WO2004024920A1 - 神経変性疾患の予防・治療剤 - Google Patents

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Hideki Matsui
Tomomichi Watanabe
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • G01N2800/28—Neurological disorders

Definitions

  • the present invention relates to a prophylactic / therapeutic agent for neurodegenerative diseases, a diagnostic agent, and the like. More specifically, the present invention relates to a prophylactic / therapeutic agent for diabetes, cancer, and rheumatic diseases, a diagnostic agent, and a screening for such a prophylactic-therapeutic agent.
  • Alzheimer's disease is a typical neurodegenerative disease with progressive dementia and cognitive dysfunction, but no effective treatment has been found so far. Needless to say, Alzheimer's disease is one of the most important diseases in the aging society, and the development of its therapeutic agent has extremely significant medical economics.
  • abnormal proteins accumulate in the endoplasmic reticulum due to factors that affect protein biosynthesis, such as heat shock and glucose starvation, and stress on the endoplasmic reticulum (ER stress).
  • ER stress stress on the endoplasmic reticulum
  • a group of endoplasmic reticulum stress response genes including chaperone molecules are expressed, repair or degrade abnormal proteins, and maintain homeostasis.
  • Parkin was identified as a pathogenic gene for hereditary Parkinson's disease, autosomal recessive juvenile parkinsonism (AR-JP) (Nature, 392, 605-608, 1998). It has been reported that it is a ubiquitin ligase involved in the disease (Nat. Genet, 25, 302-305, 2000). In addition, a Pae l (Parkin as sociated endothel in receptor-like) receptor was identified as a substrate for Parkin.
  • AR-JP autosomal recessive juvenile parkinsonism
  • This receptor is a protein whose higher-order structure is difficult to form, and the entire lower-order structure formation of this protein is usually rapidly degraded by the action of Parkin, but when the protein degradation system is suppressed, abnormal Pael
  • the body accumulates in the endoplasmic reticulum, Cell death due to endoplasmic reticulum stress has been reported (Cell, 105, 891-902, 2001).
  • cells with a mutation in the presenilin 1 causative gene of familial Alzheimer's disease become vulnerable to ER stress, and the deletion of Irel, which is involved in the ER stress response, reduces i3 amyloid production. Ascending (Biochem. Biophysic. Acta, 1536, 85-96, 2001; J. Biol.
  • IPK neuronal cell death inducible putative kinase
  • Aktl Aktl activity is enhanced in synovial cells of patients with rheumatism, and apoptosis can be induced by suppressing the function of AkU, activation of Aktl is associated with rheumatoid It has been suggested that it plays an important role in the pathogenesis of disease (Arthritis Rheum. 44, pp. 155-1567, 2001).
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, have found a gene whose expression is remarkably increased at the time of induction of neuronal cell death accompanied by endoplasmic reticulum stress. The inventors have also found that they promote dependent cell death, and as a result of further studies based on these findings, they have completed the present invention.
  • a neurodegeneration comprising a compound that inhibits the activity of a protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or a salt thereof Prevention and treatment of diseases or diabetes,
  • the medicine according to the above (7) which is an agent for preventing or treating neurodegenerative disease or diabetes.
  • a diagnostic agent comprising the antibody according to (6) above,
  • a neurodegenerative disease or diabetes comprising a polynucleotide encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof. Diagnostics,
  • the above protein or its partial peptide, or a partial peptide thereof which comprises using a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof.
  • the above protein or its partial peptide which comprises a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Or a screening kit for a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the salt thereof, (14) a compound or a salt thereof obtainable by using the screening method described in the above (12) or the screening kit described in the above (1.3).
  • the protein described above which comprises a polynucleotide encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof. Screening kit for compounds or salts thereof that inhibit gene expression,
  • a medicament comprising the compound according to (14) or (17) or a salt thereof,
  • a method for preventing or treating neurodegenerative disease or diabetes which comprises administering to a mammal an effective amount of the compound according to (14) or (17) or a salt thereof,
  • a cancer comprising a compound or a salt thereof which promotes the activity of a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or Prevention and treatment of rheumatic diseases,
  • a medicament comprising a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof;
  • a medicine comprising a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof,
  • a diagnostic agent for cancer or rheumatic disease comprising a polynucleotide encoding a protein or a partial peptide thereof containing the amino acid sequence of
  • the above protein or partial peptide thereof which comprises a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof. Is a compound for promoting the activity of the salt or a kit for screening the salt thereof,
  • (32) a compound or a salt thereof obtainable by using the screening method according to (30) or the screening kit according to (31);
  • the above-mentioned protein gene which comprises a polynucleotide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof;
  • a kit for screening a compound that promotes expression or a salt thereof
  • a method for preventing or treating cancer or rheumatic disease which comprises administering to a mammal an effective amount of the compound according to (32) or (35) or a salt thereof; (39) To promote the activity of a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof, or to promote the expression of the above protein gene.
  • FIG. 1 is a diagram showing the amount of DNA cleavage of cells 24 hours after stimulation with tunicamycin by OD405-492.
  • the vertical axis indicates the absorbance
  • the horizontal axis indicates the concentration of tunicamycin.
  • — ⁇ — indicates the amount of DNA cut in control cells
  • —Low indicates the amount of DNA cut in NIPK gene transduced cells.
  • FIG. 2 is a diagram showing the amount of DNA cleavage of cells 48 hours after stimulation with tunicamycin by using 0M05-492.
  • the vertical axis indicates the absorbance
  • the horizontal axis indicates the concentration of tunicamycin.
  • — ⁇ — indicates the amount of DM cleavage in control cells
  • —mouth— indicates the amount of MA cleavage in NIPK gene transduced cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing the amount of DNA cleavage of cells 24 hours after stimulation with evening psigargin by OD405-492.
  • the vertical axis indicates absorbance
  • the horizontal axis indicates the concentration of tabcigargin.
  • “1-1” indicates the amount of DNA cleavage in control cells
  • “—” indicates the amount of DM cleavage in NIM gene-transduced cells.
  • FIG. 4 is a diagram showing the amount of DNA cleavage of cells 48 hours after stimulation with thapsigargin by OD405-492.
  • the vertical axis indicates absorbance
  • the horizontal axis indicates the concentration of tabcigargin.
  • FIG. 5 is a diagram showing the respiratory activity of cells at 48 hours after stimulation with tab cigargin by OD450.
  • the vertical axis indicates the absorbance
  • the horizontal axis indicates the transgene.
  • Figure 6 shows that after immunoprecipitation with anti-V5 antibody, binding between NIPK and Aktl
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 used in the present invention (hereinafter sometimes referred to as the protein of the present invention or the protein used in the present invention)
  • human warm-blooded animals eg, guinea pigs, rats, mice, birds, chickens, egrets, pigs, sheep, horses, monkeys, etc.
  • hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, kidney 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langer's cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, cartilage cells Vesicles
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 50% or more, preferably about 60% or more, and more preferably about 7% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Amino acid sequence homology can be calculated using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Format Basic Local Alignment Search
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 described above. And the amino acid represented by SEQ ID NO: 1 Proteins having substantially the same activity as the protein containing the sequence are preferred. Specifically, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: And a protein containing the amino acid sequence represented by 20.
  • Substantially the same activity includes, for example, a neurofibrillary tangle promoting activity, a neuronal cell death promoting activity, and the like. Substantially the same means that their properties are
  • the above-mentioned activities are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times).
  • Quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may vary.
  • immunological staining eg, using an anti-tau antibody or the like
  • a microscope measuring the degree of change in nerve fibers.
  • the measurement of the nerve cell death promoting activity is carried out, for example, by introducing an expression vector of the protein of the present invention into a cell, and using a cell death inducer (eg, tunicamycin, tabcigargin, 2-hydroxyglucose, j3 amyloid, okadaic acid, homocystine ), And then measure the amount of degeneration of axons using force-lucein staining, mitochondrial respiratory activity, the amount of LDH (lactate dehydrogenase) in culture supernatant, or the amount of DNA cleavage associated with cell death. Can be measured.
  • a cell death inducer eg, tunicamycin, tabcigargin, 2-hydroxyglucose, j3 amyloid, okadaic acid, homocystine
  • Examples of the protein used in the present invention include: (1) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by ⁇ sequence number: 1 (for example, about 1 to 100, preferably 1 to 100) An amino acid sequence in which about 30 amino acids are deleted, preferably about 1 to 10 amino acids, and more preferably a number (1 to 5) of amino acids; (ii) 1 or 10 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence to which two or more (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10 and more preferably about 1 to 5) amino acids have been added (Iii) one or two or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 (eg, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably Is a number (1-5) (Iv) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (eg, about 1 to 100, preferably 1 to 30) Degree, preferably about 1 to 10, more
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • the protein has a N-terminus at the left end (amino terminus) and a C-terminus at the right end (capillary terminus) according to the convention of peptide notation.
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl Le, isopropyl, C w alkyl group such as n one-butyl, cyclopentyl Le, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example , phenyl, C 6, such as ⁇ - naphthyl - 12 Ariru group, e.g., benzyl, a one-naphthyl, such as phenyl one CM alkyl or flying one naphthylmethyl such phenethyl - (: C 7 such as Bok 2 Al kill group - 14 Ararukiru group, Viva Roy Ruo carboxymethyl If protein such as a methyl group is used in c present invention used has a carboxyl group (or Cal Bokishireto) other than the C-terminus, amidated force Rupokishiru group or esterified Such proteins are also included
  • an amino group at the N-terminal amino acid residue eg, methionine residue
  • a protecting group eg, an acyl group such as a CW alkanol such as a formyl group or an acetyl group.
  • Protected substances N-terminal dalluminin residues generated by cleavage in vivo, oxidized with lipamine,
  • Substituents on the side chains of amino acids in the molecule are suitable protecting groups (for example, Mill group, those protected by Asechiru like Ashiru groups such ⁇ Bok 6 Arukanoiru group such group), or sugar chains; etc. double if proteins such as glycoproteins bound.
  • protein used in the present invention include, for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the partial peptide of the protein used in the present invention is a partial peptide of the protein used in the present invention described above, and is preferably any peptide having the same properties as the protein used in the present invention described above. May be used.
  • the amino acid sequence at the 1st to 30th and 250th to 280th amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 And the like For example, at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, most preferably, of the constituent amino acid sequences of the protein used in the present invention. Alternatively, a peptide having an amino acid sequence of 200 or more is used.
  • one or more (preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence are deleted, Alternatively, one or more (preferably, about 1 to 20, more preferably, about 1 to 10, and more preferably, about 1 to 5) amino acids are added to the amino acid sequence. Or 1 or 2 or more (preferably, about 1 to 20; more preferably, about 1 to 10; more preferably, about 1 to 5) amino acids are inserted into the amino acid sequence. Or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence have been substituted with another amino acid. Is also good.
  • the partial peptide used in the present invention the C-terminus force Rupokishiru group (- C00H) carboxylates Ichito (- C00-), amide (- C0NH 2) or may be anything Re is the ester (-C00R) .
  • the partial peptide used in the present invention includes Similar to proteins that have a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, and those in which the amino group of the N-terminal amino acid residue (eg, methionine residue) is protected by a protecting group A glutamic acid residue generated by cleavage of the N-terminal side in vivo and pyroglutamine oxidation; a substituent in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group; or a sugar chain.
  • Complex peptides such as bound so-called sugar peptides are also included.
  • the partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for producing an antibody.
  • a salt with a physiologically acceptable acid eg, an inorganic acid, an organic acid
  • a base eg, an alkali metal salt
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the protein or its partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced from the cells or tissues of the human warm-blooded animal described above by a known protein purification method. It can also be produced by culturing a transformant containing the DNA to be loaded. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized, then extracted with an acid or the like, and the resulting extract is subjected to reversed phase chromatography, ion exchange chromatography, etc. Purification and isolation can be performed by combining the above chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be usually used.
  • a resin for protein synthesis examples include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl resin L-Fmoc aminoethyl) phenoxy resin.
  • amino acids having appropriately protected amino groups and side chain functional groups are condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein or partial peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the desired protein or partial peptide or amide thereof. Get the body.
  • carbodiimides are particularly preferable.
  • carbodiimides DCC, N, N, diisopropyl carbodiimide, N-ethyl- ⁇ '-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used.
  • Activation by these involves adding the protected amino acid directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, H ⁇ B t, HO ⁇ B t), or using a symmetrical acid anhydride or HOB t ester or HO ⁇ It can be added as a Bt ester to the resin after activation of the protected amino acid in advance.
  • the solvent used for activation of the protected amino acid or condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for protein condensation reactions.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetoamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, trifluoroethanol, etc.
  • Alcohols, sulphoxides such as dimethylsulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof. Used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about 120 ° C to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isopornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxyl-ponyl, CI—Z, Br—Z, and adaman Tiloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the carboxyl group can be, for example, an alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Alkyl esterification), aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzoyl ester It can be protected by xycarbonyl hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl,
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for the esterification for example, a group derived from carbonic acid such as a lower (C l ⁇ ) alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a benzyloxycarbonyl group, and an ethoxycarbonyl group is used.
  • groups suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C 1 2 one Bz l, 2-two Torobenjiru, B r- Z, such as t _ butyl is used.
  • protecting group for imidazole of histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt ;, Fmoc and the like are used.
  • Activated carbonyl groups of the raw material include, for example, Hydrates, azides, active esters [alcohols (eg, pen phenol, 2,4,5-trichloro phenol, 2,4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H ⁇ NB, N-hydroxy Succinimide, N-hydroxyfurimide, and esters with HOBt).
  • active esters eg, pen phenol, 2,4,5-trichloro phenol, 2,4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H ⁇ NB, N-hydroxy Succinimide, N-hydroxyfurimide, and esters with HOBt.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • Acid treatment with trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, or base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., or in liquid ammonia Reduction with sodium is also used.
  • the elimination reaction by the above acid treatment is generally performed at a temperature of about ⁇ 20 ° C. to 40 ° C.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw material, the protection group, the elimination of the protective group, and the activation of the functional group involved in the reaction can be appropriately selected from known groups or known means.
  • a peptide (protein) chain is added to the amino group side to a desired length.
  • the crude protein or peptide is purified by using various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein or peptide.
  • an ester of a protein or peptide for example, after condensing the carboxyl group of the amino acid at the terminal end of the amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, An ester of the protein or peptide can be obtained.
  • the partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein used in the present invention with an appropriate peptidase.
  • a peptide synthesis method for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the partial peptide used in the present invention with the remaining portion, and if the product has a protecting group, removing the protecting group. it can. Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include the methods described in the following (i) to (V).
  • the polynucleotide encoding the protein used in the present invention includes a nucleotide sequence encoding the protein used in the present invention described above. Anything may be used.
  • it is DNA.
  • the DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells and tissues, cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of pateriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • a reverse RNA was directly prepared using a preparation of a total RNA or mRNA fraction from the above-described cells and tissues.
  • RT-PCR method Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • the DNA encoding the protein used in the present invention includes, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a DNA hybridizing with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringency conditions. Any DNA may be used as long as it contains a soybean base sequence and encodes a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Examples of the DNA that can be hybridized with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringency conditions include, for example, about 50% or more, and preferably about 60% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. More preferably, a DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is used. Specifically, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 19 DNA containing the base sequence to be used.
  • Hybridization is performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can be. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, the reaction can be performed under high stringent conditions.
  • High stringency conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 6 ° C.
  • the condition at 5 is shown.
  • the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
  • DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the like are used.
  • the polynucleotide (eg, DNA) encoding the partial peptide used in the present invention may be any polynucleotide containing the above-described base sequence encoding the partial peptide used in the present invention. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-described cell / tissue-derived cDNA, the above-described cell / tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA may be used.
  • Examples of the DNA encoding the partial peptide used in the present invention include, for example, a DNA having a part of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 2.
  • DNAs containing a part of DNA encoding a protein having a base sequence that hybridizes with a base sequence of the present invention under eight stringent conditions and having substantially the same activity as the protein of the present invention are used.
  • the DNA hybridizable with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is as described above. Shows the same significance.
  • DNA is amplified by the PCR method using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention, or the DNA incorporated into an appropriate vector is used as one of the proteins of the present invention. Selection can be carried out by hybridization with a DNA fragment coding for a part or all of the region or labeled with a synthetic DNA. The method of hybridization is described in, for example, Molecular Cloning 2nd (J.
  • the DNA base sequence can be converted using PCR, a known kit, for example, Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc., using the 0M-LA PCR method. It can be carried out according to a method known per se, such as the gapped duplex method or the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or can be digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) promoting the DNA fragment in a suitable expression vector in a suitable expression vector.
  • It can be manufactured by connecting downstream of Escherichia coli-derived plasmids (eg, PBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, , PSH19, pSH15), bacteriophages such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pAl-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, For example, pc DNA I / Neo is used.
  • any promoter may be used as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • examples include the SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter, and the like.
  • CMV Cytomegalovirus
  • SRa promoter SRa promoter
  • the host is Eshierihia genus bacterium, trp promoter, lac promoter, re cA promoter one, AP L flop port motor -, promoter, one and tau 7 promoter Isseki
  • the host is a bacterium of the genus Bacillus, SP
  • yeast such as # 1 promoter overnight, SP02 promoter, penP promoter, etc., PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferred.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may further contain, if desired, an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV400 ri), and the like.
  • a selection marker include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene (methotrexate (MTX) resistance), an ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp ⁇ ), neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne o r, G418 resistance).
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • Amp ⁇ ampicillin resistance gene
  • Ne o r, G418 resistance neomycin resistance gene
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention. If the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a PhoA signal sequence, a 0-A signal sequence, etc., if the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, a primase signal sequence, a subtilisin signal sequence, etc. If the host is an animal cell, MFa signal sequence, SUC2 signal sequence, etc. If the host is an animal cell, insulin 'signal sequence, 0; A signal sequence or the like can be used.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia include, for example, Escherichia coli
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis (Bacillus).
  • subtilis MI 114 24, 255 (1983)] and 207-21 (Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)).
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-1, NA87-11A, DKD-5D, 2OB-12, Schizosaccharomyces pombe N CYC 1913, NCYC 2036, Pichia pastori Pichia pastoris) KM 71 or the like is used.
  • Insect cells include, for example, when the virus is AcNPV, a cell line derived from a larva of night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell) and Trichoplusia ni MG1 cells from the midgut, High Five TM cells from Trichoplusia ni eggs,
  • Cells derived from Maraestra brassicae or cells derived from Est igmena acrea are used.
  • a silkworm-derived cell line (Bombyx mori cell; BmN cell) is used.
  • Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711) and Sf21 cells (Vaughn, J.L., et al., In Vipo).
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Neichia — (Nature), 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh fr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter CH ⁇ (dh fr—) cell Abbreviations), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, mouse ATDC'5 cells, rat GH3, human FL cells, etc. are used.
  • CHO cell Chinese hamster cell CHO
  • CH ⁇ (dh fr—) cell Abbreviations Chinese hamster cell CHO
  • mouse L cells mouse AtT-20
  • mouse myeloma cells mouse ATDC'5 cells
  • rat GH3, human FL cells etc.
  • Transformation of yeast is performed according to the method described in, for example, Methods in Enzymology, Vol. 194, 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 75, 1929 (1978). Can be.
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • Transformation of animal cells is performed, for example, according to the method described in Cell Engineering Separate Volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973). be able to.
  • a liquid medium is suitable for the culture, and contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic substances and the like necessary for the growth of the transformant.
  • Carbon sources include, for example, glucose, dextrin, soluble 'I raw starch, sucrose, etc.
  • Nonrogen sources include, for example, ammonium salts, nitrates, corn chips' Lica-peptone, casein, meat extract, large extract
  • Inorganic or organic substances such as soybean meal and potato extract
  • inorganic substances include, for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium salt and the like.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • Examples of a medium for culturing Escherichia bacteria include, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972). Is preferred. If necessary, a drug such as 3 / 3-indolylacrylic acid can be added in order to make the promoter work efficiently.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia
  • the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ⁇ for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • Burkholder's minimal medium Bostian, KL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980) SD medium containing 0.5% casamino acid
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. Cultivation is usually carried out at about 20 to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the culture medium When culturing an insect cell or a transformant in which the host is an insect, the culture medium may be Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). What added the additive suitably is used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • MEM medium containing 3% to 20% fetal bovine serum [3 ( ⁇ 66, 122, 501 (1952)]]
  • DMEM medium [Viology, 8, 396 (1959)]
  • RPMI 164 0 medium The Journal of the Amer ican Medical Association 199, 519 (1967)]
  • the pH is about 6-8.
  • Culture is usually performed at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the protein of the present invention can be produced in the cell, in the cell membrane, or outside the cell of the transformant.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and then sonicated, lysozyme and Z or freeze-thawed. After the cells or cells are destroyed, a method of obtaining a crude protein extract by centrifugation or filtration is suitably used.
  • a protein modifier such as urea or hydrochloric guanidine in the buffers may contain a surfactant such as preparative Litton X- 1 0 0 TM.
  • the protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be purified by appropriately combining known separation and purification methods.
  • known separation and purification methods include: , Methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly using differences in molecular weight.
  • Methods that use differences in charge such as chromatography, methods that use specific affinity such as affinity chromatography, methods that use differences in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography, and isoelectric focusing.
  • the protein thus obtained when obtained in a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, the protein obtained in a salt In such a case, it can be converted to a free form or another salt by a method known per se or a method analogous thereto.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein modifying enzyme for example, trypsin, 'chymotrypsin, arginylendopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by enzyme immunoassay using a specific antibody, Western blotting, or the like.
  • the antibody against the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention is any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention. You may.
  • An antibody against the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof uses the protein of the present invention as an antigen, It can be produced according to a known antibody or antiserum production method.
  • the protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or a diluent at a site capable of producing an antibody upon administration.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • Examples of the warm-blooded animal to be used include monkeys, rabbits, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared by collecting a spleen or a lymph node and fusing the antibody-producing cells contained therein with myeloma cells of the same or different species.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene daricol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
  • the myeloma cells include, for example, myeloma cells of warm-blooded animals such as NS_1, P3U1, SP 2/0, and AP-1. P3U1 is preferably used.
  • ⁇ Antibody-producing cell used The preferred ratio between the number of spleen cells) and the number of myeloma cells is about 1 ::! To 20: 1, and PEG (preferably, PEG 1000 to PEG 6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. By incubating at 40 ° C, preferably 30 to 37 for 1 to 10 minutes, cell fusion can be carried out efficiently.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma for example, adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase (eg, a microplate) onto which a protein antigen is directly or adsorbed together with a carrier. Then, add an anti-immunoglobulin antibody (anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mice) or protein A labeled with a radioactive substance or enzyme, and bind to the solid phase.
  • a solid phase eg, a microplate
  • an anti-immunoglobulin antibody anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mice
  • protein A labeled with a radioactive substance or enzyme for example, adding an anti-immunoglobulin antibody (anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mice) or protein A labeled with a radioactive substance or enzyme, and bind to the solid phase.
  • a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which anti-immunoglobulin antibody or protein A has been adsorbed, adding a protein labeled with a radioactive substance or an enzyme, etc. Such as the method of detecting the force S.
