WO2004032615A1 - ブラディオン遺伝子発現抑制キメラマウス - Google Patents

ブラディオン遺伝子発現抑制キメラマウス Download PDF

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WO2004032615A1
WO2004032615A1 PCT/JP2002/010599 JP0210599W WO2004032615A1 WO 2004032615 A1 WO2004032615 A1 WO 2004032615A1 JP 0210599 W JP0210599 W JP 0210599W WO 2004032615 A1 WO2004032615 A1 WO 2004032615A1
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mouse
gene
bradion
embryonic stem
chimeric
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Manami Tanaka
Tomoo Tanaka
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National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Nippn, Co. Ltd.
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    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases

Definitions

  • the present invention relates to a chimeric mouse having an endogenous bradion gene whose expression has been suppressed by genetic modification.
  • the molecular medicine revolution in the 21st century aims to build a control monitor system tailored to individual characteristics by capturing the gene-substance base of diseases as a post-genome project. Specifically, based on the concept of “Quality of Life”, detection of risk groups (diagnosis and gene monitoring) for diseases that threaten social life, such as genetic diseases, cancer, and neurodegenerative diseases, Furthermore, it aims to establish a medical response system tailored to the individual's genotype, such as finding risk genes and searching for susceptibility to treatment (eg, drug, gene therapy).
  • a medical response system tailored to the individual's genotype such as finding risk genes and searching for susceptibility to treatment (eg, drug, gene therapy).
  • cancer cancer but also many diseases are due to multi-geiie effect, and environmental factors greatly influence it, so it cannot be asserted that no control will result in illness.
  • it is possible to control disease control through the development of so-called control technologies that control what has become ill.
  • bradeion protein is specifically expressed in adult brain nervous system cells, colorectal cancer, prostate cancer cells, and skin cancers. It has been clarified that it satisfies not only the target of early diagnosis of cell mutations, etc., but also the requirements for specific inhibitors and the target of gene therapy (see patents above; Tanaka, M. et al., B iochem. Biophys. Res. Comiun. (2001) 286, 547-553). Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a novel knockout chimeric mouse that is useful as an individual animal model animal and an animal for genetic breeding.
  • the present inventors first conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, produced mouse embryonic stem cells having at least one endogenous bradion gene whose expression was suppressed by genetic engineering techniques. Successful.
  • a chimeric mouse was prepared by introducing the embryonic stem cells, it was found that the chimeric mouse exhibited dysgenesis of the entire cerebral nervous system and morphological abnormalities such as poor growth of the whole body, poor skull formation, and impaired vision.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • a chimeric mouse that has generated a mouse embryo into which a mouse embryonic stem cell having a genomic DNA containing an endogenous bradion gene whose expression is suppressed is introduced.
  • Such an endogenous braion gene whose expression is suppressed is genetically modified to encode a Bradion protein with reduced biological activity or a Bradion protein that has lost biological activity.
  • the endogenous bradion gene whose expression is suppressed may have been genetically modified to delete the entire coding region.
  • mice embryo is selected from the group consisting of an 8-cell embryo, a morula, and a blastocyst.
  • morphological abnormalities include skull malformation, visual impairment, and poor growth of the whole body.
  • the Bradion gene has been reported to be involved in long-term survival of brain nerve cells. Furthermore, for example, the expression of this gene is specifically recognized in the adult brain and the like in humans, but not in the human fetus. Therefore, the function of the bradion gene in the process of development was unknown. In this regard, for the first time in the present invention, it has been found that chimeric mice in which the expression of the endogenous bradion gene has been suppressed show the above-mentioned impaired growth and morphological abnormalities of the cerebral nervous system.
  • the chimeric mouse of the present invention has elucidated the molecular mechanism that causes the above-described dysgenesis and morphological abnormalities of the cerebral nervous system, and further relates to such dysgenetic and morphological abnormalities of the cerebral nervous system. It has been found that the present invention can be provided as a suitable individual animal model for developing a method for treating or controlling disorders and diseases.
  • the present invention provides that a chimeric mouse prepared by introducing a mouse embryonic stem cell having at least one endogenous bradion gene whose expression has been suppressed from the time of development is useful as a biological individual model animal and a genetic breeding animal.
  • the headline is completed.
  • the present invention relates to a genomic gene in which at least one endogenous bradion gene is
  • the present invention relates to a chimera mouse that suppresses the expression of the bradion gene, which is produced by producing mouse embryonic stem cells having mouse DNA and introducing the embryonic stem cells into mouse early embryos to generate them.
  • the chimeric mouse of the present invention is characterized in that, by suppressing the expression of the bradion gene from the time of development, the growth of the cerebral nervous system and various morphological abnormalities are caused.
  • Bradion is a protein involved in long-term survival of brain nerve cells, which is known to be specifically present in the human adult brain and the like. This protein has a structure similar to that of substances involved in cell division and proliferation control (Septin family), and at the same time, a structure of a determinant of cell life span (causing programmed cell death). The function has already been elucidated through preliminary experiments, etc.Bradion is a cell division regulator called the septin family that shows specific expression in cancer cells, and MAP kinase signaling is transmitted at the final stage of cell division. It has also been shown to play a role as a motor pump for force scales and cell proliferation devices.
  • the bradion protein has two types of transcription / translation products encoded by the same bradion gene, ie, a model and an iS type. Tissue-specific expression of bradion protein in humans has also been observed in colorectal and skin cancer tissues (Tanaka et al., Biochemical and Biophysical Research Communicat ions 286, 547-553 (2001)). ). Furthermore, it has been reported that a mouse homolog of the Bradion protein type exists in the mouse (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-139470).
  • the present invention is useful as a model animal for brain nerve cell-related disorders / disease and cell carcinogenesis if a chimeric mouse having an endogenous bradion gene whose expression is suppressed can be produced based on such findings. It was completed based on the idea of
  • the endogenous Bradion gene whose expression is to be suppressed is one or both alleles of the Bradion gene endogenous in mouse genomic DNA.
  • expression suppression or “expression suppressed” refers to a gene that has been genetically modified so that the biological activity of the protein encoded by the gene is lower than that in the natural form. means.
  • the expression “repressed in expression” or the gene in which “expression is suppressed” also means a gene genetically modified so that the protein encoded by the gene loses biological activity.
  • expression suppression or “expression suppression” means a gene that has been genetically modified so that the protein encoded by the gene is not produced.
  • the genome ⁇ A in which the expression of the endogenous bradion gene is suppressed may be a genomic DNA lacking the entire gene or a genome lacking a part of the gene. It may be DNA. Alternatively, genomic DNA in which an exogenous DNA fragment is inserted inside the gene may be used. According to the present invention, mouse embryonic stem cells having genomic DNA in which the expression of the bradion gene is suppressed according to the following steps Can be produced.
  • the known gene targeting method is a method in which a specific mutation is introduced into a desired gene by introducing a targeting vector to cause homologous recombination.
  • the details of such a gene targeting method have already been described in various literatures, and the following steps 2 to 5 can be performed according to those literatures (Shin Aizawa: Gene targeting-ES cell Of Mutant Mice Using Biomanual Series 8, Yodosha (1995); Ho an, B., Bedington, R., Constant ini, F., Lacy, E .: Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); see Joyner, AII: Gene Targeting, A Pract, ical Approach Series, IRL Press (1993)).
  • a targeting vector used to suppress the expression of the bradion gene in the genomic DNA of mouse embryonic stem cells can be constructed, for example, as follows.
  • the mouse bradion gene is located 5 'to the region to be mutated.
  • the region to be placed and the region located on the 3 'side are selected as homologous regions, and a DM fragment corresponding to the region is prepared.
  • a plasmid clone containing the mouse bradion gene is obtained by screening using mouse bradion cDNA from a mouse genomic library.
  • a restriction enzyme map of the plasmid clone is prepared, and subcloning is performed to determine the structure of the gene.
  • the mouse genomic library and the ES cells to be used are preferably derived from the same strain, but may be derived from different strains.
  • exons located on both sides of the target region in the bradion gene are preferably selected as homologous regions.
  • DNA fragments corresponding to these regions can be prepared from the plasmid clone containing the mouse bradion gene as DNA fragments obtained by excising respective regions of interest with restriction enzymes. Alternatively, these DNA fragments may be amplified fragments obtained by amplifying a target region by a PCR method, or may be those synthesized by chemical synthesis.
  • these DNA fragments are ligated to a selection marker gene.
