WO2004015112A1 - Dns-konstrukte für die herstellung von peptiden - Google Patents

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WO2004015112A1
WO2004015112A1 PCT/EP2002/008249 EP0208249W WO2004015112A1 WO 2004015112 A1 WO2004015112 A1 WO 2004015112A1 EP 0208249 W EP0208249 W EP 0208249W WO 2004015112 A1 WO2004015112 A1 WO 2004015112A1
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polypeptide
dna construct
sequence
peptides
oligopeptide
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Inventor
Dirk Dormann
Wolfram Eichner
Klaus Sommermeyer
Volker Lang
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Fresenius Kabi Deutschland GmbH
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Fresenius Kabi Deutschland GmbH
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes

Definitions

  • the present invention relates to novel DNA constructs which code for peptides with a specific structure, their use for the production of peptides and peptide mixtures and the peptide mixtures obtainable thereby.
  • peptide libraries are currently being created, which enable a very large number of different peptides to be analyzed quickly and easily for a specific activity of the peptides.
  • phage display libraries in which short oligopeptides (for example 3 to 50 mers) are expressed on the surface of phages.
  • Antibody libraries in which the antibodies consist, for example, of a single polypeptide chain (so-called “single chain antibodies”) are expressed in bacteria or on the surface of phages. All of these libraries aim to identify peptides with specific drug or binding activity.
  • peptide libraries are not suitable for the production of this peptide in large quantities.
  • peptides are created using three different synthetic routes. All peptides can be generated by either chemical or recombinant synthesis. A number of peptides can also be obtained by extraction from natural sources. However, all methods known in the prior art have considerable disadvantages.
  • Chemical peptide synthesis is primarily suitable for short peptides, since the chemical synthesis of longer peptides is very complex. Furthermore, chemical synthesis has the inherent disadvantage that organic solvents have to be used for this, which in the case of a planned medical use of the peptides can be removed by complex cleaning processes.
  • the extraction of peptides from natural sources is usually very complex.
  • the peptides are usually present in low concentrations in these sources. A large number of purification steps are therefore necessary in order to obtain reasonably pure peptides.
  • the recombinant synthesis of a peptide by expression of a DNA coding for the peptide has the advantage of the high accuracy of the synthesis process.
  • This synthetic route makes it possible to produce peptides that would be very difficult to produce chemically.
  • Another advantage is that the use of chemical compounds with toxic effects can be avoided (no use of solvents, etc.). Longer-chain peptides can also be produced relatively inexpensively in this synthetic route (WO 98/50563).
  • fusion partner can be a protein which has an advantageous effect on expression and / or simplifies purification. Repetitions of peptide units in the form of fusion proteins were developed in a further development of this approach expressed (WO 91/07496, Kempe et al., Gene 39239-245, 1985) and then purified.
  • DNA constructs were created which code for fusion proteins which have a recognition site for peptide cleavage between two peptide sequences (WO 00/32795).
  • these DNA constructs also only express the desired peptides in a relatively low concentration.
  • the problem underlying the present invention accordingly lies in the provision of improved DNA constructs which enable recombinant expression of peptides and peptide mixtures.
  • AxB (-x 1. N -C 1 _ a ) a
  • a and B are the same or different oligopeptides of 3 to 100 amino acids
  • C or C ⁇ -. are one or more oligopeptides of any sequence with 3 to 100 amino acids;
  • x and X are the same or different recognition sequences for peptide cleavage
  • n is an integer greater than 0.
  • the present invention thus for the first time makes available DNA constructs which code for a novel combination of peptide sequences which increase the production of peptides
  • A can represent an oligopeptide that has the same or a different sequence than oligopeptide B.
  • C represents an oligopeptide that has the same or a different sequence from A and B. According to a preferred embodiment, A, B and C have different sequences.
  • n is greater than 0, preferably greater than 1, in particular greater than 3, 5 or 10. If n is greater than 1, oligopeptides C 1, C 2 , C n result which can have the same or different sequences. It is particularly preferred that n is in the range of 3 to 5.
  • the variable n can also depend on the type of host cell used for the expression of the DNA construct.
  • a host cell is used for the expression of the DNA construct, which has a reduced recombination frequency.
  • the recombination of the DNA is controlled by the so-called REC enzymes of the host cell.
  • host cells have been generated which have mutations (for example deletions or substitutions) in the REC genes. As a result of these mutations, the REC genes are expressed to a lesser extent or no longer at all.
  • host cells with a reduced expression of the REC genes compared to the wild type of the cell are referred to as cells with a reduced recombination frequency.
  • n is greater than 3, in particular greater than 5 or 15, to use host cells which have a reduced recombination frequency.
  • the DNA construct according to the invention thus codes for a peptide of the formula
  • A, B and C ⁇ represent oligonucleotides which may have the same or different sequences, and x and x 5 represent the same or different recognition sequences for peptide cleavage.
  • n is 3, 5 or greater, since in this case the desired peptides are expressed in a particularly high concentration by the DNA construct.
  • the invention therefore includes in particular DNA constructs in which n is greater than 15 and greater than 50.
  • the DNA construct codes for a peptide mixture.
  • a DNA construct which codes for a mixture of peptides the use of which in a rinsing solution for reducing the high recurrence rate of superficial bladder carcinoma after transurethral resection of bladder carcinoma (DE 19529909C2) is known.
  • the local tumor implantation is to be prevented by binding the tumor cells to adhesion molecules. It appears advantageous to block different molecules that are involved in the mechanism of cell adhesion by oligopeptides. In order to achieve the most complete blocking possible, the peptides must be in excess. Therefore, larger quantities of different oligopeptides are used in this use.
  • a corresponding peptide mixture consisting of several different peptide sequences can be expressed as a fusion protein within a cell by the DNA constructs according to the invention.
  • the different peptides are linked within the fusion protein via sequences that enable cleavage to generate the individual peptides.
  • the individual peptide sequences can be used as a single copy or as Repeat. According to this embodiment of the invention, it can be, for example, the oligopeptides A, B and C ⁇ .