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminobuterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminobuterin, thymidine
  • any medium that can grow hybridomas can be used. good.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )
  • GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum
  • SFM-101 serum-free medium for hybridoma culture
  • the culture temperature is usually from 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the bovine serum described above.
  • Monoclonal isolation and purification can be performed by methods known per se, for example, immunoglobulin separation and purification [eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric point precipitation, electrophoresis, ion exchanger (eg, DEAE) ), Specific centrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase or specific purification method in which the antibody is collected using an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bond is dissociated to obtain the antibody. You can do it.
  • immunoglobulin separation and purification eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric point precipitation, electrophoresis, ion exchanger (eg, DEAE)
  • Specific centrifugation gel filtration, antigen-binding solid phase or specific purification method in which the antibody is collected using an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bond is dissociated to obtain the antibody. You can do it.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced by a method known per se or a method analogous thereto. For example, an immunizing antigen (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier-protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting the antibody-containing substance against the protein and separating and purifying the body.
  • the type of carrier-protein and the mixing ratio of carrier-hapten are determined by antibody against hapten immunized by cross-linking with carrier-1.
  • any material may be crosslinked at any ratio.
  • serum serum albumin, psiloglopurine, hemocyanin, etc. may be used in a weight ratio of about 0.1 to 1 for hapten.
  • a method of coupling at a rate of 1 to 20, preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents must be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • an active ester reagent containing a thiol group, a dithioviridyl group, or the like can be used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production is possible or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be carried out according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • a polynucleotide encoding a protein or partial peptide used in the present invention eg, DNA (hereinafter, in the description of antisense polynucleotides, these DNAs may be abbreviated as DNA of the present invention).
  • the antisense polynucleotide having a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of (1) or a part thereof is complementary to or substantially complementary to the base sequence of the DNA of the present invention.
  • Any antisense polynucleotide may be used as long as it has a basic sequence or a part thereof and has an action capable of suppressing the expression of the DNA, but antisense DNA is preferable.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, the entire nucleotide sequence or a part of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention).
  • a base sequence having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology with the base sequence is exemplified.
  • the nucleotide sequence of the portion encoding the N-terminal site of the protein of the present invention for example, , About 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • Sense poly Nucleotide strength (mouth) In the case of an antisense polynucleotide that directs RNA degradation by RNase H, it is at least about 70%, preferably about 80%, complementary to the entire nucleotide sequence of the DNA of the present invention including introns.
  • Antisense polynucleotides having the above, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology are each suitable.
  • an antisense polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a portion thereof Preferably, for example, a base sequence complementary to the base sequence of the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or an antisense polynucleotide having a part thereof (more preferably, a base represented by SEQ ID NO: 2) A base sequence complementary to the base sequence of DNA containing the sequence, or an antisense polynucleotide having a part thereof).
  • the antisense polynucleotide is usually composed of about 10 to 40 bases, preferably about 15 to 30 bases.
  • the phosphate residues (phosphates) of each nucleotide constituting the antisense DNA should be chemically modified such as phosphorothioate, methylphosphonate, and phosphorodithionate. It may be substituted by an acid residue.
  • the sugar (dexoxy report) of each nucleotide may be substituted with a chemically modified sugar structure such as 2, _ ⁇ -methylation, or the base (pyrimidine, purine) may be chemically modified. Any one may be used as long as it hybridizes to DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • antisense polynucleotides that inhibit the replication or expression of the protein gene of the present invention are designed based on the nucleotide sequence information of the DNA encoding the cloned or determined protein. Can be synthesized. Such a nucleotide (nucleic acid) can hybridize with the RNA of the protein gene of the present invention, inhibit the synthesis or function of the RNA, or inhibit the interaction with the protein-related RNA of the present invention. Via It can regulate and control the expression of light protein gene.
  • Polynucleotides that are complementary to a selected sequence of the protein-associated RNA of the present invention, and polynucleotides that can specifically hybridize with the protein-associated RNA of the present invention, are used in vivo and in vitro. It is useful for regulating and controlling the expression of the protein gene of the present invention, and is also useful for treating or diagnosing diseases and the like.
  • the term "corresponding" means having homology or being complementary to a particular sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids, including genes.
  • nucleotide, base sequence or nucleic acid and a peptide (protein) is defined as the amino acid of the peptide (protein) in the instructions derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement.
  • the terminal palindrome region and the 3 'terminal hairpin loop may be selected as preferred regions of interest, but any region within the protein gene may be selected as the region of interest.
  • the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide complementary to at least a part of the target region is as follows.
  • Antisense polynucleotides are polynucleotides containing 2-dexoxy-D-liposome, polynucleotides containing D-liposome, or other types of N-glycosides of purine or pyrimidine bases. Or other polymers having a non-nucleotide backbone (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds (however, such polymers may be found in DNA or RNA). (Including nucleotides having a configuration that allows base pairing and base attachment as found in). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, as well as unmodified polynucleotides.
  • oligonucleotides as well as those with known modifications, such as those with labels, capped, methylated, one or more natural nucleotides known in the art Is replaced with an analog, in the molecule Nucleotide-modified, eg, having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), charged or sulfur-containing bond (eg, phosphorothioate, Such as proteins (nucleases, nucleases' inhibitors, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) and sugars (eg, monosaccharides) Those having a chain group, those having an intercurrent compound (eg, acridine, zoralen, etc.), those containing chelating compounds (eg, metal, radioactive metal, boron, oxidizing metal, etc.) Containing an alkylating agent, having a
  • Anoma first die nucleic acid may be used.
  • “nucleoside”, “nucleotide” and “nucleic acid” may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or functionalities such as ethers, amines, etc. The base may be changed.
  • the antisense polynucleotide of the present invention is RNA, DNA or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphate derivatives, and polynucleoside amides which are resistant to degradation of polynucleonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. In other words, it makes the antisense nucleic acid more stable in the cell. It makes the antisense nucleic acid more cell-permeable, makes it more compatible with the target sense strand, and if toxic. Reduce the toxicity of antisense nucleic acids.
  • antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, may be provided in special forms such as ribosomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It can be given in additional form.
  • polycations such as polylysine, which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton
  • lipids which increase the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids
  • hydrophobic substances such as phospholipid and cholesterol
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3 'end or the 5' end of the nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • capping groups specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids to prevent degradation by nucleases such as exonuclease and RNase.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the protein of the present invention.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
  • a protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof hereinafter, sometimes abbreviated as the protein of the present invention
  • a polynucleotide encoding the protein or partial peptide of the present invention eg, DNA (hereinafter, referred to as The DNA of the present invention may be abbreviated)
  • an antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof hereinafter, may be abbreviated as the antibody of the present invention
  • an anti-DNA of the present invention Sense polynucleotide (hereinafter referred to as the antisense polynucleotide of the present invention) (May be abbreviated as “nucleotide”).
  • the expression of the protein of the present invention is increased by nervous cell death accompanied by ER stress, and promotes ER stress-dependent cell death.
  • the proteins of the present invention promote cell death (neural cell death) and neurofibrillary tangles.
  • the protein of the present invention binds to Akt1 and inhibits Akt1 activity. Therefore, the protein of the present invention is useful as a marker for early diagnosis, determination of symptom severity, and prediction of disease progression in neurodegeneration, diabetes, cancer, rheumatic diseases and the like.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention a compound or a salt thereof that inhibits the expression of a gene encoding the protein of the present invention, an antisense polynucleotide of the present invention, and a protein of the present invention.
  • Pharmaceuticals containing antibodies can be used, for example, as safe preventive and therapeutic agents for neurodegenerative diseases, diabetes and its complications.
  • a compound or a salt thereof that promotes the activity of the protein of the present invention a compound or a salt thereof that promotes the expression of a gene encoding the protein of the present invention, the protein of the present invention, and the DNA of the present invention include For example, it can be used as a safe prophylactic / therapeutic agent for cancer, rheumatic diseases and the like.
  • the expression of the protein of the present invention is increased by nervous cell death accompanied by ER stress, and promotes ER stress-dependent cell death.
  • the protein of the present invention binds to Aktl, a key molecule regulating IGF-1 / insulin signal, which plays an important role in maintaining survival of neuronal cells and phosphorylation of tau, and activates Aktl activity. Inhibition of tau leads to hyperphosphorylation of tau.
  • the protein of the present invention has a neurofibrillary tangle promotion activity, a nerve cell death promotion activity, and the like.
  • compounds or salts thereof that regulate (inhibit or promote, preferably inhibit) the activity of the protein of the present invention include, for example, neurodegenerative diseases [eg, Aluhimai disease (familial Alzheimer disease, juvenile Alzheimer disease) , Sporadic Alzheimer's disease), Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's chorea, diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.), diabetes and its complications (eg, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, diabetic foot lesion, It can be used safely as a prophylactic and therapeutic agent for pulse sclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc.
  • Aktl activity is enhanced in synovial cells of rheumatoid patients because Aktl activity is enhanced and apoptosis can be induced by suppressing the function of Aktl. It plays an important role in the pathogenesis of rheumatic diseases.
  • compounds or salts thereof that regulate (inhibit or promote, preferably promote) the activity of the protein of the present invention include, for example, cancers (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, Biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, ovarian cancer, blood tumor, etc., rheumatic diseases (eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, gout) Can be used as a safe prophylactic and therapeutic agent.
  • cancers eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, Biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, ovarian cancer, blood tumor, etc.
  • rheumatic diseases eg, rheumato
  • the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that regulates (inhibits or promotes) the activity of the protein of the present invention.
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof that regulates (inhibits or promotes) the activity of the protein of the present invention, which comprises using the protein of the present invention.
  • comparing i) the activity of the protein of the present invention (neurofibrillary tangle change promoting activity, neuronal cell death promoting activity, etc.) with (ii) the activity of a mixture of the protein of the present invention and a test compound.
  • a compound or a salt thereof that regulates (promotes or inhibits) the activity of the protein of the present invention is screened.
  • ( ⁇ ′) when the protein expression vector of the present invention is introduced into a cell and cultured and (ii ′) when the protein expression vector of the present invention is introduced into the cell and the test is performed.
  • immunostaining eg, anti-tau anti- Nerve fibers are stained by a microscope, and the stained images are obtained with a microscope.
  • the activity of promoting neurofibrillary tangles is measured by comparing the degree of the change of the nerve fibers, and compared. Screening for a compound or a salt thereof that regulates (promotes or inhibits) the activity of the enzyme.
  • ⁇ ′ when the protein expression vector of the present invention is introduced into cells and cultured
  • ii ′ when the protein expression vector of the present invention is introduced into cells and When cultured in the presence of a compound, add a cell death inducer (eg, nikkimycin, evening psigargin, 2-deoxydalcos;; 3 amyloid, okadaic acid, homocystine, etc.)
  • a cell death inducer eg, nikkimycin, evening psigargin, 2-deoxydalcos;; 3 amyloid, okadaic acid, homocystine, etc.
  • Akt1 is also Cot (an oncogene found in thyroid cancer cell lines and a member of the mitogen-activated protein kinase kinase kinase family) and IKK (an inhibitor of NF- ⁇ ). Phosphorylation of I ⁇ induces the transcriptional activation of NF-zcB through activation of NF- ⁇ , a kinase that activates the transcription of NF- ⁇ (Mol. Cell. Biol. , Volume 22, 5962-5974, 2002).
  • a protein expression vector of the present invention is introduced into cells together with a NF / B binding sequence together with a repo overnight gene contained in a promoter or enhancer, and if necessary, (a) a microbial cell disruption solution; A culture medium containing a ligand such as a culture supernatant of a microorganism, a lysate of eukaryotic cells, a culture supernatant of eukaryotic cells, or a substance having the same binding activity as (b) the ligand itself or (c) a natural ligand; And if
  • the above-mentioned protein of the present invention those produced by culturing cells having the ability to produce the protein of the present invention and the like are used. Furthermore, a culture solution of the above-mentioned cells, a supernatant thereof, a cell lysate, or the like may be used.
  • a host transformed with a vector containing the above-described DNA encoding the protein of the present invention is used.
  • a host for example, animal cells such as COS 7 cells, CHO cells, and HEK293 cells are preferably used.
  • a transformant that secretes the protein of the present invention extracellularly or expresses it intracellularly by culturing by the above-mentioned method is preferably used.
  • the method for culturing cells capable of expressing the protein of the present invention is the same as the method for culturing the transformant of the present invention described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. ,
  • a test compound that reduces the activity of the protein of the present invention by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the above (ii), (ii ′) , (Ii ") and (ii ') have an activity of about 20% or more, preferably 30% or more, as compared with the above (i), ( ⁇ '), ( ⁇ ') and ( ⁇ ' ').
  • a test compound that increases by at least 50%, more preferably at least about 50%, can be selected as a compound that enhances the activity of the protein of the present invention.
  • the compound having the activity of inhibiting the activity of the protein of the present invention is safe and low toxic, for example, a neurodegenerative disease [e.g., Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease) in order to suppress the physiological activity of the protein of the present invention.
  • a neurodegenerative disease e.g., Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease) in order to suppress the physiological activity of the protein of the present invention.
  • complications eg, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, diabetic foot lesion, dynamic sclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc.
  • the compound having the activity of promoting the activity of the protein of the present invention is safe and low toxic, for example, cancer (eg, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer) in order to enhance the action of the protein of the present invention.
  • cancer eg, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer
  • Compounds or salts thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissues It is a compound selected from extracts, plasma, etc.
  • the salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the peptide of the present invention are used.
  • the gene encoding the protein of the present invention also increases the expression of the gene encoding the protein of the present invention by inducing neuronal cell death accompanied by endoplasmic reticulum stress.
  • the regulating (preferably inhibiting) compound or a salt thereof can be used, for example, as a prophylactic / therapeutic agent for neurodegenerative disease, diabetes and its complications, and can regulate the expression of a gene encoding the protein of the present invention (
  • the compound that promotes (preferably promotes) can be used, for example, as a prophylactic / therapeutic agent for cancer, rheumatic diseases and the like.
  • the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that regulates (inhibits or promotes) the expression of a gene encoding the protein of the present invention. .
  • the screening methods include (iii) culturing cells capable of producing the protein of the present invention, and (iv) culturing cells capable of producing the protein used in the present invention in the presence of a test compound. To make a comparison with And a screening method characterized by the following.
  • the expression level of the gene (specifically, the amount of the protein of the present invention or the amount of mRNA encoding the protein) in the cases (iii) and (iv) is measured and compared.
  • test compound and cells having the ability to produce the protein of the present invention include the same cells as described above.
  • the amount of the protein is measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention, and analyzing the protein present in a cell extract or the like according to a method such as Western analysis, ELISA, or a method analogous thereto. Can be measured.
  • the amount of mRNA can be measured by a known method, for example, Northern hybridization using a nucleic acid containing SEQ ID NO: 2 or a part thereof as a probe, or using SEQ ID NO: 2 or a part thereof as a primer. It can be measured according to the PCR method using the contained nucleic acid or a method analogous thereto.
  • the compound is a compound that inhibits the expression of the gene encoding the protein of the present invention
  • the gene expression level in the case of the above (iv) is about 20% or more, preferably 3% or more of that in the case of the above (iii).
  • a test compound that increases by 0% or more, more preferably about 50% or more, can be selected as a compound that promotes the expression of the gene encoding the protein of the present invention.
  • the screening kit of the present invention contains the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof, or a cell capable of producing the protein or partial peptide used in the present invention.
  • Compounds or salts thereof obtained by using the screening method or screening kit of the present invention include the test compounds described above, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, and plants. It is a compound selected from an extract, an animal tissue extract, plasma, or the like, or a salt thereof, and a compound or a salt thereof that regulates the expression of the gene of the protein of the present invention.
  • the salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
  • Compounds or salts thereof that regulate (preferably inhibit) the expression of the gene encoding the protein of the present invention include, for example, neurodegenerative diseases [eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease] ), Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Croyfeld-Jakob disease, Huntington's disease, diabetic neurobati, multiple sclerosis, etc.), diabetes and its complications (eg, It can be used as a preventive or therapeutic agent for diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, diabetic foot lesions, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc.
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease]
  • Parkinson's disease e.g, Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic
  • Compounds or salts thereof that regulate (preferably promote) the expression of the gene encoding the protein of the present invention include, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract) Cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, ovarian cancer, blood tumor, etc., rheumatic diseases (eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, It can be used as a preventive and remedy for gout.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract
  • Cancer spleen cancer
  • renal cancer bladder cancer
  • uterine cancer testicular cancer
  • testicular cancer thyroid cancer
  • kidney cancer brain tumor
  • ovarian cancer blood tumor
  • blood tumor etc.
  • rheumatic diseases e
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated into a preparation according to a conventional method.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules and the like). ), Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of pharmaceuticals.
  • a carrier diluent or excipient commonly used in the field of pharmaceuticals.
  • lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • compositions for parenteral administration include injections, suppositories, and the like.
  • Injections include intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, intravenous injections, and joint injections. Includes dosage forms such as injections.
  • Such injections may be prepared according to a method known per se, for example, by using the above-mentioned antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or sterile solution usually used for injections. It is prepared by dissolving, suspending or emulsifying in an oily liquid.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents and the like are used, and a suitable solubilizing agent, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol ( Eg, propylene glycol, polyethylene glycol), non-ionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection is usually filled in an appropriate ampoule.
  • Suppositories to be used for rectal administration are prepared by mixing the above antibody or a salt thereof with a conventional suppository base.
  • the above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition is conveniently prepared in the form of a dosage unit so as to conform to the dose of the active ingredient.
  • dosage unit forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg per dosage unit form, especially for injections.
  • the compound contains 5 to 100 mg, and the other dosage forms contain 10 to 250 mg of the above compound.
  • compositions may contain other active ingredients as long as the compound and the above-mentioned compound do not cause an undesirable interaction.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, in humans or in warm-blooded animals (eg, mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, puppies, birds, cats, dogs, Monkeys, chimpanzees, etc.) can be administered orally or parenterally.
  • warm-blooded animals eg, mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, puppies, birds, cats, dogs, Monkeys, chimpanzees, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, route of administration, and the like.
  • the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease and the like.
  • the activity of the protein of the present invention or the gene of the protein When a compound or a salt thereof that inhibits the expression is administered to an adult (with a body weight of 60 kg) usually in the form of an injection, the compound or a salt thereof is used in an amount of about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 3 mg per day. It is convenient to administer 1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg, by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • a compound or its salt that promotes the activity of the protein of the present invention or the expression of the gene of the protein or its salt is orally administered for the treatment of rheumatoid arthritis, it is generally used in adults (with a body weight of 6 O kg). Administers about 0.1 to 10 Omg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound or a salt thereof per day.
  • the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the activity of the protein of the present invention or When a compound or its salt that promotes the expression of the protein gene is administered to an adult (with a body weight of 60 kg) usually in the form of an injection, about 0.01 to 3 Omg of the compound or its salt per day is administered. It is advantageous to administer preferably about 0.:! To 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg by intra-articular injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 6 O kg.
  • an antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) can specifically recognize the protein of the present invention. In particular, it can be used for quantification by sandwich immunoassay.
  • the antibody of the present invention is allowed to competitively react with a test solution and the labeled protein of the present invention, and the ratio of the labeled protein of the present invention bound to the antibody is measured.
  • a method for quantifying the protein of the present invention in a test solution wherein
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the protein of the present invention and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and can also be detected by tissue staining or the like. .
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab' or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the antibody, antigen, or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of protein) in the test solution is measured. Any measurement method may be used as long as the amount is detected by chemical or physical means, and the amount is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, a competitive method, an immunometric method, and a sandwich method are suitably used. From the viewpoint of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the radioisotope e.g., [125 1], [131 1], [3 ⁇ 4], [ "c], etc..
  • the above enzymes large preferably stable and specific activity, e.g., 3 —Galactosidase,) 3-darcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin, etc.
  • the binding of an antibody or an antigen to a labeling agent may be carried out using a biotin- ' A system can also be used.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • the test solution is reacted with the insoluble monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insoluble monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily required to be one type, and two or more types of antibodies are used for the purpose of improving the measurement sensitivity and the like. Mixtures may be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the protein of the present invention binds.
  • the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention
  • the antibody used in the primary reaction is preferably An antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • the competition method after the antigen in the test wave and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) is separated from the labeled antigen (B) bound to the antibody ( BZF separation), B, or F labeling is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody and the like.
  • An immobilized antibody is used as the antibody, or a solid phase immobilization method using a soluble first antibody and an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of the labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the antigen is allowed to react with an excessive amount of the labeled antibody, then the immobilized antigen is added, and the unreacted labeled antibody is bound to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • the amount of insoluble sediment generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, a laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the system for measuring the protein of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations to those skilled in the art to the ordinary conditions and procedures in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews and documents.
  • the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • a neurodegenerative disease eg, Alzheimer's disease ( Familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's disease, amyotrophic lateral sclerosis, prion's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's chorea, diabetic neuropathy 1, multiple sclerosis, etc.), diabetes and its complications (eg, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, diabetic foot lesion, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc.) Etc., or can be diagnosed as likely to be affected in the future.
  • a neurodegenerative disease eg, Alzheimer's disease ( Familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's disease, amyotrophic lateral sclerosis, prion's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's chorea
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • preparation of antibody rams for use in purifying the protein of the present invention, detection of the protein of the present invention in each fraction during purification, analysis of the behavior of the protein of the present invention in test cells, etc. Can be used for
  • the DNA of the present invention can be used as a probe, for example, in humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, elephants, magpies, cats, dogs, (DNA monkeys, chimpanzees, etc.) can detect abnormalities (genetic abnormalities) in DNA or mRNA that encode the protein of the present invention or partial peptides thereof.
  • a gene whose expression is decreased or whose DNA or mRNA is increased is useful as a diagnostic agent for gene expression such as overexpression.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization ⁇ PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America), Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)) Can be.
  • a neurodegenerative disease eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's disease, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Stammfeld-Jakob disease, Huntington's chorea, diabetic neuropathy, multiple Sclerosis etc.), diabetes and its complications (eg, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, diabetic foot lesions, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc.) It can be diagnosed that the sex is high.
  • the antisense polynucleotide of the present invention which can complementarily bind to the DNA of the present invention and suppresses the expression of the DNA, has low toxicity, and inhibits the function of the protein of the present invention or the function of the DNA of the present invention in vivo.
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's disease, amyotrophic lateral sclerosis Disease, prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's chorea, diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.), diabetes and its complications (eg, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retina)
  • diabetes and its complications eg, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retina
  • As a prophylactic or therapeutic agent for diseases diabetic foot lesions, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc. it can.
  • the above antisense polynucleotide When used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered according to a method known per se.
  • an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, a human or mammalian It can be administered orally or parenterally to (eg, rats, egrets, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the anti The sense polynucleotide can be administered as is or with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant to promote uptake, and administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. Alternatively, they can be aerosolized and administered topically into the trachea as an inhalant.
  • the antisense polynucleotide is formulated alone or in combination with a carrier such as liposome (injection), and is used for intravenous, subcutaneous, It may be administered to a lesion or the like.
  • the dose of the antisense polynucleotide varies depending on the target disease, the subject of administration, the route of administration, and the like.For example, when the antisense polynucleotide of the present invention is administered for the treatment of Alzheimer's disease, For an adult (body weight 60 kg), the antisense polynucleotide is administered at about 0.1 to 10 O mg per day.
