WO2004018651A1

WO2004018651A1 - リゾチーム感受性新規微生物

Info

Publication number: WO2004018651A1
Application number: PCT/JP2003/010342
Authority: WO
Inventors: Yasuo Mitani; Nobutaka Nakashima; Tomohiro Tamura
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2002-08-20
Filing date: 2003-08-14
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2005-02-20
Also published as: AU2003257852A1; US7354754B2; JP3876310B2; US20060166312A1; JP2004073116A

Abstract

野生型株と比べて低濃度のリゾチームに対して感受性であり、容易に溶菌が可能で、発現させた組換えタンパク質の回収が容易なロドコッカス属細菌の提供。　野生型ロドコッカス属微生物に比べ、リゾチームに対する感受性が高い変異ロドコッカス属微生物。

Description

明細書リゾチーム感受性新規微生物技術分野 '

本発明は、組換えタンパク質の産生に適した口ドコッカス属微生物に関する。具体的には、野生型株と比べて低濃度のリゾチームに対して感受性であり、容易に溶菌が可能な変異株に関する。該変異株を用いることにより発現タンパク質の抽出回収を容易に行うことができる。

背景技術

微生物を宿主とした組換えタンパク質の発現に係る技術として、大腸菌を宿主とした発現系が広く一般に利用されている。その理由として、宿主微生物としての安全性が確認されていること、増殖が早いこと、分子生物学的実験操作が充分に確立されていること等を含め実験室における取り扱いが極めて容易であることが挙げられる。その一方で、組換えタンパク質の発現において、大腸菌に見られない有用性、優位性を持つ宿主微生物の開発が進められている。

口ドコッカス属微生物は一部を除き病原性が無く、通常の実験室内で容易に培養が可能であるといった必須条件に加え、産業上極めて有用な微生物触媒としての機能を有しているため、近年様々な分子生物学的技術が開発されている。例えば、該微生物にさらに有用な機能を付加する目的で、遺伝子組換え技術に係る開発が行われ、大腸菌および口ドコッカス属微生物のいずれにおいても自立複製が可能なシャトルベクタ一が確立されている（R, De Mot et al.， Microbiology丄 43- 3137-3147 (1997) )。また、ロドコッカス属微生物においては転移可能なトランスポゾンの存在も報告されており（1， Nagy et al. , J. Bac teriol. Π9, 463 5-4638 (1997) ) 遺伝子破壌や染色体への外来遺伝子の組み込み等による該微生物の機能改良が期待される。

こうした分子生物学的基盤の確立の上に、微生物触媒としての機能をさらに高めることを目的として、組換えタンパク質の発現のためのベクターの開発が行われている（特開平 10-248578)。

口ドコッカス属微生物であるロドコッカス ·エリス口ポリスは微生物触媒としての有用性に加えて、 4 °Cという低温環境下での増殖が可能であるという際だつた特徴を有する。それゆえ、これまでには確立されていなかった、大腸菌等を用いた場合には不可能な温度域での組換えタンパク質等の物質生産を可能にすることが期待され、かかる目的で誘導型発現ベクターの開発がなされている（既出願、田村；平成 14年 8月 1 2日出願）。

しかしながら、口ドコッカス属の微生物は他のグラム陽性菌と比べて細胞壁の構造が特殊で強固であるため、該微生物からの細胞内容物の抽出は大腸菌等に比ベて煩雑かつ困難である。すなわち、ロドコッカス属微生物は、微生物を溶菌するために一般的に用いられるリゾチームなどの細胞壁溶解酵素に対して極めて強い抵抗性を有しているため、その溶菌方法として、高濃度のペニシリン等の抗生剤に一定時間接触させることで細胞壁を弱めた上でリゾチームによる溶菌処理を行うという方法や、長時間に及ぶ超音波処理によって物理的に菌体を破碎する方法がとられている。このような方法では、処理が煩雑になることに加えて、大量の菌体の処理が困難であること、検体間での処理に差が出やすいこと等産業利用を図る上で大きな問題点がある。また、ペニシリン等の抗生剤は細胞壁の新規の合成を阻害することでその効果をもたらすものであり、合成が完了した細胞壁に対しては何ら影響を及ぼさない。従って、低温下等に見られるような急速な増殖が期待されない状況ではその効果は著しく低下するものと考えられる。

