WO2004052527A1 - Verfahren und reaktor zur amplifikation von dna - Google Patents

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WO2004052527A1
WO2004052527A1 PCT/DE2003/004113 DE0304113W WO2004052527A1 WO 2004052527 A1 WO2004052527 A1 WO 2004052527A1 DE 0304113 W DE0304113 W DE 0304113W WO 2004052527 A1 WO2004052527 A1 WO 2004052527A1
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reaction
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reactor
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Reinhard Guthke
Jörg-Hermann Ozegowski
Horst Ahlers
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Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung e.V.
Friedrich-Schiller-Uni Versität Jena
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Definitions

  • PCR polymerase chain reaction
  • annealing phase two smaller single-stranded DNA oligonucleotides are attached to the single strands as an initial molecule or primer at two locations according to their specific sequence (annealing phase).
  • the primers are selected on the basis that they should include the DNA region of interest when they are attached.
  • extension phase the DNA section between the primers is multiplied by the PCR (extension phase).
  • a temperature-stable polymerase with a reaction maximum at around 72 ° C channels the attachment of the phosphonucleotides (dNPTs) to the single-stranded DNA to form the complementary DNA chain.
  • the dNPTs are used as a so-called kidney mix, consisting of dATP, dCTP, dGTP, dTTP.
  • the polymerase is used in a buffer containing Mg ++ ions, detergents and optionally an adjuvant.
  • the batch then goes through the next temperature cycle. It is heated to about 95 ° C again; there are again two D ⁇ A fragments (denaturation phase), to which the d ⁇ PTs are attached again in the next step to form the complementary chains.
  • the batch is cooled to about 55 ° C beforehand. In the first cycle, a chain becomes two complementary D ⁇ A chains, then four, then eight, sixteen and so on.
  • the D autA chains act on their own formation autocatalytically. The more chains are present, the higher the education rate. The result is exponential kinetics of education.
  • the reaction is primarily determined by the type of polymerase. For example, the DNA polymerase "Taq” catalyzes with a high conversion rate, while the polymerase “Pwo” has a ten times higher accuracy but works more slowly.
  • the temporal and thermal course of the temperature gradient is decisive for the PCR. In general, you want to heat and cool as quickly as possible, but with this requirement you are reaching the limits of physics.
  • thermocyclers carry out the temperature functions T (t) automatically. Reactions are usually used in a separate, batch-wise reactor, of which several or even a large number can be present side by side or also in series (WO 02/070751 AI). In order to monitor the course of the reaction analytically, samples are taken and the amount of DNA formed is determined by gel electrophoresis and staining or Southern blotting. The accuracy of these techniques is limited, the effort is considerable (WO98 / 45481).
  • Sampling is not required for a modern variant of the thermal cycler, the so-called light cycler. These allow up to 30 thermal cycles to be carried out in 20 minutes, with data being measured online in real time.
  • the Lightcycler allows the quantitative determination or concentration determination of the amplification products. The fluorescence of fluorescent dyes is measured, which attach to the single strand and are released each time it is doubled. In this way, the concentration of free individual strands and their formation kinetics can be determined.
  • the composition of the reaction mixture changes with the length of the capillary or the time during the flow.
  • the contents of the capillary therefore have a different composition at each point or have different reaction conditions.
  • the dNPTs are consumed with each temperature cycle, their concentration drops and the concentration of reaction product increases.
  • several independently controlled reactors are arranged on a chip, between which the samples are moved back and forth several times through the different temperature zones.
  • the reaction products are characterized biochemically in this invention.
  • a disadvantage of carrying out the PCR in batch as well as in flow reactors is that the end products formed increase with an increasing number of thermal cycles Inhibit reaction more and more and the decreasing concentration of the reactants limits the reaction rate. The number of non-specific reactions is increasing. It is also known that the polymerase is largely inactivated after about 30 to 35 thermal cycles.
  • superparamagnetic particles are used, to which the amplification samples are bound (US 5942391, US 5876924).
  • the magnetic particles can be manipulated with a magnet or a magnetic field.
  • the binding takes place, for example, via streptavidin bound to the particles, to which the biotin group of a biotinylated template DNA attaches. This is obtained by the presence of a biotinylated oligonucleotide in the PCR.
  • JP 07107962 proposes a capillary reactor and binds the amplification samples to microparticles.
  • alternating magnetic field therapy device for example alternating magnetic field therapy device, MFH Hyperthermiesysteme GmbH Berlin
  • MFH Hyperthermiesysteme GmbH Berlin by means of which superparamagnetic particles can be heated.
  • Another device are miniaturized reactors consisting of a semiconductor material with a channel open at both ends. The channel walls represent optoelectronic actuator / sensor arrangements.
  • a semiconductor body, in which a channel is sawn, is proposed for the analysis of gases in DD 261 673 B5.
  • a sensor of a similar design is used to measure forces, with which forces can be measured via an optical signal (DE 4321254 C2). Both sensors use the so-called edge radiation of a semiconductor body separated by a trench-shaped depression.
  • One wall of the trench serves as a transmitter diode for electromagnetic radiation (edge radiation), the other wall as a light-sensitive receiver diode.
  • the sensors can be arranged one behind the other.
  • the gas can be measured at different wavelengths with a wavelength defined for each individual sensor become.
  • the force sensor the light signal is changed in accordance with the deflection by bending the trench bottom under the action of forces of the light receiver relative to the transmitter diode.
  • the solutions are added and removed again in such a way that a parameter related to microbial growth, such as cell density, does not exceed or fall below a predetermined value.
  • the culture volume V R is constant in both cases.
  • a steady state is formed in the reactor, in which there are no changes in the concentration of substrates, biomass or metabolic products in the culture volume or in the process.
  • the specific growth rate ⁇ of the microorganisms is in the equilibrium state equal to the inflow rate D or the ner thinning rate D. It applies
  • Dilution rate can increase the productivity Ps of substance i, which corresponds to the steady state concentration c; st ead state in the outlet of the reactor F b existing is to be optimized. Productivity will decrease
  • the aim of the invention is to propose a method by means of which larger amounts of DNA fragments can be produced in a suitably designed reactor or reactor array or the DNA amplification can be carried out practically indefinitely. It should be possible to carry out an internal Offer Vitro Evolution in DNA amplification.
  • the DNA should be able to be obtained under easily controllable or defined and variable reaction conditions. If necessary, the amplification process should be miniaturizable and then realizable as a biochip.
  • the object of the invention to describe a suitable method and a suitable arrangement for carrying out, with which DNA fragments can be produced from a DNA initial sample with a high amplification rate or productivity.
  • the object is achieved according to the invention in that, for the amplification of DNA, the basic principles of PCR (polymerase chain reaction) known per se, consisting of the cyclical action of different temperature phases on the batch and the repeated cyclical repetition of the process (temperature cycles) in one batch reactor or a flow reactor and after an initial phase, usually carried out in a known manner, for producing a starting amount of amplified DNA from the DNA sample, according to the invention the PCR or thermal phases of the PCR semi-continuously in one or more special, preferably miniaturized reactors ( Conticyclern) or arrays of the same with constant or cyclical inflow of one or more solutions containing the reactants and optionally the polymerase are carried out, the reactor contents (reaction solution) being homogeneously mixed and the reaction volume being kept constant by the sum of the In
  • the reactor according to the invention which is enclosed on all sides except for the inflows and outflows, or a variant of the reactor in which the fill level or V R is kept constant by controlling the inflow and outflow, are referred to below as conticyclers.
  • a “real” steady state or a “real” flow equilibrium is naturally characterized by complete constancy of all steady state concentrations and the reaction conditions even with a completely continuous supply of reaction solution during the entire temperature cycle and during the successive temperature cycles if not achieved because the amplification reaction and thus the concentrations of single-stranded or double-stranded DNA depend on the thermal phases of the thermal cycle that are currently going through.
  • a steady state is at least approximately and / or temporarily reached
  • the term "semi-continuous" has therefore been introduced in the invention.
  • the semi-continuous PCR is carried out such that the supply of the reactant solutions and the discharge of the reaction solution during the entire PCR thermal cycle and the repeated thermal cycles are carried out virtually continuously or without interruption.
  • the semi-continuous supply and discharge takes place during the annealing phase and the extension phase, but not during the denaturation phase. Because the inflow is thus interrupted cyclically, the inflows and outflows are cyclically semi-continuous.
  • thermophases and temperature cycles on a DNA sample to be reproduced are implemented either semicontinuously or cyclically semicontinuously in only a single conticycler.
  • the supply of the reactant solutions is completely shut off in the denaturation phase or is reduced in a controlled manner with increasing warming or increased in a controlled manner as the temperature decreases.
  • flow rates of the reactant solution can be carried out according to a predetermined, repeating program.
  • the inflow rate can be reduced or switched off, for example, in the cyclic process in comparable phases defined by the respective current temperature within the repetitive temperature cycles when the temperature rises, and can be switched on again when a defined temperature is reached and the temperature then decreases.