  • a is one of the peptides RGD, LDV, IDA, DGEA, GPRP, VTL, YIGSR, KQAGDV or REDV. It is particularly preferred that the peptides are already expressed in the mixture in which they are later used as active ingredients in the rinsing solution.
  • the DNA constructs according to the invention code for antimicrobial peptides.
  • bacteria that are resistant to antibiotics have caused major problems in human and veterinary medicine.
  • Antimicrobial peptides have recently been developed which represent a very interesting new class of antimicrobial agents (Hancock, R.E.W., J. Med. Microbiol., Vol. 46, 1-3, 1997).
  • a critical aspect for the use of antimicrobial peptides is their high manufacturing costs (US 6183992).
  • Another advantage of the method according to the invention is that peptides with antimicrobial properties cannot usually be produced in microbial expression systems due to the toxic activity of the peptides.
  • the use of the DNA constructs according to the invention in the production of these peptides enables expression in microbial host systems. Only the breakdown of the polypeptide into antimicrobial peptides would generate the toxic peptides.
  • DNA constructs according to the invention are also advantageous, for example, for the production of vaccines.
  • different peptide epitopes can be selected from a "target protein" of an infectious agent (bacterium, virus), expressed by the DNA constructs according to the invention, split and used as a peptide mixture or as individual peptides for the immunization of humans or animals.
  • the DNA construct according to the invention is suitable for the expression of poly- and oligopeptides with any chain length.
  • the chain length of the individual oligopeptides can be, for example, from 3 to 100 amino acids.
  • the construct according to the invention codes for a peptide which has one or more different recognition sequences for the peptide cleavage x.
  • the recognition sequences can be designed in such a way that the cleavage by proteases, within the host cell or by chemical cleavage is made possible.
  • proteases which allow specific cleavage of peptides, including factor Xa, TEV, Genenase I, thrombin, enterokinase and 3C ((Nagai K and Thogersen HC, Nature 309, 810-812, 1984; Dougherty WG et al., EMBO Journal 7, 1281-1287, 1988; Carter P and Wells JA et al., Science 237, 394-399, 1987; McKenzie KR et al, Journal of Immunol. 147, 312-319, 1991; laVallie ER et al, Journal of Biol. Chem.
  • the fusion protein is incubated with proteases after expression in vitro and the peptides are purified after cleavage.
  • the recognition sequences can be designed in such a way that cleavage is still possible within the host cell.
  • so-called ineins are used as recognition sequences which enable the peptides to be spliced in the cell (cf. David W. Wood et al., Nature Biotech. Vol 17, 889 -892, 1999).
  • the recognition sequences are designed in such a way that chemical cleavage after expression and isolation of the polypeptides is made possible. Any cleavage method known in the prior art can be used. For example, the specific cleavage by CNBr to methionine according to the in Dobeli H, et al.
  • one of the splitting strategies mentioned can have particular advantages.
  • the product When producing peptides for pharmaceutical use, the product must be homogeneous. For this reason, the selected cleavage must take place quantitatively and without specific side reactions (e.g. through unspecific cleavage).
  • the optimal cleavage strategy and the corresponding recognition sequences can, however, be readily determined by the person skilled in the art with regard to the planned use of the peptides on the basis of his specialist knowledge or by simple experiments in individual cases.
  • the recognition sequences, x, Xi, x 2 , etc. can be identical or different sequences. According to a preferred embodiment of the invention, the recognition sequences are identical, which enables simultaneous splitting into the oligopeptides. Particular advantages result if the DNA constructs with cleavage sites of identical sequence are expressed in host cells which have a reduced recombination frequency.
  • any method known in the art can be used to produce appropriate DNA constructs.
  • Either encoding oligonucleotides lf for the individual peptides A, B, C etc., as well as the polynucleotide encoding the full fusion peptide may be obtained by synthetic synthesis or by isolation from natural or recombinant DNA.
  • the oligonucleotides coding for the individual peptides are preferably produced by chemical synthesis.
  • the DNA construct therefore primarily consists of codons which are often used by the host cell for the expression of the corresponding amino acid.
  • Oligonucleotides generated according to the above criteria can be linked to the DNA construct according to the invention by methods known in the art.
  • the present invention further relates to expression vectors in which one of the DNA constructs according to the invention has been operatively linked to an expression-regulating sequence.
  • Numerous regulatory DNA sequences promoters, enhancers, etc.
  • Corresponding expression vectors which are adapted for certain host systems can be obtained commercially, for example. Expression can also be regulated via the number of expression vectors in a cell (the so-called "copy number"). Certain expression vectors are present in the host cell in high copy number and already achieve high expression of the desired polypeptide by this property.
  • the present invention relates to host cells which contain a DNA construct according to the invention. This can be any prokaryotic or eukaryotic host cell.
  • fungi yeasts, bacteria, insect cells, plant cells or animal cells
  • Host systems which have already been used in the prior art for inexpensive expression of polypeptides, for example cells from Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Aspergillus niger, CHO or COS cells are particularly preferred.
  • the DNA constructs according to the invention can be expressed in cells of transgenic animals, in particular in cows, goats, sheep, or in transgenic plants such as tobacco, corn, potatoes.
  • the present invention naturally also relates to methods for producing a peptide, in which the DNA constructs according to the invention are expressed in a suitable host cell and the polypeptide is obtained.
  • the polypeptide can be isolated from the culture supernatant or from the cells of the cell culture after expression.
  • Methods for isolating polypeptides have been extensively described in the art and may include one or more of ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, gel permeation chromatography, or affinity chromatography. The use of affinity chromatography is preferred because the best separation performance is achieved by this method.
  • the DNA construct comprises sequences which code for a so-called tag which enables purification by means of affinity chromatography.
  • tags for example His tags consisting of several histidine amino acid residues, and their use for affinity chromatography are known in the prior art (see, for example, Sulkowski, E., Trends in Biotechnology, Vol.3 (1985), Sl) .
  • the DNA constructs according to the invention have sequences which code for one day.