なお、口ドコッカス属に見られる細胞壁の構造はコリネ型細菌にも共通のものであることが知られており（ E. Barry I I I et al.， Prog. Lip id Res. 37, 1 43-179 (1988) )、形質転換等の分子生物学的操作を容易にする目的において本発明と類似の発明がなされている（特公平 01- 003475, T. Hi rasawa et al. , J. Ba c teriol. 182, 2696-2701 (2000) ) ₀

発明の開示

本発明は、リゾチームに対する感受性が高まり、低濃度のリゾチームで容易に溶菌し得るロドコッカス属微生物であって、外来遺伝子を組込んで発現させた後に、リゾチーム処理を行うことにより容易に該夕ンパク質を回収することのできるロドコッカス属微生物の提供を目的とする。また、本発明は、前記リゾチームに対する感受性が高い口ドコッカス属微生物を用いて外来タンパク質を産生させる方法を提供する。

本発明者らは細胞内容物の抽出処理が困難であるという点を克服しロドコッカス属微生物を用いた組換えタンパク質の発現系を完成させることを目的とし、野生型株と比べて極めて低濃度のリゾチームに対して感受性を有するロドコッカス属新規微生物を見出した。具体的には野生型株に対して突然変異の誘発を行い、リゾチーム含有培地で生育できない変異株を取得した。突然変異誘発の方法としては一般にニトロソグァ二ジン等の化学変異剤を用いる方法や放射線を照射する方法等がとられるが、本発明では安全性、簡便性といった点を考慮し紫外線照射による方法をとつた。さらに、本発明者らは該微生物を用いることにより、ベニシリン等による前処理なしに、リゾチーム処理のみによる溶菌が可能となり、その結果菌体内に蓄積された組換えタンパク質等細胞内容物の抽出が従来の方法に比べて極めて簡便に行えることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、

( 1 ) 野生型ロドコッカス属微生物に比べ、リゾチームに対する感受性が高い変異口ドコッカス属微生物、

( 2 ) ロドコッカス属微生物がロドコッカス ·エリス口ポリスである（1 ) のロドコッカス属微生物、

( 3 ) 口ドコッカス ·エリス口ポリスが口ドコッカス ·エリス口ポリス L- 65 (2 002 年 6月 1 2日付（原寄託）で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6 ) に、受託番号 FE RM BP- 8443 として寄託されている）またはロドコッカス .エリス口ポリス L - 88

(2002年 6月 1 2日付（原寄託）で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6 ) に、受託番号 FERM BP- 8444として寄託されている）である（2 ) のロドコッカス属微生物、

( 4 ) 野生型口ドコッカス属微生物に比べ、リゾチームに対する感受性が高い変異口ドコッカス属微生物を外来タンパク質をコードする遺伝子を用いて形質転換し、該遺伝子を発現させ、前記口ドコッカス属微生物をリゾチームで処理して、前記タンパク質を抽出回収することを含む、タンパク質を産生する方法、 ( 5 ) ロドコッカス属微生物がロドコッカス 'エリス口ポリスである（4 ) のタンパク質を産生する方法、および

( 6 ) 口ドコッカス'エリス口ポリスが口ドコッカス'エリス口ポリス L- 65 (受託番号 FERM BP- 8443) またはロドコッカス ·エリス口ポリス L-88 (受託番号 FE RM BP- 8444) である（5 ) のタンパク質を産生する方法、である

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明のロドコッカス属微生物は、野生型ロドコッカス属微生物に比べ、リゾチームに対する感受性が高い変異口ドコッカス属微生物である。本発明の口ドコッカス属微生物は、特定の種に限られず、ロドコッカス ·エリス口ポリス (R, er yt ropol is) , ロドコッカス ·ファシアンス (R. fascians) , ロドコッカス 'ォパカス (R. opacus) 等が挙げられる。野生型ロドコッカス微生物とは、ロドコッカス属に属する遺伝的に変異をしていない微生物をいい、例えばロドコッカス ·ェリス口ポリス； TCM3201が挙げられる。すなわち、本発明のリゾチームに感受性が高い口ドコッカス属微生物は、野生型の口ドコッカス属微生物を親株として変異誘導し得た変異体であって、親株に比べリゾチーム感受性が高くなつている変異リゾチーム属微生物である。リゾチームに対する感受性が高いとは、低いリゾチ —ム濃度で溶菌し得ることをいう。微生物を培養している培地にリゾチームを添加した場合に生育が阻止されるとき、その微生物はリゾチームに対する感受性を有するという。例えば、微生物の生育を阻止できる最小濃度のリゾチーム濃度（最小生育阻止リゾチーム濃度）によりリゾチームに対する感受性を表すことができる。リゾチームの由来も限られず、例えば卵白リゾチームが挙げられる。最小生育阻止リゾチーム濃度は、例えば口ドコッカス属微生物を 1 X 10〜l X 10⁵細胞/

