hybridization probes as well as standard hybridization techniques (as described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
  • nucleic acid molecule comprising a complete sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 or a part thereof, by polymerase chain reaction, using oligonucleotide primers based on this sequence or parts thereof (for example, a nucleic acid remolecule comprising the complete sequence or a part thereof can be isolated by polymerase chain reaction using oligonucleotide primers which have been prepared on the basis of this same sequence).
  • mRNA can be isolated from cells (for example by the guanidinium thiocyanate extraction method from Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) and cDNA using reverse transcriptase (for example Moloney-MLV reverse transcriptase, available from Gibco / BRL, Bethesda, MD, or AMV reverse transcriptase available from Seikagaku America, Inc., St.Petersburg, FL).
  • reverse transcriptase for example Moloney-MLV reverse transcriptase, available from Gibco / BRL, Bethesda, MD, or AMV reverse transcriptase available from Seikagaku America, Inc., St.Petersburg, FL.
  • Synthetic oligonucleotide primers for amplification by means of the polymerase chain reaction can be based on one of the SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 or using the information in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 26.
  • degenerate primers can be derived from the consensus sequences H [x] 2 G [X] R [X] 19 D [X] 7 K [X] 27 G, HXDGAR [X] 3 A [X] 1S D [X] 4 CXSK [X] 4 PXGS [X] 3 G [X] 7 A [X] 4 K [X] 2 GGGXRQXG, G [X] 4 GIM [X] 45 M [X] 2 RK [X] 2 M [ X] 11 GGXG [X] 3 E [X] 2 E [X] 3 W, or LG [X] 9 LVYGG [X] 3 GIMGXVA [X] 9 G [X] 3GXIP [X] 24 MHXRK [X] 2M Derive [X] 6 F [X] 9 LVYGG [X] 3 GIMGXVA [X] 9 G [X] 3GXIP [X] 24 MHXRK [X] 2M Derive [X] 6 F [X] 9 LVY
  • degenerate primers can then be used by means of PCR to amplify fragments of new threonine aldolases and / or lysine decarboxylases from other organisms. These fragments can then be used as a hybridization probe for the isolation of the complete gene sequence. Alternatively, the missing 5 'and 3' sequences can be isolated using RACE-PCR.
  • a nucleic acid according to the invention can be amplified using cDNA or alternatively genomic DNA as a template and suitable oligonucleotide primers according to standard PCR amplification techniques. The nucleic acid amplified in this way can be cloned into a suitable vector and characterized by means of DNA sequence analysis. Oligonucleotides which correspond to one of the nucleotide sequences used in the method can be produced by standard synthesis methods, for example using an automatic DNA synthesizer.
  • Nucleic acid molecules which are advantageous for the method according to the invention can be isolated on the basis of their homology to the nucleic acids disclosed here using the sequences or a part thereof as a hybridization probe according to standard hybridization techniques under stringent hybridization conditions.
  • isolated nucleic acid molecules can be used that are at least 15 nucleotides long and under stringent conditions with the nucleic acid molecules that have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25, hybridize.
  • Nucleic acids of at least 25, 50, 100, 250 or more nucleotides can also be used.
  • hybridizes under stringent conditions is intended to describe hybridization and washing conditions under which nucleotide sequences which are at least 60% homologous to one another usually remain hybridized to one another.
  • the conditions are preferably such that sequences that are at least about 65%, more preferably at least about 70%, and even more preferably at least about 75% or more homologous to one another usually remain hybridized to one another.
  • homolog or homology means identical or identity.
  • a preferred, non-limiting example of stringent hybridization conditions are hybridizations in 6 x sodium chloride / sodium citrate (SSC) at approximately 45 ° C., followed by one or more washing steps in 0.2 x SSC, 0.1% SDS 50 to 65 ° C. It is known to the person skilled in the art that these hybridization conditions differ depending on the type of nucleic acid and, if organic solvents are present, for example, with regard to the temperature and the concentration of the buffer. The temperature differs, for example, under "standard hybridization conditions” depending on the type of nucleic acid between 42 ° C and 58 ° C in aqueous buffer with a concentration of 0.1 to 5 x SSC (pH 7.2).
  • the temperature is about 42 ° C under standard conditions.
  • the hybridization conditions for DNA: DNA hybrids are preferably, for example, 0.1 ⁇ SSC and 20 ° C. to 45 ° C., preferably between 30 ° C. and 45 ° C.
  • the hybridization conditions for DNA: RNA hybrids are, for example, 0.1 ⁇ SSC and 30 ° C. to 55 ° C., preferably between 45 ° C. and 55 ° C.
  • sequences e.g. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10) or of two nucleic acids (for example of the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 , SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25)
  • sequences become Written for the purpose of optimal comparison (for example, gaps can be inserted in the sequence of a protein or a nucleic acid in order to produce an optimal alignment with the other protein or the other nucleic acid).
  • amino acid residues or nucleotides at the corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. If a position in a sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding site in the other sequence, then the molecules at that position are homologous (ie amino acid or nucleic acid "homology” as used herein corresponds to amino acid - or nucleic acid "identity").
  • An isolated nucleic acid molecule that codes for a threonine aldoalse or lysine decarboxylase that results in a protein sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 , SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 26 or the sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 is homologous by introducing one or more nucleotide substitutions, additions or deletions into a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 or in the the nucleic acid sequences derived from
  • Mutations can be in one of the sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 by standard techniques such as site-specific mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis.
  • conservative amino acid substitutions are made on one or more of the predicted non-essential amino acid residues.
  • the amino acid residue is exchanged for an amino acid residue with a similar side chain. Families of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (e.g.
  • lysine, arginine, histidine acidic side chains (e.g. aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (e.g. glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), non-polar side chains (e.g. Alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta-branched side chains (eg threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (eg tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine).
  • acidic side chains e.g. aspartic acid, glutamic acid
  • uncharged polar side chains e.g. glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine
  • non-polar side chains e.g. Alanine
  • a predicted non-essential amino acid residue in a protein sequence such as SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 26 is thus preferably replaced by another amino acid residue exchanged from the same side chain family.
  • the mutations can be introduced randomly over all or part of the coding sequence, for example by saturation mutagenesis, and the resulting mutants can be screened for their biological activity, that is to say the amino acid production, in order to identify mutants which have maintained or increased biological activity.
  • the encoded protein After mutagenesis of one of the sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 or the nucleic acid sequence which can be derived from the abovementioned sequences, the encoded protein can be expressed recombinantly and the activity of the protein can be determined, for example, using the tests described here.
  • Homologs of the nucleic acid sequences used with the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 or that of the sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 , SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 derived nucleic acid sequences mean, for example, allelic variants with at least about 30 to 50%, preferably at least about 50 to 70%, more preferably at least about 70 to 80%, 80 to 90% or 90 to 95% and even more preferably at least about 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more homology to one in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, S
  • Allelic variants include, in particular, functional variants which are characterized by deletion, insertion or substitution of nucleotides from / in the SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 or the derived nucleic acid sequences, but the intention is that the enzyme activity or the biological activity of the thereof originating synthesized proteins for the insertion of one or more genes is advantageously retained.
  • Proteins which still have the essential enzymatic activity of threonine aldolase, that is to say whose activity is essentially not reduced means proteins with at least 10%, preferably 20%, particularly preferably 30%, very particularly preferably 40% of the original biological or Enzyme activity, advantageously compared to that by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 26 encoded protein.
  • Homologues of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 or the derived sequences also mean, for example, bacterial, fungal and plant homologues, shortened sequences, single-stranded DNA or RNA of the coding and non-coding DNA sequence.
  • homologues of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 25 or the derived sequences are also to be understood as derivatives, such as promoter variants.
  • the promoters upstream of the specified nucleotide sequences can be modified by one or more nucleotide exchanges, by insertion (s) and / or deletion (s), without however impairing the functionality or activity of the promoters. It is also possible that the activity of the promoters is increased by modifying their sequence or that they are completely replaced by more active promoters, even from heterologous organisms.
  • nucleic acids and protein molecules with threonine aldolase activity and / or lysine decarboxylase activity, which are involved in the metabolism of amino acids, are used to increase the yield, production and / or efficiency in the production of a desired compound or a decrease in undesired compounds ,
  • Microorganisms are usually in a liquid medium, which contains a carbon source mostly in the form of sugars, a nitrogen source mostly in the form of organic nitrogen sources such as yeast extract or salts such as ammonium sulfate, trace elements such as iron, manganese, magnesium salts and, if appropriate, vitamins, at temperatures between 0 ° C and 100 ° C, preferably between 10 ° C to 60 ° C with oxygen.
  • the pH of the nutrient liquid can be kept at a fixed value, that is to say it can be regulated during cultivation or not.
  • the cultivation can take place batchwise, semi batchwise or continuously.
  • Nutrients can be introduced at the beginning of the fermentation or fed in semi-continuously or continuously.
  • the amino acids produced can be isolated from the organisms by methods known to those skilled in the art. For example via extraction, salt precipitation and / or ion exchange chromatography. The organisms can be unlocked beforehand.
  • the method according to the invention is advantageously at a temperature between 0 ° C. to 95 ° C., preferably between 10 ° C to 85 ° C, particularly preferably between 15 ° C to 75 ° C, very particularly preferably between 15 ° C to 45 ° C
  • the pH is advantageously kept between pH 4 and 12, preferably between pH 6 and 9, particularly preferably between pH 7 and 8.
  • the process according to the invention can be operated batchwise, semi-batchwise or continuously.
  • a summary of known cultivation methods can be found in the textbook by Chmiel (bioprocess technology 1st introduction to bioprocess engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (bioreactors and peripheral facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)) Find.
  • the culture medium to be used has to meet the requirements of the respective strains in a suitable manner. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the manual "Manual of Methods for General Bacteriology” of the American Society for Bacterology (Washington D.O., USA, 1981).
  • these media which can be used according to the invention usually comprise one or more carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and / or trace elements.
  • Preferred carbon sources are sugars, such as mono-, di- or polysaccharides.
  • sugars such as mono-, di- or polysaccharides.
  • very good carbon sources are glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, starch or cellulose.
  • Sugar can also be added to the media via complex compounds such as molasses or other by-products of sugar refining. It may also be advantageous to add mixtures of different carbon sources.
  • Other possible carbon sources are oils and fats such as e.g. B. soybean oil, sunflower oil, peanut oil and / or coconut fat, fatty acids such as. B.
  • palmitic acid palmitic acid, stearic acid and / or linoleic acid, alcohols and / or polyalcohols such as. B. glycerol, methanol and / or ethanol and / or organic acids such as. B. acetic acid and / or lactic acid.
  • Nitrogen sources are usually organic or inorganic nitrogen compounds or materials containing these compounds.
  • Exemplary nitrogen sources include liquid or gaseous ammonia or ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate or ammonium nitrate, nitrates, urea, amino acids or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, soy flour, soy protein, yeast extract, meat extract and others.
  • the nitrogen sources can be used individually or as a mixture.
  • Inorganic salt compounds that may be included in the media include the chloride, phosphorus or sulfate salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, potassium, manganese, zinc, copper and iron.
  • Inorganic sulfur-containing compounds such as, for example, sulfates, sulfites, dithionites, tetrathionates, thiosulfates, sulfides, but also organic sulfur compounds, such as mercaptans and thiols, can be used as the sulfur source for the production of sulfur-containing fine chemicals, in particular methionine.
  • Phosphoric acid potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the source of phosphorus.
  • Chelating agents can be added to the medium to keep the metal ions in solution.
  • Particularly suitable chelating agents include dihydroxyphenols, such as catechol or protocatechuate, or organic acids, such as citric acid.
  • the fermentation media used according to the invention for the cultivation of microorganisms usually also contain other growth factors, such as vitamins or growth promoters, which include, for example, biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, panthothenate and pyridoxine.
  • Growth factors and salts often come from complex media components such as yeast extract, molasses, corn steep liquor and the like. Suitable precursors can also be added to the culture medium.
  • the exact composition of the media connections strongly depends on the respective experiment and is decided individually for each specific case. Information about media optimization is available from the textbook "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach” (ed. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3).
  • Growth media can also be obtained from commercial suppliers, such as Standard 1 (Merck) or BHI (Brain heart infusion, DI FCO) and the like.
  • All media components are sterilized either by heat (20 min at 1.5 bar and 121 ° C) or by sterile filtration.
  • the components can be sterilized either together or, if necessary, separately. All media components can be present at the beginning of the cultivation or optionally added continuously or in batches.
  • the temperature of the culture is normally between 15 ° C and 45 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C and can be kept constant or changed during the experiment.
  • the pH of the medium should be in the range from 5 to 8.5, preferably around 7.0.
  • the pH for cultivation can be checked during the cultivation by adding basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid.
  • basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid.
  • B. fatty acid polyglycol esters can be used.
  • suitable selectively acting substances such as, for. B. antibiotics.
  • oxygen or oxygen-containing gas mixtures such as e.g. B. ambient air
  • the temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C and preferably 25 ° C to 40 ° C.
  • the culture is continued until a maximum of the desired product has formed. This goal is usually achieved within 10 hours to 160 hours.
  • the fermentation broths obtained in this way in particular L-methionine and / or L-lysine advantageously containing L-methionine, usually have a dry matter of 7.5 to 25% by weight.
  • the fermentation is carried out with limited sugar at least at the end, but in particular for at least 30% of the fermentation period. This means that the concentration of usable sugar in the fermentation medium is kept to> 0 to 3 g / l or reduced during this time.
  • the fermentation broth is then processed further.
  • the biomass can be wholly or partially separated by methods such as. B. centrifugation, filtration, decanting or a combination of these methods from the fermentation broth or completely left in it.
  • the fermentation broth can then be prepared using known methods, such as, for. B. with the help of a rotary evaporator, thin-film evaporator, falling film evaporator, by reverse osmosis, or by nanofiltration, thickened or concentrated on.
  • This concentrated fermentation broth can then be worked up by freeze drying, spray drying, spray granulation or by other processes.
  • the product-containing broth is subjected to chromatography with a suitable resin after the biomass has been separated off, the desired product or the impurities being wholly or partly retained on the chromatography resin.
  • chromatography steps can be repeated if necessary using the same or different chromatography resins.
  • the person skilled in the art is skilled in the selection of the suitable chromatography resins and their most effective application.
  • the purified product can be concentrated by filtration or ultrafiltration and kept at a temperature at which the stability of the product is maximum.
  • the identity and purity of the isolated compound (s) can be determined by prior art techniques. These include high performance liquid chromatography (HPLC), spectroscopic methods, mass spectrometry, staining methods, thin-layer ch. chromatography, NIRS, enzyme test or microbiological tests. These analysis methods are summarized in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; and Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp.
  • amino acids obtained in the process are suitable as a starting material for the synthesis of further valuable products.
  • they can be used in combination with one another or alone for the production of pharmaceuticals, foods, animal feed or cosmetics.
  • transformation The transfer of foreign genes into the genome of a plant is referred to as transformation, as described above.
  • the methods described for the transformation and regeneration of plants from plant tissues or plant cells for transient or stable transformation are used. Suitable methods are protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic method with the gene cannon - the so-called particle bombardment method, electroporation, the incubation of dry embryos in DNA-containing solution, microinjection and the gene transfer mediated by Agrobacterium.
  • the methods mentioned are described, for example, in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, published by S.D. Kung and R.
  • the construct to be expressed is preferably cloned into a vector which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens z ⁇ , for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711).
  • Agrobacteria transformed with such a vector can then be used in a known manner to transform plants, in particular crop plants, such as e.g. of tobacco plants can be used, for example by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • Marker genes are advantageously used for the selection of a successful introduction of the nucleic acids according to the invention into a host organism. These marker genes enable a successful introduction of the nucleic acids according to the invention to be identified a number of different principles, for example, via visual recognition with the help of fluorescence, luminescence or in the wavelength range of light visible to humans, via herbicide or antibiotic resistance, via so-called nutritive (auxotrophy markers) or anti-nutritive markers, via enzyme assays or via phytohormones.
  • GFP green fluorescent protein
  • Luciferin / Luceferacesystem the ⁇ -galactosidase with its colored substrates, for example X-Gal
  • the herbicide resistance to, for example, imidazolinone, glyphosate, phosphothricin or sulfonylurea
  • antibiotic resistance to eg bleomycin, hygromycin, streptomycin, kanamycin, tetracycline, chloramphenicol, ampicilline, gentamycin, geneticin (G418), spectinomycin or blasticidin to name just a few
  • nutritive markers such as mannose or xylose utilization or anti-nutritive markers such as 2-deoxyglucose resistance.
  • This list shows a small selection of possible markers. Such markers are well known to those skilled in the art. Different markers are preferred depending on the organism and selection method.
  • a gene encoding a selectable marker (e.g. resistance to antibiotics) is usually introduced into the host cells together with the gene of interest.
  • selectable markers in plants include those which confer resistance to a herbicide, such as glyphosphate or glufosinate.
  • Other suitable markers are, for example, markers which encode genes which are involved in biosynthetic pathways, for example of sugars or amino acids, such as ⁇ -galactodsidase, ura3 or ilv2.
  • markers which encode genes such as luciferase, gfp or other fluorescent genes are also suitable. These markers can be used in mutants in which these genes are not functional since they have been deleted, for example, using conventional methods.
  • markers which encode a nucleic acid which encodes a selectable marker can be introduced into a host cell on the same vector as that which codes for the threonine aldolases and / or lysine decarboxylases used in the method, or can be on a separate one Vector. Cells that have been stably transfected with the introduced nucleic acid can be identified, for example, by selection (e.g. cells that have integrated the selectable marker survive, whereas the other cells die).
  • the marker genes as a rule, especially the antibiotic and herbicide resistance genes in the transgenic host cell are no longer required or are undesirable after the nucleic acids have been successfully introduced, techniques are advantageously used in the method according to the invention for introducing the nucleic acids which remove or excise these marker genes allows.
  • One such method is the so-called co-transformation.
  • co- Transformation two vectors are used for the transformation at the same time, one vector carrying the nucleic acids according to the invention and a second carrying the marker gene or genes. In plants (up to 40% of transformants and more), a large proportion of the transformants contain or contain both vectors. The marker genes can then be removed from the transformed plant by crossing.
  • Another method uses marker genes, which have been integrated into a transposon, for transformation together with the desired nucleic acids (so-called Ac / Ds technology). In some cases (approx. 10%) the transposon jumps out of the genome of the host cell after successful transformation and is lost. In a further number of cases, the transposon jumps to another location. In these cases, the marker gene must be crossed out again. Techniques have been developed in microbiology that enable or facilitate the detection of such events. Another advantageous method uses so-called recombination systems, which have the advantage that an outcrossing can be dispensed with. The best known system of this type is the so-called Cre / Iox system.
  • Cre1 is a recombinase that removes the sequences that lie between the loxP sequence. If the marker gene is integrated between the loxP sequence, it is removed by expression of the recombinase after successful transformation. Further recombination systems are the HIN / HIX, the FLP / FRT and the REP / STB system (Tribble et al., J.Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al., J Cell Biol., 149, 2000: 553-566). A targeted integration of the nucleic acid sequences according to the invention into the plant genome is also possible in principle, but is less preferred due to the high workload. These methods can of course also be used for microorganisms such as yeast, fungi or bacteria.
  • Agrobacteria transformed with an expression vector according to the invention can also be used in a known manner to transform plants such as test plants such as Arabidopsis or crop plants such as, for example, cereals, maize, oats, rye, barley, wheat, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp , Potato, tobacco, tomato, carrot, paprika, rapeseed, tapioca, cassava, arrowroot, tagetes, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species, in particular of oil-containing crops, such as soybean, peanut, castor bean, sunflower , Corn, cotton, flax, rapeseed, coconut, oil palm, safflower (Carthamus tinetorius) or cocoa bean can be used, for example by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • test plants such as Arabidopsis or crop plants
  • crop plants such as, for example
  • the genetically modified plant cells can be regenerated using all methods known to the person skilled in the art. Appropriate methods can be found in the above-mentioned writings by S.D. Kung and R. Wu, Potrykus or Höfgen and Willmitzer can be found.
  • somatic cells which then have to be regenerated into plants
  • cells of plant meristems and in particular those cells which develop into gametes be transformed.
  • the transformed gametes lead to transgenic plants on the way of natural plant development.
  • Arabidopsis seeds are treated with Agrobacteria and seeds are obtained from the plants that develop from them, which are then transformed at a certain rate and are therefore transgenic (Feldman, KA and Marks MD (1987), ⁇ gro ⁇ acfer /.// 77- mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana: a non tissue culture approach.
  • Floral dip a simple method for Agrobacferium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. The Plant J. 16, 735-743). In both cases, a certain percentage of transgenic seeds are harvested, which can be distinguished from non-transgenic seeds by cultivation under the selective conditions already described.
  • Another aspect of the invention therefore relates to transgenic organisms, transformed with at least one nucleic acid sequence according to the invention, expression cassette or a vector according to the invention, as well as cells, cell cultures, tissues, parts - such as leaves, roots, etc. in plant organisms - or propagation material derived from such organisms .
  • the terms "host organism”"hostcell”,”recombinant (host) organism”, “recombinant (host) cell”, “transgenic (host) organism” and “transgenic (host) cell” are used interchangeably here. Of course, these terms refer not only to the specific host organism or the specific target cell, but also to the progeny or potential progeny of these organisms or cells.
  • SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 amino acid sequences mentioned.
  • SEQ ID NO: 1 was carried out according to known and well-established methods (see, for example, Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual”. Cold Spring Harbor Laboratory Press or Ausubel, FM et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons) into plasmids pBR322 (Sutcliffe, JG (1979) Proc. Natl Aead. Sci. USA, 75: 3737-3741); pACYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol. 134: 1141-1156); Plasmids of the pBS series (pBSSK +, pBSSK- and others; Stratagene, LaJolla, USA) or cosmids, such as SuperCosI
  • sequences SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID.NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID were analogous NO: 25 cloned.
  • DNA sequencing was carried out according to standard methods, in particular the chain termination method with ABI377 sequencing machines (see, for example, Fleischman, RD et al. (1995) "Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd., Science 269; 496-512)" ,
  • In vivo mutagenesis of Corynebacterium glutamicum can be performed by passing a plasmid (or other vector) DNA through E. coli or other microorganisms (e.g. Bacillus spp. Or yeasts such as Saccharomyces cerevisiae) that maintain the integrity of their genetic information cannot maintain.
  • E. coli or other microorganisms e.g. Bacillus spp. Or yeasts such as Saccharomyces cerevisiae
  • Common mutator strains have mutations in the genes for the DNA repair system [eg, mutHLS, mutD, mutT, etc., for comparison see Rupp, WD (1996) DNA repair mechanisms in Escherichia coli and Salmonella, p. 2277- 2294, ASM: Washington]. These strains are known to the person skilled in the art. The use of these strains is, for example, in Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7; 32-34 illustrates.
  • Example 4 DNA transfer between Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum
  • Corynebacterium and Brevibacterium species contain endogenous plasmids (such as pHM1519 or pBL1) that replicate autonomously (for an overview see, for example, Martin, J.F. et al. (1987) Biotechnology 5: 137-146).
  • Shuttle vectors for Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum can easily be constructed using standard vectors for E. coli (Sambrook, J. et al., (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press or Ausubel , FM et al.
  • origins of replication are preferably taken from endogenous plasmids which have been isolated from Corynebacterium and Brevibactertium species.
  • transformation markers for these species are genes for kanamycin resistance (such as those derived from the Tn5 or Tn-903 transposon) or for chloramphenicol (Winnacker, EL (1987) "From Genes to Clones - Introduction to Gene Technology, VCH, Weinheim)
  • kanamycin resistance such as those derived from the Tn5 or Tn-903 transposon
  • chloramphenicol Winnacker, EL (1987) "From Genes to Clones - Introduction to Gene Technology, VCH, Weinheim
  • glutamicum and which can be used for various purposes, including gene overexpression (see, for example, Yoshihama, M. et al. (1985) J. Bacteriol. 162: 591-597, Martin, JF et al., (1987) Biotechnology, 5: 137-146 and Eikmanns, BJ et al. ( 1992) Gene 102: 93-98)
  • Suitable vectors that replicate in coryne-shaped bacteria are, for example, pZ1 (Menkel et al., Appl. Environ.
  • C. glutamicum can be carried out by protoplast transformation (Kastsumata, R. et al., (1984) J. Bacteriol. 159, 306-311), electroporation (Liebl, E. et al., (1989) FEMS Microbiol. Letters, 53: 399-303) and, in cases where special vectors are used, also by conjugation (as described, for example, in Schfer, A., et (1990) J. Bacteriol.
  • the transformed sequence (s) should advantageously be integrated into the genome of the coryne-shaped bacteria
  • standard techniques are also known to the person skilled in the art.
  • plasmid vectors such as those used by Remscheid et al. (Appl. Environ. Microbiol., 60, 1994: 126-132) for the duplication or amplification of the hom-thrB operon.
  • the complete gene is cloned into a plasmid vector which can replicate in a host such as E. coli but not in C. glutamicum.
  • vectors examples include pSUP301 (Simon et al., Bio / Technology 1, 1983: 784-791), pKIBmob or pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 1994: 69-73), pGEM-T (Promega Corp., Madison, Wl, USA), pCR2.1-TOPO (Schuman, J. Biol. Chem., 269, 1994: 32678-32684, US 5,487,993), pCR ® Blunt (Invitrogen, Groningen, Niderlander) or pEMI (Schrumpf et al ., J. Bacteriol., 173, 1991: 4510-4516) in question.
  • Example 5 Determination of expression of the mutant / transgenic protein
  • the observations of the activity of a mutant or transgenic protein in a transformed host cell are based on the fact that the protein is expressed in a similar manner and in a similar amount to the wild-type protein.
  • a suitable method for determining the amount of transcription of the mutant or transgenic gene is to carry out a Nortern blot (see, for example, Ausubel et al., (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York), wherein a primer that is designed to bind to the gene of interest is provided with a detectable (usually radioactive or chemiluminescent) label so that - if the total RNA of a culture of the organism is extracted, separated on a gel, transferred to a stable matrix and incubated with this probe - the binding and the quantity of binding of the probe indicate the presence and also the amount of mRNA for this gene.
  • Total cell RNA can be isolated from Corynebacterium glutamicum by various methods known in the art, as described in Bormann, E.R. et al., (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.
  • Example 6 Growth of genetically modified Corynebacterium glutamicum media and growing conditions
  • Corynebacteria are grown in synthetic or natural growth media.
  • a number of different growth media for corynebacteria are known and readily available (Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters 11: 11-16; Patent DE 4,120,867; Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium", in: The Procaryotes, Vol. II, Balows, A., et al., Ed. Springer-Verlag).
  • These media consist of one or more carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and trace elements.
  • Preferred carbon sources are sugars, such as mono-, di- or polysaccharides.
  • Very good carbon sources are, for example, glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, starch or cellulose.
  • Sugar can also be added to the media via complex compounds such as molasses or other by-products from sugar refining. It may also be advantageous to add mixtures of different carbon sources.
  • Other possible carbon sources are alcohols and / or organic acids such as methanol, ethanol, acetic acid or lactic acid.
  • Nitrogen sources are usually organic or inorganic nitrogen compounds or materials containing these compounds.
  • Exemplary nitrogen sources include ammonia gas, aqueous ammonia solutions or ammonium salts such as NH CI or (NH 4 ) 2 SO 4 , NH 4 OH, nitrates, urea, amino acids or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, soy flour, soy protein, yeast extracts, meat extracts and others. Mixtures of the aforementioned nitrogen sources can also be used advantageously.
  • Inorganic salt compounds that may be included in the media include the chloride, phosphorus, or sulfate salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, potassium, manganese, zinc, copper and iron.
  • Chelating agents can be added to the medium to keep the metal ions in solution.
  • Particularly suitable chelating agents include dihydroxyphenols, such as catechol or protocatechuate, or organic acids, such as citric acid.
  • the media usually also contain other growth factors, such as vitamins or growth promoters, which include, for example, biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, panthothenate and pyridoxine.
  • Growth factors and salts often come from complex media components such as yeast extract, molasses, corn steep liquor and the like.
  • the exact composition of the media connections depends heavily on the respective experiment and is decided individually for each case. Information about media optimization is available, for example, from the textbook "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach” (Ed. PM Rhodes, PF Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3).
  • Growth media can also be obtained from commercial suppliers, such as Standard 1 (Merck) or BHI (Brain heart infusion, DIFCO) and the like.
  • All media components are sterilized, either by heat (20 min at 1.5 bar and 121 ° C) or by sterile filtration.
  • the components can be sterilized either together or, if necessary, separately. All media components can be present at the beginning of the cultivation or optionally added continuously or in batches.
  • the growing conditions are defined separately for each experiment.
  • the temperature should be between 15 ° C and 45 ° C and can be kept constant or changed during the experiment.
  • the pH of the medium should be in the range of 5 to 8.5, preferably around 7.0, and can be maintained by adding buffers to the media.
  • An exemplary buffer for this purpose is a potassium phosphate buffer.
  • Synthetic buffers such as MOPS, HEPES; ACES etc. can be used alternatively or simultaneously.
  • the cultivation pH value can also be kept constant during the cultivation by adding, for example, NaOH or NH 4 OH. If complex media components such as yeast extract are used, the need for additional buffers is reduced since many complex compounds have a high buffer capacity.
  • the pH value can also be regulated with gaseous ammonia.
  • the incubation period is usually in the range of several hours to several days. This time is selected so that the maximum amount of product accumulates in the fermentation broth.
  • the growth experiments disclosed can be carried out in a variety of containers such as microtiter plates, glass tubes, glass flasks or glass or metal fermenters of different sizes.
  • the microorganisms should be grown in microtiter plates, glass tubes or shake flasks either with or without baffles.
  • 100 ml shake flasks are used which are filled with 10% (by volume) of the required growth medium.
  • the flasks should be shaken on a rotary shaker (amplitude 25 mm) at a speed in the range of 100-300 rpm. Evaporation losses can be reduced by maintaining a humid atmosphere; alternatively, a mathematical correction should be carried out for the evaporation losses.
  • control clone If genetically modified clones are examined, an unmodified control clone or a control clone which contains the base plasmid without insertion should also be tested. If a transgenic sequence is to be expressed, a control clone should advantageously also be tested in this case too.
  • the medium is advantageously inoculated to an OD600 of 0.5-1.5, using cells that have been grown on agar plates, such as CM plates (10 g / l glucose, 2.5 g / l NaCl, 2 g / l urea, 10 g / l polypeptone, 5 g / l yeast extract, 5 g / l meat extract, 22 g / l agar pH 6.8 with 2 M NaOH) which have been incubated at 30 ° C.