  • a selection marker gene usually, the 5′-side DNA fragment, the marker gene for positive selection, the 3′-side DNA fragment, and the marker gene for negative selection are ligated in this order.
  • the marker gene for negative selection may not be used in some cases, and a DNA fragment other than the above or another compound may be added in some cases.
  • Positive selection marker genes to be incorporated at the site where the mutation is introduced include, but are not limited to, the neomycin resistance gene (Neo f gene), the puromycin resistance gene, or the hygromycin B resistance gene , Which is suitably used as a marker for positive selection Any one may be used.
  • the neomycin resistance gene is commercially available as a plasmid clone (Stratagene, New Engl and BioLabs, etc.).
  • a marker gene for positive selection such as a neomycin resistance gene
  • Cre is used after the positive selection. It can also be removed from genomic DNA.
  • a homologous recombinant is screened by Southern hybridization using a probe outside the homologous region, it is preferable to incorporate a restriction enzyme cleavage site for detecting the recombinant gene.
  • Ligation of these DNA fragments can be performed according to a usual method known to those skilled in the art. Also, the ligation of these DNA fragments is conveniently performed, for example, on a plasmid vector (for example, pBluescript II SK + of Stragene) or a phage vector.
  • the targeting vector designed and constructed as described above can be amplified and used by ordinary molecular biology techniques, for example, by cloning by transformation and culture of E. coli (for example, J See Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
  • a suitable combination of an embryonic stem cell line and a mouse line of an embryo into which the embryonic stem cell line is introduced. Since the chimera formation rate (chimera rate) changes depending on this combination, a combination that can achieve a suitable chimera rate should be selected.
  • the prepared chimeric mouse is intended to be used to prepare heterozygotes or homozygotes by subsequently breeding with a wild-type mouse or the like, the introduced embryonic stem cells must be germ-line derived from the chimeric mouse.
  • the combination of the embryonic stem cells used in the present invention with the mouse line of the early embryo is used to transfer the embryonic stem cells before homologous recombination to the early embryo.
  • the embryonic stem cells be confirmed to contribute to the germ line.
  • a combination of embryonic stem cells and mouse strains of the early embryo that can use appropriate genetic markers can be used.
  • body hair color is preferable. Using the body hair color, the chimera rate can be easily determined from the appearance of the mouse.
  • Examples of a suitable combination of an embryonic stem cell line and a mouse line of an early embryo into which the embryonic stem cell line is introduced, which can be used for producing the chimeric mouse of the present invention include, for example, a 129-line embryonic stem cell line (for example, ⁇ -5 strain). And C57BL / 6J mouse early embryo, D3 embryonic stem cell line and C57BL / 6 mouse early embryo. Examples of embryonic stem cells and mouse strains of early embryos that can be suitably used in the production of chimeric mice are described in, for example, “Gene Targe tingj (AL Joyner, translated by Tetsuo Noda, Medical Science International, Inc .; in particular, Tables 1 and 103 on page 101).
  • Preparation of Mouse Embryonic Stem Cell Having Endogenous Bradion Gene Suppressed in Expression The method of introducing the evening targeting vector prepared in “2. Preparation of targeting vector” into mouse embryonic stem cells includes calcium phosphate transfection. Any method known to those skilled in the art can be used, such as the fuction method, the DEAE dextran method, the lipofection method, the microinjection method, the electoral poration method, and the method using a virus vector.
  • Elect opening method is widely used as a method for introducing a targeting vector, and the method can be performed as follows. First, as mouse embryonic stem cells, cell suspensions cultured on breeding cells (one feeder cell) and then detached from the culture dish by trypsin treatment are used. It is preferable that the cell suspension is adjusted to a predetermined concentration. Targety prepared as above The linearization vector is linearized using a unique restriction enzyme cleavage site designed to integrate outside the homologous region. This is mixed with the above-mentioned cell suspension, and a pulse is applied by means of an elect opening pole. After the pulse application, the embryonic stem cells
  • a positive selection additive agent is added to the culture solution to perform positive selection. If the gene for positive selection used in the construction of the targeting vector is a neomycin resistance gene, G418 can be used as an additive for positive selection.
  • genomic DNA extracted from these colonies is screened by Southern hybridization or PCR for an embryonic stem cell line having genomic DNA in which desired homologous recombination has occurred.
  • Southern hybridization using a probe set outside the homologous region used for the construction of the targeting vector can be used.
  • PCR using a primer set outside the homologous region used for constructing the targeting vector and a primer set in the neo gene can also be used.
  • a mouse embryonic stem cell into which a desired gene mutation has been introduced by homologous recombination is introduced into an early mouse embryo to produce a chimeric mouse.
  • Such chimeric mice can be produced by using a blastocyst as a mouse early embryo and injecting embryonic stem cells into the blastocyst (blastocyst injection method); Using embryos to attach the embryonic stem cell mass to the embryo (adadaligation method; Andra, N et al .: Pro
  • the early mouse embryo into which the embryonic stem cells have been introduced is transferred into the uterus or fallopian tube of a pseudopregnant mouse, and is then developed into a chimeric mouse individual for production. This step is known to those skilled in the art and can be performed according to various literature and experimental protocols (
  • chimeras of those derived from the original lineage and those derived from the introduced embryonic stem cells are chimeras of those derived from the original lineage and those derived from the introduced embryonic stem cells.
  • a genetic marker for this chimerism for example, a coat color that can be easily observed can be used.
  • a chimeric mouse is prepared by introducing embryonic stem cells derived from a mouse strain having a hair color different from that of the original strain from which the early embryo is derived, the hair having the coat color of the embryonic stem cell-derived strain can be obtained. From the ratio, the contribution ratio of the embryonic stem cells to the tissue (chimera ratio) can be calculated.
  • the chimera rate may be calculated, for example, by calculating the ratio of the area of the body hair color of the mouse strain derived from the embryonic stem cells based on the area of each body hair measured from the appearance.
  • the chimeric mouse of the present invention exhibits poor growth of the entire cerebral nervous system as an intrinsic property. Furthermore, the chimeric mouse of the present invention shows remarkable morphological abnormalities such as poor growth of the whole body, poor skull formation and / or visual impairment in appearance.
  • poor growth of the whole body means a state in which body weight and body length are significantly inferior to normal mice of the same age.
  • skull malformation refers to a skull that has a round face (hamster-like) compared to the skull of a normal mouse and the eyeball is smaller than the size of the face compared to a normal mouse. It means big.
  • visual impairment is caused by poor growth of the optic nerve, and means that the viewpoint is not correct in appearance.
  • the chimera mouse of the present invention shows impaired growth associated with congenital impaired growth of the cerebral nervous system because of poor growth of the entire cerebral nervous system and remarkable morphological abnormalities in appearance.
  • the present invention can be used as a suitable animal model animal for diseases and diseases, and disorders and diseases associated with visual impairment due to poor growth of the whole body, poor skull formation, and poor development of the optic nervous system.
  • the chimeric mouse of the present invention is characterized by disorders and diseases associated with acquired brain nervous system regression, and disorders and diseases associated with cell carcinogenesis, which are known to involve Bradion protein. , And disorders and diseases associated with cell death can be used as suitable animal models.
  • the chimeric mouse of the present invention as an animal model animal for these diseases and disorders is useful not only for elucidating the detailed function of the bradion gene, but also for elucidating the mechanism of formation and maintenance of the cerebral nervous system and the function of controlling cell life. It is also useful for the development of a method for treating or controlling the above disorders and diseases.
  • a major feature of the chimeric mouse of the present invention is that the chimeric mouse of the present invention exhibits visual impairment due to poor optic nerve growth.
  • the optic nerve which begins to develop and differentiate ahead of the central nervous system, causes the first occurrence of abnormalities. This provides a clue to the molecular basis of optic nerve development abnormalities that have not been elucidated so far, and furthermore, the morphogenesis of the central nervous system prior to differentiation during development, and related disorders and disorders. It also shows the possibility that the chimeric mouse of the present invention can be used as an individual animal model for diseases.
  • the chimeric mouse of the present invention since the chimeric mouse of the present invention has germ cells in which the expression of the endogenous bradion gene is suppressed, it can be used for the production of heterozygotes and homozygotes by mating. In addition, it is also possible to analyze the interaction between genes by crossing with a mouse having another gene mutation. At that time, the feature that the chimeric mouse of the present invention shows a remarkable morphological abnormality can be advantageously used as a marker for easily observing changes in gene function and interaction. Therefore, the chimeric mouse of the present invention is useful as an animal for genetic breeding.