10 /x lに培地で調製し、該調製液 IO Iに、リゾチームを数百/ g/mlから数/ g/ ml含むように段階希釈した培地に添加し、数日間培養し、ロドコッカス属微生物の生育を阻止するリゾチーム濃度により表すことができる。また、一定濃度の口ドコッカス属微生物にリゾチームを添加し、培養を続け吸光度の変化を測定することによつてもリゾチーム感受性の程度を決定することができる。この場合、リゾチーム非感受性株はリゾチームによつても溶菌せず増殖を続けるので経時的に吸光度は上昇していくが、リゾチーム感受性株は、リゾチームにより溶菌していくので光度は急激に減少する。本発明のリゾチームに対する感受性が高い口ドコッカス属微生物の最小生育阻止リゾチーム濃度は、 50 g/ml以下、好ましくは 25 g/ml以下、特に好ましくは 13 i g/ml以下である。これは、野生株すなわち親株の最小生育阻止リゾチーム濃度の 8分の 1以下、好ましくは 16分の 1以下、特に好ましくは 30分の 1以下である。

通常口ドコッカス属微生物はリゾチームに対する抵抗性が高くリゾチーム単独では、微生物体を溶菌することができず、高濃度のペニシリン等の抗生剤を用いて、増殖している微生物の細胞壁合成を阻害し、微生物の細胞壁を弱めた上でリゾチームを作用させる必要があるが、本発明のロドコッカス属微生物は、リゾチ —ム単独の処理により溶菌させることができる。

本発明のリゾチームに対する感受性が高い口ドコッカス属微生物は、野生型の口ドコッカス属微生物、例えば口ドコッカス ·エリス口ポリス JCM3201を化学的変異原または物理的変異原で処理し、寒天培地上で培養し、生育したコロニーをリゾチームを含有する培地とリゾチームで含有しない培地で培養し、リゾチームを含有する培地で生育しない菌を選択することにより得ることができる。リゾチームに対する感受性は上述の感受性試験法により測定することができる。化学的変異原としては、 N-メチル -N' -ニトロ -N-ニトロソグァ二ジン、マスタードガス等のアルキル化剤、ヒドラジン、亜硝酸等の非アルキル化剤、 5 -プロモウラシル、 2 -アミノプテリン等の DNA塩基のアナログ、ァクリジンオレンジ等の DNA揷入剤が挙げられ、物理的変異原としては、紫外線、 X線、 τ線、中性子線等が挙げられる。変異原による微生物の処理方法、用いる化学的変異原の濃度、用いる物理的変異原の強度等は公知の方法に従って、適宜選択すればよい。

本発明のリゾチームに対する感受性が高いロドコッカス属微生物の例として、ロドコッカス ·エリスロポリス L - 6 5菌株（受託番号 FE履 BP- 8443) および口ドコッカス ·エリス口ポリス L - 8 8菌株（受託番号 FERM BP-8444)が挙げられる。本発明のリゾチームに対する感受性の高い口ドコッカス属微生物は、リゾチ一ムに対する感受性が野生株すなわち親株に比較して高くなつてるが、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフエ二コール、テトラサイクリン、チォストレプ卜ン等の抗生剤の少なくとも 1種以上に対する感受性は野生株と比較して同等で有意の差はないか、あるいはあったとしても野性株と比較してリゾチ一ム感受性ほどの差はない。すなわち、本発明のリゾチームに対する感受性が高いロドコッカス属微生物を特定の抗生剤耐性遺伝子を選択マーカーとして組込んであり、外来遺伝子を組込んだ発現ベクターを用いて形質転換し、該形質転換体を選択マーカ一に基づいて選択しょうとした場合、形質転換されていないロドコッカス属微生物は該抗生剤に対する感受性が低下していないので生育できず、形質転換体のみを選択することができる。この点で、本発明のリゾチームに対する感受性の高い口ドコッカス属微生物は、選択に用いようとする抗生剤に対する感受性が低下していなければよく、他の抗生剤に対する感受性が低下していてもよい。