  • the heating of the feed of the reactant solution according to the temperature profile in the thermal cycler is also according to the invention. It is advantageous that the inlet has a particularly good heat transfer due to its capillary shape.
  • the second reactor is in the outlet of the conticycler or represents the outlet. It is preferably capillary-shaped in order to achieve good heat transfer.
  • the drain is heated to 95 ° C. and part of the reaction solution is returned to the previously completely or partially emptied conticycler with a pump.
  • An advantage of this embodiment is that the different temperature phases are carried out separately in separate reactors.
  • the reflux is not returned to the conticycler, but is introduced into an upstream third, preferably capillary, continuous reactor together with the feed into the conticycler, mixed and exposed to the annealing temperature of about 54 ° C.
  • the annealing phase is carried out separately from the extension phase.
  • the semicontinuous homogeneous mixing or the cyclic homogeneous mixing of the reactant solutions is thus fundamentally new to the process according to the invention.
  • the reaction is carried out in a homogeneously mixed conticycler with or without a further device for carrying out the denaturation phase or 95 ° C. phase (second reactor).
  • a conticycler and optionally a second reactor for the heating phase or a reactor array consisting of these, preferably miniaturized, hereinafter referred to as a conticycler is proposed, in which technical arrangements for effective homogeneous mixing are proposed and maintaining a time-constant reaction volume and devices for controlling the reaction temperature and optionally for measuring the progress of the reaction, for example by fluorescence and / or by means of the extinction, are present.
  • the Inflow rates of the reactant solutions and the outflow of the reaction solution were kept constant at all times.
  • cyclic inflows (and outflows) are realized which have the same or largely the same size in comparable temperature phases of the successive temperature cycles.
  • the inflows and outflows are preferably controlled according to a predetermined, repeating program.
  • the inflow rate is reduced or switched off in comparable phases of the repetitive temperature cycles defined by the respective current temperature when the temperature rises and is switched on again when a defined temperature is reached with a subsequent temperature decrease.
  • the polymerase reaction takes place to a greater extent only at temperatures close to 72 ° C.
  • an experimentally determined function f (T) is therefore used, which describes the specific conversion rate ⁇ NA of the polymerase used as a function of the current reaction temperature T and has a maximum conversion rate in the vicinity of the annealing temperature. This function usually goes through a maximum.
  • the temperatures of the inflowing solution are controlled in such a way that they come as close as possible to or correspond to the respective temperature in the conticycler.
  • the reactant solution supplied generally contains the primers, buffer substances, dNPTs (four mix, consisting of: dATP, dCTP, dGTP, dTTP), optionally the polymerase and possibly fluorescent markers.
  • the DNA to be amplified is generally only added in the discontinuous PCR initial phase carried out using methods known per se.
  • the reactant solution supplied can also contain only primers, buffer substances and four mixes and, if appropriate, fluorescent markers if the polymerase according to the invention is present in the reaction volume in immobilized form.
  • the polymerase can optionally be immobilized on magnetic particles via a linker. According to the invention, these particles are also used for mixing the Reaction solution via an applied low-frequency magnetic
  • the reaction solution flowing out of the conticycler contains unreacted reactants and, if appropriate, the enzyme polymerase.
  • this solution can also be treated as a maturation process.
  • the temperature of the outflowing reaction solution is also controlled in accordance with the requirements of post-ripening.
  • a partial stream of the outflowing reaction solution is returned to the conticycler.
  • PCR is usually tracked by sensors using computers.
  • arrangements for measuring the extinction or the fluorescence according to the known light cycle principle are provided in the draining solution or directly in the conticycler. It is known that in the light cycler known per se, the reaction course of the PCR with fluorescence-labeled oligonucleotides and supply of light with a specific wavelength in the range of the fluorescence resonance energy transfer (FRET) according to the light cycler principle in the reaction liquid and / or the outlet is being followed.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the volume of the conticycler can generally be between 1 and 200 ⁇ l, without being restricted thereto.
  • the effective reaction volume V R is an important reference variable for computer-aided optimization.
  • the conticycler is equipped with one or more feed streams, which can be controlled in their feed rates, for the aqueous solutions containing the reactants and at least one outflow.
  • the drain is located above the inflows at the highest point of the conticycler. This prevents air bubbles from collecting in the conticycler and influencing the effective reactor volume. In order to avoid the formation of air bubbles, it is also possible in one embodiment of the conticycler to operate it under excess pressure. This is achieved by a pressure relief valve in the reactor outlet.
  • the conticycler is equipped with a device for homogeneous mixing of the liquid reactor contents.
  • the conticycler which is preferably used and provided with a semiconductor arrangement, superparamagnetic magnetic particles are present in the reaction volume and mix the reaction liquid intensively as a fluidized bed via a moving or rotating inhomogeneous magnetic field.
  • all mixing systems known per se such as stirrers, vibration generators or flow generators, are in connection with a semiconductor arrangement.
  • the magnetic particles are also used as a heat source. Under the influence of high-frequency alternating magnetic fields on the magnetic particles, they heat up and transfer the heat to the reaction liquid.
  • the heat energy is supplied by a controlled supply of heat energy generated via microwave radiation, thermistor or via a Peltier element.
  • the heat is removed by cooling in a manner known per se via a cooling liquid in a cooling circuit or also with a correspondingly switched Peltier element.
  • the polymerase is chemically or physically bound to magnetic particles in a manner known per se.
  • the particles and the substances bound to them are mechanically held in the conticycler.
  • the conticycler consists of a semiconductor arrangement or it has structural elements of a semiconductor with actuator / sensor properties.
  • the arrangement allows the controlled supply of thermal energy and for temperature measurement, the excitation of fluorescence and or the measurement of the emitted fluorescent light by utilizing the so-called edge radiation in a manner known per se.
  • Semiconductor elements with actuator / sensor properties can also be present in the inflows and outflows.
  • a light emitting diode arrangement can also be used.
  • the sensors and measuring devices present in the conticycler or at the inflow and / or outflow are generally connected to a computer, by means of which all PCR processes of the conticycler are controlled.
  • the conticycler according to the invention and the DNA amplification carried out in it differ fundamentally from the known thermal cycler, in which a liquid flow passes through different temperature zones.
  • the conticycler according to the invention can also be used as a batch reactor and is also used as such in the initial phase.
  • Fig. 1 Scheme of a conticycler.
  • Fig. 2 Scheme of a conticycler with feedback: arranged separately
  • Fig. 4 Scheme of a conticycler consisting of semiconductor elements for optical detection for PCR according to the Lightcycler principle and / or
  • coolers for example Peltier element
  • the conticycler (1) preferably has the shape of a cylindrical vessel which is closed except for the inflows and outflows.
  • Devices for cooling (2) and for heating (3) and for temperature measurement (4) are attached to the conticycler.
  • the conticycler In semi-continuous operation, the conticycler is completely filled with liquid.
  • the conticycler also contains inflows (5, 6, 7) through which the reaction solution can be pumped using pumps, for example linear piston pumps.
  • the outlet (8) At the highest point of the conticycler is the outlet (8) through which the ascending gas bubbles are also removed from the conticycler become.
  • the formation of the gas bubbles is also reduced by superimposing the pressure of the reactor contents through the pressure difference between the inflow and a pressure relief valve in the outflow (9).
  • the liquid supply is effected by controllable pumps, the pumping rate of which can be determined.
  • the inlets are connected to reservoirs (not shown).
  • a magnetic stirrer (10) is shown, which rotates about the axis of rotation (11), for example in the direction of rotation (12). With the use of the magnetic particles (13) and a moving magnetic field it is achieved that a fluidized bed is generated, through which the reactor contents can be mixed intensively homogeneously. This means that no stirrer protruding into the conticycler is necessary.
  • the conticyclers are also provided with optical detectors for absorbance or fluorescence measurement (14). Optical detectors for measuring UV absorption can also be present in the inlets and outlets (15).
  • the discharge either flows into a vessel for collecting the product, into a further continuous reactor (second stage) (not shown) or is fed into the conticycler as a partial stream after heating in a second reactor or after the 95 ° C phase has been carried out (Fig. 2) pumped back.
  • the second reactor is designed as a continuous reactor in the form of a capillary in order to achieve rapid heat transfer.
  • the reaction solution is heated to about 95 ° C here.
  • the returned partial stream can have a maximum of the reactor volume V R or can also be smaller. A residual volume is then generally left in the conticycler, which is filled up to V R by the recirculated partial stream.
  • Fig. 3 shows the diagram of a conticycler (19) with downstream denaturation flow reactor (16) with connected heat exchanger (17) for heating to the denaturation temperature as in Fig. 2.
  • the partial flow flows together with the inflow (5) to the conticycler (19) also through a further flow reactor (20) with a heat exchanger for carrying out the annealing phase.
  • Fig. 4 shows schematically a conticycler (1) with inflow (5) and outflow (8), which is provided with elements of a semiconductor arrangement (19).
  • the semiconductor arrangement consists of a luminescent semiconductor, for example made of GaAsP, GaP or SiC, with an n-doped and a p-doped region, which are separated from one another by a boundary region are separated (20).
