WO2004055184A1 - グルコース及び／又はフルクトーストランスポータＮａＧＬＴ１及びその遺伝子 - Google Patents
グルコース及び／又はフルクトーストランスポータＮａＧＬＴ１及びその遺伝子 Download PDFInfo
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- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Definitions
- the present invention relates to glucose and / or fructose transporters, their genes, their variants, and their use. Rice field
- the combined kidneys of a human are only 0.5% of body weight, but they draw about 20% of cardiac output, or 1-1.2 L / min. Approximately 20% of its plasma flow, or 120 mL / min (200 L / day), is filtered by the glomerulus into raw urine, of which 99% is reabsorbed by the tubules and the remainder 1.5 to 2 L is the daily urine output.
- the kidney is composed of a functional unit, nephron, and the vascular system surrounding it. Nephrons begin in the glomerulus and pass through the proximal tubule, the middle tubule (Henle's loop), and the distal tubule to the collecting tubule. Each segment has a different function and morphology and cooperatively involved in urine enrichment and production.
- the cells constituting the proximal tubule have a large surface area due to the development of the luminal brush border membrane, so that they can reabsorb water and electrolytes in the raw urine as well as other low-molecular-weight nutrients, as well as drugs in the blood. It is an efficient form for secretion of foreign substances and foreign substances (Monthly Pharmaceutical Affairs Vol.43, No.3, pp29-34, 2001, Monthly Pharmaceutical Affairs Vol.42, No.4, ppll 3-120, 2000).
- the blood-side basal lamina and the luminal brush border membrane of the proximal tubular epithelial cells contain transporters that mediate the reabsorption and secretion of these various substances, and they are direction-selective. Network that enables efficient mass transport (BIO Clinica, 11, 22-25, 1996, Biological Sciences, 50, 268-273, 1999).
- the cloning and structural analysis of glucose transgene which controls the renal excretion of glucose, have been remarkably advanced.In the kidney, the glucose that has migrated into the urine by the glomerulus has been reabsorbed. The mechanism by which it is returned to the blood is being elucidated at the molecular level.
- blood glucose is filtered by the glomeruli of the kidney and reabsorbed in the tubules.
- glucose is reabsorbed 100% and returned to the circulating blood.
- transport proteins for the purpose of transport.
- Transmembrane proteins which transport substances inside and outside the cells, are transporters.
- the transporters are responsible for the process by which drugs and nutrients taken into the body move to and It is involved in the discharge of waste products accumulated in Japan (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-171980).
- transport proteins transport proteins that mediate reabsorption and secretion of various substances are localized in the blood-side basal membrane and luminal brush border membrane of proximal tubular epithelial cells.
- a network has been formed that enables direction-selective mass transport that takes advantage of environmental properties such as membrane potential differences and pH gradients formed inside and outside (BIO Clinica, 11, 22-25, 1996; Biological Sciences, 50, 268-273, 1999
- Vertebrate glucose transport is roughly divided into two types.
- One is the facilitated glucose transporter (GLUT), which is a transporter of the facilitated diffusion type that transports according to the glucose concentration gradient inside and outside the cell.
- This protein has eight additional isoforms with a molecular weight of about 50,000. It is a twice transmembrane protein (Annu. Rev. Physiol. 55, 591-608, 1993, TIBS 23, 476-481, 1998, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-218981). Basically, all cells express at least one type of GLUT, thereby obtaining the necessary glucose from outside the cell.
- the other is the Na + -Z glucose transporter (SGLT), an active transport carrier that transports glucose against a concentration gradient by conjugating with Na ions. Yes, it is a 14-transmembrane protein with a molecular weight of about 75,000.
- This protein is present in the apical membrane of epithelial cells facing the lumen side of the small intestine and kidney, and uses the gradient of the Na + electrochemical potential inside and outside the cell to produce glucose. Rev. 74, 993-1026, 1994, Am. J. Physiol. 276, (5 Pt 1), G1251-1259, 1999, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-2. Publication No. 18981). Glucose and Na + taken into epithelial cells by SGLT are released into the blood by the action of GLUT_2 and Na + -K + pumps present in the baso-lateral membrane .
- SGLT-1 transports two Na + ions per sugar molecule, has high affinity for glucose and galactose, and is expressed in the small intestine and kidney.
- SGLT-2 transports one Na + ion per sugar molecule, has low affinity for glucose, and does not carry galactose. Although this protein is expressed in the kidney, its expression in the small intestine has not been confirmed.
- SGL T-1 and SGL T-12 function in different parts of the kidney.
- glucose transporters SGLT1 and SGLT2 are expressed in the kidney, and the process of reabsorption of glomerularly filtered glucose into tubular epithelial cells depends on these two types of transporters. It is believed to be mediated by
- Another cause of renal diabetes may be that the apparent threshold of Darcos has decreased, but both the average threshold and the TmG are quite normal.
- the abnormal increase in urinary excretion of glucose seen in this case is only present when the plasma concentration of glucose is low.
- excretion of glucose at plasma levels exceeding the maximum threshold is rather normal (Medical Encyclopedia, 18th ed., Ppl 059-: L060, Minamiyamado, 1989, Biochemical Dictionary 2nd Edition, pp 673, Tokyo Chemical Dojin, 1900) 0
- Renal diabetes is thought to be due to glucose reabsorption in the kidney, which mediates the process of reabsorption of glomerularly filtered glucose into tubular epithelial cells in the kidney. It is thought to be due to a congenital or acquired deficiency of two known transport types, SGLT1 and SGLT2. I However, the causative gene has not yet been identified, and has been thought to be caused by an inborn or acquired defect of the known SGLT1 and SGLT2 genes and other unknown transport genes. .
- An object of the present invention is to provide a novel glucose transporter that is expressed in the kidney and is involved in glucose reabsorption in the kidney, a gene thereof, a mutant thereof, and a use thereof.
- Renal diabetes is due to impaired glucose reabsorption in the kidney, which was thought to be due to a congenital or acquired defect in the known glucose transport genes SGLT1 and SGLT2.
- the gene could not be identified.
- the present inventors have found a gene that is highly expressed in the kidney other than the known SGLT1 and SGLT2 glucose transporter genes, and have completed the present invention. .
- the glucose transporter of the present invention has a higher expression level than known SGLT1 and SGLT2, and makes a greater contribution to glucose reabsorption in the kidney and specifically recognizes glucose. Has the property.
- the glucose transporter of the present invention was named "glucose transporter NaGLTl”. Further, as a result of the investigation, it was found that NaGLT1 of the present invention has a Na + -dependent fructos transporter function.
- the present invention also relates to a mutant of Darcos and / or fructose transporter NaGLT1 and its gene, and glucose and Z or F Includes antibodies that specifically bind to Lactose transporter NaGLTI. Further, the present invention relates to a model non-human animal and a model non-human animal developing renal diabetes in which a gene function of expressing a glucose and / or a polypeptide having a fructotransposon function of the present invention is deleted on a chromosome. Screening of preventive / therapeutic agents for renal diabetes using human animals, and a method for diagnosing renal disease and a diagnostic method for renal diseases using glucose and / or fructosporin function using the genes and antibodies of the present invention. Includes. The present invention also encompasses a method for controlling the expression of the gene of the present invention using antisense strand DNA or the like and regulating glucose and / or fructose transport function in animal tissue cells. . Disclosure of the invention
- the present invention relates to a DNA comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a complementary sequence thereof, or a sequence containing a part or all of these sequences (claim 1). ) Or a DNA that encodes a polypeptide that hybridizes with the DNA of claim 1 under stringent conditions and has a darcos and / or fructose transporter function (claim 2).
- a method for producing a polypeptide having a glucose and / or fructotransporter function characterized by introducing a vector into a host cell for expression (claim 6), or the polypeptide according to claim 4 or 5
- the present invention provides an animal tissue cell expressing a polypeptide having glucose and Z or a fructotransport function, wherein the DNA according to any one of claims 1 to 3 is introduced into the animal tissue cell.
- the tissue cells are rat kidney tissue cells, pig kidney-derived epithelial cells, dog kidney-derived epithelial cells, or possum kidney-derived epithelial cells.
- a method for screening a substance having a glucose and Z or fructose transport function regulating activity (Claim 14), which is characterized by measuring the glucose and Z or fructose transporter shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
- a model non-human animal that develops renal diabetes caused by impaired glucose reabsorption in the kidney characterized in that the gene function that expresses a polypeptide having a toose transporter function is deleted on the chromosome.
- Claim 15) or the deficiency of the function of a gene that expresses a polypeptide having a glucose and / or fructose transport function is caused by the glucose and Z or fructose transport function shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
- Consisting Ichita functional diagnostic microarray or DNA chip claims 1-9).
- the present invention provides a method for diagnosing glucose and Z or fructos transport function, comprising preparing the antibody according to any one of claims 7 to 9 and the diagnostic probe according to claim 18.
- a sample is obtained from a drug (claim 20) or a test tissue, and expression of the gene according to claim 1 in the sample is determined.
- the method for diagnosing glucose and / or fructose transport function characterized by measuring (Claim 21) and the measurement of gene expression according to Claim 21 are performed by the method according to Claim 18.
- a method for diagnosing a toose transporter function (Claim 22) and a method for obtaining a sample from a test tissue, culturing the same, and measuring the polypeptide according to claim 4 which is produced by expression of a gene in the sample.
- a method for diagnosing glucose and / or fructose transport function which is a feature of the present invention (Claim 23), and a method for measuring the polypeptide according to Claim 23.
- Using the antibody according to any one of claims 7 to 9 for diagnosing glucose and / or fructoose transport function (claim 24), and claim 21 to 24.
- a method for diagnosing renal disease characterized in that the diagnosis of glucose and / or fructose transporter function described in any one of the above is a measurement of glucose and / or fructose transposon function in renal disease (claim 2). 5) and a method for regulating glucose and Z or fructose transporter functions in animal tissue cells, which comprises introducing the DNA according to any one of claims 1 to 3 into animal tissue cells. 26) or glucose and Z or fructose transport in animal tissue cells, wherein the expression of the DNA according to claim 1 is suppressed in animal tissue cells.
- the method for regulating the function (Claim 27) and the suppression of the expression of the DNA according to Claim 1 in animal tissue cells can be achieved by converting all or a part of the antisense chain of the DNA base sequence according to Claim 1 into animal tissue cells.
- a method for regulating glucose and / or fructose trans-spotter function in animal tissue cells (claim 28); The method according to any one of claims 26 to 28, wherein the method is a method for regulating glucose and Z or fructose transporter overnight function in animal tissue cells (claim 29).
- FIG. 1 shows, in an embodiment of the present invention, A: a base sequence and an amino acid sequence of Na GLT1 of the present invention; It is a figure which shows (hydrophobic analysis).
- FIG. 2 shows, in an example of the present invention, A: Northern blot analysis of NaGLT1 mRNA in rat cells of the present invention; B: NaGLT1 mRNA in rat cells of the present invention. 4 is a photograph showing that mRNA was detected by PCR.
- FIG. 3 shows that the mRNAs of NaGLT1, SGLT1, SGLT2 and GAPDH of the present invention were detected by PCR in the examples of the present invention, and the respective mRNAs in the kidney were detected. It is a photograph which shows an expression distribution.
- + in the figure shows the results obtained by RT-PCR under the condition containing the reverse transcriptase
- 1 shows the results obtained by performing RT-PCR under the condition not containing the reverse transcriptase.
- FIG. 4 is a diagram showing that the expression levels of NaGLT1, SGLT1, and SGLT2mRNA of the present invention were quantitatively analyzed by real-time PCR in the examples of the present invention.
- FIG. 5 is a diagram showing the accumulation of various saccharides in oocytes injected with water and oocytes injected with water, in which the NaGLT1 mRNA of the present invention was synthesized in vitro in Examples of the present invention. .
- FIG. 6 shows that, in the examples of the present invention, A shows the dependency of the accumulated amount of C 14 C] aMeGlc on the NaGLT1-expressing oocytes of the present invention and the dependency of aMeGlc itself, B is Hill plot using A's data, C is [ 14 C] Q; M FIG. 4D is a diagram showing the dependency relationship between the e G1c accumulation amount and the extracellular Na + ion concentration, and D shows a Hill plot using C data.
- FIG. 7 shows the effect of various sugars on [ 14 C] ⁇ eG1c accumulation in the NaGLT1-expressing oocytes of the present invention and water-injected oocytes in the examples of the present invention.
- FIG. 8 shows the intracellular localization of NaGLT1 protein in the rat kidney membrane site (renal sclera, brush border membrane, and basolateral membrane) in the example of the present invention, which was analyzed by an immunoblot. 4 is a photograph showing a result of the experiment.
- FIG. 9 shows the Na GLT 1-mediated uptake of fructoses by HEK293 cells in the examples of the present invention.
- A shows the results for 15 minutes together with a buffer containing a sugar analog for 15 minutes.