  • polypeptides that have the following structural formula:
  • polypeptides can be used immediately or can be specifically split into a multiplicity of peptides at sites x. Depending on the structure of the DNA construct, a peptide mixture or a large number of peptides of the same sequence are obtained.
  • the peptides or peptide mixtures obtained in this way can be purified, a peptide mixture or individual peptides being obtained in high concentration and in pure form.
  • the chromatography methods already mentioned can be used, which are well known to the person skilled in the art.
  • a small proportion of non-specific by-products can optionally be removed by cleaning processes customary in the prior art.
  • Fig. 4 mass spectrometric analysis of the peptides in batch 8 after 45 hours of incubation under the conditions listed in Table 1.
  • the peptides obtained by the cleavage were separated on an RT-18 HPLC column and the cleavage efficiency of the various conditions was determined from the run profile obtained in the process. A mass spectroscopic evaluation was also carried out. Examples of the results obtained by these analyzes are shown in FIGS. 2 to 4.
  • FIG. 2 describes the elution profile of the uncleaved fusion peptide from the RT-18 HPLC column before the addition of CuCl 2 .
  • FIG. 3 RT-18 shows the HPLC elution profile of the peptides from batch 8 after 45 hours of incubation under the conditions specified in Table 1.
  • FIG. 4 shows the mass spectrometric analysis of the peptides of batch 8 after 45 hours of incubation under the conditions mentioned in table 1.
  • reaction proceeds better in borate buffer than in TRIS buffer, presumably because there may be an interaction between the nitrogen and the copper.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft DNS-Konstrukte, die für ein Polypeptid kodieren, das die folgende allgemeine Strukturformel A-x1-B(-x2-C1-n)n umfaßt, worin A und B dieselben oder verschiedene Oligopeptide mit 3 bis 100 Aminosäuren sind; C oder C1-n ein oder mehrere Oligopeptide beliebiger Sequenz mit 3 bis 100 Aminosäuren sind; x1 und x2 dieselben oder verschiedene Erkennungssequenzen für eine Peptidspaltung sind; und n eine ganze Zahl größer als 0 ist. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der DNS-Konstrukte für die Herstellung von Peptiden und Peptidgemischen sowie die dadurch erhältlichen Peptidgemische.

Description

DNS-Konstrukte für die Herstellung von Peptiden
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige DNS-Konstrukte, die für Peptide mit einer bestimmten Struktur kodieren, und deren Verwendung für die Herstellung von Peptiden und Peptidgemisehen sowie die dadurch erhältlichen Peptidgemische .
Der Bedarf an Poly- und Oligopeptiden mit einer bestimmten Sequenz und Struktur hat in den vergangenen Jahren stark zugenommen. Eine Vielzahl von Polypeptiden ist bereits als Wirkstoff für Arzneimittel zugelassen worden, weitere befinden sich in der vorklinischen oder klinischen Erprobungsphase für eine entsprechende Zulassung (Pharma Buisness, July/August 2000, Seiten 45 bis 60) .
Derzeit werden zudem viele Peptid-Bibliotheken erstellt, die es ermöglichen eine sehr große Anzahl verschiedener Peptide schnell und einfach auf eine bestimmte Aktivität der Peptide hin zu analysieren. So existieren beispielsweise Phagen-Display-Biblio- theken, bei denen kurze Oligopeptide (beispielsweise 3- bis 50- mere) auf der Oberfläche von Phagen exprimiert werden. Ferner werden Antikörper-Bibliotheken, bei denen die Antikörper beispielsweise aus einer einzigen Polypeptidkette bestehen (sogenannte "Single chain antibodies " , Einzelketten-Antikörper), in Bakterien oder auf der Oberfläche von Phagen exprimiert . Alle diese Bibliotheken haben das Ziel, Peptide mit bestimmter Wirkstoff- oder Bindungs-Aktivität zu identifizieren. Unter Verwendung einer Phagen-Display-Bibliothek wurde beispielsweise das bereits bekannte Bindungsmotiv RGD des Fibronektin-Moleküls gefunden, welches die Bindung dieses Moleküls an eine Vielzahl von Integrine bewirkt (Pasqualini et al . , J. Cell . Biol . Vol . 130 (1995), S. 1189) .
Konnte ein Peptid mit gewünschten Eigenschaften identifiziert werden, so eignen sich die Peptid-Bibliotheken nicht für die Herstellung dieses Peptides in großer Menge. Derzeit werden Peptide über drei verschiedene Synthesewege erstellt. Alle Peptide können entweder durch chemische oder rekombinante Synthese erzeugt werden. Ferner können eine Reihe von Peptiden durch Extraktion aus natürlichen Quellen gewonnen werden. Alle im Stand der Technik bekannten Verfahren weisen jedoch erhebliche Nachteile auf.
Die chemische Peptidsynthese bietet sich primär bei kurzen Peptiden an, da die chemische Synthese längerer Peptide sehr aufwendig ist. Ferner weist die chemische Synthese den inhärenten Nachteil auf, dass dafür organische Lösungsmittel verwendet werden müssen, die im Falle einer geplanten medizinischen Verwendung der Peptide durch aufwendige Reinigungsverfahren zu entfernen sind.
Auch die Extraktion von Peptiden aus natürlichen Quellen ist in der Regel sehr aufwendig. Die Peptide liegen in diesen Quellen üblicherweise in geringer Konzentration vor. Eine Vielzahl von Reinigungsschritten ist daher notwendig, um einigermaßen reine Peptide zu erhalten. Die rekombinante Synthese eines Peptids durch Expression einer für das Peptid kodierenden DNS weist als Vorteil die hohe Genauigkeit des Syntheseprozesses auf. Dieser Syntheseweg ermöglicht es, Peptide herzustellen, die chemisch nur sehr schwierig hergestellt werden könnten. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass der Einsatz chemischer Verbindungen mit toxischer Wirkung vermieden werden kann (keine Verwendung von Lösungsmitteln, etc . ) . Auf diesem Syntheseweg können auch längerkettige Peptide relativ kostengünstig hergestellt werden (WO 98/50563).