  • organs, tissues, and cell populations containing cells in which the expression of the endogenous bradion gene is suppressed which are collected from the chimeric mouse of the present invention, are also included in the present invention.
  • These biomaterials may exhibit morphological abnormalities such as dysgenesis. This These biomaterials can also be used in the analysis of gene function as described above, and in the development of treatment and control methods for disorders and diseases.
  • FIG. 1 shows the restriction map of the subclone used in the construction of the targeting vector and the mouse bradion gene fragment contained in the subclone, the bradion gene contained in the mouse genomic DNA, and the homology of the gene.
  • FIG. 3 is a diagram showing corresponding recombinant genes obtained by recombination.
  • FIG. 2 is a structural diagram of the targeting vector.
  • FIG. 3 is a photograph showing a morphological abnormality in appearance of a chimeric mouse obtained by using the embryonic stem cell line 281 in the present invention.
  • the mice in FIGS. 3A to 3D are the chimeric mice prepared in Example 3, FIG. 3A is a chimeric individual having an identification number of 58 lm, FIG. 3B is a chimeric individual having an identification number of 582 m, and FIG. C shows the chimera with the identification number 584 f, and FIG. 3D shows the chimera with the identification number 580 m.
  • FIG. 4 is a photograph showing a morphological abnormality in appearance of a chimeric mouse obtained by using the embryonic stem cell line 344 in the present invention.
  • the mice in FIGS. 4A to 4D are the chimeric mice prepared in Example 3, FIG. 4A is a chimeric individual having an identification number of 589 m, FIG. 4B is a chimeric individual having an identification number of 587 m, and FIG. 4C shows a chimeric individual having identification number 5885f, and FIG. 4D shows a chimeric individual having identification number 5888m.
  • BAC Bacte Genomics
  • BAC94R-C clone The BAC clone was digested with the restriction enzymes BamHI or Hindlll and subcloned into Bec Yuichi pZErO-1 (Invitrogen). That subcloth One-From the library, plasmid clones containing the three subclones, A1 (17.7 kb), E2 (5.1 kb), and F ⁇ ⁇ (14.1 kb) were obtained (Fig.
  • 919R (SEQ ID NO: 4) were prepared by PCR and used.
  • the sequence corresponding to the 3 ′ region (749F / 919R) corresponds to the 3 ′ untranslated region (3 ′ URF) of the human bradeion mDNA sequence (SEQ ID NO: 5) in the mouse bradion gene. Included in the area.
  • subclone A1 was found to contain a sequence corresponding to the 5 'untranslated region (97UTRF / 94R), a sequence corresponding to the in-frame region (223F / 356R), and a sequence corresponding to the 3' side region (749F / 919R).
  • the subclone E2 was detected by a probe having a sequence corresponding to the 3 'region (749F / 919R). Subclone F11 was not detected using any of the above three probes. In other words, it was found that the mouse bradion gene was contained in subclone A1, the second half of the gene was contained in E2, but the gene was not contained in subclone F11.
  • the outer sequences of the mouse bradion gene used for homologous recombination include the cutout fragment (4.1 kb) of the subclone F11 with the restriction enzyme Xbal and the cutout fragment of the subclonal A1 with the restriction enzymes EcoRI and Xhol. (3.3 kb), and these DNA fragments were cut out with restriction enzymes and prepared by a conventional method. Further, a neomycin resistance gene used as a positive selection marker was similarly prepared as a fragment excised from plasmid clone pGT_N38 (manufactured by New Engl and BioLabs) using restriction enzymes Kpnl and EcoRI.
  • the vector 381 oxP Then, the vector 381 oxP Then, the Xbal fragment of Fll, 1 ⁇ , the neomycin resistance gene, 1 ⁇ , and the EcoRIZXhoI fragment of A1 were ligated in this order to construct a targeting vector.
  • embryonic stem cells After passage embryonic stem cells (ES cells) ⁇ - 5 strain, 37 ° C, in 5% C0 2 and cultured for 36 hours in culture.
  • the embryonic stem cells were detached from the culture dish by treating with 3 ml of trypsin (15050-065, manufactured by Invitrogen) per 100 mMi culture dish, and were pitted and floated as single cells.
  • trypsin 15050-065, manufactured by Invitrogen
  • breeding cells feeder single cell
  • C0 2 incubator 37 ° C, 5 C0 2
  • the supernatant was collected, the contents of 2 to 5 culture dishes were collected into one 50 ml tube, and centrifuged at 270 g for 5 minutes.
  • the supernatant was removed by suction, and the pellet was resuspended and suspended in 1 ml of ice-cold phosphate buffer per culture dish before the cells were detached.
  • the number of cells in the solution was counted and the concentration was adjusted to 7 ⁇ 10 6 cells Zml.
  • the mixture was mixed with an electoral port. It was transferred to a cuvette for Yeon (BioRad, Cat. No. 165-2088). To this, a 240 V, 500 zF pulse was applied with an electroporator Yuichi (BioRad, genepul ser). The cuvette was then removed from the cuvette holder and left on ice for 20 minutes. Thereafter, the cell suspension in the cuvette was transferred to 10 to 20 ml of the above culture containing mouse leukemia inhibitory factor (LIF).
  • LIF mouse leukemia inhibitory factor
  • the cell suspension suspended in the LIF-containing culture solution was seeded on a gelatin-coated culture dish at 10 ml per plate.
  • the culture medium was changed (using a culture medium containing LIF), and two days later, the culture medium containing LIF was added with a selective drug of 150 to 250 g / ml G418 and cultured.
  • the colony observation was continued while changing the culture medium every day, and several drug-resistant colonies that appeared around 8 days after the selection were collected and cloned for each. And stocked.
  • the drug-resistant colonies (appearing about 8 days after selection with G418) obtained as described above were screened by Southern hybridization analysis to identify homologous recombinants in which the entire bradion gene had been deleted.
  • Genomic DNA was extracted according to the following procedure. Samples were prepared by digesting the genomic DNA with the restriction enzymes BamHI or HindIII. Both samples were subjected to agarose gel electrophoresis and then plotted on a nylon membrane.
  • Southern hybridization was performed three times for each probe in the following procedure. First, prehybridization was carried out at 65 for 30 minutes using a prehybridization solution, and then 65% using a hybridization solution and one of the following probes. It was hybrida I See Chillon overnight in D C. After that, the plate was washed with 0.1 X SSC-0.1 X SDS solution at 65 ° C for 15 minutes, and then washed again. The membrane was analyzed for signal using an image analyzer (BAS2000). went.
  • BAS2000 image analyzer
  • the 5 'probe is a 0.9 kb MA fragment prepared as a Kpnl and HindII cut-out fragment of the subclone F11 of Example 1, and is shown in FIG. 1 for a gene in which homologous recombination has occurred or a wild-type gene. Recognizes the sequence upstream of the Bradion gene.
  • the 3 'probe was prepared as a 0.6 kb! BamHI and Xhol cut fragment of subclone A1 of Example 1.
  • the Neo probe is a 1.8 kb DNA fragment prepared as a BamHI and EcoRI excised fragment of Final vector (Incyte Genomics) and has homology to the evening targeting vector as shown in Figure 1. Recognizes the neomycin resistance gene (Neo) integrated into the genome by recombination. These probes were used to labeling by Red iprime II ⁇ Labe ll ing Sys t em (Amersham Phramac ia B iotech Inc.) using alpha- CTP 32.
  • embryonic stem cell lines 281 and 344 were identified as embryonic stem cell lines having genomic DNA in which the expression of the endogenous bradion gene was suppressed. Therefore, embryonic stem cell lines 281 and 344 were selected for injection of embryonic stem cells into blastocysts.
  • Each of the embryonic stem cell lines 281 and 344 was injected into the blastocysts of C57BL / 6 mice by Mike-Injection method. Thereafter, the blastocysts were transplanted into the fallopian tubes of pseudopregnant female mice according to a conventional method and developed into individuals.
  • FIGS. 3 and 4 are photographs showing the appearance of the chimeric mouse obtained above.
  • FIG. 3 shows a chimeric mouse obtained using the embryonic stem cell line 281.
  • FIG. 4 shows a chimeric mouse obtained using the embryonic stem cell line 344.
  • All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
  • a chimeric mouse in which the expression of an endogenous bradion gene has been suppressed from the time of development, which shows growth dysfunction of the cerebral nervous system and various morphological abnormalities.