  • the antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence or expression of the DNA of the present invention in tissues or cells.
  • the present invention also includes a double-stranded RNA containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention, a lipozyme containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention, and the like. Gene expression, and the function of the protein used in the present invention or the DNA used in the present invention in vivo can be suppressed.
  • Alzheimer's disease familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.
  • Parkinson's disease Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's disease , Diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.
  • diabetes and its complications eg, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, diabetic foot lesion, arteriosclerosis, hypertension It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for shosho, hyperlipidemia, etc.).
  • Double-stranded RNA can be designed and manufactured based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
  • the lipozyme can be designed and manufactured based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, pp. 221, 2001). For example, it can be produced by linking a known lipozyme to a part of RNA encoding the protein of the present invention.
  • a part of the RNA encoding the protein of the present invention includes a portion (RNA fragment) adjacent to the cleavage site on the RNA of the present invention which can be cleaved by a known lipozyme.
  • RNA or lipozyme When the above double-stranded RNA or lipozyme is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered in the same manner as an antisense polynucleotide.
  • Antibodies of the present invention having an activity of neutralizing the activity of the protein of the present invention include, for example, neurodegenerative diseases [eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.) , Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's chorea, diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.), diabetes and its complications (eg, diabetic It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, diabetic foot lesions, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc.).
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.)
  • Parkinson's disease Down's syndrome
  • amyotrophic lateral sclerosis
  • the antibodies of the present invention can be administered by themselves or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the administration contains the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules and the like). ), Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Powerful compositions are prepared by known methods and contain carriers, diluents or excipients commonly used in the pharmaceutical field. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • compositions for parenteral administration include, for example, injections, suppositories, etc., which are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, intravenous, etc. Include shapes.
  • injections are prepared according to known methods, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily solution usually used for injections.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants, and the like, suitable solubilizing agents, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50mol) adduc t of hydrogenated castor oil)] .
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, Propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50mol) adduc t of hydrogenated castor oil)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule
  • the above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition is conveniently prepared in the form of a dosage unit so as to conform to the dose of the active ingredient.
  • dosage unit forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg per dosage unit form, especially for injections.
  • the antibody contains 5 to 100 mg, and other dosage forms contain 10 to 250 mg of the above antibody.
  • compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • the prophylactic / therapeutic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention has low toxicity, and is used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form, in humans or mammals (eg, rat, porch egret, sheep, bush). Can be administered orally or parenterally (eg, intravenously) to mice, cats, cats, dogs, monkeys, etc.). The dosage varies depending on the administration target, target disease, symptoms, administration route, etc.
  • the antibody of the present invention is used in a single dose, usually about O.OlS Omg / kg body weight, preferably about 0.1 to 1 Omg / kg body weight, and more preferably about 0.1 to 1 Omg / kg body weight. It is convenient to administer about 0.1 mg of SmgZkg body weight as an injection about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent dose can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased accordingly.
  • the antibody of the present invention may be used, for example, for neurodegenerative diseases [eg, Alzheimer's disease (family Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic lateral cord Sclerosis, prion disease, Croyfeld-Jakob disease, Huntington's chorea, diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.), diabetes and its complications (eg, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic) It is also useful as a diagnostic agent for retinopathy, diabetic foot lesions, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc.). (6) DNA transfer animal
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease (family Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic lateral cord Sclerosis, prion disease, Croyfeld-Jakob disease, Huntington's chorea,
  • the present invention relates to a DNA encoding the exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • a non-human mammal having the formula:
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof can be used for non-fertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like.
  • the calcium phosphate method, the electric pulse method, the ribofect It can be produced by transferring the target DNA by the shion method, aggregation method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, or the like.
  • the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and can be used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • the DNA transgenic animal of the present invention can also be produced by fusing the cells with the above-mentioned germ cells by a cell fusion method known per se.
  • non-human mammal for example, red sea lions, bushes, higgins, goats, night egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats and the like are used.
  • rodents with relatively short ontogeny and biological cycle in terms of the creation of disease animal model systems, and easy to breed rodents especially mice (for example, C57BL / 6 strains and DBA2 strains as pure strains)
  • mice for example, C57BL / 6 strains and DBA2 strains as pure strains
  • rat eg, Wistar, SD etc.
  • Examples of the "mammal" in the recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers to the DNA of the present invention once isolated and extracted from a mammal, not the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal.
  • mutant DNA of the present invention those in which a mutation (for example, mutation) has occurred in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition of base, deletion, substitution with another base, etc. DNA that has been used is used, and abnormal DNA is also included.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention, and for example, a DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal of the same or different species as the animal of interest.
  • a DNA construct comprising the human DNA of the present invention bound downstream of various promoters capable of expressing DNA from various mammals (eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.)
  • various mammals eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • a DNA-transferred mammal that highly expresses the DNA of the present invention can be produced by microinjecting a DNA into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg.
  • Examples of the expression vector of the protein of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacterium phage such as ⁇ phage, a retrovirus such as Moroni leukemia virus, a vaccinia virus or a baculovirus. Animal viruses such as viruses are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • promoters that regulate the expression of DN ⁇ include, for example, (i) DNA promoters derived from viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.).
  • viruses eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.
  • Mouth motors (ii) promoters derived from various mammals (humans, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.), for example, albumin, insulin II, peroplaskin II, Erasuyuze, erythropoietin , Endoselin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, daltathione S-transferase, platelet-derived growth factor] 3, keratins Kl, K10 and K14, collagen type I and II, cyclic AMP-dependent protein Kinase j3 I Subunit, Distro , Tartrate-resistant alfa rifos datase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor thymic synthase (generally abbreviated as Tie 2), sodium potassium adenosine triphosphatase (Na, K-ATP) ase), neurofilament
  • cytomegalovirus promoter capable of high expression throughout the whole body
  • a human peptide chain elongation factor 1a (EF-1 ⁇ ) promoter a human and a chicken / 3-actin promoter, and the like are preferable.
  • the vector preferably has a sequence that terminates transcription of the target messenger R ⁇ ⁇ in a DNA-transferred mammal (generally called terminator), for example, from a virus and from various mammals.
  • terminator a DNA-transferred mammal
  • the DNA sequence of each of the above can be used, and preferably, the SV40 virus of the simian virus is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of eukaryote A, etc. are placed 5 'upstream of the promoter region and the promoter region in order to further express the desired foreign DNA. It is also possible to link between the translation region and the translation region or downstream of the translation region, depending on the purpose.
  • the normal translation region of the protein of the present invention is derived from liver, kidney, thyroid cells, and fibroblasts derived from humans or various mammals (eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, Hamichi Yu, rats, mice, etc.). All or part of genomic DNA from DNA and various commercially available genomic DNA libraries, or complementary DNA prepared by known methods from liver, kidney, thyroid cells, and fibroblast-derived RNA as raw materials You can do it.
  • a foreign abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating a normal protein translation region obtained from the above-described cells or tissues by a point mutation induction method.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transposed animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated downstream of the above-mentioned promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the progeny of such animals that inherit the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and is subcultured as an animal having the DNA in a normal breeding environment. Can be done.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the DNA transfer indicates that all the offspring of the produced animal have an excessive amount of the exogenous DNA of the present invention in all of the germinal and somatic cells. Means that. The offspring of this type of animal that inherited the exogenous DNA of the present invention have an extraneous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the normal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the protein of the present invention is ultimately promoted by promoting the function of endogenous normal DNA. It may develop hypertension and can be used as a model animal for the disease. For example, using the normal DNA transgenic animal of the present invention to elucidate the pathological mechanism of hyperactivity of the protein of the present invention and diseases associated with the protein of the present invention, and to examine a method for treating these diseases. Is possible.
  • the mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can be used as a preventive or therapeutic agent for diseases related to the protein of the present invention, such as neurodegeneration.
  • Alzheimer's disease familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.
  • Parkinson's disease Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Croyfeld's-Jakob disease, Huntington's disease Disease, diabetic neurobees, frequent Such as diabetic nephropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, diabetic foot lesions, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc. It can also be used for screening tests for preventive and therapeutic agents.
  • the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention was confirmed to stably retain the exogenous DNA by mating, and was subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA. You can do it. Furthermore, the desired foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • the DNA construct with the promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the transfer of DNA means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of the germinal cells and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the endogenous normal DNA is inhibited so that the function of the protein of the present invention is finally inactivated. It can cause type refractory disease and can be used as a model animal for the disease. For example, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the functionally inactive refractory state of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease using the abnormal DNA transgenic animal of the present invention.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention can be used to inhibit the function of a normal protein by the abnormal protein of the present invention in the function-inactive refractory disease of the protein of the present invention. Action).
  • the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released protein of the present invention, the protein or function of the present invention is inactivated.
  • Agents for prevention and treatment of sexually refractory disease such as neurodegenerative diseases (eg, diseases (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis) , Prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's chorea, diabetic neurobati, multiple sclerosis, etc.), diabetes and its complications (eg, diabetic nephropathy, diabetic neurobachi, diabetic retinopathy) It can also be used for screening tests for preventive and therapeutic agents such as diabetic foot lesions, arteriosclerosis, hypertension, and hyperlipidemia.
  • other possible uses of the above two types of DNA transgenic animals of the present invention include, for example,
  • cells of a tissue having DNA are cultured by standard tissue culture techniques, and these are used to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture,
  • a mutein of the present invention isolated and purified and its ⁇ manufacturing the like can be considered c Furthermore, using D NA transgenic animal of the present invention, including the function inertness type inadaptability of the protein of the present invention It is possible to examine clinical symptoms of a disease related to the protein of the present invention, and to obtain more detailed pathological findings in each organ of the disease model related to the protein of the present invention, and to obtain a new therapeutic method. And further contribute to the research and treatment of secondary diseases caused by the disease.
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention. 6) a non-human mammal described in the item,
  • a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is an artificially mutated DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, which suppresses the expression ability of the DNA, Alternatively, the DNA substantially does not have the ability to express the protein of the present invention by substantially losing the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention). This may be referred to as a non-human mammalian embryonic stem cell (hereinafter abbreviated as ES cell).
  • ES cell non-human mammalian embryonic stem cell
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the method for artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared by, for example, shifting the reading frame of a codon or disrupting the function of a promoter or exon by these mutations.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal to be isolated is isolated and its exon portion is a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or lacZ (3_galactosidase enzyme), cat DNA sequence that disrupts the function of exons by inserting a repo overnight gene represented by (gloramphenicylacetyltransferase gene), or terminates gene transcription in the intron between exons.
  • a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or lacZ (3_galactosidase enzyme)
  • cat DNA sequence that disrupts the function of exons by inserting a repo overnight gene represented by (gloramphenicylacetyltransferase gene), or terminates gene transcription in the intron between exons.
  • the resulting A DNA chain having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene (hereinafter abbreviated as targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the obtained ES cell
  • targeting vector a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene
  • the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, the DNA sequence on the targeting vector and the DNA sequence on the targeting vector and the DNA of the neighboring region other than the DNA of the present invention used for the preparation of the evening targeting vector It can be obtained by analyzing by the PCR method using the sequence as a primer and selecting the knockout ES cells of the present invention.
  • ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established may be used as described above, and the methods described in the known Evans and Kaufnia methods may be used. A newly established one may be used. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, it is an alternative pure immunological and genetic background.
  • BDFi mice C57BL / 6 and DBA
  • the BDFi mouse can be used satisfactorily because it has a high number of eggs collected and the eggs are strong, and it has C57BLZ6 mice as a background.
  • ES cells obtained by using C57BLZ6 can be used to advantage in that when a disease model mouse is created, the genetic background can be replaced by C57BLZ6 mice by backcrossing with C57BLZ6 mice. .
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. Early embryos can be obtained.
  • male ES cells are generally more convenient for producing a germ line chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • An example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR.
  • this method conventionally, for example G-banding method, requires about 10 6 cells for karyotype analysis, than suffices ES cell number of about 1 colony (about 50),
  • the primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by discriminating between male and female, and the early stage of culture can be greatly reduced by enabling early selection of male cells.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good proliferative potential, but must be carefully subcultured because they tend to lose their ontogenetic potential.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblasts
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5%
  • LIF 1-1 000 OU / ml
  • trypsin ZEDTA solution usually 0.001-0.5% trypsin / 0.1-5 mM EDTA (Preferably, about 0.1% trypsin / ImMEDTA)
  • Such subculture is usually performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells, and if morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
  • ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions.
  • monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention may be obtained, for example, by introducing the targeting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell.
  • the DNA of the present invention can be knocked out by homologous recombination in which the A sequence replaces the DNA of the present invention on the chromosome of a mouse embryonic stem cell or mouse egg cell by homologous recombination.
  • Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be used for Southern hybridization analysis or DNA sequences on the getter vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe.
  • the DNA can be determined by PCR using the DNA sequence of the mouse-derived neighboring region other than the DNA of the present invention used for the targeting vector as a primer.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell is used, a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cell is cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage.
  • the chimeric embryo is injected into a human mammalian embryo or blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both a normal cell having the DNA locus of the present invention and an artificially mutated cell having the DNA locus of the present invention.
  • all the tissues are more artificial than the population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the DNA locus of the present invention in which a mutation has been added to, for example, by judging coat color.
  • the individual obtained in this manner is usually an individual having a heterozygous expression of the protein of the present invention, which is crossed with an individual having a heterozygous expression of the protein of the present invention. A homozygous deficient individual can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a getter vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into a nucleus of an egg by a microinjection method.
  • the transgenic non-human mammal of the present invention it can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination of the gene.
  • the germline can be obtained and maintained according to a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, homozygous animals having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that one normal individual and a plurality of homozygous animals are obtained. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, it may be caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. It is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods, because they can serve as a model for the diseases that occur. (7a) A method for screening a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by deficiency or damage of the DNA of the present invention.
  • the present invention comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, and observing and measuring changes in the animal.
  • Diseases caused by, for example, neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's chorea, diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.), diabetes and its complications (eg, diabetic nephropathy, diabetic neurobachi, diabetic retinopathy, diabetic foot lesion, Screening methods for compounds or their salts that have therapeutic and / or prophylactic effects on atherosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc.) Subjected to.
  • Examples of the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention used in the screening method include the same ones
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma, and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound and compared with a non-treated control animal, and the change in each organ, tissue, symptom of disease or the like of the animal is used as an index.
  • the therapeutic and prophylactic effects of the test compound can be tested.
  • Methods for treating a test animal with a test compound include, for example, oral administration and intravenous injection, which are appropriately selected according to the symptoms of the test animal, properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, properties of the test compound, and the like.
  • neurodegenerative diseases e.g., Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Dandrosis, amyotrophic lateral sclerosis, prion Disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Nonntington's disease, diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.), diabetes and its complications (eg, diabetic nephropathy, diabetic neurobachi, diabetic retinopathy, diabetes)
  • the test compound is administered to a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention.
  • the difference between the test compound non-administration group and the number of nerve cell deaths, the difference in the amount of various proteins, and the like are observed over time in the tissue.
  • the disease symptom of the test animal is improved by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more.
  • the test compound can be selected as a compound having a therapeutic-preventive effect on the above-mentioned diseases.
  • the compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, which is caused by deficiency or damage of the protein of the present invention. Since it has a therapeutic and preventive effect on the disease, it can be used as a drug such as a safe and low-toxic preventive and therapeutic agent for the disease. Further, a compound derived from the compound obtained by the above screening can be used in the same manner.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals). And the like, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids, etc.
  • bases eg, alkali metals
  • physiologically acceptable acid addition salts examples include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfur
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, in humans or mammals (for example, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bush, horses, horses, cats, animals And monkeys and monkeys).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.
  • Alzheimer's disease of an adult with a body weight of 60 kg
  • about 0.1 to about 00 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound is administered per day.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the compound is usually administered in the form of an injection to an adult (with a body weight of 60 kg) of an Alzheimer's disease patient.
  • the present invention relates to a compound which promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention and detecting the expression of a reporter gene. It provides a method for screening the salt.
  • the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention, wherein the DNA of the present invention is obtained by introducing a repo overnight gene. Those inactivated and capable of expressing the repo overnight gene under the control of the promoter for the DNA of the present invention are used.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • the repo overnight gene is present under the control of the promoter for the DNA of the present invention.
  • the activity of the promoter can be detected by tracing the expression of the substance encoded by the promoter.
  • the tissue of the present invention that originally expresses the protein of the present invention may 0-galactosidase is expressed instead of the protein. Therefore, for example, by staining with a reagent that serves as a substrate for iS-galactosidase, such as 5-bromo- 4-chloro-3-indolyl-1- / 3-galactopyranoside (X-gal), it is easy to perform staining. The state of expression of the protein of the present invention in an animal body can be observed.
  • a reagent that serves as a substrate for iS-galactosidase such as 5-bromo- 4-chloro-3-indolyl-1- / 3-galactopyranoside (X-gal
  • the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with daltaraldehyde, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga1 at room temperature or at 37 ° C. After reacting for about 3 Q min. By washing with PBS solution of EDTA, the reaction of] -galactosidase can be stopped and the coloration can be observed. Further, mRNA encoding 1 ac Z may be detected according to a conventional method.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, alkali metal And the like, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids
  • bases eg, alkali metal And the like, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydro
  • the compound or its salt that promotes or inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention or the salt thereof can regulate the expression of the protein of the present invention and regulate the function of the protein, for example, a neurodegenerative disease (eg, Alzheimer's disease) (Familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, thoroughfeld-Jakob disease, Huntington's chorea, diabetic neuropathy 1, multiple sclerosis, etc.), diabetes and its complications (eg, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, diabetic foot lesions, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia It is useful as a prophylactic and therapeutic agent.
  • a neurodegenerative disease eg, Alzheimer's disease
  • Parkinson's disease e.g, Parkinson's disease
  • Parkinson's disease e.g, Parkinson's disease
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example Alternatively, it can be administered to mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, horses, horses, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • mammals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, horses, horses, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.
  • a compound that inhibits the promoter activity against DNA of the present invention is orally administered, it is generally used.
  • an adult assuming a body weight of 60 kg
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • a compound that inhibits the promoter activity of DNA of the present invention is usually administered in the form of an injection to an adult.
  • Alzheimer's disease at a dose of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg of the compound per day by intravenous injection. It is convenient to administer. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter of the DNA of the present invention.
  • the present invention can greatly contribute to investigating the cause of various diseases caused by insufficient DNA expression or developing preventive and therapeutic agents.
  • a gene encoding a variety of proteins is ligated downstream using a DNA containing the promoter region of the protein of the present invention, and this is injected into an egg cell of an animal to produce a so-called transgenic animal (gene transfer). Animal), it becomes possible to specifically synthesize the protein and examine its effects on living organisms. Furthermore, by binding an appropriate reporter gene to a portion of the promoter and establishing a cell line that expresses the promoter, an effect of specifically promoting or suppressing the in vivo production ability of the protein of the present invention itself. It can be used as a search system for low molecular weight compounds with. ⁇
  • the protein of the present invention binds to Aktl and inhibits Aktl activity. Therefore, when the DNA encoding the protein of the present invention is abnormal or defective, or when the expression level of the protein of the present invention is reduced, for example, cancer (eg, colorectal cancer, breast cancer, Lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, ovarian cancer, blood tumor, etc.), rheumatism Various diseases develop, such as sexual diseases (eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, gout, etc.).
  • cancer eg, colorectal cancer, breast cancer, Lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor
  • the protein of the present invention and the DNA of the present invention include, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, To be used as a preventive or therapeutic agent for uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, thyroid cancer, brain tumor, ovarian cancer, blood tumor, etc., and rheumatic diseases (eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, gout, etc.) Can be.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer
  • rheumatic diseases eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, gout, etc.
  • the (oral) cells of the present invention are transfected with the DNA of the present invention, and the cells of the present invention are expressed.
  • the role of the protein of the present invention in the patient can be sufficiently or normally exerted by transplanting the protein of the present invention into the patient, or (8) administering the protein of the present invention to the patient.
  • the DNA of the present invention When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, the DNA may be used alone or in an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus vasovirus or the like. Once inserted, it can be administered to humans or warm-blooded animals according to conventional means.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or in the form of a formulation with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and administered with a gene gun or a catheter such as a hide mouth gel catheter.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, the protein is purified to at least 90%, preferably at least 95%, more preferably at least 98%, and even more preferably at least 99%. It is preferable to use those that have been prepared.
  • the protein of the present invention can be used, for example, in the form of tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., which are sugar-coated as required, orally, or with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections, such as sterile solutions or suspensions.
  • the protein of the present invention is mixed with a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, behiggle, preservative, stabilizer, binder, etc. in a unit dosage form generally required for the practice of the formulation.
  • a physiologically acceptable carrier such as peppermint, peppermint, peppermint, peppermint, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, etc.
  • a physiologically acceptable carrier such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • additives examples include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • a leavening agent such as magnesium stearate, a sweetener such as sucrose, lactose or saccharin, and a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil or cherry may be used.
  • a liquid carrier such as oil and fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil or coconut oil. .
  • aqueous solutions for injection examples include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium salt, etc.) and the like.
  • Solubilizers for example, alcohols (eg, ethanol, etc.), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, Polysorbate 80 TM, HCO-50, etc.) ) May be used together.
  • the oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, hydrochloride proforce, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • Preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • You may mix
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the vector into which the DNA of the present invention has been inserted is also formulated in the same manner as described above, and is usually used parenterally.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, warm-blooded animals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, horses, cats, cats) , Dogs, monkeys, chimpanzees, etc.).
  • warm-blooded animals eg, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, horses, cats, cats
  • the dose of the protein of the present invention varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.
  • the protein of the present invention is orally administered for the purpose of treating rheumatoid arthritis, it is generally used for adults ( (With a body weight of 6 O kg), the protein is administered at about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg per day.
  • the single dose of the protein varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the protein of the present invention is administered in the form of an injection to an adult (As a body weight of 60 kg), about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg of the protein per day is administered to the affected area. It is convenient to administer. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC- IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below.
  • amino acids can have optical isomers, the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • dATP 'triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate ATP Adenosine triphosphate
  • NIPK neuronal cell death inducible putative kinase
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 3.
  • GenBank Accession No. NM021158 The nucleotide sequence of GenBank Accession No. NM021158 is shown.
  • amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 is shown.
  • amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 is shown.
  • amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 is shown.
  • amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 is shown.
  • amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 is shown.
  • amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 is shown.
  • GenBank Accession No. AF250311 The nucleotide sequence of GenBank Accession No. AF250311 is shown.
  • amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19 is shown.
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 4.
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 4.
  • Example 6 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 5.
  • Example 6 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 5.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 5.
  • the present invention will be more specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
  • Example 1 The following experiments were performed to clarify the genes whose expression fluctuates due to endoplasmic reticulum stress.
  • TP-17 CD rats Primary rat neurons prepared from TP-17 CD rats (Charles River Japan) were suspended in a type I collagen-coated 24-well plate (SUMIL0N) in Neurobasal medium containing B27 (NB medium: GIBC0), and then 250,000. Individuals were inoculated with Zwell and cultured for 3 days.