- B shows the uptake of [ 14 C] fruit by HEK293 cells transfected with NaGLTlc DNA for HEK293 cells incubated at 37 ° C. It is a graph.
- FIG. 10 shows the uptake of fructose by the renal brush border membrane vesicles in the examples of the present invention.
- A shows that the membrane vesicles suspended in mannitol and HE PES are treated with a substrate containing mannitol and HE PES.
- B is a graph showing the Na + -dependent uptake of fructose at various concentrations in the incubation buffer for the uptake incubated at 25 with the mixture.
- the present invention relates to glucose and / or fructose transporter N aGL Tl involved in the cause of renal diabetes mellitus and its causative genes,
- Glucose and / or fructo involved in the cause of renal diabetes of the present invention are Glucose and / or fructo involved in the cause of renal diabetes of the present invention.
- Transport DNA NaGLTlc DNA has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Further, glucose and Z or fructose transport protein NaGLTI protein encoded by the cDNA consist of a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
- the cDNA of glucose and Z or fructose transposable NaGLTI which is a novel gene obtained in the present invention, comprises 2,173 base pairs and has a translation region (111 to 15). 6 second) encodes a polypeptide consisting of 484 amino acid residues.
- glucose and glucose or fructose transporter NaGLT1 of the present invention was a once-transmembrane glycoprotein.
- the glucose and glucose or fructose transposon NaGLTl of the present invention is glucose and Z or fructose transport expressed at high levels in the kidney, and does not recognize other monosaccharides and does not recognize glucose and / or fructose transfection. Recognize teeth specifically. Expression of Dulcose and Z or Fructotransport Na in the kidney Na GLT1 is higher than known glucose transport S GLT1 and SGLT2, and is considered to be the cause of renal diabetes It makes a significant contribution to glucose reabsorption in the kidneys.
- the gene of the present invention includes the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the above-mentioned sequence listing or a sequence complementary thereto or a sequence containing a part or all of these sequences, and further, under stringent conditions with the nucleotide sequence.
- Two (a) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing; (b) one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid 'S column shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. And a polypeptide having a polypeptide having a darcose and / or fructose transport function.
- DNA sequence mutations can be performed by well-known genetic engineering gene mutation means.
- the conditions for “hybridization under stringent conditions with the nucleotide sequence” include, for example, hybridization at 42 ° C., 1 XSSC, 0.1% 303 Washing at 42 ° C with a buffer solution containing 0.1% SSC, 0.1% 303 and a buffer solution containing 0.1% 303 at 65 ° C. A washing treatment can be more preferably mentioned.
- the factors affecting the stringency of the hybridization may be various factors other than the above-mentioned temperature conditions, and those skilled in the art may combine various factors to obtain the stringency of the hybridization described above. It is possible to realize a stringency that is equivalent to ENCY.
- the present invention relates to a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added.
- a polypeptide having a glucose and / or fructotransport function In order to obtain the polypeptide of the present invention, it can be obtained by using a known genetic engineering technique. That is, it can be obtained by appropriately incorporating the gene of the present invention into a known expression vector, introducing the recombinant vector into a host cell, and expressing it.
- the present invention further includes an antibody induced by the polypeptide of the present invention and specifically binding to the polypeptide.
- the antibody include a monoclonal antibody and a polyclonal antibody.
- the antibody can be prepared by a conventional method using the polypeptide of the present invention as an antigen.
- the antibody of the present invention can be used for detecting the presence or absence of the expression of the gene of the present invention in renal tissue cells or the like by an antigen-antibody reaction with the glucose and the polypeptide of the present invention having a glucose transporter function. It can be used for diagnosis of renal diseases related to the gene.
- known immunological measurement methods such as, for example, RIA, ELISA, and fluorescent antibody can be used.
- the DNA of the present invention can be introduced into human tissue cells to produce human tissue cells expressing a polypeptide having glucose and / or fructose transport function.
- human tissue cells it is preferable to use kidney tissue cells in which NaG1T1 is strongly expressed, and specific examples of the kidney tissue cells include a human embryonic kidney transformed cell line H EK 293 can be mentioned.
- the animal tissue cells into which the gene of the present invention is introduced include rat kidney tissue cells, porcine kidney-derived epithelial cells LLC—PK canine kidney-derived epithelial cells MD C:, possum kidney-derived epithelial cells OK Can also be used.
- an appropriate gene introduction method such as a transfusion method can be used.
- a new gene of NaG1T1 cloned from human renal cells can be used as a diagnostic probe by using the antisense strand of the nucleotide sequence as a diagnostic probe for glucose and / or fructotransport of renal tissue cells. It can be used for diagnosis of evening function. Further, using the diagnostic probe or the antibody which specifically binds to the polypeptide of the present invention, as a diagnostic agent for the darcos and Z or fructose transport function, and a diagnostic kit equipped with the diagnostic agent Can be used as
- the DNA of the present invention can be immobilized on at least one or more devices and used as a diagnostic microarray or a DNA chip having glucose and glucose transport functions. Glucose and / or other genes such as fructose transposon can be immobilized on the microarray and the DNA chip and used for diagnosis.
- a known gene measuring method such as the RT-PCR method and the Northern plotting method can be used as appropriate.
- the diagnostic method of the present invention to measure the presence or absence and the intensity of expression of glucose and / or fructose transporter Na GLTl gene in renal tissue cells, a genetic disease in human kidney can be obtained. Can be detected.
- introducing the gene of the present invention into human tissue cells or suppressing the expression of the gene of the present invention by introducing an antisense strand to the gene of the present invention can be performed.
- a method for introducing the gene of the present invention into human tissue cells a known gene introduction method such as a transfection method can be used.
- a method usually used in this field can be used.
- antisense oligonucleotides can be administered directly to human tissue cells, such as kidney tissue.
- a pharmaceutically acceptable reagent for introduction into a cell for example, a ribofectin reagent, a lipofectamine reagent, a DOTAP reagent, a Tfx reagent, a liposome, a polymer carrier and the like.
- the model non-human animal that develops renal diabetes according to the present invention is defined as glucose and / or fructose transporter.
- a non-human animal that develops renal diabetes such as malabsorption.
- Specific examples of the non-human animal of the present invention include rodents such as rats, mice, and guinea pigs.
- Model non-human animals used for screening for the renal diabetes mellitus preventive and therapeutic drugs of the present invention As the mouse, a mouse and a rat can be used particularly advantageously, but are not limited to these.
- the production of a model non-human animal in which the NaGLT1 gene function is deficient on the chromosome of the present invention is performed by using a known method for producing a gene-deficient model non-human animal.
- mice lacking NaGLT1 gene function on the chromosome can be obtained, for example, by using a gene fragment obtained from a rat gene library constructed from rat kidney. Screening the NaGLT1 gene, replacing part or all of the screened NaGLTI gene with a marker gene such as the lac-Z gene, neomycin resistance gene, etc., if necessary. Then, a gene such as a diphtheria toxin A fragment (DT-A) gene or a simple herpes virus thymidine kinase (HSV-tk) gene was introduced into the 5 'end to prepare a targeting vector.
- DT-A diphtheria toxin A fragment
- HSV-tk simple herpes virus thymidine kinase
- the resulting evening vector was linearized, introduced into ES cells by electroporation, and homologous recombination was performed.
- the above-mentioned recombinant ES cells are microinjected into mouse blastocysts, and the blastocysts are returned to the foster mother mice to produce chimeric mice.
- a heterozygous mutant mouse (+ Z-) can be obtained.
- a homozygous mutant mouse (—Z—) can be obtained.
- screening for a preventive / therapeutic agent for renal diabetes caused by glucose reabsorption deficiency in the kidney is performed by deficient glucose and / or fructose transporter NaGLTI gene function on the chromosome.
- a test substance is administered to a non-human animal that develops renal diabetes such as glucose and / or fructose reabsorption failure in the kidney, and the model non-human animal or cells, tissues or organs of the model non-human animal are administered. It is performed by measuring and evaluating the and / or fructose glucose reabsorbing ability in the above.
- the gene of the present invention in animal tissue cells, in particular, tissue cells in the kidney
- glucose and / or fructose transport function in animal tissue cells can be regulated.
- the expression of the gene in animal tissue cells can be controlled by introducing the gene of the present invention into animal tissue cells, or suppressing the expression of the gene of the present invention by introducing an antisense strand and siRNA to the gene of the present invention.
- a known gene introduction method such as a transfection method can be used.
- the method generally used in this field can be used for introducing the antisense strand into animal tissue cells.
- the antisense oligonucleotide can be directly administered to animal tissue cells such as kidney tissue.
- the composition can be administered together with a pharmaceutically acceptable intracellular introduction reagent such as a lipofectin reagent, a lipofectamine reagent, a DOTAP reagent, a DNA reagent, ribosome, and a polymer carrier.
- a pharmaceutically acceptable intracellular introduction reagent such as a lipofectin reagent, a lipofectamine reagent, a DOTAP reagent, a DNA reagent, ribosome, and a polymer carrier.
- RNA was extracted by cesium chloride density gradient centrifugation, and poly A + RNA (mRNA) was purified from the total RNA using oligo dT cellulose (manufactured by Stratagene). The purified mRNA was purified from rat kidney cD using a cDNA library production kit (Stratagene).
- the obtained gene sequence information was subjected to homology analysis with the gene sequences registered in the databases of GanBank, EMBL, DDBJ and PDB by BLAST , and divided into a known group and an unknown group.
- mRNA was synthesized in vitro using mCap RNA Capping kit (manufactured by Stratagene), and a transport experiment was performed using an African oocyte expression system.
- aMeGlc metabolically resistant ⁇ -methyl-D-darcopyranoside
- a clone (NaGLTI) that specifically transports E. coli was identified (GeneBank Accession Number: AB089802).
- the isolated NaGLT1c DNA consists of 2,173 base pairs (SEQ ID NO: 1), and its translation region (111-156 second) has 484 amino acid residues. (SEQ ID NO: 2) was encoded (Fig. 1, ⁇ ). From the results of the hydrophobicity analysis, it was inferred that ⁇ aGL ⁇ 1 is a once-transmembrane glycoprotein (FIG. 1B).
- N a C 1 KC 1, magnesium sulfate I mM of N aH 2 P_ ⁇ 4, 1 m M of 5 mM, calcium lactate I mM, 2 mM acetate Na Application Benefits um, 5 5 m MD -.
- Glucose 1 0mM of HE PES Preperfuse the left kidney with 10 ml of pH 7.4. After confirming that there is no congestion etc.
- solution B (lmg / ml collagenage (type I, manufactured by Sigma), 1 mg / m1 PG serum albumin (BSA) (Sigma)
- BSA serum albumin
- a solution containing 10 mM vanadylate liponucleoside complex manufactured by Invitrogen, perfused with 10 ml, and quickly extracted.
- kidney section Cut at an angle from the renal cortex to the medulla to make a kidney section 1-1.5 mm thick.
- the resulting kidney section was shaken at 37 ° C for 30 minutes in solution B while oxygenating the obtained kidney section using 100% O 2 , and then the kidney section was washed with ice-cooled solution A, and then sharpened with silicon.
- Using a needle separate the following tubule segments based on their structural features while observing them under a microscope.
- RNA from the kidney of Wistar male rats (7 weeks old) was reverse transcribed (see method 2), and the obtained single-stranded DNA was designated as type III, NaGLTI, SGLT1, SGLT2 and Using GAP DH-specific primers and a Taq Ma ⁇ probe (see Table 3) and a Universal master mix (Applied Biosystems), Na GLT I and S GLT were performed using the ABI PRISM 7700 Sequence Detection System. 1. The expression levels of SGLT2 and GAPDH mRNA were quantified. To obtain a standard curve, the PCR product amplified by real-time PCR was inserted into pGEM-T Easy vector (Promega) and transformed into Escherichia coli (DH-5 ⁇ ). Transformed E.
- Each concentration was measured with a UV1200 spectrophotometer (manufactured by Shimadzu) and used as a control gene with a known concentration.
- the results obtained with the PRISM 7700 were quantified using a standard curve.
- the expression level of GAPDH used as an internal standard was used for correcting the amount of type II RNA in each reaction of the real-time PCR. As a result, it was shown that the expression level of NaGLT1mRNA was higher in both renal cortex and medulla than in other SGLTs (FIG. 4).
- oocyte Xenopus oocyte (hereinafter abbreviated as oocyte) expression system
- oocyte Xenopus oocyte
- the transport activity of Na GLT1 was examined.
- in vitro synthesized NaGLTIRNA was injected into oocytes, incubated at 18 ° C for 2 days, and then subjected to experiments.
- N a GL T lc RN A injection cell and water injection oocytes [U- 14 C] one ⁇ - methyl one D- Darukobiranoshido ( "M e G lc), D- [1 - 14 C] galactose, D - [U- 14 C] mannose, D- [U- 14 C] Fourques toast, [1, 2- 3 H] - 2- Dokishi - glucose, D- [1 - 3 H] mannitol, [U- 14 C The sucrose uptake activity was measured. At that time, 9 6 mM of N a C l, 2 mM of KC 1, 1.