  • the chimeric mouse can be usefully used as an individual animal model animal and an animal for genetic breeding relating to abnormalities of the cerebral nervous system.

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Description

明 細 書 ブラディォン遺伝子発現抑制キメラマウス 技術分野
本発明は、 遺伝子改変により発現抑制させた内在性ブラディオン遺伝子を有す るキメラマウスに関する。 背景技術
21 世紀における分子医療革命は、 ポストゲノム計画として、 疾病の遺伝子 - 物質基盤を捉えて、 個人特性に合わせた制御モニターシステムを構築していくこ とを目指している。 具体的には、 "Qual i ty of L i f e" の概念に基づいて、 遺伝 子病 ·癌 ·神経退行性疾患などの社会生活を脅かす疾患群のリスクグループの検 出 （診断及び遺伝子モニタリング） 、 さらにはリスク遺伝子の発見、 並びに治療 (例えば薬剤、 遺伝子治療） に対する感受性検索など、 個人の遺伝タイプに合つ た医療対応体制を確立するというものである。 ここで、 癌のみならず多くの疾病 は、 mul t i— geiie e f f ec t によるものであり、 かつ、 環境要因が大きく左右する ことから、 何をコントロールしたら疾病にならないということは断言できない。 しかしながら、 疾病になってしまったものをコントロールする、 いわゆる制御技 術開発を通じて疾病制御対策をこうじることは可能なのである。
この概念に基づき、 現在特に細胞の癌化 ·不死化制御技術開発が、 脳神経系の 分裂抑制物質解析等を通じて研究されることも多い。 このような研究を通じて、 様々な細胞増殖 ·分裂 ·癌化に関わる分子基盤が明らかにされてきた。 そのよう な研究の結果として、 既に、 産業技術総合研究所 （旧工業技術院） から、 脳神経 細胞の発生 ·分化後の長期生存に関わる細胞寿命制御因子であるヒトブラディォ ンタンパク質に関する発明の特許出願がなされている （特開 2000- 139470号公報、 特開 2001 - 161384号公報、 米国特許第 09/440, 936号） 。 これらの研究から、 ブ ラデイオンタンパク質は、 成人脳神経系細胞、 あるいは大腸癌 ·前立腺癌細胞、 皮膚癌で特異的に発現することが判明しており、 したがつてこのブラディオンは、 細胞変異等の早期診断のターゲットとしてはもちろんのこと、 特異的阻害剤及び 遺伝子治療の夕ーゲットとして必要な諸条件を満たすことが明らかになった （上 記特許群； Tanaka, M. ら， B iochem. B i ophys. Res. Comiun. (2001) 286, 547- 553を参照のこと） 。 発明の開示
ターゲットとなりうる情報伝達物質を発見しても、 それを利用して本来の目的 である疾病制御もしくは遺伝子機能制御技術の開発へと発展させるためには、 培 養細胞レベルの解析だけでは不十分であり、 さらに生物個体モデルでの解析を行 う必要がある。 そのためには、 適切な生物個体モデル動物を確立することが必要 になってくる。 この目的に対しては、 現在のところ、 特定の遺伝子に対する各種 ノックアウトマウスを含む遺伝子改変動物が作製され、 用いられている。
しかしながら、 特定の遺伝子を発生時から発現抑制させる場合、 発生過程にお いてその影響が形態形成及び生体機能にどのように及ぶかという点については、 実質的に予測することは困難であるのが現状である。
本発明は、 生物個体モデル動物及び遺伝育種用動物として有用な、 新規ノック ァゥトキメラマウスを提供することを目的とする。
そこで、 本発明者らはまず、 上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、 遺伝子工学的手法により発現抑制させた内在性ブラディオン遺伝子を少なくとも 1つ有するマウス胚性幹細胞を作製することに成功した。 この胚性幹細胞を導入 することによりキメラマウスを作製したところ、 該キメラマウスは脳神経系全般 の発育不全、 並びに全身の発育不良、 頭蓋骨形成不良、 及び視力障害などの形態 異常を示すことが判明し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 以下の通りである。
(1) 発現が抑制されている内在性ブラディオン遺伝子を含むゲノム D N Aを有 するマウス胚性幹細胞が導入されたマウス胚を発生させたキメラマウス。
そのような発現が抑制されている内在性ブラ^ ^イオン遺伝子は、 生物学的活性 が低下しているブラディオンタンパク質、 又は生物学的活性を喪失したブラディ オンタンパク質をコードするように遺伝子改変されているものであり得る。 さら に、 発現が抑制されている内在性ブラディオン遺伝子は、 そのコード領域全体を 欠失するように遺伝子改変されているものであり得る。
(2) マウス胚性幹細胞が ΡΠ-5株由来であり、 マウス胚が C57BL/6系マウス由来 である、 上記（1)のキメラマウス。
(3) マウス胚が 8細胞期胚、 桑実胚及び胚盤胞からなる群より選択されるもの である、 上記（1)又は（2)のキメラマウス。
(4) 形態異常を示す、 上記（1)〜 ）のキメラマウス。
この形態異常としては、 頭蓋骨形成不良、 視力障害、 及び全身の発育不良が挙 げられる。
(5) キメラ率が 9 0 %以上 9 8 %未満である、 上記（1)〜（4)のキメラマウス。
(6) 上記（1)〜 ）のキメラマウスから採取される、 マウス胚性幹細胞由来の細 胞。 以下、 本発明を詳細に説明する。
ブラディオン遺伝子は脳神経細胞の長期生存に関わる遺伝子であることが報告 されている。 さらに、 例えば該遺伝子はヒトでは成人脳等に特異的に発現が認め られ、 ヒト胎児では発現が認められないことから、 ブラディオン遺伝子の発生過 程における機能は未知であった。 この点に関して、 本発明で初めて、 内在性ブラ ディオン遺伝子を発現抑制させたキメラマウスが上記のような脳神経系の発育不 全及び形態異常を示すことが明らかになったものである。 この知見に基づき、 本 発明のキメラマウスは、 上記のような脳神経系の発育不全及び形態異常が生ずる 分子的機構を解明し、 さらにはそのような脳神経系の発育不全及び形態異常と関 連する障害及び疾患の治療又は制御方法を開発する上で、 好適な生物個体モデル 動物として提供され得ることが判明した。
したがって本発明は、 発生時から発現抑制させた内在性ブラディオン遺伝子を 少なくとも 1つ有するマウス胚性幹細胞を導入し作製したキメラマウスが、 生物 個体モデル動物及び遺伝育種用動物として有用であることを見出し、 完成された ものである。
本発明は、 少なくとも 1つの内在性ブラディオン遺伝子を発現抑制させたゲノ ム DNAを有するマウス胚性幹細胞を作製し、 その胚性幹細胞をマウス初期胚に導 入して発生させることにより作製した、.ブラディオン遺伝子発現抑制キメラマウ スに関するものである。 本発明のキメラマウスは、 発生時よりブラディオン遺伝 子を発現抑制させることにより、 脳神経系の発育不全及び各種形態異常を生じて いることを特徴とする。
1 . ブラディオン遺伝子
ブラディオンは、 ヒト成人の脳などに特異的に存在することが知られている脳 神経細胞の長期生存に関わるタンパク質である。 このタンパク質は、 細胞分裂及 ぴ増殖制御に関わる物質 （セプチンファミリー） と類似した構造を有するもので あり、 また同時に細胞寿命の決定因子 （プログラム細胞死を引き起こす） の構造 を有するものでもある。 既に予備実験などにより、 その機能解明が進んでおり、 ブラディオンは、 癌細胞に特異的発現を示すセプチンファミリーとよばれる細胞 分裂制御因子であること、 細胞分裂の最終の時点で MAPキナーゼシグナル伝達力 スケード、 細胞増殖装置のモーターポンプとしての役割を果たすことも示されて いる。 ヒトにおいて、 ブラディオンタンパク質は、 同じブラディオン遺伝子によ つてコードされる 2種類の転写翻訳産物、 すなわちひ型と iS型とが存在すること が知られている。 またブラディオンタンパク質のヒ卜における組織特異的発現は 、 大腸癌組織及び皮膚癌組織においても認められている （Tanaka ら、 B iochemi c al and B iophys ical Research Communicat ions 286, 547-553 (2001) ) 。 さらに 、 マウスにおいては、 ブラディオンタンパク質 型の相同体が存在することが報 告されている.（特開 2000- 139470号公報） 。