Für die rekombinante Synthese sind im Stand der Technik eine Vielzahl von Wirtssystemen benutzt worden. Kürzlich veröffentlichte Beispiele für Expressionssysteme, die zur Herstellung von rekombinanten Peptiden/Proteinen verwendet werden können, sind zum Beispiel Escherichia coli (Gavit P, Better M, J. Biotechnol 79: 2, 127-36, Apr.28, 2000), Hefen (Cereghino JL, Cregg JM, FEMS Microbiol Rev 24: 1, 45 - 66, Jan, 2000), eukaryotische Zellkulturen (Geisse S, et al., Protein Expr. Purif.8: 3, 271-82, Nov, 1996), Insektenzellen (Sorscher EJ, Sommerfeit MA, Methods Mol. Biol 39:, 337 - 48, 1995), transgene Pflanzen (Cramer CL, Boothe JG, Oishi KK, Curr Top Microbiol Immunol 240: 95 - 118, 1999) und transgene Tiere (Pollock DP, et al . , J Immunol Methods 231:1-2, 147 -57, Dec 10, 1999).
Der Nachteil der rekombinanten Synthese liegt darin, dass die Wirtszellen dazu tendieren die Peptide nur in geringen Mengen zu erzeugen. Insbesondere bei Peptiden mit kürzerer Kettenlänge erfolgt zudem eine Sekretion der Peptide (WO 98/50563). Um die Ausbeuten zu erhöhen, wurden verschiedene Strategien entwickelt.
Ein Ansatz besteht darin, eine für das Peptid kodierende DNS- Sequenz zu erstellen, die es ermöglicht, das Peptid als Teil eines Fusionsproteins zu expri ieren (WO 95/27782, US 6,183,992) . Der "Fusionspartner" kann dabei ein Protein sein, welches sich vorteilhaft auf die Expression auswirkt und/oder die Reinigung vereinfacht. In einer Weiterentwicklung dieses Ansatzes wurden Wiederholungen von Peptideinheiten in Form von Fusionsproteinen exprimiert (WO 91/07496, Kempe et al . , Gene 39239-245, 1985) und anschließend gereinigt.
Ferner wurden im Stand der Technik DNS-Konstrukte erstellt, die für Fusionsproteine kodieren, welche zwischen zwei Peptidsequen- zen eine Erkennungsstelle für eine Peptidspaltung aufweisen (WO 00/32795) . Auch diese DNS-Konstrukte exprimieren jedoch die gewünschten Peptide nur in relativ geringer Konzentration.
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Problem liegt dementsprechend in der Bereitstellung verbesserter DNS-Konstrukte, die eine rekombinante Expression von Peptiden und Peptidgemischen ermöglichen.
Dieses Problem wurde nunmehr durch DNS-Konstrukte gelöst, die für ein Polypeptid kodieren, wobei das Polypeptid die folgende allgemeine Strukturformel
A-x-B(-x1.n-C1_a)a
umfaßt, worin
A und B dieselben oder verschiedene Oligopeptide mit 3 bis 100 Aminosäuren sind;
C oder C^-. ein oder mehrere Oligopeptide beliebiger Sequenz mit 3 bis 100 Aminosäuren sind;
x und X . dieselben oder verschiedene ErkennungsSequenzen für eine Peptidspaltung sind; und
n eine ganze Zahl größer als 0 ist.
Die vorliegende Erfindung stellt somit erstmals DNS-Konstrukte zur Verfügung, die für eine neuartige Kombination von Peptid- sequenzen kodieren, welche die Herstellung von Peptiden in hoher
Konzentration ermöglicht. Dabei kommt eine überraschende Korn- bination verschiedener rekombinanter und chemischer Techniken zum Einsatz .
In der obigen Formel kann A ein Oligopeptid darstellen, das dieselbe oder eine andere Sequenz als Oligopeptid B aufweisen. C stellt ein Oligopeptid dar, das dieselbe oder eine von A und B verschiedene Sequenz aufweist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weisen A, B und C unterschiedliche Sequenzen auf.
Das DNS-Konstrukt ist ferner dadurch gekennzeichnet, dass n größer als 0, vorzugsweise größer als 1, insbesondere größer als 3, 5 oder 10 ist. Soweit n größer als 1 ist, ergeben sich Oligopeptide C,, C2, Cn, die dieselbe oder verschiedene Sequenzen aufweisen können. Es ist besonders bevorzugt, dass n im Bereich von 3 bis 5 liegt.
Die Variable n kann auch von der Art- der für die Expression des DNS-Konstruktes verwendeten Wirtszelle abhängen. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Wirtszelle für die Expression des DNS-Konstruktes verwendet, die eine verringerte Rekombinationsfrequenz aufweist. Die Rekombination der DNS wird von den sogenannten REC-Enzymen der Wirtszelle gesteuert. Im Stand der Technik sind Wirtszellen erzeugt worden, die Mutationen (beispielsweise Deletionen oder Sub- stitutionen) in den REC-Genen aufweisen. Als Folge dieser Mutationen werden die REC-Gene in verringertem Umfang oder gar nicht mehr exprimiert. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden Wirtszellen mit einer im Vergleich zur Wildtyp der Zelle verringerten Expression der REC-Gene als Zellen mit verringerter Rekombinationsfrequenz bezeichnet.