本発明のリゾチームに対する感受性が高い口ドコッカス属微生物を用いて、組換えタンパク質を効率的に得ることができる。すなわち、本発明のリゾチームに対する感受性が高いロドコッカス属微生物を他の生物種に由来する外来夕ンパク質をコードする遺伝子で形質転換し、該形質転換口ドコッカス微生物を該遺伝子を発現しうる条件で培養することにより前記外来タンパク質を発現させ、ついで発現タンパク質を微生物体内に保持している微生物をリゾチームで処理することにより、該タンパク質が抽出され、抽出液から該タンパク質を容易に精製し回収することができる。本発明の口ドコッカス属微生物の形質転換は公知の方法により行えばよい。この際、本発明のリゾチームに対する感受性の低下したロドコッカス属微生物の形質転換効率は、野生株すなわち親株と比較して同等かあるいは、大きな差はない。変異誘導の影響で多少形質転換効率が低下することもあるが、外来夕ンパク質の発現産生の効率を大きく低下させるような低下は認められない。形質転換は、例えば公知の口ドコッカス属微生物用発現ベクターを用いることにより行うことができる。また、本発明者らが構築した、チォストレプトンで誘導発現が可能な発現べクタ一 pHN 170を用いて行うことができる。

形質転換により外来遺伝子を組込んだ口ドコッカス属微生物を培養し、外来遺伝子を発現させた後に、微生物体を遠心分離等により集め、リゾチームを溶解させたリン酸緩衝液等の緩衝液中に懸濁させ、リゾチームの至適温度付近の温度で数十分から数時間ィンキュベ一ションを行う。微生物体はリゾチームの作用により溶菌し、発現したタンパク質が緩衝液中に抽出される。抽出されたタンパク質を公知のタンパク質精製法で精製することにより該夕ンパク質を得ることができる。溶菌の際に用いるリゾチームの濃度は、 0. lmg/ml〜10mg/ml、好ましくは約 1 mg/ml である。精製は、各種の分離精製方法により行うことができる。例えば、硫酸アンモニゥム沈殿、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィニティ一クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組合せて用いることができる。この際、発現産物が GST、 His tag等との融合タンパク質として発現される場合は、目的タンパク質と融合しているペプチドまたはタンパク質の性質を利用して精製することもできる。例えば、 GST はダル夕チオンに対して親和性を有するので、ダル夕チオンを担体に結合させたカラムを用いるァフィ二ティーク口マトグラフィ一により効率的に精製することができる。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2002-239554号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明

図 1は、段階希釈した培養液を LB寒天培地に滴下し生育状態を比較した写真である。

図 2は、ロドコッカス ·エリスロポリス L-65の増殖曲線を示した図である。図 3は、ロドコッカス .エリス口ポリス L- 88の増殖曲線を示した図である。図 4は、ロドコッカス .エリス口ポリス J CM320 1の増殖曲線を示した図である。

図 5は、 P I Pタンパク質をロドコッカス 'エリス口ポリス L- 65、 L-88 および J CM 320 1で発現させた場合の SDSポリアクリルアミド電気泳動の図である。

発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。

〔実施例 1〕

リゾチーム感受性菌株の製造

ロドコッカス.エリス口ポリス J CM320 1を LB培地（1 %D i f c o B a c t o T r yp t o n e、 0. 5 % D i f c o Ye a s t E x t r a c t、 1 %塩化ナトリウム）で 3 にて振とう培養した。対数増殖期中期に適宜希釈し 1枚当たり約 5 X 10³細胞相当の菌体を 1. 5 %寒天を含む LB培地上に塗布し、紫外線照射装置（アト一社製、出力 4W) を用いて波長 254 nmの紫外線を塗布面に対し 1 5 cm離して 20秒間照射した。紫外線照射を行った培地を 30°Cで 2日間静置培養すると、 1枚当たり約 5 X 10²個のコロニーが形成された。コロニーを楊子でかき取り約 1 50 1の LB培地で満たした 96穴プレ一卜に接種し、よく懸濁した後、一部を 50 gZm 1の卵白由来リゾチーム（シグマ社製、以下単にリゾチームと表記）を含む約 150 1の LB培地で満たした 96穴プレートに接種した。これら 1対のプレートを 30°Cにて 2日間静置培養し、リゾチームを含まない LB培地でのみ生育可能な変異株をリゾチーム感受性株として取得した。本発明に係るリゾチーム感受性新規微生物として口ドコッカス ·エリス口ポリス L- 65菌株および口ドコッカス 'エリス口ポリス L- 88 菌株が挙げられる。これらの菌株は 2002年 6月 12日付（原寄託）で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6) に、受託番号 FERM B P- 8443および FERM BP - 8444としてそれぞれ寄託されている（2003年 7月 28日付で、原寄託よりブダペスト条約に基づく寄託への移管請求受領）。該菌株を LB培地に接種し、 3 0°Cにて振とう培養を行い対数増殖期中期の培養液の一部を新たな LB培地 10