  • the inoculation of the media is carried out either by introducing a saline solution of C. glutamicum cells from CM plates or by adding a liquid preculture of this bacterium.
  • Example 7 In vitro analysis of the function of the proteins encoded by the transformed sequences
  • the effect of the genetic modification in C. glutamicum on the production of an amino acid can be determined by growing the modified microorganisms under suitable conditions (such as those described above) and the medium and / or the cellular components on the increased production of the Amino acid is examined.
  • suitable conditions such as those described above
  • Such analysis techniques are well known to those skilled in the art and include spectroscopy, mass spectrometry, thin-layer chromatography, staining methods of various types, enzymatic and microbiological methods and analytical chromatography, such as high-performance liquid chromatography (see, for example, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, p. 89-90 and pp.
  • the analytical methods include measurements of the amount of nutrients in the medium (e.g. sugar, hydrocarbons, nitrogen sources, phosphate and other ions), measurements of the biomass composition and growth, analysis of the production of common metabolites from biosynthetic pathways and measurements of gases that are produced during fermentation , Standard methods for these measurements are in Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes and P.F. Stanbury, ed. IRL Press, pp. 103-129; 131-163 and 165-192 (ISBN: 0199635773) and the literature references specified therein.
  • nutrients in the medium e.g. sugar, hydrocarbons, nitrogen sources, phosphate and other ions
  • the amino acid can be obtained from C. glutamicum cells and / or from the supernatant of the culture described above by various methods known in the art.
  • the culture supernatant is first obtained, for this purpose the cells are harvested from the culture by slow centrifugation, the cells can then be broken up or lysed using standard techniques, such as mechanical force or ultrasound. The cell debris is removed by centrifugation and the supernatant fraction is taken along with the culture supernatant for further purification of the amino acid.
  • the supernatant can also be worked up alone if the concentration of the amino acid is sufficiently contained in the supernatant.
  • the amino acid or the amino acid mixture can then be further purified by, for example, extraction and / or salt precipitation or by ion exchange chromatography.
  • Chromatography steps can be repeated if necessary using the same or different chromatography resins.
  • the person skilled in the art is skilled in the selection of the suitable chromatography resins and the most effective application for a particular molecule to be purified.
  • the purified product can be concentrated by filtration or ultrafiltration and kept at a temperature at which the stability of the product is maximum.
  • Many cleaning methods are known in the art that are not limited to the previous cleaning method. These are described, for example, in Bailey, JE & Ollis, DF Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986).
  • the identity and purity of the isolated amino acid can be determined by standard techniques in the art. These include high-performance liquid chromatography (HPLC), spectroscopic methods, staining methods, thin-layer chromatography, NIRS, enzyme tests or microbiological tests. These analysis methods are summarized in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11: 27-32; and Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp.
  • the PCR amplification of SEQ ID: No1 was carried out in accordance with the Pfu Turbo DNA polymerase protocol (Stratagene).
  • the composition was as follows: 1x PCR buffer [20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 2 mM MgSO 4 , 10 mM KCI, 10 mM (NH 4 ) SO 4 , 0.1% Triton X-100, 0 , 1 mg / ml BSA], 0.2 mM d-thio-dNTP and dNTP (1: 125), 100 ng genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae (strain S288C; Research Genetics, Inc., now Invitrogen), 50 pmol forward primer, 50 pmol reverse primer, 2.5 u Pfu Turbo DNA polymerase.
  • the amplification cycles were as follows:
  • the first 19 nucleotides of the forward pimer specified above contain interfaces for the cloning of the genes as a universal part of the primer.
  • the following part of the primer in the given case 25 nucleotides, are specific for the gene to be cloned.
  • the universal part of the reverse primer again contains cloning sites at the 5 'end (20 nucleotides).
  • the specific part here 26 nucleotides, is again specific for the gene to be cloned.
  • the universal part of the forward pimer contains an EcoRI interface, while the universal part of the reverse primer contains an Smal interface. Both interfaces were used to clone the nucleic acid sequences. The restriction was carried out as described below. The amplificate was then purified using QIAquick columns according to the standard protocol (Qiagen).
  • the restriction of the vector DNA (30 ng) was cut with EcoR ⁇ and Smal according to the standard protocol, the EcoRI site was filled up according to the standard protocol (MBI-Fermentas) and stopped by adding high salt buffer.
  • the cut vector fragments were purified using nucleobond columns according to the standard protocol (Machery-Nagel).
  • a binary vector was used which contained a selection cassette (promoter, selection marker, terminator) and an expression cassette with promoter, cloning cassette and terminator sequence between the T-DNA border sequences. Except in the cloning cassette, the binary vector has no EcoRI and Smal interfaces.
  • the ligated vectors were transformed in the same reaction vessel by adding competent E. co // cells (strain DH ⁇ alpha) and incubating for 20 'at 1 ° C, followed by a heat shock for 90 "at 42 ° C and cooling to 4 ° C. Full medium (SOC) was then added and incubation was carried out for 45 'at 37 ° C. The entire batch was then plated out on an agar plate with antibiotics (selected, depending on the binary vector used) and overnight at 37 ° C incubated. Successful cloning was checked by amplification using primers that bind upstream and downstream of the restriction site and thus allow the insertion to be amplified.
  • the amplification was carried out in accordance with the protocol of Taq DNA polymerase (Gibco-BRL).
  • the composition was as follows: 1x PCR buffer [20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 1.5 mM MgCl 2 , 50 mM KCl, 0.2 mM dNTP, 5 pmol forward primer, 5 pmol reverse Primer, 0.625 u Taq DNA polymerase.
  • the amplification cycles were as follows: 1 cycle for 5 'at 94 ° C, followed by 35 cycles each with 15 "94 ° C, 15" 66 ° C and 5' 72 ° C, followed by 1 cycle for 10 'at 72 ° C, then 4 ° C.
  • the plasmid preparation was carried out in accordance with the specifications of the Qiaprep standard protocol (Qiagens).
  • Example 11 Production of transgenic plants that express SEQ ID: NO 1
  • the entire batch was then applied to YEP agar plates with the respective antibiotics, for example rifampicin and gentamycin for GV3101 pMP90, and another antibiotic for selection were plated onto the binary vector and incubated at 28 ° C. for 48 h.
  • the respective antibiotics for example rifampicin and gentamycin for GV3101 pMP90, and another antibiotic for selection were plated onto the binary vector and incubated at 28 ° C. for 48 h.
  • the agrobacteria with the plasmid construct generated according to Example 10 were then used for the plant transformation.
  • a colony was picked from the agar plate with the aid of a pipette tip and liquid was taken up in 3 ml of TB medium, which also contained appropriate antibiotics, depending on the agrobacterial strain and binary plasmid.
  • the preculture grew for 48 hours at 28 ° C and 120 rpm.
  • the dishes were covered with a hood and placed in the stratification (8 h, 110 ⁇ mol / m 2 / s ' 1 , 22 ° C; 16 h, dark, 6 ° C). After 5 days, the dishes were placed in the short-day phytotron (8h 130 ⁇ mol / m 2 / s "1 , 22 ° C; 16 h, dark 20 ° C). They remained there for about 10 days until the first leaves were formed ,
  • the seedlings were transferred to pots containing the same substrate (Teku pots, 7 or 10 cm, LC series, manufacturer Pöppelmann GmbH & Co, Germany). Five or nine plants were pricked into a pot. The pots were then placed in the short-day phytotron for further growth.
  • the plants After 10 days, the plants then came into the greenhouse cabin (additional lighting, 16 h, 340 ⁇ E, 22 ° C; 8 h, dark, 20 ° C). Here they continued to grow for 17 days.
  • the plants were then placed in a moist chamber for 18 hours. The pots were then placed back in the greenhouse for further growth. The plants stayed here for another 10 weeks until the seeds could be harvested. Depending on the resistance marker used for the selection of the transformed plants, the harvested seeds were applied in the greenhouse and subjected to spray selection or, after sterilization on agar plates, were attracted with the respective selection agent. After about 10-14 days, the transformed resistant plants differed clearly from the dead wild-type seedlings and could be pricked into 6 cm pots. The seeds of the transgenic A. thaliana plants were stored in the freezer (at -20 ° C).
  • the transgenic plants were cultivated uniformly in a special cultivation.
  • the GS-90 substrate was placed in the pot machine (Laible System GmbH, Singen, Germany) as a soil mixture and filled into the pots. Then 35 pots were put together in a bowl and treated with Previcur. For the treatment, 25 ml Previcur was taken up in 10 l tap water. This amount was enough to treat about 200 pots. The pots were placed in the Previcur solution and additionally watered from the top with tap water without Previcur. Sowing took place on the same day or within three days. ,
  • the seeds stored in the refrigerator were removed from the Eppendorf tubes using a toothpick and transferred to the pots with the soil. A total of about 5-12 seeds were distributed in the center of the pot.
  • the pots were covered with a suitable plastic hood and placed in the stratification chamber for 4 days in the dark and at 4 ° C.
  • the humidity was about 80-90%.
  • the test plants were cultivated for 22-23 days in a 16 h light and 8 h dark rhythm at 20 ° C., an atmospheric humidity of 60% and a CO 2 concentration of 400 ppm.
  • Powerstar HQI-T 250 W / D daylight lamps from Osram were used as the light source, producing light similar to the sun color spectrum with a light intensity of approx. 220 ⁇ E / m 2 / s "1 .
  • the plants were subjected to selection for the resistance marker.
  • the transgenic, resistant seedlings small plants in the four-leaf stage
  • the non-transgenic seedlings were bleached out or dead.
  • the transgenic resistant plants were isolated at the age of 14 days. The most optimal in the middle plants grown in the pot were considered the target plant. With the help of metal tweezers, all other plants were carefully removed and discarded.
  • the plants were poured into the gutters with distilled water from above (to the earth) and from below. The grown plants were then harvested at the age of 23 days.
  • the aluminum rack with the plant samples in the extraction tubes was placed in the pre-cooled (-40 ° C) freeze dryer.
  • the initial temperature during the main drying was -35 ° C, the pressure was 0.120 mbar.
  • the parameters were changed according to a pressure and temperature program.
  • the final temperature after 12 hours was +30 ° C and the final pressure was 0.001 to 0.004 mbar.
  • the system was vented with air (dried through a drying tube) or argon.
  • the extraction tubes with the freeze-dried plant material were inserted into the 5 mL extraction cartridges of an ASE- immediately after the freeze dryer was vented. Transferred (Accelerated Solvent Extractor ASE 200 with Solvent Controller and AutoASE software (DIONEX)).
  • the 24 sample positions of the ASE device were filled with plant samples.
  • the solution was mixed with internal standards: ribitol, L-glycine-2,2-d 2 , L-alanine-2,3,3,3-d, methionine-methyl-d 3 and ⁇ -methylglucopyranoside and nonadecanoic acid methyl ester, Undecanoic acid methyl ester, tridecanoic acid methyl ester, pentadecanoic acid methyl ester, nonacosanoic acid methyl ester.
  • the entire extract was mixed with 8 mL water.
  • the solid residue of the plant sample and the extraction thimble were discarded.
  • the extract was shaken and then centrifuged at at least 1400 g for 5 to 10 minutes to accelerate the phase separation.
  • 1 mL of the supernatant methanol / water phase ("polar phase", colorless) was taken off for the further GC analysis, 1 mL was taken out for the LC analysis. The rest of the methanol / water phase was discarded.
  • 0.5 mL of the organic phase (“lipid phase”, dark green) was removed for further GC analysis,
  • the lipid extract evaporated to dry was taken up in mobile phase.
  • the HPLC run was carried out with gradient elution.
  • the carbonyl groups were methoximized by reaction with methoxyamine
  • Hydrochloride (5 mg / mL in pyridine, 100 ⁇ L for 1.5 h at 60 ° C in a tightly closed vessel. 20 ⁇ L of a solution of odd-numbered, straight-chain fatty acids (0.3 mg / mL each of fatty acids with 7 to 25 carbon atoms and 0.6 mg / mL each of the fatty acids with 27, 29 and 31 carbon atoms dissolved in a mixture of 30% pyridine in toluene (v / v) were added as time standards, and finally with 100 ⁇ L of N-methyl-N- (trimethylsilyl ) -2,2,2-trifluoroacetamide (MSTFA) derivatized for 30 min in a tightly closed vessel at 60 ° C. The final volume before the GC injection was 220 ⁇ L.
  • MSTFA N-methyl-N- (trimethylsilyl ) -2,2,2-trifluoroacetamide
  • the carbonyl groups were methoximized by reaction with methoxyamine hydrochloride (5 mg / mL in pyridine, 50 ⁇ L for 1.5 h at 60 ° C in a tightly closed vessel.
  • 10 ⁇ L of a solution of odd-numbered, straight-chain fatty acids 0.3 mg each / mL of fatty acids with 7 to 25 carbon atoms and 0.6 mg / mL each of the fatty acids with 27, 29 and 31 carbon atoms dissolved in a mixture of 30% pyridine in toluene (v / v) were added as time standards N-Methyl-N- (trimethylsilyl) -2,2,2-trifluoroacetamide (MSTFA) derivatized for 30 min in a resealed vessel at 60 ° C.
  • the final volume before the GC injection was 110 ⁇ L.
  • the samples were measured in individual series of 20 plant samples (so-called sequences), each sequence containing at least 5 wild-type plants as controls.
  • the peak area or the peak height of each analyte was divided by the peak area of the respective internal standard.
  • the data were standardized to the fresh weight weighed for the plant.
  • the values thus calculated were related to the wild type control group by dividing by the mean of the corresponding data of the wild type control group of the same sequence.
  • the values obtained were designated x times, are comparable across sequences and indicate how many times the analyte concentration in the mutant differs relative to the wild-type control.
  • amino acids can advantageously be separated by HPLC in ethanolic extracts according to Geigenberger et al. (Plant Cell & Environ, 19, 1996: 43-55).
  • the results of the various analyzes of the plants can be found in the following table:
  • Column 1 of the table shows the sample number.
  • Column 2 shows the analyzed amino acid.
  • Column 3 shows the ratio of the analyzed amino acid between the trange plant and the wild type.
  • Column 4 shows the ratio of the transgenic plant to the median of other transgenic plants which were not transformed with the threonine aldolase gene.
  • Column 5 shows the analysis method.
  • Column 1 of the table shows the analyte number.
  • Column 2 shows the analyzed amino acid.
  • Column 3 shows the ratio of the analyzed amino acid between the transgenic Plant and the wild type (x-fold according to the Ratio_by_WT method).
  • Column 4 shows the analysis method.

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Abstract

Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst: a) Einbringen einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Threonin-abbauendes Protein oder Lysin-abbauendes Protein codiert oder für ein Threonin-abbauendes Protein und Lysin-abbauendes Protein codiert, oder b) Einbringen einer Nukleinsäuresequenz, die den Threoninabbau oder Lysinabbau oder den Threoninabbau und Lysinabbau in den transgenen Organismen erhöht und c) Expression einer unter (a) oder (b) genannten Nukleinsäuresequenz im transgenen Organismus.Vorteilhaft wird in Verfahrensschritt (a) eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe i) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 und/oder SEQ ID NO: 25 dargestellten Sequenz; ii) einer Nukleinsäuresequenz, die aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 und/oder SEQ ID NO: 26 dargestellten Aminosäuresequenz erhalten wird und iii) eines Derivats der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 und/oder SEQ ID NO: 25 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 und/oder SEQ ID NO: 26 dargestellten Aminosäuresequenz codiert und mindestens 50 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne dass die biologische Aktivität der Polypeptide wesentlich reduziert ist; eingebracht.

Description

Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen.
Weiterhin betrifft die Erfindung Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und transgene Organismen sowie deren Verwendung.
Aminosäuren bilden die grundlegende Struktureinheit sämtlicher Proteine und sind somit für die normale Zellfunktionen essentiell. Der Begriff "Aminosäure" ist im Fachgebiet bekannt. Die proteinogenen Aminosäuren, von denen es 20 Arten gibt, dienen als Struktureinheiten für Proteine, in denen sie über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind, wohingegen die nicht- proteinogenen Aminosäuren (von denen Hunderte bekannt sind) gewöhnlich nicht in Proteinen vorkommen [siehe Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97 VCH: Weinheim (1985)]. Die Aminosäuren können in der D- oder L-Konfiguration vorliegen, obwohl L- Aminosäuren gewöhnlich der einzige Typ sind, den man in natürlich vorkommenden Proteinen vorfindet. Biosynthese- und Abbauwege von jeder der 20 proteinogenen Aminosäuren sind sowohl bei prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen gut charakterisiert (siehe bspw. Stryer, L. Biochemistry, 3. Auflage, S. 578-590 (1988)). Die "essentiellen" Aminosäuren (Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan und Valin), so bezeichnet, da sie aufgrund der Komplexität ihrer Biosynthese mit der Ernährung aufgenommen werden müssen, werden durch einfache Biosynthesewege in die übrigen 11 "nichtessentiellen" Aminosäuren (Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure, Glutamin, Glycin, Prolin, Serin und Tyrosin) umgewandelt. Höhere Tiere besitzen die Fähigkeit, einige dieser Aminosäuren zu synthetisieren, jedoch müssen die essentiellen Aminosäuren mit der Nahrung aufgenommen werden, damit eine normale Proteinsynthese stattfindet.
Aminosäuren werden in vielen Industriezweigen verwendet, einschließlich der Nahrungsmittel-, Futtermittel-, Kosmetik-, pharmazeutischen und chemischen Industrie. So wird L-Glutaminsäure beispielsweise in Infusionslösungen verwendet. Aminosäuren wie D;L-Methionin, L-Lysin oder L- Threonin werden in der Futtermittelindustrie verwendet. Von besonderer Wichtigkeit für die Ernährung von Menschen und vielen Nutztieren sind die essentiellen Aminosäuren Valin, Leucin, Isoleucin, Lysin, Threonin, Methionin, Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan. So ist Lysin beispielweise nicht nur für die Ernährung des Menschen eine wichtige Aminosäure, sondern auch für monogastrische Tiere, wie Geflügel und Schweine. In Pflanzen, wie Mais oder Weizen, ist L-Lysin die limitierende Aminosäure, das heißt um eine optimale Ausnutzung derartiger Pflanzennahrung zu ermöglichen, ist es sinnvoll die Nahrung oder das Futtermittel mit L-Lysin zu supplementieren. Glutamat wird am häufigsten als Geschmacksadditiv (Mononatriumglutamat,
Seq MSG) sowie weithin in der Nahrungsmittelindustrie verwendet, wie auch Aspartat, Phenylalanin, Glycin und Cystein. Glycin, L-Methionin und Tryptophan werden sämtlich in der pharmazeutischen Industrie verwendet. Glutamin, Valin, Leucin, Isoleucin, Histidin, Arginin, Prolin, Serin und Alanin werden in der pharmazeutischen Industrie und der Kosmetikindustrie verwendet. Threo- nin, Tryptophan und D-/L-Methionin sind weitverbreitete Futtermittelzusätze [Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, S. 466-502 in Rehm et al., (Hrsg.) Biotechnology Bd. 6, Kapitel 14a, VCH: Weinheim]. Außerdem eignen sich Aminosäuren für die chemischen Industrie als Vorstufen für die Synthese von synthetischen Aminosäuren und Proteinen, wie N-Acetylcystein, S-Carboxymethyl-L-cystein, (S)-5-Hydroxytryptophan und anderen, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97, VCH, Weinheim, 1985 beschriebenen Substanzen eignen.
Die Jahresproduktion von Aminosäuren beläuft sich derzeit auf über 1 Mio. t/a mit einem Marktwert von über 2 Mrd. US-$. Ihre Produktion erfolgt heutzutage durch vier konkurrierende Verfahren:
1. Extraktion aus Proteinhydrolysaten beispielsweise von L-Cystin, L-Leucin oder L-Tyrosin,
2. chemische Synthese beispielsweise von D, L-Methionin,
3. Umwandlung chemischer Vorstufen im Enzym- oder Zellreaktor beispielsweise L- Phenylalanin und
)
4. fermentative Herstellung mittels Anzucht von Bakterien im Großmaßstab, die entwickelt wurden, um große Mengen des jeweils gewünschten Moleküls zu produzieren und sezer- nieren. Ein für diesen Zweck besonders geeigneter Organismus ist Corynebacterium glu- tamicum, der beispielsweise für die Herstellung von L-Lysin oder L-Glutaminsäure verwendet wird. Weitere fermentativ hergestellte Aminosäuren sind beispielsweise L- Threonin, L-Tryptophari, L-Asparaginsäure und L-Phenylalanin.
Die Biosynthese der natürlichen Aminosäuren in Organismen, die sie produzieren können, bspw. Bakterien, ist gut charakterisiert worden [für einen Überblick der bakteriellen Aminosäure- Biosynthese und ihrer Regulation, s. Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533 - 606]. Glutaminsäure wird durch reduktive Aminierung von α-Ketoglutarat, einem Zwischenprodukt im Citronensäure-Zyklus, synthetisiert. Glutamin, Prolin und Arginin werden jeweils nacheinander aus Glutamat erzeugt. Die Biosynthese von Serin erfolgt in einem Dreischritt-Verfahren und beginnt mit 3-Phosphoglycerat (einem Zwischenprodukt bei der Glykolyse), und ergibt nach Oxidations-, Transaminierungs- und Hydrolyseschritten diese Aminosäure. Cystein und Glycin werden jeweils aus Serin produziert, und zwar die erstere durch Kondensation von Homocystein mit Serin, und die letztere durch Übertragung des Seitenketten-ß-Kohlenstoffatoms auf Tetra- hydrofolat, in einer durch Serintranshydroxymethylase katalysierten Reaktion. Phenylalanin und Tyrosin werden aus den Vorstufen des Glycolyse- und Pentosephosphatweges, Erythrose-4- phosphat und Phosphoenolpyruvat in einem 9-Schritt-Biosyntheseweg synthetisiert, der sich nur in den letzten beiden Schritten nach der Synthese von Prephenat unterscheidet. Tryptophan wird ebenfalls aus diesen beiden Ausgangsmolekülen produziert, jedoch erfolgt dessen Synthese in einem 11 -Schritt-Weg. Tyrosin lässt sich in einer durch Phenylalaninhydroxylase katalysierten Reaktion auch aus Phenylalanin herstellen. Alanin, Valin und Leucin sind jeweils Biosyntheseprodukte aus Pyruvat, dem Endprodukt der Glykolyse. Asparaginsäure wird aus Oxalacetat, einem Zwischenprodukt des Citronensäure-Zykius, gebildet. Asparagin, Methionin, Threonin und Lysin werden jeweils durch Umwandlung von Asparaginsäure produziert. Isoleucin wird aus Threonin gebildet. In einem komplexen 9-Schritt-Weg erfolgt die Bildung von Histidin aus 5- Phosphoribosyl-1-pyrophosphat, einem aktivierten Zucker.
Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium giutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der bestehenden Herstellverfahren gearbeitet Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zum Produkt, beispielsweise durch lonenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen. Auch Bakterien anderer Gattungen wie Escherichia of Bacillus werden für die Herstellung von Aminosäuren verwendet.
Über Stammselektion sind eine Reihe von Mutantenstämmen entwickelt worden, die ein Sortiment wünschenswerter Verbindungen aus der Reihe der schwefelhaltigen Feinchemikalien produzieren. Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen hinsichtlich der Produktion eines bestimmten Moleküls werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Dies ist jedoch ein zeitaufwendiges und schwieriges Verfahren. EP-A-0 066 129 beschreibt beispielhaft ein Verfahren zur Herstellung von Threonin mit Coryne- bakterien. Entsprechende Verfahren wurden auch zur Herstellung von Methionin bearbeitet. Auf diese Weise erhält man z.B. Stämme, die resistent gegen Antimetabolite, wie z. B. die Methio- nin-Analoga α-Methyl-Methionin, Ethionin, Norleucin, N-Acetylnorleucin, S-Trifluoromethyl- homocystein, 2-Amino-5-heprenoitsäure, Seleno-Methionin, Methioninsulfoximin, Methoxin, 1- Aminocyclopentan-Carboxylsäure oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und schwefelhaltige Feinchemikalien, wie z. B. L-Methionin, produzieren. Derartige zur Herstellung von Methionin entwickelte Verfahren haben den Nachteil, dass sie für eine wirtschaftliche Nutzung zu geringe Ausbeuten aufweisen und deshalb gegenüber der chemischen Synthese nicht konkurrenzfähig sind. Von Zeh et al.(Plant Physiol., Vol. 127, 2001: 792-802) wird eine Erhöhung des Methioningehalts in Kartoffelpflanzen durch die Hemmung der Threoninsynthase über die sogenannte Antisense- Technoiogie beschrieben. Dies führt zu einer verringerten Aktivität der Threoninsynthase, ohne dass der Threoningehalt in den Pflanzen reduziert wird. Von Nachteil ist, dass diese Technolo- gie sehr komplex ist und in einem technischen Maßstab nicht oder nur sehr schlecht verwendet werden kann. Außerdem muss die Hemmung des Enzymaktivität sehr differenziert erfolgen, da sonst eine Auxotrophie für die Aminosäure auftritt und die Pflanze nicht mehr wächst.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L-Aminosäure produzierender Stämme von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure-Produktion untersucht.
Aminosäuren, deren Menge den Proteinbiosynthesebedarf der Zelle übersteigt, können nicht gespeichert werden, und werden stattdessen abgebaut, so dass Zwischenprodukte für die Haupt-Stoffwechselwege der Zelle bereitgestellt werden [für einen Überblick siehe Stryer, L, Biochemistry, 3. Aufl. Kap. 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle"; S 495-516 (1988)]. Die Zelle ist zwar in der Lage, unerwünschte Aminosäuren in nützliche Stoffwechsel- Zwischenprodukte umzuwandeln, jedoch ist die Aminosäureproduktion hinsichtlich der Energie, der Vorstufenmoleküle und der für ihre Synthese nötigen Enzyme aufwendig. Es überrascht daher nicht, dass die Aminosäure-Biosynthese durch Feedback-Hemmung reguliert wird, wobei das Vorliegen einer bestimmten Aminosäure ihre eigene Produktion verlangsamt oder ganz beendet [für einen Überblick über den Rückkopplungs-Mechanismus bei Aminosäure- Biosynthesewegen, siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl., Kap. 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", S. 575-600 (1988)]. Der Ausstoß einer bestimmten Aminosäure wird daher durch die Menge dieser Aminosäure in der Zelle eingeschränkt.
Verbesserungen der fermentativen Herstellung von Feinchemikalien korrelieren in der Regel mit Verbesserungen von Stoffflüssen und Ausbeuten. Wichtig dabei ist es, Zwischen- oder Endprodukthemmungen wichtiger Syntheseenzyme zu verhindern oder zu verringern. Ebenso ist es von Vorteil, Abflüsse des Kohlenstoffflusses in ungewünschte Produkte oder Seitenprodukte zu verhindern oder zu verringern.
Die essentiellen Aminosäuren sind wie oben beschrieben für den Menschen und viele Säugetiere beispielsweise für Nutztiere notwendig. L-Methionin ist dabei wichtig als Methylgruppen- Lieferant für die Biosynthese z.B. von Cholin, Creatin, Adrenalin, Basen u. RNS u. DNS, Histidin sowie für die Transmethylierung nach Bildung von S-Adenosylmethionin oder als Sulf- hydrylgruppen-Lieferant für die Cysten-Bildung.
L-Methionin scheint außerdem einen positiven Einfluss bei Depressionen zu haben Die Verbesserung der Qualität von Nahrungs- und Futtermitteln ist daher eine wichtige Aufgabe der Nahrungs- und Futtermittelindustrie. Diese ist notwendig, da beispielsweise in Pflanzen A- minosäuren wie L-Lysin und L-Tryptophan für die Versorgung von Säugetieren limitierend sind. Besonders vorteilhaft für die Qualität von Nahrungs- und Futtermittel ist eine möglichst ausge- wogene Aminosäurebalance, da ein hoher Uberschuss an einer Aminosäure wie beispielsweise L-Lysin ab einer bestimmten Konzentration im Lebensmittel keinen weiteren positiven Effekt auf die Verwertung des Lebensmittels hat, da andere Aminosäuren plötzlich limitierend werden. Eine weitere Steigerung der Qualität ist nur über Zugabe weiterer unter diesen Bedingungen limitierenden Aminosäuren möglich. So ist in wachsenden Schweinen zunächst Lysin limitierend. Ist ausreichend Lysin im Futtermittel enthalten, so wird Threonin zur limitierenden Aminosäure. Wird auch Threonin ausreichend zum Futtermittel gegeben, so ist als nächste Aminosäure Tryptophan limitiert. Für Hühner ist die Reihenfolge der ersten drei limitierenden Aminosäuren wie folgt: Methionin, Lysin und dann Threonin. Dies zeigt, dass diese Aminosäuren für eine optimale Ernährung wichtige Funktion haben und in einem ausgewogenen Verhältnis in der Nahrung vorliegen müssen.
Eine gezielte Gabe der limitierenden Aminosäure in Form synthetischer Produkte muss deshalb sehr vorsichtig vorgenommen werden, um Aminosäure-Imbalanzen zu vermeiden. Durch Zugabe einer essentiellen Aminosäure wird nämlich die Proteinverdauung angeregt, was besonders Mangelsituationen bei der in zweiter oder dritter Stelle limitierenden Aminosäure hervorrufen kann.
So hat man bei Fütterungsversuchen beispielsweise von Casein durch zusätzliche Gaben von Methionin, das im Casein limitiert ist, Leberverfettungen festgestellt, die erst nach zusätzlicher Gabe von Tryptophan behoben werden konnten.
Für eine hohe Nahrungs- und Futtermittelqualität ist deshalb die je nach Organismus ausgewo- gene Zugabe mehrerer Aminosäuren notwendig. Die vorgenannten fermentativen sowie anderen Syntheseverfahren ermöglichen in der Regel nur den Zugang zu einer einzelnen Aminosäu- , re.
Es bestand daher die Aufgabe für die vorliegende Erfindung ein kostengünstiges Verfahren zur Synthese von Aminosäuren vorteilhaft der essentiellen Aminosäuren L-Lysin und L-Methionin bevorzugt von L-Methionin zu entwickeln, die zu den zwei häufigsten limitierenden Aminosäuren gehören.
Diese Aufgabe wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren vorteilhaft von L-Methionin in transgenen Organismen gelöst, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst: a) Einbringen einer Nukleinsauresequenz, die für ein Threonin-abbauendes Protein und/oder Lysin-abbauendes Protein codiert, oder b) Einbringen einer Nukleinsauresequenz, die den Threoninabbau und/oder Lysinabbau in den transgenen Organismen erhöht und c) Expression einer unter (a) oder (b) genannten Nukleinsauresequenz im transgenen Organismus.