  • Tabcigargin is added to the above cultured cells to a final concentration of 2 nM, or (iii) The cultured cells are exchanged twice with glucose-free DMEM medium containing B27 to become 3 mM. 2-Doxyglucose (2DG) was added, and after 4, 8 and 24 hours, respectively, total RNA was extracted from the cells using RNeasy Mini kit (Qiagen) according to the experimental manual. As a control, instead of the above drugs (Tnc, Thap and 2DG), cells to which each medium was added (cells to which no drug was added) were used. Using these as materials, gene expression analysis was performed using an oligonucleotide microarray (Rat Genome U34A; Affymetrix).
  • Example 2 Primary rat neurons prepared in the same manner as in Example 1 were suspended in N2-containing DMEM medium (GIBC0). After turbidity, the cells were seeded at 250,000 cells / well and cultured for 4 days. After the culture, iQ amyloid suspended in the above medium was added to a final concentration of 25 ⁇ , and after 4, 8, and 24 hours, total RNA was extracted from the cells and subjected to gene analysis as in Example 1. As a control, cells to which the above medium was added in place of] 3 amyloid were used. NIPK expression was enhanced in cells stimulated with; 8 amyloid compared to controls (Table 2). '
  • NIPK gene-expressing cells were prepared using transient transduction and used in a cell death induction system.
  • Tabcigargin was added to human neuroblastoma SK-N-AS cells (purchased from ATCC) to a final concentration of 500 nM and cultured for 8 hours. After culturing, total RNA was extracted using IS0GEN (Futtsubon Gene). Using the obtained total RNA as type II, RNA PCR kit
  • Reverse transcription was performed using (TA ARA).
  • PCR was performed using the synthetic primer (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4) and Pfu turbo (Stratagene) as an enzyme under the following conditions (1) to (5). This gave a specific PCR product.
  • the obtained PCR product was cloned into PCDNA3 / V5_His T0P0 (Invitrogen) to transform Escherichia coli DH5.
  • the obtained colonies were cultured in an LB medium, and the vector was recovered using QUAGEN plasmid plasmid (Qiagen).
  • This NIPK gene expression vector was transduced into SK-N-AS cells using Nucleofector (AMAXA).
  • AMAXA Nucleofector
  • SK-N-AS cells were transduced with PCDNA3.1 (Invitrogen).
  • Each transduced cell was seeded in a type I collagen-coated 96-well plate (IWAKI) at 7500 Z-wells.After 1-well culture, tunicamycin or tabcigargin was added at various concentrations and cultured for 1 or 2 days to kill cells. Induced. After culturing, DM cleavage accompanying cell death was detected using CELL DEATH DETECTION ELISA PLUS kit (Roche). The experimental method followed the experimental manual attached to the kit.
  • rat NIPK gene-expressing cells were prepared using a lentivirus and used in a cell death induction system.
  • Rat hippocampal neurons were supplemented with tunicamycin to a final concentration of 100 nM and cultured for 8 hours. After the culture, total RNA was extracted from the cells using RNeasy Mini kit (Qiagen). Using the obtained total RNA as type I, a reverse transcription reaction was performed using RNA PCR kit (TAKARA). Synthetic primer for amplification of rat NIPK gene
  • PCR was performed under the following conditions (1) to (3) to obtain a specific PCR product. .
  • the obtained PCR product was cloned into the pLenti6 / V5-TOP0 vector using the viraPower Lentiviral Directional TOPO Expression Kit (INVITR0GEN), and E. coli DH5Q! Was transformed.
  • the obtained colonies were cultured in an L.B medium, and the vector was recovered using QIAGEN endofreemai kit (Qiagen).
  • Qiagen QIAGEN endofreemai kit
  • HEK293FT cells (Invitrogen) were introduced at the same time. The medium was replaced 24 hours later, and the culture supernatant was recovered 48 and 72 hours after the introduction. The collected culture supernatant was centrifuged at 40,000 ⁇ g for 4 hours, and the precipitate was dissolved in a 1/100 volume of neurobasal medium, left overnight at 4 ° C., and heated to 37 ° C. before use.
  • AMAXA Nucleofector
  • hippocampal neurons were isolated according to a standard method, and seeded at 250,000 cells / well in a poly J-gin coated 24-well plate (SUMIL0N).
  • 5001 medium containing lentivirus (equivalent to 50 ml of culture supernatant) was added, and 24 hours later, the whole amount was replaced with a medium containing 3 nM evening psigargin.
  • 1/10 of the medium was added to WST-8, and the cells were cultured at 37 for 90 minutes. Then, 200 1 of the medium was collected and the absorbance at 450 nm was measured.
  • Fig. 5 shows the results.
  • rat NIPK transgenic cells showed reduced mitochondrial respiratory activity. This clearly shows that NIPK has a cell death promoting effect.
  • Human NIPK (Example 3) cloned into the pCDNA3.1- / V5-His T0P0 (Invitrogen) vector was used as type III, with synthetic primers (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 23) and an enzyme. Using Pfu turbo (Stratagene), PCR was performed under the following conditions (1) to (3) to obtain specific PCR products.
  • the obtained PCR product was cloned into PCDNA3.1- / V5-HisTOPO (Invitrogen), and E. coli DH5Q: was transformed.
  • the obtained colonies were cultured in an LB medium, and a human NIM gene expression vector with a V5 tag was recovered using a QIAGEN endofree maxi kit (Qiagen).
  • the Aktl gene expression vector was prepared by the following method. Using Quick-clone human whole brain cDNA (Clontech) as type III, using primers (SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25) and Pfu turbo (Stratagene) as enzyme, the following (1) to (3) PCR was performed under the following conditions.
  • PCR was carried out using the same synthetic primers and enzymes under the following conditions (1) to (3) to obtain a specific PCR product.
  • the obtained PCR product was cloned into PCDNA3.1- / V5-HiSTOP0 (Invitrogen) to transform E. coli DH5Q !.
  • the obtained colony was cultured in LB medium, and the vector was recovered using QIAGEN endofree maxi kit (Qiagen).
  • the human NI PK gene expression vector and Ak11 gene expression vector with V5 fragment obtained above were simultaneously introduced into C0S7 cells using Nucleofector (AMAXA).
  • the cells were seeded at 4 million cells / dish in a 10 cm dish coated with type I collagen and cultured at 37 ° C for 18 hours. After removing the medium and collecting the cells, the cells were suspended in lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH7.5) 150 mM NaCl, 0.5% NonidetP-40, 1 mM j3-mercaptoet anoK protease inhibitor cocktail (ROCHE)). Cells were disrupted with a homogenizer.
  • lysis buffer 50 mM Tris-HCl (pH7.5) 150 mM NaCl, 0.5% NonidetP-40, 1 mM j3-mercaptoet anoK protease inhibitor cocktail (ROCHE)
  • Fig. 6 shows the results.
  • Akt1 is detected when NIPK with V5 tag and Aktl are expressed simultaneously, whereas Aktl is detected when GFP (Wako Pure Chemical) and Aktl are expressed simultaneously (control group). Did not. From this, it was confirmed that NIPK and Aktl bind in the cells. It is suggested that the binding between NIPK and Aktl causes a decrease in Aktl activity, and promotes neuronal cell death through suppression of the neuronal protective action of Aktl. Therefore, treatment of neurodegenerative diseases can be expected by inhibiting NIPK. Industrial applicability
  • neurodegenerative diseases include, for example, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), Parkinson's disease, Down's syndrome , Amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Huntington's disease, diabetic neuropathy, multiple sclerosis, etc.], diabetes and its complications (eg, diabetic nephropathy, diabetic neuropathy) 1, diabetic retinopathy, diabetic foot lesion, arteriosclerosis, high blood As a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as hypertension, hyperlipidemia, etc., and a compound or a salt thereof which promotes the activity of the protein, a compound or a salt thereof which promotes the expression of a gene of the protein, Polynucleotides encoding proteins include, for example, cancers (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer,

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Abstract

　本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、該タンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、本発明の抗体などは、神経変性疾患、糖尿病などの予防・治療剤として使用することができ、本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩、該タンパク質の遺伝子の発現を促進する化合物などは、癌、リウマチ性疾患などの予防・治療剤として使用することができる。

Description

明細 書 神経変性疾患の予防 ·治療剤 '技術分野
本発明は、 神経変性疾患の予防'治療剤および診断薬などに関する。 さらに 詳しくは、 糖尿病、 癌、 リウマチ性疾患の予防 ·治療剤、 診断薬、 該予防 -治 療剤のスクリーニングなどに関する。 背景技術
アルツハイマー病 （Al zhe imer's d i sease) は進行性痴呆および認知能力の失 調を伴う神経変性疾患の代表的なものであるが、 これまでに効果的な治療法は 見出されていない。 アルツハイマー病は高齢化社会を迎えつつある現在におい て最も重要な疾患の一つであることは言うまでもなくその治療薬の開発は医療 経済的にも極めて大きな意義を有する。
一方、 ヒ一トショックゃグルコース飢餓などタンパク質の生合成に影響を与 える因子により小胞体に異常タンパク質が蓄積し、 小胞体にストレスがかかる ことが知られている (小胞体ストレス) 生体に小胞体ストレスがかかると、 シャペロン分子をはじめとする小胞体ストレス応答遺伝子群が発現し、 異常夕 ンパク質を修復または分解し、 恒常性の維持を行なう。
近年、 種々の神経変性疾患と小胞体ストレスとの関連性が重要視されるよう になった。 遺伝性のパーキンソン氏病である常染色体劣性遺伝性若年性パ一キ ンソニズム （AR-JP) の病因遺伝子として Parkinが同定され （Nature, 392卷， 605- 608頁， 1998年） 、 タンパク分解系に関与するュビキチンリガ一ゼであるこ とが報告されている （Nat . Genet, 25巻， 302 - 305頁， 2000年） 。 さらに Parkin の基質として Pae l (Parkin as soc i ated endo the l in receptor-l ike) 受容体が 同定された。 この受容体は高次構造形成が困難なタンパク質で、 このタンパク 質の高次構造形成不全体は通常、 速やかに Parkinの作用で分解されるが、 タン パク質分解系を抑制すると、 異常 Pael受容体が小胞体に蓄積し、 その細胞は小 胞体ストレスによる細胞死に陥ることが報告されている （Cell, 105巻， 891- 902頁， 2001年） 。 さらに家族性アルツハイマー病の原因遺伝子であるプレセ二 リン 1の変異を有する細胞が小胞体ストレスに対して脆弱となること、 および、 小胞体ストレス応答に関与する Irelの欠失により i3アミロイドの産生が上昇す ること (Biochem. Biophysic. Acta, 1536巻， 85- 96頁， 2001年； J. Biol.
Chem. , 276卷， 2108- 2114頁， 2001年） が報告されている。
一方、 遺伝子発現を網羅的に解析するために、 cDNAまたはオリゴヌクレオチ ドを固定ィ匕したマイクロアレイ法が開発され、 疾患特異的な遺伝子発現の変化 を見出す技術が普及し、 その有用性が確認されている。 例えば、 Affymetrix社 の GeneChipシステムは癌などの疾患の診断や創薬標的遺伝子の発見に多用され つつある。
Neuronal cell death inducible putative kinase ( IPK) は、 ラット由来 の細胞において NGF飢餓やカルシウムィオノフォア刺激により発現上昇し、 その 翻訳領域にキナーゼドメインを有することが報告されている （BBRC, 258巻， 260-264頁， 1999年）。 最近、 NIPKが転写因子である ATF4と結合し、 転写活性を 制御すること（Oncogene 22卷, 2823-2835頁， 2003年； Experimental Cell Research 286卷， 308-320頁， 2003年） 、 NIPKがインシュリンのシグナル伝達分 子である AkUと結合し、 そのシグナルを負に制御すること （Science 300巻， 1574- 1577頁， 2003年） が報告されている。 AkUのシグナル伝達経路の活性化は、 癌およびリゥマチ性疾患の病態形成に重要な役割を果たしていることが報告さ れている。 癌抑制遺伝子である ΠΕΝは Aktlを不活性化しているが、 多くの癌で は DNA変異により PTENの機能が欠失して Aktlが恒常的に活性化しており、 これが 細胞の癌化と悪性化に重要な役割を果たしている （Nature Reviews Cancer 2 巻， 489-501頁， 2002年） 。 また、 リウマチ患者の滑膜細胞では Aktl活性が亢進 しており、 かつ、 AkUの機能を抑制することによりアポト一シスを誘導できる ことから、 Aktlの活性化が滑膜細胞の増殖を伴うリゥマチ性疾患の病態形成変 化に重要な役割を果たしていることが示唆されている （Arthritis Rheum. 44巻， 1555- 1567頁， 2001年） 。
安全で優れた神経変性疾患または糖尿病などの予防 ·治療剤が求められてい る。 発明の開示
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 小胞体 ストレスを伴う神経細胞死誘導の時に発現が顕著に増加する遺伝子を見出し、 さらに、 該遺伝子が小胞体ストレス依存性の細胞死を促進することも見出し、 これらの知見に基づいて、 さらに検討を重ねた結果、 本発明を完成するに至つ た。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の 活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患または糖尿病 の予防 ·治療剤、
( 2 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の 遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患また は糖尿病の予防 ·治療剤、
( 3 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはそ の一部分を含有するァンチセンスポリヌクレオチド、
( 4 ) 上記 （3 ) 記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
( 5 ) 神経変性疾患または糖尿病の予防 ·治療剤である上記 （4 ) 記載の医
( 6 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドまたはその塩に対 する抗体、
( 7 ) 上記 （6 ) 記載の抗体を含有してなる医薬、
( 8 ) 神経変性疾患または糖尿病の予防 ·治療剤である上記 （ 7 ) 記載の医 (9) 上記 （6) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(10) 神経変性疾患または糖尿病の診断薬である上記 （9) 記載の診断薬、
(1 1) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポ リヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患または糖尿病の診断薬、
(12) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 を用いることを特徴とする、 上記タンパク質もしくはその部分ペプチドまたは その塩の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリ一ニング方法、
(13) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 を含有することを特徴とする、 上記タンパク質もしくはその部分ペプチドまた はその塩の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、 (14) 上記 （12) 記載のスクリーニング方法または上記 （1.3) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩、
(15) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポ リヌクレオチドを用いることを特徴とする、 上記タンパク質遺伝子の発現を阻 害する化合物またその塩のスクリーニング方法、
(16) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポ リヌクレオチドを含有することを特徴とする、 上記夕ンパク質遺伝子の発現を 阻害する化合物またその塩のスクリーニング用キット、
(17) 上記 （15) 記載のスクリーニング方法または上記 （16) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またその塩、
(18) 上記 （14) または （17) 記載の化合物またその塩を含有してな る医薬、
(19) 神経変性疾患または糖尿病の予防 ·治療剤である上記 （18) 記載 の医薬、
(20) 哺乳動物に対して、 上記 （14) または （17) 記載の化合物また その塩の有効量を投与することを特徴とする神経変性疾患または糖尿病の予 防 ·治療法、
(21) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドの活性を阻害す る、 または上記タンパク質遺伝子の発現を阻害することを特徴とする神経変性 疾患または糖尿病の予防 ·治療法、
(22) 神経変性疾患または糖尿病の予防 ·治療剤を製造するための上記 (14) または （17)'記載の化合物またその塩の使用、
(23) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる癌またはリウマチ性疾患 の予防 ·治療剤、
(24) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩を含有してなる癌またはリウマ チ性疾患の予防 ·治療剤、
(25) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有する夕ンパク質またはその部分べプチドまたはその塩を 含有してなる医薬、
(26) 癌またはリウマチ性疾患の予防 ·治療剤である上記 （25) 記載の
(27) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポ リヌクレオチドを含有してなる医薬、
(28) 癌またはリウマチ性疾患の予防 ·治療剤である上記 （27) 記載の
(29) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポ リヌクレオチドを含有してなる癌またはリゥマチ性疾患の診断薬、
(30) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するタンパク質も,しくはその部分ペプチドまたはその塩 を用いることを特徴とする、 上記タンパク質もしくはその部分ペプチドまたは その塩の活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(31) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 を含有することを特徴とする、 上記タンパク質もしくはその部分ペプチドまた はその塩の活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(32) 上記 （30) 記載のスクリーニング方法または上記 （31) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩、
(33) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポ リヌクレオチドを用いることを特徴とする、 上記タンパク質遺伝子の発現を促 進する化合物またその塩のスクリーニング方法、
(34) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポ リヌクレオチドを含有することを特徴とする、 上記タンパク質遺伝子の発現を 促進する化合物またその塩のスクリーニング用キット、
(35) 上記 （33) 記載のスクリーニング方法または上記 （34) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またその塩、
(36) 上記 （32) または （35) 記載の化合物またその塩を含有してな る医薬、
(37) 癌またはリウマチ性疾患の予防 ·治療剤である上記 （36) 記載の
(38) 哺乳動物に対して、 上記 （32) または （35) 記載の化合物また その塩の有効量を投与することを特徴とする癌またはリウマチ性疾患の予防 · 治療法、 ( 3 9 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドの活性を促進す る、 または上記タンパク質遺伝子の発現を促進することを特徴とする癌または リゥマチ性疾患の予防 ·治療法、
( 4 0 ) 癌またはリウマチ性疾患の予防 ·治療剤を製造するための上記 （3 2 ) または （3 5 ) 記載の化合物またその塩の使用などを提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ッニカマイシン刺激 24時間後における細胞の DNA切断量を 0D405-492 で表す図である。 図中、 縦軸は吸光度を、 横軸はッニカマイシンの濃度を示す。 —〇—は対照細胞における DNA切断量を、 —ローは NIPK遺伝子形質導入細胞にお ける DNA切断量を示す。
図 2は、 ッニカマイシン剌激 48時間後における細胞の DNA切断量を 0M05-492 で表す図である。 図中、 縦軸は吸光度を、 横軸はッニカマイシンの濃度を示す。 —〇—は対照細胞における DM切断量を、 —口—は NIPK遺伝子形質導入細胞にお ける MA切断量を示す。
図 3は、 夕プシガーギン刺激 24時間後における細胞の DNA切断量を OD405- 492 で表す図である。 図中、 縦軸は吸光度を、 横軸はタブシガーギンの濃度を示す。 一〇一は対照細胞における DNA切断量を、 —口—は NIM遺伝子形質導入細胞にお ける DM切断量を示す。
図 4は、 タプシガーギン剌激 48時間後における細胞の DNA切断量を OD405- 492 で表す図である。 図中、 縦軸は吸光度を、 横軸はタブシガーギンの濃度を示す。 —〇一は対照細胞における DNA切断量を、 —ローは NI 遺伝子形質導入細胞にお ける DNA切断量を示す。
図 5は、 タブシガーギン剌激 48時間後における細胞の呼吸活性を OD450で表す 図である。 図中、 縦軸は吸光度を、 横軸には導入遺伝子を示す。
図 6は、 抗 V5抗体で免疫沈降法後、 NIPKと Akt lとの結合を抗 Akt l抗体を用い
：より検出した図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明で用いられる配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質 （以下、 本発明のタンパク質 または本発明で用いられるタンパク質と称することもある） は、 ヒトゃ温血動 物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲル八ンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 線維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラ 一細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） もしくはそれら の細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋などに由来するタンパク 質であってもよく、 合成タンパク質であってもよい。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特 に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するァ ミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (Nat ional Center for Biotechnology Informat ion Bas ic Local Al ignment Search
Tool) を用いて計算することができる。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 1で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好 ましい。 具体的には、 配列番号： 6、 配列番号： 8、 配列番号： 1 0、 配列番 号： 1 2、 配列番号： 1 4、 配列番号： 1 6、 配列番号： 1 8または配列番 号： 2 0で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などが挙げられる。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 神経原線維変化促進活性、 神経細胞 死促進活性などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に
(例、 生理学的に、 または薬理学的に） 同質であることを示す。 したがって、 上記活性が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 1〜1 0倍、 より好ましくは 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度、 タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
神経原線維変化促進活性の測定は、 例えば、 本発明のタンパク質の発現べク 夕一を細胞に導入後、 免疫染色法 （例、 抗タウ抗体などを使用） により神経線 維を染色し、 その染色像を顕微鏡により取得し、 神経線維の変化の程度を測る ことにより、 測定できる。
神経細胞死促進活性の測定は、 例えば、 本発明のタンパク質の発現ベクター を細胞に導入し、 細胞死誘導剤 （例、 ッニカマイシン、 タブシガーギン、 2 -デ ォキシグルコース、 j3アミロイド、 オカダ酸、 ホモシスティンなど） を添加し た後、 力ルセイン染色を用いた軸索の変性量、 ミトコンドリアの呼吸活性、 培 養上清中の LDH (lactate dehydrogenase) 量、 または細胞死に伴う DNA切断量な どを測ることにより、 測定できる。
また、 本発明で用いられるタンパク質としては、 例えば、 （1 ) ω 配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 1 0 0個程 度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましく は数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （i i) 配列番号： 1 で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ま しくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1 〜5 ) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （i i i) 配列番号： 1で表され るアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1 〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 1で表されるァ ミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または （V) それらを組 み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムティンも含ま れる。
上記のようにアミノ酸配列が揷入、 欠失または置換されている場合、 その揷 入、 欠失または置換の位置としては、 とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、 ぺプチド標記の慣例に従って左端が N末端 (ァミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 配列番号： 1で 表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、 本発明で用い られるタンパク質は、 C末端が力ルポキシル基 （- C00H) 、 カルボキシレート（- COO') 、 アミド （_C0NH2) またはエステル （-C00R) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピ ル、 イソプロピル、 n一ブチルなどの C wアルキル基、 例えば、 シクロペンチ ル、 シクロへキシルなどの C 3_8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナ フチルなどの C 6— 12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエニル 一 C Mアルキル基もしくはひ一ナフチルメチルなどの a一ナフチル— (：卜2アル キル基などの C 7— 14ァラルキル基、 ビバロイルォキシメチル基などが用いられる c 本発明で用いられるタンパク質が C末端以外にカルボキシル基 （またはカル ボキシレート) を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル 化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。 この場合のェ ステルとしては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明で用いられるタンパク質には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基など の C Wアルカノィルなどの ァシル基など） で保護されているもの、 生体内 で切断されて生成する N末端のダル夕ミン残基がピ口ダル夕ミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば一〇H、 一 S H、 アミノ基、 イミ ダゾール基、 インド一ル基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 (例えば、 ホ ルミル基、 ァセチル基などの〇卜6アルカノィル基などの ァシル基など） で 保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複 合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で 表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
本発明で用いられるタンパク質の部分べプチドとしては、 前記した本発明で 用いられるタンパク質の部分ペプチドであって、 好ましくは、 前記した本発明 で用いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでも よい。
具体的には、 後述する本発明の抗体を調製する目的には、 配列番号： 1で表 されるアミノ酸配列において第 1〜3 0番目、 第 2 5 0〜2 8 0番目のァミノ 酸配列を有するペプチドなどがあげられる。 例えば、 本発明で用いられるタン パク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以 上、 さらに好ましくは 7 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上、 最も好まし くは 2 0 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、 本発明で用いられる部分ペプチドは、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好まし ぐは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 ( 1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2 個以上 （好ましくは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さら に好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入され、 または、 そのアミノ酸 配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 より好ましくは数 個、 さらに好ましくは 1〜5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されて いてもよい。
また、 本発明で用いられる部分ペプチドは C末端が力ルポキシル基 （- C00H) カルボキシレ一ト （- C00— ) 、 アミド （- C0NH2) またはエステル （-C00R) の何 れであってもよい。