/2 1中に約1ズ 1 0⁵、 1 X 1 0⁴、 1 X 1 0³、 1 X 1 0²、 1 X 1 0細胞が含まれるように希釈し、 50、 25、 1 2. 5および 6. 3 g Zm 1のリゾチームを含有する LB寒天培地上にそれぞれ滴下した。この培地を 30°Cにて 2日間培養した後、菌体の生育の有無を確認することで最小生育阻止濃度を決定した（表 1 および図 1 )。図に示すごとく、リゾチームを含まない L B寒天培地およびリゾチーム 1 2. 5 g/m 1含有 L B寒天培地に J CM 3201、 L- 65および L - 88を滴下培養した。滴下した菌株は上段が J CM 3201、中段が L- 65、下段が L- 88であり、培養液中の菌体数は左から、 I X 10⁵、 X 10⁴、 I X

0³、 1 X 10²、 1 X 10である。菌株孔番最小生育阻止リゾチーム濃度 g/m 1 ) ロドコッカス ·エリス口 FERM BP- 8443 1 2. 5

ポリス L- 6 5

ロドコッカス ·エリス口 FERM B P-8444 1 2. 5

ポリス L- 8 8

ロドコッカス ·エリス口 ATCC 2 5 544 >400

ポリス J CM32 0 1

〔実施例 2〕

口ドコッカス ·エリス口ポリス L- 6 5培養液へのリゾチーム添加による濁度の変化

1 0 0m lの LB培地に口ドコッカス'エリス口ポリス L- 6 5を植え 3 0°Cにて振とう培養し、対数増殖期の初期から 1時間ごとに吸収波長 60 0 nmでの培養液の吸光度（OD_ra)を測定した。 OD,が 0. 2前後に達した時点で半量ずつ

2本に分け、一方はそのまま、もう一方は終濃度 1 2. 5 ^ gZm lのリゾチ一ムを添加しそれぞれさらに培養を続けながら吸光度の測定を行った。この結果を図 2に示した。ロドコッカス ·エリス口ポリス L- 6 5の培養液に 1 2. 5 β g, m 1のリゾチームを添加した場合と添加しない場合の増殖の様子を 6 00 nmの吸光度で示した。 OD疆がおよそ 0. 2になった時点でリゾチームを添加した（矢印で図示）。リゾチームを添加した場合には吸光度が急激に低下することが観察された。これはリゾチームによって溶菌が起きたためと考えられる。

〔実施例 3〕

ロドコッカス ·エリスロポリス L- 8 8培養液へのリゾチーム添加による濁度の変化

実施例 2と同一の操作を口ドコッカス'エリス口ポリス L- 88で行った場合の吸光度の測定結果を図 3に示した。ロドコッカス 'エリス口ポリス L - 8 8の培養液に 1 2. 5 g/m 1のリゾチ一ムを添加した場合と添加しない場合の増殖の様子を 600 nmの吸光度で示した。 OD羅がおよそ 0. 2になった時点でリゾチームを添加した（矢印で図示）。リゾチ一ムを添加した場合には吸光度が急激に低下することが観察された。これはリゾチームによって溶菌が起きたためと考えられる。

〔比較例 1〕

ロドコッカス ·エリス口ポリス J CM3201培養液へのリゾチーム添加による濁度の変化

実施例 2と同一の操作を口ドコッカス ·エリス口ポリス J CM 3201で行つた場合の吸光度の測定結果を図 4に示した。口ドコッカス ·エリス口ポリス J C M 3201の培養液に 12. 5 n g/m 1のリゾチームを添加した場合と添加しない場合の増殖の様子を 600 nmの吸光度で示した。〇D謹がおよそ 0. 2になった時点でリゾチームを添加した（矢印で図示）。リゾチームの添加の有無に関わらず増殖の傾向は変わらないことが観察された。