Unter Threonin-abbauenden Proteinen sind vorteilhaft Proteine zu verstehen wie die Threonin- Aldolase (EC 4.1.2.5) oder die Serin-Hydroxymethyltransferase (EC 2.1.2.1), die Threonin zu Acetaldehyd und Glycin umsetzen, die Threonindehydrogenase, die unter Bildung von NADH + H+ Threonin zu L-2-Amino-Acetoacetat umsetzt, oder die Threonindehydratase, die Threonin unter NH3 und Wasserabspaltung zu Oxobutyrate umsetzt. Vorteilhaft wird als Thronin- abbauende Aktivität die Threonin-Aldolase im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet. Die Aktivität der vorgenannten Proteine und/oder der für sie codierenden Nukieinsäuresequenzen kann auf verschiedenen Wegen erhöht werden. Vorteilhaft werden die Nukieinsäuresequenzen in einem Organismus exprimiert und so die Aktivität in einem Organismus über die Genkopienzahl erhöht und/oder aber es wird die Stabilität der exprimierten mRNA erhöht und/oder es wird die Stabilität des Genprodukts erhöht. Weiterhin kann die Regulation der vorgenannten Nukieinsäuresequenzen verändert werden, so dass die Expression der Gene erhöht wird. Dies kann vorteilhaft durch heteroioge Regulationssequenzen oder durch Veränderung z.B. über Mutation der vorhandenen natürlichen Regulationssequenzen erreicht werden. Beide vorteilhaften Methoden können auch miteinander kombiniert werden.
Eine vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren vorteilhaft von L-Methionin in transgenen Organismen dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst:
a) Einbringen einer Nukleinsauresequenz, die für ein Threonin-abbauendes Protein codiert, das folgende Consensus-Sequenz enthält
H[x]2G[X]R[X]19D[Xl7K[X]27G, oder
HXDGAR[X]3A[X]15D[X]4CXSK[X]4PXGS[X]3G[X]7A[X]4K[X]2GGGXRQXG b) Einbringen einer Nukleinsauresequenz, die den Threoninabbau in den transgenen Organismen erhöht und c) Expression einer unter (a) oder (b) genannten Nukleinsauresequenz im transgenen Organismus. Wobei in der Consensus-Sequenz der ein Buchstaben Aminosäurecode verwendet wurde. An Stellen an denen ein X steht, kann eine beliebige Aminosäure stehen. Figur 1 gibt den Consen- sus der Threonin-Aldolase, die im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft verwendet werden können, wieder. Die in Figur 1 genannten Abkürzungen der Proteine bzw. deren Accession- Nummern bedeuten das folgende: P1;T24108 ist ein hypothetisches Protein R102.4b aus Cae- norhabditis elegans, Q87I10 ist eine putative L-allo-Threonin Aldolase aus Vibrio parahaemolyticus, GLY1_YEAST ist eine low-specificity L-Threonin Aldolase aus Saccharomyces cerevisiae (Baker's yeast), P1;T38302 ist eine mögliche Threonin Aldolase aus Schizosaccharomyces pombe, P1;E75410 ist eine L-allo-Threonin Aldolase aus Deinococcus radiodurans. Q9VCK6 wird als CG10184 Protein bezeichnet und stammt aus Drosophila melanogaster (Fruit fly), Q885J1 ist eine Threonin Aldolase mit geringer Spezifität aus Pseudomonas syringae. P1;G83533 ist ein hypothetisches Protein PA0902 aus Pseudomonas aeruginosa, Q83S08 ist eine putative Arylsulfatase aus Shigella flexneri, P1;F64825 ist eine L-allo-Threonin Aldolase aus Escherichia coli, ebenso wie P1;AF0608, das aus Salmonella enterica stammi. Q87HF4 ist eine L-allo-Threonin Aldolase aus Vibrio parahaemolyticus. Auch bei den folgenden Proteinen handelt es sich um L-allo-Threonin Aldolasen: P1;E82418 (Vibrio cholerae), P1;T46877 (Aeromonas jandaei), Q9M835 (Arabidopsis thaliana; Mouse-ear cress), Q8RCY7 (Thermoanaerobacter tengcongensis), P1;C72215 (Thermotoga maritima), Q896G8 (Clostridium tetani), P1;C84060 (Bacillus halodurans. Q89N26 ist ein BII4016 Protein aus Bradyrhizobium japonicum.Q9X8S4 ist eine L-Threonin Aldolase mit geringer Spezifität aus Zymomonas mobilis, P1;D84395 ist eine L- allo-Threonin Aldolase aus Halobacterium sp. NRC-1. Bei CAA02484 handelt es sich um Sequenz 33 aus der PCT-Anmeldung WO 94/25606. Die Sequenz stammt aus Tolypocladium inflatum. TOXG_COCCA ist eine Alanin Racemase TOXG aus Cochliobolus carbonum (Bipola- ris zeicola), P1;AF1474 stammt aus Listeria innocua und ist eine L-allo-Threonin Aldolase mit geringer Spezifität.
Unter Lysin-abbauenden Proteinen sind vorteilhaft Proteine zu verstehen wie die Lysin- Decarboxylase (EC 4.1.1.18), die L-lysine 6-monooxygenase (EC 1.14.13.59), die L-Lysine 2- monooxygenase (EC 1.13.12.2), Lysin-Ketoglutaratreductase (EC 1.5.1.7) oder die Lysine 2,3- aminomutase (EC 5.4.3.2), die L-Lysin zu Cadaverin, N6-hydroxy-L-lysine, 5-Aminopentanamid, Saccharopin oder (3S)-3,6-Aminohexanoat umsetzen, Vorteilhaft wird als Lysin-abbauende Aktivität die Lysin-Decarboxylase allein oder in Kombination mit einer Threonin-abbauenden Aktivität vorteilhaft der Threonin-Aldolase im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet. Die Aktivität der vorgenannten Proteine und/oder der für sie codierenden Nukieinsäuresequenzen kann auf verschiedenen Wegen erhöht werden. Vorteilhaft werden die Nukieinsäuresequenzen in einem Organismus exprimiert und so die Aktivität in einem Organismus über die Genkopienzahl erhöht und/oder aber es wird die Stabilität der exprimierten mRNA erhöht und/oder es wird die Stabilität des Genprodukts erhöht. Weiterhin kann die Regulation der vorgenannten Nukieinsäuresequenzen verändert werden, so dass die Expression der Gene zen verändert werden, so dass die Expression der Gene erhöht wird. Dies kann vorteilhaft durch heterologe Regulationssequenzen oder durch Veränderung z.B. über Mutation der vorhandenen natürlichen Regulationssequenzen erreicht werden. Beide vorteilhaften Methoden können auch miteinander kombiniert werden.
Eine vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren vorteilhaft von L-Methionin in transgenen Organismen dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst, gelöst:
a) Einbringen einer Nukleinsauresequenz, die für ein Lysin-abbauendes Protein codiert, das folgende Consensus-Sequenz enthält
GtXμGIMIX^sMpqzRKIXlzMIXJuGGXGpqsEIXlzEIXkW. oder
LG[X]9 LVYGG[X]3GIMGXVA[X]9G[X]3GXIP[X]24MHXRKpq2M[X]6Fp(]3PGGXGTXEE[X]2 E[X]2TW[X]2IG[X]3KP[X]4N[X]3FY[X]14F b) Einbringen einer Nukleinsauresequenz, die den Lysinabbau in den transgenen Organismen erhöht und c) Expression einer unter (a) oder (b) genannten Nukleinsauresequenz im transgenen Organismus. Wobei in der Consensus-Sequenz der ein Buchstaben Aminosäurecode verwendet wurde. An Stellen an denen ein X steht, kann eine beliebige Aminosäure stehen. Figur 2 gibt den Consen- sus der Lysin-abbauendes Protein , die im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft verwendet werden können, wieder. Die in Figur 2 aufgeführten Aminosäuresequenzen sind nummeriert (1., 2., 3., usw) und bedeuten folgendeAbkürzungen der Proteine bzw. deren Accession-Nummern: Q871Q6 [2] ist ein hypothetisches Protein aus Neurospa crassa. Bei Q815T3 [3] handelt es sich um eine Lysin-Decarboxylase aus Bacillus cereus. Q81XE4 [4] codiert für ein hypothetisches Protein aus Bacillus anthracis, ebenso wie P1;D70033 [5] für ein hypothetisches Protein aus Bacillus subtiiis codiert. Q8H7U8 [6] ist eine putative Lysin-Decarboxylase aus Oryza sativa. Q8L8B8 [7] codiert für ein hypothetisches Protein aus Arabidopsis thaliana. Auch bei Q8XXM6 [8] handelts es sich um ein hypothetisches Protein aus Ralstonia solanacearum. Auch bei den folgenden Proteinen handelt es sich um hypothetische Proteine: Q88DF4 [9] (Pseudomonas putida), P1;A83031 [10] (Pseudomonas aeruginosa) ,Q8PAJ9 [11] (Xanthomonas campestris) und Q8PMA0 [12] (Xanthomonas axonopodis). Q8NN34 [13] codiert für ein vorhergesagtes Rossmann Fold Nucleotide Binding-Protein (1 segment) aus Corynebacterium glutamicum. P1;AI3438 [14] codiert für eine Lysin-Decarboxylase aus Brucella melitensis. Q8G289 [15] codiert für ein hypothetisches Protein aus Brucella suis, ebenso wie Q984W8 [16] (Rhizobium loti). P1;B97490 [17] ist eine Lysin-Decarboxylase aus Agrobacterium tumefaciens. Auch P1;B83993 [18] codiert für eine Lysin-Decarboxylase aus Bacillus halodurans. Von Q8A2T1 [19] wird angenommen, dass es sich um eine putative Lysin-Decarboxylase aus Bacteroides thetaiotaomicron handelt. Die folgenden Proteine codieren für hypothetische Proteien: Q92R13 [20] (Rhizobium meliloti), Q8ETC2 [21] (Oceanobacilius iheyensis), Q8NXQ6 [22] (Staphylococcus aureus), Q8CTK0 [23] (Staphylococcus epidermidis) und P1;F55578 [24] (Rhodococcus fascians). Q839D0 [25] codiert für ein Protein der Decarboxylase-Familie aus Enterococcus faecalis. P1;D84035 [26] ist ein hypothetisches Protein aus Bacillus halodurans. Q8EZ03 [27] ist eine Lysin-Decarboxylase aus Leptospira interrogans. Q89NP4 [28] ist ein hypothetisches Protein aus Bradyrhizobium japonicum ebenso wie Q8RFZ1 [29] (Fusobacterium nucleotum). Die in den eckigen Klammern wiedergegebenen Nummern geben die in Figur 2 gezeigte Nummerierung und damit die Reihenfolge der Proteine an. Der Klon YJL055W, der vorteilhaft im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, trägt die Nummer 1. Die Consensussequenz ist in Nummer 30 wiedergegeben.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens handelt es sich um ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren vorteilhaft von L-Methionin in transgenen Organismen, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst:
a) Einbringen einer Nukleinsauresequenz, die für ein Threonin-abbauendes Protein codiert, das folgende Consensus-Sequenz enthält
H[x]2G[X]R[X]19D[X]7K[X]27G, oder
HXDGAR[X]3A[X]15D[X]4CXSK[X]4PXGS[X]3G[X]7A[X]4K[X]2GGGXRQXG
und Einbringen einer Nukleinsauresequenz, die für ein Lysin-abbauendes Protein codiert, das folgende Consensus-Sequenz enthält
GtX GIMtX^ pClzRKIXlaMIXlnGGXGIXlaEIXlzECXJsW, oder
LG[X]9 LVYGG[X]3GIMGXVA[X]9G[X]3GXIP[X]24 HXRK[X]2MtX]6F[X]3PGGXGTXEEpq2 E[X]2TW[X]2IG[X]3KP[X]4N[X]3FY[X]14F, oder b) Einbringen einer Nukleinsauresequenz, die für Proteine codiert, die den Threoninabbau und Lysinabbau in den transgenen Organismen erhöhen, und c) Expression einer unter (a) oder (b) genannten Nukleinsauresequenz im transgenen Organismus. In einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung von Aminosäuren vorteilhaft von L-Methionin in transgenen Organismen ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass im oben genannten Verfahrensschritt (a) eine Nukleinsauresequenz, eingebracht wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe der Nukieinsäuresequenzen i) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13,
SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 dargestellten Sequenz;
ii) einer Nukleinsauresequenz, die aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:
16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 oder SEQ ID NO: 26 dargestellten Aminosäuresequenz erhalten wird und
iii) eines Derivats der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 dargestellten Nukleinsauresequenz, die für ein Polypeptid codiert, welches mindestens
50 % Homologie auf Aminosäureebene zu der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 oder SEQ ID NO: 26 dargestellten Aminosäuresequenz aufweist, ohne dass die biologische Aktivität der Polypeptide wesentlich reduziert ist; und
diese Nukieinsäuresequenzen anschließend in einem transgenen Organismus exprimiert werden.
Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung von Aminosäuren vorteilhaft von L-Methionin in transgenen Organismen ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass im oben genannten Verfahrensschritt (a) oder (b) Nukieinsäuresequenzen in Kombina- tion miteinander oder in Kombination mit anderen Nukieinsäuresequenzen, die die Synthese von L-Lysin und/oder L-Threonin in einem transgenen Organismus steigern können. Hierzu gehören neben Genen, die für den Zentralstoffwechsel wie der Verwertung von Zuckern wie Glucose innerhalb der Glykolyse oder des Citratzykluses codieren, auch Gene, die ausgehend von Aspartat an der Synthese der Aminosäuren beteiligt sind.
Diese vorteilhaften Ausführungsformen des Verfahrens zur Herstellung von Aminosäuren vorteilhaft von L-Methionin in transgenen Organismen stellt sich damit wie folgt dar:
a) Einbringen einer Nukleinsauresequenz ausgewählt aus der Gruppe
i) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 und/oder SEQ ID NO: 25 dargestellten Sequenz;
ii) einer Nukleinsauresequenz, die aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 und/oder SEQ ID NO: 26 dargestellten Aminosäuresequenz erhalten wird und
iii) eines Derivats der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 und/oder SEQ ID NO: 25 dargestellten Nukleinsauresequenz, die für ein Polypeptid codiert, welches mindestens 50 % Homologie auf Aminosäureebene zu der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 und/oder SEQ ID NO: 26 dargestellten Aminosäuresequenz aufweist, ohne dass die biologische Aktivität der Polypeptide wesent- lieh reduziert ist; und
b) Expression einer unter (a) genannten Nukleinsauresequenz in einem transgenen Organismus.
In einerweiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung von Aminosäuren vorteilhaft von L-Methionin in transgenen Organismen ist das Verfahren dadurch gekenn- zeichnet, dass im oben genannten Verfahrensschritt (a) eine oder mehrere Nukieinsäuresequenzen) eingebracht wird/werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe der Nukieinsäuresequenzen
i) einer Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 dargestellten
Aminosäuresequenz erhalten wird;
ii) eines Derivats der Nukleinsauresequenz, die durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 dargestellten Aminosäuresequenz er- halten wird und welche mindestens 70 % Homologie auf Aminosäureebene zu den vorgenannten Aminosäuresequenzen aufweist, ohne dass die biologische Aktivität der Polypeptide wesentlich reduziert ist; eingebracht wird und
anschließend diese Nukieinsäuresequenzen in einem transgenen Organismus exprimiert werden.
Nach dem Einbringen und der Expression der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukieinsäuresequenzen wird der transgene Organismus vorteilhaft kultiviert und anschließend geerntet. Im Falle, dass es sich bei dem transgenen Organismus um einen Mikroorganismus wie einem eukaryotischen Organismus wie einem Pilz, einer Alge oder einer Hefe oder einem prokaryotischen Organismus wie einem Bakterium wie einem Bakterium der Gattungen Escherichia, Bacillus, Serratia, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Corynebacterium oder Bre- vibacterium handelt wird dieser in einem dem Fachmann bekannten und je nach Organismus üblichen Fest- oder Flüssigmedium kultiviert. Nach Anzucht werden die Organismen gegebe- nenfalls geerntet. Die Aminosäuren können dann direkt in Nahrungsmittel oder Futtermittel oder für sonstige Anwendungen beispielsweise gemäß den in EP-B-0 533 039 oder EP-A-0 615 693 gemachten Offenbarungen, auf die hier ausdrücklich verwiesen wird, weiter verarbeitet werden oder aber weiter in üblicherweise über Extraktion und Fällung oder Kristallisation oder über Ionenaustauscher oder Kombinationen dieser Methoden weiter aufgereinigt werden. Produkte dieser unterschiedlichen Aufarbeitungen sind Aminosäuren oder Aminosäurezusammensetzungen, die noch Anteile der Fermentationsbrühe und der Zellen in unterschiedlichen Mengen vorteilhaft im Bereich von 0 bis 100 Gew.-%, bevorzugt von 1 bis 80 % Gew.-%, besonders bevorzugt zwischen 5 und 50 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt zwischen 5 und 40 Gew.-% enthalten.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Organismus um eine Pflanze, deren Aminosäuregehalt durch die eingebrachte Nukleinsauresequenz vorteilhaft verändert wird. Dies ist für Pflanzeπzüchter wichtig, da beispielsweise für monogastrische Tiere der Nährwert von Pflanzen durch einige essentielle Aminosäuren wie Lysin oder Methionin limitiert ist. Auch Threonin spielt in diesem Zusammenhang eine wichtige Rolle. Diese so hergestell- te transgene Pflanze wird nach dem Einbringen der im erfindungsgemäßen Verfahren vewende- ten Nukleinsäure bzw. Nukleinsäurekombination auf oder in einem Nährmedium oder aber in Festkultur z.B. einer Erdkultur angezogen und anschließend geerntet. Die Pflanzen können dann direkt als Lebens- oder Futtermittel verwendet werden oder aber weiter verarbeitet werden. Auch in diesem Fall können die Aminosäuren in üblicher Weise über Extraktion, Kristallisation und/oder Fällung oder über Ionenaustauscher oder Kombinationen dieser Methoden weiter aufgereinigt werden. Produkte dieser unterschiedlichen Aufarbeitungen sind Aminosäuren oder Aminosäurezusammensetzungen, die noch Anteile der Pflanze in unterschiedlichen Mengen vorteilhaft im Bereich von 0 bis 100 Gew.-%, bevorzugt von 20 bis 80 % Gew.-%, besonders bevorzugt zwischen 50 und 90 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt zwischen 80 und 99 Gew.-% enthalten. Vorteilhaft werden die Pflanzen direkt ohne weitere Aufarbeitung verwendet.
In einerweiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Organismus um einen Mikroorganismus wie Bakterien der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia, Serratia, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, oder Bacillus. Bevorzugt werden Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia oder Bacillus verwendet. Diese Mikroorganismen werden vorteilhaft in einem fermentativen Verfahren verwendet. Vorteilhaft werden in den Organismen neben der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 und/oder SEQ ID NO: 25 genannten Sequenz, den Nukieinsäuresequenzen, die sich von den Sequenzen SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 ableiten lassen, oder deren Derivaten noch weitere Gene exprimiert und/oder mutiert. Besonders vorteilhaft wird in den Organismen wie Pflanzen oder Mikroorganismen zusätzlich wenigstens ein weiteres Gen des Biosyntheseweges des L-Lysins, L-Threonins und/oder L-Methionins exprimiert und/oder es werden Gene exprimiert, deren Regulation verändert wurden. Vorteilhaft kann auch die Regulation der natürlichen Gene verändert worden sein, so dass das Gen und/oder dessen Genprodukt nicht mehr der den in Organismen vorhandenen Regelkreisläufen unterliegt. Dadurch kommt es zu einer verstärkten Synthese der gewünschten Aminosäuren, da z.B. Feedback-Regulationen nicht mehr oder nicht mehr in dem Maße vorhanden sind. Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren Aminosäuren wie L- Lysin, L-Threonin und/oder L-Methionin, bevorzugt L-Methionin produziert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden deshalb Organismen vorteilhaft Bakterien der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus oder Escherichia oder Pflanzen angezogen, in denen gleichzeitig wenigstens eine Nukleinsäure bzw. eines der Gene, die für Proteine kodieren, ausgewählt aus der Gruppe der Genprodukte bestehend aus der Aspartatkinase (lysC), der Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase (asd), der Di- hydrodipicolinat Synthase, der Dihydrodipicolinat Reductase, der Tetrahydrodipicolinat Succi- nyltransferase, der N-Succinyl-L-Diaminopimelinsäure-Glutaminsäure Transaminase, der Succi- nyl-diaminopimelat Desuccinylase, der Diaminopimelat Epimerase, der Diaminopimelat Decar- boxylase, der Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase (gap), der 3-Phosphoglycerat Kina- se (pgk), der Pyruvat Carboxylase (pyc), der Triosephosphat Isomerase (tpi), der Homoserin O- Acetyltransferase (metA), der Cystahionin-γ-Synthase (metB), der Cystahionin-gamma-Lyase (metC), Cystahionin-ß-Lyase, der Methionin-Synthase (metH), der Serin- Hydroxymethyltransferase (glyA), der O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase (metY), der Methylen- Tetrahydrofolat-Reduktase (metF), der Phosphoserin-Aminotransferase (serC), der Phosphose- rin-Phosphatase (serB), der Serine Acetyl-Transferase (cysE), der Cystein-Synthase (cysK), der Homoserin-Dehydrogenase (hom), Homoserin-Kinase, Homocysteine S-Methyltransferase und S-Adenosylmethionin Synthase (metX) überexprimiert ist.
In einerweiteren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden im Verfahren Organismen verwendet, in denen gleichzeitig wenigstens eines der vorgenannten Gene bzw. eine der vorgenannten Nukleinsäuren mutiert ist, so dass die korrespondierenden Proteine, verglichen mit den nicht mutierten Proteinen, in geringerem Maße oder gar nicht durch Stoffwechselmetaboiite in ihrer Aktivität beeinflusst werden und dass insbesondere die erfindungsgemäße Produktion der Aminosäuren nicht beeinträchtigt wird, oder so dass ihre spezifi- sehe enzymatische Aktivität gesteigert wird. Unter geringer Beeinflussung ist dabei eine gegenüber dem Ausgangsorganismus um mindestens 10 %, vorteilhaft mindestens 20, 30 oder 40 %, besonders vorteilhaft um mindestens 50, 60 oder 70 % geringere Regulierung der Enzymaktivität, das heißt Beeinflussung ihrer enzymatischen Aktivität durch Stoffwechselmetabolite und damit um diese genanten Zahlen erhöhte Aktivität des Enzyms gegenüber dem Ausgangsorganismus zu verstehen. Unter Steigerung der enzymatischen Aktivität ist eine gegenüber dem Ausgangsorganismus um mindestens 10 %, vorteilhaft mindestens 20, 30 oder 40 %, besonders vorteilhaft um mindestens 50, 60 oder 70 % gesteigerte enzymatische Aktivität zu verstehen. Dies führt zu einer erhöhten Produktivität der gewünschten Aminosäure oder der gewünschten Aminosäuren.
In einerweiteren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden im Verfahren Organismen verwendet, in denen gleichzeitig wenigstens eines der Gene, die für eine enzymatische Aktivität codiert ausgewählt unter der Homoserine-Kinase (thrB), der Threonin Dehydratase (ilvA), der Threonin Synthase (thrC), der Meso-Diaminopimelat D-Dehydrogenase (ddh), der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (pck), der Giucose-6-Phosphat-6-!somerase (pgi), der Pyruvat-Oxidase (poxB), der Dihydrodipicolinat Synthase (dapA), der Dihydrodipicoli- nat Reduktase (dapB) und der Diaminopicolinat Decarboxylase (lysA) abschwächt ist, insbesondere durch Verringerung der Expressionsrate des korrespondierenden Gens.
Gemäß einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden im Verfah- ren Organismen verwendet, in denen gleichzeitig wenigstens eine der vorgenannten Nukleinsäuren bzw. der vorgenannten Gene so mutiert ist, dass die enzymatische Aktivität des ko- respondierenden Proteins teilweise verringert wird oder vollständig blockiert ist. Unter Verringerung der enzymatischen Aktivität ist eine gegenüber dem Ausgangsorganismus um mindestens 10 %, vorteilhaft mindestens 20, 30 oder 40 %, besonders vorteilhaft um mindestens 50, 60 oder 70 % verringerte enzymatische Aktivität zu verstehen.
Enzyme können derart in ihrer Aktivität beeinflusst werden, dass es zu einer Verringerung oder Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit, oder zu einer Veränderung (Verringerung oder Erhöhung) der Affinität gegenüber dem Substrat kommt.
Vorzugsweise werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium oder Brevibacterium oder Pflanzen eingesetzt.
Auch chemisch reine Aminosäuren oder Aminosäurezusammensetzungen sind nach den vorbeschriebenen Verfahren darstellbar. Dazu werden die Aminosäuren oder die Aminosäurezusammensetzungen aus dem Organismus wie den Mikroorganismen oder den Pflanzen oder dem Kulturmedium, in dem oder auf dem die Organismen angezogen wurden, oder aus dem Orga- nismus und dem Kulturmedium in bekannter Weise isoliert. Diese chemisch reinen Aminosäu- ren oder Aminosäurezusammensetzungen sind für Anwendungen im Bereich der Lebensmittelindustrie, der Kosmetikindustrie oder der Pharmaindustrie vorteilhaft.
Vorteilhaft werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Aminosäuren wie Methionin, Lysin oder deren Mischungen bevorzugt Methionin hergestellt.
Dabei können im erfindungsgemäßen Verfahren die vorgenannten Aminosäuren mindestens um den Faktor 3, bevorzugt mindestens um den Faktor 5, besonders bevorzugt mindestens um den Faktor 10, ganz besonders bevorzugt um mindestens den Faktor 50 gegenüber dem Wiidtyp der Organismen erhöht werden. Besonders vorteilhaft wirkt es sich im erfindungsgemäßen Verfahren auf die Aminosäureproduktivität aus, wenn eine Kombination von Genen verwendet wird, die für eine Threonin-Aldolase oder Threonin-Aldolase ähnliches Protein oder eine Lysin- Decarboxylase oder ein Lysin-Decarboxylase ähnliches Protein codieren.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren können die hergestellten Aminosäuren in den im Verfahren verwendeten Organismen prinzipiell auf zwei Arten erhöht werden. Es kann vorteilhaft der Pool an freien Aminosäuren und/oder der Anteil der über das Verfahren hergestellten Ami- nosäuren in den Proteinen erhöht werden. Vorteilhaft wird durch das erfindungsgemäße Verfahren der Pool an freien Aminosäuren in den transgenen Organismen erhöht. Im vorteilhaften Falle der Fermentation von Mikroorganismen werden die Aminosäuren im Medium angereichert.
Prinzipiell sind für das erfindungsgemäße Verfahren alle eukaryotischen oder prokaryotischen Organismen geeignet, die in der Lage sind, Methionin und/oder Lysin zu synthetisieren. Vorteil- haft handelt es sich bei den im Verfahren verwendeten Organismen um Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze, Hefen oder Algen oder Pflanzen wie dicotyledone oder monocotyledone Pflanzen wie Pflanzen der Familien Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassica- ceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaceae, Pa- paveraceae, Rosaceae, Salicaceae, Solanaceae, Arecaceae, Bromeliaceae, Cyperaceae, Irida- ceae, Liliaceae, Orchidaceae, Gentianaceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae, Capri- folaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Caryophyllaceae, Ericaceae, Polygonaceae, Violaceae, Juncaceae oder Poaceae bevorzugt einer Pflanze ausgewählt aus den Gruppe der Familien Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Solanaceae, Liliaceae oder Poaceae.
Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren transgene Mikroorganismen wie Pilze wie die Gattung Claviceps oder Aspergillus oder gram-positive Bakterien wie die Gattungen Bacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Brevibacterium, Rhodococcus, Nocardia, Caseobacter oder Arthrobacter oder gram-negative Bakterien wie die Gattungen Escherichia, Flavobacterium oder Salmonella oder Hefen wie die Gattungen Rhodotorula, Hansenula oder Candida. Besonders vorteilhaft sind Organismen ausgewählt aus der Gruppe der Gattungen Corynebacterium, Brevi- bacterium, Escherichia, Bacillus, Serratia, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Rhodotorula, Hansenula, Candida, Claviceps oder Flavobacterium. Gans besonders vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe der Gattungen und Arten bestehend aus Hansenula anomala, Candida utilis, Claviceps purpurea, Bacillus circulans, Bacillus subtilis, Bacillus sp., Brevibacterium albidum, Brevibacterium album,
Brevibacterium cerinum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium glutamigenes, Brevibacterium iodinum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium linens, Brevibacterium roseum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium sp., Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum (= Micrococcus glutamicum), Corynebacterium melassecola, Corynebacterium sp. oder Escherichia coli speziell Escherichia coli K12 und dessen beschriebene Stämme verwendet.
Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren transgene Pflanze ausgewählt aus der Gruppe der Nutzpflanzen verwendet. Wie Pflanzen ausgewählt aus der Gruppe der Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Safflor (Färberdistel), Olive, Sesam, Haselnuss, Mandel, Avoca- do, Lorbeer, Kürbis, Lein, Soja, Pistazien, Borretsch, Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Hirse, Triti- cale, Reis, Gerste, Maniok, Kartoffel, Zuckerrübe, Futterrübe, Aubergine, sowie ausdauernde Gräser und Futterfeldfrüchte, Öipalme, Gemüse (Kohlgemüse, Wurzelgemüse, Knollengemüse, Hülsengemüse, Fruchtgemüse, Zwiebelgemüse, Blatt- und Stieigemüse), Buchweizen, Topi- nambur, Ackerbohne, Wicken, Linse, Buschbohne, Alfaalfa , Lupine, Klee und Luzerne.