さらに、 本発明で用いられる部分ペプチドには、 前記した本発明で用いられ るタンパク質と同様に、 C末端以外にカルボキシル基 （またはカルポキシレー ト） を有しているもの、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のアミ ノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したダル 夕ミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換 基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖 ぺプチドなどの複合べプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いるこ とができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、 生理学的 に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などと の塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様 な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マ レイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタン スルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩は、 前述したヒトゃ温血動物の細胞または組織から自体公知の夕ンパク質の精製方 法によって製造することもできるし、 タンパク質をコ一ドする D N Aを含有す る形質転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述の ぺプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織 または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相ク ロマ卜グラフィ一、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー を組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、 または そのアミド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることがで きる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチ ル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一べンジルォキシ ベンジルアルコール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4ーヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル榭脂、 ポリアクリル アミド榭脂、 4— ( 2 '， 4'ージメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル) フエノ キシ樹脂、 4一 ( 2 ', 4'—ジメトキシフエ二ルー Fm o cアミノエチル） フエ ノキシ樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 ひ一アミノ基 と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通り に、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂 からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、 目的のタン パク質もしくは部分べプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種 活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルボ ジイミド類としては、 D C C、 N， N，ージイソプロピルカルポジイミド、 N— ェチルー Ν'— ( 3—ジメチルァミノプロリル) カルポジイミドなどが用いられ る。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H〇B t , H O〇 B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物ま たは HO B tエステルあるいは HO〇B tエステルとしてあらかじめ保護アミ ノ酸の活性化を行なつた後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク 質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例え ば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N, N—ジメチルァセトアミド， N—メ チルピロリドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲ ン化炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスル ホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフラン などのエーテル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢 酸メチル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが 用いられる。 反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られ ている範囲から適宜選択され、 通常約一 2 0 °C〜5 0 の範囲から適宜選択さ れる。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニン ヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を 行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができ る。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァ セチルイミダゾ一ルを用いて未反応ァミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 Bo c、 t一ペンチルォキ シカルポニル、 ィソポルニルォキシカルポニル、 4—メトキシベンジルォキシ 力ルポニル、 C I— Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフル ォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエ二ル、 ジ フエニルホスフイノチオイル、 Fmo cなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 t -ブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロへ プチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環 状アルキルエステル化) 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステル、 4—ニトロべンジルエステル、 4—メトキシベンジルエステル、 4一クロ口べ ンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化) 、 フエナシルエステル化、 ベン ジルォキシカルポニルヒドラジド化、 t一ブトキシカルボニルヒ ラジド化、 トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護する ことができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基など の低級 (Cl→) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジル ォキシカルポニル基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基など が用いられる。 また、 ェ一テル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロピラニル基、 t一ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 12 一 Bz l、 2—二トロベンジル、 B r— Z、 t _ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4ーメトキ シ— 2, 3, 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメ チル、 Bum、 Bo c、 Tr t；、 Fmo cなどが用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール (例えば、 ペン夕クロ口フエノール、 2 , 4， 5—トリクロ口フエノール、 2， 4—ジニトロフエノール、 シァノメ チルアルコール、 パラニトロフエノール、 H〇N B、 N—ヒドロキシスクシミ ド、 N—ヒドロキシフ夕ルイミド、 HO B t ) とのエステル〕 などが用いられ る。 原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸ァ ミドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d—炭素 などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるい はこれらの混合液などによる酸処理や、 ジィソプロピルェチルァミン、 トリエ チルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニ ァ中ナトリゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約— 2 0 °C〜4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チオアニソール、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾール、 ジメチルスルフィド、 1， 4一ブタンジチオール、 1 , 2一エタンジチオール などのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダ ゾール保護基として用いられる 2 , 4—ジニトロフエニル基はチォフエノール 処理により除去され、 トリブトファンのィンドール保護基として用いられるホ ルミル基は上記の 1， 2—エタンジチオール、 1， 4—ブタンジチオールなど の存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニ ァなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保 護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段 から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルポキシ末端アミノ酸の 一力ルポキシル基をアミド化して保護した 後、 アミノ基側にペプチド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該 ぺプチド鎖の N末端のひ一アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部 分ペプチドと C末端の力ルポキシル基の保護基のみを除去したタンパク質また は部分ペプチドとを製造し、 これらのタンパ、ク質またはペプチドを上記したよ うな混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細についてば上記と同様である。 縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、 上記方法に よりすべての保護基を除去し、 所望の粗夕ンパク質またはべプチドを得ること ができる。 この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して 精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのァ ミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 力ルポキシ末 端アミノ酸のひ—カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エス テルとした後、 タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、 所望の夕 ンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、 自体公知のペプチド の合成法に従って、 あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なぺプチダ —ゼで切断することによつて製造することができる。 ペプチドの合成法として は、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本 発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と 残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離すること により目的のペプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱 離としては、 例えば、 以下の （i) 〜 （V) に記載された方法が挙げられる。
(u M. Bodanszky およひ M.A. OndettK Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966年）
(ii) Schroederおよび Luebke、 The Peptide, Academic Press, New York (1965年）
(in) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(iv) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 （1977年）
(v) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店 また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトグ ラフィ一 ·液体クロマトグラフィー '再結晶などを組み合わせて本発明で用い られる部分べプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べ プチドが遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって 適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あ るいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる 本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、 前 述した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するもので あればいかなるものであってもよい。 好ましくは DNAである。 DNAとして は、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c DNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリ一、 合成 DN Aのいず れでもよい。
ライブラリ一に使用するベクターは、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コ スミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 '組織 より total RNAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse
Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT - PCR法と略称する) によ つて増幅することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードする DNAとしては、 例えば、 配列 番号： 2で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 2で表され る塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を 含有し、 前記した配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質 と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする DNAであれば何れの ものでもよい。
配列番号： 2で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下で八イブ リダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2で表される塩基配列と 約 50%以上、 好ましくは約 60%以上、 さらに好ましくは約 70 %以上、 よ り好ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。 具 体的には、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1、 配 列番号： 13、 配列番号： 15、 .配列番号： 17または配列番号： 19で表さ れる塩基配列を含有する D N Aなどが挙げられる。 塩基配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (Nat ional Center for Biotechnology Informat ion Bas ic Local Al ignment Search Tool) を用レ、 以下の条件 （期待値 = 10；ギャップを許す；フィルタリング =0N；マッチスコ ァ = 1；ミスマッチスコア =-3) にて計算することができる。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例 えば、 モレキュラー 'クローニング （Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al .， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行 なうことができる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説 明書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリ ンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜4 0 mM、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0〜 6 5での条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク 質をコードする D NAとしては、 配列番号： 2で表される塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド （例、 D N A) としては、 前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配 列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム D N A、 ゲノム D NAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c D NA、 前記した細 胞 ·組織由来の c D NAライブラリー、 合成 D NAのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードする D NAとしては、 例えば、 配 列番号： 2で表される塩基配列を含有する D NAの一部分を有する D NA、 ま たは配列番号： 2で表される塩基配列と八イストリンジェントな条件下でハイ ブリダイズする塩基配列を含有し、 本発明のタンパク質と実質的に同質の活性 を有するタンパク質をコードする D N Aの一部分を含有する D N Aなどが用い られる。
配列番号： 2で表される塩基配列とハイブリダィズできる D NAは、 前記と 同意義を示す。
ハイブリダィゼ一シヨンの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と 同様のものが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質、 部分ペプチド （以下、 これらをコードする DNAのクローニングおよび発現の説明においては、 これらを単に本発明の夕 ンパク質と略記する場合がある） を完全にコードする DNAのクローニングの 手段としては、 本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合 成 DNAプライマーを用いて PC R法によって増幅するか、 または適当なべク ターに組み込んだ DN Aを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコード する DNA断片もしくは合成 D N Aを用いて標識したものとのハイブリダイゼ ーションによって選別することができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば、 モレキュラー ·クローニング （Molecular Cloning) 2nd (J.
Sambrook et a'l.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法など に従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添 付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
DNAの塩基配列の変換は、 PCR、 公知のキット、 例えば、 MutanTM-super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 Mutan™-K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 0M- LA PCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じ る方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードする DNAは目的によりそのまま、 ま たは所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用するこ とができる。 該 DN Aはその 5'末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し， また 3'末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有し ていてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DN Aアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のタンパク質 をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断 片を適当な発現べクタ一中のプロモー夕一の下流に連結することにより製造す ることができる。 ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 PBR 322, pBR3 25, pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 11 0， pTP 5, p C 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 pSH19， pSH 15) 、 λファ一ジなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニア ウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 11、 p XT 1, pR c/CMV, pRc/RS V, p c DNA I /N e oなどが用い られる。
本発明で用いられるプロモータ一としては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対 応して適切なプロモータ一であればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞 を宿主として用いる場合は、 SR aプロモータ一、 SV40プロモーター、 L TRプロモータ一、 CMVプロモーター、 HS V- TKプロモータ一などが挙げ られる。
これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモ一夕一、 SRaプロ モー夕一などを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプロモーター、 r e cAプロモータ一、 APLプ 口モータ—、 プロモーター、 τ 7プロモ一夕一などが、 宿主がバチルス 属菌である場合は、 SP〇1プロモ一夕一、 SP02プロモー夕一、 p e nP プロモータ一など、 宿主が酵母である場合は、 PH05プロモ一夕一、 PGK プロモータ一、 GAPプロモータ一、 ADHプロモータ一などが好ましい。 宿 主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモー夕一、 P 10プロモ一ター などが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサ一、 スプライシング シグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカ一、 SV40複製オリジン （以下、 S V400 r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いること ができる。 選択マーカ一としては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセ一ト （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 Amp ^と略称する場合がある） 、 ネオマイ シン耐性遺伝子 （以下、 Ne orと略称する場合がある、 G418耐性） 等が 挙げられる。 特に、 dh ί r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて dh f r遺伝子を選択マ一力一として使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを 含まない培地によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のタンパク質の N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA ·シグナル 配列、 0即 A ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 《—ァ ミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母で ある場合は、 MFa ·シグナル配列、 SUC2 ·シグナル配列など、 宿主が動 物細胞である場合には、 インシュリン 'シグナル配列、 0；—イン夕一フエ口 ン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする DN Aを含有す るべクタ一を用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシェリヒア属菌の具体例としては、 例えば、 ェシエリヒア ·コリ
. (Escherichia coli) K 12 · DH 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 巻， 160(1968)〕 ， JM 103 [Nucleic Acids Research, 9巻， 309(1981)〕 ， J A221 [Journal of Molecular Biology, 120巻， 517 (1978)〕 , HB 101
[Journal of Molecular Biology, 41巻， 459 (1969)〕 ， C 600 [Genetics, 39 巻，440 (1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス （Bacillus
subtilis) M I 114
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24巻，255 (1983)〕 ， 207- 21 (Journal of Biochemistry, 95巻, 87(1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R一， NA87 - 11 A, DKD— 5D, 2 OB— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) N CYC 1913, NCYC 2036、 ピキア パストリス （Pichia pastoris) KM 71などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが AcNPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia niの 中腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、
Maraestra brassicae由来の細胞または Est igmena acrea由来の細胞などが用いら れる。 ウィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori 細 胞； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細 胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 2 1細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン ·ヴィポ
(In Vivo) ，13, 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ — (Nature) , 3 15巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7, Ve r o, チャイニーズ ハムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損チヤ ィニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CH〇 （dh f r— ) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス A t T— 20, マウスミエローマ細胞， マウス ATDC '5細胞， ラット GH3， ヒト FL細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69巻， 2110 (1972)や Gene, 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なう ことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 Molecular & General
Genetics, 168巻， 111 (1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。 酵母を形質転換するには、 例えば、 Methods in Enzymology, 194巻， 182 - 187(1991)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75巻， 1929 (1978)などに記載の方法に 従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 Bio/Technology, 6, 47- 55 (1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プ ロトコール. 263-267 (1995) (秀潤社発行) 、 Virology, 52巻， 456 (1973)に記載 の方法に従って行なうことができる。
このようにして、 タンパク質をコードする DNAを含有する発現べクタ一で 形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培 養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体 の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源と しては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶' I生澱粉、 ショ糖など、 窒素 源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ ' リカ一 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または 有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウ ム、 塩ィ匕マグネシウムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 成 長促進因子などを添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザ ミノ酸を含む M 9培地 〔ミラー （Miller) ， Journtfl of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972) が好ましい。 ここに必要によりプロモータ一を効率よく働かせるために 例えば、 3 /3—インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。 宿主がェシェリヒァ属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜43^で約3〜24時 間行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜40°Cで約 6〜24時間行 ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バーク ホールダ一 (Burkholder) 最小培地 [Bostian, K. L. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77巻， 4505 (1980)〕 や 0.5 %カザミノ酸を含有する S D培地
[Bitter, G. A. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 81卷， 5330 (1984)〕 が挙げ られる。 培地の pHは約 5〜8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 20で 〜35°Cで約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace's Insect Medium (Grace, T. C. C. , Nature, 195, 788 (1962)) に非動化した 1 0 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pHは 約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27°Cで約 3〜5曰 間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜2 0 %の胎児牛血清を含む ME M培地 〔3(^ 6 6，122巻，501 (1952)〕 , DM E M培地 [Vi rology, 8巻， 396 (1959)〕 ， R P M I 1 6 4 0培地 〔The Journal of the Amer ican Medical Associat ion 199巻， 519 (1967)〕 , 1 9 9培地
[Proceeding of the Soc iety for the Biological Medic ine, 73卷， 1 (1950)〕 などが用いられる。 p Hは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0 °C 〜4 0 °Cで約 1 5〜6 0時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明のタ ンパク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方 法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養 後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超 音波、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破 壊したのち、 遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適 ' 宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 ト リトン X— 1 0 0 TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にタン パク質が分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるい は細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるタンパク質 の精製は、 自体公知の分離 '精製法を適切に組み合わせて行なうことができる, これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用 する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルァ ミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換ク 口マトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマトグ ラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィ 一などの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利 用する方法などが用いられる。
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の方法 あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られ た場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他 の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生するタンパク質を、 精製前または精製後に適当な蛋白 修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部 分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 'キモトリプシン、 アルギニルェンドぺプチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 グリ コシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、 特異抗体を用いたェンザィ ムィムノアッセィやウェスタンプロッティングなどにより測定することができ る。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分べプチドまたはその塩に対する , 抗体は、 本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を 認識し得る抗体であれば、 ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナル抗体の何れで あってもよい。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 抗体の説明においては、 これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合があ る） に対する抗体は、 本発明のタンパク質を抗原として用い、 自体公知の抗体 または抗血清の製造法に従つて製造することができる。
〔モノク口一ナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位 にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生 能を高めるため、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバン トを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行 われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモ ット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙げられるが、 マウスおよ びラッ卜が好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種 動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の 標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性 を測定することにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミルスタインの方法 〔ネイチヤー （Nature), 256、 495 (1975)] に 従い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレンダリ コール （PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEG が用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS_ 1、 P 3U1、 S P 2/0、 AP— 1 などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3U 1が好ましく用いられる < 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： ；!〜 20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG6 000) が 10〜 80 %程度の濃度で添加され、 20〜 40 °C、 好ましくは 3 0〜37 で 1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を 実施できる。
モノク口一ナル抗体産生ハイプリドーマのスクリ一エングには種々の方法が 使用できるが、 例えば、 タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させ た固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放 射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる 細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロ ティン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫 グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上 清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、 固相に結合 したモノクローナル抗体を検出する方法など力 S挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って 行なうことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノブテリン、 チミジ ン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地 としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても 良い。 例えば、 1〜2 0 %、 好ましくは 1 0〜2 0 %の牛胎児血清を含む R P M l 1 6 4 0培地、 1〜 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 (株） ) あるいはハイプリドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製 薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ま しくは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリ ドーマ培養上清の抗体価は、 上記の坊血清中の抗体価の測定と同様にして測定 できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル坊体の分離精製は、 自体公知の方法、 例えば、 免疫グロプリ ンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原 結合固相あるいはプロティン Aあるいはプロティン Gなどの活性吸着剤により 抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行な うことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に 従って製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （タンパク質抗原） 自体、 あ るいはそれとキャリア一蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗 体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のタンパ ク質に対する抗体含有物を採取して、 坊体の分離精製を行なうことにより製造 することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合 体に関し、 キャリア一蛋白質の種類およびキャリア一とハプテンとの混合比は、 キャリア一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブ ミンゃゥシサイログロプリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合でカプルさせる方法が用いられる。 また、 ハプテンとキャリア一の力プリングには、 種々の縮合剤を用いること ができるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チオール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるい は担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよ い。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なわれる。 ポリクロ一ナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリク口一ナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定 と同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ ーナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうこ とができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分べプチドをコ一ドするポリヌクレ ォチド （例、 D NA (以下、 アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、 これらの D N Aを本発明の D NAと略記する場合がある） ） の塩基配列に相補 的な、 または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンス ボリヌクレオチドとしては、 本発明の D N Aの塩基配列に相補的な、 または実 質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、 該 D NAの発現を抑制し得る 作用を有するものであれば、 いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであって もよいが、 アンチセンス D N Aが好ましい。