本発明は、 このような知見から、 発現抑制させた内在性ブラディオン遺伝子を 有するキメラマウスを作製することができれば、 脳神経細胞に関連する障害 ·疾 患、 及び細胞の癌化に関するモデル動物として有用であろうという着想に基づい て完成されたものである。
発現を抑制させる対象となる内在性ブラディオン遺伝子は、 マウスゲノム DNA 中に内在するブラディオン遺伝子の対立遺伝子の片方または両方である。 本明細 書において、 「発現抑制」 又は 「発現を抑制」 させた遺伝子とは、 該遺伝子にコ 一ドされるタンパク質の生物学的活性が天然形態よりも低下するように遺伝的に 改変された遺伝子を意味する。 さらに、 「発現抑制」 又は 「発現を抑制」 させた 遺伝子とは、 該遺伝子にコードされるタンパク質が生物学的活性を喪失するよう に遺伝的に改変された遺伝子をも意味する。 さらにまた、 「発現抑制」 又は 「発 現を抑制」 させた遺伝子とは、 該遺伝子にコードされるタンパク質が産生されな いように遺伝的に改変された遺伝子をも意味する。 内在性ブラディオン遺伝子を 発現抑制させたゲノム丽 Aとは、 構造的には、 該遺伝子の全体を欠失しているゲ ノム DNAでもよいし、 該遺伝子の一部を欠失しているゲノム DNAでもよい。 ある いは、 該遺伝子の内部に外来性の DNA断片が揷入されているゲノム DNAでもよい 本発明では、 以下の工程にしたがって、 ブラディオン遺伝子を発現抑制させた ゲノム DNAを有するマウス胚性幹細胞を作製することができる。
特定の遺伝子を発現抑制させるためには、 公知のジーンターゲティング法が広 く用いられている。 公知のジーン夕一ゲティング法は、 夕ーゲティングベクター を導入して相同組換えを起こさせることにより、 所望の遺伝子に特定の変異を導 入する方法である。 このようなジーンターゲティング法の詳細については、 すで に様々な文献に記載されており、 以下の 2〜 5の工程はそれらの文献に従って行 うことができる （相澤慎ー：ジーンターゲティングー ES細胞を用いた変異マウス の作製， バイオマニュアルシリーズ 8， 羊土社 （1995) ; Ho an, B. , Bedd ington, R. , Cons tant ini, F. , Lacy, E.： Manipulat ing the Mouse Embryo, Cold Spri ng Harbor Laboratory Press (1994)； Joyner, A丄： Gene Target ing, A Pract, ical Approach Series, IRL Press (1993)等を参照されたい) 。
2 . 夕一ゲティングベクターの作製
本発明において、 マウス胚性幹細胞のゲノム DNA中のブラディオン遺伝子を発 現抑制させるために用いるターゲティングベクターとしては、 例えば以下の通り にして構築することができる。
まず、 マウスブラディオン遺伝子において変異を導入する領域に対し 5'側に位 置する領域、 及び 3'側に位置する領域を相同領域として選択し、 その領域に相当 する DM断片を調製する。 そのために、 例えば、 マウスゲノムライブラリ一から のマウスブラディオン cDNAによるスクリーニングによって、 マウスブラディオン 遺伝子を含むプラスミドクローンを取得する。 次に、 プラスミドクローンの制限 酵素地図を作製し、 サブクロ一ニングを行い、 該遺伝子の構造を決定する。 そし て、 所望の相同組換え体を得る上で好適に相同組換えを起こさせ得る領域を選択 することにより、 上記相同領域に相同な DNA断片を設計することができる。 この 際、 組換え頻度を向上させるためにはマウスゲノムライブラリーと使用する ES細 胞とが同じ系統に由来するものであることが好ましいが、 別の系統に由来するも のであってもよい。 特にブラディオン遺伝子全体を欠失させる場合には、 ブラデ イオン遺伝子よりも上流 （5'側） 及び下流 （3'側） の領域を相同領域として選択 することが好ましい。 ブラディオン遺伝子の一部のェキソンを含む領域を欠失さ せる場合には、 ブラディオン遺伝子中の目的領域の両側に位置するェキソンを相 同領域として選択することが好ましい。 ブラディオン遺伝子中に外来遺伝子を揷 入する場合には、 ェキソン中に存在する挿入部位の両側の領^ ¾を相同領域として 選択することが好ましい。 これらの領域に相当する DNA断片は、 前記マウスブラ ディオン遺伝子を含むプラスミドクローンから、 目的の領域を制限酵素によりそ れぞれ切り出した DNA断片として調製することができる。 あるいはこれらの DNA断 片は、 目的とする領域を PCR法により増幅した増幅断片であってもよいし、 化学 合成により合成したものであってもよい。
次いで、 これらの DNA断片をセレクション用マーカー遺伝子と連結させる。 限 定するものではないが、 通常は、 上記 5'側 DNA断片、 ポジティブセレクション用 マーカー遺伝子、 上記 3'側 DNA断片、 ネガティブセレクション用マーカー遺伝子 の順に連結させる。 ネガティブセレクション用マーカ一遺伝子は、 場合により使 用しなくてもよく、 また場合により上記以外の DNA断片又は他の化合物等を付加 してもよい。 変異を導入する部位に組み込まれるポジティブセレクション用マー カー遺伝子としては、 ネオマイシン耐性遺伝子 (Neof遺伝子）、 ピューロマイシン 耐性遺伝子、 又はハイグロマイシン B耐性遺伝子が挙げられるが、 これらに限定 されるわけではなく、 ポジティブセレクション用マーカーとして好適に用いられ るならばどのようなものを用いてもよい。 ネオマイシン耐性遺伝子は、 プラスミ ドクローンとして市販されている （St rat agene社、 New Engl and BioLabs社等） 。 このようなターゲティングベクタ一を用いることにより変異導入部位に組み込ま れるネオマイシン耐性遺伝子等のポジティブセレクション用マーカー遺伝子は、 その前後に ΙοχΡ配列を挿入しておけば、 ポジティブセレクション後に制限酵素 Cr eを用いてゲノム DNA中から除去することも可能である。 また、 胚性幹細胞に導入 する際にベクターを直鎖状化するために、 ユニークな制限酵素部位を相同領域の 外側に組み込んでおくことが好ましい。 また、 相同組換え体を相同領域の外側の プローブを用いてサザンハイブリダイゼーシヨンによりスクリーニングする場合 には、 組換え遺伝子検出用の制限酵素切断部位を組み込んでおくことが好ましい。 これらの DNA断片の連結は、 当業者に公知の通常の方法に従って行うことができ る。 またこれらの DNA断片の連結は、 例えばプラスミドベクター （例えば Stra g ene社の pBluescrip t I I SK+等） 又はファージベクタ一上等で行うと都合がよい。 上記のようにして設計 ·構築されたターゲティングベクターは、 通常の分子生 物学的手法により、 例えば大腸菌の形質転換及び培養によるクローニングによつ て、 増幅して使用することができる （例えば、 J. Sambrookら， Molecul ar Cloni ng, A Laboratory Manual, Second Ed i t ion, Cold Spring Harbor Laboratory P ress (1989)を参照されたい） 。
3 . 内在性ブラディオン遺伝子を発現抑制させるマウス胚性幹細胞とそれを導入 するマウス胚の選択
キメラマウスを作製する上では、 胚性幹細胞株とそれを導入する胚 （特に初期 胚） のマウス系統との好適な組み合わせを選択する必要がある。 この組み合わせ によってキメラ形成率 (キメラ率) が変化することから、 好適なキメラ率を達成 できる組み合わせを選択するべきである。 また作製したキメラマウスを、 その後、 野生型マウス等と交配させてヘテロ接合体、 ホモ接合体を作製するために用いる ことを意図する場合には、 導入した胚性幹細胞がキメラマウスの生殖細胞系列に 寄与するものであることが必要である。 このため、 本発明で用いる胚性幹細胞と 初期胚のマウス系統との組み合わせは、 相同組換え前の胚性幹細胞を初期胚に導 入した場合、 胚性幹細胞が生殖細胞系列に寄与することが確認されるものである ことが好ましい。 また、 作製したキメラマウスの胚性幹細胞の寄与率 （キメラ率 ) を容易に確認するためには、 適切な遺伝的マーカーを利用できるような胚性幹 細胞と初期胚のマウス系統との組み合わせを用いるのがよい。 このような遺伝的 マ一カーとしては、 体毛色が好適である。 体毛色を用いれば、 マウスの外観から、 容易にキメラ率を判定することができる。