  • the semiconductor arrangement encloses the reaction space. Doping and material selection are carried out in such a way that the pn junctions can both luminesce and receive the luminescent radiation; p and n regions can also be interchanged. The following relationship applies: If a current is sent through one of the pn junctions, the channel module is heated and is therefore a thermal actuator. If the resulting Kermlineshift is measured, this is a measure of the existing temperature. This provides a thermal sensor and actuator function. The temperature of both doped regions can be controlled by current in such a way that a temperature cycle is generated which is suitable for carrying out a PCR.
  • a conticycler is filled in a manner known per se with a conticycler volume of 25 ⁇ L and a denaturation at 95 ° C. for 60 s, an annealing temperature at 54 ° C. for 60 s, an extension temperature at 72 ° C. for 90 s exposed. The process is repeated 10 times.
  • the Conticycler differs from a conventional thermal cycler in that the reactor is provided with inlets and outlets, a device for mixing with a fluidized bed of magnetic particles and a device for heating the inflow to the temperature of the respective thermophase.
  • the semi-continuous DNA amplification is then started by switching on the feed of the reactant solution with constant stirring with the fluidized bed.
  • the fluidized bed is made from commercially available superparamagnetic particles that have a diameter between 1 ⁇ m and 5 ⁇ m.
  • the alternating magnetic field is generated by a rotating permanent magnet with a magnetic rod length of 3 mm attached below the conticycler at a distance of 1 mm generated.
  • the concentration of nucleotides is reduced to 20 ⁇ M so that the speed of the reaction is controlled by limitation of the nucleotides.
  • the feed is filled semi-continuously in a non-cyclical manner or not interrupted.
  • the cycle time is also 210 s.
  • the temperature of the incoming solution is adjusted to the respective temperature phase in an upstream heat exchanger.
  • 8.57 '25 ⁇ l 214 ⁇ l DNA-containing solution or for comparison with the result of the initialization instead of 25 ⁇ l per 0.583 hours the amount of 124.76 ⁇ l per 0.583 hours with a theoretically also 2 10 times the content obtained on the starting DNA.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine nach Prinzipien der Polymerase-Chain-Reaction durchgeführte spezielle DNA-Amplifikation in einem oder einer Vielzahl von bevorzugt miniaturisierten Reaktoren und gegebenfalls deren Anordnung als Array. Die Erfindung ermöglicht die kontinuierliche Produktion grösserer Mengen von DNA z.B. für die Herstellung von DNA-Vakzinen unter den erfindungsgemässen Bedingungen eines weitgehend angenäherten Fliessgleichgewichtes. Sie kann auch zur Beeinflussung der Spezifität bzw. der Fehlerrate bei der DNA-Amplifikation nach Prinzipien einer in-Vitro-Evolution beispielsweise bei der Entwicklung von DNA-Aptamere eingesetzt werden.

Description

VERFAHREN UND REAKTOR ZUR AMPLIFIKATION VON DNA
Die Polymerase-Chain-Reaction (PCR) ist ein molekularbiologisches Verfahren zur in vitro Replikation bzw. Amplifikation (oder Vermehrung) von DNA. Um die DNA zu vervielfachen, müssen verschiedene Temperaturen auf den Ansatz einwirken, bzw. dieser muß einem Temperaturzyklus mit unterschiedlichen Temperaturen unterworfen werden. Zuerst werden in der Denaturierungsphase aus einem DNA-Doppelstrang Einzelstränge bzw. eine Template-DNA durch Erhitzen auf die Denaturierungstemperatur von etwa 95° C hergestellt. Die Doppelstrang-DNA stellt, wenn es sich um die Initialphase handelt, die zu amplifizierende DNA-Probe dar. Während der laufenden Amplifizierung ist sie die mit Primer beladene Doppelstrang-DNA aus einem vorhergehenden Zyklus. Während des nachfolgenden Abkühlen auf Temperaturen um 55° C, der Annealingtemperatur, werden an die Einzelstränge zwei kleinere einzelsträngige DNA- Oligonukleotide als Initialmolekül bzw. Primer an zwei Stellen entsprechend ihrer spezifisch Sequenz angelagert (Annealingphase). Die Auswahl der Primer erfolgt unter dem Gesichtspunkt, dass sie bei ihrer Anlagerung den interessierenden DNA-Bereich einschließen sollen. Durch Erwärmen auf etwa 72° C wird der DNA- Abschnitt zwischen den Primern durch die PCR vervielfacht (Extensionsphase). Hier kanalisiert eine temperaturstabile Polymerase mit einem Reaktionsmaximum bei etwa 72° C die Anlagerung der Phosphonukleotide (dNPTs) an die einsträngige DNA unter Bildung der komplementären DNA-Kette. Die dNPTs werden als sogenannter Nierermix, bestehend aus dATP, dCTP, dGTP, dTTP, eingesetzt. Die Polymerase wird in einem Mg++-Ionen, Detergentien und gegebenenfalls ein Adjuvans enthaltenden Puffer eingesetzt. Anschließend durchläuft der Ansatz den nächsten Temperaturzyklus. Er wird wieder auf etwa 95° C erhitzt; es entstehen wieder zwei DΝA-Fragmente (Denaturierungsphase), an die im nächstem Schritt wieder die dΝPTs unter Bildung der komplementären Ketten angelagert werden. Vorher wird der Ansatz auf etwa 55° C abgekühlt. Aus einer Kette werden somit im ersten Zyklus zwei zueinander komplementäre DΝA-Ketten, dann vier, dann acht, sechzehn und so weiter.
Die DΝA-Ketten wirken bei der PCR autokatalytisch auf ihre eigene Bildung ein. Um so mehr Ketten anwesend sind desto höher ist die Bildungsrate. Eine exponentielle Bildungskinetik ist die Folge. Die Reaktion wird vor allem durch die Art der Polymerase bestimmt. Z. B. katalysiert die DNA-Polymerase „Taq" mit hoher Umsatzgeschwindigkeit, während die Polymerase „Pwo" eine zehnfach höhere Genauigkeit aufweist aber langsamer arbeitet. Entscheidend für die PCR ist der zeitliche und thermische Verlauf des Temperaturgradienten. Man möchte generell möglichst schnell erwärmen und abkühlen, stößt mit dieser Forderung aber an die Grenzen der Physik. Die Zykluszahl, das zeitliche und thermische Profil des Temperaturgradienten, die Menge und die Art der Polymerase und die Menge an Nukleotiden im sogenannten Vierermix sind Größen, die das Ergebnis beeinflussen. Moderne Thermocycler fuhren die Temperararfunktionen T(t) automatisch durch. Es werden meistens Reaktionen in einem separaten, nicht kontinuierlich betriebenen (batch) Reaktor, von denen mehrere bzw. auch eine Vielzahl nebeneinander oder auch hintereinander (WO 02/070751 AI) vorliegen können, eingesetzt. Um den Reaktibnsverlauf analytisch zu verfolgen, werden Proben gezogen und durch Gelelektrophorese und Anfärben oder Southern-Blotting die Menge der gebildeten DNA bestimmt. Die Genauigkeit dieser Techniken ist begrenzt, der Aufwand beträchtlich (WO98/45481).
Die Entnahme von Proben entfällt bei einer modernen Variante des Thermocyclers, dem sogenannten Lightcycler. Dieser erlauben die Durchführung von bis zu 30 Thermozyklen in 20 Minuten, wobei Daten on-line in Echtzeit gemessen werden. Der Lightcycler gestattet die quantitative Bestimmung bzw. die Konzentrationsbestimmung der Amplifikationsprodukte. Es wird die Fluoreszenz von Fluoreszenzfarbstoffen gemessen, die sich an den Einzelstrang anlagern und bei jedem Verdopplung wieder frei werden. Auf diese Weise kann die Konzentration an freien Einzelsträngen bzw. ihre Bildungskinetik bestimmt werden.
Bekannt ist, dass durch Einsatz von mikrofluidischen Systemen die herkömmlich verwendeten batch-Reaktoren, wie beispielsweise Reagenzgläser oder Mikroplatten, ersetzt werden können. Reaktantenlösungen werden in miniaturisierten Arrays bzw. auf Chips beispielsweise durch Pumpen zusammengeführt und gemischt und die Reaktionen detektiert.