Erfindungsgemäß ist es besonders in den Fällen, in denen n größer als 3, insbesondere größer als 5 oder 15 ist, bevorzugt, Wirtszellen zu verwenden, die eine verringerte Rekombinations- frequenz aufweisen. Für den Fall, dass n 5 ist, kodiert das erfindungsgemäße DNS- Konstrukt somit für ein Peptid der Formel
A—X—B—Xj—Cj—x2~C2—x3 —C3—X4—C — 5—C5 ,
worin A, B und C^ Oligonukleotide darstellen, welche dieselben oder verschiedene Sequenzen aufweisen können, und x und x 5 dieselben oder verschiedene ErkennungsSequenzen für eine Peptidspaltung darstellen. Erfindungsgemäß werden besondere Vorteile erhalten, wenn n 3, 5 oder größer ist, da die gewünschten Peptide in diesem Fall durch das DNS-Konstrukt in besonders hoher Konzentration zur Expression gelangen. Die Erfindung umfaßt daher insbesondere DNS-Konstrukte in denen n größer als 15 und größer als 50 beträgt.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass das DNS-Konstrukt für ein Peptidgemisch kodiert. Eine solche Anwendung wäre zum Beispiel ein DNS-Konstrukt, das für ein Gemisch von Peptiden kodiert, deren Verwendung in einer Spüllösung zur Reduzierung der hohen Rezidivrate des oberflächlichen Harnblasenkarzinoms nach transurethraler Resektion von Blasenkarzinom (DE 19529909C2) bekannt ist. Bei dieser Verwendung soll die lokale Tumorimplantation durch Bindung der Tumorzellen an Adhäsionsmoleküle verhindert werden. Hierbei erscheint es vorteilhaft unter- schiedliche Moleküle, die am Mechanismus der Zelladhäsion beteiligt sind, durch Oligopeptide zu blockieren. Um eine möglichst vollständige Blockierung zu erreichen, müssen die Peptide im Überschuß vorliegen. Daher werden größere Quantitäten unterschiedlicher Oligopeptide bei dieser Verwendung eingesetzt.
Ein entsprechendes Peptidgemisch bestehend aus mehreren unterschiedlichen Peptidsequenzen kann durch die erfindungsgemäßen DNS-Konstrukte als Fusionsprotein innerhalb einer Zelle ex- primiert werden. Die unterschiedlichen Peptide sind innerhalb des Fusionsproteins über Sequenzen verbunden, die eine Spaltung zur Generierung der einzelnen Peptide ermöglichen. Die einzelnen Peptidsequenzen können dabei als Einzelkopie oder auch als Wiederholung vorliegen. Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung kann es sich beispielsweise bei den Oligopeptiden A, B und Cι.a um eines der Peptide RGD, LDV, IDA, DGEA, GPRP, VTL, YIGSR, KQAGDV oder REDV handeln. Dabei ist es besonders bevor- zugt, dass die Peptide bereits in der Mischung exprimiert werden, in der diese später als Wirkstoffe in der Spüllösung eingesetzt werden.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform kodieren die erfindungs- gemäßen DNS-Konstrukte für antimikrobielle Peptide. In den letzten Jahren verursachen Bakterien, die gegen Antibiotika resistent sind, große Probleme in der Human- und Veterinär- Medizin. Neuerdings sind antimikrobielle Peptide entwickelt worden, die eine sehr interessante neue Klasse von antimikro- biellen Agenzien darstellen (Hancock, R. E. W. , J. Med. Microbiol., Vol. 46 , 1 - 3, 1997). Ein kritischer Aspekt für den Einsatz von antimikrobiellen Peptiden sind jedoch deren hohe Herstellungskosten (US 6183992). Durch die Verwendung der erfindungsgeraäßen DNS-Konstrukte für die Expression der anti- mikrobiellen Peptide ist es nunmehr möglich, die Herstellkosten zu reduzieren und in einem Verfahrensschritt eine Kombination unterschiedlicher Peptide zu erzeugen.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass Peptide mit antimikrobiellen Eigenschaften aufgrund der toxischen Aktivität der Peptide üblicherweise nicht in mikrobiellen Expressionssystemen hergestellt werden können. Die Verwendung der erfindungsgemäßen DNS-Konstrukte bei der Herstellung dieser Peptide ermöglicht jedoch die Expression in mikrobiellen WirtsSystemen. Erst die Aufspaltung des Polypeptids in antimikrobielle Peptide würde die toxischen Peptide erzeugen.
Der Einsatz der erfindungsgemäßen DNS-Konstrukte ist beispielsweise auch für die Herstellung von Impfstoffen vorteilhaft. Für diesen Zweck können verschiedene Peptid-Epitope aus einem "Zielprotein" eines infektiösen Agens (Bakterium, Virus) ausgewählt, durch die erfindungsgemäßen DNS-Konstrukte exprimiert, aufgespalten und als Peptidgemisch oder als einzelne Peptide zur Immunisierung von Menschen oder Tieren verwendet werden.
Das erfindungsgemäße DNS-Konstrukt eignet sich für die Expression von Poly- und Oligopeptiden mit einer beliebigen Kettenlänge. Die Kettenlänge der einzelnen Oligopeptide kann beispielsweise von 3 bis 100 Aminosäuren betragen. Die Expression von Oligopeptiden A, B und Ci.,. mit eine Länge von 5 bis 50 Aminosäuren, insbesondere 7 bis 20 Aminosäuren, ist jedoch besonders bevorzugt.
Das erfindungsgemäße Konstrukt kodiert für ein Peptid, das eine oder mehrere verschiedene ErkennungsSequenzen für die Peptidspaltung x aufweist. Die Erkennungssequenzen können dabei so ausgestaltet sein, dass die Spaltung durch Proteasen, innerhalb der Wirtszelle oder durch eine chemische Spaltung ermöglicht wird..
Im Stand der Technik sind eine Vielzahl .von Proteasen bekannt, die eine spezifische Spaltung von Peptiden ermöglichen, darunter Faktor Xa, TEV, Genenase I, Thrombin, Enterokinase and 3C ((Nagai K and Thogersen HC, Nature 309, 810 - 812, 1984; Dougherty WG et al., EMBO Journal 7, 1281 - 1287, 1988; Carter P and Wells JA et al., Science 237, 394 - 399, 1987; McKenzie KR et al, Journal of Immunol. 147, 312 - 319, 1991; laVallie ER et al, Journal of Biol. Chem. 268, 23311- 23317; Walker PA et al, Biotechnology 12., 601 - 605, 1994). Bei dieser Spaltung wird das Fusionsprotein nach der Expression in vitro mit Proteasen inkubiert und die Peptide nach der Spaltung gereinigt.