本発明の D NAに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の D NA に相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の D NAの相補鎖） の全塩基配列ある いは部分塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは 約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列などが 挙げられる。 特に、 本発明の D NAの相補鎖の全塩基配列うち、 （ィ） 翻訳阻 害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、 本発明のタンパク質の N末端部位をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列 など） の相補鎖と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセンスポリ ヌクレオチド力 （口） R N a s e Hによる R NA分解を指向するアンチセン スポリヌクレオチドの場合は、 イントロンを含む本発明の D N Aの全塩基配列 の相補鎖と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 % 以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレ ォチドがそれぞれ好適である。
具体的には、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を含有する D NAの塩基配 列に相補的な、 もしくは実質的に相補的な塩基配列、 またはその一部分を有す るアンチセンスポリヌクレオチド、 好ましくは例えば、 配列番号： 2で表わさ れる塩基配列を含有する D N Aの塩基配列に相補な塩基配列、 またはその一部 分を有するアンチセンスポリヌクレオチド （より好ましくは、 配列番号： 2で 表わされる塩基配列を含有する D N Aの塩基配列に相補な塩基配列、 またはそ の一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド) などが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 1 0〜4 0個程度、 好ましくは 1 5 〜3 0個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、 アンチセンス D N Aを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基 （ホスフェート） は、 例えば、 ホ スホロチォェ一ト、 メチルホスホネート、 ホスホロジチォネートなどの化学修 飾りん酸残基に置換されていてもよい。 また、 各ヌクレオチドの糖 （デォキシ リポース） は、 2，_〇—メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよ いし、 塩基部分 （ピリミジン、 プリン） も化学修飾を受けたものであってもよ く、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する D NAにハイブリダィズする ものであればいずれのものでもよい。 これらのアンチセンスポリヌクレオチド は、 公知の D NA合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、 本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害するこ とのでさるアンチセンスポリヌクレオチドを、 クローン化した、 あるいは決定 されたタンパク質をコードする D NAの塩基配列情報に基づき設計し、 合成し うる。 かかるヌクレオチド （核酸） は、 本発明のタンパク質遺伝子の R NAと ハイブリダイズすることができ、 該 R N Aの合成または機能を阻害することが できるか、 あるいは本発明のタンパク質関連 R NAとの相互作用を介して本発 明のタンパク質遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 本発明のタンパ ク質関連 R N Aの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 および本発明 の夕ンパク質関連 R N Aと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌク レオチドは、 生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節 · 制御するのに有用であり、 また病気などの治療または診断に有用である。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または核酸の特定 の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレオチド、 塩基配列または核酸とペプチド （タンパク質） との間で 「対応する」 とは、 ヌ クレオチド （核酸） の配列またはその相補体から誘導される指令にあるべプチ ド （蛋白質） のアミノ酸を通常指している。 タンパク質遺伝子の 5 '端ヘアピン ループ、 5 '端 6—ベースペア 'リピート、 5 '端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳 開始コドン、 蛋白質コード領域、 O R F翻訳終止コドン、 3，端非翻訳領域、 3 ' 端パリンドローム領域、 および 3 '端ヘアピンル一プは好ましい対象領域として 選択しうるが、 タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。 目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関 係は、 対象物とハイプリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、
「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンスポリヌクレオチド は、 2—デォキシ一D—リポ一スを含有しているポリヌクレオチド、 D—リポ —スを含有しているポリヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—グ リコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド 骨格を有するその他のポリマー （例えば、 市販の蛋白質核酸および合成配列特 異的な核酸ポリマー） または特殊な結合を含有するその他のポリマー （但し、 該ポリマーは D N Aや R N A中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の 付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する） などが挙げられる。 それ らは、 2本鎖 D NA、 1本鎖 D NA、 2本鎖 R NA、 1本鎖 R NA、 さらに D NA： R N Aハイブリッドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド
(または非修飾オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化 されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内 ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネ —ト、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つ もの、 電荷を有する結合または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォェ一ト、 ホスホロジチォェ一トなど） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレア一ゼ、 ヌク レア一ゼ'インヒビター、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ— L—リ ジンなど） や糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有している もの、 インタ一カレント化合物 （例えば、 ァクリジン、 ゾラレンなど） を持つ もの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性 の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合 を持つもの （例えば、 ひァノマ一型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌ クレオシド」 、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおよびピリミジ ン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつような ものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチル化されたプリンおよびピリ ミジン、 ァシル化されたプリンおよびピリミジン、 あるいはその他の複素環を 含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチ ドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲン とか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官 能基に変 ¾されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 R NA、 D NA、 あるいは修飾 された核酸 （R NA、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例としては核酸 の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミドゃォ リゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定さ れるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設 計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする. アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親 和性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の 毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al .， Pharm Tech Japan, Vo l . 8, pp. 247, 1992 ; Vol . 8, pp. 395, 1992 ; S. T. Crooke e t al . ed. , Ant isense Research and Appl i cat i ons, CRC Press, 1993 などに開示がある。 - 本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で 供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられる ことができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格 の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との 相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホス ホリピド、 コレステロールなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加す るに好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステ リルクロ口ホルメート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸 の 3 '端あるいは 5，端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド 結合を介して付着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 '端あ るいは 5 '端に特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレア一ゼ、 R N a s eなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリエチレングリコ一ル、 テトラエチレン グリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護 基が挙げられるが、 それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生 体外の遺伝子発現系、 あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系 を用いて調べることができる。 該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用 できる。 以下に、 本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本 発明のタンパク質と略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質または部分べ プチドをコードするポリヌクレオチド （例、 D NA (以下、 本発明の D NAと 略記する場合がある） ） 、 本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそ の塩に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合がある） 、 および本発 明の D NAのアンチセンスポリヌクレオチド （以下、 本発明のアンチセンスポ リヌクレオチドと略記する場合がある） の用途を説明する。 本発明のタンパク質は、 小胞体ストレスを伴う神経細胞死により発現が上昇 し、 小胞体ストレス依存性の細胞死を促進する。 また、 本発明のタンパク質は、 細胞死 （神経細胞死） および神経原線維変化を促進する。 さらに、 本発明のタ ンパク質は、 Akt lと結合し、 Akt l活性を阻害する。 よって、 本発明のタンパク 質は、 神経変性、 糖尿病、 癌、 リウマチ性疾患などにおける早期診断、 症状の 重症度の判定、 疾患進行の予測のためのマーカ一として有用である。 また、 本 発明のタンパク質の活性を阻害する化合物もしくはその塩、 本発明のタンパク 質をコードする遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩、 本発明のアン チセンスポリヌクレオチド、 および本発明のタンパク質に対する抗体を含有す る医薬は、 例えば、 神経変性疾患、 糖尿病およびその合併症などの安全な予 防 ·治療剤として使用することができる。 また、 本発明のタンパク質の活性を 促進する化合物またはその塩、 本発明のタンパク質をコ一ドする遺伝子の発現 を促進する化合物またはその塩、 本発明のタンパク質、 および本発明の D NA などは、 例えば癌、 リウマチ性疾患などの安全な予防 ·治療剤として使用する ことができる。
( 1 ) 疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質は小胞体ストレスを伴う神経細胞死により発現が上昇し、 小胞体ストレス依存性の細胞死を促進する。 また、 本発明のタンパク質は、 神 経細胞の生存維持およびタウのリン酸化に重要な役割を果たしている IGF-1/ィ ンスリンシグナルを調節する主要な分子である Akt lと結合し、 Akt l活性を阻害 することにより、 タウの高リン酸化が起こる。 これより、 本発明のタンパク質 は、 神経原線維変化促進活性、 神経細胞死促進活性などを有する。
よって、 本発明のタンパク質の活性を調節 （阻害または促進、 好ましくは阻 害） する化合物またはその塩は、 例えば、 神経変性疾患 〔例、 アルッ八イマ一 病 （家族性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性ァルツハイマ —病など） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト—ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿病性ニューロパチ一、 多発性硬化症など〕 、 糖尿病およびその合併症 （例、 糖尿病性腎症、 糖尿病性 ニューロパチ一、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性足病変、 脈硬化、 高血圧症、 高 脂血症など） などの予防 ·治療剤として安全に使用することができる。
一方、 多くの癌では、 DNA変異により ΠΕΝ (Akt lを不活性化している癌抑制遺 伝子の一つ） の機能が欠失し、 AkUが恒常的に活性化しており、 これが細胞の 癌ィ匕と悪性化に重要な役割を果たしている。 また、 リウマチ患者の滑膜細胞で は Akt l活性が亢進しており、 かつ、 Akt lの機能を抑制することによりアポトー シスを誘導できることから、 Akt lの活性化が滑膜細胞の増殖を伴うリゥマチ性 疾患の病態形成に重要な役割を果たしている。
よって、 本発明のタンパク質の活性を調節 （阻害または促進、 好ましくは促 進） する化合物またはその塩は、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺 癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） 、 リウマチ性疾患 （例、 慢性関節リウマチ、 変形関節症、 痛風など） などの安全な予防 ·治療剤として 使用することができる。
したがって、 本発明のタンパク質は、 本発明のタンパク質の活性を調節 （阻 害または促進） する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として 有用である。
すなわち、 本発明は、 本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明 のタンパク質の活性を調節 （阻害または促進） する化合物またはその塩のスク リーニング方法を提供する。
例えば、 （i) 本発明のタンパク質の活性 （神経原線維変化促進活性、 神経細 胞死促進活性など） と、 （i i) 本発明のタンパク質と試験化合物の混合物の活 性との比較をすることにより、 本発明のタンパク質の活性を調節 （促進または 阻害） する化合物またはその塩をスクリーニングする。
具体的には、 例えば、 （ί ' ) 本発明のタンパク質発現べクタ一を細胞に導入 し、 培養した場合、 および （i i' ) 本発明のタンパク質発現べクタ一を細胞に導 入し、 試験化合物存在下、 培養した場合において、 免疫染色法 （例、 抗タウ抗 体などを使用） により神経線維を染色し、 その染色像を顕微鏡により取得し、 神経線維の変化の程度をそれぞれ測ることにより神経原線維変化促進活性を測 定し、 比較し、 本発明のタンパク質の活性を調節 （促進または阻害） する化合 物またはその塩をスクリ一ニングする。
具体的には、 例えば、 （Γ ' ) 本発明のタンパク質発現べクタ一を細胞に導入 し、 培養した場合、 および （i i' ' ) 本発明のタンパク質発現べクタ一を細胞に 導入し、 試験化合物存在下、 培養した場合において、 細胞死誘導剤 （例、 ッニ 力マイシン、 夕プシガーギン、 2-デォキシダルコ一ス、 ;3アミロイド、 オカダ 酸、 ホモシスティンなど） を添加し、 力ルセイン染色を用いた軸索の変性量、 ミトコンドリアの呼吸活性、 培養上清中の LDH (lactate dehydrogenase) 量、 または細胞死に伴う DNA切断量などを測ることにより神経細胞死促進活性を測定、 比較し、 本発明のタンパク質の活性を調節 （促進または阻害） する化合物また はその塩をスクリーニングする。
また、 Akt lは、 Cot (甲状腺癌細胞株から発見された癌遺伝子で、 mi togen- act ivated protein kinase kinase kinaseファミリ一の一つである） および IKK (NF- κ Βのィンヒビ夕一である I κ Βをリン酸化することにより、 NF- κ Βの転写 を活性化するキナ一ゼである）の活性化を介して NF- zc Bの転写活性化を誘導する (Mol. Cel l. Biol . , 22巻、 5962— 5974項、 2002年) 。
これより、 以下のスクリーニング方法も用いられる。
(1' " ) 本発明のタンパク質発現ベクターを、 NF / Bの結合配列をプロモータ 一またはェンハンサー中に含有するレポ一夕一遺伝子とともに細胞に導入し、 必要に応じ、 （a) 微生物細胞破碎液、 微生物培養上清、 真核細胞破碎液、 真核 細胞培養上清などリガンドが含まれる液、 （b) リガンド自身または （c) 天然 のリガンドと同等に結合活性を有する物質を添加して培養した場合と、
(i i ' ' ' ) 本発明のタンパク質発現ベクターを、 NF /c Bの結合配列をプロモー夕 —またはェンハンサ一中に含有するレポーター遺伝子とともに細胞に導入し、 必要に応じ、 （a) 微生物細胞破砕液、 微生物培養上清、 真核細胞破碎液、 真核 細胞培養上清などリガンドが含まれる液、 （b) リガンド自身または （c) 天然 のリガンドと同等に結合活性を有する物質を添加して、 試験化合物の存在下、 培養した場合の、 レポ一ター発現 *を測定し、 比較し、 本発明のタンパク質の 活性を調節 （促進または阻害） する化合物またはその塩をスクリーニングする レポーター発現量は、 ルシフェラーゼ活性、 アルカリフォスファターゼ活性 などを用いたレポータータンパク活性を指標とすることにより測定できる。
上記の本発明のタンパク質は、 本発明のタンパク質を産生する能力を有する 細胞を培養することによって製造されたものなどが用いられる。 さらには、 前 記細胞の培養液、 その上清、 細胞破碎物などを用いてもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述し た本発明のタンパク質をコ一ドする DN Aを含有するべクタ一で形質転換され た宿主 （形質転換体） が用いられる。 宿主としては、 例えば、 COS 7細胞、 CHO細胞、 HEK293細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。 該スク リ一ニングには、 例えば、 前述の方法で培養することによって、 本発明のタン パク質を細胞外に分泌させる、 または細胞内に発現させる形質転換体が好まし く用いられる。 本発明のタンパク質を発現し得る細胞の培養方法は、 前記した 本発明の形質変換体の培養法と同様である。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあ げられる。 ，
例えば、 上記 （ii) 、 (ϋ') 、 (ii") および （ii''') の場合における活 性が上記 （i) 、 （Γ) 、 (i") および （Γ'') の場合に比べて、 約 20%以 上、 好ましくは 30%以上、 より好ましくは約 50%以上減少する試験化合物 を、 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物として、 上記 （ii) 、 （ii') 、 (ii") および （ii' ) の場合における活性が上記 （i) 、 （ί') 、 （Γ') お よび （Γ'') の場合に比べて、 約 20%以上、 好ましくは 30%以上、 より好 ましくは約 50%以上増加する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を促進 する化合物として選択することができる。 '
本発明のタンパク質の活性を阻害する活性を有する化合物は、 本発明のタン パク質の生理活性を抑制するため、 安全で低毒性な、 例えば、 神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 (家族性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬 化症、 プリオン病、 クロイツフェルト—ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿 病性ニューロパチ一、 多発性硬化症など〕 、 糖尿病およびその合併症 （例、 糖 尿病性腎症、 糖尿病性ニューロバチ一、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性足病変、 動 硬化、 高血圧症、 高脂血症など） などの予防 ·治療剤として有用である。
本発明のタンパク質の活性を促進する活性を有する化合物は、 本発明のタン パク質の作用を増強するため、 安全で低毒性な、 例えば、 癌 （例、 大腸癌、 乳 癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） 、 リウ マチ性疾患 （例、 慢性関節リウマチ、 変形関節症、 痛風など） などの予防 ·治 療剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合 物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血 漿などから選ばれた化合物である。 該化合物の塩としては、 前記した本発明の ぺプチドの塩と同様のものが用いられる。
上記した本発明のタンパク質の作用に加え、 本発明のタンパク質をコードす る遺伝子も、 小胞体ストレスを伴う神経細胞死誘導により発現が増加すること により、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節 （好ましくは阻 害） する化合物またはその塩は、 例えば、 神経変性疾患、 糖尿病およびその合 併症などの予防 ·治療剤として、 また、 本発明のタンパク質をコードする遺伝 子の発現を調節 （好ましくは促進） する化合物またはその塩は、 例えば、 癌、 リウマチ性疾患などの予防 ·治療剤として使用することができる。
したがって、 本発明のポリヌクレオチド （例、 D NA) は、 本発明のタンパ ク質をコードする遺伝子の発現を調節 （阻害または促進） する化合物またはそ の塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
スクリーニング方法としては、 （i i i) 本発明のタンパク質を産生する能力を 有する細胞を培養した場合と、 （iv) 試験化合物の存在下、 本発明で用いられ るタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うこと を特徴とするスクリ一ニング方法が挙げられる。
上記方法において、 （i i i) と （iv) の場合における、 前記遺伝子の発現量 (具体的には、 本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードする mR NA量） を測定して、 比較する。
試験化合物および本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 上記と同様のものが挙げられる。
タンパク質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明のタンパク質を認識す る抗体を用いて、 細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、 ウェスタン 解析、 E L I S A法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することが できる。
mR NA量の測定は、 公知の方法、 例えば、 プローブとして配列番号： 2ま たはその一部分を含有する核酸を用いるノーザンハイブリダィゼーション、 あ るいはプライマ一として配列番号： 2またはその一部分を含有する核酸を用い る P C R法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
例えば、 上記 （iv) の場合における遺伝子発現量を、 上記 （i i i) の場合に比 ベて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上減 少させる試験化合物を、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害 する化合物として、 上記 （iv) の場合における遺伝子発現量を、 上記 （i i i) の 場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上増加させる試験化合物を、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子の 発現を促進する化合物として選択することができる。
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明で用いられるタンパク質もしく は部分ペプチドまたはその塩、 または本発明で用いられるタンパク質もしくは 部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 上記した試験化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパク 質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、 本発明の タンパク質の遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩である。 該化合物の塩としては、 前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用 いられる。
本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節 （好ましくは阻害） する 化合物またはその塩は、 例えば、 神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族 性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病な ど） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイ ッフェルト—ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿病性ニューロバチ一、 多発 性硬化症など〕 、 糖尿病およびその合併症 （例、 糖尿病性腎症、 糖尿病性ニュ 一ロバチ一、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性足病変、 動脈硬化、 高血圧症、 高脂血 症など） などの予防 ·治療剤として使用することができる。 本発明のタンパク 質をコードする遺伝子の発現を調節 （好ましくは促進） する化合物またはその 塩は、 例えば、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓 癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳 腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） 、 リウマチ性疾患 （例、 慢性関節リウマチ、 変 形関節症、 痛風など） などの予防 ·治療剤として使用することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩を上述の予防 ·治療剤として使用する場合、 常套手段に 従って製剤化することができる。
例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的 には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコ一ティング錠を含む) 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などがあ げられる。 かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、 製剤分野におい て通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネ シゥムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤、 関 節内注射剤などの剤形を包含する。 かかる注射剤は、 自体公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは 油性液に溶解、 懸濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液と しては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが 用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール (例、 エタノール） 、 ポリ アルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非ィォ ン界面活性剤 〔例、 ポリソルベート 8 0、 H C O - 5 0
(,polyoxyethylene (50mol) adduct of hydrogenated cas tor oi l) 〕 などと併用 してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解 補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどを併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。 直腸投与に用いら れる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによつ て調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよ うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形 としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示さ れ、 それぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜5 0 0 m g、 とりわけ注射剤では 5〜1 0 0 m g、 その他の剤形では 1 0〜2 5 0 m gの上記化合物が含有され ていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記化合物との配合により好ましくない相互作用 を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的にまたは非経口 的に投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ル —トなどにより差異はあるが、 例えば、 アルツハイマー病の治療の目的で、 本 発明のタンパク質の活性または該タンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物 またはその塩を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 0 k gとして） にお いては、 一日につき該ィ匕合物またはその塩を約 0 . 1〜1 0 0 m g、 好ましくは 約 1 . 0〜5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 O m g投与する。 非経口的 に投与する場合は、 該化合物またはその塩の 1回投与量は投与対象、 対象疾患 などによっても異なるが、 例えば、 アルツハイマー病の治療の目的で、 本発明 のタンパク質の活性または該タンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物また はその塩を注射剤の形で通常成人 （体重 60 kgとして） に投与する場合、 一 日につき該化合物またはその塩を約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは約 0. 1 〜20mg、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omgを静脈注射により投与するの が好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60 kg当たりに換算した量を投与 することができる。
例えば、 慢性関節リウマチの治療の目的で、 本発明のタンパク質の活性また は該タンパク質の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩を経口投与する 場合、 一般的に成人 （体重 6 O kgとして） においては、 一日につき該化合物 またはその塩を約 0.1〜 10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好 ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物 またはその塩の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例 えば、 慢性関節リウマチの治療の目的で、 本発明のタンパク質の活性または該 タンパク質の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩を注射剤の形で通常 成人 （体重 6 O kgとして） に投与する場合、 一日につき該化合物またはその 塩を約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは約 0. ：!〜 2 Omg、 より好ましくは 約 0. 1〜1 Omgを関節内注射により投与するのが好都合である。 他の動物 の場合も、 体重 6 O kg当たりに換算した量を投与することができる。
(2) 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明のタンパク質に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合があ る） は、 本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、 被検液中 の本発明のタンパク質の定量、 特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに 使用することができる。
すなわち、 本発明は、
(i) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競合 的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測 定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、 および
( i i ) 被検波と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、'不溶化担体上の標識剤の 活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提 供する。
上記 （i i) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のタンパク質の N端部 を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のタンパク質の C端部に反応する抗体 であることが望ましい。 ., また、 本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモ ノクローナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のタンパク質の定量を 行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的に は、 钪体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F (ab' ) 2 、 Fab'ある いは Fab画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、 特に制限されるべき ものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク質量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定 法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリ一、 競合 法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位 元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例えば、 〔1251〕 、 〔1311〕 、 〔¾〕 、 〔"c〕 などが用いられる。 上記酵素とし ては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 3—ガラクトシダーゼ、 )3—ダルコシダ一ゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ 酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミ ン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用 いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン—' 系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常 タンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用 いる方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースな どの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹 脂、 あるいはガラス等が挙げられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノク口一ナルぉ体に被検液 を反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体 を反応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定すること により被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらし て行なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じること ができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体ある いは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感 度を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、 1 次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明のタン パク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次 反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体 が、 本発明のタンパク質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体 は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができ る。
競合法では、 被検波中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させ たのち、 未反応の標識抗原（F) と、 抗体と結合した標識抗原 （B) とを分離し (BZF分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量 する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 BZF分離をポリエチレ ングリコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1 抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い 第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化 抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中 の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標 識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの 相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の 沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメト リ一などが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の 条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定 系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成 書などを参照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） . 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄 治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵 素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵 素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「Methods in
ENZYMOLOGYJ Vol. 70 (I腿 unochemical Techniques (Par t A) )、 同書 Vol .
73 (Immunochemical Techniques (Part B) )、 同書 Vol . 74 (Immunochemical
Techniques (Part C) )、 同書 Vol. 8 (Immunochemi cal Techniques (Par t D: Selec ted Immunoassays) ) ¾ 同書 Vol, 92 (Immunochemi cal Techniques (Part
E :Monoc lonal Ant ibodies and General Immunoassay Methods)) , 同書 Vol .