Auch bei der Durchführung der PCR werden solche mikrofluidischen Systeme an Stelle von batch-Reaktoren inzwischen eingesetzt. Es werden Durchflußreal toren wegen des besseren Wärmeübergangs als Kapillaren ausgebildet. Die Reaktionslösung fließt mehrfach durch die als Kapillaren ausgebildeten (JP 07107962 A), hintereinander angeordneten Erwärmungs- und Abkühlungszonen oder sie wird zwischen den unterschiedlichen Temperaturzonen hin und her gefördert (multi-Temperaturzonen-PCR) (WO 02/072267 AI, Chemical Amplification: M. U. Koop, A. J. de Mello, A. Manz (1998). Continuous-Flow PCR on a chip. Science, 280, 1046 - 1048. Schneegaß, L, and Köhler, J. M. (2001). "Flow-through PCR in chip thermocyclers", Reviews in Molecular Biotechnology, 82(2), 101-121; Schneegaß, L, Bräutigam, R., and Köhler, M. (2001). "Miniaturized flow-through PCR with different template types in a Silicon chip thermocycler", Lab on a Chip, 1, 42-49; Welche DNA darfs denn sein? VDI-Nachrichten vom 7.9.2001, A. Kusserow: Die PCR-Technik, Life Sciences 9/2001, 11-19; A. Rieger, P. C. Held: Quantifizierung von Nukleinsäuren und Proteinen im Microplate-Format. Git Labor-Fachzeitschrift 9/2001, 898-902; D. Fischer: Optimierung und Validierung von PCRs. GIT Labor-Fachzeitschrift 9/2001, 906-908; 1, 42-49). CN 1248702 schützt die Anordnung von insgesamt vier Mikroreaktoren, in denen jeweils eine Temperaturphase durchgeführt wird.
Typisch für diese Art der Durchflußreaktoren ist, dass sich beim Durchfluß die Zusammensetzung der Reaktionsmischung mit der Länge der Kapillare bzw. der Zeit ändert. Der Inhalt der Kapillare weist dadurch an jeder Stelle eine andere Zusammensetzung auf bzw. besitzt andere Reaktionsbedingungen. Die dNPTs werden bei jedem Temperaturzyklus verbraucht, ihre Konzentration sinkt und die Konzentrationen an Reaktionsprodukt steigt an. Bei einer in WO01/07159A2 beschriebenen Weiterentwicklung sind mehrere unabhängig kontrollierte Reaktoren auf einem Chip angeordnet, zwischen denen die Proben mehrfach durch die verschiedenen Temperaturzonen hin und her bewegt werden. Zusätzlich werden in dieser Erfindung die Reaktionsprodukte biochemisch charakterisiert.
In all den beschriebenen Durchfluß-Reaktoren werden demnach keine steady State- bzw. Fließgleichgewichtsbedingungen erreicht bzw. annähernd erreicht. Bei den herkömmlichen PCR-Methoden ist eine Optimierung auf Grund der Komplexität der Reaktion relativ schwierig durchzuführen. Die erhaltenen Mengen an DNA- Fragmenten sind durch den batch-Charakter der PCR begrenzt.
Nachteilig bei der Durchfül rung der PCR in batch- als auch in Durchflußreaktoren ist, dass mit zunehmender Anzahl der Thermozyklen die gebildeten Endprodukte die Reaktion mehr und mehr inhibieren und die abnehmende Konzentration der Reaktanten die Reaktionsgeschwindigkeit limitiert. Die Zahl der unspezifischen Reaktionen nimmt zu. Bekannt ist auch, dass die Polymerase nach etwa 30 bis 35 Thermozyklen weitgehend inaktiviert ist.
Bei einer Variante der PCR in einem batch-Reaktor werden superparamagnetische Partikel eingesetzt, an welche die Amplifizierungsproben gebunden sind (US 5942391, US 5876924). Die magnetischen Partikel können mit einem Magneten bzw. einem magnetischen Feld manipuliert werden. Es liegen Ergebnisse zur Durc---führung der PCR mit der Polymerase Taq vor, bei denen die Template-DNA an magnetische Partikel (Dynabeads M-280) gebunden vorliegt. Die Bindung erfolgt beispielsweise über an die Partikel gebundenes Streptavidin, an welches sich die Biotingruppe einer biotinylierten template-DNA anlagert. Diese wird durch die Anwesenheit eines biotinylierten Oligonukleotids bei der PCR gewonnen. JP 07107962 schlägt einen Kapillarreaktor vor und bindet die Amplifizierungsproben an Mikropartikel.
Andere bekannte technische Lösungen betreffen eine Vorrichtung und ein Verfahren, bei welchem ein magnetisches Wechselfeld erzeugt wird (beispielsweise Magnetwechselfeld-Therapie-Gerät, MFH Hyperthermiesysteme GmbH Berlin), durch dass superparamagnetische Partikel erwärmt werden können. Eine weitere Vorrichtung sind miniaturisierte, aus einem Halbleitermaterial bestehende Reaktoren mit einem an beiden Enden offenen Kanal. Die Kanalwände stellen hierbei optoelektronische Aktor/Sensor- Anordnungen dar. Ein Halbleiterkörper, in dem ein Kanal eingesägt ist, wird für die Analyse von Gasen in DD 261 673 B5 vorgeschlagen. Ein ähnlich aufgebauter Sensor wird zur Messung von Kräften eingesetzt, mit dem auftretende Kräfte über ein optisches Signal gemessen werden können (DE 4321254 C2). Beide Sensoren nutzen die sogenannte Kantenstrahlung eines durch eine grabenförmige Vertiefung getrennten Halbleiterkörpers. Die eine Wand des Grabens dient als Sendediode für elektromagnetische Strahlung (Kantenstrahlung), die andere Wand als lichtempfindliche Empfängerdiode. Bei einer vorgeschlagenen Mehrfachanordnung können mehrere der Sensoren hintereinander angeordnet werden. Dadurch kann das Gas bei verschiedenen Wellenlängen mit einer für jeden Einzelsensor definierten Wellenlänge gemessen werden. Bei dem Kraftsensor wird durch Verbiegen des Grabenbodens unter der Einwirkung von Kräften der Lichtempfänger relativ zum Sendediode, das Lichtsignal entsprechend der Ausbiegung verändert.
Bekannt ist weiterhin, dass die Durchführung von Wachstumsreaktionen bzw. Amplifikation von Mikroorganismen in kontinuierlicher Kultur unter Anwendung des Chemostatenprinzips und des Turbidostatenprinzips erfolgen kann. Durch die technischen Anordnungen wird eine sterile Kulrarflüssigkeit, welche die Substrate des mikrobiellen Wachstums enthält, in den Reaktor mit einer Verdünnungsrate D hineingepumpt, homogen vermischt und gleichzeitig mit der gleichen Verdünnungsrate D Kulturlösung, welche die gewachsenen Mikroorganismen, nichtverbrauchte Substrate und Stoffwechselprodukte enthält, entnommen. Man unterscheidet das Chemostaten- und das Turbidostatenprinzip. Beim Chemostaten werden die Lösungen kontinuierlich zugepumpt und entnommen. Beim Turbidostaten werden die Lösungen so zugeführt und wieder entnommen, dass ein mit dem mikrobiellen Wachstum zusammenhängender Parameter, z.B. die Zelldichte, einen vorher festgelegten Wert nicht überschreitet oder unterschreitet. Das Kulturvolumen VR ist in beiden Fällen konstant. Es bildet sich im Reaktor ein Fließgleichgewicht bzw. steady State aus, bei welchem im Kulturvolumen als auch im Ablauf keine Konzentrationsänderungen von Substraten, Biomasse oder Stoffwechselprodukten stattfinden. Die spezifische Wachstumsrate μ der Mikroorganismen ist im Gleichgewichtszustand gleich der Zulaufrate D bzw. der Nerdünnungsrate D. Es gilt
μ = D [1/t]
und
Figure imgf000007_0001
mit der Flußrate F, definiert als zufließendes (Fz) bzw. abfließendes (FAb) Flüssigkeitsvolumen pro Zeiteinheit und mit dem Reaktionsvolumen VR. Durch Veränderungen von Substratkonzentrationen im Zufluß und der
Verdünnungsrate kann die Produktivität Ps der Substanz i, welche mit der steady state- Konzentration c; stead state im Auslauf des Reaktor F b vorhandenen ist, optimiert werden. Die Produktivität wird nach
Ps = D . Ci steady State
berechnet. Beim Turbidostaten wird die Konzentration der Reaktanten im Reaktor durch Steuerung des Zuflusses an Reaktantenlösung konstant gehalten. (H.Boze, G. Moulin: Biomass in „Biotechnology Vol. 9, p. 167 - 220; F. Bergter. Wachstum von Mikroorganismen. Experimente und Modelle. VEB Gustav Fischer Verlag Jena 1972.)
Es ist abzusehen, dass zuk-ünftig für verschiedene Anwendungen besonders im Bereich der Gentherapie größere Mengen an DNA, beispielsweise als DNA- Vakzine oder als antisense DNA zur gezielten Blockierung bestimmter, mit der Krankheit zusammenhängender Genabschnitte benötigt werden. Diese Mengen können mit herkömmlichen, batchweise arbeitenden Thermocyclern oder auch den nach gleichem Prinzip arbeitenden Lightcyclern nicht hergestellt werden. Weiterhin existiert keine effektive Methode für die langzeitige Simulation der Fehlerrate bei der DNA- Replikation.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren vorzuschlagen, mit dem in einem entsprechend ausgebildeten Reaktor oder Reaktorarray größere Mengen an DNA- Fragmenten hergestellt werden bzw. die DNA-Amplifikation zeitlich praktisch unbegrenzt durchgefülirt werden kann.. Es soll Möglichkeit der Durchfuhrung einer in- Vitro Evolution bei der DNA-Amplifikation bieten. Die DNA soll unter leicht kontrollierbaren bzw. definierten und variierbaren Reaktionsbedingungen gewonnen werden können. Das Amplifikationsverfahren soll gegebenfalls miniaturisierbar und dann als Biochip realisierbar sein.