Die im Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen verwendete(n) Nukleinsäuresequenz(en) stammen vorteilhaft aus einem Eukaryont (für die Erfindung soll der Plural den Singular und umgekehrt umfassen), können aber auch aus einem Prokaryont wie Bakterien ausgewählt aus den Gattungen Brevibacterium, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Corynebacterium, Serratia, Klebsiella oder Enterobacter stammen. Vorteilhaft stammen die Nukieinsäuresequenzen aus einer Pflanze wie einer Pflanze ausgewählt aus den Familien Acera- ceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Salicaceae, Solanaceae, Arecaceae, Bromeliaceae, Cyperaceae, Iridaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Gentia- naceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae, Carifolaceae, Rubjaceae, Scrophularia- ceae, Caryophyllaceae, Ericaceae, Polygonaceae, Violaceae, Juncaceae oder Poaceae bevorzugt einer Pflanze ausgewählt aus den Gruppe der Familien Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Solanaceae, Liliaceae oder Poaceae; einem Pilz wie den Gattungen Aspergillus, Penicillum oder Claviceps oder einer Hefe wie den Gattungen Pichia, Torulopsis, Hansenula, Schizosaccharomyces, Candida, Rhodotorula oder Saccharomyces. Besonders vorteilhaft stammen die Sequenzen aus Hefen wie den Gattungen Pichia, Torulopsis, Hansenula, Schizosaccharomyces, Candida, Rhodotorula oder Sac- charomyces, ganz besonders vorteilhaft aus der Hefe der Familie Saccharomycetaceae wie der vorteilhaften Gattung Saccharomyces und der besonders vorteilhaften Gattung und Art Saccha- romyces cerevisiae.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukieinsäuresequenzen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 13 und/oder SEQ ID NO: 15 kodieren für eine Threonin-Aldolase. Diese Aldolase (SEQ ID NO: 1) zeigt die höchste Homologie zum GLY1 Protein von A. gossypii [Eremothecium ashbii, Eremothecium gossypii] (EMBL-Datenbank. Accession Nr. AJ005442, CAA06545.1 , GENSEQ_PROT: AAY25338, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 76 %). Auch zu Threonin-Aldolasen, die aus Reis, Soja, Weizen stammen und die in US 2002123118 A1 offenbart wurde, besteht eine hohe Homologie. Darüber hinaus lassen sich Homologien zu einer Vielzahl von Nukleinsäuren finden. Die Threonin-Aldolase von Hefen wie Candida albicans (EMBL-Datenbank. Accession Nr. AF009967, AAB64198.1, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 56 %), von Schizosaccharomyces pombe (EMBL- Datenbank. Accession Nr. Z99163, CAB 16235.1, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 49 %), oder von Bakterien wie Aeromonas jandaei (EMBL-Datenbank. Accession Nr.
AF169478, AAD47837.1, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 41 %), Pseudomonas aeruginosa (EMBL-Datenbank. Accession Nr. AF011922, AAC46016.1, , Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 38 %), Vibrio cholerae (EMBL-Datenbank. Accession Nr. AE004405, AAF96663.1, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 38 %), E- scherichia coli (EMBL-Datenbank. Accession Nr. AB005050, BAA20882.1 , Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 38 %), Deinococcus radiodurans (EMBL-Datenbank. Accession Nr. AE001978, AAF10885.1, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 38 %), Bacillus halodurans (EMBL-Datenbank. Accession Nr. AP001518, BAB07002.1, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 34 %), Halobacterium sp. (EMBL-Datenbank. Accessi- on Nr. AE005124, AAG20528.1), Thermotoga maritima (EMBL-Datenbank. Accession Nr.
AE001813, AAD36809.1, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 40 %) oder den Pflanzen Arabidopsis thaliana (EMBL-Datenbank. Accession Nr. AF325033, AAG40385.1, AC022287, AAF63783.1, AC003981, AAC14037.1, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von jeweils 40, 42 bzw. 37 %) oder von nicht-humanen Tieren wie Caenorhabditis ele- gans (EMBL-Datenbank. Accession Nr. Z70309, CAA94358.1 , Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 41 %) oder Drosophila melanogaster (EMBL-Datenbank. Accession Nr. AE003744, AAF56152.1, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 39 %) oder die Alaninracemase von Pilzen wie Cochliobolus carbonum/Bipolaris zeicola (EMBL-Datenbank. Accession Nr. AF169478, AAD47837.1, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 38 %). Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren Nukieinsäuresequenzen und durch diese codierte Proteine verwendet, die aus Hefen der Gattungen Candida, Hansenula, Rhodotorula, Schizosaccharomyces oder Saccharomyces stammen. Weiterhin zeigt die vorteilhaft im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Aldolase eine hohe Homologie zu den unter SEQ ID NO: 3 (Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 35 %), SEQ ID NO: 4 (Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 35 %), SEQ ID NO: 5 (Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 27 %), SEQ ID NO: 6 (Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 43 %), SEQ ID NO: 7 (Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 39 %), SEQ ID NO: 8 (Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 32 %), SEQ ID NO: 9 (Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 35 %) oder SEQ ID NO: 10 (Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 1 von 36 %) genannten Sequenzen, die aus Soja (SEQ ID NO: 3 - 5), Reis (SEQ ID NO: 6 und 7) bzw. aus Canola (SEQ ID NO: 8 - 10) stammen. Vorteilhaft können im Verfahren Nukieinsäuresequenzen verwendet werden, die sich von den Aminosäuresequen- zen SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 ableiten.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukieinsäuresequenzen mit der Sequenz SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 sowie deren Derivate kodieren für eine Lysin-Decarboxylase bzw. für ein Lysin- Decarboxylase ähnliches Protein. Diese vorteilhafte Lysin-Decarboxylase (SEQ ID NO: 11) zeigt die höchste Homologie zu einem Protein von Neurospora crasa (EMBL-Datenbank. Accession Nr. TREMBL_NEW:CAD70937, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 11 von 45 % über ein maximale Länge von 231 Aminosäuren = AS). Auch die Lysin-Decarboxylasen von Oryza sative (EMBL-Datenbank. Accession Nr. SPTREMBLQ9FWG6, TREMBL_NEW:AA019380, zeigen Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 11 von jeweils 41 % bzw. 37 %) bzw. die Proteine von Arabidopsis thaliana (EMBL-Datenbank. Accession Nr. SPTREMB Q9ASW6, PIR.T45885, SPTREMB Q9FNH8, PIR:H84789, PIR:T48348, SPTREMB Q9FYM7, PIR:T48554, PIR:T04966 und PIR:E84775, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 11 jeweils von 42 %, 42 %, 41 %, 39 %, 39 %, 39 %, 39 %, 36 %, und 35 %,) oder von Bakterien wie Ralstonia solanacearum [= Pseudomonas solanacearum] (EMBL- Datenbank. Accession Nr. SPTREMBLQ8XXM6, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 11 von 43 %), Pseudomonas putida (EMBL-Datenbank. Accession Nr. TREMBL_NEW:AAN70440, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 11 von 40 %), Pseudomonas aeruginosa (EMBL-Datenbank. Accession Nr. PIR:A83031, Identität auf Amino- säureebene zu SEQ ID NO: 11 von 40 %), Bacteroides thetaiotaomicron (EMBL-Datenbank. Accessiori Nr. TREMBL_NEW:AAO78330, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 11 von 39 %), Brucella melitensis (EMBL-Datenbank. Accession Nr. PIR:AI3438, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 11 von 43 %), Bacillus subtilis (EMBL-Datenbank. Accession Nr. PIR:D70033, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 11 von 36 %), Rhizobium loti bzw. Rhisobium meliloti (EMBL-Datenbank. Accession Nr. STREMB Q984W8 bzw.
STREMB Q92R13, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 11 von 39 % bzw. 36 %), Bacillus halodurans. (EMBL-Datenbank. Accession Nr. PIR:B83993, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 11 von 37 %), Agrobacterium tumefaciens (EMBL-Datenbank. Accession Nr. PIR:AI2707 bzw. PIR:B97490, Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 11 von jeweils 41 %), Staphylococcus aureus (EMBL-Datenbank. Accession Nr. PIR:A89839, Identität auf A- minosäureebene zu SEQ ID NO: 11 von jeweils 34 %), zeigen Homologien zur im erfindungsgemäß verwendeten Lysin-Decarboxylase-Sequenz SEQ ID NO: 11. Vorteilhaft werden im er- findungsgemäßen Verfahren Nukieinsäuresequenzen und durch diese codierte Proteine verwendet, die aus Hefen der Gattungen Candida, Hansenula, Rhodotorula, Schizosaccharomyces oder Saccharomyces stammen. Weiterhin zeigt die vorteilhaft im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Lysin-Decarboxylase eine hohe Homologie zu den unter SEQ ID NO: 21 (Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 11 von 42 %), SEQ ID NO: 23 (Identität auf Aminosäure- ebene zu SEQ ID NO: 11 von 43 %) oder SEQ ID NO: 25 (Identität auf Aminosäureebene zu SEQ ID NO: 11 von 37 %), die aus Raps, Reis und Maiz stammen. Vorteilhaft können im Verfahren Nukieinsäuresequenzen verwendet werden, die sich von den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 ableiten und eine Lysin-Decarboxylase-Aktivität aufweisen. .
Für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafte Nukieinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit Threonin-Aldolase-Aktivität oder Lysin-Decarboxylase-Aktivität codieren, lassen sich aus allgemein zugänglich Datenbanken ermitteln. Insbesondere sind hier allgemeine Gen- Datenbanken zu nennen, wie die EMBL-Datenbank (Stoesser G. et al., Nucleic Acids Res 2001 , Vol. 29, 17-21), die GenBank-Datenbank (Benson D.A. et al., Nucleic Acids Res 2000, Vol. 28,15-18), oder die PIR-Datenbank (Barker W. C. et al., Nucleic Acids Res. 1999, Vol. 27, 39- 43).
Weiterhin können Organismen-spezifische Gen-Datenbanken zur Ermittlung vorteilhafter Sequenzen verwendet werden, so z.B. vorteilhaft für Hefe die SGD-Datenbank (Cherry J. M. et al., Nucleic Acids Res. 1998, Vol. 26, 73-80) oder die MI PS-Datenbank (Mewes H.W. et al., Nucleic Acids Res. 1999, Vol. 27, 44-48), für E. coli die GenProtEC-Datenbank
(http://web.bham.ac.uk/bcm4ght6/res.html), für Arabidopsis die TAIR-Datenbank (Huala, E. et al., Nucleic Acids Res. 2001 Vol. 29(1), 102-5) oder die MIPS-Datenbank.
Um das Einbringen der Nukieinsäuresequenzen und die Expression der Sequenzen in den transgenen Organismen, die im Verfahren verwendet werden, zu verbessern, werden die Nuk- leinsäuresequenzen in ein Nukleinsäurekonstrukt und/oder einen Vektor eingebaut. Zusätzlich zu den im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten oben beschriebenen Sequenzen können im Nukleinsäurekonstrukt bzw. im Vektor noch weitere Nukieinsäuresequenzen vorteilhaft von Biosynthesegene der im Verfahren hergestellten Aminosäure vorhanden sein, die zusammen in den Organismus eingebracht werden. Diese zusätzlichen Sequenzen können aber auch direkt oder über andere getrennte Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren in die Organismen eingebracht werden. Vorteilhaft werden Gene, die für Threonin-Aldolasen oder Lysin-Decarboxylase codieren, allein oder in Kombination in einen Organismus vorteilhaft einen Mikroorganismus oder einer Pflanze eingebracht.
Bei den im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukieinsäuresequenzen handelt es sich um isolierte Nukieinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit Threonin-Aldolase-Aktivität oder Lysin-Decarboxylase-Aktivität codieren.
Unter Nukleinsäuren sind im erfindungsgemäßen Verfahren DNA oder RNA-Sequenzen, die einzel- oder doppelsträngig sein oder gegebenenfalls synthetische, nicht natürliche oder veränderte, in DNA oder RNA einbaubare Nukleotidbasen aufweisen können, zu verstehen.
Der Begriff "Expression" meint die Transkription und/oder Translation eines kodogenen Ge- nabschnitts bzw. Gens. In der Regel ist das resultierende Produkt ein Protein. Zu den Produkten gehören aber auch funktioneile RNAs wie z.B. Ribozyme. Die Expression kann systemisch oder lokal, z.B. auf bestimmte Zelltypen, Gewebe oder Organe beschränkt, erfolgen.
Die Expressionsprodukte der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren z.B. der kodogenen Genabschnitte (ORFs) und ihrer regulatorischen Elemente lassen sich durch ihre Funktion kennzeichnen. Hierzu gehören beispielsweise Funktionen in den Bereichen Metaboiismus, Energie, Transkription, Proteinsynthese, Proteinprozessierung, zellulärer Transport und Transportmechanismen, zelluläre Kommunikation und Signaltransduktion, Zellrettung, Zellverteidigung und Zellvirulenz, Regulation der zellulären Umgebung und Interaktion der Zelle mit ihrer Umgebung, Zellschicksal, transponierbare Elemente, virale Proteine und Plasmidpro- teine, zelluläre Organisationskontrolle, subzelluläre Lokalisation, Regulation der Proteinaktivität, Proteine mit Bindungsfunktion oder Cofaktor-Erfordernis und Transporterleichterung. Gene gleicher Funktion werden zu sogenannten funktioneilen Genfamilien zusammengefasst.
Durch die biologische Aktivität der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die für Polypeptide mit Threonin-Aldolase-Aktivität oder Lysin-Decarboxylase-Aktivität codie- ren, können unterschiedliche Aminosäuren hergestellt bzw. deren Herstellung verbessert und/oder gesteigert werden. Je nach Auswahl des für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Organismus beispielsweise eines Mikroorganismus oder einer Pflanze lassen sich Mischungen der verschiedenen Aminosäuren herstellen. Vorteilhaft wird im erfindungsgemäßen Verfahren L-Lysin und/oder L-Methionin als Aminosäure oder Aminosäuregemisch hergestellt. Besonders bevorzugt wird im Verfahren L-Methionin hergestellt. Diese hergestellten Aminosäuren können in den Zellen der transgenen Organismen als freie Aminosäuren und/oder gebunden in Proteinen vorliegen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren sind unter transgenen Organismen wenn es sich um Pflanzen handelt auch Pflanzenzellen, -gewebe, -organe wie Wurzel, Spross, Stängel, Same, Blüte, Knolle oder Blatt oder ganze Pflanzen zu verstehen, die zur Herstellung von Aminosäuren angezüchtet werden. Unter Anzucht ist beispielsweise die Kultivierung der transgenen Pflanzenzellen, -gewebe oder -organe auf oder in einem Nährmedium oder der ganzen Pflanze auf bzw. in einem Substrat beispielsweise in Hydrokultur, Blumentopferde oder auf einem Ackerboden zu verstehen.
Werden Pflanzen im erfindungsgemäßen Verfahren als Spenderorganismus gewählt, so kann diese Pflanze im Prinzip eine beliebige phylogenetische Verwandtschaft mit der Empfängerpflanze aufweisen. So können Spender- und Empfängerpflanze derselben Familie, Gattung, Spezies, Sorte oder Linie angehören, wobei sich eine zunehmende Homologie zwischen den zu integrierenden Nukleinsäuren und entsprechenden Teilen des Genoms der Empfängerpflanze ergibt. Gleiches gilt auch für Mikroorganismen als Spender- und Empfängerorganismus.
Vorteilhaft wird im erfindungsgemäßen Verfahren eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 und/oder SEQ ID NO: 25 dargestellten Sequenz, Nukleinsäurese- quenzen, die sich von den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO; 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 ableiten, oder deren Derivat oder Homologe, die für Polypeptide codieren, die noch die enzymatische Aktivität bzw. biologische Aktivität besitzen, verwendet. Diese Sequenzen werden einzeln oder in Kombination in Expressionskonstrukte cloniert. Diese Expressionskonstrukte ermöglichen eine optima- le Synthese der im erfindungsgemäßen Verfahren produzierten Aminosäuren.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens einer Zelle, die die im Verfahren verwendeten Nukieinsäuresequenzen, die für ein Enzym mit Threonin-Aldolase-Aktivität oder Lysin-Decarboxylase-Aktivität codieren, enthält, wobei eine Zelle mit den Nukieinsäuresequenzen, einem Genkonstrukt (= Nukleinsäurekonstrukt) oder einem Vektor, welche die Expression der Aldolase- oder Decarboxylase-Nukleinsäure allein oder in Kombination mit anderen Genen bzw. Sequenzen herbeiführen, transformiert wird. Bei einerweiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst dieses Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens der Aminosäure(n) bzw. des Aminosäuregemisches aus der Kultur und/oder dem Organismus. Die so hergestellte Zelle ist vorteilhaft eine Zelle einer wie oben als vorteilhaft beschriebenen Pflanze oder eines Mikroorganismus.
Unter transgenem Organismus wie einer Pflanze oder eines transgenen Mikroorganismus im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, dass die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom eines Organismus sind, dabei können die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Transgen bedeutet aber auch, dass die erfindungs- gemäßen Nukleinsäuren an ihrem natürlichen Platz im Genom eines Organismus sind, dass jedoch die Sequenz gegenüber der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder das die Regulationssequenzen, der natürlichen Sequenzen verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren an nicht natürlicher Stelle im Genom zu verstehen, das heißt eine homologe oder bevorzugt heterologe Expression der Nukleinsäuren liegt vor. Die Expression kann dabei transient oder von einer stabil im Genom integrieten Sequenz aus erfolgen. Bevorzugte transgene Pflanzen sind beispielhaft folgende Pflanzen, ausgewählt aus den Familien Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Malva- ceae, Nymphaeaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Salicaceae, Solanaceae, Arecaceae, Brome- liaceae, Cyperaceae, Iridaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Gentianaceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae, Carifolaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Caryophyllaceae, Ericaceae, Polygonaceae, Violaceae, Juncaceae oder Poaceae bevorzugt einer Pflanze ausgewählt aus den Gruppe der Familien Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Solanaceae, Liliaceae oder Poaceae. Weitere vorteilhafte bevorzugte Pflanzen sind Nutzpflanzen vorteilhaft ausgewählt aus der Gruppe der Gattung der Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Safflor (Färberdistel), Olive, Sesam, Haselnuss, Mandel, Avoca- do, Lorbeer, Kürbis, Lein, Soja, Pistazien, Borretsch, Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Hirse, Triti- cale, Reis, Gerste, Maniok, Kartoffel, Zuckerrübe, Aubergine, Alfaalfa sowie ausdauernde Gräser und Futterfeldfrüchte, Ölpalme, Gemüse (Kohlgemüse, Wurzelgemüse, Knollengemüse, Hülsengemüse, Fruchtgemüse, Zwiebelgemüse, Blatt- und Stielgemüse), Buchweizen, Topinambur, Ackerbohne, Wicken, Linse, Buschbohne, Lupine, Klee und Luzerne.
Der erfindungsgemäß verwendete Begriff "transgene Pflanze" bezieht sich auch auf die Nachkommenschaft einer transgenen Pflanze, z.B. die T-p, T2-, T3- und nachfolgende Pflanzengenerationen oder die BC-p, BC2-, BC3- und nachfolgende Pflanzengenerationen. So können die er- findungsgemäßen transgenen Pflanzen aufgezogen und mit sich selbst oder anderen Individuen gekreuzt werden, um weitere erfindungsgemäße transgene Pflanzen zu erhalten. Auch können transgene Pflanzen durch vegetative Propagation transgener Pflanzenzellen erhalten werden. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch von einer erfindungsgemäßen Population transgener Pflanzen ableitbares transgenes pflanzliches Material. Hierzu gehören Pflanzenzel- len und bestimmte Gewebe, Organe und Teile von Pflanzen in all ihren Erscheinungsformen, wie Samen, Blätter, Antheren, Fasern, Wurzeln, Wurzelhaare, Stängei, Embryos, Kaili, Kotely- donen, Petiolen, Erntematerial, pflanzliches Gewebe, reproduktives Gewebe und Zellkulturen, das von der eigentlichen transgenen Pflanze abgeleitet ist und/oder dazu verwendet werden kann, die transgene Pflanze hervorzubringen.
Transgene Pflanzen, die die im erfindungsgemäßen Verfahren synthetisierten Aminosäuren enthalten, können direkt vermarktet werden ohne die synthetisierten Verbindungen zu isolieren. Unter Pflanzen im erfindungsgemäßen Verfahren sind alle Pflanzenteile, Pflanzenorgane wie Blatt, Stiel, Wurzel, Knollen oder Samen oder die gesamte Pflanze zu verstehen. Der Samen umfasst dabei alle Samenteile wie die Samenhüllen, Epidermis- und Samenzellen, Endosperm oder Embyrogewebe. Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Aminosäuren bzw. die vorteilhaft hergestellte Aminosäure L-Methionin können aber auch aus den Pflanzen in Form ihrer freien Aminosäuren oder gebunden in Proteinen isoliert werden. Durch dieses Verfahren hergestellte Aminosäuren lassen sich durch Ernten der Organismen entweder aus der Kultur, in der sie wachsen, oder vom Feld ernten. Dies kann über Pressen, Mahlen und/oder Extraktion, Salzfällung und/oder lonenaustauscherchromatographie der Pflanzenteile bevorzugt der Pflanzensamen, -fruchte, -knollen etc. erfolgen.
Auf diese Weise können mehr als 50 Gew.-%, vorteilhaft mehr als 60 Gew.-%, bevorzugt mehr als 70 Gew.-%, besonders bevorzugt mehr als 80 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt mehr als 90 Gew.-% der im Verfahren hergestellten Aminosäuren isoliert werden. Anschließend können die so erhaltenen Aminosäuren ggf. weiter gereinigt, falls gewünscht mit anderen Wirkstoffer) wie Vitaminen, Aminosäuren, Kohlenhydraten, Antibiotika etc. abgemischt werden und gegebe- nenfalls formuliert werden.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Verwendung der im Verfahren hergestellten Aminosäuren oder der transgenen Organismen in Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kos- metika oder Pharmazeutika.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren können nach Einbringung in eine Pflanzenzelle bzw. Pflanze entweder im Piastidengenom oder bevorzugt in das Genom der Wirtszelle integriert sein auch eine transiente Expression ist möglich und kann vorteilhaft verwendet werden. Auch eine Produktion durch beispielsweise eine Virusinfektion mit rekombinanten Virus ist prinzipiell möglich, dabei wird vorteilhaft die Expression des Gens bzw. der Gene erhöht. Bei Integration in das Genom kann die Integration zufallsgemäß sein oder durch derartige Rekombination erfolgen, dass das native Gen durch die eingebrachte Kopie ersetzt wird, wodurch die Produktion der gewünschten Verbindung durch die Zelle moduliert wird, oder durch Verwendung eines Gens in trans, so dass das Gen mit einer funktioneilen Expressionseinheit, welche mindestens eine die Expression eines Gens gewährleistende Sequenz und mindestens eine die Polyadeny- lierung eines funktionell transkribierten Gens gewährleistende Sequenz enthält, funktionell ver- bunden ist. Vorteilhaft werden die Nukleinsäuren über Multiexpressionskassetten oder Konstruk- te zur multiparallelen Expression von Genen in die Pflanzen gebracht. In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform wird die Nukleinsauresequenz in einer einfachen Expressionskassette oder einem einfachen Konstrukt, das heißt ohne weitere andere Nukieinsäuresequenzen in die Pflanze eingebracht. Bevorzugt werden heterologe Nukieinsäuresequenzen eingebracht. Unter der Verwendung von Klonierungsvektoren in Pflanzen und bei der Pflanzentransformation, wie denjenigen, die veröffentlicht sind in und dort zitiert sind: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1 , Engineering and Utili- zation, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Bioi. 42 (1991), 205-225)), lassen sich die Nukleinsäuren zur gentechnologischen Veränderung eines breiten Spektrums an Pflanzen verwenden, so dass diese ein besserer oder effizienterer Produ- zent von den im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Aminosäuren wird. Diese verbesserte Produktion oder Effizienz der Produktion der Aminosäuren oder davon abgeleitete Produkte, wie veränderte Proteine, kann durch direkte Wirkung der Manipulation oder eine indirekte Wirkung dieser Manipulation hervorgerufen werden.
Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die die Veränderung des im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Threonin-Aldolase- oder Lysin-Decarboxylase-Proteins die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der Aminosäuren aus einer den transgenen Pflanzen oder den Mikroorganismen wie einer Hefe, einem Pilz oder einem Bakterium aufgrund eines veränderten Proteins direkt beeinflussen kann. Die Anzahl oder Aktivität des Threonin-Aldolase- oder Lysin-Decarboxylase-Proteins oder -Gens kann erhöht sein, so dass durch diese Enzymak- tivität größere Mengen des gewünschtes Produkts de novo hergestellt werden, weil den Organismen beispielsweise die eingebrachte enzymatische Aktivität und damit die Fähigkeit zur Erhöhung der Biosynthese vor dem Einbringen des entsprechenden Gens fehlte. Es kann aber auch die Expression des natürlich in den Organismen vorhandenen Gens beispielsweise durch eine veränderte Regulation des Gens erhöht werden oder es kann die Stabilität der mRNA oder des Genproduktes, das heißt der Aldolase oder der Carboxylase erhöht werden. Entsprechendes gilt für die Kombination mit weiteren für die Synthese der Aminosäuren nützlichen Enzymen aus dem Biosynthesestoffwechsel. Auch die Verwendung verschiedener divergenter, d.h. auf DNA-Sequenzebene unterschiedlicher Sequenzen kann dabei vorteilhaft sein bzw. die Verwendung von Promotoren zur Genexpression, die eine andere zeitliche Genexpression ermöglicht.
Durch das Einbringen eines Threonin-Aldolase- oder Lysin-Decarboxylase-Gens oder mehrerer Aldolase- und/oder Decarboxylase-Gene in einen Organismus allein oder in Kombination mit anderen Genen kann nicht nur der Biosynthesefluss zum Endprodukt erhöht werden, sondern auch eine im Organismus vorhandene Produkt-Zusammensetzung erhöht, verändert oder de novo geschaffen werden. Ebenso kann die Anzahl oder Aktivität anderer Gene, die am Im- oder Export von Nährstoffen der Zelle(n), die zur Biosynthese der Aminosäuren nötig sind, erhöht sein, so dass die Konzentration dieser Vorläufer, Cofaktoren oder Zwischenverbindungen innerhalb der Zelle(n) oder innerhalb des Speicherkompartiments erhöht ist, wodurch die Fähigkeit der Zellen zur Produktion von Aminosäuren, wie im folgenden beschrieben, weiter gesteigert wird. Durch die Optimierung der Aktivität oder Erhöhung der Anzahl von Threonin-Aldolase- und/oder Lysin-Decarboxylasenukleinsäuresequenzen und/oder weiteren Genen, die an der Biosynthese der Aminosäuren beteiligt sind, oder durch Zerstören der Aktivität einer oder meh- rerer Gene, die am Abbau der Aminosäuren beteiligt sind, kann die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Aminosäuren im Wirtsorganismus wie der Pflanzen oder der Mikroorganismen gesteigert werden.
Durch diese Beeinflussung des Stoffwechsels lassen sich im erfindungsgemäßen Verfahren weitere vorteilhafte schwefelhaltige Verbindungen herstellen, die wenigstens ein Schwefelatom kovalent gebunden enthalten. Beispiele für derartige Verbindungen sind neben Methionin, Ho- mocystein, S-Adenosylmethionin, Cystein, vorteilhaft Methionin und S-Adenosylmethionin.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfassen die Begriffe „L-Methionin", „Methionin", „Homocystein" und „S-Adenosylmethionin" auch die korrespondierenden Salze, wie z. B. Methionin-Hydrochlorid oder Methionin-Sulfat. Die Bezeichnungen Methionin oder Threonin sollen auch die Bezeichnungen L-Methionin oder L-Threonin mit umfassen. Weiterhin sind Proteine umfasst, in die das im Verfahren hergestellte Methionin gebunden sind.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten isolierten Nukleinsäuremoleküle codieren für Proteine oder Teilen von diesen, wobei die Proteine oder das einzelne Protein oder Teilen davon eine Aminosäuresequenz enthält, die ausreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz der Sequenz SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 oder SEQ ID NO: 26 ist, so dass das Protein oder der Teil davon eine Threonin-Aldolase- oder Lysin-Decarboxylase-Aktivität beibehält. Vorzugsweise hat das Protein oder der Teil davon, das/der von dem Nukleinsäuremoiekül kodiert wird, seine wesentliche enzymatische bzw. biologische Aktivität und die Fähigkeit, am Stoffwechsel von Aminosäuren in Pflanzen oder Mikroorganismen bzw. allgemein am Pflanzen- oder
Mikroorganismenstoffwechsel oder am Transport von Molekülen über Membranen teilzunehmen. Vorteilhaft ist das von den Nukleinsäuremoiekülen kodierte Protein zu mindestens etwa 30 %, 35 %, 40 %, 45 % oder 50 %, vorzugsweise mindestens etwa 60 % und stärker bevorzugt mindestens etwa 70 %, 80 % oder 90 % und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr homolog zu einer Aminosäuresequenz der Sequenz SEQ ID NO: 2. Bevorzugt ist das Protein ein Volllängen-Protein, das im wesentlichen in Teilen homolog zu einer gesamten Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 oder SEQ ID NO: 26 (die von dem in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 gezeigten offenen Leserahmen herrührt) ist. Weitere vorteilhafte weitere im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nukieinsäuresequenzen leiten sich von den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 ab. Vorteilhaft sind die von diesen abgeleiteten Nukleinsäuremoleküle codierten Proteine zu mindestens etwa 70 % oder 75 %, vorzugsweise etwa mindestens 80 % oder 85 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 90 %, 91 %, 92 % oder 94 % und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr homolog zu den durch sie codierten Aminosäuresequenzen bzw. einer Aminosäuresequenz der Sequenz SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10. Im Sinne der Erfindung ist unter Homologie oder homolog, Identität oder identisch zu verstehen.
Unter wesentlicher enzymatischer bzw. biologischer Aktivität der verwendeten Enzyme ist zu verstehen, dass sie gegenüber den durch die Sequenzen mit SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 oder den von den Sequenzen SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 abgeleiteten Sequenzen und deren Derivate codierten Proteinen/Enzymen im Vergleich noch mindestens eine enzymatische bzw. biologische Aktivität von mindestens 10 %, bevorzugt 20 %, besonders bevorzugt 30 % und ganz besonders 40 % aufweisen und damit am Stoffwechsel von Aminosäuren in einer Pflanzen- oder Mikroorganismenzelle notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über Membranen teilnehmen können, wobei vorteilhaft die Aminosäuren Methionin oder Lysin gemeint sind.
Im Verfahren verwendbare Nukleinsäuren stammen vorteilhaft aus Hefen wie der Familie Sac- charomycetaceae wie der vorteilhaften Gattung Saccharomyces oder Hefegattungen wie Candida, Hansenula, Rhodotorula oder Schizosaccharomyces und der besonders vorteilhaften Gat- tung und Art Saccharomyces cerevisiae. Ihre Sequenz ist unter den EMBL-Accession Nummern Z49330, Y13136 bzw. YJL055W in der EMBL-Datenbank als „hypothetical 26.9 kDa Protein oder U18779, L10830 bzw. U00092 in der EMBL-Datenbank als Produkt Glylp (protein required for glycine prototrophy), CDS compiement (14603..15766), mit der Protein ID ="AAB64996.1" und db_xref="GI: 603634" hinterlegt.