121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybridoma Technology and
Monoclonal Ant ibodi es)) (以上、 アカデミックプレス社発行）などを参照するこ とができる。 以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパク 質を感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量すること によって、 本発明のタンパク質の濃度の増加または減少が検出された場合、 例 えば、 神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族性アルツハイマー病、 若年 性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダウ ン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト一ヤコブ病、 ハン チントン舞踏病、 糖尿病性ニューロパチ一、 多発性硬化症など〕 、 糖尿病およ びその合併症 （例、 糖尿病性腎症、 糖尿病性ニューロバチ一、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性足病変、 動脈硬化、 高血圧症、 高脂血症など） などである、 または将 来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタン パク質を検出するために使用することができる。 また、 本発明のタンパク質を 精製するために使用する抗体力ラムの作製、 精製時の各分画中の本発明のタン パク質の検出、 被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのた めに使用することができる。
(3) 遺伝子診断薬
本発明の DNAは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） における本発明の タンパク質またはその部分ペプチドをコードする DN Aまたは mRN Aの異常 (遺伝子異常） を検出することができるので、 .例えば、 該 DNAまたは mRN Aの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DNAまたは mRNAの増加ある ¾は発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明の DNAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザン ハイプリダイゼーションゃ PCR— SSCP法 （Genomics，第 5巻， 874〜879頁 (1989年)、 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) , 第 86巻， 2766〜2770頁（1989年)）などにより実施すること ができる。
例えば、 ノーザンハイプリダイゼーションにより発現過多または減少が検出 された場合や P C R— S S C P法により D NAの突然変異が検出された場合は、 例えば神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族性アルツハイマー病、 若年 性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダウ ン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト—ヤコブ病、 ハン チントン舞踏病、 糖尿病性ニュ一ロバチ一、 多発性硬化症など〕 、 糖尿病およ びその合併症 （例、 糖尿病性腎症、 糖尿病性ニューロパチ一、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性足病変、 動脈硬化、 高血圧症、 高脂血症など） などである可能性が高 いと診断することができる。
( 4 ) ァンチセンスボリヌクレオチドを含有する医薬
本発明の D N Aに相補的に結合し、 該 D N Aの発現を抑制することができる 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、 生体内における本発 明のタンパク質または本発明の D N Aの機能を抑制することができるので、 例 えば、 神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族性アルツハイマー病、 若年 性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダウ ン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト一ヤコブ病、 ハン チントン舞踏病、 糖尿病性ニューロパチ一、 多発性硬化症など〕 、 糖尿病およ びその合併症 （例、 糖尿病性腎症、 糖尿病性ニューロパチ一、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性足病変、 動脈硬化、 高血圧症、 高脂血症など） などの予防 ·治療剤と して使用することができる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防 ·治療剤として使用する場 合、 自体公知の方法に従って製剤化し、 投与することができる。
また、 例えば、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロ ウィルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシェ一テツ ドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常套手段に従って、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的に投与することができる。 該アンチ センスポリヌクレオチドは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤な どの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲル力 テーテルのようなカテーテルによって投与できる。 あるいは、 エアロゾル化し て吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、 体内動態の改良、 半減期の長期化、 細胞内取り込み効率の改善を目 的に、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリポゾームなどの担 体とともに製剤 （注射剤） 化し、 静脈、 皮下、 病変部等に投与してもよい。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ル ートなどにより差異はあるが、 例えば、 アルツハイマー病の治療の目的で本発 明のアンチセンスポリヌクレオチドを投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 0 k g ) においては、 一日にっき該ァンチセンスポリヌクレオチドを約 0 · 1〜 1 0 O m g投与する。
さらに、 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 組織や細胞における本発明の D NAの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプロ一 ブとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、 本発明のタンパク質をコード する R NAの一部を含有する二重鎖 R NA、 本発明のタンパク質をコードする R N Aの一部を含有するリポザィムなども、 本発明の遺伝子の発現を抑制する ことができ、 生体内における本発明で用いられるタンパク質または本発明で用 いられる D NAの機能を抑制することができるので、 例えば、 神経変性疾患
〔例、 アルツハイマー病 (家族性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬 化症、 プリオン病、 クロイツフェルト一ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿 病性ニューロパチ一、 多発性硬化症など〕 、 糖尿病およびその合併症 （例、 糖 尿病性腎症、 糖尿病性ニューロバチ一、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性足病変、 動 脈硬化、 高血庄症、 高脂血症など） などの予防 ·治療剤などとして使用するこ とができる。
二重鎖 R N Aは、 公知の方法 （例、 Nature, 411巻， 494頁， 2001年） に準じ て、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。 リポザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS in Molecul ar Medic ine, 7巻， 221 頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造 することができる。 例えば、 本発明のタンパク質をコードする R N Aの一部に 公知のリポザィムを連結することによつて製造することができる。 本発明の夕 ンパク質をコードする R NAの一部としては、 公知のリポザィムによって切断 され得る本発明の R NA上の切断部位に近接した部分 （R NA断片） が挙げら れる。
上記の二重鎖 R NAまたはリポザィムを上記予防 ·治療剤として使用する場 合、 アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与することがで きる。
( 5 ) 本発明の抗体を含有する医薬
本発明のタンパク質の活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、 例えば 神経変性疾患 〔例、 アルッ八イマ一病 （家族性アルツハイマー病、 若年性アル ッハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト一ヤコブ病、 ハンチント ン舞踏病、 糖尿病性ニューロバチ一、 多発性硬化症など〕 、 糖尿病およびその 合併症 （例、 糖尿病性腎症、 糖尿病性ニューロバチ一、 糖尿病性網膜症、 糖尿 病性足病変、 動脈硬化、 高血圧症、 高脂血症など） などの予防 ·治療剤として 使用することができる。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することがで きる。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記抗体またはその塩と薬理学的 に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成 物は、 経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、 例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤 形、 具体的には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒 剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁 剤などがあげられる。 力かる組成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野 において通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン 酸マグネシゥムなどが用いられる。
. 非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤など の剤形を包含する。 かかる注射剤は、 公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体 またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸 濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、 適当な 溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコ一ル） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルべ一ト 8 0、 H C O - 5 0 (polyoxyethylene (50mol) adduc t of hydrogenated cas tor oi l) 〕 などと併用してもよい。 油性液,としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジ ルアルコールなどを併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアン プルに充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通 常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよ うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形 としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示さ れ、 それぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜5 0 0 m g、 とりわけ注射剤では 5〜 1 0 0 m g、 その他の剤形では 1 0〜2 5 0 m gの上記抗体が含有されて いることが好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を 生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防 ·治療剤は低毒性であり、 そのまま 液剤として、 または適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口 的または非経口的 （例、 静脈投与） に投与することができる。 投与量は、 投与 対象、 対象疾患、 症状、 投与ル一トなどによっても異なるが、 例えば、 成人の アルツハイマー病の治療のために使用する場合には、 本発明の抗体を 1回量と して、 通常 O. O l S Omg/k g体重程度、 好ましくは 0.1〜1 Omg/ kg体重程度、 さらに好ましくは 0. l SmgZk g体重程度を、 1日 1〜5 回程度、 好ましくは 1日 1〜3回程度、 注射剤として投与するのが好都合であ る。 他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することが できる。 症状が特に重い場合には、 その症状に応じて増量してもよい。
また、 本発明の抗体は、 例えば、 神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 (家 族性アルツハイマー病、 若年性ァルツハイマ一病、 孤発性アルツハイマー病な ど） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイ ッフェルト一ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿病性ニューロパチ一、 多発 性硬化症など〕 、 糖尿病およびその合併症 （例、 糖尿病性腎症、 糖尿病性ニュ —ロバチ一、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性足病変、 動脈硬化、 高血圧症、 高脂血 症など） などの診断薬としても有用である。 (6) DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明のタンパク質をコードする DNA (以下、 本発明 の外来性 DN Aと略記する） またはその変異 DN A (本発明の外来性変異 DN Aと略記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒ卜哺乳動物、
(2) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1)記載の動物、
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （2) 記載の動物、 および
(4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物におい て発現しうる組換えべクタ一を提供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の DNA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその 始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生に おける胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でか つ一般に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リボフェク シヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DE AE—デキストラン法などにより目的とする DNAを転移することによって作 出することができる。 また、 該 DN A転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培 養などに利用することもでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公 知の細胞融合法により融合させることにより本発明の DN A転移動物を作出す ることもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブ夕、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィ ヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なか でも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的 短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C 57BL/6系統， DBA 2系統など、 交雑系として、 B SCSFi系統， BDF 系統， BeDSFi系統， BALBZc系統， I CR系統など） または ラット （例えば、 Wi s t a r, SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えべクタ一における 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒ卜哺乳動物の他にヒ卜などがあげられる。
本発明の外来性 DNAとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DN Aではなく、 いったん哺乳動物から単離■抽出された本発明の DNAをいう。 本発明の変異 DNAとしては、 元の本発明の DNAの塩基配列に変異 （例え ば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基 への置換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。 該異常 DN Aとしては、 異常な本発明のタンパク質を発現させる DNAを意 味し、 例えば、 正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現 させる DN Aなどが用いられる。
本発明の外来性 DNAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺 乳動物由来のものであってもよい。 本発明の DNAを対象動物に転移させるに あたっては、 該 DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合し た DNAコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明 のヒト DNAを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の DNAを有する 各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラッ ト、 マウスなど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモー夕一の下流に、 本 発明のヒト DN Aを結合した DNAコンストラクト （例、 ベクタ一など） を対 象哺乳動物の受精卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションする ことによって本発明の DN Aを高発現する DN A転移哺乳動物を作出すること ができる。 ，
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯 草菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファ一ジなどのパクテリオ ファージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィル スまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミ ドなどが好ましく用いられる。
上記の DN Α発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 （i) ウィル ス （例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳がんウィルス、 ポリオウイルスなど) に由来する DNAのプ 口モータ一、 （ii) 各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモータ一、 例えば、 アルブミン、 インスリン I I、 ゥロプラキン I I、 エラス夕一ゼ、 エリスロポエチン、 ェン ドセリン、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク質、 ダルタチォ ン S—トランスフェラーゼ、 血小板由来成長因子 ]3、 ケラチン Kl， K1 0お よび K14、 コラーゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパク 質キナーゼ j3 Iサブュニット、 ジス卜ロフィン、 酒石酸抵抗性アル力リフォス ファタ一ゼ、 心房ナトリウム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ (一般に T i e 2と略される） 、 ナトリウムカリウムアデノシン 3リン酸化酵 素 （Na, K-ATP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタロチォネィ ン Iおよび I I A、 メタ口プロティナ一ゼ 1組織インヒビ夕一、 MHCクラス I抗原 （H— 2L) 、 H— r a s、 レニン、 ドーパミン β—水酸化酵素、 甲状腺 ペルォキシダ一ゼ （ΤΡΟ) 、 ペプチド鎖延長因子 l a (EF- 1 ) 、 βァ クチン、 ひおよび) 3ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎夕 ンパク質、 チログロブリン、 T h y— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VN P ) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグロビン、 トロポニン C、 平滑 筋 ァクチン、 プレプロエンケフアリン A、 バソプレシンなどのプロモ一夕一 などが用いられる。 なかでも、 全身で高発現することが可能なサイトメガロウ ィルスプロモーター、 ヒトペプチド鎖延長因子 1 a (E F - 1 α ) のプロモー ター、 ヒトおよびニヮトリ /3ァクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、 D NA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー R Ν Αの転写を終結する配列 （一般にターミネ夕一と呼ばれる） を有しているこ とが好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 D NAの配 列を用いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの S V 4 0夕一ミネ夕 —などが用いられる。
その他、 目的とする外来性 D NAをさらに高発現させる目的で各 D NAのス プライシングシグナル、 ェンハンサー領域、 真核 Aのイントロンの一部な どをプロモ一ター領域の 5 '上流、 プロモータ一領域と翻訳領域間あるいは翻訳 領域の 3，下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス夕一、 ラット、 マウスなど） 由来の 肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 D NAおよび市販の各種ゲノム D N Aライプラリーよりゲノム D NAの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎 臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 R NAより公知の方法により調製された相補 D NAを原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 D NAは、 上 記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘 発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる D NAコンストラクトとして、 前 記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通 常の D N A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 D NA転移後の作 出動物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 D N Aが存在することは、 作出動 ' 物の後代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを保持することを意味する。 本発明の外来性 D NAを受け継いだこの種の動 物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを有す る。
本発明の外来性正常 D NAを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 D N Aを安定に保持することを確認して、 該 D N A保有動物として通常の飼 育環境で継代 育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D NA転移後 の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D N Aが過剰に存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有することを意味する。 本発翻の外来性 D N Aを受け継いだこの種 の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過 剰に有する。
導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌 雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように 繁殖継代することができる。
本発明の正常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 D NAが高発 現させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を促進することにより最終的に 本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物 として利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D N A転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能亢進症や、 本発明のタンパク質が関連する疾患の病 態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。 また、 本発明の外来性正常 D NAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明 のタンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質に関連する疾 患に対する予防 ·治療剤、 例えば神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族 性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病な ど） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイ ッフェルト—ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿病性ニュ一ロバチ一、 多発 性硬化症など〕 、 糖尿病およびその合併症 （例、 糖尿病性腎症、 糖尿病性ニュ 一口パチ一、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性足病変、 動脈硬化、 高血圧症、 高脂血 症など） などの予防 ·治療剤のスクリ一ニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外 来性 D NAを安定に保持することを確認して該 D NA保有動物として通常の飼 育環境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D NAを前述の プラスミドに組み込んで原料として用いることができる。 プロモーターとの D N Aコンストラク卜は、 通常の D N A工学的手法によって作製することができ る。 受精卵細胞段階における本発明の異常 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。 D NA転移後の作出 動物の胚芽細胞において本発明の異常 D N Aが存在することは、 作出動物の子 孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有すること を意味する。 本発明の外来性 D NAを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その 胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D NAを有する。 導入 D NAを相 同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配す ることによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することができ る。
本発明の異常 D N Aを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 D N Aが高発 現させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に 本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル 動物として利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A転移動物を用 いて、 本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの 疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本 発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質によ る正常タンパク質の機能阻害 （dominant negat ive作用） を解明するモデルとな る。
また、 本発明の外来異常 D NAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の タンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質または機能不活 性型不応症に対する予防 ·治療剤、 例えば神経変性疾患 〔例、 病 (家族性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性ァルツハイマ 一病など） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト一ヤコ.ブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿病性ニューロバチ一、 多発性硬化症など〕 、 糖尿病およびその合併症 （例、 糖尿病性腎症、 糖尿病性 ニューロバチ一、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性足病変、 動脈硬化、 高血圧症、 高 脂血症など） などの予防 ·治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。 また、 上記 2種類の本発明の D N A転移動物のその他の利用可能性として、 例えば、
(1) 組織培養のための細胞源としての使用、
(i i) 本発明の D NA転移動物の組織中の D N Aもしくは R NAを直接分析す るか、 または D NAにより発現されたペプチド組織を分析することによる、 本 発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性 についての解析、
(i i i) D NAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを 使用して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(iv) 上記 （i i i) 記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬 剤のスクリーニング、 および
(v) 本発明の変異タンパク質を単離精製およびその枋体作製などが考えられる c さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活 性型不応症などを含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べ ることができ、 また、 本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器にお けるより詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該 疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の D NA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシン などのタンパク質分解酵素により、 遊離した D NA転移細胞の取得、 その培養 またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明の夕 ンパク質産生細胞の特定化、 アポト一シス、 分化あるいは増殖との関連性、 ま たはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなど ができ、 本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料とな る。
さらに、 本発明の DNA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活 性型不応症を含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行な うために、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療 薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DNA転 移動物または本発明の外来性 DN A発現ベクターを用いて、 本発明のタンパク 質が関連する疾患の DN A治療法を検討、 開発することが可能である。 (7) ノックアウト動物
本発明は、 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および 本発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(2) 該 DNAがレポ一夕一遺伝子 （例、 大腸菌由来の^—ガラクトシダーゼ 遺伝子） を導入することにより不活性化された第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(3) ネオマイシン耐性である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒ卜哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(5) ゲッ歯動物がマウスである第 （4) 項記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の DNAが不活性化された該 DNA発現不全非ヒト哺乳動物、
(7) 該 DNAがレポ一ター遺伝子 （例、 大腸菌由来の 3—ガラクトシダーゼ 遺伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝子が本発明の DNAに対するプロモーターの制御下で発現しうる第 （6) 項記載の非ヒト哺 乳動物、
(8) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物、
(9) ゲッ歯動物がマウスである第 （8) 項記載の非ヒト哺乳動物、 および
(10) 第 （7) 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の 発現を検出することを特徴とする本発明の DNAに対するプロモータ一活性を 促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺 乳動物が有する本発明の DN Aに人為的に変異を加えることにより、 DNAの 発現能を抑制するか、 もしくは該 DNAがコードしている本発明のタンパク質 の活性を実質的に喪失させることにより、 D N Aが実質的に本発明の夕ンパク 質の発現能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがあ る） 非ヒト哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学 的手法により該 DN A配列の一部又は全部の削除、 他 DN Aを挿入または置換 させることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コド ンの読み取り枠をずらしたり、 プロモータ一あるいはェキソンの機能を破壊す ることにより本発明のノックアウト DNAを作製すればよい。
本発明の DN Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の DNA不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記する） の 具体例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNA を単離し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐 性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは l ac Z ( 3_ガラクトシダ —ゼ遺伝子） 、 c a t (グロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラーゼ遺 伝子） を代表とするレポ一夕一遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能 を破壊するか、 あるいはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結さ せる DNA配列 （例えば、 p o 1 yA付加シグナルなど） を揷入し、 完全なメ ッセンジャー RN Aを合成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壊 するように構築した DN A配列を有する DN A鎖 （以下、 ターゲッティングべ クタ一と略記する） を、 例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた ES細胞について本発明の DNA上あるいはその近傍の DNA配列を プローブとしたサザンハイブリダィゼーション解析あるいはターゲッティング ベクター上の DNA配列と夕ーゲッティングベクタ一作製に使用した本発明の DN A以外の近傍領域の DN A配列をプライマーとした PC R法により解析し， 本発明のノックアウト ES細胞を選別することにより得ることができる。 ' また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の ES細胞と しては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知 Evansと Kaufniaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、 免疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝 的背景が明らかな ES細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57 BLZ6マ ウスや C 57 BLZ 6の採卵数の少なさを DBA/ 2との交雑により改善した BDFiマウス （C 57 BL/6と DBA/2との を用いて樹立したもの なども良好に用いうる。 BDFiマウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫で あるという利点に加えて、 C 57 BLZ6マウスを背景に持つので、 これを用 いて得られた ES細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 57BLZ6マ ウスとバッククロスすることでその遺伝的背景を C 57 BLZ6マウスに代え ることが可能である点で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効 率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生 殖系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減する ためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の 性決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることがで きる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数 を要していたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むの で、 培養初期における ES細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうこ とが可能であり、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間 は大幅に削減できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンディング法による染 色体数の確認等により行うことができる。 得られる E S細胞の染色体数は正常 数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色 体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体 発生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例えば、 S TO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1 -1 000 OU/ml) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 9 5%空気または 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90 %空気） で約 37 °Cで培養する などの方法で培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン ZEDTA溶液 （通常 0.001-0.5%トリプシン/ 0. l〜5mM EDTA, 好ましくは約 0. 1%トリプシン/ ImM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意したフ ィーダ一細胞上に播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1〜 3日毎に行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受け られた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または 細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋など の種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔Μ· J. Evans及び M. H. Kaufman, Nature第 292巻、 154頁、 1981年； G. R. Martin Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A.第 78巻、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、 ジャーナル 'ォ ブ ·ェンブリオロジー ·アンド ·ェクスペリメンタル ·モルフォロジ一、 第 87 巻、 27頁、 1985年〕 、'本発明の E S細胞を分化させて得られる本発明の DNA 発現不全細胞は、 インビトロにおける本発明の夕ンパク質の細胞生物学的検討 において有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRNA量を公知方法 を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別 することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製 したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し， 導入により夕一ゲッティングベクタ一の本発明の D N Aが不活性化された D N A配列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色 体上の本発明の D NAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の D N Aをノックアウトさせることができる。
本発明の D NAがノックアウトされた細胞は、 本発明の D N A上またはその 近傍の D NA配列をプローブとしたサザンハイブリダィゼ一ション解析または 夕一ゲッティングベクタ一上の D N A配列と、 夕ーゲッティングベクタ一に使 用したマウス由来の本発明の D NA以外の近傍領域の D N A配列とをプライマ 一とした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細 胞を用いた場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D N Aが不活性化され た細胞株をクローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒ ト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒ ト哺乳動物の子宮に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D N A座をも つ細胞と人為的に変異した本発明の D N A座をもつ細胞との両者から構成され るキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D NA座をもつ場合、 こ のようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全 ての組織が人為的に変異を加えた本発明の D NA座をもつ細胞で構成された個 体を、 例えば、 コートカラ一の判定等により選別することにより得られる。 こ のようにして得られた個体は、 通常、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個 体であり、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの 産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション 法で D N A溶液を注入することにより夕一ゲッティングベクタ一を染色体内に 導入したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトラ ンスジエニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D NA座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D N Aがノックァゥトされている個体は、 交配によ. り得られた動物個体も該 D N Aがノックアウトされていることを確認して通常 の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。 さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D NA を相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザ ィゴ一ト動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴ一卜複数になる ような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴ一 ト動物の雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴート およびへテロザィゴ一ト動物を繁殖継代する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明のタンパク質によ り誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のタンパク質の生物活 性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因 究明及び治療法の検討に有用である。 ( 7 a ) 本発明の D NAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防 効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D NAの欠損や損傷な どに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに 用いることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物 を投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D NA の欠損や損傷などに起因する疾病、 例えば神経変性疾患 〔例、 アルッハイマ一 病 （家族性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性ァルツハイマ —病など） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト—ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿病性ニューロパチ一、 多発性硬化症など〕 、 糖尿病およびその合併症 （例、 糖尿病性腎症、 糖尿病性 ニューロバチ一、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性足病変、 動脈硬化、 高血圧症、 高 脂血症など） などに対して治療 ·予防効果を有する化合物またはその塩のスク リーニング方法を提供する。 該スクリーニング方法において用いられる本発明の D N A発現不全非ヒト哺 乳動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿な どがあげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物 であってもよい。