Darüber hinaus können die Erkennungssequenzen so ausgestaltet sein, dass eine Spaltung noch innerhalb der Wirtszelle ermöglicht wird. Dafür werden als Erkennungssequenzen sogenannte Inteine verwendet, die ein Spleißen der Peptide in der Zelle ermöglichen (vgl. David W. Wood et al . , Nature Biotech. Vol 17, 889 -892, 1999). Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die Erkennungssequenzen so ausgestaltet, dass eine chemische Spaltung nach Expression und Isolierung der Polypeptide ermöglicht wird. Beliebige im Stand der Technik bekannte Spaltungsverfahren können dabei zum Einsatz kommen. So kann beispielweise die spezifische Spaltung durch CNBr nach Methionin nach dem in Dobeli H, et al . (Protein Expr Purif 12 (3), 404 - 14, 1998) offenbarten Verfahren eingesetzt werden. Weitere Spaltungen können durch Hydroxylamin vorgenommen werden, welches spezifisch Asp-Gly Bindungen spaltet (Butler,W. T., J. Biol. Chem. 244, 3415 - 3417, 1969). Schließlich sind Spaltungen von Asp-Pro Bindungen durch Säurehydrolyse (Han KK, Richard C, Biserte G. , Int J Biochem, 15(7), 875 - 884, 1982) und der Sequenz DKTH durch Cuz+ (Humphreys D.P. et al . , Protein Eng 12(2): 179-184, 1999) bekannt.
In Abhängigkeit der geplanten Verwendung kann eine der genannten Spaltungsstrategien besondere Vorteile aufweisen. Bei der Produktion von Peptiden für den pharmazeutischen Einsatz muß das Produkt homogen vorliegen. Aus diesem Grund muß die gewählte Spaltung quantitativ und ohne spezifische Nebenreaktionen (z. B. durch unspezifische Spaltung) ablaufen. Die optimale Spaltungsstrategie und die entsprechenden Erkennungssequenzen können jedoch von dem Fachmann im Hinblick auf die geplante Verwendung der Peptide aufgrund seines Fachwissens oder durch einfache Versuche im Einzelfall ohne weiteres ermittelt werden.
Die Erkennungssequenzen, x, Xi, x2, etc. können identischer oder verschiedener Sequenz sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungs- form der Erfindung sind die ErkennungsSequenzen identischer Sequenz, was eine gleichzeitige Aufspaltung in die Oligopeptide ermöglicht. Besondere Vorteile ergeben sich, wenn die DNA- Konstrukte mit Spaltstellen identischer Sequenz in Wirtszellen exprimiert werden, die eine verringerte Rekombinationsfrequenz aufweisen.
Zur Herstellung entsprechender DNS-Konstrukte können beliebige im Stand der Technik bekannte Verfahren verwendet werden. Sowohl die Oligonukleotide, welche für die einzelnen Peptide A, B, Cl f etc. kodieren, als auch das Polynukleotid, welches für das vollständige Fusionspeptid kodiert, können durch synthetische Synthese oder durch Isolierung aus natürlicher oder rekombinanter DNS erhalten werden. Vorzugsweise werden die für die einzelnen Peptide kodierenden Oligonukleotide durch chemische Synthese erzeugt. Bei der Auswahl der DNS-Sequenz kann es vorteilhaft sein, die Benutzung der Codons durch die Wirtszelle, in der das DNS-Konstrukt exprimiert werden soll, zu berücksichtigen. Gemäß dieser Ausführungsform besteht das DNS-Konstrukt daher primär aus Codons, die von der Wirtszelle häufig für die Expression der entsprechenden Aminosäure verwendet werden.
Ferner kann es vorteilhaft sein, mögliche mRNS-Sekundärstrukturen bei der Auswahl der Codons des erfindungsgemäßen DNS-Konstruktes zu berücksichtigen. Durch die Wahl von Codons, welche die Ausbildung einer stabilen mRNS-Sekundärstruktur verhindern, kann die Translationseffizienz verbessert werden.
Nach den obigen Kriterien erzeugte Oligonukleotide können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren zu dem erfindungsgemäßen DNS-Konstrukt verknüpft werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Expressionsvektoren, in denen eines der erfindungsgemäßen DNS-Konstrukte operativ mit einer Expressions-regulierenden Sequenz verknüpft wurde. Zahlreiche regulatorische DNS-Sequenzen (Promotoren, Enhancer, etc.) sind im Stand der Technik bekannt. Entsprechende Expressionsvektoren, die für bestimmte Wirtssysteme angepaßt sind, können beispielsweise kommerziell erhalten werden. Die Expression kann auch über die Anzahl der Expressionsvektoren in einer Zelle (die sogenannte "copy number") reguliert werden. Bestimmte Expressionsvektoren liegen in der Wirtszelle in hoher Kopienzahl vor, und erzielen bereits durch diese Eigenschaft eine hohe Expression des gewünschten Polypeptids . Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die ein erfindungsgemäßes DNS-Konstrukt enthalten. Dabei kann es sich um eine beliebige prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle handeln. Die Verwendung von Pilzen, Hefen, Bakterien, Insektenzellen, Pflanzenzellen oder tierischen Zellen ist bevorzugt. Wirtssysteme, die bereits im Stand der Technik für eine kostengünstige Expression von Polypeptiden verwendet wurden, beispielsweise Zellen von Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Aspergillus niger, CHO- oder COS-Zellen sind besonders bevorzugt. Alternativ dazu können die erfindungsgemäßen DNS-Konstrukte in Zellen transgener Tiere, insbesondere in Kühen, Ziegen, Schafen, oder in transgenen Pflanzen, wie Tabak, Mais, Kartoffeln, exprimiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft selbstverständlich ebenfalls Verfahren zur Herstellung eines Peptids, bei denen man die erfindungsgemäßen DNS-Konstrukte in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert und das Polypeptid gewinnt . In Abhängigkeit des gewählten ExpressionsSystems kann man das Polypeptid nach der Expression aus dem Kulturüberstand oder aus den Zellen der Zellkultur isolieren. Verfahren zur Isolierung von Polypeptiden sind im Stand der Technik umfassend beschrieben und können einen oder mehrere aus Ionenaustauscher-Chromatographie, hydrophobe Interaktions-Chromatographie, Gel-Permeations-Chromatographie oder Affinitäts-Chromatographie umfassen. Die Verwendung der Affinitäts-Chromatographie ist bevorzugt, da durch dieses Verfahren die besten Trennleistungen erreicht werden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das DNS-Konstrukt Sequenzen, die für einen sogenannten Tag kodieren, welches die Reinigung mittels Affinitäts-Chromatographie ermöglicht. Entsprechende Tags, beispielsweise His-Tags bestehend aus mehreren Histidin-Aminosäureresten, und deren Verwendung für die Affinitäts-Chromatographie sind im Stand der Technik bekannt (vgl. beispielsweise Sulkowski, E., Trends in Biotechnology, Vol.3 (1985), S.l). Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen DNS-Konstrukte Sequenzen auf, die für einen Tag kodieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich die Polypeptide, die durch dieses Verfahren erhältlich sind. Dabei handelt es sich um Polypeptide, welche die folgende Strukturformel umfassen:
A-x1-B(-x2-C1_n)n
worin A, B, C, x und n die oben genannte Bedeutung aufweisen. Der prinzipielle Aufbau eines Beispiels eines entsprechenden Polypep- tids ist auch in Fig. 1 dargestellt.