- C a CI have a I mM M g C l 2, 5mM of HE PES (p H 7. 4) of 8mM force, Ru Rana Incubated in buffer. If extracellular Na + concentration is to be dependent, adjust the NaCl concentration to between 9.6 and 96 mM and capture the shortage of 96 mM with choline chloride. The final osmotic pressure was kept constant (Figs. 6 and 7).
- N a GL T l result of examining the effects of various inhibitors on expressing oocytes to the via 4 C] labeled shed M e G 1 c uptake, unlabeled ⁇ e G 1 c, D - glucose, 2-de Oxyglucose and phlorizin had very strong inhibitory effects. Fructosov mouth retin had a weak inhibitory effect. On the other hand, L-glucose, 3_ ⁇ -methyldarcose, galactose and mannose had no effect on aMeGlc uptake via NaGLTI (FIG. 7).
- a C-terminal peptide (H 2 N_ LP LDRKQE KSINSE GQ—C ⁇ OH) (SEQ ID NO: 30) was prepared using the N-terminal as a cysteine (Saddy's Technology 1 Requesting the company to synthesize). As a result of analysis by high performance liquid chromatography (HP CL), the purity of the synthesized peptide was 92%. Subsequently, a conjugate was prepared using hemocyanin (keyhole limpet heraocyanin (Calbiochem-Behring)) with the peptide. The conjugate was dispensed into 10 tubes of 1 ml each and stored frozen.
- the conjugate was made with Freund's complete adjuvant (Difco) to make a uniform emulsion.
- Pre-immune sera of male Japanese white rabbits (2 kg) were collected and immunized at a rate of 0.2 mgZ feathers at 2-week intervals.
- Blood was collected at each immunization and the antibody titer was analyzed by ELISA. Eventually enough anti After the titer was obtained, whole blood was collected and cryopreserved as antiserum.
- each tissue was removed from a Wistar male rat (220 to 230 g), and homogenated buffer (230 mM sucrose, 5 mM Tris Z hydrochloric acid (pH 7.5)) After homogenizing with 2 m of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), centrifugation was performed at 300 g for 15 minutes. The supernatant was separated, and centrifuged at 24500 g for 30 minutes to collect a precipitate (crude membrane fraction).
- EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
- PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride
- Rat renal brush border membrane and basolateral membrane were prepared simultaneously according to the protocol density gradient centrifugation (Biochim Biophys Acta 773, 113-124 1984).
- the membrane sample was solubilized in SDS sample buffer (2% SDS, 125 mM tris, 20% darcerol) and subjected to polyacrylamide electrophoresis (Nature 227, 680-685, 1970).
- the membrane vesicles (201) suspended in lO OmM mannitol and 10 mM HE PES (pH 7.'5) were added to lO OmM mannitol, mM of N a C 1 (black circles: ⁇ ) or KC 1 (white circles: ⁇ ) of 4mM [: 1 4 C] Fourques preparative Ichisu and 1 0 mM of HEPES to (p H 7. 5)
- the mixture was incubated at 25 ° C with the substrate mixture (201).
- the results are shown in Fig. 10 (A). Each value is the average of three individual experiments S.E.M. Represents Each experiment was performed with brush border membrane vesicles isolated from five rats.
- HEK29 transfected with rNaGLTl in the presence and absence of either the saccharide analog (30 mM) phlorizin (50 M) or phloretin (50 fiM).
- the uptake of [ 14 C] fruitose (0, 1 mM, 37 kBQZm 1) by the three cells was measured at 37 ° C for 15 minutes, and HEK293 transfected with the vector was measured. The uptake measured in the cells was subtracted.
- Renal diabetes was due to glucose reabsorption failure in the kidney, and the glucose reabsorption failure was thought to be due to a defect in the glucose transport gene.
- the use of the gene and glucose and / or fructose transport protein as expression products of the gene to elucidate diagnose and diagnose renal diabetes. Prevention and treatment It became possible to develop drugs for that purpose.
- measuring the expression of glucose and Z or fructotransposon in human rat tissue cells can be used to isolate new genes, diagnose the function of glucose and Z or fructotransport, and in the kidney. Genetic diseases can be detected.
- introduction of the gene of the present invention into tissue cells such as kidney tissue cells and suppression of the expression of the gene by introducing an antisense strand of the gene of the present invention allow glucose and Z or fructose transport in tissue cells.
- tissue cells such as kidney tissue cells
- an antisense strand of the gene of the present invention allow glucose and Z or fructose transport in tissue cells.
- By regulating the functions it is possible to prevent and treat renal genetic diseases.
- by producing an animal deficient in the chromosome of the gene of the present invention it is possible to produce a non-human animal model of renal diabetes with a focus on glucose, Z or fructose transport. By using the non-human model animal, it becomes possible to develop a novel drug for preventing and treating renal diabetes.
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Abstract
腎性糖尿病に関与する新規グルコース及び／又はフルクトーストランスポータ、その遺伝子、及びそれらの変異体、及び、それらの利用を提供するものである。本発明のグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ及びその遺伝子は、腎性糖尿病に関与するグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ及びその遺伝子であり、該タンパク質及び遺伝子は、腎臓で高発現し、腎でのグルコース再吸収において、より大きな寄与を果たす新規タンパク質及びその遺伝子からなる。本発明は、該タンパク質及び遺伝子の変異体、及び該タンパク質に特異的に結合する抗体を包含する。更に、本発明は、本発明の遺伝子を染色体上で欠損させたモデル非ヒト動物、腎性糖尿病の予防・治療薬のスクリーニング方法、該遺伝子や抗体を用いたグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能や腎疾患の診断方法や本発明の遺伝子を組織細胞に導入して該組織細胞のトランスポータ機能を調節する方法も包含する。
Description
グルコース及び/又はフルク トーストランスポ一タ N a GL T l及びそ の遺伝子 技術分野
本発明は、 グルコース及び/又はフルク トーストランスポー夕、 その 遺伝子、 その変異体、 及びそれ明らの利用に関する。 田
背景技術
ヒ卜の腎臓は 2つ合わせても体重のわずか 0. 5 %に過ぎないが、 心 拍出量の約 2 0 %、 即ち毎分 1〜 1. 2 Lもの血液が流れ込んでいる。 その血漿流量の約 2 0 %、 即ち毎分 1 2 0 mL ( 1 日 2 0 0 L) が糸球 体で濾過され原尿となるが、 その 9 9 %は尿細管で再吸収され、 残りの 1. 5〜 2 Lが 1 日の尿量となる。 腎臓は機能単位であるネフロンとそ れを取りまく血管系から構成されている。 ネフロンは糸球体に始まり、 近位尿細管、 中間部尿細管 （ヘンレループ細脚）、 遠位尿細管を経て集合 管系に至る。 それぞれの分節は異なった機能と形態を有し、 協同的に尿 の濃縮，生成に関与している。 特に、 近位尿細管を構成する細胞では管 腔側刷子縁膜の発達により表面積が大きいため、 原尿中の水や電解質の 他低分子性の栄養物質を再吸収したり、 血液中の薬物や異物を分泌する 際に効率的な形態となっている （月刊薬事 Vol.43， No.3, pp29-34, 2001、 月刊薬事 Vol.42, No.4, ppll 3-120, 2000)。
近位尿細管上皮細胞の血液側側底膜と管腔側刷子縁膜には、 このよう に多様な物質の再吸収と分泌を媒介するトランスポー夕 （輸送体） が局 在し、 方向選択的な物質輸送を可能とするネッ トワークが形成されてい
る （BIO Clinica, 11， 22-25, 1996、 生体の科学、 50, 268-273, 1999)。 この数年間に、 グルコースの腎排泄調節を司るグルコース卜ランスポー 夕の遺伝子のクローニングと、 構造 '機能解析が著しく進展し、 腎臓に おいて、 糸球体で尿中へ移行したグルコースが、 再吸収されて血液中へ 戻される機構が分子レベルで明らかにされつつある。
即ち、 血中グルコースは腎糸球体で濾過され、 尿細管で再吸収を受け る。 この機構により正常血糖時には、 グルコースは 1 0 0 %再吸収され 循環血中に戻る。
そこで、 グルコースやアミノ酸等の水溶性分子やイオンは、 リン脂質 二重層からなる生体膜を速やかに通過することができないために、 一般 的には、 細胞膜や膜小器官にはこれらの分子を特異的に輸送するための 輸送タンパク質が存在する。 このような細胞内外の物質輸送を行う膜夕 ンパク質が、 トランスポ一タであるが、 トランスポ一タは、 体内に取り こまれた薬物、 栄養物等が各組織に移動する過程や、 各組織に蓄積した 老廃物の排出に関与している （特開 2 0 0 2— 1 7 1 9 8 0号公報）。 腎 臓においては、近位尿細管上皮細胞の血液側側底膜と管腔側刷子縁膜に、 多様な物質の再吸収と分泌を媒介するトランスポー夕（輸送タンパク質） が局在し、 細胞内外に形成された膜電位差や P H勾配等の環境特性を巧 みに利用した方向選択的な物質輸送を可能とするネッ トワークが形成さ れている （BIO Clinica, 11, 22-25, 1996、 生体の科学， 50， 268-273, 1999
脊椎動物のグルコーストランスポー夕は、大きく 2種類に分けられる。 1 つは促進グルコ ース ト ラ ンス ポ一タ （ facilitated glucose transporter： GLUT) とよばれるもので、 細胞内外のグルコース濃度 勾配にしたがって輸送を行う促進拡散型の輸送担体である。 このタンパ ク質はさらに 8つのアイソフォームが存在し、 分子量約 5 0， 0 0 0の