Alternativ können im erfindungsgemäßen Verfahren isolierte Nukleotidsequenzen verwendet werden, die für putative Aldolasen oder Decarboxylasen codieren und die an eine Nukleotidse- quenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 oder in einer anderen vorteilhaften Ausführungsform an eine Sequenz, die sich von den Sequenzen SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 ableitet, hybridisieren, z.B. unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Die Hybridisierung sollte vorteilhaft mit Fragmenten von einer Länge von mindestens 200 bp, vorteilhaft mindestens 400 bp, bevorzugt mindestens 600 bp, besonders bevorzugt von mindestens 800 bp, ganz besonders bevorzugt von mindestens 1000 bp durchgeführt werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sollte die Hybridisierung mit der gesamten Nuklein- säuresequenz durchgeführt werden.
Die im Verfahren verwendeten Nukieinsäuresequenzen werden vorteilhaft in einer Expressionskassette (= Nukleinsäurekonstrukt), die die Expression der Nukleinsäuren in einem Organismus vorteilhaft einer Pflanze oder einem Mikroorganismus ermöglicht, eingebracht.
Zum Einbringen wird der kodogene Genabschnitt vorteilhaft einer Amplifikation und Ligation in bekannter Weise unterworfen. Vorzugsweise geht man in Anlehnung an das Protokoll der Pfu- DNA-Polymerase oder eines Pfu/Taq-DNA-Polymerasegemisches vor. Die Primer werden in Anlehnung an die zu amplifizierende Sequenz gewählt. Zweckmäßigerweise sollten die Primer so gewählt werden, dass das Amplifikat die gesamte kodogene Sequenz vom Start- bis zum Stop-Kodon umfasst. Im Anschluss an die Amplifikation wird das Amplifikat zweckmäßigerweise analysiert. Beispielsweise kann die Analyse nach gelelektrophoretischer Auftrennung hinsichtlich Qualität und Quantität erfolgen. Im Anschluss kann das Amplifikat nach einem Standardprotokoll gereinigt werden (z.B. Qiagen). Ein Aliquot des gereinigten Amplifikats steht dann für die nachfolgende Klonierung zur Verfügung. Geeignete Klonierungsvektoren sind dem Fachmann allgemein bekannt. Hierzu gehören insbesondere Vektoren, die in bakteriellen Systemen replizierbar sind, also vor allem Vektoren, die eine effiziente Klonierung in E. coli gewährleisten, und die stabile Transformation von Pflanzen ermöglichen. Zu nennen sind insbesondere verschiedene für die T-DNA-vermittelte Transformation geeignete, binäre und co-integrierte Vektorsysteme. Derartige Vektorsysteme sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest die für die Agrobakterium-vermittelte Transformation benötigten vir-Gene sowie die T-DNA begrenzen- den Sequenzen (T-DNA-Border) beinhalten. Vorzugsweise umfassen diese Vektorsysteme auch weitere cis-regulatorische Regionen wie Promotoren und Terminatoren und/oder Selektions- marker, mit denen entsprechend transformierte Organismen identifiziert werden können. Während bei co-integrierten Vektorsystemen vir-Gene und T-DNA-Sequenzen auf demselben Vektor angeordnet sind, basieren binäre Systeme auf wenigstens zwei Vektoren, von denen einer vir- Gene, aber keine T-DNA und ein zweiter T-DNA, jedoch kein vir-Gen trägt. Dadurch sind letztere Vektoren relativ klein, leicht zu manipulieren und sowohl in E.-coli als auch in Agrobacterium zu replizieren. Zu diesen binären Vektoren gehören Vektoren der Serien pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. Erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV und pCAMBIA. Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung gibt Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5, 446-451. Für die Vektorpräparation können die Vektoren zunächst mit Restriktionsendonuklease(n) linearisiert und dann in geeigneter Weise enzy- matisch modifiziert werden. Im Anschluss wird der Vektor gereinigt und ein Aliquot für die Klo- nierung eingesetzt. Bei der Klonierung wird das enzymatisch geschnittenen und erforderlichenfalls gereinigten Amplifikat mit ähnlich präparierten Vektorfragmenten mit Einsatz von Ligase kloniert. Dabei kann ein bestimmtes Nukleinsäurekonstrukt bzw. Vektor- oder Plasmidkonstrukt einen oder auch mehrere kodogene Genabschnitte aufweisen. Vorzugsweise sind die kodoge- nen Genabschnitte in diesen Konstrukten mit regulatorischen Sequenzen funktional verknüpft. Zu den regulatorischen Sequenzen gehören insbesondere pflanzliche Sequenzen wie die oben beschriebenen Promotoren und Terminatoren. Die Konstrukte lassen sich vorteilhafterweise in Mikroorganismen, insbesondere Escherichia coli und Agrobacterium tumefaciens, unter selektiven Bedingungen stabil propagieren und ermöglichen einen Transfer von heterologer DNA in Pflanzen oder andere Mikroorganismen. Gemäß einer besonderen Ausführungsform basieren die Konstrukte auf binären Vektoren (Übersicht zu binären Vektoren in Hellens et al., 2000). Diese beinhalten in der Regel prokaryotische regulatorische Sequenzen, wie Repiikation- sursprung und Selektionsmarker, zur Vermehrung in Mikroorganismen wie Escherichia coli und Agrobacterium tumefaciens, und Agrobakterium-T-DNA-Sequenzen zwecks Transfer von DNA in Pflanzengenome. Von der gesamtern T-DNA-Sequenz aus Agrobacterium wird zumindest die rechte, etwa 25 Basenpaare umfassende Border-Sequenz benötigt. Gewöhnlich beinhalten die erfindungsgemäßen Vektorkonstrukte T-DNA-Sequenzen sowohl aus dem rechten wie auch aus dem linken Begrenzungsbereich, welche zweckmäßige Erkennungsstellen für ortsspezifisch agierende Enzyme, die wiederum von einem Teil der vir-Gene kodiert werden, beinhalten. Ge- eignete Wirtsorganismen sind dem Fachmann bekannt. Vorteilhafte Organismen sind in" dieser Anmeldung weiter oben beschrieben. Hierzu zählen vor allem bakterielle Wirte, von denen einige bereits oben im Rahmen von Spender-Mikroorganismen genannt sind, z.B. Mikroorganismen wie Pilze wie die Gattung Claviceps oder Aspergillus oder gram-positive Bakterien wie die Gattungen Bacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Brevibacterium, Rhodococcus, Nocardia, Ca- seobacter oder Arthrobacter oder gram-negative Bakterien wie die Gattungen Escherichia, Fla- vobacterium oder Salmonella oder Hefen wie die Gattungen Rhodotorula, Hansenula oder Candida. Besonders vorteilhaft sind Organismen ausgewählt aus der Gruppe der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia, Bacillus, Rhodotorula, Hansenula, Candida, Claviceps oder Flavobacterium. Gans besonders vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfah- ren Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe der Gattungen und Arten bestehend aus Hansenula anomala, Candida utilis, Claviceps purpurea, Bacillus circulans, Bacillus subtilis, Bacillus sp., Brevibacterium albidum, Brevibacterium album, Brevibacterium cerinum, Brevibacterium fiavum, Brevibacterium glutamigenes, Brevibacterium iodinum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium linens, Brevibacterium roseum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium sp., Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum (= Micrococcus glutamicum), Corynebacterium melassecola, Corynebacterium sp. oder Escherichia coli speziell Escherichia coli K12 und dessen beschriebene Stämme verwendet. Erfindungsgemäß vorteilhaft bevorzugt sind Wirtsorganismen der Gattung Escherichia, insbesondere Escherichia coli, und Agrobacterium, insbesondere Agrobacterium tumefaciens oder Pflanzen ausgewählt aus den Familien Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaceae, Papaveraceae, Rosa- ceae, Salicaceae, Solanaceae, Arecaceae, Bromeliaceae, Cyperaceae, Iridaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Gentianaceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae, Carifolaceae, Rubia- ceae, Scrophulariaceae, Caryophyllaceae, Ericaceae, Polygonaceae, Violaceae, Juncaceae oder Poaceae bevorzugt einer Pflanze ausgewählt aus den Gruppe der Familien Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Solanaceae, Liliaceae oder Poaceae. Weitere vorteilhafte bevorzugte Pflanzen sind Nutzpflanzen vorteilhaft ausgewählt aus der Gruppe der Gattung der Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Safflor (Färberdistel), Olive, Sesam, Haselnuss, Mandel, Avocado, Lorbeer, Kürbis, Lein, Soja, Pistazien, Borretsch, Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Hirse, Triticale, Reis, Gerste, Maniok, Kartoffel, Zuckerrübe, Futterrübe, Aubergine sowie ausdauernde Gräser und Futterfeldfrüchte, Ölpalme, Gemüse (Kohlgemüse, Wurzelgemüse, Knollengemüse, Hülsengemüse, Fruchtgemüse, Zwiebelgemüse, Blatt- und Stielgemüse), Buchweizen, Topinambur, Ackerbohne, Wicken, Linse, , Alfaalfa, Buschbohne, Lupine, Klee und Luzerne. Zum Einbringen der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren in eine Pflanze hat es sich als vorteilhaft erwiesen diese zunächst in einen Zwischenwirt, z.B. ein Bakterium, zu übertragen. Als zweckmäßig hat sich hierbei die Transformation in E. coli erwiesen, die in an sich bekannter Weise, z.B. mittels Hitzeschock oder Elektroporation, durchgeführt werden kann. So können die transformierten E. coli- Kolonien hinsichtlich der Klonierungseffizienz untersucht werden. Dies kann mit Hilfe einer PCR erfolgen. Dabei kann sowohl die Identität als auch die Integrität des Plasmidkonstrukts anhand einer definierten Kolonienzahl überprüft werden, indem man ein Aliquot der Kolonien besagter PCR unterwirft. Hierfür werden in der Regel universelle, von Vektorsequenzen abgeleitete Primer eingesetzt, wobei der forward-Primer stromaufwärts vom Start-ATG und der reverse-Primer stromabwärts vom Stop-Kodon des kodogenen Genabschnitts angeordnet ist. Die Amplifikate werden elektrophoretisch aufgetrennt und hinsichtlich Quantität und Qualität bewertet. Wird ein Fragment in der entsprechenden Größe detektiert, erfolgt eine positive Bewertung. Die gegebe- nenfalls überprüften Plasmidkonstrukte werden anschließend für die Transformation der Pflanzen verwendet. Hierfür kann es zunächst erforderlich sein, die Konstrukte aus dem Zwischenwirt zu gewinnen. Beispielsweise lassen sich die Konstrukte als Plasmide aus bakteriellen Wirten in Anlehnung an eine herkömmliche Plasmidisolierung gewinnen. Es sind zahlreiche Verfahren zur Transformation von Pflanzen bekannt. Da erfindungsgemäß eine stabile Integration heterologer DNA in das Genom von Pflanzen von Vorteil ist, hat sich insbesondere die T-DNA-vermittelte Transformation als zweckmäßig erwiesen. Hierzu ist es zunächst erforderlich, geeignete Vehikel, insbesondere Agrobakterien, mit dem kodogenen Genabschnitt bzw. dem entsprechenden Plasmidkonstrukt zu transformieren. Dies kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Beispiels- weise kann man das obigen Ausführungen entsprechend erzeugte Plasmidkonstrukt mittels Elektroporation oder Hitzeschock in kompetente Agrobakterien transformieren. Prinzipiell ist hierbei zwischen der Bildung co-integrierter Vektoren einerseits und der Transformation mit binären Vektoren zu unterscheiden. Bei der ersten Alternative weisen die den kodogenen Genschnitt umfassenden Vektorkonstrukte keine T-DNA-Sequenzen auf, sondern die Bildung der co-integrierten Vektoren erfolgt in den Agrobakterien durch homologe Rekombination des Vektorkonstruktes mit T-DNA. Die T-DNA liegt in den Agrobakterien in Form von Ti- oder Ri- Plasmiden, in denen die Onkogene zweckmäßigerweise durch exogene DNA ersetzt wurden, vor. Verwendet man binäre Vektoren, so können diese durch bakterielle Konjugation oder direk- ten Transfer auf Agrobakterien übertragen werden. Diese Agrobakterien enthalten zweckmäßigerweise bereits den Vektor, der die vir-Gene trägt (häufig als Helfer-Ti(Ri)-Plasmid bezeichnet). Zusammen mit dem Plasmidkonstrukt und der T-DNA können zweckmäßigerweise auch ein oder mehrere Marker verwendet werden, anhand derer die Selektion transformierter Agrobakterien und transformierter Pflanzenzellen möglich ist. Für diesen Zweck wurde eine Vielzahl von Markern entwickelt. Hierzu gehören beispielsweise solche, die eine Resistenz gegen Chlo- ramphenicol, Kanamycin, dem Aminoglykosid G418, Hygromycin und ähnliches verleihen.. In der Regel ist es erwünscht, dass die Plasmidkonstrukte an einer oder beiden Seiten des kodogenen Genabschnitts durch T-DNA flankiert sind. Dies ist insbesondere dann von Nutzen, wenn Bakterien der Arten Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes für die Trans- formation verwendet werden. Eine erfindungsgemäß bevorzugte Methode ist die Transformation mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens. Aber auch biolistische Methoden können vorteilhaft zum Einbringen der. Sequenzen im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, auch das Einbringen mittels PEG ist möglich. Die transformierten Agrobakterien können in an sich bekannter Weise kultiviert werden und stehen damit für eine zweckmäßige Transformation der Pflanzen bereit. Die zu transformierenden Pflanzen oder Pflanzenteile werden in herkömmlicher Weise angezogen bzw. bereitgestellt. Anschließend lässt man die transformierten Agrobakterien so lange auf die Pflanzen bzw. Pflanzenteile einwirken, bis eine hinreichende Transformationsrate erreicht ist. Das Einwirken der Agrobakterien auf die Pflanzen bzw. Pflanzenteile kann in unterschiedlicher Art und Weise erfolgen. Beispielsweise kann man eine Kultur morphogener pflanzlicher Zellen oder Gewebe verwenden. Im Anschluss an den T-DNA-Transfer werden die Bakterien in der Regel durch Antibiotika eliminiert und die Regeneration pflanzlichen Gewebes induziert. Insbesondere verwendet man hierzu geeignete pflanzliche Hormone, um nach anfänglicher Kallus-Bildung die Sprossentwicklung zu fördern. Eine vorteilhafte Transformationsmethode ist die Transformation in planta. Hierzu kann man beispielsweise die Agrobakterien auf pflanzliche Samen einwirken lassen oder Pflanzenmeristem mit Agrobakterien inokulieren. Erfindungsgemäß hat es sich insbesondere als zweckmäßig erwiesen, eine Suspension transformierter Agrobakterien auf die gesamte Pflanze oder zumindest die Blütenanlagen einwirken zu lassen. Diese wird anschließend weiter angezogen, bis Samen der behandelten Pflanze gewon- nen werden (Clough und Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Zur Auswahl transformierter Pflanzen wird das aus der Transformation gewonnene pflanzliche Material in der Regel selektiven Bedingungen unterworfen, so dass transformierte von nichttransformierten Pflanzen unterschieden werden können. Beispielsweise können die in der vorstehend beschriebenen Art und Weise gewonnenen Samen erneut ausgebracht und nach Anzucht einer geeigneten Sprühselektion unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Samen, erforderlichenfalls nach Sterilisation, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsagens so anzuziehen, dass lediglich die transformierten Samen zu Pflanzen anwachsen können. Weitere vorteilhafte Transformationsmethoden insbesondere von Pflanzen sind dem Fachmann bekannt und werden im folgenden beschrieben.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die für im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Threonin-Aldolase und/oder Lysin-Decarboxylase codierenden Nukieinsäuresequenzen mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und die Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus (= transgener Organismus z.B. Pflanze oder Mikroorganismus) bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder übe- rexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Die Expressionskassette (= Expressionskonstrukt = Genkonstrukt = Nukleinsäurekonstrukt) kann aber auch einfa- eher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Nukleinsauresequenz oder dessen Derivate inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und/oder die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können in Form von Teilsequenzen (= Promotor mit Teilen der erfindungsgemäßen Nukieinsäuresequenzen) auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsauresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA- Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatori- sehe Elemente oder Terminatoren. Die Nukleinsäuresequenz(en), die für die Threonin-Aldolase- Proteine codiert(en), kann (können) in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette (= Nukleinsäurekonstrukt) enthalten sein. Vorteilhaft liegt nur jeweils eine Kopie der Gene in der Expressionskassette vor. Dieses Nukleinsäurekonstrukt oder die Nukleinsäurekonstrukte kön- nen zusammen im Wirtsorganismus exprimiert werden. Dabei kann das Nukleinsäurekonstrukt oder die Nukleinsäurekonstrukte in einem oder mehreren Vektoren inseriert sein und frei in der Zelle vorliegen oder aber im Genom inseriert sein, vorteilhaft. Im Falle von Pflanzen kann eine Integration ins Piastidengenom oder bevorzugt in das Zellgenom erfolgt sein. Es ist vorteilhaft für die Insertion weiterer Gene im Wirtsgenom, wenn die zu exprimierenden Gene zusammen in einem Genkonstrukt vorliegen.
Regulatorische Sequenzen sind in der Regel stromaufwärts (5'), innerhalb und/oder stromabwärts (3') in Bezug auf eine bestimmte Nukleinsäure bzw. einen bestimmten kodogenen Genabschnitts angeordnet. Sie kontrollieren insbesondere die Transkription und/oder Translation sowie die Transkriptstabilität des kodogenen Genabschnitts, gegebenenfalls in Zusammenspiel mit weiteren zelleigenen funktionellen Systemen wie dem Proteinbiosynthese-Apparat der Zelle.
Zu regulatorischen Sequenzen gehören vor allem stromaufwärts (5') angeordnete Sequenzen, welche insbesondere die Regulation der Transkriptionsinitiation betreffen, wie Promotoren, und stromabwärts (3') angeordnete Sequenzen, welche vor allem die Regulation der Transkripti- onstermination betreffen, wie Polyadenylierungssignale.
Grundsätzlich sind alle Promotoren einsetzbar, welche die Transkription von Genen in Organismen wie Mikroorganismen, Pflanzen oder Nicht-humanen Tieren stimulieren können. Geeignete in diesen Organismen funktionsfähige Promotoren sind allgemein bekannt. Es kann sich um konstitutive oder induzierbare Promotoren handeln. Geeignete Promotoren können in mehrzelli- gen Eukaryonten eine entwicklungs- und/oder gewebespezifisch Expression ermöglichen, so können in Pflanzen vorteilhaft Blatt-, Wurzel-, Blüten-, Samen-, Schließzellen- oder Fruchtspezifische Promotoren verwendet werden.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem z.B. Translationsenhancersequenzen eingeführt werden oder die Stabilität der RNA verbessert wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sind ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, die eine oder mehrere Nukieinsäuresequenzen enthalten, die durch SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 definiert sind und für die in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 oder SEQ ID NO: 26 wiedergegebenen Polypeptide kodieren. Eine weitere vorteilhafte Ausführungs- form der Erfindung sind ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, die eine oder mehrere Nukieinsäuresequenzen enthalten, die sich von den erfindungsgemäßen Sequenzen SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 ableiten lassen. Die genannten Polypeptide haben vorteilhaft eine Threo- nin-Aldolase- Aktivität. Gleiches gilt für ihre Homologen, Derivate oder Analoga, die funktionsfähig mit einem oder mehreren Regulationssignalen, vorteilhafterweise zur Steigerung der Genexpression, verbunden sind.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das neue Verfahren liegen beispielsweise in Promotoren vor, wie dem cos-, tac-, rha-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq"' T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder λ-PL-Promotor, die vorteilhafterweise in Gram-negativen Bakterien verwendet werden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen liegen beispielsweise in den Gram-positiven Promotoren amy, dnaK, xylS und SP02, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, UASH, MCB, PHO, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflan- zenpromotoren CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294, US 5,352,605], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, PGEL1, OCS [Leisner and Gelvin (1988) Proc Natl Aead Sei USA 85(5):2553-2557], Iib4, usp, mas [Comai et al. (1990) Plant Mol Biol 15 (3):373-381], STLS1 , ScBV Schenk et al. (1999) Plant Mol Biol 39(6):1221-1230, B33, SAD1 oder SAD2 (Flachspromotoren, Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696 - 1701) oder nos [Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20):7831-7846]. Auch die verschiedenen Ubiquitinpromotoren aus Arabidopsis [Callis et al.(1990) J. Biol. Chem., 265:12486- 12493; Holtorf S et al. (1995) Plant. Mol. Biol., 29:637-747], Pinus, Mais [(Ubi1 und Ubi2), US 5,510,474; US 6,020,190 und US 6,054574] oder Petersilie [Kawalleck et al., Plant Molecular Biology, 21, 1993: 673 - 684] oder Phaseolin-Promotor können vorteilhaft verwandt werden. In diesem Zusammenhang vorteilhaft sind ebenfalls induzierbare Promotoren, wie die in EP-A-0 388 186 (Benzylsulfonamid- induzierbar), Plant J. 2, 1992:397-404 (Gatz et al., Tetracyclin-induzierbar), EP-A-0 335 528 (Abzisinsäure-induzierbar) oder WO 93/21334 (Ethanol- oder Cyclohexenol-induzierbar) beschriebenen Promotoren. Weitere geeignete Pflanzenpromotoren sind der Promotor von cytoso- lischer FBPase oder der ST-LSI-Promotor der Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445), der Phosphoribosylpyrophosphatamidotransferase-Promotor aus Glycine max (Genbank- Zugangsnr. U87999) oder der in EP-A-0249676 beschriebene nodienspezifische Promotor. Besonders vorteilhafte Promotoren sind Promotoren, welche die Expression in spezifischen Geweben ermöglichen oder eine präferenzielle Expression in bestimmten Geweben zeigen. Vorteilhaft sind auch samenspezifische Promotoren, wie der ausführungsgemäße USP Promotor aber auch andere Promotoren wie der LeB4-, DC3-, SAD1-, Phaseolin- oder Napin- Promotor. Weitere besonders vorteilhafte Promotoren sind samenspezifische Promotoren, die für monokotyle oder dikotyle Pflanzen verwendet werden können und in US 5,608,152 (Napin- Promotor aus Raps), WO 98/45461 (Oleosin-Promotor aus Arabidopsis), US 5,504,200 (Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (Bce4-Promotor aus Brassica), von Baeumiein et al., Plant J., 2, 2, 1992:233-239 (LeB4-Promotor aus einer Leguminose) beschrieben sind, wobei sich diese Promotoren für Dikotyledonen eignen. Die folgenden Promotoren eignen sich beispielsweise für Monokotyledonen lpt-2- oder lpt-1 -Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230), Hordein-Promotor aus Gerste, der Ubiquitin-Promotor aus Mais und andere, in WO 99/16890 beschriebene geeignete Promotoren.
Es ist im Prinzip möglich, alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen, wie die oben genannten, für das neue Verfahren zu verwenden. Es ist ebenfalls möglich und vorteilhaft, zusätzlich oder alleine synthetische Promotoren zu verwenden, besonders wenn sie eine Samen-spezifische Expression vermitteln, wie z.B. beschrieben in WO 99/16890.
Um einen besonders effektiven Gehalt an Threonin-Aldolase- und/oder Lysin-Decarboxylase- Proteinen in transgenen Pflanzen zu erzielen, können die codierten Biosynthesegene vorteilhaft konstitutiv und/oder samen-, frucht- oder knollenspezifisch in Pflanzen exprimiert werden. In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können sie aber auch induzierbar exprimiert werden, so dass sie gezielt in einer gewünschten Wachstumsphase der Pflanze induziert und damit exprimiert werden. Hierzu können Samen-spezifische Promotoren verwendet werden, bzw. solche Promotoren die im Embryo und/oder im Endosperm aktiv sind. Samen-spezifische Promotoren können prinzipiell sowohl aus dikotolydonen als auch aus monokotolydonen Pflanzen isoliert werden. Im folgenden sind vorteilhafte bevorzugte Promotoren aufgeführt: USP (= unknown seed protein) und Vicilin (Vicia faba) [Bäumlein et al., Mol. Gen Genet., 1991, 225(3)], Napin (Raps) [US 5,608,152], Acyl-Carrier Protein (Raps) [US 5,315,001 und WO 92/18634], Oleosin (Arabidopsis thaliana) [WO 98/45461 und WO 93/20216], Phaseolin (Phaseolus vulgaris) [US 5,504,200], Bce4 [WO 91/13980], Leguminosen B4 (LegB4-Promotor) [Bäumlein et al., Plant J., 2,2, 1992], Lpt2 und lpt1 (Gerste) [WO 95/15389 u. WO95/23230], Samen-spezifische Promotoren aus Reis, Mais u. Weizen [WO 99/16890], Amy32b, Amy 6-6 und Aleurain [US 5,677,474], Bce4 (Raps) [US 5,530,149], Glycinin (Soja) [EP 571 741], Phosphoenol-Pyruvatcarboxylase
(Soja) [JP 06/62870], ADR12-2 (Soja) [WO 98/08962], Isocitratlyase (Raps) [US 5,689,040] oder ß-Amylase (Gerste) [EP 781 849].
Die Pflanzengenexpression lässt sich auch über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89- 108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Saiicylsäure-induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) und ein Ethanoi-induzierbarer Promotor.
Auch eine Expression spezifisch in Gymnospermen oder Angiospermen ist prinzipiell möglich Um eine stabile Integration im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukieinsäuresequenzen in Kombination mit weiteren Biosynthesegene in die transgene Pflanze über mehrere Generation sicherzustellen, sollte jede der im Verfahren .verwendeten Nukleinsäuren, die für die Aldolasen und/oder Decarboxylasen codieren, unter der Kontrolle eines eigenen bevorzugt eines unterschiedlichen Promotors exprimiert werden, da sich wiederholende Sequenzmotive zu Instabilität der T-DNA bzw. zu Rekombinationsereignissen bzw zu Silencing führen können. Die Expressionskassette ist dabei vorteilhaft so aufgebaut, dass einem Promotor eine geeignete Schnittstelle zur Insertion der zu expremierenden Nukleinsäure folgt vorteilhaft in einem Polylinker anschließend gegebenenfalls ein Terminator hinter dem Polylinker liegt. Diese Abfolge wie- derholt sich mehrfach bevorzugt drei-, vier- oder fünfmal, so dass bis zu fünf Gene in einem Konstrukt zusammengeführt werden und so zur Expression in die transgene Pflanze eingebracht werden können. Vorteilhaft wiederholt sich die Abfolge bis zu dreimal. Die Nukieinsäuresequenzen werden zur Expression über die geeignete Schnittstelle beispielsweise im Polylinker hinter den Promotor inseriert. Vorteilhaft hat jede Nukleinsauresequenz ihren eigenen Promotor und gegebenenfalls ihren eigenen Terminator. Es ist aber auch möglich mehrere Nukieinsäuresequenzen hinter einem Promotor und ggf. vor einem Terminator zu inserieren. Dabei ist die Insertionsstelle bzw. die Abfolge der inserierten Nukleinsäuren in der Expressionskassette nicht von entscheidender Bedeutung, das heißt eine Nukleinsauresequenz kann an erster oder letzter Stelle in der Kassette inseriert sein, ohne dass dadurch die Expression wesentlich beeinflusst wird. Es können in der Expressionskassette vorteilhaft unterschiedliche Promotoren wie beispielsweise der USP-, der LegB4-, der DC3-Promotor oder der Ubiquitin-Promotor aus Petersilie und unterschiedliche Terminatoren verwendet werden. Es ist aber auch möglich nur einen Promotortyp in der Kassette zu verwenden. Dies kann jedoch zu unerwünschten Rekombinationsereignissen oder Silencingeffekten führen. Eine weitere vorteilhafte Nukleinsauresequenz, die in Kombination mit den im Verfahren verwendeten Sequenzen und/oder den vorgenannten Biosynthesegenen exprimiert werden kann, ist die Sequenz für einen ATP/ADP-Translokator wie sie in WO 01/20009 beschrieben wird. Dieser ATP/ADP-Translokator führt zu einer Steigerung der Synthese der essentiellen Aminosäuren Lysin und/oder Methionin vorteilhaft von Methionin.
Wie oben beschrieben sollte die Transkription der eingebrachten Gene vorteilhaft durch geeig- nete Terminatoren am 3'-Ende der eingebrachten Biosynthesegene (hinter dem Stopcodon) abgebrochen werden. Verwendet werden kann hier z.B. der OCS1 Terminator. Wie auch für die Promotoren, so sollten hier für jedes Gen unterschiedliche Terminatorsequenzen verwendet werden.
Das Genkonstrukt kann, wie oben beschrieben, auch weitere Gene umfassen, die in die Orga- nismen eingebracht werden sollen. Es ist möglich und vorteilhaft, in die Wirtsorganismen Regulationsgene, wie Gene für Induktoren, Repressoren oder Enzyme, welche durch ihre Enzymaktivität in die Regulation eines oder mehrerer Gene eines Biosynthesewegs eingreifen, einzubrin- gen und darin zu exprimieren. Diese Gene können heterologen oder homologen Ursprungs sein. Weiterhin können vorteilhaft im Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt weitere Biosynthesegene enthalten sein oder aber diese Gene können auf einem weiteren oder mehreren weiteren Nukleinsäurekonstrukten liegen. Vorteilhaft werden als Biosynthesegene Gene des Aminosäu- restoffwechsels, der Glykolyse, des Tricarbonsäurestoffwechsels oder deren Kombinationen verwendet.
Dabei können die vorgenannten Polypeptide bzw. Enzyme in Kombination mit weiteren Genen in den Nukleinsäurekonstrukten oder Vektoren kloniert werden und zur Transformation von Mikroorganismen oder Pflanzen mithilfe von z.B. Agrobacterium eingesetzt werden.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem bei- spielsweise die Stabilität der mRNA verbessert oder eine Translationsenhancersequenz eingefügt wird. Die Expressionskassetten können prinzipiell direkt zum Einbringen in die Pflanze verwendet werden oder aber in einen Vektoren eingebracht werden.