Es ist demnach die Aufgabe der Erfindung, ein geeignetes Verfahren und eine geeignete Anordnung zur Durchführung zu beschreiben, mit dem DNA-Fragmente mit einer hohen Amplifikationsrate bzw. Produktivität aus einer DNA-Initialprobe produziert werden können. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass zur Amplifikation von DNA die an sich bekannten Grundprinzipien der PCR (Polymerase-Chain-Reaction), bestehend aus der zyklischen Einwirkung von verschiedenen Temperaturphasen auf den Ansatz und der vielfachen zyklischen Wiederholung des Prozesses (Temperaturzyklen) in einem batch-Reaktor oder einem Durchflußreal tor und nach einer in der Regel in bekannter Weise durchgeführten Initialphase zur Herstellung einer Startmenge an amplifizierter DNA aus der DNA-Probe, erfindungsgemäß die PCR oder thermische Phasen der PCR semikontinuierlich in einem oder mehreren speziellen, bevorzugt miniaturisierten Reaktoren (Conticyclern) oder Arrays derselben bei ständigem oder zyklischem Zufluß einer oder mehrerer die Reaktanten und gegebenenfalls die Polymerase enthaltenden Lösungen durchgeführt werden, wobei der Reaktorinhalt (Reaktionslösung) homogen durchmischt und das Reaktionsvolumen VR konstant gehalten wird, indem die Summe der Zuflußraten der Reaktantenlösungen Fzu gleich der Abflußrate der Reaktionslösung FAb ist. Der flüssige Reaktorinhalt wird hierbei homogen gemischt.
Der erfindungsgemäße, bis auf die Zu- und Abflüsse allseitig umschlossene Reaktor, oder eine Variante des Reaktors, bei dem der Füllstand bzw. VR durch Steuerung des Zu- und Abflusses konstant gehalten wird, werden im Weiteren als Conticycler bezeichnet.
Bei der erfindungsgemäßen Durchführung der PCR wird ein „echter" steady State bzw. ein „echtes" Fließgleichgewicht, gekennzeichnet durch vollständige Konstanz aller steady State Konzentrationen und der Reaktionsbedingungen auch bei einer vollständig kontinuierlichen Zuführung von Reaktionslösung während des gesamten Temperaturzyklus und während der aufeinanderfolgenden Temperaturzyklen naturgemäß schon deshalb nicht erreicht, weil die Amplifikationsreaktion und damit die Konzentrationen an einsträngiger oder doppelsträngiger DNA von den thermischen Phasen des Thermozyklus abhängig ist, die gerade durchlaufen werden. Für die erfindungsgemäßen Art der Zu- und Abführung von Reaktanten- und Reaktionslösung, bei der ein steady State zumindest annähernd und/oder zeitweise erreicht wird, ist in der Erfindung deshalb der Ausdruck „semikontinuierlich" eingeführt worden.
Die semikontinuierliche PCR wird in einer Ausführungsform so durchgeführt, dass die Zuführung der Reaktantenlösungen und die Abführung der Reaktionslösung während des gesamten PCR-Thermozyklus und der sich wiederholenden Thermozyklen quasi kontinuierlich bzw. ohne Unterbrechung erfolgt.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung erfolgt die semikontinuierliche Zu- und Abführung während der Annealingphase und der Extensionsphase, nicht jedoch während der Denaturierungsphase. Weil somit die Zufluß zyklisch unterbrochen wird, erfolgen die Zu- und Abflüsse zyklisch semikontinuierlich.
In einer bevorzugten Ausfül rungsform der Erfindung werden alle Thermophasen und Temperaturzyklen an einer zu vervielfältigenden DNA-Probe entweder semikontinuierlich oder zyklisch semikontinuierlich in nur einem einzigen Conticycler realisiert.
In einer anderen, modifizierten Ausfuhrungsform der zyklisch semikontinuierlichen Verfahrensweise der Erfindung wird die Zuführung der Reaktantenlösungen in der Denaturierungsphase vollständig abgestellt oder mit zunehmender Erwärmung kontrolliert verringert bzw. bei Temperaturerniedrigung kontrolliert erhöht. Auch bei dieser modifizierten Ausführung des zyklisch semikontinuierlichen Verfahrens erfolgt die Zufül rung der Reaktantenlösung in einer Weise, dass bezogen auf gleichartige Temperaturphasen innerhalb der aufeinanderfolgender Temperaturzyklen sich die Konzentrationen der Reaktanten und Reaktionsprodukte c; nicht bzw. wenig ändern (dcj/dt = 0 bzw. dcj/dt = Minimum) sowie die Verdünnungsrate D mit D = FZI VR, berechnet pro Temperaturzyklus gleich oder kleiner als 1/tz (tz = Zeit eines Temperaturzyklus) ist.
Bei dieser Ausfülirungsform können Zuflußraten der Reaktantenlösung nach einem vorgegebenen, sich wiederholenden Programm durchgeführt werden. Die Zuflußrate kann beispielsweise bei dem zyklischen Prozess in vergleichbaren, durch die jeweilige aktuelle Temperatur definierten Phasen innerhalb der sich wiederholenden Temperaturzyklen bei Temperaturerhöhung reduziert bzw. abgeschaltet und bei Erreichen einer definierten Temperatur bei nachfolgender Temperaturerniedrigung wieder eingeschaltet werden. Die Anwärmung des Zulaufs der Reaktantenlösung entsprechend dem Temperaturverlauf im Thermocycler ist ebenfalls erfindungsgemäß. Vorteilhaft ist, dass der Zulauf auf Grund seiner Kapillarform einen besonders gute Wärmeübergang aufweist. In einer Ausführungsform, im Folgenden als Rückführungsverfahren bezeichnet, befindet sich der zweite Reaktor im Ablauf des Conticyclers bzw. stellt den Ablauf dar. Er ist bevorzugt kapillarförmig ausgebildet, um einen guten Wärmeübergang zu erreichen. Die Ablauf wird auf 95 °C erwärmt und ein Teil der Reaktionslösung in den vorher vollständig oder teilweise entleerten Conticycler mit einer Pumpe zurückgeführt. Vorteilhaft an dieser Ausfuhrungsform ist, dass die unterschiedlichen Temperaturphasen voneinander getrennt in separaten Reaktoren durchgefülirt werden. Bei einer Variante dieser Ausfülirungsform wird der Rücklauf nicht in den Conticycler zurückgeführt, sondern in einen vorgeschalteten dritten bevorzugt kapillarförmigen Durchlaufreaktor zusammen mit dem Zulauf in den Conticycler eingeleitet, gemischt und der Annealingtemperatur von etwa 54°C ausgesetzt. Bei dieser Variante wird die Annealingphase separat von der Extensionsphase ausgeführt.
Grundsätzlich neu an dem erfindungsgemäßen Verfahren ist somit die semikontinuierliche homogene Durchmischung oder die zyklische homogene Mischung der Reaktantenlösungen. Die Durchführung der Reaktion erfolgt in einem homogen durchmischten Conticycler mit oder ohne einer weiteren Vorrichtung zur Durchführung der Denaturierungsphase bzw. 95°C-Phase (zweiter Reaktor).
Um das Prinzip der semikontinuierlichen DNA-Amplifikation durchzuführen, wird demnach ein aus Conticyclern und gegebenenfalls zweiten Reaktor für die Erwärmungsphase bzw. ein aus diesen bestehendes Reaktorarray, bevorzugt miniaturisierten ausgebildet, im weiteren als Conticycler bezeichnet, vorgeschlagen, in dem technische Anordnungen zur effektiven homogenen Durchmischung und Aufrechterhaltung eines zeitlich konstanten Reaktionsvolumens sowie Vorrichtungen zur Steuerung der Reaktionstemperatur und gegebenenfalls zur Messung des Reaktionsfortschrittes z.B. durch Fluoreszenz und/oder über die Extinktion vorhanden sind. Erfindungsgemäß wird somit bei der erfindungsgemäßen Durchführung der semikontinuierlichen PCR in einem Conticycler angestrebt, dass die Konzentrationen der Reaktanten und Reaktionsprodukte c; in aufeinanderfolgenden vergleichbaren Phasen der Temperaturzyklen sich nicht bzw. wenig ändern (dcj/dt = 0 bzw. dcj/dt = Minimum). Um dieses Ziel zumindest teilweise zu erreichen, werden in einer Ausführungsform die Zuflußraten der Reaktantenlösungen und der Abfluß der Reaktionslösung kontinuierlich konstant gehalten. In einer weiteren Ausführungsform des Conticyclers werden zyklische Zuflüsse (und Abflüsse) realisiert, welche in vergleichbaren Temperaturphasen der aufeinanderfolgenden Temperaturzyklen eine gleiche oder weitgehend gleiche Größe haben. Die Steuerung der Zu- und Abflüsse erfolgt bevorzugt nach einem vorgegebenen, sich wiederholenden Programm.