1 2回膜貫通型タンパク質である （Annu. Rev. Physiol. 55, 591-608, 1993、 TIBS 23, 476-481, 1998、 特開 2 0 0 2— 2 1 8 9 8 1号公報）。 基本的に、 すべての細胞は少なくとも 1つのタイプの GLUTを発現さ せ、それによつて必要なグルコースを細胞外から得ている。もう 1つは、 N a +Zグルコーストランスポー夕 （Na+- glucose co t ranspor t er： S G L T) で、 N aイオンと共役することでグルコースを濃度勾配に逆らつ て輸送する能動輸送担体であり、 分子量約 7 5 , 0 0 0の 1 4回膜貫通 型タンパク質である。
このタンパク質は小腸と腎臓の管腔（lumen)側に面した上皮細胞の頂 端側細胞膜 （apical membrane) に存在し、 細胞内外の N a +の電気化学 ポテンシャルの勾配を利用してグルコースを細胞内へ取り込む能動輸送 を行っている (Physiol. Rev. 74, 993-1026， 1994、 Am. J. Physiol. 276, (5 Pt 1), G1251-1259, 1999、 特開 2 0 0 2— 2 1 8 9 8 1号公報）。 S GL Tによって上皮細胞内に取り込まれたグルコースと N a+は、 側底 膜 （baso- lateral membrane) に存在する G L U T _ 2 と N a +— K +ポ ンプの働きで血中へ放出される。
哺乳類の S GL Tは、 輸送特性によって更に、 S GL T— 1 と S GL T _ 2の二つのタイプに分類される。 S GL T— 1は、 糖 1分子あたり 2個の N a +イオンを輸送し、 グルコースとガラク トースに対して高い 親和性を持ち、 小腸と腎臓で発現している。 一方、 S GL T— 2は糖 1 分子あたり 1個の N a +イオンを輸送し、 グルコースに対する親和性は 低く、 ガラクトースは運ばない。 このタンパク質は腎臓で発現している が、 小腸での発現は確認されていない。 更に、 S GL T— 1 と S GL T 一 2は腎臓の異なる場所で機能している。 糸球体で尿中へ移行したグル コースは、 その多くが、 まず近位尿細管の S GL T— 2で再吸収され、 更に遠位尿細管の S GL T_ 1で完全に再吸収され血液中へ戻される。
これに対して、 食物中のグルコースは総て、 小腸の S GL T— 1で体内 へ吸収されている。
このように、 腎臓にはグルコーストランスポー夕 S G L T 1及び S G L T 2が発現しており、 糸球体で濾過されたグルコースの尿細管上皮細 胞内への再吸収過程は、 これら 2種類のトランスポー夕によって媒介さ れると考えられている。
一方で、腎性糖尿病とされる、血漿中のグルコースの濃度が正常域（ 1 7 O mg/d L以下）であるのに、明らかな糖尿の見られる状態がある。 糸球体を通過したグルコースが尿細管で再吸収され得る最大速度 （Tm Gで表す） は正常人では毎分 3 5 Omgであるが、 これが異常に低い場 合が最も多い。 その結果、 血漿中のグルコース濃度の高低に関係なく尿 中のグルコース濃度が異常に高くなる。この現象は、近位尿細管の異常、 即ち先天的あるいは後天的ファコンニ症候群のときゃフロリジン注射の 後などにも見られる。 もう一つの腎性糖尿病の原因としては、 ダルコ一 スのみかけ上の閾値が低下しているが閾値の平均値と T m Gとの両者が まったく正常という場合もある。 この場合に見られるグルコースの尿中 への異常な排泄増加は、 グルコースの血漿濃度が低いときのみに存在す る。 そして、 最大閾値を越えた血漿レベルでのグルコースの排泄はかえ つて正常である （医学大辞典 第 1 8版， p p l 0 5 9〜： L 0 6 0 , 南 山堂， 1 9 9 8年、 生化学辞典 第 2版， p p 6 7 3， 東京化学同人， 1 9 9 0年）0
腎性糖尿病は、 腎臓におけるグルコース再吸収不全によると考えられ ており、 かかるグルコース再吸収不全は、 腎臓において糸球体で濾過さ れたグルコースの尿細管上皮細胞内への再吸収過程を媒介していると考 えられている既知の 2種類のトランスポー夕、 即ち、 S GL T 1及び S G L T 2の先天性或いは後天性の欠損に起因すると考えられている。 し
かしながら、 未だ原因遺伝子については同定されておらず、 該既知の S G L T 1及び S G L T 2遺伝子とそれ以外の未知のトランスポー夕遺伝 子の先天的或いは後天的欠損によって引き起こされると考えられてきた。
また、 腎疾患を、 標的或いは回避することを目的とした医薬品の開発 は、 腎疾患時における薬物療法をより有効かつ安全に実施するために重 要であるが、 今までの腎疾患の原因の解明に対する技術的な研究基盤が 乏しいために、 有効な成功例がないのが現状である。
本発明の課題は、 腎において発現し、 腎でのグルコース再吸収に関与 する新規グルコーストランスポータ、その遺伝子、及びそれらの変異体、 更にはそれらの利用を提供することにある。
腎性糖尿病は、腎臓におけるグルコース再吸収不全によるものであり、 かかる不全は既知のグルコーストランスポー夕遺伝子 S G L T 1及び S G L T 2の先天性或いは後天性の欠損に起因すると考えられていたが、 その原因遺伝子については、 同定されないできた。 本発明者は、 この未 同定の遺伝子について、 鋭意探索の結果、 既知の S G L T 1及び S G L T 2グルコーストランスポー夕遺伝子とは別の腎臓で高発現する遺伝子 を見い出し、 本発明を完成するに至った。
本発明のグルコーストランスポ一タは、 既知の S G L T 1及び S G L T 2よりも高い発現量を有し、 腎でのグルコース再吸収において、 より 大きな寄与を果たすとともに、 グルコースを特異的に認識するといぅ特 性を有する。本発明のグルコーストランスポー夕を、 「グルコーストラン スポ一夕 N a G L T l」 と命名した。 更に、 検討した結果、 本発明の N a G L T 1は、 N a +依存的なフルク ト一ストランスポ一タ機能を有す ることを見い出した。
本発明は、 また、 ダルコ一ス及び/ /又はフルク トーストランスポー夕 N a G L T 1及びその遺伝子の変異体、 及び該グルコース及び Z又はフ
ルクト一ストランスポ一夕 N a GL T lに特異的に結合する抗体を包含 する。 更に本発明は、 本発明のグルコース及び/又はフルク トーストラ ンスポ一夕機能を有するポリべプチドを発現する遺伝子機能を染色体上 で欠損させた腎性糖尿病を発症するモデル非ヒ卜動物及び該モデル非ヒ ト動物を用いた腎性糖尿病の予防 ·治療薬のスクリーニング、 更には、 本発明の遺伝子や抗体を用いたグルコース及び/又はフルク トーストラ ンスポー夕機能ゃ腎疾患の診断方法やそのための診断薬を包含するもの である。 また、 本発明は、 アンチセンス鎖 DNA等を用いて、 本発明の 遺伝子の発現を制御し、 動物組織細胞におけるグルコース及び/又はフ ルクトーストランスポー夕機能を調節する方法も包含するものである。 発明の開示
すなわち具体的には本発明は、 配列表の配列番号 1に示される塩基配 列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む 配列からなることを特徴とする DNA (請求項 1 ) や、 請求項 1記載の DNAとストリンジェントな条件下でハィブリダイズし、 かつダルコ一 ス及び/又はフルクト一ストランスポ一タ機能を有するポリぺプチドを コードすることを特徴とする DNA (請求項 2 )や、以下の（a)又は（b) のポリぺプチドをコードする D N A ； (a)配列表の配列番号 2に示され るアミノ酸配列からなるポリべプチド（b)配列表の配列番号 2に示され るアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若し くは付加されたアミノ酸配列からなり、'かつグルコース及び/又はフル ク トーストランスポー夕機能を有するポリペプチド （請求項 3 ) や、 配 列表の配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポ リペプチド （請求項 4) や、 配列表の配列番号 2に示されるアミノ酸配 列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、 かつグルコース及び Z又はフルクト一ストラ ンスポー夕機能を有するポリペプチド （請求項 5 ) や、 請求項 1〜3記 載の D N Aを、 発現べクタ一に組込み、 該組換え発現ベクターを宿主細 胞に導入して発現することを特徴とするグルコース及び/又はフルク ト 一ストランスポ一タ機能を有するポリぺプチドの製造法（請求項 6 )や、 請求項 4又は 5記載のポリペプチドを用いて誘導され、 該ポリべプチド に特異的に結合することを特徴とする抗体 （請求項 7 ) や、 抗体が、 モ ノクロ一ナル抗体であることを特徴とする請求項 7記載の抗体 （請求項 8 ) や、 抗体が、 ポリクロ一ナル抗体であることを特徴とする請求項 7 記載の抗体 （請求項 9 ) からなる。
また本発明は、 請求項 1〜 3のいずれか記載の D N Aを動物組織細胞 に導入することを特徴とするグルコース及び Z又はフルク卜一ストラン スポ一夕機能を有するポリペプチドを発現する動物組織細胞の製造法 (請求項 1 0 ) や、 物組織細胞が、 ラッ ト腎臓の組織細胞、 ブタ腎臓由 来上皮細胞、 ィヌ腎臓由来上皮細胞、 又はフクロネズミ腎臓由来上皮細 胞であることを特徴とする請求項 1 0記載のグルコース及び Z又はフル ク トーストランスポ一タ機能を有するポリペプチドを発現する動物組織 細胞の製造法 （請求項 1 1 ) や、 動物組織細胞が、 ヒト胎児腎臓の形質 転換細胞株 H E K 2 9 3であることを特徴とする請求項 1 0記載のダル コース及び 又はフルクト一ストランスポ一夕機能を有するポリべプチ ドを発現する動物組織細胞の製造法 （請求項 1 2 ) や、 請求項 1 0〜 1 2のいずれか記載の方法により製造されたことを特徴とするグルコース 及び Z又はフルク トーストランスポー夕機能を有するポリべプチドを発 現する動物組織細胞 （請求項 1 3 ) や、 請求項 1 3記載のグルコース及 び Z又はフルクトーストランスポー夕機能を有するポリべプチドを発現 する動物組織細胞を用いて、 被研物質のグルコース輸送機能への影響を
測定することを特徴とするグルコース及び Z又はフルク トーストランス ポー夕機能調節活性を有する物質のスクリ一二ング方法 （請求項 1 4 ) や、 配列表の配列番号 2に示されるグルコース及びノ又はフルク トース トランスポー夕機能を有するポリべプチドを発現する遺伝子機能を染色 体上で欠損させたことを特徴とする腎におけるグルコース再吸収能不全 に起因する腎性糖尿病を発症するモデル非ヒ卜動物 （請求項 1 5 ) や、 グルコース及びノ又はフルク ト一ストランスポー夕機能を有するポリべ プチドを発現する遺伝子機能の欠損が、 配列表の配列番号 1に示される グルコース及び Z又はフルクトーストランスポー夕機能を有するポリぺ プチドを発現する遺伝子の機能の欠損であることを特徴とする請求項 1 5記載の腎性糖尿病を発症するモデル非ヒト動物 （請求項 1 6 ) や、 請 求項 1 5又は 1 6記載の腎におけるグルコース及び 又はフルク ト一ス 再吸収能不全に起因する腎性糖尿病を発症するモデル非ヒト動物に、 被 検物質を投与し、 該モデル非ヒト動物、 或いは該モデル非ヒト動物の細 胞、 組織又は器官におけるグルコース再吸収能を測定 ·評価することを 特徴とするグルコース再吸収能不全に起因する腎性糖尿病予防 ·治療薬 のスクリーニング方法 （請求項 1 7 ) や、 請求項 1記載の塩基配列のァ ンチセンス鎖の全部又は一部からなるグルコース及び Z又はフルク トー ス トランスポー夕機能診断用プローブ （請求項 1 8 ) や、 請求項 1〜 3 のいずれか記載の D N Aの少なくとも 1つ以上を固定化させたことを特 徵とするグルコース及び Z又はフルク トーストランスポ一タ機能診断用 マイクロアレイ又は D N Aチップ （請求項 1 9 ) からなる。
さらに本発明は、 請求項 7〜 9のいずれか記載の抗体及びノ又は請求 項 1 8記載の診断用プローブを用意することを特徴とするグルコース及 び Z又はフルク ト一ストランスポー夕機能診断用薬剤（請求項 2 0 )や、 被検組織から試料を得、 該試料における請求項 1記載の遺伝子の発現を
測定することを特徴とするグルコース及び 又はフルク トーストランス ポー夕機能の診断方法 （請求項 2 1 ) や、 請求項 2 1記載の遺伝子の発 現の測定を、 請求項 1 8記載のグルコース及び/又はフルクトーストラ ンスポ一夕機能診断用プローブ、 或いは請求項 1 9記載のグルコース及 び Z又はフルクトーストランスポー夕機能診断用マイクロアレイ又は D N Aチップを用いて行うことを特徴とするダルコ一ス及び/又はフルク トーストランスポータ機能の診断方法 （請求項 2 2 ) や、 被検組織から 試料を取得、 培養し、 該試料における遺伝子の発現により生成される請 求項 4記載のポリぺプチドを測定することを特徴とするグルコース及び /又はフルクトーストランスポー夕機能の診断方法 （請求項 2 3 ) や、 請求項 2 3記載のポリペプチドの測定を、 請求項 7〜 9のいずれか記載 の抗体を用いて行うことを特徴とするグルコース及び 又はフルク トー ストランスポ一夕機能の診断方法 （請求項 2 4 ) や、 請求項 2 1〜 2 4 のいずれか記載のグルコース及び/又はフルク トーストランスポ一タ機 能の診断が、 腎疾患におけるグルコース及び/又はフルクトーストラン スポ一夕機能の測定であることを特徴とする腎疾患の診断方法 （請求項 2 5 ) や、 動物組織細胞に、 請求項 1〜 3のいずれか記載の D N Aを導 入することを特徴とする動物組織細胞におけるグルコース及び Z又はフ ルクトーストランスポ一タ機能の調節方法 （請求項 2 6 ) や、 動物組織 細胞における請求項 1記載の D N Aの発現を抑制することを特徴とする 動物組織細胞におけるグルコース及び Z又はフルク トーストランスポー 夕機能の調節方法 （請求項 2 7 ) や、 動物組織細胞における請求項 1記 載の D N Aの発現の抑制が、 請求項 1記載の D N A塩基配列のアンチセ ンス鎖の全部又は一部を動物組織細胞に導入することにより行われるこ とを特徴とする動物組織細胞グルコース及び/又はフルク トーストラン スポ一タ機能の調節方法 （請求項 2 8 ) や、 動物組織細胞が、 動物腎細
胞であることを特徴とする請求項 2 6〜 2 8のいずれか記載の動物組織 細胞におけるグルコース及び Z又はフルク トーストランスポ一夕機能の 調節方法 （請求項 2 9 ) からなる。 図面の簡単な説明
第 1図は、 本発明の実施例において、 Aは本発明の N a G L T 1の塩 基配列及びアミノ酸配列を、 Bは本発明の N a G L T 1のアミノ酸配列 のハイ ド口パシ一プロッ ト （疎水性分析） を示す図である。
第 2図は、 本発明の実施例において、 Aは本発明のラッ ト細胞におけ る N a GLT l mRNAのノ一ザンブロッ ト分析を、 Bは本発明のラッ ト細胞における N a GL T 1 mRNAを P C Rにより検出したことを 示す写真である。
第 3図は、 本発明の実施例における、 本発明の N a GL T 1、 S G L T l、 S GLT 2及び GAP DHの mRNAを P C Rにより検出し、 そ れぞれの mR N Aについて腎臓内での発現分布を示す写真である。なお、 図中の +は逆転写酵素を含む条件で、 一は逆転写酵素を含まない条件で RT— P C Rを行ったものをそれぞれ示す。
第 4図は、 本発明の実施例における、 本発明の N a GL T 1、 S GL T 1及び S GL T 2 mR N Aの発現量をリアルタイム P C Rによって 定量解析したことを示す図である。
第 5図は、本発明の実施例における、本.発明の N a G L T 1 mRNA をインビトロ合成し、 注入した卵母細胞と、 水注入卵母細胞における各 種糖類蓄積を示す図である。 .