Diese vorteilhaften Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, enthalten die im Verfahren verwendeten Nukleinsäure, die für Threonin-Aldolase- und/oder Lysin-Decarboxylase-Proteine codieren, oder ein Nukleinsäurekonstrukt, die die verwendeten Nukleinsäure allein oder in Kombination mit weiteren Genen wie den Biosynthesegenen des Aminosäurestoffwechsels enthält. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an welche es gebunden ist. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", welches für eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife steht, in die zusätzlichen DNA-Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA- Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren (z.B. Bakterienvektoren mit bakteriellem Replikationsursprung). Andere bevorzugte Vektoren werden vorteilhaft beim Einbringen in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden sind, steuern. Diese Vektoren werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Sie können, wie vorgenannt, autonom replizieren oder in das Wirtsgenom integriert sein. Gewöhnlich haben Expressionsvektoren, die für DNA- Rekombinationstechniken geeignet sind, die Form von Plasmiden. In der vorliegenden Be- Schreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch diese anderen Expressions- vektorformen, wie virale Vektoren, die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen. Femer soll der Begriff Vektor auch andere Vektoren, die dem Fachmann bekannt sind, wie Phagen, Viren, wie SV40, CMV, TMV, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA, umfassen.
Die im Verfahren vorteilhaft verwendeten rekombinanten Expressionsvektoren umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt in einer Form, die sich zur Expression der verwendeten Nukleinsäuren in einer Wirtszelle eignen, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere Regulationssequenzen, ausgewählt auf der Basis der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen, die mit der zu expremierenden Nukleinsauresequenz funktionsfähig verbunden ist, umfasst. In einem rekombinanten Expressionsvektor bedeutet "funktionsfähig verbunden", dass die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die Regulationssequenz(en) gebunden ist, dass die. Expression der Nukleotidsequenz möglich ist und sie aneinander gebunden sind, so dass beide Sequenzen die vorhergesagte, der Sequenz zugeschriebene Funktion erfüllen (z.B. in einem In-vitro- Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht wird). Der Begriff "Regulationssequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z.B. Polyadenylierungssignale) umfassen. Diese Regulationssequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), oder siehe: Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, Hrsgb.: Glick und Thompson, Kapitel 7, 89-108, einschließlich der Literaturstellen darin. Regulationssequenzen umfassen solche, welche die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen steuern, und solche, welche die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen unter bestimmten Bedingungen steuern. Der Fachmann weiß, dass die Gestaltung des Expressionsvektors von Faktoren, wie der Auswahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Ausmaß der Expression des gewünschten Proteins usw., abhängen kann.
Die verwendeten rekombinanten Expressionsvektoren können speziell zur Expression von im Verfahren verwendeten Nukieinsäuresequenzen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen ausgestaltet sein. Dies ist vorteilhaft, da häufig Zwischenschritte der Vektorkonstruktion der einfachheithalber in Mikroorganismen durchgeführt werden. Beispielsweise können die Aminosäure-, Lysin-Decarboxylase- und/oder Threonin-Aldoalse-Gene in bakteriellen Zellen, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefe- und anderen Pilzzellen [siehe Romanos, M.A., et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8:423- 488; van den Hondel, C.A.M.J.J., et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi", in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, Hrsgb., S. 396-428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) "Gene trans- fer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F., et al., Hrsgb., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge], Algen [Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology.1, 3:239-251] mit Vektoren nach einem Transformationsverfahren, wie beschrieben in WO 98/01572, sowie bevorzugt in Zellen vielzelliger Pflanzen [siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tumefa- c/ens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep.:583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S.71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225 (und darin zitierte Literaturstellen)] exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden femer erörtert in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press; San Diego, CA (1990). Die Sequenz des rekombinanten Expressionsvektor kann alternativ, zum Beispiel unter Verwendung von T7-Promotor-Regulationssequenzen und T7-Polymerase, in vitro transkribiert und translatiert werden.
Die Expression von Proteinen in Prokaryoten erfolgt meist mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, welche die Expression von Fusions- oder nicht- Fusionsproteinen steuern. Typische Fusions-Expressionsvektoren sind u.a. pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B., und Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), bei denen Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusioniert wird.
Beispiele für geeignete induzierbare nicht-Fusions-E. coli-Expressionsvektoren sind u.a. pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315) und pET 11d [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89]. Die Zielgenexpression vom pTrc-Vektor beruht auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor. Die Zielgenexpression aus dem pET 11d-Vektor beruht auf der Transkription von einem T7-gn10-lac-Fusions-Promotor, die von einer coexpri- mierten viralen RNA-Polymerase (T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) von einem residenten λ-Prophagen bereitge- stellt, der ein T7 gn1-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV 5-Promotors birgt.
Andere in prokaryotischen Organismen geeignete Vektoren sind dem Fachmann bekannt, diese Vektoren sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, die pBR-Reihe, wie pBR322, die pUC-Reihe, wie pUC18 oder pUC19, die M113mp-Reihe, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-lll113-B1, λgt11 or pBdCI, in Streptomyces plJ101, plJ364, plJ702 oder plJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667. Bei einer weiteren Ausführungsform ist der Expressionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYeDesaturased (Bal- dari et al. (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie den filamentösen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. [(1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy et al., Hrsgb., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge; oder in: More Gene Manipula- tions in Fungi; J.W. Bennet & L.L. Lasure, Hrsgb., S. 396-428: Academic Press: San Diego]. Weitere geeignete Hefevektoren sind beispielsweise 2ocM, pAG-1, YEpδ, YEp13 oder pEMBLYe23.
Als weitere Vektoren seien in Pilzen pALS1, plL2 oder pBB116 oder in Pflanzen pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51 beispielhaft genannt.
Alternativ können die Nukieinsäuresequenzen in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovi- rus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (z.B. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc- Reihe (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol.. 3:2156-2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170:31-39).
Die oben genannten Vektoren bieten nur einen kleinen Überblick über mögliche geeignete Vektoren. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und sind zum Beispiel beschrieben in: Cloning Vectors (Hrsgb. Pouwels, P.H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0444 904018). Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryoti- sche Zellen siehe in den Kapiteln 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E.F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Bei einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens können die Nukieinsäuresequenzen in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen), siehe Falciatore et al., 1999, Marine Biotech- nology 1 (3):239-251 und darin zitierte Literaturangaben, und Pflanzenzellen aus höheren Pflan- zen (z.B. Spermatophyten, wie Feldfrüchten) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzen- Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kem- per, E., Schell, J., und Masterson, R. [(1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1195-1197] und Bevan, M.W. [(1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12:8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38]. Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung findet sich auch in Hellens, R., Mullineaux, P. und Klee H. , [(2000) " A guide to Agrobacterium binary vectors .Trends in Plant Science, Vol 5 No.10, 446-451.
Eine Pflanzen-Expressionskassette enthält vorzugsweise Regulationssequenzen, welche die Genexpression in Pflanzenzellen steuern können und funktionsfähig verbunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion, wie Termination der Transkription, erfüllen kann, beispielsweise Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind diejenigen, die aus Agrobacterium tumefaciens-T-DNA stammen, wie das als Octopinsynthase bekannte Gen 3 des Ti- Plasmids pTiACHδ (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835ff.) oder funktionelle Äquivalente davon, aber auch alle anderen in Pflanzen funktionell aktiven Terminatoren sind geeignet.
Da die Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf Transkriptionsebenen beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise andere funktionsfähig verbundene Sequenzen, wie Translationsenhancer, beispielsweise die. Overdrive-Sequenz, welche die 5'- untranslatierte Leader-Sequenz aus Tabakmosaikvirus, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht, enthält (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-8711).
Zur Expression in Pflanzen müssen die Nukieinsäuresequenzen wie oben beschrieben funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein, der die Genexpression auf rechtzeitige, zell- oder gewebespezifische Weise durchführt. Nutzbare Promotoren sind konstitutive Promotoren (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), wie diejenigen, die von Pflanzenviren stammen, wie 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (siehe auch US 5352605 und WO 84/02913), 34S FMV (Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433 - 443), der Ubiquitin-Promotor aus Petersilie oder Pflanzenpromotoren, wie der in US 4,962,028 beschriebene der kleinen Untereinheit der Rubisco.
Andere bevorzugte Sequenzen für die Verwendung zur funktionsfähigen Verbindung in Pflan- zengenexpressions-Kassetten sind Targeting-Sequenzen, die zur Steuerung des Genproduktes in sein entsprechendes Zellkompartiment notwendig sind (siehe eine Übersicht in Kermode, Grit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996) 285-423 und darin zitierte Literaturstellen), beispielsweise in die Vakuole, den Zellkern, alle Arten von Piastiden, wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chro- moplasten, den extrazellulären Raum, die Mitochondrien, das Endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen.
Die Pflanzengenexpression lässt sich auch wie oben beschrieben über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäüre-induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin- induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor.
Auch Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, sind geeignete Promotoren, beispielsweise der pathogeninduzierte PRP1 -Gen-Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), der hitzeinduzierbare hsp80-Promotor aus Tomate (US
5,187,267), der kälteinduzierbare Alphaamylase-Promotor aus Kartoffel (WO 96/12814) oder der durch Verwundung induzierbare pinll-Promotor (EP-A-0 375 091).
Es sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, welche die Genexpression in Geweben und Organen herbeiführen, in denen die Aminosäure-Biosynthese stattfindet, in Samenzellen, wie den Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos. Geeignete Promotoren sind der Napingen-Promotor aus Raps (US 5,608,152), der USP-Promotor aus Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3):459-67), der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), der Bce4-Promotor aus Brassica (WO 91/13980), der arc5-Promotor aus der Bohne, der DcG3-Promotor aus der Karotte oder der Legumin-B4-Promotor (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2):233- 9) sowie Promotoren, welche die samenspezifische Expression in Monokotyledonen-Pflanzen, wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis usw. herbeiführen. Vorteilhafte samenspeziiϊsche Promotoren sind der Sucrose-Binding-Protein-Promotor (WO 00/26388), der Phaseolin- Promotor und der Napin-Promotor. Geeignete beachtenswerte Promotoren sind der lpt2- oder lpt1 -Gen-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230) oder die in WO 99/16890 beschriebenen (Promotoren aus dem Gersten-Hordein-Gen, dem Reis-Glutelin-Gen, dem Reis- Oryzin-Gen, dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin-Gen, Weizen-Glutelin-Gen, dem Mais-Zein-Gen, dem Hafer-Glutelin-Gen, dem Sorghum-Kasirin-Gen, dem Roggen-Secalin- Gen).
Insbesondere kann die multiparallele Expression der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren allein oder in Kombination mit anderen Genen bzw. Nukleinsäuren gewünscht sein. Die Einführung solcher Expressionskassetten kann über eine simultane Transformation mehrerer einzelner Expressionskonstrukte erfolgen oder bevorzugt durch Kombination mehrerer Expressionskassetten auf einem Konstrukt. Auch können mehrere Vektoren mit jeweils mehreren Expressi- onskassetten transformiert und auf die Wirtszelle übertragen werden.
Ebenfalls besonders geeignet sind Promotoren, welche die plastidenspezifische Expression herbeiführen. Geeignete Promotoren, wie der virale RNA-Polymerase-Promotor, sind beschrieben in WO 95/16783 und WO 97/06250, und der clpP-Promotor aus Arabidopsis, beschrieben in WO 99/46394. Für die starke Expression heterologer Sequenzen in möglichst vielen Geweben, insbesondere auch Blättern, werden neben verschiedenen der oben genannten viralen und bakteriellen Promotoren, bevorzugt pflanzliche Promotoren von Actin- oder Ubiquitin-Genen, wie beispielsweise der Actinl -Promotor aus Reis verwendet. Einen weiteres Beispiel für konstitutive pflanzliche Promotoren stellen die V-ATPase-Promotoren aus Zuckerrübe dar (WO 01/14572). Beispielhaft für synthetische konstitutive Promotoren sind der Super-Promotor (WO 95/14098) und von G- Boxen abgeleitete Promotoren (WO 94/12015) zu nennen. Weiterhin können unter Umständen auch chemisch induzierbare Promotoren genutzt werden, vergleiche EP-A 388186, EP-A 335528, WO 97/06268. Auch stehen für die Expression von Genen in Pflanzen blattspezifische Promotoren wie in DE-A 19644478 beschrieben, oder lichtregulierte Promotoren, wie beispielsweise der petE-Promotor aus Erbse zur Verfügung.
Von den Polyadenylierungssignalen ist insbesondere die Poly-A-Additionssequenz aus dem ocs- Gen oder nos-Gen von Agrobacterium tumefaciens zu nennen. Zu weiteren gegebenenfalls zweckmäßigen regulatorischen Sequenzen gehören auch Sequenzen, die den Transport und/oder die Lokalisierung der Expressionsprodukte steuern (Targeting). Hier sind insbesondere die an sich bekannten Signalpeptid oder Transitpeptid kodierenden Sequenzen zu nennen. Beispielsweise gelingt es mit Hilfe von Plastid-Transitpeptid kodierenden Sequenzen, das Expressionsprodukt in die Plastide einer Pflanzenzelle zu leiten. Als Empfängerpflanzen werden wie oben beschrieben insbesondere Pflanzen bevorzugt, die in zweckmäßiger Weise transformiert werden können. Hierzu gehören mono- und dikotelydone Pflanzen. Insbesondere sind landwirtschaftliche Nutzpflanzen wie Getreide und Gräser, z.B.Triticum spp., Zea mays, Hordeum vulgäre, Hafer, Seeale cereale, Oryza sativa, Pennisetum glaueum, Sorghum bicolor, Triticale, Agrostis spp., Cenchrus ciliaris, Dactylis glomerata, Festuca arundinacea, Lolium spp., Medica- go spp. und Saccharum spp., Hülsenfrüchte und Ölfrüchte, z.B. Brassica juncea, Brassica na- pus, Glyeine max, Araehis hypogaea, Gossypium hirsutum, Cieer arietinum, Helianthus annuus, Lens culinaris, Linum usitatissimum, Sinapis alba, Trifolium repens und Vicia narbonensis, Gemüse und Früchte, z.B. Bananen, Weintrauben, Lycopersicon esculentum, Spargel, Kohl, Wassermelonen, Kiwis, Solanum tuberosum, Beta vulgaris, Cassava und Chicory, Bäume, z.B. Cof- fea species, Citrus spp., Eucalyptus spp., Picea spp., Pinus spp. und Populus spp., medizini- sehe Pflanzen und Bäume sowie Blumen zu nennen. Gemäß einer besonderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen der Gattung Arabidopsis, z.B. Arabidopsis thaliana und der Gattung Oryza.
Vektor-DNA lässt sich in prokaryotische oder eukaryotische Zellen über herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken einbringen. Die Begriffe "Transformation" und "Trans- fektion", Konjugation und Transduktion, wie hier verwendet, sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einbringen fremder Nukleinsäure (z.B. DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE- Dextran-vermittelte Transfektion, PEG-vermittelte Transfektion, Lipofektion, natürliche Kompetenz, chemisch vermittelter Transfer, Elektroporation oder Teilchenbeschuss, umfassen. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, einschließlich Pflanzenzellen, lassen sich finden in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Labor-Handbüchern, wie Methods in Molecular Biology, 1995, Bd. 44, Agrobacterium protocols, Hrsgb: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.
Der Begriff "Nukleinsäure(molekül bzw. -sequenz)", wie hier verwendet, kann zudem die am 3'- und am 5'-Ende des kodierenden Genbereichs gelegene untranslatierte Sequenz: mindestens 500, bevorzugt 200, besonders bevorzugt 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5'- Endes des kodierenden Bereichs und mindestens 100, bevorzugt 50, besonders bevorzugt 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3'-Endes des kodierenden Genbereichs mit umfassen. Vorteilhaft wird zur Klonierung und Expression nur der codierende Bereich genommen. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorliegen. Eine "isolierte" Nukleinsäure hat vorzugsweise keine Sequenzen, welche die Nukleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt, natürlicherweise flankieren (z.B. Sequenzen, die sich an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure befinden). Bei verschiedenen Ausführungsformen kann das isolierte im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nukleinsäuremolekül zum Beispiel weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb an Nukleotidsequenzen enthalten, die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt flankieren.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle, z.B. ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 oder eines Teils davon, kann unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken und der hier bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Auch kann mithiife von Vergleichsalgorithmen beispielsweise eine homologe Sequenz oder homologe, konservierte Sequenzbereiche auf DNA oder Aminosäureebene identifiziert werden. Diese können als Hybridisierungssonde sowie Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) zur Isolierung weiterer im Verfahren nützlicher Nukieinsäuresequenzen verwendet werden. Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 oder einen Teil davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz oder von Teilen davon, verwendet werden (z.B. kann ein Nukleinsäu- remolekül, umfassend die vollständigen Sequenz oder einen Teil davon, durch Polymeraseket- tenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotidprimern isoliert werden, die auf der Basis dieser gleichen Sequenz erstellt worden sind). Zum Beispiel lässt sich mRNA aus Zellen isolieren (z.B. durch das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al. (1979) Bioche- mistry 18:5294-5299) und cDNA mittels Reverser Transkriptase (z.B. Moloney-MLV-Reverse- Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder AMV-Reverse-Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St.Petersburg, FL) herstellen. Synthetische Oligonukleo- tidprimer zur Amplifizierung mittels Polymerasekettenreaktion lassen sich auf der Basis einer der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 oder mithilfe der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 oder SEQ ID NO: 26 dargestellten Aminosäuresequenzen erstel- len.Weiterhin können durch Proteinsequenzvergleiche von Threonin-Aldolasen oder Lysin- Decarboxylasen aus verschiedenen Organismen konservierte Bereiche identifiziert werden, von denen dann wiederum degenerierte Primer abgeleitet werden können. Derartige degenerierte Primer lassen sich aus den Consensus-Sequenzen H[x]2G[X]R[X]19D[X]7K[X]27G, HXDGAR[X]3A[X]1SD[X]4CXSK[X]4PXGS[X]3G[X]7A[X]4K[X]2GGGXRQXG, G[X]4GIM[X]45M[X]2RK[X]2M[X]11GGXG[X]3E[X]2E[X]3W, oder LG[X]9 LVYGG[X]3GIMGXVA[X]9G[X]3GXIP[X]24MHXRK[X]2M[X]6F[X]3PGGXGTXEE[X]2 E[X]2TW[X]2IG[X]3KP[X]4N[X]3FY[X]1 F ableiten. Diese degenerierten Primer können dann mittels PCR zur Amplifikation von Fragmenten neuer Threonin-Aldolasen und/oder Lysin- Decarboxylasen aus weiteren Organismen genutzt werden. Diese Fragmente können dann als Hybridiserungssonde für die Isolierung der vollständigen Gensequenz genutzt werden. Alternative können die fehlenden 5'und 3'-Sequenzen mittels RACE-PCR isoliert werden. Eine erfin- dungsgemäße Nukleinsäure kann unter Verwendung von cDNA oder alternativ von genomischer DNA als Matrize und geeigneten Oligonukleotidprimern gemäß Standard-PCR- Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, die einer der im Verfahren verwendeten Nukleotidsequenz entsprechen, kön- nen durch Standard-Syntheseverfahren, beispielsweise mit einem automatischen DNA- Synthesegerät, hergestellt werden.
Für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafte Nukleinsäuremoleküle können auf der Grundlage ihrer Homologie zu den hier offenbarten Nukleinsäuren unter Verwendung der Sequenzen oder eines Teils davon als Hybridisierungssonde gemäß Standard-Hybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden. Dabei können beispielsweise isolierte Nukleinsäuremoleküle verwendet werden, die mindestens 15 Nukleotide lang sind und unter stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekülen, die eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 umfassen, hybridisieren. Es können auch Nukleinsäuren mindestens 25, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotide verwendet werden. Der Begriff "hybridisiert unter stringenten Bedingungen", wie hier verwendet, soll Hybridisierungs- und Waschbedingungen beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen, die mindestens 60 % homolog zueinander sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Die Bedingungen sind vorzugsweise derart, dass Sequenzen, die mindestens etwa 65 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 70 % und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 75 % oder stärker zueinander homolog sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Unter Homolog oder Homologie ist im Sinne der Erfindung identisch oder Identität zu verstehen. Diese stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und lassen sich in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6., finden. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierungen in 6 x Natriumchlorid/Natriumcitrat (sodium chloride/sodiumcitrate = SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 x SSC, 0,1 % SDS bei 50 bis 65°C. Dem Fachmann ist bekannt, dass diese Hybridisierungsbedingungen sich je nach dem Typ der Nukleinsäure und, wenn beispielsweise organische Lösungsmittel vorliegen, hinsichtlich der Temperatur und der Konzentration des Puffers unterscheiden. Die Temperatur unterscheidet sich beispielsweise unter "Standard- Hybridisierungsbedingungen" je nach dem Typ der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C in wässrigem Puffer mit einer Konzentration von 0,1 bis 5 x SSC (pH 7,2). Falls organisches Lösungsmittel im obengenannten Puffer vorliegt, zum Beispiel 50 % Formamid, ist die Temperatur unter Standardbedingungen etwa 42°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA: DNA-Hybride zum Beispiel 0,1 x SSC und 20°C bis 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 45°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride zum Bei- spiel 0,1 x SSC und 30°C bis 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die vorstehend genannten Hybridisierungstemperaturen sind beispielsweise für eine Nukleinsäure mit etwa 100 bp (= Basenpaare) Länge und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid bestimmt. Der Fachmann weiß, wie die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen anhand von Lehrbüchern, wie dem vorstehend erwähnten oder aus den folgenden Lehrbüchern Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Harnes und Higgins (Hrsgb.)
1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsgb.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford, bestimmt werden können.
Zur Bestimmung der prozentualen Homologie (= Identität) von zwei Aminosäuresequenzen (z.B. der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10) oder von zwei Nukleinsäuren (z.B. der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25) werden die Sequenzen zum Zweck des optimalen Vergleichs untereinander geschrieben (z.B. können Lücken in die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure eingefügt werden, um ein optimales Alignment mit dem anderen Protein oder der anderen Nukleinsäure zu erzeugen). Die Aminosäurereste oder Nukleotide an den entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz durch den gleichen Aminosäurerest oder das gleiche Nukleotid wie die entsprechende Stelle in der anderen Sequenz belegt wird, dann sind die Moleküle an dieser Position homolog (d.h. Aminosäure- oder Nukleinsäure- "Homologie", wie hier verwendet, entspricht Aminosäure- oder Nukleinsäure-"ldentität"). Die prozentuale Homologie zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an identi- sehen Positionen, die den Sequenzen gemeinsam sind (d.h. % Homologie = Anzahl der identischen Positionen/Gesamtanzahl der Positionen x 100). Die Begriffe Homologie und Identität sind damit als Synonym anzusehen.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für eine Threonin-Aldoalse oder Lysin-Decarboxylase kodiert, die zu einer Proteinsequenz der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 oder SEQ ID NO: 26 oder den Sequenzen SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 homolog ist, kann durch Einbringen einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 oder in die den von den vorgenannten Aminosäuresequenzen abgeleiteten Nukieinsäuresequenzen erzeugt werden, so dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das kodierte Protein eingebracht werden. Mutationen können in eine der Sequenzen der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 durch Standardtechniken, wie stellenspezifische Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese, eingebracht werden. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einer oder mehreren der vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäureresten hergestellt. Bei einer "konservativen Aminosäuresubstitution" wird der Aminosäurerest gegen einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ausgetauscht. Im Fachgebiet sind Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolaren Seitenketten, (z.B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta- verzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Ein vorhergesagter nicht-essentieller Aminosäurerest in einer Proteinsequenz wie SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 oder SEQ ID NO: 26 wird somit vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest aus der gleichen Seitenkettenfamilie ausgetauscht. Alternativ können bei einer anderen Ausführungsform die Mutationen zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil der kodierenden Se- quenz eingebracht werden, z.B. durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können auf ihre biologische Aktivität das heißt die Aminosäureproduktion hin durchmustert werden, um Mutanten zu identifizieren, die die biologische Aktivität beibehalten bzw erhöht haben. Nach der Mutagenese einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 oder der von den vorgenannten Sequenzen ableitbaren Nukleinsauresequenz kann das kodierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann z.B. unter Verwendung der hier beschriebenen Tests bestimmt werden.
Homologe der verwendeten Nukieinsäuresequenzen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 oder der von den Sequenzen SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 abgeleiteten Nukieinsäuresequenzen bedeuten beispielsweise allelische Varianten mit mindestens etwa 30 bis 50 %, vorzugsweise mindestens etwa 50 bis 70 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 70 bis 80 %, 80 bis 90 % oder 90 bis 95 % und noch stärker bevorzugt min- destens etwa 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr Homologie zu einer in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 gezeigten Nukleotidsequenzen oder den vorgenannten abgeleiteten Nukieinsäuresequenzen oder ihren Homologen, Derivaten oder Analoga oder Teilen davon. Weiterhin sind isolierte Nukleinsäuremoleküle einer Nukleotidsequenz, die an eine der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 gezeigten Nukleotidsequenzen, den abgeleiteten Nukleinsäuresequenzenoder einen Teil davon hybridisieren, z.B. unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Allelische Varianten umfassen insbesondere funktioneile Varianten, die sich durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus/in der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 dargestellten Sequenz oder den abgeleiteten Nukieinsäuresequenzen erhalten lassen, wobei aber die Absicht ist, dass die Enzymaktivität bzw. die biologische Aktivität der davon herrührenden synthetisierten Proteine für die Insertion eines oder mehrerer Gene vorteilhafterweise beibehalten wird. Proteine, die noch die wesentliche enzymatische Aktivität der Threonin-Aldolase besitzen, das heißt deren Aktivität im wesentlichen nicht reduziert ist, bedeutet Proteine mit mindestens 10 %, vorzugsweise 20 %, besonders bevorzugt 30 %, ganz besonders bevorzugt 40 % der ursprünglichen biologischen bzw. Enzym-Aktivität, vorteilhaft verglichen mit dem durch SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 oder SEQ ID NO: 26 kodierten Protein.
Homologen der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 oder der abgeleiteten Sequenzen bedeuten beispielsweise auch bakterielle, Pilz- und Pflanzenhomologen, verkürzte Sequenzen, einzelsträngige DNA oder RNA der kodierenden und nicht-kodierenden DNA- Sequenz.
Unter Homologen der SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 oder der abgelei- teten Sequenzen sind auch Derivate, wie beispielsweise Promotorvarianten, zu verstehen. Die Promotoren stromaufwärts der angegebenen Nukleotidsequenzen können durch einen oder mehrere Nukleotidaustausche, durch lnsertion(en) und/oder Deletion(en) modifiziert werden, ohne dass jedoch die Funktionalität oder Aktivität der Promotoren gestört wird. Es ist weiterhin möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz erhöht ist oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren, sogar aus heterologen Organismen, ersetzt werden.
Die vorgenannten Nukleinsäuren und Proteinmoleküle mit Threonin-Aldolase-Aktivität und/oder Lysin-Decarboxylase-Aktivität, die am Stoffwechsel von Aminosäuren beteiligt sind, werden zur Steigerung der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Verbindung oder einer Abnahme unerwünschter Verbindungen verwendet.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gege- benenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 °C und 100 °C, bevorzugt zwischen 10 °C bis 60 °C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann batch weise, semi batch weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nach- gefüttert werden. Die hergestellten Aminosäuren können nach dem Fachmann bekannten Verfahren aus den Organismen isoliert werden. Beispielsweise über Extraktion, Salzfällung und/oder lonenaustauschchromatographie. Die Organismen können dazu vorher noch aufgeschlossen werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird, wenn es sich bei den Wirtsorganismen um Mikroorga- nismen handelt, vorteilhaft bei einer Temperatur zwischen 0 °C bis 95 °C, bevorzugt zwischen 10 °C bis 85 °C, besonders bevorzugt zwischen 15 °C bis 75 °C, ganz besonders bevorzugt zwischen 15 °C bis 45 °C durchgeführt
Der pH-Wert wird dabei vorteilhaft zwischen pH 4 und 12, bevorzugt zwischen pH 6 und 9, besonders bevorzugt zwischen pH 7 und 8 gehalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann batchweise, semi-batchweise oder kontinuierlich betrieben werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden.
Das zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme zu genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods für General Bacteriology" der American Society für Bacterio- logy (Washington D. O, USA, 1981) enthalten.
Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Medien umfassen wie oben beschrieben gewöhnlich eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, Vitamine und/oder Spurenelemente.
Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte der Zucker- Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und/oder Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und/oder Linolsäure, Alkohole und/oder Polyalkohole wie z. B. Glycerin, Methanol und/oder Ethanol und/oder organische Säuren wie z. B. Essigsäure und/oder Milchsäure.
Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak in flüssiger- oder gasform oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumnitrat, Nitrate, Harnstoff, Aminosäu- ren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen.
Als Schwefelquelle für die Herstellung von schwefelhaltigen Feinchemikalien, insbesondere von Methionin, können anorganische schwefelhaltige Verbindungen wie beispielsweise Sulfate, Sulfite, Dithionite, Tetrathionate, Thiosulfate, Sulfide aber auch organische Schwefelverbindungen, wie Mercaptane und Thiole, verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydro- genphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.
Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat, oder organische Säuren, wie Citronensäure.
Die erfindungsgemäß zur Kultivierung von Mikroorganismen eingesetzten Fermentationsmedien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförde- rer, zu denen beispielsweise Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyridoxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DI FCO) und dergleichen.
Sämtliche Medienkomponenten werden, entweder durch Hitze (20 min bei 1 ,5 bar und 121°C) oder durch Sterilfiltration, sterilisiert. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden.
Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 15°C und 45°C, vorzugsweise bei 25°C bis 40°C und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen. Der pH-Wert für die Anzucht lässt sich während der Anzucht durch Zugabe von basischen Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder sauren Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure kontrollieren. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen, wie z. B. Umgebungsluft, in die Kultur einge- tragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die so erhaltenen, insbesondere L-Methionin und/oder L-Lysin vorteilhaft L-Methionin enthalten- den, Fermentationsbrühen haben üblicherweise eine Trockenmasse von 7,5 bis 25 Gew.-%.
Vorteilhaft ist außerdem auch, wenn die Fermentation zumindest am Ende, insbesondere jedoch über mindestens 30% der Fermentationsdauer zuckerlimitiert gefahren wird. Das heißt, dass während dieser Zeit die Konzentration an verwertbarem Zucker im Fermentationsmedium auf > 0 bis 3 g/l gehalten, beziehungsweise abgesenkt wird.
Die Fermentationsbrühe wird anschließend weiterverarbeitet. Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden, wie z. B. Zentrifugation, Filtration, Dekantieren oder einer Kombination dieser Methoden aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden.
Anschließend kann die Fermentationsbrühe mit bekannten Methoden, wie z. B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose, oder durch Nanofiltration, eingedickt beziehungsweise auf konzentriert werden. Diese aufkonzentrierte Fermentationsbrühe kann anschließend durch Gefriertrocknung, Sprühtrocknung, Sprühgranulation oder durch anderweitige Verfahren aufgearbeitet werden.