〔実施例 4〕

リゾチーム感受性菌株のァンピシリンに対する感受性

ロドコッカス'エリス口ポリス L- 65およびロドコッカス 'エリス口ポリス L -88のアンピシリンに対する感受性を実施例 1と同様の方法により決定した。即ち、該菌株を LB培地に接種し、 30°Cにて振とう培養を行い対数増殖期中期の培養液の一部を新たな LB培地 10 1中に約 1 X 10⁵、 1 X 10⁴、 1 X 10³、

1 X 10²、 1 X 10細胞が含まれるように希釈し、 1 5、 10、 1および 0. 1 g/m 1のリゾチームを含有する LB寒天培地上にそれぞれ滴下した。この培地を 30°Cにて 2日間培養した後、菌体の生育の有無を確認することで最小生育阻止濃度を決定した（表 2)。同様にカナマイシン、クロラムフエニコ一ル、テトラサイクリンおよびチォストレブトンに対する感受性の比較も行ったが、野生株と変異株の間で有意な差は認められなかった。菌株口 j*口 1)番⁷^ * 最小生育阻止アンピシリン濃度 g/m 1 ) 口ドコッカス ·エリス口 FERM B P-8443 1

ポリス L- 65

口ドコッカス ·エリス口 FERM B P-8444 1

ポリス L- 88

ロドコッカス ·エリス口 ATCC 2 5 544 1 5

ポリス J CM320 1

〔実施例 5〕

リゾチーム感受性菌株の形質転換効率

口ドコッカス ·エリス口ポリスの形質転換はエレクトロポレーシヨン法によつた。以下にその詳細を述べる。ロドコッカス 'エリス口ポリス J CM3 20 1、ロドコッカス ·エリス口ポリス L- 6 5およびロドコッカス ·エリス口ポリス - 8 8株をそれぞれ LB培地 1 0 0m lにて対数増殖期に至るまで 30°Cで振とう培養した。培養液を 30分間氷冷し、遠心分離し、菌体を回収した。これに 1 0 0m 1の氷冷滅菌水を加え、よく撹拌し、再び遠心分離し、菌体を回収した。これに 1 0 Om 1の氷冷 1 0 %グリセリン溶液を加え、よく撹拌し、遠心分離し、菌体を回収した。この氷冷 1 0 %グリセリン溶液での洗浄をもう一度繰り返し、菌体を 5m 1の氷冷 1 0 %グリセリン溶液に懸濁し、この菌体 400 1とロドコッカス，エリス口ポリスでの自立複製が可能なプラスミド DNA (pHN 14 4 ：中島、田村、全長配列を配列番号 1に示した）の混合液をエレクト口ポレーションキュべット（B i o- R a d社： 0. 2 c mギヤップキュべット）に移し、同社の遺伝子導入装置ジーンパルサー I Iを用いて、電場強度 1 2. 5 kV/c mで、パルスコントローラ一の設定はキャパシタンス 2 5 F、外部抵抗 400 Ωにてそれぞれ電気パルスを与えた。電気パルス処理した菌体と DN Aの混合液を lm 1の LB培地に混合し、 30°Cにて 4時間培養した後集菌し、 1 0 n g Z m 1チォストレプトン含有 LB寒天培地に塗布し、 30°Cにて 3日培養し、それぞれの形質転換体を得た。このときの DNA 1 gあたりの形質転換効率（コロニー形成数）を表 3に示した。