In einer Ausführung wird die Zuflußrate in vergleichbaren, durch die jeweilige aktuelle Temperatur definierten Phasen der sich wiederholenden Temperaturzyklen bei Temperaturerhöhung reduziert bzw. abgeschaltet und bei Erreichen einer definierten Temperatur bei nachfolgender Temperaturerniedrigung wieder eingeschaltet. In einer anderen Ausführung wird davon ausgegangen, dass die Polymerasereaktion nur bei Temperaturen nahe 72°C in größerem Maße stattfindet. Mit Temperturerhöhung auf die Denaturierungstemperatur nimmt die spezifische Umsatzrate μDNA stark ab. Zur Steuerung der Zuflußrate wird deshalb eine experimentell zu bestimmende Funktion f(T) verwendet, welche die spezifische Umsatzrate μπNA der verwendeten Polymerase in Abhängigkeit von der aktuellen Reaktionstemperatur T beschreibt und eine maximale Umsatzrate in der Nähe der Anneallingtemperatur aufweist. Diese Funktion durchläuft in der Regel ein Maximum. Bei allen Ausführungen ist es wie bei dem herkömmlichen Thermocycler von Vorteil, wenn die thermischen Zyklen möglichst schnell hintereinander erfolgen. Bei einer besonders effektive Ausführung des Conticyclers werden die Temperaturen der zufließenden Lösung so gesteuert, dass sie der jeweiligen Temperatur im Conticycler möglichst nahe kommen bzw. entsprechen. Die zugeführte Reaktantenlösung enthält in der Regel die Primer, Puffersubstanzen, dNPTs (Vierermix, bestehend aus: dATP, dCTP, dGTP, dTTP), gegebenfalls die Polymerase und gegebenenfalls Fluoreszenzmarker. Die zu vermehrende DNA wird in der Regel nur in der nach der mit an sich bekannten Methoden durchgeführten diskontinuierlichen PCR-Initialphase zugegeben. Die zugeführte Reaktantenlösung kann jedoch auch nur Primer, Puffersubstanzen und Vierermix sowie gegebenenfalls Fluoreszenzmarker enthalten, wenn die Polymerase erfindungsgemäß in immobilisierter Form im Reaktionsvolumen vorliegt. Die Polymerase kann gegebenenfalls über einen Linker an Magnetpartikel immobilisiert vorliegen. Diese Partikel werden erfindungsgemäß auch zum Durchmischen der Reaktionslösung über ein angelegtes niederfrequentes magnetischen
Wechselfeld oder auch zum Erwärmen der Reaktionslösung über ein angelegtes hochfrequentes magnetisches Wechselfeld eingesetzt.
Die aus dem Conticycler abfließende Reaktionslösung enthält bei der erfindungsgemäß durchgeführten PCR noch nicht umgesetzte Reaktanten sowie gegebenenfalls das Enzym Polymerase. In nachgeschalteten Conticyclern, die beispielsweise auch nach dem Conticyclerprinzip arbeiten, kann diese Lösung auch im Sinne eines Ausreifungsprozesses behandelt werden. Hierzu besteht die erfindungsgemäße Möglichkeit, dass auch die Temperatur der abfließenden Reaktionslösung entsprechend den Erfordernissen der Nachreifung gesteuert wird.
In einer anderen Ausführungsform wird ein Teilstrom der abfließenden Reaktionslösung in den Conticycler zurückgeführt.
Eine wichtige Vorbedingung für den Betrieb des Conticyclers ist, dass die PCR über Sensoren in der Regel computergesteuert verfolgt wird. Hierzu sind Anordnungen zur Messung der Extinktion oder der Fluoreszenz entsprechend dem an sich bekannten Lightcycle rinzip in der abfließenden Lösung oder direkt im Conticycler vorgesehen. So ist bekannt, dass in dem an sich bekannten Lightcycler der Reaktionsverlauf der PCR mit fluoreszenzmarkierten Oligonukleotide und Zuführung von Licht mit einer spezifischen Wellenlänge im Bereich des Fluoreszenz Resonance Energy Transfer (FRET) nach dem Light cycler-Prinzip in der Reaktionsflüssigkeit und/oder dem Auslauf verfolgt wird.
Das Volumen des Conticyclers kann, ohne darauf beschränkt zu sein, in der Regel zwischen 1 und 200 μl liegen. Das effektive Reaktionsvolumen VR ist eine wichtige Bezugsgröße für die rechnergestützte Optimierung. Der Conticycler ist mit einem oder mehreren in ihren Zulaufraten steuerbaren Zuläufen für die wäßrige Lösungen enthaltend die Reaktanten und mindestens ein Abfluß ausgestattet. Der Abfluß ist oberhalb der Zuflüsse an der höchsten Stelle des Conticyclers angebracht. Dadurch wird vermieden, dass sich Luftblasen im Conticycler ansammeln und das effektive Reaktorvolumen beeinflussen können. Um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, besteht auch die Möglichkeit bei einer Ausführungsform des Conticyclers, ihn bei Überdruck zu betreiben. Dies wird durch ein Überdruckventil im Reaktorabfluß erreicht. Es ist eine Vorbedingung für das erfindungsgemäße Verfahren,, dass die zufließenden Lösungen sehr schnell mit dem Reaktionsvolumen vorhanden Reaktionslösung vermischt werden kann. Der Conticycler ist in allen Ausführungsformen mit einer Vorrichtung zur homogenen Durchmischen des flüssigen Reaktorinhalts ausgestattet. In einer bevorzugt eingesetzten Variante des Conticyclers, versehen mit einer Halbleiteranordnung sind superparamagnetische Magnetpartikel im Reaktionsvolumen vorhanden, die über ein sich bewegendes bzw. drehendes inhomogenes Magnetfeld als Wirbelbett die Reaktionsflüssigkeit intensiv vermischen. Erfindungsgemäß sind in Verbindung mit einer Halbleiteranordnung alle an sich bekannten Durchmischungssysteme, wie Rührer, Schwingungserzeuger oder Strömungserzeuger.
Die Magnetpartikel werden in einer Ausführung auch als Wärmequelle verwendet. Unter dem Einfluß von hochfrequenten magnetischen Wechselfeldern auf die Magnetpartikel erwärmen diese sich und übertragen die Wärme auf die Reaktionsflüssigkeit. In einer anderen Ausführung erfolgt die Zuführung von Wärmeenergie durch eine gesteuerte Zuführung von Wärmeenergie erzeugt über Mikrowellenstrahlung, Thermistor oder über ein Peltierelement.
Die Abführung der Wärme erfolgt durch Kühlung in an sich bekannter Weise über eine Kühlflüssigkeit in einem Kühlkreislauf oder auch mit einem entsprechend geschalteten Peltierelement.
Um den Verbrauch der relativ kostenintensiven Polymerase zu verringern, wird die Polymerase in einer Ausführung der Erfindung an Magnetpartikel chemisch oder physikalisch auf an sich bekannte Weise gebunden. Dadurch werden die Partikel und die an sie gebunden Substanzen mechanisch im Conticycler festgehalten. In einer bevorzugten Anordnung besteht der Conticycler aus einer Halbleiteranordnung oder er weist konstruktive Elemente eines Halbleiters mit Aktor/Sensor-Eigenschaften auf. Die Anordnung erlaubt in an sich bekannter Weise die gesteuerte Zuführung von Wärmeenergie und zur Temperaturmessung, die Anregung von Fluoreszenz und oder die Messung des emittierten Fluoreszenzlichtes durch Ausnutzung der sogenannten Kantenstrahlung. Halbleiterelemente mit Aktor/Sensor-Eigenschaften können auch in den Zu- und Abflüssen vorhanden sein. Eine Leuchtdiodenanordnung kann ebenfalls eingesetzt werden. Die im Conticycler oder an den Zu- und/oder Abfluß vorhandenen Sensoren und Meßeinrichtungen sind in der Regel mit einem Computer verbunden, über den alle PCR-Prozesse des Conticyclers gesteuert werden.
Der erfindungsgemäße Conticycler und die in ihm durchgeführte DNA-Amplifikation unterscheiden sich grundlegend von dem bekannten Thermocyclern, bei denen ein Flüssigkeitsstrom verschiedene Temperaturzonen durchläuft.
Da bei der herkömmlichen, batchweise durchgeführten PCR nachteilige Inaktivierung der Polymerase nach etwa 30 Thermozyklen wird durch die kontinuierliche Zuführung von frischer Polymerase in der Reaktantenlösung und zusätzlich auch durch die vorgeschlagene Immobilisierung des Enzyms an die Magnetpartikel entgegengewirkt. Der erfindungsgemäße Conticycler ist in einer Ausftihrungsform auch als diskontinuierlich arbeitender Reaktor (batch-Reaktor) einsetzbar und wird in der Initialphase auch als ein solcher genutzt.