Es ist aber auch möglich die Aminosäure weiter aufzureinigen. Hierzu wird die produkthaltige Brühe nach dem Abtrennen der Biomasse einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Produkt oder die Verunreinigungen ganz oder teilweise auf dem Chromatographieharz zurückgehalten werden. Diese Chromatographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromatographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und ihrer wirksamsten Anwendung bewandert. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist.
Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindung(en) kann durch Techniken des Standes der Technik bestimmt werden. Diese umfassen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), spektroskopische Verfahren, Massenspektrometrie, Färbeverfahren, Dünnschichtch- . romatographie, NIRS, Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind zusammengefasst in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; und Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566, 575-581 und S. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Path- ways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.
Die im Verfahren gewonnenen Aminosäuren eignen sich als Ausgangsmaterial für die Synthese von weiteren Wertprodukten. Sie können beispielsweise in Kombination miteinander oder allein zur Herstellung von Pharmaka, Nahrungsmittel, Tierfutter oder Kosmetika verwendet werden.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird wie oben beschrieben als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimie- rende Konstrukt in einen Vektor Moniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zμ trans- formieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z.B. von Tabakpflanzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens wird beispielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem bekannt aus F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.
Für die Selektion einer erfolgreichen Einbringung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in ei- nen Wirtsorganismus werden vorteilhaft Markergene verwendet. Diese Markergene ermöglichen die Identifizierung einer erfolgreichen Einbringung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren über ein Reihe verschiedener Prinzipien beispielsweise über eine visuelle Erkennung mit Hilfe von Fluoreszenz, Lumineszenz oder im für den Mensch sichtbaren Wellenbereich des Lichtes, über eine Herbizid- oder Antibiotikaresistenz, über sogenannte nutritive (Auxotrophiemarker) oder anti-nutritive Marker, über Enzymassays oder über Phytohormone. Als Beispiele für derartige Maker seien hier das GFP (= Green fluorescent Protein); das Luciferin/Luceferacesystem; die ß- Galactosidase mit ihren farbigen Substraten z.B. X-Gal; die Herbizideresistenzen gegen z.B. Imidazolinon, Glyphosat, Phosphothricin oder Sulfonylhamstoff; die Antibiotikaresistenzen gegen z.B. Bleomycin, Hygromycin, Streptomycin, Kanamycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicil- lin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin um nur einige zu nennen; nutritive Marker wie die Mannose- oder Xyloseverwertung oder anti-nutritive Marker wie 2- Deoxyglukoseresistenz genannt. Diese Liste gibt einen kleinen Ausschnitt möglicher Marker wieder. Dem Fachmann sind derartige Marker wohl bekannt. Je nach Organismus und Selektionsmethode sind unterschiedliche Marker bevorzugt.
Über die stabile oder transiente Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen ist bekannt, dass je nach verwendetem Expressionsvektor und verwendeter Transfektionstechnik nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA aufnimmt und falls gewünscht in ihr Genom integriert. Zur Identifikation und Selektion dieser Integranten wird gewöhnlich ein Gen, das einen selektierbaren Marker (z.B. Resistenz gegen Antibiotika) kodiert, zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Bevorzugte selektierbare Marker umfassen in Pflanzen solche, welche Resistenz gegen ein Herbizid, wie Glyphosphat oder Glufosinat, verleihen. Weitere geeignete Marker sind beispielsweise Marker, welche Gene kodieren, die an Biosynthesewegen von zum Beispiel Zuckern oder Aminosäuren beteiligt sind, wie ß-Galactodsidase, ura3 oder ilv2. Marker, welche Gene, wie Luziferase, gfp oder andere Fluoreszenzgene kodieren, sind ebenfalls geeignet. Diese Marker lassen sich in Mutanten verwenden, in denen diese Gene nicht funktionell sind, da sie beispielsweise mittels herkömmlicher Verfahren deletiert worden sind. Ferner können Marker, welche eine Nukleinsäure kodieren, die einen selektierbaren Marker kodiert, in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, wie derjenige, der für die im Verfahren verwendeten Threonin-Aldolasen und/oder Lysin-Decarboxylasen kodiert, oder können auf einem gesonderten Vektor eingebracht werden. Zellen, die mit der eingebrachten Nukleinsäure stabil transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (z.B. überleben Zellen, die den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen absterben).
Da die Markergene in der Regel speziell die Antibiotika- und Herbizidresistenzgen in der transgenen Wirtszelle nach erfolgreicher Einbringung der Nukleinsäuren nicht mehr benötigt werden bzw. unerwünscht sind, werden im erfindungsgemäßen Verfahren zur Einbringung der Nukleinsäuren vorteilhaft Techniken verwendet, die eine Entfernung bzw. Exzision dieser Markergene ermöglicht. Eine derartige Methode ist die sogenannte Co-Transformation. Bei der Co- Transformation werden zur Transformation zwei Vektoren gleichzeitig verwendet, wobei ein Vektor die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und ein zweiter das oder die Markergene trägt. Ein hoher Teil der Transformanten erhält bzw. enthält bei Pflanzen (bis zu 40 % der Transfor- manten und mehr) beide Vektoren. Durch Kreuzung lassen sich anschließend die Markergene aus der transformierten Pflanze entfernen. Eine weitere Methode verwendet Markergene, die in ein Transposon integriert wurden, zur Transformation zusammen mit den gewünschten Nukleinsäuren (sog. Ac/Ds-Technologie). In einigen Fällen (ca. 10 %) springt das Transposon nach erfolgreicher Transformation aus dem Genom der Wirtszelle und geht verloren. In eine weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen wieder ausgekreuzt werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, die eine Detektion derartiger Ereignisse ermöglicht bzw. erleichtert. Eine weitere vorteilhafte Methode verwendet sogenannte Rekombinationssysteme, die den Vorteil haben, dass auf eine Auskreuzung verzichtet werden kann. Das bekannteste derartige System ist das sogenannte Cre/Iox-System. Cre1 ist eine Rekombinase, die die Sequenzen, die zwischen der loxP-Sequenz liegen, entfernt. Wird das Markergen zwischen die loxP-Sequenz integriert, so wird es nach erfolgreicher Transformation durch Expression der Rekombinase entfernt. Weitere Rekombina- sesysteme sind das HIN/HIX-, das FLP/FRT- und das REP/STB-System (Tribble et al., J.Biol. Chem., 275, 2000: 22255 - 22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553 - 566). Auch eine gezielte Integration der erfindungsgemäßen Nukieinsäuresequenzen in das Pflanzengenom ist prinzipiell möglich, aber aufgrund des hohen Arbeitsaufwandes weniger bevorzugt. Diese Methoden sind natürlich auch bei Mikroorganismen wie Hefen, Pilze oder Bakterien anwendbar.
Mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen wie Testpflanzen wie Arabidopsis oder Kulturpflanzen wie beispielsweise Getreide, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Karotte, Paprika, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies, insbesondere von Öl-haltigen Kulturpflanzen, wie Soja, Erdnuß, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuß, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinetorius) oder Kakaobohne verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S.D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.
Neben der Transformation von somatischen Zellen, welche dann zu Pflanzen regeneriert werden müssen, können auch Zellen pflanzlicher Meristeme und insbesondere solche Zellen, die sich zu Gameten entwickeln, transformiert werden. In diesem Fall führen die transformierten Gameten auf dem Weg der natürlichen Pflanzenentwicklung zu transgenen Pflanzen. So werden beispielsweise Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt und von den sich daraus entwickelnden Pflanzen Samen gewonnen, die dann zu einer bestimmten Rate transfor- miert, daher transgen sind ( Feldman, KA und Marks MD (1987), Λgroόacfer/.//77-mediated trans- formation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana: a non tissue culture approach. Mol Gen Genet 208:274-289; Feldmann K (1992) T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis: seed infection transformation. In C Koncz, N-H Chua und J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp274-289). Alternative Methoden beruhen auf der wieder- holten Entfernung der Infloreszenzen und der Inkubation der Schnittstelle im Zentrum der Ros- sette mit transformierten Agrobakterien, wodurch ebenfalls später transformierte Samen gewonnen werden können (Chang, SS, Park SK, Kim, BC, Kang, BJ, KimDU und Nam, HG (1994) Stable genetic transformation of Arabidopsis thaliana by Agrobacterium inoculation in planta. Plant J. 5: 551-558; Katavic, V, Haughn, GW, Reed, D, Martin, M und Kunst, L (1994) In planta transformation of Arabidopsis thaliana. Mol Gen Genet, 245: 363-370). Besonders effizient ist jedoch die Methode der Vakuum-Infiltration mit ihren Abwandlungen wie "Floral dip". Bei der Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden ganze Pflanzen unter Vakuum mit einer Agorbakteri- umsuspension behandelt (Bechthold, N, Ellis, J, und Pelletier, G (1993) In planta Agrobacterium- mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thalina plants. C R Aead Sei Paris Life Sei, 316: 1194-1199), während bei der "Floral dip"-Methode das sich entwickelnde Blütengewebe in einer mit einem Surfactant versetzten Agrobakteriumsuspension kurzzeitig inkubiert wird (Clough, SJ und Bent, AF (1998) Floral dip: a simple method for Agrobacferium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. The Plant J. 16, 735-743). In beiden Fällen werden zu einem bestimmten Prozentsatz transgene Samen geerntet, die durch Anzucht unter den bereits be- schriebenen selektiven Bedingungen von nicht transgenen Samen unterschieden werden können.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft deshalb transgene Organismen, transformiert mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenz, Expressionskassette oder einem erfindungsgemäßen Vektor, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile - wie zum Beispiel bei pflanzlichen Organismen Blätter, Wurzeln usw.- oder Vermehrungsgut abgeleitet von solchen Organismen. Die Begriffe "Wirtsorganismus" "Wirtszelle", "rekombinanter (Wirts)organismus", "rekombinante (Wirts)zelle", "transgener (Wirts)organismus" und "transgene (Wirts)zelle" werden hier untereinander austauschbar verwendet. Selbstverständlich betreffen diese Begriffe nicht nur den bestimmten Wirtsorganismus oder die bestimmte Zielzelle, sondern auch die Nachkommen oder potentiellen Nachkommen dieser Organismen bzw. Zellen. Da in aufeinanderfolgenden Generationen aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte Modifikationen auftreten können, sind diese Nachkommen nicht unbedingt mit der Parentalzelle identisch, sind jedoch immer noch vom Umfang des Begriffs, wie hier verwendet, umfasst. Ein anderer Aspekt der Erfindung sind die in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 genannten Aminosäuresequenzen.
Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefasst werden sollten. Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung zitierten Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen ist hier durch Bezugnahme aufgenommen.
Beispiele:
Beispiel 1: Klonierung von SEQ ID NO: 1 in Escherichia coli
SEQ ID NO: 1 wurde gemäß bekannter und gut eingeführter Verfahren (siehe bspw. Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons) in die Plasmide pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl Aead. Sei. USA, 75: 3737-3741); pA- CYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol. 134: 1141-1156); Plasmide der pBS-Reihe (pBSSK+, pBSSK- und andere; Stratagene, LaJolla, USA) oder Cosmide, wie SuperCosI
(Stratagene, LaJolla, USA) oder Loristθ (Gibson, T.J. Rosenthal, A., und Waterson, R.H. (1987) Gene 53: 283-286) zur Expression in E. coli Moniert.
Analog wurden die Sequenzen, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID.NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 cloniert.
Beispiel 2: DNA-Sequenzierung und Computer-Funktionsanalyse
Die DNA-Sequenzierung wurde gemäß Standard-Verfahren, insbesondere dem Kettenabbruchverfahren mitABI377-Sequenziermaschinen (s. z.B. Fleischman, R.D. et al. (1995) "Whole- genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd., Science 269; 496- 512) durchgeführt".
Beispiel 3: In-vivo-Mutagenese
In vivo-Mutagenese von Corynebacterium glutamicum kann durchgeführt werden, indem eine Plasmid- (oder andere Vektor-) DNA durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z.B. Bacillus spp. oder Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae) geleitet wird, die die Integrität ihrer genetischen Information nicht aufrechterhalten können. Übliche Mutatorstämme weisen Mutationen in den Genen für das DNA-Reparatursystem auf [z.B., mutHLS, mutD, mutT, usw., zum Vergleich siehe Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms in Escherichia coli and Salmonella, S. 2277- 2294, ASM: Washington]. Diese Stämme sind dem Fachmann bekannt. Die Verwendung dieser Stämme ist bspw. in Greener, A. und Callahan, M. (1994) Strategies 7; 32-34 veranschaulicht.
Beispiel 4: DNA-Transfer zwischen Escherichia coli und Corynebacterium glutamicum
Mehrere Corynebacterium- und Brevibacterium-Arten enthalten endogene Plasmide (wie bspw. pHM1519 oder pBL1) die autonom replizieren (für einen Überblick siehe bspw. Martin, J.F. et al. (1987) Biotechnology 5: 137-146). Shuttle-Vektoren für Escherichia coli und Corynebacterium glutamicum lassen sich leicht mittels Standard-Vektoren für E. coli konstruieren (Sambrook, J. et al., (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons), denen ein Replikationsursprung für und ein geeigneter Marker aus Corynebacterium glutamicum beigegeben wird. Solche Replikationsursprünge werden vorzugsweise von endogenen Plasmi- den entnommen, die aus Corynebacterium- und Brevibactertium-Arten isoliert worden sind. Besondere Verwendung als Transformationsmarker für diese Arten sind Gene für Kanamycin- Resistenz (wie solche, die vom Tn5- oder Tn-903-Transposon stammen) oder für Chloramphe- nicol (Winnacker, E.L. (1987) "From Genes to Clones - Introduction to Gene Technology, VCH, Weinheim). Es gibt zahlreiche Beispiele in der Literatur zur Herstellung einer großen Vielzahl von Shuttle-Vektoren, die in E. coli und C. glutamicum repliziert werden, und die für verschiedene Zwecke verwendet werden können, einschließlich Gen-Überexpression (siehe bspw. Yoshi- hama, M. et al. (1985) J. Bacteriol. 162: 591-597, Martin, J.F. et al., (1987) Biotechnology, 5: 137-146 und Eikmanns, B.J. et al. (1992) Gene 102: 93-98). Geignete Vektoren, die in coryne- formen Bakterien replizieren, sind beispielsweise pZ1 (Menkel et al., Appl. Environ. Microbiol., 64, 1989: 549 - 554) pEkExl (Eikmanns et al., Gene 102, 1991: 93 - 98) oder pHS2-1 (Sonnen et al, Gene 107, 1991: 69 - 74). Diese Vektoren beruhen auf den krytischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren wie zum Beispiel solche, die auf pCG4 (US 4,489,160), pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiol. Lett., 66, 1990: 119 - 124) oder pAG1 (US 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden.
Mittels Standard-Verfahren ist es möglich, ein Gen von Interesse in einen der vorstehend beschriebenen Shuttle-Vektoren zu klonieren und solche Hybrid-Vektoren in Corynebacterium glutamicum-Stämme einzubringen. Die Transformation von C. glutamicum lässt sich durch Pro- toplastentransformation (Kastsumata, R. et al., (1984) J. Bacteriol. 159, 306-311), Elektropora- tion (Liebl, E. et al., (1989) FEMS Microbiol. Letters, 53: 399-303) und in Fällen, bei denen spezielle Vektoren verwendet werden, auch durch Konjugation erzielen (wie z.B. beschrieben in Schäfer, A., et (1990) J. Bacteriol. 172: 1663-1666). Es ist ebenfalls möglich, die Shuttle- Vektoren für C. glutamicum auf E. coli zu übertragen, indem Plasmid-DNA aus C. glutamicum (mittels im Fachgebiet bekannter Standard-Verfahren) präpariert wird und in E. coli transformiert wird. Dieser Transformationsschritt kann mit Standard-Verfahren erfolgen, jedoch wird vorteil- hafterweise ein Mcr-defizienter E. coli-Stamm verwendet, wie NM522 (Gough & Murray (1983) J. Mol. Biol. 166: 1-19).
Soll vorteilhaferweise die Integration der transformierten Sequenz(en) in das Genom der coryne- formen Bakterien erfolgen, so sind auch hierfür dem Fachmann Standardtechniken bekannt. Hierfür werden beispielsweise Plasmidvektoren verwendet, wie sie von Remscheid et al. (Appl. Environ. Microbiol., 60, 1994: 126 - 132) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB- Operons beschrieben wurden. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmid- vektor Moniert, der in einem Wirt wie E. coli, nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1 , 1983: 784 - 791), pKIBmob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 1994: 69 - 73), pGEM-T (Promega Corp., Madison, Wl, USA), pCR2.1-TOPO (Schuman, J. Biol. Chem., 269, 1994: 32678 - 32684, US 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niderlande) oder pEMI (Schrumpf etal., J. Bacteriol., 173, 1991: 4510 - 4516) in Frage.
Beispiel 5: Bestimmung der Expression des mutanten/transgenen Proteins
Die Beobachtungen der Aktivität eines mutierten bzw. transgenen Proteins in einer transformierten Wirtszelle beruhen auf der Tatsache, dass das Protein auf ähnliche Weise und in ähnlicher Menge exprimiert wird wie das Wildtyp-Protein. Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Transkriptionsmenge des mutanten bzw. transgenen Gens (ein Anzeichen für die mRNA- Menge, die für die Translation des Genprodukts verfügbar ist) ist die Durchführung eines Nor- thern-Blots (s. bspw. Ausubel et al., (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York), wobei ein Primer, der so ausgestaltet ist, dass er an das Gen von Interesse bindet, mit einer nachweisbaren (gewöhnlich radioaktiven oder chemilumineszierenden) Markierung versehen wird, so dass - wenn die Gesamt-RNA einer Kultur des Organismus extrahiert, auf einem Gel aufgetrennt, auf eine stabile Matrix übertragen und mit dieser Sonde inkubiert wird - die Bindung und die Quantität der Bindung der Sonde das Vorliegen und auch die Menge von mRNA für dieses Gen anzeigt. Diese Information ist ein Nachweis für das Ausmaß der Transkription des Gens. Gesamt-Zell-RNA lässt sich durch verschiedene Verfahren aus Corynebacterium glutamicum isolieren, die im Fachgebiet bekannt sind, wie beschrieben in Bormann, E.R. et al., (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.
Zur Bestimmung des Vorliegens oder der relativen Menge von Protein, das aus dieser mRNA translatiert wird, können Standard-Techniken, wie Westem-Blot, eingesetzt werden (s. bspw. Ausubel et al. (1988) "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley, New York). Bei diesem Verfahren werden Gesamt-Zellproteine extrahiert, durch Gelelektrophorese getrennt, auf eine Matrix, wie Nitrocellulose, übertragen und mit einer Sonde, wie einem Antikörper, inkubiert, die an das gewünschte Protein spezifisch bindet. Diese Sonde ist gewöhnlich direkt oder indirekt mit einer chemilumineszierenden oder kolorimetrischen Markierung versehen, die sich leicht nachweisen lässt. Das Vorliegen und die beobachtete Menge an Markierung zeigt das Vorliegen und die Menge des gesuchten Mutantenproteins in der Zelle an.
Beispiel 6: Wachstum von genetisch verändertem Corynebacterium glutamicum - Medien und Anzuchtbedingungen
Genetisch veränderte Corynebakterien werden in synthetischen oder natürlichen Wachstumsmedien gezüchtet. Eine Anzahl unterschiedlicher Wachstumsmedien für Corynebakterien sind bekannt und leicht erhältlich (Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters 11: 11-16; Patent DE 4 120 867; Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium", in: The Procaryotes, Bd. II, Balows, A., et al., Hrsg. Springer-Verlag). Diese Medien bestehen aus einer oder mehreren Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganischen Salzen, Vitaminen und Spurenelementen. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind bspw. Glucose, Fructo- se, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte aus der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Alkohole und/oder organische Säuren, wie Methanol, Ethanol, Essigsäure oder Milchsäure. Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffver- bindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas, wässrige Ammoniaklösungen oder Ammoniumsalze, wie NH CI oder (NH4)2S04, NH4OH, Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakte, Fleischextrakte und andere. Auch Mischungen der vorgenannten Stickstoffquellen können vorteilhaft verwendet werden.
Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor-, oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen. Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxypheno- le, wie Catechol oder Protocatechuat oder organische Säuren, wie Citronensäure. Die Medien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen bspw. Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyri- doxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden Fall individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung ist beispielsweise erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infu- sion, DIFCO) und dergleichen.
Sämtliche Medienkomponenten sind sterilisiert, entweder durch Hitze (20 min bei 1,5 bar und 121 °C) oder durch Sterilfiltration. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden.
Die Anzuchtbedingungen werden für jedes Experiment gesondert definiert. Die Temperatur sollte zwischen 15°C und 45°C liegen und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen, und kann durch Zugabe von Puffern zu den Medien aufrechterhalten werden. Ein beispielhafter Puffer für diesen Zweck ist ein Kaliumphosphatpuffer. Synthetische Puffer, wie MOPS, HEPES; ACES usw., können alternativ oder gleichzeitig verwendet werden. Der Anzucht-pH-Wert lässt sich während der Anzucht auch durch Zugabe von z.B. NaOH oder NH4OH konstant halten. Werden komplexe Medienkomponenten, wie Hefe-Extrakt verwendet, sinkt der Bedarf an zusätzlichen Puffern, da viele komplexe Verbindungen eine hohe Pufferkapazität aufweisen. Beim Einsatz eines Fermenters für die Anzucht von Mikroorganismen kann der pH-Wert auch mit gasförmigem Ammoniak reguliert werden.
Die Inkubationsdauer liegt gewöhnlich in einem Bereich von mehreren Stunden bis zu mehreren Tagen. Diese Zeit wird so ausgewählt, dass sich die maximale Menge Produkt in der Fermentationsbrühe ansammelt. Die offenbarten Wachstumsexperimente können in einer Vielzahl von Behältern, wie Mikrotiterplatten, Glasröhrchen, Glaskolben oder Glas- oder Metallfermentern unterschiedlicher Größen durchgeführt werden. Zum Screening einer großen Anzahl von Klonen sollten die Mikroorganismen in Mikrotiterplatten, Glasröhrchen oder Schüttelkolben entweder mit oder ohne Schikanen gezüchtet werden. Vorzugsweise werden 100-ml-Schüttelkolben verwendet, die mit 10% (bezogen auf das Volumen) des erforderlichen Wachstumsmediums gefüllt sind. Die Kolben sollten auf einem Kreiselschüttler (Amplitude 25 mm) mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 100-300 U/min geschüttelt werden. Verdampfungsverluste können durch Aufrechterhalten einer feuchten Atmosphäre verringert werden; alternativ sollte für die Verdamp- fungsverluste eine mathematische Korrektur durchgeführt werden.
Werden genetisch modifizierte Klone untersucht, sollten auch ein unmodifizierter Kontrollklon oder ein Kontrollklon getestet werden, der das Basisplasmid ohne Insertion enthält. Soll eine transgene Sequenz exprimiert werden, so sollte vorteilhafterweise auch in diesem Fall ein Kontrollklon mit getestet werden. Das Medium wird vorteilhaft auf eine OD600 von 0,5 - 1,5 ange- impft, wobei Zellen verwendet werden, die auf Agarplatten gezüchtet wurden, wie CM-Platten (10 g/l Glucose, 2,5 g/l NaCI, 2 g/l Harnstoff, 10 g/l Polypepton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l Fleischextrakt, 22 g/l Agar pH-Wert 6,8 mit 2 M NaOH), die bei 30°C inkubiert worden sind. Das Animpfen der Medien erfolgt entweder durch Einbringen einer Kochsalzlösung von C. glutamicum-Zellen von CM-Platten oder durch Zugabe einer flüssigen Vorkultur dieses Bakteriums.
Beispiel 7: In-vitro-Analyse der Funktion der durch die transformierten Sequenzen codierten Proteine
Die Bestimmung der Aktivitäten und kinetischen Parameter von Enzymen ist im Fachgebiet gut bekannt. Experimente zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten veränderten Enzyms müssen an die spezifische Aktivität des Wildtypenzyms angepasst werden, was innerhalb der Fähigkeiten des Fachmann liegt. Überblicke über Enzyme im Allgemeinen sowie spezifische Einzelheiten, die die Struktur, Kinetiken, Prinzipien, Verfahren, Anwendungen und Beispiele zur Bestimmung vieler Enzymaktivitäten betreffen, können bspw. in den nachstehenden Literaturstellen gefunden werden: Dixon, M., und Webb, E.C: (1979) Enzymes, Longmans, London; Fersht (1985) Enzyme Structure and Mechanism, Freeman, New York; Walsh (1979) Enzymatic Reaction Meehanisms. Freeman, San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D: Hrsg. (1983) The Enzymes, 3. Aufl. Academic Press, New York; Bisswanger, H. (1994) Enzymkinetik, 2. Aufl. VCH, Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Graßl, M. Hrsg. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3. Aufl. Bd. I-Xll, Verlag Chemie: Weinheim; und Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) Bd. A9, "Enzymes", VCH, Weinheim, S. 352-363.
Beispiel 8: Analyse des Einflusses der Nukleinsäuren auf die Produktion der Aminosäuren
Die Wirkung der genetischen Modifikation in C. glutamicum auf die Produktion einer Aminosäure kann bestimmt werden, indem die modifizierten Mikroorganismen unter geeigneten Bedingungen (wie solchen, die vorstehend beschrieben sind) gezüchtet werden und das Medium und/oder die zellulären Komponenten auf die erhöhte Produktion der Aminosäure untersucht wird. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann wohlbekannt und umfassen Spektroskopie, Massenspektrometrie, Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromatographie, wie Hoch- leistungs-Flüssigkeitschromatographie (s. bspw. Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification", S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. und Cabral, J.M.S. (1992) Recovery proc- esses for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. und Henry, J.D. (1988) Bio- chemical Separations, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 11 , S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Zusätzlich zur Messung des Fermentationsendproduktes ist es ebenfalls möglich, andere Kom- ponenten der Stoffwechselwege zu analysieren, die zur Produktion der gewünschten Verbindung verwendet werden, wie Zwischen- und Nebenprodukte, um die Gesamt-Produktivität des Organismus, die Ausbeute und/oder die Effizienz der Produktion der Verbindung zu bestimmen. Die Analyseverfahren umfassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium (bspw. Zucker, Kohlenwasserstoffe, Stickstoffquellen, Phosphat und andere Ionen), Messungen der Biomasse- Zusammensetzung und des Wachstums, Analyse der Produktion gewöhnlicher Metabolite aus Biosynthesewegen und Messungen von Gasen, die während der Fermentation erzeugt werden. Standardverfahren für diese Messungen sind in Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes und P.F. Stanbury, Hrsg. IRL Press, S. 103-129; 131-163 und 165-192 (ISBN: 0199635773) und den darin angegebenen Literaturstellen beschrieben.
Beispiel 9: Reinigung der Aminosäure aus C. glutamicum-Kultur
Die Gewinnung der Aminosäure aus C. glutamicum-Zellen und/oder aus dem Überstand der vorstehend beschriebenen Kultur kann durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen. Hierzu wird zunächst der Kulturüberstand gewonnen, dazu werden die Zellen aus der Kultur durch langsame Zentrifugation geerntet, die Zellen können anschließend durch Standard- Techniken, wie mechanische Kraft oder Ultrabeschallung, zertrümmert bzw. lysiert werden. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt, und die Überstandsfraktion, wird zusammen mit dem Kulturüberstand zur weiteren Reinigung der Aminosäure genommen. Es kann aber auch der Überstand alleine aufgearbeitet werden, wenn die Konzentration der Aminosäure ausreichend im Überstand enthalten ist. Die Aminosäure bzw. das Aminosäuregemisch kann dann weiter über beispielsweise eine Extraktion und/oder Salzfällung oder über eine lone- naustauschchromatographie weiter aufgereinigt werden.
Falls erforderlich und gewünscht können weitere Chromatographieschritte mit einem geeigneten Harz folgen, wobei die Aminosäure entweder auf dem Chromatographieharz zurückgehalten wird, viele Verunreinigungen in der Probe jedoch nicht, oder wobei die Verunreinigungen auf dem Harz zurückbleiben, die Probe mit dem Produkt (Aminosäure) hingegen nicht. Diese
Chromatographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromatographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und der wirksamsten Anwendung für ein bestimmtes, zu reinigendes Molekül bewandert. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist. Im Fachgebiet sind viele Reinigungsverfahren bekannt, die nicht auf das vorhergehende Reinigungsverfahren eingeschränkt sind. Diese sind bspw. beschrieben in Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986).
Die Identität und Reinheit der isolierten Aminosäure kann durch Standard-Techniken des Fach- gebiets bestimmt werden. Diese umfassen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, NIRS, Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind zusammengefasst in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11: 27-32; und Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566, 575- 581 und S. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.
Beispiel 10: Klonierung der SEQ ID: No 1 für die Expression in Pflanzen
Soweit nichts anderes angegeben ist, werden Standardmethoden nach Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, verwendet.
Die PCR-Amplifikation von SEQ ID: No1 erfolgte entsprechend dem Protokoll der Pfu Turbo DNA-Polymerase (Fa. Stratagene). Die Zusammensetzung war wie folgt: 1x PCR-Puffer [20 mM Tris-HCI (pH 8,8), 2 mM MgS04, 10 mM KCI, 10mM (NH4)S04 , 0,1 % Triton X-100, 0,1 mg/ml BSA], 0,2 mM d-Thio-dNTP und dNTP (1:125), 100 ng genomische DNA von Saccharomyces cerevisiae (Stamm S288C; Fa. Research Genetics, Inc., jetzt Invitrogen), 50 pmol forward- Primer, 50 pmol reverse-Primer, 2,5 u Pfu Turbo DNA Polymerase. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt:
1 Zyklus für 3' bei 95°C, gefolgt von 36 Zyklen jeweils mit 1" 95°C, 45" 50°C, und 210" 72 °C, gefolgt von 1 Zyklus für 8 bei 72 °C, dann 4 °C .