本発明のキメラマウス作製に用いることができる、 胚性幹細胞株とそれを導入 する初期胚のマウス系統との好適な組み合わせとしては、 例えば、 129系胚性幹 細胞株 （例えば ΡΠ-5株） と C57BL/6J系マウス初期胚、 D3系胚性幹細胞株と C57BL /6系マウス初期胚等が挙げられる。 キメラマウス作製において好適に使用可能な 胚性幹細胞および初期胚のマウス系統については、 例えば 「Gene Targe t ingj ( A. L. Joyner著、 野田哲夫訳、 メディカル ·サイエンス ·インターナショナル社 ；特に 101頁表 1および 103頁） や 「実験医学別冊 バイオマニュアルシリーズ 8 ジーン夕ーゲッティング」 （相沢慎一著、 羊土社 （1995) ；特に第 2章 IV ES細 胞の培養 31頁の表 1、 および 33頁表 2A) 等の一般的な実験マニュアル書にも記 載されている。 但し、 目的とするキメラマウスを作製可能であれば、 これらの組 み合わせに限定されるものではない。
4 . 発現抑制させた内在性ブラディオン遺伝子を有するマウス胚性幹細胞の作製 マウス胚性幹細胞中に、 「2 . ターゲティングベクターの作製」 で調製した夕 ーゲティングベクターを導入する方法としては、 リン酸カルシウムトランスフエ クシヨン法、 DEAEデキストラン法、 リポフエクシヨン法、 マイクロインジェクシ ヨン法、 エレクト口ポレーシヨン法、 ウィルスベクタ一を用いる方法等、 当業者 に公知の任意の方法を用いることができる。
夕一ゲティングベクターを導入する方法としては、 このうちエレクト口ポレー ション法が広く用いられており、 その方法は以下のようにして行うことができる。 まずマウス胚性幹細胞としては、 飼育細胞 （フィーダ一細胞） 上で培養し、 そ の後トリプシン処理により培養皿から剥離させた細胞浮遊液を用いる。 細胞浮遊 液は所定の濃度に調製しておくことが好ましい。 上記の通り調製したターゲティ ングベクターは、 相同領域の外側に組み込むように設定したユニークな制限酵素 切断部位を利用して直鎖状化する。 これを上記の細胞浮遊液と混合し、 エレクト 口ポレー夕一によりパルスを加える。 パルス印加後 胚性幹細胞は、 培養液中で
3 6〜4 8時間程度培養する。 その後該培養液にポジティブセレクション用添加 薬剤を添加して、 ポジティブセレクションを行う。 ターゲティングベクター構築 に用いたポジティブセレクションマ一力一用遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子で ある場合には、 ポジティブセレクション用添加薬剤として G418を用いることがで きる。
上記のような添加薬剤を含有した培養液を毎日交換しながら胚性幹細胞の培養 を継続し、 7〜9日経過後、 出現した薬剤耐性コロニーを採取する。
得られた薬剤耐性コロニーは、 相同組換え体の候補と考えられる。 そこでそれ らのコロニーから抽出されるゲノム DNAについて、 サザンハイプリダイゼーショ ン又は PCRにより所望の相同組換えを起こしたゲノム DNAを有する胚性幹細胞株を スクリーニングする。
前記スクリーニングには、 ターゲティングベクターの構築に用いた相同領域の 外側に設定したプローブを利用したサザンハイプリダイゼーシヨンを用いること ができる。 また前記スクリーニングには、 夕一ゲティングベクターの構築に用い た相同領域の外側に設定したプライマーと、 neo遺伝子内に設定したプライマー とを利用する PCRを用いることもできる。 '
5 . 発現抑制されたブラディオン遺伝子を有するマウス胚性幹細胞を導入したキ メラマウスの作製
次に、 相同組換えにより所望の遺伝子変異を導入したマウス胚性幹細胞を、 マ ウス初期胚に導入して、 キメラマウスを作製する。 このようなキメラマウスの作 製方法としては、 マウス初期胚として胚盤胞を利用してこれに胚性幹細胞を注入 する方法 （胚盤胞注入法） 、 マウス初期胚として 8細胞期胚又は桑実胚を利用し これと胚性幹細胞塊を接着させる方法 （ァダリゲーシヨン法； Andra, Nら： Pro
Nat l. Acad. Sc i. USA, 90 : 8424-8428, 1993、 Step an. A. W.ら: Pro Nat l.
Acad. Sci. USA, 90 : 4582- 4585等を参照のこと） 等の、 当業者に公知の方法を 用いることができる。
胚性幹細胞を導入したマウス初期胚は、 偽妊娠マウスの子宮又は卵管内に胚移 植し、 キメラマウス個体へと発生させ、 産出させる。 この工程は当業者には公知 であり、 様々な文献及び実験プロトコールにしたがって実施することができる （
Hogan, B.ら： 「マウス胚の操作 （Manipul at ing the Mouse Embryo) 」 Cold Spr i ng Harbor Laboratory Press, 1988、 村松正實ら編：新遺伝子工学ハンドブック 第 3版， 羊土社 （1999)、 等を参照されたい） 。
6 . 発現抑制されたブラディオン遺伝子を有するキメラマウスの特徴
上記のようにして作製され産出された本発明のキメラマウスは、 その体細胞及 び生殖細胞が、 オリジナル系統由来のものと導入した胚性幹細胞由来のものとの キメラとなっている。 このキメリズムの遺伝的マーカーとして、 例えば、 容易に 観察することができる体毛色を用いることができる。 この場合、 キメラマウスを、 初期胚の由来するオリジナル系統と異なる色の体毛を有するマウス系統に由来す る胚性幹細胞を導入して作製すれば、 その胚性幹細胞由来系統の毛色を示す体毛 の割合から、 胚性幹細胞の組織への寄与率 （キメラ率） を算出することができる。 このキメラ率は、 例えば、 外観から測定したそれぞれの体毛の面積に基づいて、 胚性幹細胞の由来するマウス系統の体毛色の面積の割合を算出すればよい。
また、 本発明のキメラマウスは、 固有の性質として、 脳神経系全般の発育不良 を示す。 さらに本発明のキメラマウスは、 外観上、 全身の発育不良、 頭蓋骨形成 不良及び/又は視力障害という顕著な形態異常を示す。 本明細書において、 全身 の発育不良とは、 正常マウスの同週齢の個体と比較して、 体重及び体長が大幅に 劣っている状態を意味する。 また頭蓋骨形成不良とは、 正常マウスの面長な頭蓋 骨と比較して丸顔 （ハムスター様） となる頭蓋骨を有しており、 かつ正常マウス と比較すると眼球が顔面の大きさに比して大きいことを意味する。 さらに視力障 害とは、 視神経の発育不良に起因するものであり、 外観上はその視点が合ってい ない状態を意味する。
上記のように、 脳神経系全般の発育不良、 及び外観上顕著な形態異常を示すこ とから、 本発明のキメラマウスは、 先天的な脳神経系の発育不良と関連する障害 及び疾患、 並びに全身の発育不良、 頭蓋骨形成不良、 及び視神経系の発育不良に 基づく視力障害と関連する障害及び疾患に関して、 好適な生物個体モデル動物と して用いることができる。 さらに本発明のキメラマウスは、 ブラディオンタンパ ク質が関与することが知られている、 後天的な脳神経系の退行状態と関連する障 害及び疾患、 また細胞の癌化と関連する障害及び疾患、 並びに細胞死と関連する 障害及び疾患に関して、 好適な生物個体モデル動物として用いることができる。 これらの疾患及び障害に関する生物個体モデル動物としての本発明のキメラマウ スは、 ブラディオン遺伝子の詳細な機能の解明に有用であるだけでなく、 脳神経 系の形成 ·維持機構、 細胞寿命制御機能の解明にも有用であり、 さらには前記障 害及び疾患の治療又は制御法の開発の上でも有用である。
また、 本発明のキメラマウスが視神経の発育不良に基づく視力障害を示すこと は、 本発明のキメラマウスの大きな特徴である。 本発明のキメラマウスにおいて、 脳神経細胞で部位特異的 ·細胞特異的に働くことが報告されているブラディオン 遺伝子を発現抑制させることにより、 中枢神経系に先駆けて発生 ·分化が開始さ れる視神経までが発生異常を引き起こすことが初めて明らかにされた。 このこと は、 これまで解明されていない視神経発生異常の分子基盤を明らかにするための 糸口となるものであり、 さらに、 発生段階における中枢神経系の分化以前の形態 形成、 及びそれに関連する障害及び疾患に関しても、 本発明のキメラマウスを生 物個体モデルとして用いることができる可能性を示すものである。