第 6図は、 本発明の実施例において、 Aは本発明の N a G L T 1発現 卵母細胞における C14 C] a M e G 1 c蓄積量と aM e G l c 自身の依 存関係を、 Bは Aのデ一夕を用いた Hill プロッ トを、 Cは [1 4 C] Q; M
e G 1 c蓄積量と細胞外 N a +イオン濃度の依存関係を、 Dは Cのデ一 タを用いた Hill プロッ トを示す図である。
第 7図は、 本発明の実施例における、 本発明の N a GL T 1発現卵母 細胞及び水注入卵母細胞における、 [14C] αΜ e G 1 c蓄積に対する各 種糖類の影響を示す図である。
第 8図は、 本発明の実施例における、 ラッ ト腎臓膜部位 （腎粗膜、 刷 子縁膜、及び側底膜）における N a GL T 1タンパク質の細胞内局在を、 ィムノブロッ トにより解析した結果を示す写真である。
第 9図は、 本発明の実施例における N a G L T 1が媒介する H E K 2 9 3細胞によるフルク ト一スの取込みについて、 （A) は、糖類似体を含 む緩衝液とともに 1 5分間、 3 7 °Cでインキュベーションした HEK 2 9 3細胞について、 （B) は、 N a GL T l c DNAでトランスフエク 卜した HEK 2 9 3細胞による [14C]フルク ト一スの取込みについて、 示したグラフである。
第 1 0図は、 本発明の実施例における腎臓刷子縁膜小胞によるフルク トースの取込みについて、 （A) は、 マンニトール及び HE P E Sに懸濁 した膜小胞を、マンニトール及び HE P E Sを含む基質混合液とともに、 2 5 でインキュベーションした取込みについて、 （B ) は、 フルク トー スの N a+依存性の取込みを、 インキュベーション緩衝液中、 各種濃度 における取込みについて、 示したグラフである。 発明を実施するための最良の形態
(本発明の遺伝子、 該遺伝子によってコ一ドされるポリべプチド及びそ の抗体）
本発明は、 腎性糖尿病の原因に関与するグルコース及び/又はフルク トーストランスポ一タ N a GL T l及びその原因遺伝子、 更にはそれら
1
の変異体からなる。
本発明の腎性糖尿病の原因に関与するグルコース及び 又はフルク ト
—ストランスポー夕 N a GL T l c DNAは、 配列表の配列番号 1に示 される塩基配列を有する。 また、 該 c DNAによって、 コードされるグ ルコース及び Z又はフルク トーストランスポー夕 N a GL T lタンパク 質は、 配列表の配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるポリぺプチ ドからなる。 本発明において取得された新規遺伝子であるグルコース及 び Z又はフルクトーストランスポ一夕 N a GL T lの c DNAは、 2， 1 7 3の塩基対からなり、その翻訳領域（ 1 1 1〜 1 5 6 2番目）には、 4 84個のアミノ酸残基からなるポリペプチドがコードされている。 本発明のグルコース及びノ又はフルクトーストランスポ一夕 N a GL T 1は、 疎水性解析の結果からは、 1 1回膜貫通型の糖タンパク質であ ることが確認された。 本発明の該グルコース及びノ又はフルクト一スト ランスポ一夕 N a GLT lは、 腎臓において高発現するグルコース及び Z又はフルクトーストランスポー夕であり、 他の単糖類は認識せずダル コース及び/又はフルク ト一スを特異的に認識する。 腎臓におけるダル コース及び Z又はフルク ト一ストランスポ一夕 N a GLT lの発現量は、 既知のグルコーストランスポー夕 S GLT 1や S GL T 2よりも高く、 腎性糖尿病の原因と考えられている腎臓でのグルコースの再吸収に大き な寄与を果たしているものである。
本発明の遺伝子としては、 前記配列表の配列番号 1に示される塩基配 列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む 配列、 更には、 該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダィ ズし、 かつグルコース及び Z又はフルクトーストランスポ一タ機能を有 するポリペプチドをコードする DNA配列、 及び、 次の（a)又は（b)の ポリペプチドをコードする DNA ；
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( a )配列表の配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド (b)配列表の配列番号 2に示されるアミノ酸 'S列において、 1若しくは 数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつダルコ一ス及び/又はフルクトーストランスポー夕機能を有するポ リペプチドを有するポリペプチド、 を含むものである。
本発明において、 種々の DNA配列の変異は、 周知の遺伝子工学的遺 伝子変異手段によって、 行うことができる。
なお、上記本発明の塩基配列において、 「塩基配列とストリンジェント な条件下でハイブリダィズする」 条件としては、 例えば、 4 2°Cでのハ イブリダィゼ一シヨン、 及び 1 X S S C、 0. 1 %の303を含む緩衝 液による 4 2 での洗浄処理を挙げることができ、 6 5 °Cでのハイプリ ダイゼーシヨン、 及び 0. 1 XS S C、 0. 1 %の303を含む緩衝液 による 6 5 °Cでの洗浄処理をより好ましく挙げることができる。 なお、 ハイプリダイゼ一ションのストリンジエンシーに影響を与える要素とし ては、 上記温度条件以外に種々の要素があり、 当業者であれば種々の要 素を組み合わせて、 上記例示したハイプリダイゼーションのストリンジ エンシーと同等のストリンジエンシーを実現することが可能である。 更に、 本発明は、 配列表の配列番号 2に示されるアミノ酸配列からな るポリペプチド、該配列表の配列番号に示されるァミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配 列からなり、 かつグルコース及び/又はフルク 卜一ストランスポ一夕機 能を有するポリべプチドを含むものである。 本発明のポリぺプチドを取 得するには、 公知の遺伝子工学の技術を用いて取得することができる。 即ち、 本発明の遺伝子を適宜公知の発現ベクターに組込み、 該組換えべ クタ一を宿主細胞に導入し、 発現することによって取得することができ る。
(本発明のポリべプチドによって誘導される抗体の利用） 更に、 本発明は、 本発明のポリペプチドによって誘導され、 該ポリべ プチドに特異的に結合する抗体を含む。 該抗体としては、 モノクローナ ル抗体及びポリクローナル抗体を挙げることができる。該抗体の作製は、 本発明のポリペプチドを抗原として、常法により作製することができる。 本発明の抗体は、 本発明のグルコース及びノ又はフルク ト一ストランス ポ一タ機能を有するポリべプチドとの抗原抗体反応により、 本発明遺伝 子の腎組織細胞等における発現の有無の検出に利用することができ、 該 遺伝子に関わる腎疾患の診断に利用することができる。 本発明の抗体を 用いた免疫学的測定には、 例えば R I A法、 E L I S A法、 蛍光抗体法 等公知の免疫学的測定法を用いることができる。
(本発明の DN Aを導入したヒト組織細胞の利用）
本発明の DNAを、 ヒト組織細胞に導入して、 グルコース及び/又は フルク トーストランスポー夕機能を有するポリペプチドを発現するヒト 組織細胞を製造することができる。 該ヒト組織細胞としては、 本来 N a G 1 T 1が強く発現している腎臓の組織細胞を用いることが好ましく、 該腎臓の組織細胞の具体例としては、 ヒト胎児腎臓の形質転換細胞株 H EK 2 9 3を挙げることができる。 また、 本発明の遺伝子を導入する動 物組織細胞としては、 ラッ トの腎臓の組織細胞や、 ブタ腎臓由来上皮細 胞 L L C— P K ィヌ腎臓由来上皮細胞 MD C ：、 フクロネズミ 腎臓由来上皮細胞 OKのいずれかの細胞を用いることもできる。 本発 明の DNAをヒト組織細胞に導入するには、トランスフエクシヨ ン法等、 適宜の遺伝子導入法を用いることができる。
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(本発明の遺伝子及び該遺伝子によってコードされるポリべプチドの利 用）
本発明において、 ヒト腎細胞からクローニングした N a G 1 T 1の新 規遺伝子は、 該塩基配列のアンチセンス鎖を用いることにより、 診断用 プローブとして、 腎組織細胞のグルコース及び/又はフルク トーストラ ンスポー夕機能の診断に用いることができる。 また、 該診断用プローブ や前記本発明のポリベプチドに特異的に結合する抗体を用いて、 ダルコ —ス及び Z又はフルク トーストランスポー夕機能の診断薬として、 及び 該診断薬を装備した診断用キットとして利用することができる。
更に、本発明の D N Aを、少なくとも 1つ以上デバイス上に固定して、 グルコース及びノ又はフルク ト一ストランスポー夕機能の診断用マイク ロアレイ又は D N Aチップとして利用することができる。 該マイクロア レイ及び D N Aチップには、 グルコース及び/又はフルク トーストラン スポ一夕の他の遺伝子等を合わせて固定し、診断に用いることができる。 また、腎組織細胞における本発明の遺伝子の発現の状態を測定するには、 R T - P C R法やノーザンプロッティング法等、 公知の遺伝子の測定法 を適宜用いることができる。 本発明の診断法を用いて、 腎組織細胞にお けるグルコース及びノ又はフルクトーストランスポー夕 N a G L T lの 遺伝子の発現の有無や発現の強度を測定することにより、 ヒト腎臓にお ける遺伝子疾患を検出することができる。
(本発明の遺伝子を用いたグルコース及び Z又はフルク トーストランス ポー夕機能の調節）
ヒト組織細胞における本発明の遺伝子の発現の制御により、 ヒト組織 細胞におけるグルコース及び Z又はフルク ト一ストランスポ一夕機能の 調節を行うことができる。ヒト組織細胞における遺伝子の発現の制御は、
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ヒト組織細胞への本発明遺伝子の導入や、 本発明遺伝子に対するアンチ センス鎖の導入による本発明遺伝子の発現抑制によって行うことができ る。 ヒト組織細胞への本発明遺伝子の導入方法としては、 トランスフエ クション法等の公知の遺伝子導入法を用いることができる。 アンチセン ス鎖のヒト組織細胞への導入には、 この分野で通常用いられる方法を用 いることができる。 例えば、 アンチセンスオリゴヌクレオチドを、 腎組 織等のヒト組織細胞へ直接投与することができる。 また、 必要に応じて 薬学的に許容される細胞内導入試薬、 例えば、 リボフェクチン試薬、 リ ポフエクトァミン試薬、 D O T A P試薬、 T f x試薬、 リポソ一ム及び 高分子担体等と共に投与することができる。
腎臓等のヒト組織細胞におけるグルコース及び/又はフルク トースト ランスポー夕機能の調節により、 腎臓等における遺伝子疾患の予防 ·治 療が可能となる。 (本発明の遺伝子欠損モデル非ヒト動物及びその利用）
本発明の、 腎性糖尿病を発症するモデル非ヒト動物とは、 グルコース 及び/又はフルクトーストランスポー夕 N a G L T 1遺伝子機能が染色 体上で欠損することにより、 腎臓におけるグルコース及び Z又はフルク トース再吸収不全のような腎性糖尿病を発症する非ヒト動物をいう。 本 発明における非ヒト動物としては、 ラッ ト、 マウス、 モルモッ ト等の齧 歯目動物を具体的に挙げることができ、 本発明の腎性糖尿病の予防 ·治 療薬のスクリーニングに用いるモデル非ヒト動物としては、 マウス、 ラ ッ 卜が特に有利に利用することができるが、 これらに限定されるもので はない。
本発明の N a G L T 1遺伝子機能が染色体上で欠損したモデル非ヒト 動物の作製は、 公知の遺伝子欠損モデル非ヒト動物の作製方法を用いて
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作製することができる。 以下に、 N a GL T 1遺伝子機能が染色体上で 欠損したモデル非ヒト動物の作製方法を、 N a GL T 1遺伝子機能が染 色体上で欠損したマウスを例にとって説明する。
N a GL T 1遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、 すなわちホモ 接合体変異マウス (-/-) は、 例えば、 ラッ ト腎臓から構築したラッ ト遺伝子ライブラリーより得られた遺伝子断片を用いて、 N a GL T 1 遺伝子をスクリ一ニングし、 スクリーニングされた N a GLT l遺伝子 の一部又は全部を、 例えば l a c— Z遺伝子、 ネオマイシン耐性遺伝子 等のマーカ一遺伝子で置換し、 必要に応じて、 5 ' 末端側にジフテリア トキシン Aフラグメント （DT— A) 遺伝子や単純へルぺスウィルスの チミジンキナーゼ （HS V— t k) 遺伝子等の遺伝子を導入してタ一ゲ ッティングベクタ一を作製し、 この作製された夕一ゲッティングベクタ 一を線状化し、 エレクト口ポレーシヨン （電気穿孔） 法等によって E S 細胞に導入し、 相同的組換えを行い、 その相同的組換え体の中から、 X - g a l による染色あるいは G 4 1 8やガンシクロビル （G AN C) 等 の抗生物質に抵抗性を示す E S細胞を選択する。 この選択された E S細 胞が目的とする組換え体かどうかをサザンプロッ ト法等により確認する ことが好ましい。