表 3

〔実施例 6〕

ロドコッカス ·エリス口ポリス L- 65株を用いた組換えタンパク質の抽出口ドコッカス ·エリス口ポリス菌体内で自立複製可能で、かつチォス卜レプトンによる誘導により C末側 6 Xヒスチジンタグをもつプロリンィミノべプチダーゼ（以下 P I Pと表記）タンパク質（T. Tamura et al.， FEBS Lett. 398. 101- 105 (1996) ) を発現すべく構築されたプラスミド（PHN 1 70 ：中島、田村、全長配列を配列番号 2に示した）をロドコッカス 'エリス口ポリス L- 65株にェレクト口ポレーシヨン法により導入し、テトラサイクリン（20 x gZm l ) 含有 LB寒天培地上で形質転換体を選別した。形質転換体をテトラサイクリン（8 g/m 1 ) 含有 L B培地 4m 1に植え、吸収波長 600 n mでの培養液の吸光度が 0. 8に達するまで 30°Cにて振とう培養した。この全量をチォストレブトン (1 a g/m 1 ) 含有 LB培地 40m 1に加え、羽根付きフラスコで 16時間旋回培養し P I Pタンパク質の発現を誘導した後、 1， 500 Xg、 1 5分間の遠心操作で集菌した。菌体を 30 OmM食塩含有 5 OmMリン酸緩衝液（pH8. 0) 4m 1に懸濁後リゾチ一ムを終濃度 lmg/m 1となるように添加した。 3 7°Cで 1時間インキュベーションした後、氷上にて冷却し 1 0 , O O O Xg、 1 5分間の遠心操作を行い上清（s) と沈殿（p) に分離した。得られた上清（s) のうち lm 1を別の微量遠心チューブにとりわけ、あらかじめ 30 OmM食塩含有 5 OmMリン酸緩衝液（pH 8. 0 ) で平衡化しておいた N i -NT A S u e r f 1 ow (Q I AGEN社製） 50 1を添加し、上下反転しながら 4°Cにて 1時間ィンキュベーシヨンした。 30 OmM食塩および 10 %グリセリン含有 5 OmMリン酸緩衝液（pH 6. 0) 1m lで、 3回洗浄した後 50 OmM ED TA、 30 OmM食塩および 10 %グリセリン含有 5 OmMリン酸緩衝液（pH 6. 0) 50 1で 6 Xヒスチジン融合 P I Pタンパク質を溶出した。このうち 10 1を S D Sポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ 6 Xヒスチジン融合 P I Pタンパク質のアミノ酸配列から予想される分子量（34. 3 KD a) 付近に明瞭なバンドが検出された（図 5)。一方で、得られた沈殿（p) は 8M尿素含有 100 mMリン酸 2水素ナトリウム- 10 mM卜リス塩酸緩衝液（ p H 8. 0 ) lm lに再懸濁し 30分間放置した後、 10, O O O Xg、 1 5分間の遠心操作を行い上清を新たな微量遠心チューブに移し、あらかじめ 8 M尿素含有 10 OmMリン酸 2水素ナトリウム- 1 OmMトリス塩酸緩衝液（pH8. 0) で平衡化しておいた N i -NTA S up e r f l ow50 lを添加し、上下反転しながら室温にて 1時間インキュベーションした。 8M尿素含有 10 OmMリン酸 2 水素ナトリウム- 1 OmMトリス塩酸緩衝液（pH 6. 3) lm lで 3回洗浄した後 50 OmM EDTAおよび 8 M尿素含有 100 mMリン酸 2水素ナトリウム- 1 OmMトリス塩酸緩衝液（pH 8. 0) 50 1で 6 Xヒスチジン融合 P I P タンパク質を溶出した。このうち I O Iを S D Sポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した（図 5)。 Μは分子量マーカ一であり各バンドのおよその分子量を図左に示した。図 5中、各レーンは以下のパンドパターンを示した。

レーン 1 (J CM 3201、 s )； J CM 320 1株で P I Pを発現させた場合の上清から得られた試料を泳動したもの。未変性条件緩衝液（尿素を含まない）中ではほとんど溶菌しないので目的のバンド（矢印で図示）は検出されない。レーン 2 ( J CM320 1、 p)； J CM3201株で P I Pを発現させた場合の沈殿から得られた試料を泳動したもの。変性条件緩衝液（尿素を含む）中でわずかに溶菌し、目的のバンドが薄く確認される。

レーン 3 ( J CM 3201 + amp, s )； J CM 320 1株で P I Pを発現させた場合の上清から得られた試料を泳動したもの。ただし、ここでは集菌直前の

2時間に渡ってアンピシリンによる処理を施してある。アンピシリンによってリゾチームに対する感受性が高まり、未変性条件緩衝液中でも溶菌が起こり目的のバンドが十分確認できる。

レーン 4 ( J CM3201 + amp, p) ;-J CM3201株で P I Pを発現させた場合の沈殿から得られた試料を泳動したもの。ただし、ここでは集菌直前の 2時間に渡ってアンピシリンによる処理を施してある。アンピシリンで前処理をしてもなお未変性条件緩衝液中では溶菌されなかった菌体が、変性条件緩衝液中で溶菌し、目的のバンドが検出されたと考えられる。