Folgende Primer-Sequenzen wurden gewählt für das Gen SEQ ID: NO 1:
i) forward-Primer (SEQ ID NO:1)
5'-GGAATTCCAGCTGACCACCATGACTGAATTCGAATTGCCTCCAA
ii) reverse-Primer (SEQ ID NO: 1)
5'-GATCCCCGGGAATTGCCATGTCAGTATTTGTAGGTTTTTATTTCGC Die ersten 19 Nukleotide des oben angegebenen forward-Pimers enthalten als universellen Teil des Primers Schnittstellen für die Klonierung der Gene. Der folgende Teil des Primers, im angegebenen Fall 25 Nukleotide, sind spezifisch für das zu Monierende Gen. Der universelle Teil des reversen Primers enthält am 5'-Ende (20 Nukleotide) wieder Schnittstellen für die Klonierung. Der spezifische Teil, hier 26 Nukleotide, ist wieder für das zu klonierende Gen spezifisch. Der universelle Teil des forward-Pimers enthält eine EcoRI-Schnittstelle, während der unverselle Teil des reversen Primers eine Smal-Schnittstelle enthält. Beide Schnittstellen wurden zur Klonierung der Nukieinsäuresequenzen verwendet. Die Restriktion wurde wie unten beschrieben durchgeführt. Im Anschluß wurde das Amplifikat über QIAquick-Säulen nach Standardprotokoll (Fa. Qiagen) gereinigt.
Analog wurden Pimer für die weiteren im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Sequenzen hergestellt und verwendet.
Die Restriktion der Vektor-DNA (30 ng) wurde mit EcoR\ und Smal nach dem Standard- Protokoll geschnitten, die EcoRI-Schnittstelle nach dem Standard-Protokoll aufgefüllt (Fa. MBI- Fermentas) und durch Zugabe von Hochsalzpuffer gestoppt. Die Reinigung der geschnittenen Vektorfragmente erfolgte über Nucleobond-Säulen nach Standardprotokoll (Machery-Nagel). Es wurde ein binärer Vektor verwendet, der zwischen den T-DNA-Bordersequenzen eine Selektionskassette (Promotor, Selektionsmarker, Terminator) sowie eine Expressionskassette mit Promotor, Klonierungskassette und Terminatorsequenz, enthielt. Außer in der Klonierungskassette besitzt der binäre Vektor keine EcoRI und Smal-Schnittstellen Verwendbare einsetzbare binären Vektoren sind dem Fachmann bekannt und eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung gibt Hellens, R., Mullineaux, P. und Klee H. , [(2000) " A guide to Agrobacterium binary vectors .Trends in Plant Science, Vol 5 No.10, 446-451. Die Klonierung kann jenach verwendetem Vektor auch vorteilhaft über andere Restriktionsenzyme erfolgen. Entsprechende vorteilhafte Schnittstellen können dem ORF durch die Verwendung entsprechender Primer für die PCR-Amplilϊkation angefügt werden.
Es wurden ca. 30 ng präparierter Vektor und eine definierte Menge präpariertes Amplifikat gemischt und durch Zugabe von Ligase ligiert.
Die Transformation der ligierten Vektoren erfolgte im gleichen Reaktionsgefäß durch Zugabe von kompetenten E. co//-Zellen (Stamm DHδalpha) und Inkubation für 20' bei 1 °C, gefolgt von einem Hitzeschock für 90" bei 42 °C und Abkühlung auf 4 °C. Dann erfolgte die Zugabe von Vollmedium (SOC) und eine Inkubation für 45' bei 37 °C. Im Anschluss wurde der gesamte Ansatz auf einer Agarplatte mit Antibiotika (ausgewählt, je nach verwendeten binären Vektor) aus- plattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die erfolgreiche Klonierung wurde durch eine Amplifikation mit Hilfe von Primern überprüft, die stromaufwärts und stromabwärts von der Restriktionsschnittstelle binden und somit die Amplifikation der Insertion ermöglichen. Die Amplifikation erfolgte entsprechend dem Protokoll der Taq DNA-Polymerase (Fa. Gibco-BRL). Die Zusammensetzung war wie folgt: 1x PCR-Puffer [20 mM Tris-HCL (pH 8,4), 1,5 mM MgCI2, 50 mM KCl, 0,2 mM dNTP, 5 pmol forward-Primer, 5 pmol reverse-Primer, 0,625 u Taq DNA-Polymerase.
Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: 1 Zyklus für 5' bei 94 °C, gefolgt von 35 Zyklen jeweils mit 15" 94 °C, 15" 66 °C und 5' 72 °C, gefolgt von 1 Zyklus für 10' bei 72 °C, dann 4 °C .
Es wurden mehrere Kolonien überprüft, wobei nur eine Kolonie weiterverwendet wurde, für die ein PCR-Produkt der erwarteten Größe detektiert wurde.
Ein Aliquot dieser positiven Kolonie wurde in ein mit Vollmedium (LB) befülltes Reaktionsgefäß transferiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Das LB-Medium enthielt für die Selektion des Klones ein Antibiotikum das je nach verwendeten binären Vektor und dem darin enthaltenen Resistenzgen ausgewählt wurde.
Die Plasmidpräparation erfolgte nach den Vorgaben des Qiaprep-Standardprotokolls (Fa. Qia- gen).
Beispiel 11: Herstellung von transgenen Pflanzen, die SEQ ID: NO 1 exprimieren
1 ng der isolierten Plasmid-DNA wurde mittels Elektroporation in kompetente Zellen von Agrobacterium tumefaciens, beispielsweise des Stamms GV 3101 pMP90 (Koncz and Schell, Mol. Gen. Gent. 204, 383-396, 1986) transformiert. Die Auswahl des Agrobakterienstamms, hängt von der Wahl des binären Vektors ab. Eine Übersicht über mögliche Stämme und ihre Eigenschaften findet sich in Hellens, R., Mullineaux, P. und Klee H. , [(2000) " A guide to Agrobacterium binary vectors .Trends in Plant Science, Vol 5 No.10, 446-451. Darauf erfolgte die Zugabe von Voilmedium (YEP) und der Transfer in ein neues Reaktionsgefäß für 3 h bei 28 °C. Im Anschluss wurde der gesamte Ansatz auf YEP-Agarplatten mit den respektiven Antibiotika, bspw. Rifampicin und Gentamycin für GV3101 pMP90, sowie ein weiteres Antibiotika für die Selekion auf den binären Vektor ausplattiert und 48 h bei 28 °C inkubiert.
Die in den gemäß Beispiel 10 erzeugten Agrobakterien mit dem Plasmidkonstrukt wurden dann für die Pflanzentransformation verwendet. Es wurde mit Hilfe einer Pipettenspitze eine Kolonie von der Agarplatte gepickt und in 3 ml TB Medium flüssig, das auch entsprechende Antibiotika, je nach Agrobakterienstamm und binären Plasmid enthielt, aufgenommen. Die Vorkultur wuchs 48 h bei 28 °C und 120 rpm.
Zur Hauptkultur wurden 400 ml LB Medium, das die gleichen Antibiotika wie zuvor enthielt, ver- wendet. Die Vorkultur wurde in die Hauptkultur überführt. Diese wuchs 18 h bei 28 °C und 120 rpm. Nach dem Zentrifugieren bei 4000 rpm wurde das Pellet in Infiltrationsmedium (MS- Medium, 10 % Saccharose) resuspendiert.
Für die Anzucht der Pflanzen für die Transformation wurden Schalen (Piki Saat 80, grün mit Siebboden, 30 x 20 x 4,5 cm, Firma Wiesauplast, Kunststofftechnik, Deutschland) mit einem GS 90 Substrat (Einheitserde, Werkverband E.V., Deutschland) bis zur Hälfte gefüllt. Die Schalen wurden über Nacht mit 0,05 % Previcur Lösung ( Previcur N, Aventis CropScience oder ProplantChimac-Agriphar, Belgien) gewässert. Arabidopsis thaliana C24 Samen (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, UK ; NASC Stock N906) wurden auf die Schale gestreut, etwa 1000 Samen je Schale. Die Schalen wurden mit einer Haube abgedeckt und in die Stratifizierung ge- stellt (8 h, 110 μ μmol/m2/s'1, 22 °C; 16 h, dunkel, 6 °C). Nach 5 Tagen wurden die Schalen in das Kurztag-Phytotron gestellt ( 8h 130 μmol/m2/s"1, 22 °C; 16 h, dunkel 20 °C). Hier blieben sie etwa 10 Tage, bis die ersten Laubblätter gebildet wurden.
Die Keimlinge wurden in Töpfe, die das gleiche Substrat enthielten, transferiert (Teku-Töpfe, 7 oder 10cm , Serie LC, Hersteller Pöppelmann GmbH&Co, Deutschland). Es wurden fünf oder neun Pflanzen in einen Topf pikiert. Die Töpfe wurden dann wieder zum weiteren Wachstum in das Kurztag-Phytotron gestellt.
Nach 10 Tagen kamen die Pflanzen dann in die Gewächshauskabine (Zusatzbeleuchtung, 16 h, 340 μE, 22 °C; 8 h, dunkel, 20 °C). Hier wuchsen sie noch 17 Tage weiter.
Für die Transformation wurden 6 Wochen alte, gerade blühende Arabidopsis-Pflanzen für 10 sec in die oben beschriebene Agrobakterien-Suspension getaucht. Dieses wurden zuvor mit 10μl Silwett L77 (Crompton S.A., Osi Specialties, Schweiz) versetzt. Die entsprechende Methode ist beschrieben in Clough und Bent, 1998 (Clough, JC and Bent, AF..1998 Floral dip: a simplified method for >Agroόacter/u/77-mediated transformation of Arabidopsis thaliana, Plant J.. 16:735-743
Anschließend wurden die Pflanzen 18 h in eine feuchte Kammer gelegt. Danach stellte man die Töpfe zum weiteren Wachstum wieder ins Gewächshaus. Hier verblieben die Pflanzen noch 10 Wochen, bis die Samen geerntet werden konnten. Je nach für die Selektion der transformierten Pflanzen verwendetem Resistenzmarker wurden die geernteten Samen im Gewächshaus ausgebracht und der Sprühselektion unterworfen oder aber nach Sterilisation auf Agarplatten mit dem respektiven Selektionsagens angezogen. Nach ca. 10-14 Tagen unterschieden sich die transformierten resistenten Pflanzen deutlich von den abgestorbenen Wildtypkeimlingen und konnten in 6-cm-Töpfe pikiert werden Die Samen der transgenen A. thaliana Pflanzen wurden im Gefrierschrank (bei -20 °C) aufbewahrt.
Analog wurden auch die anderen im Verfahren verwendeten Sequenzen in Pflanzen exprimiert.
Beispiel 12 Anzucht der Pflanzen für bioanalytische Untersuchungen.
Um die transgene Pflanzen bioanalytisch zu untersuchen wurde sie in einer speziellen Anzucht gleichmäßig kultiviert. Dazu wurde als Bodengemisch das GS-90 Substrat in der Topfmaschine (Laible System GmbH, Singen, Deutschland) gebracht und in die Töpfe gefüllt. Danach wurden 35 Töpfe in eine Schale zusammengestellt und mit Previcur behandelt. Für die Behandlung wurden 25 ml Previcur in 10 I Leitungswasser aufgenommen. Diese Menge reichte aus, um ca. 200 Töpfe zu behandeln. Die Töpfe wurden in die Previcur-Lösung gestellt und von oben zusätzlich mit Leitungswasser ohne Previcur begossen. Die Aussaat fand am gleichen oder innerhalb von drei Tagen statt. .
Für die Aussaat wurden die im Kühlschrank (bei -20 °C) aufbewahrten Samen aus den Eppen- dorfröhrchen mit Hilfe eines Zahnstochers entnommen und in die Töpfe mit der Erde überführt. Insgesamt wurden ca. 5-12 Samen in dem Topf mittig verteilt.
Nach der Aussaat wurden die Schalen mit den Töpfen mit einer dazu passenden Plastikhaube bedeckt und in die Stratifizierungskammer für 4 Tage bei einer Dunkelheit und 4 °C gestellt. Die Feuchtigkeit betrug ca. 80-90 %. Nach der Stratifizierung wurden die Testpflanzen 22-23 Tage bei einem 16 h Licht und 8 h Dunkelrhythmus bei 20 °C, einer Luftfeuchtigkeit von 60 % und einer C02-Konzentration von 400 ppm kultiviert. Als Lichtquelle dienten Powerstar HQI-T 250 W/D Daylight Lampen von Osram, die ein dem Sonnenfarbspektrum ähnelndes Licht mit einer Lichtintensität von ca. 220 μE/m2/s"1 erzeugen.
Im Alter von 8, 9 und 10 Tagen wurden die Pflanzen der Selektion auf den Resistenzmarker unterworfen. Nach weiteren 3-4 Tagen konnten dann deutlich die transgenen, resistenten Keim- linge (Pflänzchen im Vierblattstadium) von den nicht transformierten Pflänzchen unterschieden werden. Die nicht transgenen Keimlinge waren ausgebleicht oder abgestorben. Die transgenen resistenten Pflanzen wurden im Alter von 14 Tagen vereinzelt. Die am optimalsten in der Mitte des Topfes gewachsenen Pflanzen wurden als Zielpflanze betrachtet. Mit Hilfe von Metallpinzetten wurden alle übrigen Pflanzen vorsichtig entfernt und verworfen.
Während des Wachstums wurden die Pflanzen mit destilliertem Wasser von oben (auf die Erde) und von unten in die Aufstellrinnen gegossen. Im Alter von 23 Tagen wurden dann die gewachsenen Pflanzen geerntet.
Analog wurden auch die Pflanzen mit den weiteren im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Sequenzen analysiert.
Beispiel 13: Metabolische Analyse von transformierten Pflanzen
Die erfindungsgemäß identifizierten Änderungen in dem Inhalt an beschriebenen Metaboliten wurden durch folgendes Verfahren identifiziert.
a) Probennahme und Lagerung der Proben
Die Probenahme fand direkt in der Phytotronkammer statt. Die Pflanzen wurden mit einer kleinen Laborschere abgeschnitten, rasch auf einer Laborwaage gewogen, in eine vorgekühlte Extraktionshülse überführt und in ein Aluminiumrack das durch Flüssigstickstoff gekühlt ist, ge- steckt. Wenn erforderlich, können die Extraktionshülsen bei -80 °C im Gefrierschrank gelagert werden. Die Zeit vom Abschneiden der Pflanze bis zum Einfrieren in Flüssigstickstoff betrug nicht mehr als 10 - 20 s.
b) Gefriertrocknung
Es wurde darauf geachtet, dass während des Versuches die Pflanzen bis zum ersten Kontakt mit Lösemitteln entweder in tiefkaltem Zustand blieben (Temperaturen < -40 °C) oder durch Gefriertrocknen vom Wasser befreit wurden.
Das Aluminiumrack mit den Pflanzenproben in den Extraktionshülsen wurde in die vorgekühlte (-40 °C) Gefriertrocknungsanlage gestellt. Die Anfangstemperatur während der Haupttrocknung betrug -35 °C, der Druck betrug 0,120 mbar. Während der Trocknung wurden die Parameter entsprechend eines Druck- und Temperaturprogrammes verändert. Die Endtemperatur nach 12 Stunden betrug +30 °C, und der Enddruck lag bei 0,001 bis 0,004 mbar. Nach dem Abschalten der Vakuumpumpe und der Kältemaschine wurde das System mit Luft (durch ein Trockenrohr getrocknet) oder Argon belüftet.
c) Extraktion
Die Extraktionshülsen mit dem gefriergetrockneten Pflanzenmaterial wurden unmittelbar nach der Belüftung des Gefriertrocknungsgerätes in die 5-mL-Extraktionskartuschen eines ASE- Gerätes (Accelerated Solvent Extractor ASE 200 mit Solvent Controller und AutoASE-Software (Firma DIONEX)) überführt.
Die 24 Probenpositionen des ASE-Gerätes wurden mit Pflanzenproben gefüllt.
Die polaren Substanzen wurden mit ca. 10 mL Methanol/Wasser (80/20, v/v) bei T = 70 °C und p = 140 bar, 5 min Aufheizphase, 1 min statische Extraktion, extrahiert. Die lipophileren Substanzen wurden mit ca. 10 mL Methanol/Dichlormethan (40/60, v/v) bei T = 70 °C und p = 140 bar, 5 min Aufheizphase, 1 min statische Extraktion, extrahiert. Beide Lösemittelgemische wurden in dasselbe Probengläschen (Zentrifugengläser, 50 mL mit Schraubkappe und durchstechbarem Septum für die ASE (DIONEX)) extrahiert.
Die Lösung wurde mit internen Standards versetzt: Ribitol, L-Glycin-2,2-d2, L-Alanin-2,3,3,3-d , Methionin-methyl-d3 und α-Methylglucopyranosid und Nonadecansäure-Methylester, Undecan- säure-Methylester, Tridecansäure-Methylester, Pentadecansäure-Methylester, Nonacosansäu- re-Methylester.
Der Gesamtextrakt wurde mit 8 mL Wasser versetzt. Der feste Rückstand der Pflanzenprobe und die Extraktionshülse wurden verworfen.
Der Extrakt wurde geschüttelt und dann bei mindestens 1400 g für 5 bis 10 min zentrifugiert, um die Phasentrennung zu beschleunigen. 1 mL der überstehenden Methanol/Wasser-Phase ("polare Phase", farblos) wurde für die weitere GC-Analyse abgenommen, 1 mL wurde für die LC- Analyse entnommen. Der Rest der Methanol/Wasser-Phase wurde verworfen. 0,5 mL der orga- nischen Phase ("Lipide Phase", dunkelgrün) wurde für die weitere GC-Analyse entnommen,
0,5 mL wurden für die LC-Analyse entnommen. Alle entnommenen Aliquote wurden mit dem IR- Dancer Infrarot-Vakuum-Evaporator (Hettich) zur Trockne eingedampft. Die maximale Temperatur während des Eindampf-Vorgangs überschritt dabei nicht 40 °C. Der Druck im Gerät betrug nicht weniger als 10 mbar.
d) Weiterverarbeitung der Lipid-Phase für die LC/MS- oder LC/MS/MS-Analyse
Der zur Trocknung eingedampfte Lipide Extrakt wurde in Laufmittel aufgenommen. Der HPLC- Lauf wurde mit Gradientenelution durchgeführt.
Der zur Trocknung eingedampfte polare Extrakt wurde in Laufmittel aufgenommen. Der HPLC- Lauf wurde mit einer Gradientenelution durchgeführt.
e) Derivatisierung der Lipid-Phase für die GC/MS-Analyse Zur Transmethanolyse wurde eine Mischung aus 140 μL Chloroform, 37 μL Salzsäure (37 Gew.- % HCI in Wasser), 320 μL Methanol und 20 μL Toluol zu dem eingedampften Extrakt zugefügt. Das Gefäß wurde dicht verschlossen und unter Schütteln 2 h bei 100 °C erhitzt. Anschließend wurde die Lösung zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde vollständig getrocknet.
Die Methoximierung der Carbonylgruppen erfolgte durch Reaktion mit Methoxyamin-
Hydrochlorid (5 mg/mL in Pyridin, 100 μL für 1,5 h bei 60 °C im dicht verschlossenen Gefäß. 20 μL einer Lösung von ungeradzahligen, geradkettigen Fettsäuren (je 0,3 mg/mL von Fettsäuren mit 7 bis 25 Kohlenstoffatomen und je 0,6 mg/mL der Fettsäuren mit 27, 29 und 31 Kohlenstoffatomen gelöst in einem Gemisch aus 30 % Pyridin in Toluol v/v) wurden als Zeitstandards zuge- setzt. Schließlich wurde mit 100 μL N-Methyl-N-(trimethylsilyl)-2,2,2-trifluoracetamid (MSTFA) für 30 min bei 60 °C im wieder dicht verschlossenen Gefäß derivatisiert. Das Endvolumen vor der GC-Injektion war 220 μL.
f) Derivatisierung der polaren Phase für die GC/MS-Analyse
Die Methoximierung der Carbonylgruppen erfolgte durch Reaktion mit Methoxyamin- Hydrochlorid (5 mg/mL in Pyridin, 50 μL für 1,5 h bei 60 °C im dicht verschlossenen Gefäß. 10 μL einer Lösung von ungeradzahligen, geradkettigen Fettsäuren (je 0,3 mg/mL von Fettsäuren mit 7 bis 25 Kohlenstoffatomen und je 0,6 mg/mL der Fettsäuren mit 27, 29 und 31 Kohlenstoffatomen gelöst in einem Gemisch aus 30 % Pyridin in Toluol v/v) wurden als Zeitstandards zugesetzt. Schließlich wurde mit 50 μL N-Methyl-N-(trimethylsilyl)-2,2,2-trifluoracetamid (MSTFA) für 30 min bei 60 °C im wieder dicht verschlossenen Gefäß derivatisiert. Das Endvolumen vor der GC-Injektion war 110 μL.
g) Analyse der verschiedenen Pflanzenproben
Die Proben wurden in einzelnen Serien zu jeweils 20 Pflanzenproben (sogenannte Sequenzen) gemessen, wobei jede Sequenz mindestens 5 Wildtyppflanzen als Kontrolle enthält. Die Peakfläche oder die Peakhöhe jedes Analyten wurde durch die Peakfläche des jeweiligen Internen Standards dividiert. Die Daten wurden auf das für die Pflanze eingewogene Frischgewicht normiert. Die so berechneten Werte wurden auf die Wildtypkontrollgruppe bezogen, indem sie durch den Mittelwert der entsprechenden Daten der Wildtypkontrollgruppe derselben Sequenz dividiert wurden. Die erhaltenen Werte wurden als xfache bezeichnet, sind sequenzübergreifend vergleichbar und geben an, wie vielfach sich die Analytkonzentration in der Mutante relativ zur Wildtypkontrolle unterscheidet.
Alternative können die Aminosäuren vorteilhaft über eine HPLC-Auftrennung in ethanolischen Extrakten nach Geigenberger et al. (Plant Cell & Environ, 19, 1996: 43 - 55) nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der verschiedenen Analysen der Pflanzen sind der folgenden Tabelle zu entnehmen:
YEL046C
Figure imgf000073_0001
Spalte 1 der Tabelle gibt die Probennummer wieder. Spalte 2 ist die analysierte Aminosäure zu entnehmen. Spalte 3 zeigt das Verhältnis der analysierten Aminosäure zwischen der trangenen Pflanze und dem Wildtyp. Spalte 4 gibt das Verhältnis der transgenen Pflanze gegenüber dem Mediän anderer transgener Pflanzen, die nicht mit dem Threonin-Aldolase-Gen transformiert wurden, wieder. Spalte 5 gibt die Analysenmethode wieder.
Alle Ergebnisse ergaben sich bei unabhängiger Wiederholung der Analysen als signifikant.
YJL055W
Figure imgf000073_0002
Spalte 1 der Tabelle gibt die Analytnummer wieder. Spalte 2 ist die analysierte Aminosäure zu entnehmen. Spalte 3 zeigt das Verhältnis der analysierten Aminosäure zwischen der transgenen Pflanze und dem Wildtyp (x-fache nach der Ratio_by_WT-Methode). Spalte 4 gibt die Analysenmethode wieder.
Alle Ergebnisse ergaben sich bei unabhängiger Wiederholung der Analysen als signifikant.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst:
a) Einbringen einer Nukleinsauresequenz, die für ein Threonin-abbauendes Protein oder Lysin-abbauendes Protein codiert oder für ein Threonin-abbauendes Protein und Lysin-abbauendes Protein codiert, oder
b) Einbringen einer Nukleinsauresequenz, die den Threoninabbau oder Lysinabbau oder den Threoninabbau und Lysinabbau in den transgenen Organismen erhöht und c) Expression einer unter (a) oder (b) genannten Nukleinsauresequenz im transgenen Organismus.
2. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst, gelöst:
a) Einbringen einer Nukleinsauresequenz, die für ein Threonin-abbauendes Protein codiert, das folgende Consensus-Sequenz enthält
H[x]2G[X]R[X]19D[X]7K[X]27G, oder
HXDGAR[X]3A[X]15D[X]4CXSK[X]4PXGS[X]3G[X]7A[X]4K[X]2GGGXRQXG , oder b) Einbringen einer Nukleinsauresequenz, die den Threoninabbau in den transgenen Organismen erhöht und
c) Expression einer unter (a) oder (b) genannten Nukleinsauresequenz im transgenen Organismus.
3. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen nach Anspruch
1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst, gelöst:
a) Einbringen einer Nukleinsauresequenz, die für ein Lysin-abbauendes Protein codiert, das folgende Consensus-Sequenz enthält
G|X] GIM[Xl46 pq2Rr |2Mp lιιGGXG|X!3E|Xl2Ep 3W, oder
LG[X]9LVYGG[X]3GIMGXVA[X]9G[X]3GXIP[X]24MHXRK[X]2M[X]6F[X]3PGGXGT XEE[X]2 E[X]2TW[X]2IG[X]3KP[X]4N[X]3FY[X]14F, oder
b) Einbringen einer Nukleinsauresequenz, die den Lysinabbau in den transgenen
Organismen erhöht und
Seq c) Expression einer unter (a) oder (b) genannten Nukleinsauresequenz im transgenen Organismus.
4. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst, gelöst: a) Einbringen einer Nukleinsauresequenz, die für ein Threonin-abbauendes Protein codiert, das folgende Consensus-Sequenz enthält
H[x]2G[X]R[X]19D[X]7K[X]27G, oder
HXDGAR[X]3A[X]15D[X]4CXSK[X]4PXGS[X]3G[X]7A[X]4K[X]2GGGXRQXG
und Einbringen einer Nukleinsauresequenz, die für ein Lysin-abbauendes Protein codiert, das folgende Consensus-Sequenz enthält
G\)q M[X]i5M[X]2RK[X]2M[X GGXG[X]3E\X]2E X]3W, oder
LG[X]9
LVYGG[X]3GIMGXVA[X]9G[X]3GXIP[X]24MHXRK[X]2M[X]6F[X]3PGGXGTXEE
[X]2E[X]2TW[X]2IG[X]3KP[X]4N[X]3FY[X]14F, oder b) Einbringen einer Nukleinsauresequenz, die für Proteine codiert, die den Threoninabbau und Lysinabbau in den transgenen Organismen erhöhen, und c) Expression einer unter (a) oder (b) genannten Nukleinsauresequenz im transgenen Organismus.
5. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen nach An- spruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass im Verfahrensschritt (a) gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 eine Nukleinsauresequenz eingebracht wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe der Nukieinsäuresequenzen: i) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 11 , SEQ ID
NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 dargestellten Sequenz; ii) einer Nukleinsauresequenz, die aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 oder SEQ ID NO: 26 dargestellten Aminosäuresequenz erhalten wird und iii) eines Derivats der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID
NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 oder SEQ ID NO: 25 dargestellten Nukleinsauresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 oder SEQ ID NO: 26 dargestellten Aminosäuresequenz codiert und mindestens 50 % Homologie auf - Aminosäureebene aufweisen, ohne dass die biologische Aktivität der Polypeptide wesentlich reduziert ist.
6. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen nach Anspruch 1 oder 2 oder den Ansprüchen 4 und 5 dadurch gekennzeichnet, dass im Verfahrensschritt (a) eine Nukleinsauresequenz eingebracht wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe der Nukieinsäuresequenzen: i) einer Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID
NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 dargestellten Aminosäuresequenz erhalten wird;
ii) eines Derivats der Nukleinsauresequenz, die durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 dargestellten Aminosäuresequenz erhalten wird und welche mindestens 70 % Homologie auf Aminosäureebene zu den vorgenannten Aminosäuresequenzen aufweist, ohne dass die biologische Aktivität der Polypeptide wesentlich reduziert ist.
7. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen nach den An- Sprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der transgene Organismus nach Einbringen und Expression der Nukleinsäure kultiviert und geerntet wird.
8. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure aus dem Organismus oder dem Kulturmedium oder dem Organismus und dem Kulturmedium isoliert wird.
9. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure ausgewählt ist aus der Gruppe Methionin, Homoserin und Lysin.
10. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die essentielle Aminosäure Methionin handelt.
11. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem transgenen Organismus um einen Mikroorganismus oder um eine Pflanze handelt.
12. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen nach den An- Sprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem transgenen Orga- nismus um einen Mikroorganismus ausgewählt aus der Gruppe der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia, Bacillus, Rhodotorula, Hansenula, Schizosaccharomyces, Saccharomyces, Candida, Claviceps oder Flavobacterium handelt.
13. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen nach den An- Sprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem transgenen Organismus um eine Pflanze ausgewählt aus der Gruppe der Nutzpflanzen handelt.
14. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem transgenen Organismus um eine Pflanze ausgewählt aus der Gruppe der Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Safflor (Färberdistel), Olive, Sesam, Haselnuss, Mandel, Avocado, Lorbeer, Kürbis, Salat, Lein,
Soja, Pistazien, Borretsch, Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Hirse, Triticale, Reis, Gerste, Maniok, Kartoffel, Zuckerrübe, Futterrübe, Aubergine, Tomate, Erbse, Alfaalfa sowie ausdauernde Gräser und Futterfeldfrüchte handelt.
15. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen nach den An- Sprüchen 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsauresequenz aus einem
Eukaryont stammt.
16. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen nach den Ansprüchen 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsauresequenz aus der Gattung Saccharomyces stammt.
17. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen nach den Ansprüchen 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsauresequenz zum Einbringen und zur Expression in ein Nukleinsäurekonstrukt oder einen Vektor eingebaut wird.
18. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren in transgenen Organismen nach den An- Sprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich Biosynthesegene der im
Verfahren hergestellten Aminosäure in den Organismus eingebracht werden.
19. Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine Nukleinsauresequenz gemäß den Ansprüchen 2 bis 6, die funktionell mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.
20. Vektor enthaltend eine Nukleinsauresequenz gemäß den Ansprüchen 2 bis 6oder ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 19.
21. Transgener prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus enthaltend mindestens eine Nukleinsauresequenz gemäß den Ansprüchen 2 bis 6 oder mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 19 oder mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 20.
22. Transgener prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus nach Anspruch 21 , wobei es sich um einen Mikroorganismus oder um eine Pflanze handelt.
23. Transgener prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus nach Anspruch 22, wobei es sich um einen Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium handelt.
24. Transgener prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus nach Anspruch 22, wo- bei es sich um eine Pflanze ausgewählt aus der Gruppe der Gattung der Erdnuss,
Raps, Canola, Sonnenblume, Safflor (Färberdistel), Olive, Sesam, Haselnuss, Mandel, Avocado, Lorbeer, Kürbis, Salat, Lein, Soja, Pistazien, Borretsch, Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Hirse, Triticale, Reis, Gerste, Maniok, Kartoffel, Zuckerrübe, Futterrübe, Aubergine, Tomate, Erbse, Alfaalfa sowie ausdauernde Gräser und Futterfeldfrüchte han- delt.
25. Verwendung der transgenen Organismen gemäß den Ansprüchen 21 bis 24 oder einer Aminsäure hergestellt nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 18 zur Herstellung eines Futtermittel- oder Nahrungsmittel, zur Herstellung von Kosmetika oder Pharmazeutika.
26. Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzen SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10.
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