さらに本発明のキメラマウスは、 内在性ブラディオン遺伝子を発現抑制させた 生殖細胞を有するため、 交配により、 ヘテロ接合体及びホモ接合体の作製に用い ることができる。 また、 他の遺伝子変異を有するマウスとの交配により、 遺伝子 同士の相互作用を解析することも可能である。 その際、 本発明のキメラマウスが 顕著な形態異常を示すという特徴を、 遺伝子の機能及び相互作用の変化を容易に 観察できるマーカーとして、 有利に利用することができる。 したがって、 本発明 のキメラマウスは、 遺伝育種用動物として有用である。
なお、 本発明のキメラマウスから採取した、 内在性ブラディオン遺伝子を発現 抑制させた細胞を含む器官、 組織、 細胞集団も、 本発明に含まれるものとする。 これらの生体材料は、 発育不全等の形態異常を示しているものであり得る。 これ らの生体材料も、 上述したような遺伝子機能の解析、 並びに障害及び疾患の治療 •制御方法の開発において用いることができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 夕一ゲティングベクタ一構築に用いたサブクローンの制限酵素切断地 図、 並びに該サブクローンに含まれるマウスブラディオン遺伝子断片、 マウスゲ ノム DNAに含まれるブラディオン遺伝子、 及び該遺伝子の相同組換えにより得ら れた組換え遺伝子を、 それぞれ対応させて示した図である。
図 2は、 ターゲテイングベクターの構造図である。
図 3は、 本発明において胚性幹細胞株 281を用いて得たキメラマウスの外観上 の形態異常を示す写真である。 図 3 A〜図 3 Dのマウスは実施例 3で作製したキ メラマウスであり、 図 3 Aは識別番号 5 8 l mのキメラ個体、 図 3 Bは識別番号 5 8 2 mのキメラ個体、 図 3 Cは識別番号 5 8 4 f のキメラ個体、 図 3 Dは識別 番号 5 8 0 mのキメラ個体を示している。
図 4は、 本発明において胚性幹細胞株 344を用いて得たキメラマウスの外観上 の形態異常を示す写真である。 図 4 A〜図 4 Dのマウスは実施例 3で作製したキ メラマウスであり、 図 4 Aは識別番号 5 8 9 mのキメラ個体、 図 4 Bは識別番号 5 8 7 mのキメラ個体、 図 4 Cは識別番号 5 8 5 f のキメラ個体、 図 4 Dは識別 番号 5 8 8 mのキメラ個体を示している。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明の技術 的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
[実施例 1〗 ターゲティングベクターの作製
ブラディオン遺伝子をコードするマウス cDNA (配列番号 1 ) をプロ一ブとして、 マウス ·ゲノムの細菌人工染色体（BAC ; Bacteri la art i f icial chromosome)ライ ブラリー （Incyte Genomics社製） を常法によりスクリーニングし、 BAC94R- Cク ローンを得た。 その BACクローンを、 制限酵素 BamHI又は Hindll lで消化し、 べク 夕一 pZErO- 1 (Invi trogen社製） 中へサブクローニングを行った。 そのサブクロ 一ン - ライブラリーより、 3つのサブクロ一ン、 A1 (17. 7 kb) , E2 (5. 1 kb)、 F ΐ ί (14. 1 kb)をそれぞれ組み込んだプラスミド ·クローンを得た （図 1 ) 。 それ らのサブクローンを各種制限酵素により消化し、 ァガロースゲル電気泳動による 解析を行って、 制限酵素マップを作成した （図 1 ) 。 その結果、 この 3種のサブ クローンは、 マウスゲノム上で、 5'側から F l l、 Al、 E2の順に配列していること が判明した （図 1 ) 。 次に、 これらのサブクローンにおけるマウスブラディオン 遺伝子の局在を確認するために、 F l l、 AU E2の各サブクローンを各種制限酵素 によりそれぞれ消化し、 ァガロースゲル電気泳動を行った後、 サザンハイブリダ ィゼーシヨン解析を行った。 そのためのプロ一ブとしては、 マウスブラディ.オン 遺伝子の 5'側非翻訳領域（5' UTR)相当配列 (97UTRF/94R) (配列番号 2 ) 、 読み 枠内領域相当配列 (223F/356R) (配列番号 3 ) 、 及び 3'側領域相当配列 (749F/
919R) (配列番号 4 ) の 3種の DNA断片を PCR法により調製して用いた。 なお、 こ の 3'側領域相当配列 （749F/919R) は、 マウスブラディオン遺伝子中の、 ヒトブ ラデイオン の mDNA配列 （配列番号 5 ) の 3'側非翻訳領域（3' URF)に対応する領 域に含まれている。 この解析の結果、 サブクローン A1は、 5'側非翻訳領域相当配 列 (97UTRF/94R) 、 読み枠内領域相当配列 (223F/356R) 、 及び 3'側領域相当配 列 （749F/919R) の各プローブにより検出され、 またサブクローン E2は、 3'側領 域相当配列 （749F/919R) のプローブにより検出された。 サブクローン F 11は、 上 記 3つのプローブのいずれを用いても検出されなかった。 すなわち、 サブクロー ン A1にはマウスブラディオン遺伝子が、 E2には該遺伝子の後半の一部が含まれる が、 サブクローン F 11には該遺伝子は含まれないことが判明した。
上記の解析に基づき、 該遺伝子全体をノックァゥトするためのターゲティング ベクターを構築した。 相同組換えに利用するマウスブラディオン遺伝子の外側の 配列としては、 サブクローン F 1 1の制限酵素 Xbalによる切り出し断片（4. 1 kb)と、 サブクロ一ン A1の制限酵素 EcoRI及び Xholによる切り出し断片（3. 3 kb)とを選択 し、 これらの DNA断片を制限酵素によって切り出して、 通常法により調製した。 また、 ポジティブセレクションマ一カーとして用いるネオマイシン耐性遺伝子を、 プラスミド ·クローン pGT_N38 (New Engl and BioLabs社製） からの制限酵素 Kpnl 及び EcoRIによる切り出し断片として同様に調製した。 次いで、 ベクター 381 oxP に、 F l lの Xbal断片、 1οχΡ、 ネオマイシン耐性遺伝子、 1οχΡ、 A1の EcoRIZXhoI断 片の順に連結して、 ターゲティングベクターを構築した。
[実施例 2 ] ブラディオン遺伝子を完全欠失した対立遺伝子を有する胚性幹細胞 の作製
(1) ターゲティングベクターの胚性幹細胞への導入及び相同組換え体の選択
胚性幹細胞 （E S細胞） ΡΠ- 5株を継代後、 培養液中で 37°C、 5 % C02で 36時間 培養した。 この胚性幹細胞を、 lOOmni培養皿当たり 3mlのトリプシン （Invi t rogen 社製， 15050-065) を用いて処理することにより培養皿から剥がし、 これをピぺ ッティングして、 単細胞として浮遊させた。 これに 10% ゥシ胎児血清含有]) MEM培 地を 7ml加え、 さらにピペッティングした。
次いで、 飼育細胞 （フィーダ一細胞） だけを培養皿に付着させて胚性幹細胞と 分けるために、 前記細胞浮遊液を別の 100mm培養皿に播き、 C02インキュベーター (37°C、 5 C02) に 15〜30分間入れた。 その後、 上清を採取し、 2〜5培養皿分を 1本の 50mlチューブにまとめ、 270 gで 5分間遠心分離した。 上清を吸引除去し、 ペレツトを、 細胞を剥がす前の培養皿 1枚あたり 1mlの氷冷リン酸緩衝液に再懸濁 して浮遊させた。 溶液中の細胞数を数え、 7 X 106細胞 Zmlに濃度を調整した。 このようにして得た細胞浮遊液 （7 X 106細胞/ ml) 0. 8mlと、 制限酵素 Not lで 処理して直鎖状にしたベクター丽 A 40 gとを混合した後、 エレクト口ポレーシ ヨン用キュベット （B ioRad社製、 Cat. No. 165-2088) に移した。 これに、 エレ クトロポレー夕一 （BioRad社製、 genepul ser) で 240V、 500 z Fのパルスを加えた。 次いでキュべットをキュべッ卜ホルダーから取り出し、 氷上に 20分間静置した。 その後、 キュベット中の細胞浮遊液を、 マウス白血病阻害因子 (LIF)を含む上記 培養液 10〜20ml中に移した。