Diese Polypeptide können unmittelbar eingesetzt werden oder spezifisch an den Stellen x in eine Vielzahl von Peptiden aufspalten werden. In Abhängigkeit der Struktur des DNS-Konstruktes wird dadurch ein Peptidgemisch oder eine Vielzahl von Peptiden gleicher Sequenz erhalten.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die so erhaltenen Peptide oder Peptidgemische aufgereinigt werden, wobei ein Peptidgemisch oder einzelne Peptide in hoher Konzentration und reiner Form erhalten werden. Zur Reinigung können die bereits genannten Chromatographie-Verfahren eingesetzt werden, die dem Fachmann wohl bekannt sind.
Ein geringer Anteil an unspezifischen Nebenprodukten kann gegebenenfalls durch im Stand der Technik übliche Reinigungsverfahren entfernt werden.
Kurze Darstellung der Figuren:
Fig. 1 Prinzipieller Aufbau der erfindungsgemäßen Fusionsproteine;
Fig. 2 RT-18 HPLC-Elutionsprofil des Fusionspeptides vor Zugabe von CuCl2; Fig. 3 RT-18 HPLC-Elutionsprofil der Peptide im Ansatz 8 nach 45 Stunden Inkubation unter den in Tabelle 1 genannten Bedingungen;
Fig. 4 Massenspektroskopische Analyse der Peptide im Ansatz 8 nach 45 Stunden Inkubation unter den in Tabelle 1 genannten Bedingungen.
Beispiel
Das Peptid mit der Sequenz :
S-H-G-R-G-D-S-D-Ό-ΈL-S-ΪI-D-K-Q-A-G-D-V-Ό-K-S-K-E-I-L-D-V-K-Ό-K
(SEQ ID NO: 1), worin die Cu-Spaltstellen fett und die verschiedenen Peptidsequenzen kursiv dargestellt wurden, wurde unter den in Tabelle 1 genannten Reaktionsbedingungen gespalten. Die einzelnen Reaktionen werden in Tabelle 1 zusammengefasst.- Die Konzentration des Fusionspeptides betrug in allen Ansätzen 1 mg/ml .
Figure imgf000016_0001
Tabelle 1 Reaktionsbedingungen, unter denen die Spaltung des Peptids analysiert wurde; ein Teil der Ansätze wurde nacheinander bei verschiedenen Bedingungen inkubiert, d.h. Ansatz 1 wurde mit dem genannten Puffer nacheinander für 3 Stunden bei 55 °C, für 24 Stunden bei 55 °C, für 3 Stunden bei 62 °C, etc . inkubiert . Die durch die Spaltung erhaltenen Peptide wurden über eine RT-18 HPLC-Säule aufgetrennt und aus dem dabei erhaltenen Laufprofil wurde die Spaltungseffizienz der verschiedenen Bedingungen ermittelt. Zudem wurde eine massenspektroskopische Auswertung vorgenommen. Beispiele der durch diese Analysen erhaltenen Ergebnisse werden in den Figuren 2 bis 4 dargestellt.
Die Elutionsprofile zeigen lediglich die optische Dichte des Eluates über die Zeit. Die massenspektroskopische Darstellung zeigt die Verteilung der Masse/Ladung der erhaltenen Peptide. Fig. 2 beschreibt das Elutionsprofil des ungespaltenen Fusionspeptides von der RT-18 HPLC-Säule vor Zugabe von CuCl2. Demgegenüber ist in Fig. 3 RT-18 das HPLC-Elutionsprofil der Peptide des Ansatzes 8 nach 45 Stunden Inkubation unter den in Tabelle 1 genannten Bedingungen zu sehen. Fig. 4 stellt die massenspektroskopische Analyse der Peptide des Ansatzes 8 nach 45 Stunden Inkubation unter den in Tabelle 1 genannten Bedingungen dar.
Die Ergebnisse zeigen, dass eine Spaltung bei basischem pH-Wert möglich ist, wobei sich zwischen pH 8 , 2 und pH 9 , 0 keine signifikanten Unterschiede ergeben.
Die Reaktion verläuft besser in Boratpuffer als in TRIS-Puffer, vermutlich weil es zu einer Wechselwirkung zwischen dem Stick- stoff und dem Kupfer kommen kann.
Bei einer Temperatur von 62 °C wird eine 100%ige Spaltung innerhalb von 24 bis 48 Stunden erzielt. Bei einer Temperatur von 55 °C verläuft die Reaktion langsamer.
Spezifische Nebenprodukte konnten nicht identifiziert werden.