具体的には、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理 し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変 化を指標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注 射などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選 択す
ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質 などにあわせて適宜選択することができる。
例えば神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族性アルツハイマー病、 若 年性アルツハイマー病、 孤発性アルッ八ィマ一病など) 、 パーキンソン病、 ダ ゥン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト一ヤコブ病、 ノ ンチントン舞踏病、 糖尿病性ニューロパチ一、 多発性硬化症など〕 、 糖尿病お よびその合併症 （例、 糖尿病性腎症、 糖尿病性ニューロバチ一、糖尿病性網膜 症、 糖尿病性足病変、 動脈硬化、 高血圧症、 高脂血症など） などに対して治 療'予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、 本発明の D NA発現 不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、 試験化合物非投与群と神経細胞死 数の違い、 種々のタンパク質量の違いなどを上記組織で経時的に観察する。
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該 試験動物の上記疾患症状が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ま しくは約 5 0 %以上改善した場合、 該試験化合物を上記の疾患に対して治療- 予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリ一ニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物から 選ばれた化合物であり、 本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起 こされる疾患に対して治療 ·予防効果を有するので、 該疾患に対する安全で低 毒性な予防 ·治療剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記ス クリ一ニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることがで さる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合 物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 (例、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容さ れる酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩 酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） と の塩などが用いられる。
該スクリ一ニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前 記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。 このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトま たは哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど) に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 該化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体 重 60 kgとして） のアルツハイマー病患者においては、 一日につき該化合物 を約 0.1〜： L 00mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. • 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は 投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 該化合物を注射剤の形 で通常成人 （体重 60 kgとして） のアルツハイマー病患者に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omgを静脈注射により投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 体重 6 Okg当たりに換算した量を投与することがで さる。 (7 b) 本発明の DNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化 合物をスクリーニング方法
本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を投与し, レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対する プロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニン グ方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DNA発現不全非ヒ卜哺乳動物 としては、 前記した本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明 の DN Aがレポ一夕一遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポ一夕 —遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが 用いられる。
試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。
レポ一夕一遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 ]3—ガラクトシ ダ一ゼ遺伝子 (1 a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファタ一ゼ遺伝子またはル シフエラ一ゼ遺伝子などが好適である。
本発明の DN Aをレポーター遺伝子で置換された本発明の DN A発現不全非 ヒト哺乳動物では、 レポ一夕一遺伝子が本発明の DNAに対するプロモーター の支配下に存在するので、 レポ一夕一遺伝子がコードする物質の発現を卜レー スすることにより、 プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、 本発明のタンパク質をコードする DNA領域の一部を大腸菌由来の )3—ガラクトシダーゼ遺伝子 （ 1 a c Z) で置換している場合、 本来、 本発明 . のタンパク質の発現する組織で、 本発明のタンパク質の代わりに 0—ガラクト シダーゼが発現する。 従って、 例えば、 5—ブロモー 4一クロロー 3—インド リル一 /3 _ガラクトピラノシド (X— g a l) のような iS—ガラクトシダ一ゼ の基質となる試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明のタンパク質の 動物生体内における発現状態を観察することができる。 具体的には、 本発明の タンパク質欠損マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩衝生理食塩液 (PBS) で洗浄後、 X— g a 1を含む染色液で、 室温 または 37°C付近で、 約 3 Q分ないし 1峙間反応させた後、 組織標本を ImM E D T Aノ P B S溶液で洗浄することによって、 ]3—ガラクトシダーゼ反応を 停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mR N Aを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した 試験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D NAに対するプロモーター 活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリ一ニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合 物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 ァ ルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付 加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン 酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ 酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩な どが用いられる。
本発明の D N Aに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物また はその塩は、 本発明のタンパク質の発現の調節、 該タンパク質の機能を調節す ることができるので、 例えば神経変性疾患 〔例、 アルツハイマー病 （家族性ァ ルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性ァルツハイマー病など) 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側索硬化症、 プリオン病、 クロイツフエ ルト—ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿病性ニューロパチ一、 多発性硬化 症など〕 、 糖尿病およびその合併症 （例、 糖尿病性腎症、 糖尿病性ニューロパ チ一、 糖尿病性網膜症、'糖尿病性足病変、 動脈硬化、 高血圧症、 高脂血症な ど） などの予防 ·治療剤として有用である。
さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様 に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前 記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造する ことができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトま たは哺乳動物 （例えば、 ラ.ット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモー夕一活性を阻害 する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60 kgとして） のアル ッハイマー病患者においては、 一日につき該化合物を約 0.1〜100mg、 好 ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患など によっても異なるが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモーター活性を阻 害する化合物を注射剤の形で通常成人 （60 kgとして） のアルツハイマー病 患者に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg、 好ましく は約 0. 1〜2 Omg、 より好ましくは約 0. 1〜 1 Omgを静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60 kg当たりに換算し た量を投与することができる。
このように、 本発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の DNAに 対するプロモ一タ一の活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリ 一二ングする上で極めて有用であり、 本発明の DN A発現不全に起因する各種 疾患の原因究明または予防 ·治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、 本発明のタンパク質のプロモータ一領域を含有する DN Aを使って、 その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞 に注入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれば、 特異的にそのタンパク質を合成させ、 その生体での作用を検討することも可能 となる。 さらに上記プロモ一夕一部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、 これが発現するような細胞株を樹立すれば、 本発明の夕ンパク質そのものの体 内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探 索系として使用できる。 ·
(8) 本発明のタンパク質が関与する各種疾病の予防 ·治療剤
本発明のタンパク質は、 Aktlと結合し、 Aktl活性を阻害する。 したがって、 本発明のタンパク質をコードする D NAに異常があったり、 欠 損している場合あるいは本発明のタンパク質の発現量が減少している場合には、 例えば、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆 道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍など） 、 リウマチ性疾患 （例、 慢性関節リウマチ、 変形関節 症、 痛風など） などの種々の疾患が発症する。
よって、 本発明のタンパク質および本発明の D N Aは、 例えば、 癌 （例、 大 腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌 滕臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫瘍な ど） 、 リウマチ性疾患 （例、 慢性関節リウマチ、 変形関節症、 痛風など） など の予防 ·治療剤として使用することができる。
例えば、 生体内において本発明の夕ンパク質が減少あるいは欠損しているた めに、 本発明のタンパク質の活性が十分に、 あるいは正常に発揮されない患者 がいる場合に、 （ィ）本発明の D NAを該患者に投与し、 生体内で本発明の夕 ンパク質を発現させることによって、 （口） 細胞に本発明の D NAを揷入し、 本発明のタンパク質を発現させた後に、 該細胞を患者に移植することによって、 または （八） 本発明のタンパク質を該患者に投与することなどによって、 該患 者における本発明のタンパク質の役割を十分に、 あるいは正常に発揮させるこ とができる。
本発明の D NAを上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、 該 D NAを単 独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクタ一、 アデノウィル スァソシェ一テツドウィルスベクタ一などの適当なベクターに揷入した後、 常 套手段に従って、 ヒトまたは温血動物に投与することができる。 本発明の D N Aは、 そのままで、 あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認めら れる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイド口ゲルカテーテルのようなカテ —テルによって投与できる。
本発明のタンパク質を上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、 少なくと も 9 0 %、 好ましくは 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上、 さらに好まし くは 9 9 %以上に精製されたものを使用するのが好ましい。 本発明のタンパク質は、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル 剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もし くはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの 注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 本発明のタンパク質を生理学的 に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒグル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤など とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和すること によつて製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された 範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
鲑剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼ ラチン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性 セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよ うな膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖または サッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのよう な香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記夕 イブの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のた めの無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油な どのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施 に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬 を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩ィ匕ナトリウ ムなど） などが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 エタノールなど） 、 ポリアルコール （例えば、 プロピレングリコール、 ポリエ チレングリコールなど） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルべ一ト 8 0™、 H C O— 5 0など） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが挙げられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジ ルアルコールなどと併用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液など） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩 酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレング リコールなど） 、 保存剤 (例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど) 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプ ルに充填される。
本発明の DNAが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、 通常、 非 経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 温血動 物 （例えば、 ヒト、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ 夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど) に対して投与するこ とができる。
本発明のタンパク質の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 慢性関節リウマチの治療目的で本発明のタンパク質 を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O kgとして） においては、 一日 にっき該タンパク質を約 0.1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該 タンパク質の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例え ば、 慢性関節リゥマチの治療目的で本発明のタンパク質を注射剤の形で成人 (体重 60 kgとして） に投与する場合、 一日につき該タンパク質を約 0. 0 1〜3 Omg、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omgを患部に ¾射する'ことにより投与するのが好都合である。 他の動物の場 合も、 体重 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。 本明細書において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC- IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野におけ る慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し光学 異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA デォキシリポ核酸
cDNA 相補的デォキシリポ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン C
RNA リポ核酸
mRNA ーリポ核酸 dATP '三リン酸 dTTP デォキシチミジン三リン酸 dGTP デォキシグアノシン三リン酸 dCTP デォキシシチジン三リン酸 ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸 SDS ドデシル硫酸ナトリウム G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
Va 1 バリン
Le u
I 1 e
S e r セリン
Th r スレオニン
Cy s
Me t メチォニン
G 1 u グルタミン酸
As ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g アルギニン
H i s ヒスチジン
P e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン
T r p トリプトファン
P r o プロリン
A s n ァスパラギン G 1 n グルタミン
pG 1 u ピログルタミン酸
S e c (selenocysteine) また、 本明細 ：中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表 記する。
M e メチル基
E t ェチル基
Bu ブチル基
P h フエニル基
TC チアゾリジン一 4 (R) —カルポキサミド基
T o s p_トルエンスルフォニル
CHO ホルミル
B z 1 ベンジレ
Cl2-Bzl ： 2， 6ージクロ口べンジル
B om ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルポニル
C 1一 Z 2一クロ口べンジルォキシカルポニル
B r -Z 2一ブロモベンジルォキシカルポニル
B o c t一ブトキシカルポニル
DNP ジニトロフエニル
T r t 卜リチル
Bum t一ブトキシメチル
Fmo c N— 9一フルォレニルメトキシカルボニル
HOB t 1ーヒドロキシベンズトリアゾール
HOOB t 3， 4ージヒドロ一 3—ヒドロキシー 4ーォキソ一
1, 2， 3—ベンゾトリアジン
HONB 1—ヒドロキシー 5—ノルポルネンー 2, 3—ジカ ルポキシイミド 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
ヒト Neuronal cell death inducible putative kinase (NIPK) のアミノ酸酉己列 を示す。
〔配列番号： 2〕
ヒト NIPKをコ一ドする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3〕
実施例 3および実施例 5で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
実施例 3で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
GenBank Accession No. NM021158の塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
配列番号： 5で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 7〕
GenBank Accession No. 丽 021158の 251番目の Aが Gに置換された塩基配列を示す c 〔配列番号： 8〕
配列番号： 7で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 9〕
GenBank Accession No. AAF30480の塩基配列を示す。
〔配列番号： 10〕
配列番号： 9で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 1 1〕
GenBank Accession No. AAH76218の塩基配列を示す。
〔配列番号： 12〕
配列番号： 1 1で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 1 3〕 GenBank Accession No. AAI 58064の塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕
配列番号： 1 3で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 15〕
GenBank Accession No. AAI59850の塩基配列を示す。
〔配列番号： 16〕
配列番号： 1 5で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 17〕
GenBank Accession No. AAS06709の塩基配列を示す。
〔配列番号： 18〕
配列番号： 17で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 19〕
GenBank Accession No. AF250311の塩基配列を示す。
〔配列番号： 20〕
配列番号： 1 9で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 21〕
実施例 4で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 22〕
実施例 4で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 23〕
実施例 5で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 24〕
実施例 5で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 25〕
実施例 5で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。 以下において、 実施例により本発明をより具体的にするが、 この発明はこれ らに限定されるものではない。
実施例 1 小胞体ストレスで発現変動する遺伝子群を明らかにするため、 以下のような 実験を行った。
タイプ I型コラーゲンコート 24穴プレート （SUMIL0N) に TP- 17の CDラット (日本チャールズリバ一） より調製したラット初代神経細胞を B27含 Neurobasal 培地 （NB培地： GIBC0) に懸濁した後、 25万個 Zwellで播種し 3日間培養した。
(i) 上記培養細胞に最終濃度 ΙΟΟηΜとなるようッニカマイシン （Tnc) を添加し、
(ii) 上記培養細胞に最終濃度 2nMとなるようタブシガーギン （Thap) を添加し、 または （iii) 上記培養細胞を、 グルコースを含まない B27含 DMEM培地で 2回培地 交換した後、 3mMとなるよう 2-デォキシグルコース （2DG) を添加し、 それぞれ 4、 8および 24時間後に細胞より RNeasy Mini kit (キアゲン） を用いて実験手引き 書に従い total RNAを抽出した。 対照として上記薬剤 （Tnc、 Thapおよび 2DG) の 代わりに、 各培地を添加した細胞 （薬剤非添加細胞） を用いた。 これらを材料 として ol igonucleotide microarray (Rat Genome U34A; Affymetrix社) を用い て遺伝子発現解析を行った。
実験方法は、 Affymetrix社の実験手引き書 (Expression analysis technical manual) に従った。 各薬剤で刺激した細胞と非添加の細胞の遺伝子発現 profile を比較した結果、 euronal cell death inducible putative kinase (NIPK) 遺 伝子が、 各小胞体ストレス刺激 〔上記 （i) 、 (ii) および （iii) 〕 により発 現亢進していた （表 1) 。
〔表 1〕
細胞 遺伝子発現』
Tnc刺激 4時間後 0.41
非刺激 4時間後 ND
Tnc刺激 8時間後 1.64
非刺激 8時間後 ND
Tnc 24時間後 1.32
非刺激 24時間後 ND
Thap刺激 4時間後 0.93
非刺激 4時間後 ND
Thap 8時間後 2.70
非刺激 4時間後 ND
Thap剌激 24時間後 1.64
非刺激 24時間後 ND
2DG添加 4時間後 0.72
非刺激 4時間後 ND
2DG添加 8時間後 1.79
非刺激 8時間後 ND
2DG添加 24時間後 2.45
非刺激 24時間後― ND
a遺伝子発現量は、 oligonucleotide microarrayで発現が検出された presenceを示す遺伝子の発現量の中央値を 1として標準化した。
ND; not detected 実施例 2
小胞体ストレスにより発現亢進した NIPK遺伝子の発現に ]3アミロイド刺激が 影響を与えるか否かを検討する目的で、 /3アミロイドで刺激した細胞を用いて 実施例 1と同様に遺伝子発現解析を行なった。
実施例 1と同様に調製したラット初代神経細胞を N2含 DMEM培地 （GIBC0) に懸 濁した後、 25万個/ wel lで播種し 4日間培養した。 培養後、 最終濃度 25μΜとなる よう上記培地で懸濁した iQアミロイドを添加し、 4、 8、 24時間後に実施例 1と 同様に、 細胞より total RNAを抽出し、 遺伝子解析を行なった。 対照には ]3アミ ロイドの代わりに上記培地を添加した細胞を用いた。 対照と比較して、 ；8アミ ロイドで刺激した細胞で NIPKの発現が亢進していた （表 2 ) 。'
〔表 2〕
細胞—
/3アミロイド刺激 4時間後 ND
非刺激 4時間後 ND
；6アミロイド刺激 8時間後 ND
非刺激 8時間後 ND
iSアミロイド刺激 24時間後 0. 34
非刺激 24時間後 ND
a遺伝子発現量は、 o l igonuc leo t i de mi croarrayで発現が検出された presenceを示す遺伝子の発現量の中央値を 1として標準化した。 実施例 3
NIPKが細胞死に与える影響を検討する目的で、 一過性形質導入を用いて NIPK 遺伝子発現細胞を作製し、 細胞死誘導系に供した。
ヒト神経芽細胞腫 SK-N- AS細胞 （ATCCより購入） に最終濃度 500nMとなるよう タブシガーギンを添加し 8時間培養した。 培養後、 IS0GEN (二ツボンジーン） を 用いて tot al RNAを抽出した。 得られた t o t al RNAを铸型として RNA PCR ki t
(TA ARA) を用いて逆転写反応を行なった。 ヒト NIM遺伝子の増幅のため、 合 成プライマ一 （配列番号： 3および配列番号： 4 ) と、 酵素として Pfu turbo (ストラタジーン） を用い、 以下の （1) 〜 （5) の条件で PCRを行ない、 特異的 な PCR産物を得た。
(1) 95°C 1分
(2) 95°C 20秒一 68。C 15秒一 72°C 1分を 3回 (3) 95°C 20秒一 66 15秒— 72°C 1分を 3回
(4) 95°C 20秒一 64°C 15秒一 72°C 1分を 35回
• (5) 72°C 5分
得られた PCR産物を、 PCDNA3.卜/ V5_Hi s T0P0 (インビトロジェン） へクロ一 ニングし、 大腸菌 DH5 を形質転換した。 得られたコロニーを LB培地で培養し、 QUAGEN pl asmi d mi d i ki t (キアゲン） を用いてベクタ一を回収した。 この NIPK 遺伝子発現ベクターを Nuc l eofec tor (AMAXA) を用い、 SK-N- AS細胞へ形質導入 した。 対照として PCDNA3. 1 (インビトロジェン） を SK-N-AS細胞へ形質導入した。 各形質導入細胞をタイプ Iコラーゲンコート 96穴プレート （IWAKI) へ 7500個 Zゥエルで播種し、 1晚培養後、 ッニカマイシンまたはタブシガーギンを種々の 濃度で添加し、 1日または 2日間培養し細胞死を誘導した。 培養後、 細胞死に伴 う DM切断を、 CELL DEATH DETECTION EL ISA PLUS ki t (ロッシュ) を用い検出し た。 実験方法は、 キットに添付された実験手引き書に従った。
結果を図 1〜図 4に示す。
PCDNA3. 1形質導入 SK-N-AS細胞 （対照細胞） と比較して、 ヒト NIPK遺伝子形質 導入細胞では DNA切断が亢進した。 これより、 NIPKが細胞死促進作用を有するこ とが明らかである。 実施例 4
NIMが細胞死に与える影響を検討することを目的として、 レンチウィルスを 用いてラット NIPK遺伝子発現細胞を作製し、 細胞死誘導系に供した。
ラッ卜海馬神経細胞に最終濃度 100 nMとなるようッニカマイシンを添加し 8時 間培養した。 培養後、 細胞より RNeasy Mini ki t (キアゲン) を用いて tot al RNAを抽出した。 得られた tot al RNAを铸型として RNA PCR ki t (TAKARA) を用い て逆転写反応を行なった。 ラット NIPK遺伝子の増幅のため、 合成プライマ一
(配列番号： 2 1および配列番号： 2 2 ) と、 酵素として Pfu turbo (ストラタ ジーン） を用い、 以下の （1) 〜 （3) の条件で PCRを行い、 特異的な PCR産物を 得た。
(1) 94°C 1分 (2) 94°C 30秒— 65 30秒一 72°C 30秒を 25回
(3) 72°C 5分
得られた PCR産物を、 viraPower Lentiviral Directional TOPO Expression Kit (INVITR0GEN)を用いて pLenti6/V5-TOP0ベクタ一にクローニングし、 大腸菌 DH5Q!を形質転換した。 得られたコロニーを L.B培地で培養し、 QIAGEN endofree ma i kit (キアゲン） を用いてベクタ一を回収した。 作製した NIPKレンチウイ ルスべクタ一、 または LacZレンチウィルスベクタ一と packaging Mixを
Nucleofector (AMAXA) を用い、 同時に HEK293FT細胞 （インビトロジェン） に導 入した。 24時間後に培地を交換し、 導入から 48および 72時間後に培養上清を回 収した。 回収した培養上清を 40000xgで 4時間遠心し、 沈殿を 1/100量のニューロ ベィサル培地で溶解させ、 4°Cで一晩放置した後、 37°Cに加温して使用した。
SD - IGSラット （日本チャールズリパーから購入） の TP17の胎児を使用し、 定 法に従い海馬神経細胞を単離し、 ポリい Jジンコート 24穴プレート （SUMIL0N) へ 25万個/ゥエルで播種した。 培養 4日後にレンチウィルス （培養上清 50 ml相 当） を含む培地 500 1を添加し、 24時間後に 3 nMの夕プシガーギンを含む培地 で全量交換を行なった。 培養 2日後に WST-8を培地の 1/10量加え、 37 で 90分培 養した後培地を 200 1回収し、 450 nmの吸光度を測定した。
結果を図 5に示す。
LacZ形質導入ラット神経細胞 （対照細胞） と比較して、 ラット NIPK遺伝子形 質導入細胞ではミトコンドリア呼吸活性の低下が見られた。 これより、 NIPKが 細胞死促進作用を有することが明らかである。 実施例 5
NIPKと Aktlの結合を確認することを目的として以下の実験を行なった。
pCDNA3.1-/V5-His T0P0 (インビトロジェン） ベクターにクロ一ニングしたヒ ト NIPK (実施例 3) を鎵型とし、 合成プライマー （配列番号： 3および配列番 号： 2 3) と、 酵素として Pfu turbo (ストラタジーン） を用い、 以下の （1) 〜 （3) の条件で PCRを行い、 特異的な PCR産物を得た。
(1) 9 °C 5分 (2) 94°C 30秒一 60°C 30秒一 72°C 1分を 25回
(3) 72°C 5分
得られた PCR産物を、 PCDNA3.1-/V5- His T0PO (インビトロジェン） へクロー ニングし、 大腸菌 DH5Q:を形質転換した。 得られたコロニーを LB培地で培養し、 QIAGEN endofree maxi kit (キアゲン） を用いて V5タグ付きヒト NIM遺伝子発 現ベクターを回収した。
Aktl遺伝子発現ベクターは以下の方法で作製した。 Quick- clone human whole brain cDNA (クロンテック) を铸型とし、 合 プライマー （配列番号： 24お よび配列番号： 25) と酵素として Pfu turbo (ストラタジーン） を用い、 以下 の （1) 〜 （3) の条件で PCRを行った。
(1) 94°C 5分
(2) 9 °C 30秒一 58°C 30秒一 72°C 2分を 35回 '
(3) 72°C 5分
得られた PCR産物 2 1を铸型とし、 同様の合成プライマーと酵素を用い、 以下 の （1) 〜 （3) の条件で PCRを行い、 特異的な PCR産物を得た。
(1) 94°C 5分
(2) 9 °C 30秒一 58°C 30秒一 72°C 2分を 20回
(3) 72°C 5分
得られた PCR産物を、 PCDNA3.1- /V5 - His T0P0 (インビトロジェン） へクロ一 ニングし、 大腸菌 DH5Q!を形質転換した。 得られたコロニーを LB培地で培養し、 QIAGEN endofree maxi kit (キアゲン） を用いてベクターを回収した。
上記で得られた V5夕グ付きヒト NI PK遺伝子発現べクタ一および Ak 11遺伝子発 現べクタ—を、 Nucleofector (AMAXA) を用いて同時に C0S7細胞に導入した。 こ の細胞をタイプ Iコラーゲンコート 10 cmシャ一レに 400万個/シャーレで細胞を 播種し、 37°Cで 18時間培養した。 培地を除去し細胞を回収した後、 lysis buffer 〔50 mM Tris-HCl (pH7.5) 150 mM NaCl、 0.5 % NonidetP - 40、 1 mM j3-mercaptoet anoK protease inhibitor cocktail (ROCHE) 〕 で懸濁し、 ホ モジナイザーにより細胞を破碎した。 遠心により回収した上清に rec-protein G sepharose 4B (ZYMED) を添加し、 4°Cで 2時間反応した後、 上清を回収し、 rec_ protein G sepharose 4B、 抗 V5抗体 (INVITROGEN) を加え、 4°Cで 18時間回転さ せながら反応した。 1 mlの lys is buf ferで 4回洗浄後、 電気泳動を行い、 抗 Akt l 抗体 (SANTA CRUZ) を用いてウエスタンブロッテイングを行なった。
結果を図 6に示す。
V5タグ付き NIPKと Akt lを同時に発現させた場合 Akt 1が検出されるのに対して、 GFP (和光純薬） と Akt lを同時に発現させた場合 （対照群） には Akt lは検出され なかった。 これより、 NIPKと Aktlが細胞内で結合することが確認された。 NIPK と Akt lとの結合は、 Akt lの活性低下を惹起し、 Akt lによる神経細胞保護作用の 抑制を介した神経細胞死を促進することが示唆される。 したがって、 NIPKを阻 害することにより、 神経変性疾患の治療が期待できる。 産業上の利用可能性
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、 該タンパ ク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 該タンパク質に対する抗 体、 該遺伝子のアンチセンスポリポリヌクレオチドなどは、 例えば神経変性疾 患 〔例、 アルツハイマー病 （家族性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー 病、 孤発性アルツハイマー病など） 、 パーキンソン病、 ダウン症、 筋萎縮性側 索硬化症、 プリオン病、 クロイツフェルト—ヤコブ病、 ハンチントン舞踏病、 糖尿病性ニューロパチ一、 多発性硬化症など〕 、 糖尿病およびその合併症 （例、 糖尿病性腎症、 糖尿病性ニューロパチ一、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性足病変、 動脈硬化、 高血圧症、 高脂血症など） などの予防 ·治療剤として、 また、 該タ ンパク質の活性を促進する化合物またはその塩、 該タンパク質の遺伝子の発現 を促進する化合物またはその塩、 該タンパク質、 該タンパク質をコードするポ リヌクレオチドなどは、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道 癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道 脾臓癌、 腎癌、 fl旁胱癥、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺 癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 血液腫 など） 、 リウマチ性疾患 （例、 慢性関 節リウマチ、 変形関節症、 痛風など） などの予防 ·治療剤として使用すること ができる。 また、 本発明の各種のポリヌクレオチドは、 例えば上記疾患の診断 に有用である。

Claims

請求 の 範 囲
1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活 性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患または糖尿病の 予防 ·治療剤。
2 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺 伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患または 糖尿病の予防 ·治療剤。
3 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌ クレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその 一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド。
4. 請求項 3記載のァンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
5 . 神経変性疾患または糖尿病の予防 ·治療剤である請求項 4記載の医薬。
6 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対す る ¾ι体。
7 . 請求項 6記載の抗体を含有してなる医薬。
8 . 神経変性疾患または糖尿病の予防 ·治療剤である請求項 7記載の医薬。
9 . 請求項 6記載の抗体を含有してなる診断薬。
1 0 . 神経変性疾患または糖尿病の診断薬である請求項 9記載の診断薬。
1 1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患または糖尿病の診断薬。
1 2 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有する夕ンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を 用いることを特徴とする、 上記タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそ の塩の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
1 3 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を 含有することを特徴とする、 上記夕ンパク質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリ一ニング用キット。
1 4. 請求項 1 2記載のスクリーニング方法または請求項 1 3記載のスクリ —ニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩。
1 5 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを用いることを特徴とする、 上記タンパク質遺伝子の発現を阻害 する化合物またその塩のスクリ一ニング方法。
1 6 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを含有することを特徴とする、 上記夕ンパク質遺伝子の発現を阻 害する化合物またその塩のスクリーニング用キット。
1 7 . 請求項 1 5記載のスクリーニング方法または請求項 1 6記載のスクリ —ニング用キットを用いて得られうる化合物またその塩。
1 8 . 請求項 1 4または請求項 1 7記載の化合物またその塩を含有してなる 1 9 . 神経変性疾患または糖尿病の予防 ·治療剤である請求項 1 8記載の医 薬。
2 0 . 哺乳動物に対して、 請求項 1 4または請求項 1 7記載の化合物またそ の塩の有効量を投与することを特徴とする神経変性疾患または糖尿病の予防- 治療法。
2 1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドの活性を阻害する, または上記タンパク質遺伝子の発現を阻害することを特徴とする神経変性疾患 または糖尿病の予防 ·治療法。
2 2 · 神経変性疾患または糖尿病の予防 ·治療剤を製造するための請求項 1 4または請求項 1 7記載の化合物またその塩の使用。
2 3 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の 活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる癌またはリウマチ性疾患の 予防 ·治療剤。
2 4. 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の 遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩を含有してなる癌またはリウマチ 性疾患の予防 ·治療刳。
2 5 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩を含 有してなる医薬。
2 6 . 癌またはリウマチ性疾患の予防 ·治療剤である請求項 2 5記載の医薬 c 2 7 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを含有してなる医薬。
2 8 . 癌またはリウマチ性疾患の予防 ·治療剤である請求項 2 7記載の医薬。
2 9 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを含有してなる癌またはリゥマチ性疾患の診断薬。
3 0 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を 用いることを特徴とする、 上記タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそ の塩の活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
3 1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を 含有することを特徴とする、 上記夕ンパク質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
3 2 . 請求項 3 0記載のスクリーニング方法または請求項 3 1記載のスクリ 一二ング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩。
3 3 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチ.ドをコードするポリ ヌクレオチドを用いることを特徴とする、 上記タンパク質遺伝子の発現を促進 する化合物またその塩のスクリーニング方法。
3 4. 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを含有することを特徴とする、 上記夕ンパク質遺伝子の発現を促 進する化合物またその塩のスクリーニング用キット。
3 5 . 請求項 3 3記載のスクリーニング方法または請求項 3 4記載のスクリ 一二ング用キットを用いて得られうる化合物またその塩。
3 6 . 請求項 3 2または請求項 3 5記載の化合物またその塩を含有してなる
3 7 . 癌またはリウマチ性疾患の予防 ·治療剤である請求項 3 6記載の医薬。 3 8 . 哺乳動物に対して、 請求項 3 2または請求項 3 5記載の化合物またそ の塩の有効量を投与することを特徴とする癌またはリウマチ性疾患の予防 ·治
3 9 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドの活性を促進する, または上記タンパク質遺伝子の発現を促進することを特徴とする癌またはリウ マチ性疾患の予防 ·治療法。
4 0 . 癌またはリゥマチ性疾患の予防 ·治療剤を製造するための請求項 3 2 または請求項 3 5記載の化合物またその塩の使用。
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