次に、 この LIF含有培養液中に懸濁した細胞浮遊液を、 ゼラチンコーティング した培養皿に 1枚あたり 10mlずつ播いた。 翌日、 培養液を交換し （LIFを含んだ培 養液を使用） 、 さらに 2日後、 LIFを含んだ培養液に、 選択性薬剤である 150〜250 g/ml G418を加えて培養した。 培養液を毎日交換しながらコロニーの観察を続 け、 選択後 8日頃から出現した薬剤耐性コロニーを複数個採取し、 各々クローン 化し、 株化した。
(2) サザンハイブリダイゼーシヨンによる相同組換え体の同定
上記のようにして得た薬剤耐性コロニー （G418による選択の約 8日後に出現） を、 サザンハイブリダィゼーシヨン解析によってスクリーニングし、 ブラディォ ン遺伝子全体が欠失した相同組換え体を同定した。
そのためにまず、 ブラディオン遺伝子全体が欠失した相同組換え体の候補であ る薬剤耐性コロニー由来の胚性幹細胞株 279、 281、 313、 344のそれぞれのゲノム DNA抽出用培養細胞から、 通常法に従ってゲノム DNAを抽出した。 そのゲノム DNA について、 制限酵素 BamHI又は Hindl l lで各々消化したサンプルを作製した。 両サ ンプルはァガロース ·ゲル電気泳動に供し、 その後ナイロン ·メンブレンにプロ ッティングした。
サザンハイプリダイゼーシヨンは、 以下の手順で 3回、 プローブ毎に行った。 まず、 プレハイブリダィゼーシヨン溶液を用いて、 6 5 で 3 0分間のプレハイ ブリダィゼーシヨンを行い、 次いでハイプリダイゼーシヨン溶液及び下記のプロ ーブを 1種づっ用いて、 6 5 DCで一晩のハイブリダィゼーシヨンを行った。 その 後、 0. 1 X SSC - 0. 1 X SDS溶液により 65°Cで 15分間洗浄を行い、 さらに同様の洗浄 を再度行い、 さらにメンプレンをイメージアナライザー （BAS2000) を用いてシ グナルの解析を行った。
プローブとしては、 ブラディオン遺伝子の上流のゲノム配列を認識する 5 'プロ ーブ、 ネオマイシン耐性遺伝子を認識する Neoプローブ、 ブラディオン遺伝子の 下流のゲノム配列を認識する 3'プローブをそれぞれ別々に用いた。 5'プローブは、 実施例 1のサブクローン F 11の Kpnl及び Hindl l l切り出し断片として調製した 0. 9 kbの MA断片であり、 相同組換えが起こった遺伝子又は野生型遺伝子において、 図 1に示す通りブラディオン遺伝子の上流の配列を認識する。 3'プローブは、 実 施例 1のサブクローン A1の BamHI及び Xhol切り出し断片として調製した 0. 6 kbの！）
NA断片であり、 相同組換えが起こった遺伝子又は野生型遺伝子において、 図 1に 示す通りブラディオン遺伝子のすぐ下流の配列を認識する。 Neoプロ一ブは、 F in al vec tor (Incyte Genomics社製） の BamHI及び EcoRI切り出し断片として調製し た 1. 8 kbの DNA断片であり、 図 1に示す通り、 夕ーゲティングベクターとの相同 組換えによりゲノムに組み込まれたネオマイシン耐性遺伝子 （Neo) を認識する。 これらのプローブは、 alpha- CTP32を用いて Red iprime I I 丽 Labe l l ing Sys t em (Amersham Phramac ia B iotech社）によりラベリングして用いた。
これらのプローブを用いて解析を行つたところ、 BamHIで消化したサンプルで は、 相同組換えの起こっている胚性幹細胞由来丽 Aサンプルでは 5. 7キロベースの シグナルが、 相同組換えの起こっていない胚性幹細胞由来の野生型対立遺伝子の みを含む DNAサンプルでは 17. 7キロベースのシグナルが認められた。 Hindl l lで消 化したサンプルでは、 相同組換えの起こっている胚性幹細胞由来 DNAサンプルで は 12. 2キロベースのシグナルが、 相同組換えの起こっていない胚性幹細胞由来の 野生型対立遺伝子のみを含む DNAサンプルでは 14. 1キロベースのシダナルが検出 された。
このようなサザンハイプリダイゼーションの結果より、 内在性ブラディオン遺 伝子を発現抑制されたゲノム DNAを有する胚性幹細胞株として 281株及び 344株が 同定された。 したがって、 胚盤胞への胚性幹細胞の注入のために、 胚性幹細胞株 281及び 344を選定した。
[実施例 3 ] ブラディオン遺伝子を欠失したゲノムを有するマウス胚性幹細胞を 用いたキメラマウスの作製及び該キメラマウスの形態観察
胚性幹細胞株 281及び 344のそれぞれを、 C57BL/6系マウスの胚盤胞へマイク ΰ インジェクション法により注入した。 その後常法に従って、 該胚盤胞を偽妊娠雌 マウスの卵管内に移植し、 個体へと発生させた。
その結果、 以下のキメラマウスが得られた。
①胚性幹細胞株 281を用いて得たキメラマウス （2001年 5月 6日誕生）
キメラ個体 (識別番号 5 8 0 m) · • -キメラ率 90%、 雄
キメラ個体 (識別番号 5 8 1 m) · - ·キメラ率 90 、 雄
キメラ個体 (識別番号 5 8 2 m) - • ·キメラ率 90%、 雄
キメラ個体 (識別番号 5 8 3 m) · - ·キメラ率 90%、 雄
キメラ個体 (識別番号 5 8 4 f ) - • ·キメラ率 95%、 雌
②胚性幹細胞株 344を用いて得たキメラマウス （2001年 5月 8日誕生) キメラ個体 （識別番号 5 8 5 f ) · · ·キメラ率 90%、 雌
キメラ個体 （識別番号 5 8 7 m) · · ·キメラ率 98%、 雄
キメラ個体 （識別番号 5 8 8 m) · · ，キメラ率 98%、 雄
キメラ個体 （識別番号 5 8 9 m) · · ·キメラ率 90%、 雄
図 3及び 4は、 上記で得られたキメラマウスの外観を示す写真である。 図 3に は、 胚性幹細胞株 281を用いて得たキメラマウスを示した。 図 4には、 胚性幹細 胞株 344を用いて得たキメラマウスを示した。 いずれのキメラマウスにおいても、 全身の発育不良、 ハムスター様の顔、 比較的大きな眼球、 及び視点の定まらない 様子が観察される。 本明細書に引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願は、 その全文を参照によ り本明細書に組み入れるものとする。 産業上の利用可能性
本発明により、 脳神経系の発育不全及び各種形態異常を示す、 発生時より内在 性ブラディオン遺伝子を発現抑制させたキメラマウスが提供される。 このキメラ マウスは、 脳神経系の異常に関連した生物個体モデル動物及び遺伝育種用動物と して有用に利用できる。

Claims

請 求 の 範 囲 発現が抑制されている内在性ブラディォン遺伝子を含むゲノム D N Aを有 するマウス胚性幹細胞が導入されたマウス胚を発生させたキメラマウス。 発現が抑制されている内在性ブラディオン遺伝子が、 生物学的活性を喪失 したブラディオン夕ンパク質をコードするように遺伝子改変されているこ とを特徴とする、 請求項 1記載のキメラマウス。
発現が抑制されている内在性ブラディオン遺伝子が、 そのコード領域全体 を欠失するように遺伝子改変されていることを特徴とする、 請求項 1記載 のキメラマウス。
マウス胚性幹細胞が ΡΠ- 5株由来であり、 マウス胚が C57BL/6系マウス由来 である、 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載のキメラマウス。
マウス胚が 8細胞期胚、 桑実胚及び胚盤胞からなる群より選択されるもの である、 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載のキメラマウス。
形態異常を示す、 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載のキメラマウス。 形態異常が、 頭蓋骨形成不良、 視力障害、 及び全身の発育不良からなる群 から選択される少なくとも 1つである、 請求項 6記載のキメラマウス。 キメラ率が 9 0 %以上 9 8 %未満である、 請求項 1〜7のいずれか 1項に 記載のキメラマウス。
請求項 1〜8のいずれか 1項記載のキメラマウスから採取される、 マウス 胚性幹細胞由来の細胞。
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