レーン 5 (L-65、 s)； L-65株で P I Pを発現させた場合の上清から得られた試料を泳動したもの。リゾチーム処理によって完全に溶菌し、目的のバンドが検出される。

レーン 6 (L- 65、 p)； L- 65株で P I Pを発現させた場合の沈殿から得られた試料を泳動したもの。沈殿には溶菌後の細胞残滓のみが含まれると考えられ目的のバンドは検出されない。

レーン 7 (L- 88、 s )； L- 88株で P I Pを発現させた場合の上清から得られた試料を泳動したもの。 L- 65株の場合と同様のことが考えられる。

レーン 8 (L- 88、 p)； L- 88株で P I Pを発現させた場合の沈殿から得られた試料を泳動したもの。 L- 65株の塲合と同様のことが考えられる。

なお、上記操作で用いた抗生剤は、 5mgテトラサイクリンを lm 1の 50重量％エタノールに溶解したもの、または 1 Omgチォス卜レプトンを lm 1のジメチルスルホォキシドに溶解したものを必要量使用した。

〔実施例 7〕

ロドコッカス ·エリス口ポリス L- 88株を用いた組換えタンパク質の抽出実施例 6と同一の操作を口ドコッカス 'エリス口ポリス L- 65株に代えて口ドコッカス ·エリス口ポリス L- 88株を用いて行った（図 5)。

〔比較例 2〕

口ドコッカス ·エリス口ポリス J CM320 1株を用いた組換えタンパク質の抽出

実施例 6と同一の操作を口ドコッカス'エリス口ポリス L- 65株に代えて口ドコッカス ·エリス口ポリス J CM320 1株を用いて行った（図 5)。

〔比較例 3〕口ドコッカス ·エリス口ポリス J C M 3 2 0 1株を用いた組換えタンパク質の抽出

口ドコッカス 'ェリズ口ポリス L - 6 5株に代えて口ドコッカス'エリス口ポリス J C M 3 2 0 1株を用いて実施例 6のごとく形質転換体を作製し、チォストレプトンによる P I Pタンパク質の発現誘導を行った。集菌を行う 2時間前に 5 0 m g /m 1アンピシリン水溶液 4 8 0 Iを添加し（終濃度 6 0 0 g Zm 1 )、集菌以下実施例 6と同様の操作を行い得られた試料を電気泳動に供した（図 5 )。本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。産業上の利用の可能性

実施例に示すように、本発明の口ドコッカス属微生物はリゾチームに対する感受性が野生株に比べ高くなつている。また、形質転換効率は野性株と比べて大きく変わっていない。従って、本発明のロドコッカス属微生物を外来タンパク質をコードする遺伝子で効率的に形質転換し、該タンパク質を発現させた後に、リゾチームで溶菌させることにより容易に該タンパク質を抽出し、回収することがでさる。

配列表フリーテキスト

配列番号 1 ：プラスミド PHN144

配列番号 2 ：プラスミド PHN170

Claims

請求の範囲

1 . 野生型ロドコッカス属微生物に比べ、リゾチームに対する感受性が高い変異口ドコッカス属微生物。

2 . 口ドコッカス属微生物が口ドコッカス ·エリス口ポリスである請求項 1 記載の口ドコッカス属微生物。

3 . 口ドコッカス-エリス口ポリスが口ドコッカス ·エリス口ポリス L- 65 (受託番号 FERM BP-8443) またはロドコッカス ·エリス口ポリス L- 88 (受託番号 FE RM BP- 8444) である請求項 2記載のロドコッカス属微生物。

4 . 野生型ロドコッカス属微生物に比べ、リゾチームに対する感受性が高い変異口ドコッカス属微生物を外来タンパク質をコードする遺伝子を用いて形質転換し、該遺伝子を発現させ、前記ロドコッカス属微生物をリゾチームで処理して、前記タンパク質を抽出回収することを含む、タンパク質を産生する方法。

5 . 口ドコッカス属微生物が口ドコッカス ·エリス口ポリスである請求項 4 記載のタンパク質を産生する方法。

6 . 口ドコッカス ·エリス口ポリスが口ドコッカス ·エリス口ポリス L- 65 (受託番号 FERM BP-8443) またはロドコッカス ·エリス口ポリス L- 88 (受託番号 FE RM BP- 8444) である請求項 5記載のタンパク質を産生する方法。