Die Erfindung soll, ohne das dadurch die Erfindung eingeschränkt werden soll, durch Beispiele an Hand der folgenden Abbildungen und Beispiele erläutert werden.
Abb. 1 Schema eines Conticyclers. Abb. 2 Schema eines Conticyclers mit Rückführung: Separat angeordneten
Denaturierungs-Durchflußreaktor. Abb. 3 Schema eines Conticyclers mit Rück-uöhrung: Separat angeordneter
Denaturierungsreaktor und im Zufluß vorgeschalteten Annealing-Reaktor. Abb. 4 Schema eines Conticyclers bestehend aus Halbleiterelementen für die optische Detektion für PCR nach dem Lightcycler-Prinzip und/oder der
Temperatureinstellung und Temperaturmessung.
In den Abbildungen verwendete Abkürzungen:
1 Reaktorwand bzw. Reaktor
2 Kühler beispielsweise Peltier-Element
3 Heizer 4 Temperaturmesseinrichtung
5 Zufluß bzw. Pumpe für Reaktionslösung
6 Zufluß bzw. Pumpe für Reaktionslösung
7 Zufluß bzw. Pumpe für Reaktionslösung 8 Abfluß
9 Vorrichtung zum Erwärmen auf etwa 95°C,
10 Drehbarer oder oszillierender Magnet
11 Drehachse
12 Drehrichtung 13 Magnetpartikel
14 optischer Detektor am Abfluß
15 optischer Detektor am Zufluß
16 als Kapillare ausgebildeter zweiter Reaktor zur Durchführung der 95°C-Phase
17 Vorrichtung zur Erwärmung, beispielsweise Heizbad 18 Vorrichtung zum Transportieren der Flüssigkeit
19 Conticycler zur Durchführung der Extensionsphase
20 Durchflußreaktor zur Durchführung der Annealingphase an den vereinigten Flüssen von Rückführung und Zufluß
21 Halbleitervorrichtung mit gesägtem Kanal, in dem sich der Conticycler befindet 22 emittiertes Licht (Kantenstrahlung)
23 Lichtdetektion
24 Grenze zwischen p und n-Dotierung der Halbleiteranordnung
25 Vorrichtung zur Temperatureinstellung der zufließenden Reaktantenlösung
Beispiel 1
Der Conticycler (1) besitzt vorzugsweise die Form eines zylinderförmigen Gefäßes, welches bis auf die Zu- und Abflülsse verschlossen ist. An dem Conticycler sind Vorrichtungen zum Kühlen (2) und zum Heizen (3) und zur Temperaturmessung (4) angebracht. Im semikontinuierlichen Betrieb ist der Conticycler vollständig mit Flüssigkeit gefüllt. Weiterhin enthält der Conticycler Zuflüsse (5, 6, 7), durch welche mit Pumpen, beispielsweise linear arbeitenden Kolbenhubpumpen die Reaktionslösung gefördert werden kann. An der höchsten Stelle des Conticyclers befindet sich der Ablauf (8) durch welchen auch die aufsteigenden Gasbläschen aus dem Conticycler entfernt werden. Die Bildung der Gasblasen wird auch durch Drucküberlagerung des Reaktorinhalts durch die Druckdifferenz zwischen Zufluß und einem Überdruckventil im Abfluß (9) reduziert. Der Flüssigkeitszulauf wird durch steuerbare Pumpen bewirkt, deren Pumprate bestimmt werden kann. Die Zuläufe sind mit Reservoirs (nicht abgebildet) verbunden.
In der Abb. 1 ist ein Magnetrührer (10) dargestellt, der sich um die Drehachse (11) beispielsweise in der Drehrichtung (12) dreht. Mit dem Einsatz der Magnetpartikel (13) und eines bewegten Magnetfeldes wird erreicht, dass ein Wirbelbett erzeugt wird, durch welches der Reaktorinhalt intensiv homogen durchmischt werden kann. Dadurch ist kein in den Conticycler hineinragender Rührer notwendig. Weiterhin sind in einer Ausführung die Conticycler mit optischen Detektoren zur Extinktions- oder zur Fluoreszenzmessung (14) versehen. Auch in den Zu- und Abläufen können optische Detektoren zur Messung der UV-Absorption vorhanden (15) sein. Der Ablauf mündet entweder in ein Gefäß zum Sammeln des Produktes, in einen weiteren Durchlaufreaktor (zweite Stufe) (nicht abgebildet) oder wird als Teilstrom nach Erwärmen in einem zweiten Reaktor bzw. nach Durchführung der 95° C-Phase in den Conticycler (Abb. 2) zurückgepumpt. Der zweite Reaktor ist als Durchlaufreaktor in Form einer Kapillare ausgebildet, um einen schnellen Wärmeübergang zu erreichen. Die Reaktionslösung wird hier auf etwa 95° C erwärmt. Der zurückgeführte Teilstrom kann maximal das Reaktorvolumen VR aufweisen oder auch kleiner sein. Im Conticycler wird dann in der Regel ein Restvolumen belassen, welches durch den rückgeführten Teilstrom zu VR aufgefüllt wird.
Abb. 3 zeigt das Schema eines Conticyclers (19) mit nachgeschalteten Denaturierungs- Durchflußreaktor (16) mit angeschlossenen Wärmetauscher (17) zum Erwärmen auf die Denaturierungstemperatur wie in Abb. 2. Im Gegensatz zu der in Abb. 2 dargestellten Anordnung strömt der Teilstrom zusammen mit dem Zufluß (5) zum Conticycler (19) außerdem noch durch einen weiteren Durchflußreaktor (20) mit Wärmetauscher für die Durchführung der Annealingphase. Im Conticycler wird bei dieser Anordnung nur die Extensionsphase durchgeführt. Abb. 4 stellt schematisch einen Conticycler (1) mit Zufluß (5) und Abfluß (8) dar, der mit Elementen einer Halbleiteranordnung (19) versehen ist. Die Halbleiteranordnung besteht aus einem lumineszierenden Halbleiter, z.B. aus GaAsP, GaP oder SiC, mit einem n- dotierten und einem p-dotierten Gebiet, die voneinander durch eine Grenzbereich getrennt sind (20). Die Halbleiter -mordnung umschließt den Reaktionsraum. Dotierung und Materialauswalil sind so vorgenommen, daß die pn-Übergänge sowohl lumineszieren als auch die Lumineszenzstrahlung empfangen können, p- und n-Gebiete können auch vertauscht angeordnet sein. Es gilt der folgende Zusammenhang: Wird ein Strom durch einen der pn-Übergänge geschickt, wird das Kanalmodul erwärmt und ist damit ein thermischer Aktor. Wird die dabei entstehende Kermlinienverschiebung gemessen, ist diese ein Maß für die vorhandene Temperatur. Dadurch ist eine thermische Sensor- und Aktorfunktion gegeben. Beide dotierten Gebiete können durch Strom so in ihrer Temperatur gesteuert werden, daß ein Temperaturzyklus erzeugt wird, der für die Durchführung einer PCR geeignet ist.
Beispiel 2
Alle Reaktanten werden in einem Puffer gelöst, so dass eine Lösung entsteht, welche 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3) und 1,5 mM MgCl2 enthält. Die Endkonzentrationen von jedem Nukleotid in dem Puffer betragen 200 μM, 0,4 μM von jedem Primer, 1 Unit Taq Polymerase und 100 ng genomisches DNA-Template. Für die Durchführung der Initialreaktion wird in an sich bekannter Weise ein Conticycler mit einem Conticyclervolumen von 25 μL gefüllt und einer Denaturierung bei 95° C für 60 s, einer Annealingtemperatur bei 54° C für 60 s, einer Extensionstemperatur bei 72° C für 90 s ausgesetzt. Der Vorgang wird 10 mal wiederholt. Der Conticycler unterscheidet sich von einem herkömmlichen Thermocycler dadurch, dass der Reaktor mit Zu- und Abführungen, einer Vorrichtung zum Durchmischen mit einem Wirbelbett von Magnetpartikel und einer Vorrichtung zum Aufheizen des Zuflusses auf die Temperatur der jeweilige Thermophase versehen ist. Die Amplifikation im Conticycler dauert etwa =0,583 Stunden (210s/3600s)h • 10 = 0,583 h). Es wird 25 μl einer DNA-haltige Lösung, enthaltend theoretisch die 210 fachen Menge an DNA im Vergleich zur Ausgangsmenge als Ergebnis der Initialisierung erhalten.