上記組換え E S細胞をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクション し、 かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、 キメラマウスを作製する。 こ のキメラマウスを野生型のマウスとインタ一クロスさせると、 ヘテロ接 合体変異マウス （+ Z—） を得ることができ、 また、 このへテロ接合体 変異マウスをィン夕一クロスさせることによって、 ホモ接合体変異マウ ス （― Z—） を得ることができる。 そして、 かかるホモ接合体変異マウ スに N a GLT 1遺伝子が欠損しているかどうかを確認する方法として は、 例えば、 このマウスの N a G L T 1遺伝子の発現をウエスタンプロ
ッ ト法等により調べる方法がある。
本発明における、 腎臓におけるグルコース再吸収不全に起因する腎性 糖尿病の予防 ·治療薬のスクリーニングは、 グルコース及び/又はフル クトーストランスポータ N a GL T l遺伝子機能の染色体上での欠損に より、 腎臓におけるグルコース及び 又はフルクト一ス再吸収不全のよ うな腎性糖尿病を発症する非ヒト動物に、 被検物質を投与し、 該モデル 非ヒト動物、 或いは該モデル非ヒト動物の細胞、 組織又は器官における 及び/又はフルク トースグルコース再吸収能を測定 ·評価することによ り行う。
上記のように、 腎臓におけるグルコース及び/又はフルクトース再吸 収不全に起因する腎性糖尿病の予防。治療薬のスクリ一ニングをする際、 野生型非ヒト動物及び/又は N a GL T 1遺伝子機能が染色体上で欠損 した非ヒト動物を用いて、 グルコース及び/又はフルクトース再吸収不 全に起因する腎性糖尿病を発症するモデル非ヒト動物の場合と比較 ·評 価することが好ましく、 野生型非ヒト動物としては、 上記 N a GL T l 遺伝子機能が染色体上で欠損したモデル非ヒト動物と同種の動物を意味 し、 中でも同腹の動物を好適に例示することができ、 N a GLT l遺伝 子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物は、文献（Pro Natl. Acad. Sci. USA 97, 6132-6137, 2000)記載の方法等によって作製することができる。 N a GL T 1遺伝子機能欠損型と、 それらの同腹の野生型は、 個体レべ ルで正確な比較実験 ·評価 （解析） 等を行うことができる点で同時に用 いることが好ましい。
(本発明の遺伝子を用いたグルコース及び/又はフルクトーストランス 'ポー夕機能の調節）
動物組織細胞、 特に腎臓における組織細胞における本発明の遺伝子の
発現の制御により、 動物組織細胞におけるグルコース及び/又はフルク トーストランスポー夕機能の調節を行うことができる。 動物組織細胞に おける遺伝子の発現の制御は、動物組織細胞への本発明遺伝子の導入や、 本発明遺伝子に対するアンチセンス鎖並びに s i RN Aの導入による本 発明遺伝子の発現抑制によって行うことができる。 動物組織細胞への本 発明遺伝子の導入方法としては、 トランスフエクション法等の公知の遺 伝子導入法を用いることができる。 アンチセンス鎖の動物組織細胞への 導入には、 この分野で通常用いられる方法を用いることができる。 例え ば、 アンチセンスオリゴヌクレオチドを、 腎組織等の動物組織細胞へ直 接投与することができる。 また、 必要に応じて薬学的に許容される細胞 内導入試薬、 例えば、 リポフエクチン試薬、 リポフエクトァミン試薬、 DOTAP試薬、 Τ ί χ試薬、 リボソーム及び高分子担体等と共に投与 することができる。
腎臓等の動物組織細胞におけるグルコース及び Ζ又はフルク ト一スト ランスポー夕機能の調節により、 腎性糖尿病等における遺伝子疾患の予 防 ·治療が可能となる。 以下、 実施例により本発明をより具体的に説明するが、 本発明の技術 的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
[実施例]
(グルコース及び Ζ又はフルクトーストランスポ一タ N a GL T lの c DNAクローニング）
ラッ ト腎臓より、 塩化セシウム密度勾配遠心法により全 RN Aを抽出 し、 この全 RN Aからオリゴ d Tセルロース （Stratagene社製） を用い てポリ A + RNA (mRNA) を精製した。 精製した mRNAは、 c D N Aライブラリ一作製キッ ト （Stratagene社製） を用いてラッ ト腎 c D
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リ
N Aライブラリーを作製した。 この c DN Aライブラリーから、 無作為 に 1， 0 0 0遺伝子を取り出し、 ベクタープライマ一（T 3プライマー ； 5'- AATTAACCCTCACTAAAGGG -3') を用いてシークェンスを行った。 なお、 N a G L T 1の全長シークェンスについては、 下記の表 1に記載のとお りプライマー （配列表の配列番号 3〜 1 2 ) を設計し （Proligo 社に合 成依頼）、 RISA-384 (島津社製） を用いたチェーンターミネータ一法によ り解読を行い、 GENETYX- MAC Version 10 (SOFTWARE DEVELOPMENT 社製、 東京） を用いて配列表を作成した。 実際のシークェンスは、 RISA- 384シ ステムにより行った （島津ジエノミックリサーチ （株） に委託解析）。
(表 1 ) プライマー名 塩基配列 (5'→3') NaGLTIにおける位置 配列番号 フォワードプライマー：
T3-1 TCGGAAATGGAGTTCCGTGG 105-124 3
丁 3- 2 AGCTGCCTTACTGACTGCCATG 494~5〗5 4
T3-3 TACGTATTCTCCTTCGCCACC 996 - 1016 5
T3-4 TGTGTAACATTGGCAGCCTGG 1144—1164 6
T3-5 TAACCCATAGCTGAGGTCTC 1699-1718 7
(ノ一ザンブロッ ト法及び RT— P C Rによる N a GL T lの発現分布 の解析）
ストリンジェン卜な条件下 [ 5 0 %のホルムアミ ド、 5 X S S P E ( 1 ズ 33 ? £の組成 ： 0. 1 5 M N a C l、 1 0mM N a H2 P 04、 及び I mM E D T A； p H 7. 4)、 5 Xデンハルト溶液、 0. 2 %の S D S及び 1 0 g/mLの二シン精子由来の D N A、 42 °C] におい て [ a— 32 P] d C T P (Amersham 社製） で N a GL T lの c DNA (全長） を Prime- a_Gene Labeling System (Promega社製） を用いて標 識し、 ラッ ト各臓器から RNeasymini RNAextractionkit (QIAGEN社製） を用いて全 RNAを抽出し、 をブロッ トしたナイロン膜 （Hybond N+ membrane： Amersham社製） とハイブリダィズさせた。 ハイブリダィゼー ションを行った後、 2 X S S C ( 1 X S S Cの組成： 0. 1 5 M N a C l、 1 5 mM クェン酸ナトリウム、 p H 7. 0) / 0. 1 %の S D Sで 1 0分間室温でプロッ トメンプレンを 2度洗浄し、 さらに 0. 5 X S S CZ 0 , 1 % S D Sで 3 0分間 4 2でで 1度洗浄した。 洗浄したブ ロットメンプレンをイメージングプレー卜に 3〜 6時間露出し、 可視化 されたバンドをイメージングプレートリーダで読みとつた後、 Image Analyze II (富士フィルム社製） で画像処理を行った （BIO- imaging
Analyzer BAS-2000II システム、 富士写真フィルム株式会社）。 それぞれ のバンドに相当する放射線強度は、 Image Analyze II上で数値定量化し た。 その結果、 N a GLT 1 mRNAは、 腎臓の皮質部及び髄質部に多 く発現することが認められた （第 2図 A)。
次に、 RT— P CR法で調べるため、 ラッ ト各組織 （脳、 心臓、 肺、 肝臓、 小腸、 脾臓、 腎臓の皮質部、 腎臓の髄質部） から RNeasymini kit (QIAGEN 社製） を用いて 1 ^ gの全 R N Aを得た後、 Superscript II reverse transcriptase (インビトロジェン社製） を用いて逆転写反応を 行った。 反応終了後残存 RN Aを RNase H (インビトロジェン社製） で 分解した。 得られた 1本鎖 D N Aを铸型として、 N a GLT l、 S GL T l、 S G L Τ 2及び G A P DHに特異的なプライマ一 （下記の表 2及 び配列表の配列番号 1 3〜 2 0参照） と Taq DNA polymerase (Takara 社製） を使用し、 9 5 で 3分間熱変性させた後、 以下のサイクルを 3 5回繰り返し増幅させた。 サイクル： 94°Cで 1分間の熱変性、 5 8°C で 1分間アニーリング、 7 2 °Cで 1分間の伸長反応により得られた RT 一 P C R産物を 1. 5 %のァガロースゲル上で分離した後、 ェチジゥム ブロマイ ドで染色、 紫外線下で可視化した。 その結果、 腎臓 （皮質部、 髄質部） で N a GLT 1が高発現しており、 腎臓以外にも、 脳、 肺及び 肝臓でも検出限界以上の発現が認められた （第 2図 B)。
(表 2) プライマー 遺伝子 (GenBankァクセッション番号) (位置） 配列番号
NaGLTI (AB089802)
Sense 5' - TGGGACCCACATTTCCAGAC - 3' (279-298) 13
An tisense 5' - TCTGAGGCGGCTTCAAAGGATC - 3' (736-757) 14 rSGLTI (D16101)
Sense 5' - ATGGACAGTAGCACCTTGAGCC - 3' (170-191 ) 15
An tisense 5' - TAGCCCCAGAGAAGATGTCTG C - 3' (647-668) 16 rSGLT2 (U29881)
Sense 5' - CATTGTCTCAGGCTGGCACTGG 一 3' (851-872) 17
An tisense 5' - GGACACTGCCACAATGAACACC 一 3' (1289-1310 ) 18 rGAPDH (M 17701)
Sense 5' - CCTTCATTGACCTCAACTAC - 3' (131-150) 19
An tisense 5' - GGAAGGCCATGCCAGTGAGC - 3' (705-724) 20
(マイクロダイセクション法によるラッ ト腎尿細管分節の単離）
Wistar系雄性ラット （ 7週齢） をネンブタール麻酔下正中開腹し、 左 腎臓を露出させる。下大動脈の左腎動脈分岐点直前頭部側にて結紮する。 下大動静脈を左右分岐点直前頭部側にて結紮し、 左腎動脈直下尾部側に おいて血管に小孔を開ける。 続いてその小孔ょりポリエチレン医療用チ ユーブ （PE-50, Becton Dickinson 社製） を挿入し、 1 0m l容量のシ リンジを用いて過加圧にならないように A液 （ 1 3 0 mMの N a C 1 、
5mMの KC 1、 I mMの N aH2 P〇4、 1 m Mの硫酸マグネシウム、 I mMの乳酸カルシウム、 2 mMの酢酸ナ ト リ ウム、 5 . 5 m M D - glucose, 1 0mMの HE P E S、 p H 7. 4) 1 0 m lで左腎を前灌 流する。 灌流腎に鬱血等がないことを確認した後、 B液 （ l mg/m l の collagenage ( type I， Sigma社製）、 1 m g /m 1 のゥシ血清アルブ ミン （B S A) (Sigma 社製）、 1 0 mMのバナジル酸リポヌクレオシド コンプレックス (インビトロジェン社製）含有 A液） 1 0m lで灌流し、 すばやく摘出する。
腎皮質から髄質にわたる角度で切断して厚さ 1〜 1. 5 mmの腎切片 を作る。 得られた腎切片を 1 0 0 % 02を用いて酸素化しながら B液中 で 3 7 °C、 3 0分間の振盪後、 氷冷 A液で腎切片を洗浄し、 シリコナイ ズした鋭利な針を用いて以下の尿細管各分節をそれぞれの構造的特徴を 基に顕微鏡で観察しながら分離する。単離した各ネフロン分節（糸球体、 近位曲尿細管、 近位直尿細管、 髄質ヘンレ太い上行脚、 皮質ヘンレ太い 上行脚、 皮質集合管、 髄質外層集合管、 髄質内層集合管） を糸球体は 2 0個、 その他の分節は 8 mmを 1サンプルとして、 それぞれの分節サン プルから RNeasy RNA mini kit (QIAGEN社製） を用いて全 RN Aを抽出 した。 得られた全 RNAと下記の表 3のプライマ一セッ ト （配列番号 2 1〜 2 9 ) を用いて RT— P C Rを行った （第 3図）。 その結果、 N a G L T 1 mRNAは他の S GL Tと同様、近位曲尿細管及び近位直尿細管 で高発現することが明らかになった （第 3図）。