Claims

Patentansprüche
1. DNS-Konstrukt, das für ein Polypeptid kodiert, wobei das Polypeptid die folgende allgemeine Strukturformel
A-x1-B(-x2-C1.n)n
umfaßt, worin
A und B dieselben oder verschiedene Oligopeptide mit 3 bis 100 Aminosäuren sind;
C oder C .a ein oder mehrere Oligopeptide beliebiger Sequenz mit 3 bis 100 Aminosäuren sind;
x: und x2 dieselben oder verschiedene Erkennungssequenzen für eine Peptidspaltung sind; und
n eine ganze Zahl größer als 0 ist.
2. DNS-Konstrukt gemäß Anspruch 1, in der A ein Oligopeptid darstellt, das eine andere Sequenz als Oligopeptid B aufweist .
3. DNS-Konstrukt gemäß Anspruch 1 oder 2, in der C ein Oligopeptid darstellt, das dieselbe Sequenz wie Oligopeptid A oder B aufweist.
4. DNS-Konstrukt gemäß Anspruch 1 oder 2, in der C ein Oligopeptid darstellt, das eine von A und B verschiedene Sequenz aufweist .
5. DNS-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 , in der n größer als 1 ist.
6. DNS-Konstrukt gemäß Anspruch 5, in der n größer als 3 ist.
7. DNS-Konstrukt gemäß Anspruch 6, in der n größer als 5 ist.
8. DNS-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7, in der Clf C2, Cn derselben oder verschiedene Oligopeptide sind.
9. DNS-Konstrukt gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, in der die Oligopeptide A, B und Cγ_a eine Länge von 10 bis 50 Aminosäuren aufweisen.
10. DNS-Konstrukt gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, in der n von 2 bis 50 beträgt.
11. DNS-Konstrukt gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, in der x eine Erkennungssequenz darstellt, die eine Spaltung durch Proteasen, Spaltung innerhalb der Wirtszelle oder eine chemische Spaltung ermöglicht.
12. DNS-Konstrukt gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, in der x eine ErkennungsSequenz darstellt, die eine Spaltung durch Faktor Xa, TEV, Genenase I, Thrombin, Enterokinase, 3C, CNBr, Hydroxylamin, Cu2+ oder Säurehydrolyse ermöglicht.
13. Expressionsvektor, in dem ein DNS-Konstrukt gemäß einem der vorstehenden Ansprüche operativ mit einer expressionsregu- lierenden Sequenz verknüpft wurde.
14. Wirtszelle, die ein DNS-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 enthält.
15. Wirtszelle nach Anspruch 14, die eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle ist.
16. Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 14 oder 15, die eine Hefezelle, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle oder eine tierische Zelle ist.
17. Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16, die eine E.coli, CHO-, COS- oder S .cerevisiae-Zelle ist.
18. Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17, die eine verringerte Rekombinationsfrequenz aufweist.
19. Verfahren zur Herstellung eines Peptids, bei dem man eine DNS-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert und das Polypeptid gewinnt.
20. Verfahren gemäß Anspruch 19, bei dem die Expression des DNS- Konstruktes in einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 14 bis 18 erfolgt.
21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 oder 20, bei dem man das Polypeptid nach der Expression isoliert.
22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche .19 bis 21, bei dem man das Polypeptid aus dem Kulturüberstand isoliert.
23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 bis 22, bei dem man das Polypeptid aus den Zellen der Zellkultur isoliert.
24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 bis 23, bei dem man das Polypeptid spezifisch an den Stellen x in Peptide aufspaltet.
25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 bis 24, bei dem man ferner einzelne Peptide oder ein Peptidgemisch isoliert.
26. Polypeptid erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 bis 25.
27. Polypeptid, umfassend die folgende allgemeine Strukturformel
A-x1-B(-x2-C1.n)n worin
A und B dieselben oder verschiedene Oligopeptide mit 3 bis 100 Aminosäuren sind;
C ein beliebiges Oligopeptid mit 3 bis 100 Aminosäuren ist;
xx und x2 dieselben oder verschiedene Erkennungssequenzen für eine Peptidspaltung sind; und
n eine ganze Zahl größer als 0 ist.
28. Polypeptid gemäß Anspruch 27, in dem A ein Oligopeptid darstellt, das eine andere Sequenz als Oligopeptid B aufweist.
29. Polypeptid gemäß Anspruch 27 oder 28, in dem C ein Oligopeptid darstellt, das dieselbe Sequenz wie Oligopeptid A oder B aufweist.
30. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 27 bis 29, in der C ein Oligopeptid darstellt, das eine von A und B verschiedene Sequenz aufweist.
31. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 27 bis 30, in der n größer als 1 ist.
32. Polypeptid gemäß Anspruch 31, in der n größer als 3 ist.
33. Polypeptid gemäß Anspruch 32, in der n größer als 5 ist.
34. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 27 bis 33, in der Clf C2, Cn derselben oder verschiedene Oligopeptide sind.
35. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 27 bis 34, in der die Oligopeptide A, B und C^ eine Länge von 10 bis 50 Aminosäuren aufweisen.
36. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 27 bis 35, in der n von 2 bis 50 beträgt.
37. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 27 bis 36, in der x eine Erkennungssequenz darstellt, die eine Spaltung durch Proteasen, Spaltung innerhalb der Wirtszelle oder eine chemische Spaltung ermöglicht.
38. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 27 bis 37, in der x eine Erkennungssequenz darstellt, die eine Spaltung durch Factor Xa, TEV, Genenase I, Thrombin, Enterokinase, 3C,
CNBr, Hydroxylamin, Cu 2+ oder Säurehydrolyse ermöglicht.
SEQUENZPROTOKOLL
<110> Fresenius Kabi <120> DNS-Konstrukte für die Herstellung von Peptiden <130> 56904
<140> <141>
<160> 1
<170> Patentin Ver. 2.1
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Fusionsprotein <400> 1
Ser His Gly Arg Gly Asp Ser Asp Asp Lys Ser His Asp Lys Gin Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Asp Lys Ser His Glu Ile Leu Asp Val Lys Asp Lys
20 25 30
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