Anschießend wird die semikontinuierliche DNA-Amplifikation durch Anstellen der Zulaufes der Reaktantenlösung unter ständigem Rühren mit dem Wirbelbett gestartet. Das Wirbelbett wird aus handelsüblichen superparamagnetischen Partikeln hergestellt, die einen Durchmesser zwischen 1 μm und 5 μm aufweisen. Das magnetische Wechselfeld wird durch einen unterhalb des Conticyclers im Abstand von 1 mm angebrachten sich drehenden Permanentmagneten mit einer Magnetstablänge von 3 mm erzeugt. Die Konzentration an Nukleotiden wird auf 20 μM herabgesetzt, damit die Geschwindigkeit der Reaktion durch Limitation der Nukleotide gesteuert wird. Der Zulauf wird semikontinuierlich in nicht zyklischer Weise durchgefülirt bzw. nicht unterbrochen. Die Zeit zur Durchführung eines Zyklus beträgt ebenfalls 210 s. Die Temperatur der zufließenden Lösung wird in einem vorgeschalteten Wärmetauscher auf die jeweilige Temperaturphase eingestellt. In einer Stunde fließen bei einer Dauer des thermischen Zyklus von 210s bei einer Flußrate von 12,5 μl/210s ( D = 0,5 l/h)insgesamt 12,5 μl • (3600/210)/h = 214,3 μl/h. Die Verdünnungsrate D beträgt somit D = F/VR = (214,3 μl/h)/ 25 μl = 8,57/h. Innerhalb einer Stunde werden somit 8,57 ' 25μl = 214 μl DNA-haltiger Lösung bzw. zum Vergleich mit dem Ergebnis der Initialisierung statt 25 μl pro 0,583 Stunden die Menge von 124,76 μl pro 0,583 Stunden mit einem theoretisch ebenfalls 210 fachen Gehalt an der Ausgangs-DNA erhalten.

Claims

Ansprüche:
1. Verfahren zur Amplifikation von DNA unter Anwendung von Prinzipien der Polymerase-Chain-Reaction (PCR), insbesondere der Einwirkung zyklischer
Temperaturänderungen (Temperaturzyklen), in der Regel in Anschluß an eine in an sich bekannter Weise durchgeführten Initialphase, gekennzeichnet dadurch, dass die PCR oder thermische Phasen der PCR semikontinuierlich in einem oder mehreren speziellen, bevorzugt miniaturisierten Reaktoren (Conticyclern) oder Arrays derselben bei ständigem oder zyklischem Zufluß einer oder mehrerer die Reaktanten und gegebenenfalls die Polymerase enthaltenden Lösungen durchgeführt werden, wobei der Reaktorinhalt (Reaktionslösung) homogen durchmischt und das Reaktionsvolumen VR konstant gehalten wird, indem die Summe der Zuflußraten der Reaktantenlösungen Fzu gleich der Abflußrate der Reaktionslösung FAb ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass bei der semikontinuierlichen DNA-Amplifikation während vergleichbarer aufeinanderfolgender Temperaturphasen der nacheinander durchgeführten Temperaturzyklen die Konzentrationen der Reaktanten und der Reaktionsprodukte c; sich nicht bzw. wenig ändern (dc;/dt = 0 bzw. dcj/dt = Minimum) sowie die
Verdünnungsrate D mit D = FZU/VR, berechnet pro Temperaturzyklus mit der zeitlichen Länge t, gleich oder kleiner als 1/t ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, dass die Summe der Zuflußraten bei zyklisch semikontinuierlicher Zuführung der Realctionslösungen Fzu bzw. die Abflußrate FAÖ in vergleichbaren aufeinanderfolgenden Phasen der Temperaturzyklen, beispielsweise in der Annealingphase und der Extensionsphase oder nur in der Extensionsphase, von gleicher Größe ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, gekennzeichnet dadurch, dass die Steuerung der Zuflußraten der Reaktantenlösungen während der Thermozyklen nach einem vorgegebenen, sich wiederholendem Programm durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, dass die Zuflußrate Fzu bei Temperaturerhöhung reduziert bzw. abgeschaltet, bei Erreichen der Denaturingstemperatur gleich Null ist und bei nachfolgender Temperaturerniedrigung wieder eingeschaltet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, dass zur Steuerung der Verdünnungsrate D eine Funktion D = f(T) verwendet wird, welche die spezifische Bildungsrate μτmA der verwendeten Polymerase in Abhängigkeit von der aktuellen Reaktionstemperatur T in Form einer Maximumfunktion beschreibt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass die zugeführte Reaktantenlösungen die Primer, dNPTs als Vierermix bestehend aus dATP, dCTP, dGTP und dTTP, und Polymerase enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass die zugeführte Reaktantenlösung Primer und Vierermix enthält und die Polymerase in immobilisierter Form im Reaktionsvolumen vorliegt.
9. Verfahren nach Anspruch 1 und 8, gekennzeichnet dadurch, dass die Polymerase gegebenenfalls über einen Linker an Magnetpartikel immobilisiert ist.
10. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass die Temperatur der zufließenden Lösung und/oder der abfließenden Reaktionslösung durch Vorrichtung gesteuert wird, die außerhalb des Reaktionsraumes des Conticyclers angeordnet sind.
11. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass der Reaktionsverlauf über fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide und Zuführung von Licht mit einer spezifischen Wellenlänge im Bereich des Fluoreszenz Resonance Energy Transfer (FRET) nach dem Lightcycler-Prinzip in der Reaktionsflüssigkeit und/oder dem Auslauf verfolgt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass die abfließende Reaktionslösung in nachgeschalteten Conticyclern oder herkömmlichen Reaktoren bzw. Durchflußreaktoren behandelt bzw. einem Ausreifungsprozess unterworfen wird.
13. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass ein Teilstroms des Abflusses aus einem Conticyclers in diesen zurückgeführt wird.
14. Reaktor (Conticycler) zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass er einen oder mehrere in ihren Zulaufraten steuerbaren Zuläufe für die Reaktantenlösungen und mindestens ein Ablauf enthält, eine effektive homogene Durchmischung bewirkt wird und dass. durch eine integrierte
Halbleiteranordnung oder durch Elemente einer Halbleiteranordnung als Aktor/Sensor-System elektromagnetische Strahlung zur Anregung von Fluoreszenz und/oder zur Messung der Extinktion emittiert und die elektromagnetische Strahlung delektiert wird.
15. Conticycler nach Anspruch 14, gekennzeichnet durch das Vorhandensein eines Wirbelbettes von Magnetpartikeln, eines Rührers, eines Schwingungssystems oder eines Strömungserzeugers.
16. Conticycler nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, dass der Abfluß oberhalb der Zuflüsse an der höchsten Stelle des Conticyclers angebracht ist.
17. Conticycler nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, dass der Reaktorinhalt unter Überdruck steht.
18. Conticycler nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, dass zur Steuerung der Reaktionstemperatur eine Halbleiteranordnung als Aktor/Sensor-System genutzt wird.
19. Conticycler nach Anspruch 15, gekennzeichnet dadurch, dass das Wirbelbett durch ein bewegtes, beispielsweise drehendes, inhomogenes Magnetfeld oder durch ein seine Polarität wechselndes Magnetfeld angetrieben wird.
20. Conticycler nach Anspruch 15, gekennzeichnet dadurch, dass die Magnetpartikel durch hochfrequente magnetische Wechselfelder erwärmt werden.
21. Conticycler nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, dass die Zuführung von Wärmeenergie über eingestrahlte Mikrowellen erfolgt.
22. Conticycler nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, dass die Zuführung von Wärmeenergie mit einer Thermistoranordnung erfolgt.
23. Conticycler nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, dass eine gesteuerte Zu- oder Abführung der Wärmeenergie unter Verwendung eines Peltier-Element erfolgt.
24. Conticycler nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, dass Temperaturen, Zu- und Abflußraten sowie Fluoreszenz und/oder Extinktion der Reaktionslösung im Conticycler und dessen Zuflüssen über separat angeordnete Sensoren gemessen und gesteuert werden.
25. Conticycler nach Anspruch 24, gekennzeichnet dadurch, dass die Fluoreszenz und/oder Extinktion mit einer Halbleiteranordnung als Aktor/Sensor-System in den Zu- und/oder den Abflüssen gemessen wird.
26. Conticycler nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, dass im Zulauf, im Abfluß und/oder in einem separat am Conticycler angebrachten kapillarförmigen Durchflußreaktor steuerbare Wärmequellen und/oder steuerbare Anordnungen zur Abführung von Wärmeenergie vorhanden sind.
27. Conticycler nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, dass der Abfluß des Conticyclers mit dem Zufluß eines weiteren Conticyclers oder eines herkömmlichen Thermocyclers oder eines Durchflußreaktors verbunden ist.
28. Conticycler nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, dass zur Durchführung eines Rückführungsverfahrens der Conticycler entweder einen zweiten Abfluß besitzt oder der Abfluß über eine Verzweigung geteilt wird.
29. Conticycler nach Anspruch 26 und 28, gekennzeichnet dadurch, dass der Abfluß oder ein Teilstrom des Abflusses aus dem Conticycler in einem nachgeschalteten Durchflußreaktor eine Denaturierungphase und - gegebenenfalls nach Vereinigung eines Teilstromes mit der zufließenden Reaktantenlösung des Conticyclers - eine
Annealingphase durchläuft.
30. Conticycler nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, dass der Füllstand bzw. VR des Conticyclers durch Steuerung des Zu- und Abflusses konstant gehalten wird.
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