(表 3 ) プライマー 遺伝子 (G enB ankァクセッション番号） (位置） 配列番号
NaGLTI (ABO画 2)
forward primer 5し CCGGTGTCTCATTTGGTGT €3T (526-547) 21 r6V6「S6 primer 5'- ACCCAAGGCGAAACTGAAG-^G (618-638) 22
TaqMan probe 5'- ACAAAGGAGCCCCACATATTCAGGCH3TT (589-616) 23 rSGLTl (D16101)
forward primer 5'- CGAGGAGGACCCTAAAGATAe^A (1912-1934) 24 revsrs6 primer 5'- GAACAGGTCATATGCCTTCCTQA (1977-1999) 25
TaqMan probe 5- TGAAATAGATGCAGAAGCCCCCCAGA-a'GG (1936-1964) 26 rSGLT2 (U29881)
forward primer 5'- AAAATACGG3AGGAAGGAACTQ' (2117-2138) 27 reverse primer 5し GACAAATTGGCCACCATCTBG (2193-2213) 28
Taq an probe 5し CCAGTCCATTTGATTGGTTGTCACrraCC (2163-2191) 29
(N a GL T I mRN A発現レベルの定量的解析）
Wistar系雄性ラット （ 7週齢） の腎臓由来全 R N Aを逆転写し （方法 2参照）、 得られた 1本鎖 D N Aを铸型として、 N a GL T I、 S GL T 1、 S GL T 2及び GAP DHに特異的なプライマー及び T a q M a η プローブ (表 3参照) と Universal master mix (Applied Biosys terns 社製） を使用し、 ABI PRISM 7700 Sequence Detection Systemを用いて N a GLT I、 S GLT 1、 S GL T 2及び GAPDH mRN A発現量 を定量した。 なお、 標準曲線を求めるため、 リアルタイム P C Rで増幅 した P C R産物を pGEM-T Easy vector (Promega社製） に挿入し、 大腸 菌 （DH— 5 α) に形質転換した。 形質転換した大腸菌を一晩 L Β培地
( 1 L中に 1 O gのバク ト トリプトン、 5 gのイーストェクストラク ト 及び 1 0 gの N a C l、 p H 7. 2) で振盪培養し、 N a GL T l、 S GL T 1、 S GL T 2及び GAPDHそれぞれの増幅産物 （表 2のブラ イマ一セッ トで増幅した P C R断片） をコードしているプラスミ ド DN Aの精製を行った。
それぞれの濃度を UV 1 2 0 0分光光度計 （島津社製） で測定し、 既 知濃度の対照遺伝子として使用した。 PRISM 7700で得られた結果は、 標 準曲線を用いて数値化した。 なお、 内部標準として用いた GAP DH発 現量をリアルタイム P C R各反応内における铸型 RN A量の補正に用い た。 その結果、 N a GL T 1 m R N A発現量は、 腎皮質及び髄質のいず れにおいても、 他の S GL Tと比較して高発現することが示された （第 4図）。
(N a G L T 1の輸送基質）
アフリカッメガエル卵母細胞（以下卵母細胞と略す）発現系を用いて、 N a GLT 1の輸送活性について調べた。 先ず、 種々の糖類の選択性に ついて調べるためインビトロ合成 N a GL T 1 RN Aを卵母細胞に注 入し、 2日間 1 8 °Cでインキュベートした後実験に供した。 放射性標識 した単糖類 （ひ —メチル—D—ダルコピラノシド （aM e G 1 c ： 代謝 抵抗性グルコース）、 ガラク トース、 フルクト一ス、 マンノース、 マンニ トール及び 2—デォキシグルコース） 並びに 2糖類 （スクロース） を基 質として調べた結果、 aM e G 1 c取り込みのみが、 陰性対照として同 時に調べた水注入卵母細胞と比較して有意に高かった（第 5図）。従って、 N a GL T 1の輸送基質がグルコースであることが明らかになった。
(N a GLT lを介したひ M e G l c輸送特性）
N a GL T l c RN A注入細胞及び水注入卵母細胞の [U— 14 C] 一 α—メチル一 D—ダルコビラノシド （《M e G l c )、 D— [ 1 - 14 C] ガラク トース、 D— [U- 14 C] マンノース、 D— [U- 14 C] フルク トース、 [ 1， 2— 3 H] — 2—デォキシ—グルコース、 D— [ 1 — 3H] マンニトール、 [U— 14 C] スクロースの取り込み活性を測定し た。 その際、 9 6mMの N a C l、 2 mMの KC 1、 1. 8mMの C a C I い I mMの M g C l 2、 5mMの HE P E S ( p H 7. 4) 力、らな る緩衝液中でインキュベートした。 また、 細胞外 N a+濃度依存性を行 う場合は、 N a C lの濃度を 9. 6〜 9 6 mMの間に調製し、 9 6mM に不足する分を塩化コリンで捕うこととし、 最終的な浸透圧を一定にし た （第 6図、 第 7図）。
次に、 N a GL T 1発現卵母細胞を用いて、 aM e G l c取り込みの 濃度依存性について調べた結果、 Km値は 3. 7 1士 0. 0 9mMを示 した （第 6図 A)。 また、 N a GL T lを介した aM e G 1 c取り込みに 対する細胞外 N a+イオン濃度の影響について解析した。 はじめに、 r N a GL T lのひ M e G l c取り込みに対する細胞外 N a +の影響は、 7 の valinomycin添加により膜電位差を無くした状態で、 細胞外 N a +の濃度を 0〜 9 6 mMまで変化させ検討した。 インビト口合成 r N a G L T l R N Aを注入した細胞では細胞外 N a +濃度依存的にひ M e G 1 c取り込みは増大した。 また、 r N a GL T lの aM e G l c取 り込みに対する用量依存性、 あるいは細胞外 N a +依存性の検討 （第 6 図 A、 第 6図 C) より、 各々の Vm a x値 （最大輸送速度）、 Km値を算 出した。 それらの値をもとにヒルプロッ ト （横軸に変化させた基質また はイオンの濃度、 縦軸にはそれぞれの基質 （またはイオン） 濃度の時の 輸送速度 Vで Vm a xを徐したものの対数値をとる。）を行い（第 6図 B、
第 6図 D)、 ヒル係数を算出した。 その結果、 aM e G l c、 N a+のヒ ル係数はそれぞれ 1. 0 6、 .1. 0 0であり、 aM e G l c と N a +と のカップリング比は 1 ： 1であることが示された （第 6図）。 従って N a GL T 1は、 細胞外 N a +イオン濃度依存的に機能するグルコース 卜ラ ンスポー夕であることが示唆された。
さらに、 N a GL T l発現卵母細胞を介する 4 C] 標識ひ M e G 1 c取り込みに対する種々阻害剤の影響について調べた結果、 非標識 αΜ e G 1 c、 D -グルコース、 2—デォキシグルコース及びフロリジンは 極めて強い阻害効果を有していた。 フルク ト一スゃフ口レチンは弱い阻 害効果を有していた。 一方、 L一グルコース、 3 _〇—メチルダルコ一 ス、 ガラク ト一ス及びマンノースは N a GL T lを介した aMe G l c 取り込みに対して影響を示さなかった （第 7図）。
(抗 N a G L T 1抗体の作製）
N a G L T 1のアミノ酸配列を基に、 C末端側のペプチド （H2N_ L P LDRKQE K S I N S E GQ— C〇OH) (配列番号 3 0 )を N末 端側をシスティンとして作製した （サヮディー ' テクノロジ一社に合成 依頼）。 高速液体クロマトグラフィー （HP C L) による分析の結果、 合 成されたペプチ ドの純度は 9 2 %であった。 続いてへモシァニン (keyhole limpet heraocyanin (Calbiochem - Behring社製)) を用レ こ のペプチドとのコンジユゲー卜を作製した。 コンジュゲートは 1 m 1ず つ 1 0本に分注し凍結保存した。
コンジュゲートは Freund完全アジュバント （Difco社製） を用いて均 一なェマルジョ ンを作った。 雄性日本白色家兎 （ 2 k g) の前免疫血清 を採取後、 0. 2 mgZ羽の割合で 2週間間隔で免疫した。 各免疫時に 採血し、 E L I S A法により抗体価の解析を行った。 最終的に充分な抗
体価が得られた後、 全採血して抗血清として凍結保存した。
(ィムノブロットによる N a GL T lの局在解析）
ペントバルビタール麻酔下 Wistar系雄性ラッ ト （ 2 2 0〜 2 3 0 g) から各組織を取り出し、 ホモジネートバッファー （ 2 3 0 mMのスクロ ース、 5 mMのトリス Z塩酸 （ p H 7. 5 )、 2mのエチレンジァミン四 酢酸 （EDTA)、 0. 1 mM フッ化フエ二ルメチルスルフォニル （ P MS F))でホモジナイズした後、 1 5分間の 3 0 0 0 gでの遠心分離を 行った。 上清を取り分け、 さらに 3 0分間の 24 5 0 0 gでの遠心分離 を行い、 沈殿物 （粗膜画分） を回収した。 ラッ ト腎刷子縁膜及び側底膜 の調製はパ一コール密度勾配遠心法（Biochim Biophys Acta 773, 113-124 1984) に従い同時調製した。 膜サンプルは S D Sサンプルバッファ一 ( 2 %の S D S、 1 2 5 mMの卜リス、 2 0 %ダルセロール) に可溶化 しポリアクリルアミ ド電気泳動（Nature 227, 680-685, 1970)を行った。 分子垦マ一力一には、 RainbowTM colored protein molecular weight markers [myosin (220, 000) , phosphory 1 ase beta (97, 400), BSA (66, 000) , ovalbumin (46, 000) , carbonic anhydrase (30, 000) , trypsin inhibitor (21, 500), lysozyme (14, 300)] (Amersham社製) を使用した。 泳動の後、 P VD F膜 （ImmobironP、 ミリポア社製） にタンパク質をト ランスファー後、 T B S— T (Tris buffered saline; 2 0 mMの T r i s /H C 1 ( p H 7. 5)、 1 3 7mMの N a C l、 0. 1 %の Tween 20) でリンスした。 次に 5 %の B S A含有 TB S一 Tで室温 2時間ブロッキ ングした後、 5 % B S A含有 T B S一 Tで希釈した抗血清 （ 1 : 2 0 0 0) と 4°C、 一晩反応させ、 その後 TB S— Tで 1 5分、 3回膜を洗浄 した。 そして E C L化学発光キッ ト （Amersham社製） を用いて X線フィ ルム （富士フィルム社製） に感光させた。 その結果、 N a GLT lタン
パク質は腎臓刷子縁膜に局在することが明らかになった（第 8図）。なお、 第 8図中の左側は、 抗 N a GL T 1抗体のみと反応させた場合、 右側は 予め抗原べプチドで処理した抗 N a GLT 1抗体で反応させた結果をそ れぞれ示す。
(N a G L T 1が媒介する H E K 2 9 3細胞によるフルクトースの取込 み）
糖類似体を含む緩衝液 （ 0. 1 mM、 3 7 k B q Zm 1 ) とともに 1 5分間、 3 7 °Cでインキュベーションした HEK 2 9 3細胞について、 ベクター （白のカラム、 0. ゥエル） 又は r N a GL T l c
D N A (黒のカラム、 0. 8 jLt gZゥエル） のトランスフエクシヨンか ら 2日後に、 取込み分析を行った。 結果を、 第 9図 （A) に示す。 各力 ラムは 3つの単層から得られた平均値土 S . E. M. を表す。 * P< 0. 0 5という値は、 ベクターでトランスフエク トした HEK 2 9 3細胞と は有意に異なっていた （Student's unpaired t-test)。
また、 r N a GL T l c DNA ( 0. 8 gZゥエル） でトランス フエク トした HEK 2 9 3細胞による [14C]フルク ト一スの取込みを、 ィンキュベーション緩衝液中、 各種濃度（ 0. 1〜 2 0 mM) について、 1 5分間、 3 7 °Cで分析し、 ベクターでトランスフエク 卜した HEK 2 9 3細胞にて測定された取込み量を差し引いた。 結果を、 第 9図 （B) に示す。 差込み図は、 取り込みの Eadie-Hofstee plotを示す。 各ポイン トは、 3つの単層の平均値土 S . E . M. を表す。 見かけ上の Km値及 び Vma x値は、 3回の個別実験により得られたものである。
(腎臓刷子縁膜小胞によるフルク 卜一スの取込み）
l O OmMのマンニトール及び 1 0 mMの HE P E S ( p H 7. ' 5 ) に懸濁した膜小胞 （ 2 0 1 ) を、 l O OmMのマンニトール、 2 0 0
mMの N a C 1 (黒の丸：參） 又は KC 1 (白の丸：〇）、 4mMの [：1 4 C ] フルク ト一ス及び 1 0 mMの H E P E S ( p H 7. 5 ) を含む基 質混合液 （2 0 1 ) とともに、 2 5 °Cでインキュベーションした。 結 果を、 第 1 0図 （A) に示す。 それぞれの値は、 3回の個別実験の平均 値土 S . E. M。 を表す。 各実験は、 5匹のラッ トから単離した刷子縁 膜小胞を用いて行われた。
腎臓刷子縁膜小胞によるフルク トースの N a +依存性の取り込みを、 N a C 1 の存在下において、 各種濃度 （ 0. l〜 2 0 mM) のインキュ ベ一ション緩衝液中で 1 5秒間、 2 5 X：で分析し、 N a C l を KC 1で 置換する場合の取込み量を差し引いた。結果を、第 1 0図（B) に示す。 差込み図は、 取り込みの Eadie-Hofstee plotを示す。 各ポイントは、 3 回の測定の平均値土 S . E . M. を表す。 見かけ上の Km値及び Vma x 値は、 3回の個別実験により得られたものである。 ( r N a GL T lでトランスフエク トした HEK 2 9 3細胞又は腎臓刷 子縁膜小胞による [14C] フルク ト一スの取込みに対する、 糖類似体フ 口リジン及ぴフ口レチンの作用）
糖類似体 （ 3 0mM) であるフロリジン （ 5 0 M) 又はフロレチン ( 5 0 fi M) のいずれかの存在下及び非存在下で、 r N a GL T lでト ランスフエク 卜した HE K 2 9 3細胞による [14C]フルク ト一ス（ 0 , 1 mM, 3 7 k B Q Zm 1 ) の取込みを、 1 5分間、 3 7 °Cで測定し、 ベクタ一でトランスフエクトした H E K 2 9 3細胞にて測定された取込 み量を差し引いた。 糖類似体 （3 0 mM) であるフロリジン （ 5 0 ^ M) 又はフロレチン （ 5 0 M) のいずれかの存在下及び非存在下で、 1 0 0 mMのマンニトール及び 1 0 mMの HE P E S ( p H 7. 5 ) に懸濁 した膜小胞 （ 2 0 1 ) を、 [14 C] フルク ト一ス （最終的に 2mM、
74 k B q/m 1 ) 含む基質混合液 （2 0 1 ) とともに、 1 5秒間、 2 5 °Cでインキュベーションし、 N a C l を KC 1で置換する場合の取 込み量を差し引いた。 N a+の穽存在とは、 N a C l を塩化コリンで置 換するという条件で測定した取り込み量である。 結果を、 表 4に示す。 それぞれの値は、 3回の個別実験の平均値土 S . E . M. を表す。 * P < 0. 0 5 という値は、 コントロールの値とは有意に異なっていた (Fisher's t-test 0
(表 4) 処理 rNaGLTI 発現 HEK293細胞による 腎刷子縁膜小胞による Na+依存的な
["C]フルク卜ース取込み ["C]フルク卜ース取込み pm ol/mg protem/min % of con troi pm ol/mg protem/sec % of control 対照 2.92土 0.04 100 49.5土 3.6 100
Na+非存在 0.16士 0.20ネ 5 一 0,2土 1.3* 0 フノレク卜一ス 0.22土 0.06* 8 5.4土 2.1ネ 11
■ eGIc 1.24士 0.13ネ 42 23.8土 2·1# 48 ガラク卜ース 2.88 + 0.23 99 35.2土 3.3 71 3-0 G 2.60土 0.15 89 47.1 土 4.5 95 2-DG 2.04 + 0.19* 70 16.8 + 3.7* 34 スクロース 4.20土 o. 144 47.3土 6.0 96 2,5-A 1.16土 0.16# 40 38.6 ± 2.6 78 フロリジン 0.34土 0.Π* 12 3.2 ± 0.8* 6 フロレチン 0.97土 0。09* 33 35.8土 3.5 72
産業上の利用可能性
腎性糖尿病は、腎臓におけるグルコース再吸収不全によるものであり、 該グルコース再吸収不全はグルコーストランスポー夕遺伝子の欠損によ ると考えられていた。 本発明により、 従来不明であった遺伝子が取得さ れたことにより、 該遺伝子及び該遺伝子の発現産物であるグルコース及 び/又はフルクトーストランスポー夕タンパク質を用いて、 腎性糖尿病 の解明、 診断、 予防 ·治療そのための薬剤の開発が可能となった。
例えば、 本発明の遺伝子及びペプチド、 更には該ペプチドに特異的に 結合する抗体を用いて、 例えば、 ヒト腎におけるような新たなダルコ一 ス及び/又はフルクトーストランスポ一夕遺伝子の単離を行うことや、 ヒトゃラッ ト組織細胞におけるグルコース及び Z又はフルクト一ストラ ンスポ一夕の発現を測定することが、 新規遺伝子の単離やグルコース及 び Z又はフルクト一ストランスポー夕の機能の診断、 腎臓における遺伝 子疾患の検出が可能となる。
また、 腎組織細胞のような組織細胞への本発明の遺伝子の導入や、 本 発明の遺伝子のアンチセンス鎖の導入による該遺伝子の発現抑制により、 組織細胞におけるグルコース及び Z又はフルク トーストランスポー夕機 能を調節することにより、 腎遺伝子疾患の予防 ·治療を行うことも可能 となる。 更に、 本発明の遺伝子の染色体上での欠損動物を作製すること により、 グルコース及び Z又はフルクトーストランスポー夕に着目した 腎性糖尿病非ヒトモデル動物を作製することが可能である。 該非ヒトモ デル動物を用いることにより、 腎性糖尿病の予防及び治療のための新規 薬剤の開発が可能となる。
Claims
1. 配列表の配列番号 1に示される塩基配列若しくはその相補的配列 又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴と する DNA。
2. 請求項 1記載の DN Aとストリンジェントな条件下でハイプリダ ィズし、 かつグルコース及びノ又はフルク トーストランスポータ機能を 有するポリぺプチドをコードすることを特徴とする DNA。
3. 以下の（a)又は（b)のポリペプチドをコードする DNA ； (a)配列表の配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド (b) )配列表の配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、 1若しく は数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からな り、 かつグルコース及び/又はフルクト一ストランスポー夕機能を有す るポリべプチド
4: 配列表の配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなることを特徴 とするポリペプチド。
5. 配列表の配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、 1若しく は数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からな り、 かつグルコース及び Z又はフルクトーストランスポ一タ機能を有す るポリペプチド。
6. 請求項 1〜3記載の DNAを、 発現ベクターに組込み、 該組換え 発現べクタ一を宿主細胞に導入して発現することを特徴とするダルコ一 ス及び/又はフルクトーストランスポ一夕機能を有するポリべプチドの 製造法。
7. 請求項 4又は 5記載のポリペプチドを用いて誘導され、 該ポリべ プチドに特異的に結合することを特徴とする抗体。
8 . 抗体が、 モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 7記 載の抗体。
9 . 抗体が、 ポリクロ一ナル抗体であることを特徴とする請求項 7記 載の抗体。
1 0 . 請求項 1 〜 3のいずれか記載の D N Aを動物組織細胞に導入す ることを特徴とするグルコース及び Z又はフルクトーストランスポ一タ 機能を有するポリぺプチドを発現する動物組織細胞の製造法。
1 1 .物組織細胞が、 ラット腎臓の組織細胞、ブタ腎臓由来上皮細胞、 ィヌ腎臓由来上皮細胞、 又はフクロネズミ腎臓由来上皮細胞であること を特徴とする請求項 1 0記載のグルコース及び/又はフルクトーストラ ンスポータ機能を有するポリぺプチドを発現する動物組織細胞の製造法。
1 2 . 動物組織細胞が、 ヒト胎児腎臓の形質転換細胞株 H E K 2 9 3 であることを特徴とする請求項 1 0記載のグルコース及び Z又はフルク トーストランスポー夕機能を有するポリべプチドを発現する動物組織細 胞の製造法。
1 3 . 請求項 1 0〜 1 2のいずれか記載の方法により製造されたこと を特徴とするグルコース及び Z又はフルクトーストランスポー夕機能を 有するポリぺプチドを発現する動物組織細胞。
1 4 . 請求項 1 3記載のグルコース及びノ又はフルクトーストランス ポー夕機能を有するポリペプチドを発現する動物組織細胞を用いて、 被 研物質のグルコース輸送機能への影響を測定することを特徴とするダル コース及び//又はフルクト一ストランスポー夕機能調節活性を有する物 質のスクリーニング方法。
1 5 . 配列表の配列番号 2に示されるグルコース及び 又はフルクト —ストランスポー夕機能を有するポリべプチドを発現する遺伝子機能を 染色体上で欠損させたことを特徴とする腎におけるグルコース再吸収能
不全に起因する腎性糖尿病を発症するモデル非ヒト動物。
1 6 . グルコース及び/又はフルク トーストランスポ一夕機能を有す るポリぺプチドを発現する遺伝子機能の欠損が、 配列表の配列番号 1に 示されるグルコース及び/又はフルク卜ーストランスポー夕機能を有す るポリべプチドを発現する遺伝子の機能の欠損であることを特徴とする 請求項 1 5記載の腎性糖尿病を発症するモデル非ヒト動物。
1 7 . 請求項 1 5又は 1 6記載の腎におけるグルコース及び/又はフ ルク卜ース再吸収能不全に起因する腎性糖尿病を発症するモデル非ヒ卜 動物に、 被検物質を投与し、 該モデル非ヒト動物、 或いは該モデル非ヒ ト動物の細胞、 組織又は器官におけるグルコース再吸収能を測定 ·評価 することを特徴とするグルコース再吸収能不全に起因する腎性糖尿病予 防 ·治療薬のスクリーニング方法。
1 8 . 請求項 1記載の塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部から なるグルコース及びノ又はフルクト一ストランスポー夕機能診断用プロ —ブ。
1 9 . 請求項 1〜 3のいずれか記載の D N Aの少なくとも 1つ以上を 固定化させたことを特徵とするグルコース及び Z又はフルクトーストラ ンスポ一夕機能診断用マイクロアレイ又は D N Aチップ。
2 0 . 請求項 7〜 9のいずれか記載の抗体及び Z又は請求項 1 8記載 の診断用プローブを用意することを特徴とするグルコース及び Z又はフ ルクト一ストランスポ一タ機能診断用薬剤。
2 1 . 被検組織から試料を得、 該試料における請求項 1記載の遺伝子 の発現を測定することを特徴とするグルコース及び Z又はフルク トース トランスポー夕機能の診断方法。
2 2 . 請求項 2 1記載の遺伝子の発現の測定を、 請求項 1 8記載のグ ルコース及び/又はフルク トーストランスポー夕機能診断用プローブ、
或いは請求項 1 9記載のグルコース及び Z又はフルク トーストランスポ 一夕機能診断用マイクロアレイ又は D N Aチップを用いて行うことを特 徵とするグルコース及び/又はフルク トーストランスポ一夕機能の診断 方法。
2 3 . 被検組織から試料を取得、 培養し、 該試料における遺伝子の発 現により生成される請求項 4記載のポリペプチドを.測定することを特徴 とするグルコース及び Z又はフルクトーストランスポ一タ機能の診断方 法。
2 4 . 請求項 2 3記載のポリべプチドの測定を、 請求項 7〜 9のいず れか記載の抗体を用いて行うことを特徴とするグルコース及び Z又はフ ルク トーストランスポー夕機能の診断方法。
2 5 . 請求項 2 1〜 2 4のいずれか記載のグルコース及び Z又はフル クトーストランスポ一タ機能の診断が、 腎疾患におけるグルコース及び Z又はフルクトーストランスポ一夕機能の測定であることを特徴とする 腎疾患の診断方法。
2 6 . 動物組織細胞に、 請求項 1〜 3のいずれか記載の D N Aを導入 することを特徴とする動物組織細胞におけるグルコース及び Z又はフル ク トーストランスポー夕機能の調節方法。
2 7。 動物組織細胞における請求項 1記載の D N Aの発現を抑制する ことを特徴とする動物組織細胞におけるグルコース及び Z又はフルク ト —ストランスポー夕機能の調節方法。
2 8 . 動物組織細胞における請求項 1記載の D N Aの発現の抑制が、 請求項 1記載の D N A塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部を動物 組織細胞に導入することにより行われることを特徴とする動物組織細胞 グルコース及び Z又はフルク ト一ストランスポ一夕機能の調節方法。
2 9 . 動物組織細胞が、 動物腎細胞であることを特徴とする請求項 2
6〜 2 8のいずれか記載の動物組織細胞におけるグルコース及び Z又は フルクト一ストランスポー夕機能の調節方法。
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